CN108570440A - 一株重组大肠杆菌及其在生产光学纯meso-2,3-丁二醇中的应用 - Google Patents

一株重组大肠杆菌及其在生产光学纯meso-2,3-丁二醇中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株重组大肠杆菌，该菌株命名为Escherichia coli W‑7/pETRABC‑1，其基因型为：Escherichia coli str.K‑12substr.W3110 ΔgldA ΔucpA ΔldhA ΔpoxB ΔadhE ΔackAΔfrdA/pETRABC‑1；本发明还公开了所述重组大肠杆菌在生产光学纯meso‑2,3‑丁二醇中的应用，实验证实本发明的工程菌以葡萄糖为底物，可生产光学纯度高达99.51％的meso‑2,3‑丁二醇，且生产过程简便，成本低，具有很好的应用价值和可观的经济效益。

Description

一株重组大肠杆菌及其在生产光学纯meso-2,3-丁二醇中的 应用
技术领域
本发明涉及一种重组大肠杆菌及其应用，尤其涉及一株用于生产光学纯meso-2,3-丁二醇的基因工程菌及其应用。
背景技术
2,3-丁二醇在常温下是一种无色粘稠状液体，低温下为无色晶体，可以广泛应用于化工、食品、燃料及航天航空等多个领域(Syu M J.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2001,55:10-18)。2,3-丁二醇有三种同分异构体：(2R,3R)-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇；其中，meso-2,3-丁二醇可以应用于聚合物的生产，生成的聚合物可用于服装和合成材料等多个领域(Gubbels et al.,J.Polym.Sci.,2012,51:890-898)，具有广阔的应用前景。
目前，通过微生物发酵法生产丁二醇的菌株多为条件致病菌，如肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌等(Celinska E.&Grajek W.,Biotechnol.Adv.,2009,27:715-725；Ji et al.,Biotechnol.Adv.,2011,29:351-364；Kim D K et al.,J.Biosci.Bioeng.,2013,116:186-192)，这些菌株产生的多为2,3-丁二醇的两种或三种立体异构体的混合物。近年有研究报道，利用枯草芽孢杆菌(Fu J etal.Biotechnol.Biofuels.,2016,9:90)和地衣芽孢杆菌(Ge Y et al.Green.Chem.,2016,18:4693-4703)可生产光学纯度大于99％的meso-2,3-丁二醇，尽管这两种菌株为生物安全菌株，但培养成本较高限制了其在工业生产中的应用。
大肠杆菌作为一种生物安全模式菌株具有培养成本低的优势。2004年，研究者在大肠杆菌中表达阴沟肠杆菌2,3-丁二醇合成基因簇，得到光学纯度为95.5％的meso-2,3-丁二醇(Xu Y et al.Metab.Eng.,2014,23:2 2-33)，但纯度难以满足聚合级要求。基于此，迫切需要寻找一种通过基因工程改造大肠杆菌生产高光学纯meso-2,3-丁二醇的方法。
发明内容
针对现有技术中，产品生产纯度低，难以满足聚合级要求的不足，本发明要解决的问题是构建一株大肠杆菌基因工程菌获得重组大肠杆菌，并以该工程菌生产高光学纯度的meso-2,3-丁二醇的应用。
本发明所述的重组大肠杆菌，命名为Escherichia coli W-7/pETRABC-1。该菌株基因型为Escherichia coli str.K-12 substr.W3110 ΔgldA ΔucpA ΔldhA ΔpoxB ΔadhE ΔackA ΔfrdA/pETRABC-1。
上述的重组大肠杆菌Escherichia coli W-7/pETRABC-1为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，最适培养温度为37±1℃，可以在含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基上生长。
上述的重组大肠杆菌是以Escherichia coli str.K-12 substr.W3110为出发菌株，外源表达阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM乙偶姻合成基因簇budRAB以及地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis DSM13 meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因budC；同时敲除内源具有2,3-丁二醇脱氢酶活性的甘油/1,2-丙二醇脱氢酶基因gldA和假定为氧化还原酶的基因ucpA；敲除副产物形成相关的乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸氧化酶基因poxB、乙醇脱氢酶基因adhE、乙酸激酶基因ackA和延胡索酸还原酶基因frdA制得。
具体的，上述菌株构建方法如下：
(1)上述的重组大肠杆菌Escherichia coli W-7/pETRABC-1菌株中2,3-丁二醇合成相关基因的外源表达是通过PCR克隆阴沟肠杆菌E.cloacae SDM乙偶姻合成基因簇budRAB和地衣芽孢杆菌B.licheniformis DSM 13meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因budC，通过重组PCR将两基因整合后，Xba I/EcoR I双酶切与pET28a连接，得到重组质粒pETRABC-1。
(2)上述的重组大肠杆菌Escherichia coli W-7/pETRABC-1菌株中基因的敲除采用λ-Red重组技术，将目的基因用包含目的基因上下游同源序列的硫酸卡那霉素抗性基因片段替换，再将抗性基因消除。通过此方法在出发菌株中敲除内源具有2,3-丁二醇脱氢酶活性的基因gldA,ucpA以及副产物合成相关基因ldhA,poxB,adhE,ackA,frdA，将获得的已敲除7个基因的菌株命名为E.coli W-7。
(3)将步骤(1)得到的重组质粒pETRABC-1转化到重组菌株E.coli W-7中，获得重组大肠杆菌菌株，命名为E.coli W-7/pETRABC-1。
本发明所述重组大肠杆菌Escherichia coli W-7/pETRABC-1在生产光学纯meso-2,3-丁二醇中的应用。
具体的，应用步骤如下：
(1)平板培养：将菌株Escherichia coli W-7/pETRABC-1划线到含有质量体积比为1.6～1.8％琼脂并含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基上，37±1℃培养12±2小时；
(2)种子培养：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±2小时；
(3)摇瓶培养：在无菌条件下，取步骤(2)所得的菌液，按照终OD为0.06-0.08接种到含有40～50g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、4g/L乙酸和50μg/mL硫酸卡那霉素的M9培养基中，37±1℃摇床振荡培养，其间，每3小时取样检测发酵样品中葡萄糖消耗和产物生成，底物葡萄糖耗尽或不再消耗时停止培养，取产物生成量最高点计算产物纯度；
其中：上述步骤(1)～(2)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L，pH 7.0；121℃灭菌20分钟。
上述步骤(3)中所述的M9培养基配方为：Na2HPO4·12H2O 12.069g/L，KH2PO4 3g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 0.5g/L，1M MgSO4溶液1mL，1M CaCl2溶液0.3mL，微量元素溶液(100×)10mL，调节pH为7.4，121℃灭菌20分钟。其中，微量元素溶液(100×)配方为：EDTA 5g/L，FeCl3·6H2O 0.83g/L，ZnCl2 84mg/L，CuCl2·2H2O 13mg/L，CoCl2·2H2O 10mg/L，H3BO310mg/L，MnCl2·4H2O 1.6mg/L。
上述方法中：底物葡萄糖的检测方法是：
样品稀释适当倍数后，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。测定原理为利用固定化葡萄糖氧化酶膜专一性测定葡萄糖含量。
上述方法中：发酵产物meso-2,3-丁二醇的检测方法是：
每500mL乙酸乙酯中加入0.4mL异戊醇作为萃取剂，利用该萃取剂，对发酵样品进行等体积萃取，涡旋振荡器对混合样品震荡2分钟后12000rpm离心2分钟，取上层样品进行气相检测。具体的气相检测条件如下：
所用气相色谱仪的型号为Agilent 6820，氮气作为载气，进样器和检测器的温度均设为280℃，检测过程的柱温设定为：40℃保持3分钟；然后以每分钟1.5℃的速率升温到80℃；以每分钟0.5℃的速率升温到86℃；以每分钟30℃的速率升温到200℃。进样量1μL，进行气相检测。
上述方法中：meso-2,3-丁二醇的光学纯度计算方法为([M]/([M]+[S]+[R]))×100％，其中，[M],[S]和[R]分别代表meso-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇和(2R,3R)-2,3-丁二醇。
本发明建立的通过基因工程改造大肠杆菌生产光学纯meso-2,3-丁二醇的方法，产品纯度高达99.5％以上。
本发明具有的突出特点是：
(1)本发明应用敲除内源具有2,3-丁二醇脱氢酶活性的基因，外源表达阴沟肠杆菌ALS、ALDC和地衣芽孢杆菌meso-BDH，敲除乳酸、乙酸、乙醇、琥珀酸等副产物生成途径的大肠杆菌工程菌株Escherichia coli W-7/pETRABC-1，实现了发酵葡萄糖生产光学纯的meso-2,3-丁二醇。
(2)本发明敲除了大肠杆菌内源两个具有2,3-丁二醇脱氢酶活性的基因，成功解决了大肠杆菌生产meso-2,3-丁二醇纯度低的瓶颈问题，最终，本发明构建的重组菌株能够发酵葡萄糖生产纯度大于99.5％的meso-2,3-丁二醇，具有良好的工业应用前景。
(3)本发明构建的大肠杆菌工程菌株要求的培养基简单、培养成本低。同样，应用其生产光学纯meso-2,3-丁二醇中操作过程简单，产物分离方便。
附图说明
图1载体pET-RABC-1图谱
其中：lacI：编码lac启动子的调控因子；ori：复制起始位点；Kan：编码卡那霉素抗性基因；Xba I,EcoR I：核酸内切酶位点；budC：编码2,3-丁二醇合成调控因子；Pabc：2,3-丁二醇合成启动子；budA/budB：编码ALS/ALDC；budC：编码meso-BDH。
图2发酵产物手性气相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步阐明本发明，但本发明保护范围不仅限于此。
如下实施例涉及的菌株来源简述：
出发菌株Escherichia coli str.K-12 substr.W3110(CGSC No.4474)购买于美国耶鲁大学大肠杆菌基因中心CGSC。
乙偶姻合成基因簇的来源菌Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM为本申请人实验室前期筛选得到的生产2,3-丁二醇菌株，其已完成基因组测序，并已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.4230。
meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因来源菌Bacillus licheniformis DSM13(ATCCNo.14580)购买于美国ATCC全球生物资源中心，保藏号为ATCC No.14580。
实施例1：过表达外源2,3-丁二醇合成相关基因
(1)基因簇budRAB的克隆
R-乙偶姻合成基因簇budRAB包括budC(编码2,3-丁二醇合成调控因子)、Pabc(2,3-丁二醇合成启动子)、budA/budB(编码ALS/ALDC)，序列长度为3480个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
采用常规的方法制备菌株Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学实验指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取E.cloacae SDM的基因组DNA；使用合成的引物从E.cloacae SDM基因组DNA中PCR扩增得到乙偶姻合成基因簇。
通过PCR扩增E.cloacae SDM来源的乙偶姻合成基因簇，引物设计如下：
上游引物：5’-TCAATCTAGACTACTCCTCGCTTATCATCGT-3’，携带一个Xba I位点；
下游引物：5’-TTTTCCAGATACTTTACTCATTTCTCTGTCCTTATAGTGA-3’。
(2)budC基因的克隆
过表达的meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因budC序列长度为783个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
制备菌株地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis DSM13的基因组DNA，使用合成的引物从基因组DNA中PCR扩增得到budC基因，使用的引物如下：
上游引物5’-CTCACTATAAGGACAGAGAAATGAGTAAAGTATCTGGAAA；
下游引物5’-CTGTGAATTCTTAATTAAATACCATTCCGCC-3’，携带一个EcoR I位点。
(3)重组质粒pETRABC-1的构建
利用基因簇budRAB的上游引物和budC基因的下游引物通过重组PCR将以上两个片段连接，Xba I/EcoR I双酶切重组片段和pET28a质粒，并用T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒pETRABC-1。
实施例2：敲除内源具有2,3-丁二醇脱氢酶活性基因和副产物合成相关基因
在出发菌株Escherichia coli str.K-12 substr.W3110中敲除内源具有2,3-丁二醇脱氢酶活性基因gldA,ucpA和副产物合成相关基因ldhA,poxB,adhE,ackA,frdA。
以上基因采用λ-Red重组技术进行敲除。λ-Red重组系统由3个酶组成，分别为Gam,Bet,Exo，分别负责抑制外源DNA片段降解以及DNA与染色体的同源重组。质粒pTKRED(壮观霉素抗性)包含这三个酶的编码基因，在IPTG诱导下可进行表达，从而包含同源臂的抗性基因(硫酸卡那霉素)片段和染色体特定位点之间发生同源重组，抗性基因将待敲除基因替换。该质粒包含温敏性复制子，可在37℃下停止复制。用于替换目的基因的抗性基因两端各包含一个FRT位点，可在温敏型质粒pCP20(氨苄青霉素、氯霉素抗性；42℃停止复制)携带的FLP重组酶组作用下发生位点特异性重组，消除抗性基因，进而实现目的基因敲除。
(1)甘油/1,2-丙二醇脱氢酶基因gldA的敲除
甘油/1,2-丙二醇脱氢酶基因gldA序列长度为1104个碱基，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
本发明构建的菌株是在Escherichia coli str.K-12 substr.W3110基础上进行基因改造。
a.将质粒pTKRED转化进宿主菌株W3110，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学实验指南》中质粒DNA导入细胞的CaCl2转化法(培养温度为30℃)。
b.硫酸卡那霉素抗性基因替换目的基因
硫酸卡那霉素抗性基因的扩增：
以质粒pKD4为模板(包含硫酸卡那霉素抗性基因)，利用敲除引物PCR扩增包含长度为50bp的同源臂的硫酸卡那霉素抗性片段。
引物序列如下：
敲除引物：(未被下划线标注为同源臂序列)
上游引物：5’-ACACGACTGGAATGCCGCATTTGGCACTACTCATCTCTAAAGGAGCAATTGTGTAGG CTGGAGCTGCTTC-3’
下游引物：5’-CAGGCAATTTTGCGTTCAAACTCCCGGACAAGCCGGGAGTTTGGAGTAGGATGGGAA TTAGCCATGGTCC-3’
验证引物：
上游引物：5’-CAAGGGTTATTAGCCGCACT-3’
下游引物：5’-AAGGAGTGGCTGGTAAATGC-3’
将PCR扩增得到的片段电转化导入a步获得的菌株中(培养温度为37℃)，制作电转化感受态时接种半小时后加入终浓度0.06M IPTG诱导重组蛋白表达，制备电转化感受态及电转操作可参考科学出版社出版的《精编分子生物学实验指南》中高效率的电转化方法，挑取在硫酸卡那霉素抗性平板上生长的菌株用验证引物进行菌落PCR验证，验证成功的菌株即为硫酸卡那霉素抗性基因替换目的基因的菌株。
c.pCP20质粒的导入与抗性基因的消除
将质粒pCP20转化进b步得到的菌株中，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学实验指南》中质粒DNA导入细胞的CaCl2转化法，将复苏培养后的菌液涂布于含有氯霉素抗性的LB平板(培养温度为30℃)，挑取得到的单菌落42℃培养12±2小时，蘸取菌液划线于无抗LB固体平板于42℃培养，挑取单菌落分别点板于无抗、含有硫酸卡那霉素、含有氯霉素的LB固体平板于37℃培养，挑取只在无抗平板上生长的菌株用验证引物进行菌落PCR验证，验证成功的即为敲除成功的菌株。
(2)预测的氧化还原酶基因ucpA的敲除
假定为氧化还原酶的基因ucpA序列长度为792个碱基，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
基因ucpA的敲除步骤参照(1)中gldA的敲除步骤，引物如下：
敲除引物：(未被下划线标注为同源臂序列)
上游引物：5’-TTCAGAGGGAATGGAGTGTAACGCTCTGTATTAACAAGGAGAGCATTAAAGTGTAGG CTGGAGCTGCTTC-3’
下游引物：5’-AGTTCAAGACGAAATCCTCCCCACAAATGCAGGGAGGAAACAGAGGTGAAATGGGAA TTAGCCATGGTCC-3’
验证引物：
上游引物：5’-TTCTCTGACTGACTCTCCGC-3’
下游引物：5’-TTTTCAGTAAGTTAACGGCC-3’
(3)乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除
乳酸脱氢酶基因ldhA序列长度为990个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
基因ldhA的敲除步骤参照(1)中gldA的敲除步骤，引物如下：
敲除引物：(未被下划线标注为同源臂序列)
上游引物：5’-ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGAAGTACCTGCAGTGTAGG CTGGAGCTGCTTC-3’
下游引物：5’-TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTTTCCAGATTGCTTAAGTATGGGAA TTAGCCATGGTCC-3’
验证引物：
上游引物：5’-CCGAGCGGTAGCCAGATGCC-3’
下游引物：5’-TTTTATCGCTGGTCACGGGC-3’
(4)丙酮酸氧化酶基因poxB的敲除
丙酮酸氧化酶基因poxB序列长度为1719个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
基因poxB的敲除过程与ldhA相似，不同点在于所使用的包含硫酸卡那霉素基因的模板为菌株E.coli MG1655ΔpoxB::kan(购买于CGSC机构)基因组，抗性基因片段同源臂长度为300bp，引物序列如下：
上游引物：5’-GAGGCGCTGGAAAGCAATAA-3’
下游引物：5’-TTGAATACTGCCCAGCACCG-3’
(5)乙醇脱氢酶基因adhE的敲除
乙醇脱氢酶基因adhE序列长度为2676个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
基因adhE的敲除步骤参照(4)中poxB的敲除步骤，硫酸卡那霉素基因的模板为菌株E.coli MG1655 ΔadhE::kan(购买于CGSC机构)基因组，引物序列如下：
上游引物：5’-AACATGCTAATGTAGCCACC-3’
下游引物：5’-ACGGCGAACAACATCGGTAA-3’
(6)乙酸激酶基因ackA的敲除
乙酸激酶基因ackA序列长度为1203个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
基因ackA的敲除步骤参照(4)中poxB的敲除步骤，硫酸卡那霉素基因的模板为菌株E.coli MG1655 ΔackA::kan(购买于CGSC机构)基因组，引物序列如下：
上游引物：5’-CATGCTTCACCTCAACTTCA-3’
下游引物：5’-GATTGCTGGAAAGCAGACCT-3’
(7)延胡索酸还原酶基因frdA的敲除
延胡索酸还原酶基因frdA序列长度为1809个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
基因frdA的敲除步骤参照(1)中gldA的敲除步骤，引物如下：
敲除引物：(未被下划线标注为同源臂序列)
上游引物：5’-GTACGTGGCTGTGGGATAAAAACAATCTGGAGGAATGTCGTGCAAACCTTGTGTAGG CTGGAGCTGCTTC-3’
下游引物：5’-GACTTCCGGGTTATAGCGCACCACCTCAATTTTCAGGTTTTTCATCTCAGATGGGAA TTAGCCATGGTCC-3’
验证引物：
上游引物：5’-ATGCCGTTTCGCTCATAGTT-3’
下游引物：5’-GGAGTTGCCGATGATGTACG-3’
将最终获得的已敲除7个基因的菌株命名为Escherichia coli W-7(E.coli W-7)。
实施例3：重组大肠杆菌的构建
将实施例1中得到的重组质粒pETRABC-1转化进大肠杆菌W-7中，该过程参考科学出版社出版的《精编分子生物学实验指南》中质粒DNA导入细胞的CaCl2转化法，得到重组大肠杆菌，命名为E.coli W-7/pETRABC-1。
实施例4：重组大肠杆菌利用M9培养基发酵葡萄糖生产meso-2,3-丁二醇
(1)平板培养：将重组大肠杆菌菌株E.coli W-7/pETRABC-1划线到含有质量体积比为1.6～1.8％琼脂并含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基上，37±1℃培养12±2小时；
(2)种子培养：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±2小时；
(3)摇瓶培养：在无菌条件下，取步骤(2)所得的菌液，按照终OD为0.06-0.08接种到含有40～50g/L葡萄糖、5g/L酵母粉和50μg/mL硫酸卡那霉素的M9培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±2小时，其间，每3小时取样检测发酵样品中葡萄糖消耗和产物生成，底物葡萄糖耗尽或不再消耗时停止培养，取产物生成量最高点计算产物纯度；
其中：上述步骤(1)～(2)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L，pH 7.0；121℃灭菌20分钟。
上述步骤(3)中所述的M9培养基配方为：Na2HPO4·12H2O 12.069g/L，KH2PO4 3g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 0.5g/L，1M MgSO4溶液1mL，1M CaCl2溶液0.3mL，微量元素溶液(100×)10mL，调节pH为7.4，121℃灭菌20分钟。其中，微量元素溶液(100×)配方为：EDTA 5g/L，FeCl3·6H2O 0.83g/L，ZnCl2 84mg/L，CuCl2·2H2O 13mg/L，CoCl2·2H2O 10mg/L，H3BO310mg/L，MnCl2·4H2O 1.6mg/L。
结果显示：菌株培养42小时，消耗葡萄糖50.33±0.58g/l，产生2,3-丁二醇16.70±0.28g/L，meso-2,3-丁二醇纯度为97.33％。
实施例5：重组大肠杆菌利用M9+乙酸培养基发酵葡萄糖生产meso-2,3-丁二醇
重组大肠杆菌E.coli W-7/pETRABC-1按照实施例4中(1)～(2)步骤活化后，按照终OD为0.06-0.08接种到含有40～50g/L葡萄糖、5g/L酵母粉、4g/L乙酸和50μg/mL硫酸卡那霉素的M9培养基中，按照实施例4中(3)步骤进行培养。
结果显示：菌株培养36小时，消耗葡萄糖34.5±0.71g/l，产生2,3-丁二醇16.58±0.40g/L，meso-2,3-丁二醇纯度为99.51％。
序列表
<110> 山东大学
<120> 一株重组大肠杆菌及其在生产光学纯meso-2,3-丁二醇中的应用
<141> 2018-3-8
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3480
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<222> （1）…（3480）
<223> 乙偶姻合成基因簇budRAB的核苷酸序列
<400> 1
ctactcctcg cttatcatcg tcaagaaccg cttcaccgtc cgcgagcgtt caaaccgtcg 60
ccagcagagc gcgatatcgg tataaagctc gggtgagctc aacgcatgat aggtgacatt 120
cggcggagaa atggccgcca tcgatttcgg caccagcgcg aagccgccac cggcggagac 180
catgctcagg gaggacgaaa gctgtgacga ctgcagcgcg tgctgcacgt cgatcccggc 240
ccgttcgcag cagctgtaaa cccggtcgaa caggccgggc gcgacctcct gcgggaacaa 300
caccactggc gtatcccgga gctgctccag cgccagatcg ccgcttgttg cgagcggatg 360
gtcgcgatgc agcgccacca ccatcggttc ccggtcaagg atctttaact cgaatgcctt 420
gctgctttcg cacggtagcc gcacgaaggc aatatccagt tccccctccg ccagcatcgc 480
tgtcagcgaa gacatattgg cctccacctg gtgtacctgc accgccatgt tctgtacctg 540
aaactgacga atgagcgtga aaattttggg atgaaaagca tctgaactgg taatgccaat 600
cgacaggtta ccgttcagac cgcgcgcgat gccccgggct ttctccagcg cggcgtcgct 660
cagcgccagg atcttacagg cgtcctcgta gaaggcttct cccgcttcgg ttagctctac 720
gccccgcgtc aggcgtctga acagcggcgt gcccacttcc tcttcgagcc gtttgatctg 780
ctgactcaga ggaggctgtg aaatacccag cgcttcggcc gccctggtga agtgtcgctc 840
gcgtgcaacc gcgacaaaat accgcagata acgaagttcc atatctaaaa cgtctcaaac 900
cagcatggat tctatattgg aactctctgc tgaatcgggt caacatttat ttaacctttc 960
taaataaagt tgaagaggac gagcatgatg atgcactcat ctgcctgcga ctgtgaggcc 1020
agtttatgcg agaccctgcg cgggttctcc gctaagcatc ctgacagcgt gatctatcag 1080
acatcgctaa tgagcgccct gctaagcggc gtctacgagg gggacaccac catcgccgat 1140
ctgctggcgc acggtgattt tggtctgggc accttcaacg agctggacgg cgaaatgatt 1200
gccttcagca gccaggtgta ccagctgcgc gccgacggca gcgcacgcgc cgcgaagcca 1260
gagcagaaaa cgccgttcgc ggtgatgacc tggttccagc cgcagtaccg taaaaccttt 1320
gatgcgccgg tcagtcgtca gcagatccac gacgtgatcg accagcaaat cccctccgat 1380
aacctgttct gcgcgctgcg catcgacggc aacttccgcc acgcccacac ccgtaccgta 1440
ccgcgtcaga cgccgccata ccgcgcgatg accgacgtgc tggacgacca gccggtgttc 1500
cgcttcaacc agcgcgaagg ggtgctggtc gggttccgca cgccgcagca tatgcagggc 1560
attaacgtgg ccggctatca cgaacatttc attaccgacg accgtcaggg cgggggacat 1620
ctgctcgact atcagttgga gagcggcgtg ctcacctttg gcgaaataca caagctgatg 1680
atcgatctgc cagccgacag cgcgttttta caggccaacc ttcaccccag caatcttgat 1740
gcagcgatcc gttccgtcga aaactaacag gagaactacc gtgaacagtg agaaacagtc 1800
acgtcagtgg gcgcatggcg ccgatatggt tgtaggtcaa ctggaagcgc agggcgtgaa 1860
gcaggtgttc gggatcccgg gggcgaaaat cgacaaagtc tttgactccc tgctggactc 1920
ctccattgag atcatccccg tacgccacga ggcaaacgcg gcgttcatgg cggcggcggt 1980
agggcgcctg accggcaaag ccggggtggc gctggtcacc tccggcccgg gctgttccaa 2040
cctgatcacc ggtatcgcca ccgccaacag cgaaggcgac ccggtggtgg cgctgggcgg 2100
ggcggtgaag cgggcggata aagccaagct ggtgcaccag agcatggata cggttgccat 2160
gttcagcccg gtcaccaaat acgctgttga agtcagctct ccggatgcga ttgctgaagt 2220
ggtgtcgaac gcattccgtg ccgccgagca cggcaggccg ggcggtgcgt tcgtcagcct 2280
gccgcaggat attgttgacc agcctgccac gggggcgatt ttaccggcca gcggcccggc 2340
gctgatgggc ccggctcctg aatcggccat taacgacgtg gcgaaactca tcgacaacgc 2400
caaaaacccg gtgatcctgc tggggctgat ggcgagccag cctgctaaca gcgcggcgct 2460
gcgtaagctg ctggagaaaa gccgcattcc ggtcaccagc acctatcagg ccgccggggc 2520
ggtgaaccag gagcatttca cccgcttcgc cggacgcgtt ggcctcttta acaaccaggc 2580
gggtgaccgc ctgctgcacc tggcggatct gattatctgt atcggctaca gcccggttga 2640
gtatgagccg tccatgtgga acagcggcga cgccacgctg gtgcatattg atgtactgcc 2700
tgcgtatgaa gagcgcaatt atgtccctga catcgagctg gtgggcgaca tcgccgccac 2760
gctgaacctg cttgccagcc ggattgacca caagctggag ctcagccagc gtgcgtcaga 2820
aatcctggtc gatcgccagc atcagcgcga tctgctcgat cgccgcggtg cctcgctcaa 2880
ccagtttgcc ctgcatccac tgcgtatcgt tcgcgccatg caggacatcg tcaataacga 2940
cgtgacgctg accgtcgaca tgggcagctt ccacatctgg atcgcccgct acctctacag 3000
cttccgggcg cgccaggtga tgatctccaa cggtcagcag accatgggcg ttgcgctgcc 3060
gtgggccatt ggcgcgtggc tggtcaaccc gggccgcaag gtggtgtcgg tgtccggtga 3120
cggcggcttc ctgcagtcga gcatggagct ggaaaccgcg gtgcgcctca acgccaacgt 3180
gctgcacatc atctgggtgg ataacggcta caacatggtc gccattcagg aagagaaaaa 3240
ataccagcgt ctttccggcg tggcgttcgg cccggttgac ttcaaagcct atgccgacgc 3300
ctttggcgcc aggggctttg ccgtggagag cgccgatgcc cttgaatcga cgctgcgtgc 3360
ggcgatggat gtgaatggcc cggccgtggt ggccattccc gttgactaca gcgataaccc 3420
gctgctgatg ggccagctcc atctcagcca gattttgtga ctcactataa ggacagagaa 3480
<210> 2
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<222> （1）…（783）
<223> meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因budC的核苷酸序列
<400> 2
atgagtaaag tatctggaaa aattgctttt gttactggcg gcggtcaagg aattggagaa 60
gcaatctgca aacgattggc agaggacgga ttcgcagttg cagttgccga ttataatgta 120
gaaactgcaa cacaagttgc tgaggacatc aataagctta acggcaaagc aattgcggtt 180
aaagtggatg ttgctgatcg cgatgatgtt tttaaagctg tcgatgaaac agtaaaacgt 240
cttggcggtc ttgatgtggt gattaataat gcgggtcttg gaccaaccac ccctattgaa 300
agcattacat atgaagatta tcggaaagtc tatgatgtta acgttggcgg tacttattgg 360
ggaatacaag cagctgtaaa agcctttaaa gaacttggac acggcgggaa aatcattaat 420
gcatcttctc aagccggcca agtcggcaac ccgggcttag cggtttacgg aggaacaaag 480
ttcgctgttc gcgggattac ccaaactgcg gcaaaagatc tagctgaatt aggtattact 540
gtaaacgcct tttgtccggg tatcgttaaa actcctatga tgatggggat tgcacagcaa 600
accgctgatg aagcaggcaa gccgtttgaa tggggcatgg aacaattcgc taaaaatatt 660
gcattaaaac gcttatccga gccggaagat gtagcagcat gcgtttctta ccttgcaggg 720
ccagattcag attatatgac tggtcaagct cttatcattg atggcggaat ggtatttaat 780
taa 783
<210> 3
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<222> （1）…（1104）
<223> 甘油/1,2-丙二醇脱氢酶基因gldA的核苷酸序列
<400> 3
atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60
ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt 120
ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa 180
attgcgccgt ttggcggtga atgttcgcaa aatgagatcg accgtctgcg tggcatcgcg 240
gagactgcgc agtgtggcgc aattctcggt atcggtggcg gaaaaaccct cgatactgcc 300
aaagcactgg cacatttcat gggtgttccg gtagcgatcg caccgactat cgcctctacc 360
gatgcaccgt gcagcgcatt gtctgttatc tacaccgatg agggtgagtt tgaccgctat 420
ctgctgttgc caaataaccc gaatatggtc attgtcgaca ccaaaatcgt cgctggcgca 480
cctgcacgtc tgttagcggc gggtatcggc gatgcgctgg caacctggtt tgaagcgcgt 540
gcctgctctc gtagcggcgc gaccaccatg gcgggcggca agtgcaccca ggctgcgctg 600
gcactggctg aactgtgcta caacaccctg ctggaagaag gcgaaaaagc gatgcttgct 660
gccgaacagc atgtagtgac tccggcgctg gagcgcgtga ttgaagcgaa cacctatttg 720
agcggtgttg gttttgaaag tggtggtctg gctgcggcgc acgcagtgca taacggcctg 780
accgctatcc cggacgcgca tcactattat cacggtgaaa aagtggcatt cggtacgctg 840
acgcagctgg ttctggaaaa tgcgccggtg gaggaaatcg aaaccgtagc tgcccttagc 900
catgcggtag gtttgccaat aactctcgct caactggata ttaaagaaga tgtcccggcg 960
aaaatgcgaa ttgtggcaga agcggcatgt gcagaaggtg aaaccattca caacatgcct 1020
ggcggcgcga cgccagatca ggtttacgcc gctctgctgg tagccgacca gtacggtcag 1080
cgtttcctgc aagagtggga ataa 1104
<210> 4
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<222> （1）…（792）
<223> 预测的氧化还原酶基因ucpA的核苷酸序列
<400> 4
atgggtaaac tcacgggcaa gacagcactg attacgggcg cattgcaggg aattggcgaa 60
ggaattgcca gaacttttgc acgtcatggc gcgaacctaa tcttgctgga tatctcccct 120
gagatcgaaa agctggcgga cgaactgtgt ggtcgtggtc atcgctgtac ggcggttgtc 180
gccgatgtgc gtgacccggc gtcggtagcc gcagctatca aacgcgcgaa ggaaaaagaa 240
gggcgcattg atatcctggt gaataacgca ggcgtttgtc gtctgggcag tttcctcgat 300
atgagcgatg acgatcgcga tttccatatt gacatcaata ttaaaggcgt atggaacgtc 360
acgaaggcgg tgctgccgga gatgattgcc cgcaaagatg gtcgcattgt gatgatgtct 420
tcagtcactg gtgatatggt ggccgatcct ggcgaaacgg cgtacgcctt aacgaaagcg 480
gcgattgttg gcctgacaaa atcgctggcg gtggagtacg cgcagtctgg tattcgcgtt 540
aacgccattt gcccgggata cgtgcgcaca ccaatggcgg aaagcattgc ccgccagtcg 600
aacccggaag atccagagtc ggtgctgact gaaatggcga aagcaatccc gatgcgtcgc 660
ctcgccgatc cgctggaagt cggcgaactg gcggccttcc tcgcatcgga tgaatccagc 720
tatttaaccg gtacacagaa tgtgattgat ggcggcagca cactgccgga gacggttagc 780
gtcggtatct ga 792
<210> 5
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<222> （1）…（990）
<223> 乳酸脱氢酶基因ldhA的核苷酸序列
<400> 5
atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60
gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc tgacggaaaa aaccgctaaa 120
actgccaatg gctgcgaagc ggtatgtatt ttcgtaaacg atgacggcag ccgcccggtg 180
ctggaagagc tgaaaaagca cggcgttaaa tatatcgccc tgcgctgtgc cggtttcaat 240
aacgtcgacc ttgacgcggc aaaagaactg gggctgaaag tagtccgtgt tccagcctat 300
gatccagagg ccgttgctga acacgccatc ggtatgatga tgacgctgaa ccgccgtatt 360
caccgcgcgt atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt 420
actatgtatg gcaaaacggc aggcgttatc ggtaccggta aaatcggtgt ggcgatgctg 480
cgcattctga aaggttttgg tatgcgtctg ctggcgttcg atccgtatcc aagtgcagcg 540
gcgctggaac tcggtgtgga gtatgtcgat ctgccaaccc tgttctctga atcagacgtt 600
atctctctgc actgcccgct gacaccggaa aactatcatc tgttgaacga agccgccttc 660
gaacagatga aaaatggcgt gatgatcgtc aataccagtc gcggtgcatt gattgattct 720
caggcagcaa ttgaagcgct gaaaaatcag aaaattggtt cgttgggtat ggacgtgtat 780
gagaacgaac gcgatctatt ctttgaagat aaatccaacg acgtgatcca ggatgacgta 840
ttccgtcgcc tgtctgcctg ccacaacgtg ctgtttaccg ggcaccaggc attcctgaca 900
gcagaagctc tgaccagtat ttctcagact acgctgcaaa acttaagcaa tctggaaaaa 960
ggcgaaacct gcccgaacga actggtttaa 990
<210> 6
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<222> （1）…（1719）
<223> 丙酮酸氧化酶基因poxB的核苷酸序列
<400> 6
atgaaacaaa cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggcagg ggtgaaacgc 60
atctggggag tcacaggcga ctctctgaac ggtcttagtg acagtcttaa tcgcatgggc 120
accatcgagt ggatgtccac ccgccacgaa gaagtggcgg cctttgccgc tggcgctgaa 180
gcacaactta gcggagaact ggcggtctgc gccggatcgt gcggccccgg caacctgcac 240
ttaatcaacg gcctgttcga ttgccaccgc aatcacgttc cggtactggc gattgccgct 300
catattccct ccagcgaaat tggcagcggc tatttccagg aaacccaccc acaagagcta 360
ttccgcgaat gtagtcacta ttgcgagctg gtttccagcc cggagcagat cccacaagta 420
ctggcgattg ccatgcgcaa agcggtgctt aaccgtggcg tttcggttgt cgtgttacca 480
ggcgacgtgg cgttaaaacc tgcgccagaa ggggcaacca tgcactggta tcatgcgcca 540
caaccagtcg tgacgccgga agaagaagag ttacgcaaac tggcgcaact gctgcgttat 600
tccagcaata tcgccctgat gtgtggcagc ggctgcgcgg gggcgcataa agagttagtt 660
gagtttgccg ggaaaattaa agcgcctatt gttcatgccc tgcgcggtaa agaacatgtc 720
gaatacgata atccgtatga tgttggaatg accgggttaa tcggcttctc gtcaggtttc 780
cataccatga tgaacgccga cacgttagtg ctactcggca cgcaatttcc ctaccgcgcc 840
ttctacccga ccgatgccaa aatcattcag attgatatca acccagccag catcggcgct 900
cacagcaagg tggatatggc actggtcggc gatatcaagt cgactctgcg tgcattgctt 960
ccattggtgg aagaaaaagc cgatcgcaag tttctggata aagcgctgga agattaccgc 1020
gacgcccgca aagggctgga cgatttagct aaaccgagcg agaaagccat tcacccgcaa 1080
tatctggcgc agcaaattag tcattttgcc gccgatgacg ctattttcac ctgtgacgtt 1140
ggtacgccaa cggtgtgggc ggcacgttat ctaaaaatga acggcaagcg tcgcctgtta 1200
ggttcgttta accacggttc gatggctaac gccatgccgc aggcgctggg tgcgcaggcg 1260
acagagccag aacgtcaggt ggtcgccatg tgcggcgatg gcggttttag catgttgatg 1320
ggcgatttcc tctcagtagt gcagatgaaa ctgccagtga aaattgtcgt ctttaacaac 1380
agcgtgctgg gctttgtggc gatggagatg aaagctggtg gctatttgac tgacggcacc 1440
gaactacacg acacaaactt tgcccgcatt gccgaagcgt gcggcattac gggtatccgt 1500
gtagaaaaag cgtctgaagt tgatgaagcc ctgcaacgcg ccttctccat cgacggtccg 1560
gtgttggtgg atgtggtggt cgccaaagaa gagttagcca ttccaccgca gatcaaactc 1620
gaacaggcca aaggtttcag cctgtatatg ctgcgcgcaa tcatcagcgg acgcggtgat 1680
gaagtgatcg aactggcgaa aacaaactgg ctaaggtaa 1719
<210> 7
<211> 2676
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<222> （1）…（2676）
<223> 乙醇脱氢酶adhE的核苷酸序列
<400> 7
atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag 60
cgtgaatatg ccagtttcac tcaagagcaa gtagacaaaa tcttccgcgc cgccgctctg 120
gctgctgcag atgctcgaat cccactcgcg aaaatggccg ttgccgaatc cggcatgggt 180
atcgtcgaag ataaagtgat caaaaaccac tttgcttctg aatatatcta caacgcctat 240
aaagatgaaa aaacctgtgg tgttctgtct gaagacgaca cttttggtac catcactatc 300
gctgaaccaa tcggtattat ttgcggtatc gttccgacca ctaacccgac ttcaactgct 360
atcttcaaat cgctgatcag tctgaagacc cgtaacgcca ttatcttctc cccgcacccg 420
cgtgcaaaag atgccaccaa caaagcggct gatatcgttc tgcaggctgc tatcgctgcc 480
ggtgctccga aagatctgat cggctggatc gatcaacctt ctgttgaact gtctaacgca 540
ctgatgcacc acccagacat caacctgatc ctcgcgactg gtggtccggg catggttaaa 600
gccgcataca gctccggtaa accagctatc ggtgtaggcg cgggcaacac tccagttgtt 660
atcgatgaaa ctgctgatat caaacgtgca gttgcatctg tactgatgtc caaaaccttc 720
gacaacggcg taatctgtgc ttctgaacag tctgttgttg ttgttgactc tgtttatgac 780
gctgtacgtg aacgttttgc aacccacggc ggctatctgt tgcagggtaa agagctgaaa 840
gctgttcagg atgttatcct gaaaaacggt gcgctgaacg cggctatcgt tggtcagcca 900
gcctataaaa ttgctgaact ggcaggcttc tctgtaccag aaaacaccaa gattctgatc 960
ggtgaagtga ccgttgttga tgaaagcgaa ccgttcgcac atgaaaaact gtccccgact 1020
ctggcaatgt accgcgctaa agatttcgaa gacgcggtag aaaaagcaga gaaactggtt 1080
gctatgggcg gtatcggtca tacctcttgc ctgtacactg accaggataa ccaaccggct 1140
cgcgtttctt acttcggtca gaaaatgaaa acggcgcgta tcctgattaa caccccagcg 1200
tctcagggtg gtatcggtga cctgtataac ttcaaactcg caccttccct gactctgggt 1260
tgtggttctt ggggtggtaa ctccatctct gaaaacgttg gtccgaaaca cctgatcaac 1320
aagaaaaccg ttgctaagcg agctgaaaac atgttgtggc acaaacttcc gaaatctatc 1380
tacttccgcc gtggctccct gccaatcgcg ctggatgaag tgattactga tggccacaaa 1440
cgtgcgctca tcgtgactga ccgcttcctg ttcaacaatg gttatgctga tcagatcact 1500
tccgtactga aagcagcagg cgttgaaact gaagtcttct tcgaagtaga agcggacccg 1560
accctgagca tcgttcgtaa aggtgcagaa ctggcaaact ccttcaaacc agacgtgatt 1620
atcgcgctgg gtggtggttc cccgatggac gccgcgaaga tcatgtgggt tatgtacgaa 1680
catccggaaa ctcacttcga agagctggcg ctgcgcttta tggatatccg taaacgtatc 1740
tacaagttcc cgaaaatggg cgtgaaagcg aaaatgatcg ctgtcaccac cacttctggt 1800
acaggttctg aagtcactcc gtttgcggtt gtaactgacg acgctactgg tcagaaatat 1860
ccgctggcag actatgcgct gactccggat atggcgattg tcgacgccaa cctggttatg 1920
gacatgccga agtccctgtg tgctttcggt ggtctggacg cagtaactca cgccatggaa 1980
gcttatgttt ctgtactggc atctgagttc tctgatggtc aggctctgca ggcactgaaa 2040
ctgctgaaag aatatctgcc agcgtcctac cacgaagggt ctaaaaatcc ggtagcgcgt 2100
gaacgtgttc acagtgcagc gactatcgcg ggtatcgcgt ttgcgaacgc cttcctgggt 2160
gtatgtcact caatggcgca caaactgggt tcccagttcc atattccgca cggtctggca 2220
aacgccctgc tgatttgtaa cgttattcgc tacaatgcga acgacaaccc gaccaagcag 2280
actgcattca gccagtatga ccgtccgcag gctcgccgtc gttatgctga aattgccgac 2340
cacttgggtc tgagcgcacc gggcgaccgt actgctgcta agatcgagaa actgctggca 2400
tggctggaaa cgctgaaagc tgaactgggt attccgaaat ctatccgtga agctggcgtt 2460
caggaagcag acttcctggc gaacgtggat aaactgtctg aagatgcatt cgatgaccag 2520
tgcaccggcg ctaacccgcg ttacccgctg atctccgagc tgaaacagat tctgctggat 2580
acctactacg gtcgtgatta tgtagaaggt gaaactgcag cgaagaaaga agctgctccg 2640
gctaaagctg agaaaaaagc gaaaaaatcc gcttaa 2676
<210> 8
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<222> （1）…（1203）
<223> 乙酸激酶基因ackA的核苷酸序列
<400> 8
atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcactgaa atttgccatc 60
atcgatgcag taaatggtga agagtacctt tctggtttag ccgaatgttt ccacctgccc 120
gaagcacgta tcaaatggaa aatggacggc aataaacagg aagcggcttt aggtgcaggc 180
gccgctcaca gcgaagcgct caactttatc gttaatacta ttctggcaca aaaaccagaa 240
ctgtctgcgc agctgactgc tatcggtcac cgtatcgtac acggcggcga aaagtatacc 300
agctccgtag tgatcgatga gtctgttatt cagggtatca aagatgcagc ttcttttgca 360
ccgctgcaca acccggctca cctgatcggt atcgaagaag ctctgaaatc tttcccacag 420
ctgaaagaca aaaacgttgc tgtatttgac accgcgttcc accagactat gccggaagag 480
tcttacctct acgccctgcc ttacaacctg tacaaagagc acggcatccg tcgttacggc 540
gcgcacggca ccagccactt ctatgtaacc caggaagcgg caaaaatgct gaacaaaccg 600
gtagaagaac tgaacatcat cacctgccac ctgggcaacg gtggttccgt ttctgctatc 660
cgcaacggta aatgcgttga cacctctatg ggcctgaccc cgctggaagg tctggtcatg 720
ggtacccgtt ctggtgatat cgatccggcg atcatcttcc acctgcacga caccctgggc 780
atgagcgttg acgcaatcaa caaactgctg accaaagagt ctggcctgct gggtctgacc 840
gaagtgacca gcgactgccg ctatgttgaa gacaactacg cgacgaaaga agacgcgaag 900
cgcgcaatgg acgtttactg ccaccgcctg gcgaaataca tcggtgccta cactgcgctg 960
atggatggtc gtctggacgc tgttgtattc actggtggta tcggtgaaaa tgccgcaatg 1020
gttcgtgaac tgtctctggg caaactgggc gtgctgggct ttgaagttga tcatgaacgc 1080
aacctggctg cacgtttcgg caaatctggt ttcatcaaca aagaaggtac ccgtcctgcg 1140
gtggttatcc caaccaacga agaactggtt atcgcgcaag acgcgagccg cctgactgcc 1200
tga 1203
<210> 9
<211> 1809
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<222> （1）…（1809）
<223> 延胡索酸还原酶基因frdA的核苷酸序列
<400> 9
gtgcaaacct ttcaagccga tcttgccatt gtaggcgccg gtggcgcggg attacgtgct 60
gcaattgctg ccgcgcaggc aaatccgaat gcaaaaatcg cactaatctc aaaagtatac 120
ccgatgcgta gccataccgt tgctgcagaa gggggctccg ccgctgtcgc gcaggatcat 180
gacagcttcg aatatcactt tcacgataca gtagcgggtg gcgactggtt gtgtgagcag 240
gatgtcgtgg attatttcgt ccaccactgc ccaaccgaaa tgacccaact ggaactgtgg 300
ggatgcccat ggagccgtcg cccggatggt agcgtcaacg tacgtcgctt cggcggcatg 360
aaaatcgagc gcacctggtt cgccgccgat aagaccggct tccatatgct gcacacgctg 420
ttccagacct ctctgcaatt cccgcagatc cagcgttttg acgaacattt cgtgctggat 480
attctggttg atgatggtca tgttcgcggc ctggtagcaa tgaacatgat ggaaggcacg 540
ctggtgcaga tccgtgctaa cgcggtcgtt atggctactg gcggtgcggg tcgcgtttat 600
cgttacaaca ccaacggcgg catcgttacc ggtgacggta tgggtatggc gctaagccac 660
ggcgttccgc tgcgtgacat ggaattcgtt cagtatcacc caaccggtct gccaggttcc 720
ggtatcctga tgaccgaagg ttgccgcggt gaaggcggta ttctggtcaa caaaaatggc 780
taccgttatc tgcaagatta cggcatgggc ccggaaactc cgctgggcga gccgaaaaac 840
aaatatatgg aactgggtcc acgcgacaaa gtctctcagg ccttctggca cgaatggcgt 900
aaaggcaaca ccatctccac gccgcgtggc gatgtggttt atctcgactt gcgtcacctc 960
ggcgagaaaa aactgcatga acgtctgccg ttcatctgcg aactggcgaa agcgtacgtt 1020
ggcgtcgatc cggttaaaga accgattccg gtacgtccga ccgcacacta caccatgggc 1080
ggtatcgaaa ccgatcagaa ctgtgaaacc cgcattaaag gtctgttcgc cgtgggtgaa 1140
tgttcctctg ttggtctgca cggtgcaaac cgtctgggtt ctaactccct ggcggaactg 1200
gtggtcttcg gccgtctggc cggtgaacaa gcgacagagc gtgcagcaac tgccggtaat 1260
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gttaaccagg atggcggcga aaactgggcg aagatccgcg acgaaatggg cctggctatg 1380
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gcagagctgc aggaacgctt caagcgcgtg cgcatcaccg acacttccag cgtgttcaac 1500
accgacctgc tctacaccat tgaactgggc cacggtctga acgttgctga atgtatggcg 1560
cactccgcaa tggcacgtaa agagtcccgc ggcgcgcacc agcgtctgga cgaaggttgc 1620
accgagcgtg acgacgtcaa cttcctcaaa cacaccctcg ccttccgcga tgctgatggc 1680
acgactcgcc tggagtacag cgacgtgaag attactacgc tgccgccagc taaacgcgtt 1740
tacggtggcg aagcggatgc agccgataag gcggaagcag ccaataagaa ggagaaggcg 1800
aatggctga 1809

Claims (3)

1.一株重组大肠杆菌，其特征在于：该菌株命名为Escherichia coli W-7/pETRABC-1，其基因型为：Escherichia coli str.K-12substr.W3110ΔgldAΔucpAΔldhAΔpoxBΔadhEΔackAΔfrdA/pETRABC-1；所述菌株为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，最适培养温度为37±1℃，可以在含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基上生长。
2.权利要求1所述重组大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于：所述菌株是以Escherichia coli str.K-12substr.W3110为出发菌株，外源表达阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM乙偶姻合成基因簇budRAB以及地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis DSM13 meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因budC；同时敲除内源具有2,3-丁二醇脱氢酶活性的甘油/1,2-丙二醇脱氢酶基因gldA和假定为氧化还原酶的基因ucpA；敲除副产物形成相关的乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸氧化酶基因poxB、乙醇脱氢酶基因adhE、乙酸激酶基因ackA和延胡索酸还原酶基因frdA制得。
3.权利要求1所述重组大肠杆菌菌株在生产光学纯meso-2,3-丁二醇中的应用。
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