CN101760498A - 混菌共发酵餐厨垃圾生产燃料乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种混菌共发酵餐厨垃圾原料生产燃料乙醇的新方法，其特征在于：1、分离筛选到一株同时具有淀粉酶和纤维素酶活性的米根霉菌株；2、仅以餐厨垃圾为原料，将该米根霉与酿酒酵母按一定比例混合进行共发酵生产燃料乙醇。该方法避免了在餐厨垃圾发酵生产燃料乙醇过程中由于酶失活而产生的原料不能水解，发酵液中葡萄糖匮乏，乙醇发酵不能完全进行的问题；发酵过程中无需添加任何催化剂及营养物，垃圾中淀粉、纤维素等大分子有机物的利用度高，降低了餐厨垃圾乙醇的生产成本，节约能源，所需设备简单，投资费用低，是一种新的，具有良好实用价值的厨余垃圾资源化途径。
Description
技术领域
本发明属于可再生能源制造领域，特别涉及一种以餐厨垃圾为原料发酵生产燃料乙醇的方法
背景技术
餐厨垃圾是指产生于餐饮经营与居民生活的食物加工下脚料(厨余)和食用残余(泔脚)。餐厨垃圾具有含水率高和有机质含量高的特点，不适于传统的焚烧、填埋方法处理；且由于其含盐量高，用于做堆肥原料受到很大的限制。因此，如何科学、合理地对餐厨垃圾进行处置和资源化利用已经成为亟待解决的问题，值得人们关注[1，2，3]。
乙醇是酒精燃料的主要成分，也是汽车可以使用的干净燃料之一。目前，国内外生产的燃料乙醇多是以粮食作为原料，对粮食的消耗较大，且生产成本较高。为降低成本，乙醇的生产应该采用非粮食原料或部分使用非粮食原料，研究利用各种废弃可再生资源，例如餐厨垃圾生产燃料乙醇具有环境保护及可再生能源开发的双重意义[1，2，3]。
目前研究利用餐厨垃圾生产燃料乙醇的工艺通常为采用酶水解后发酵工艺(SHF)和同步糖化发酵工艺(SSF)[4，5]。两者都要利用淀粉酶或纤维素酶的水解催化作用，使联结淀粉、纤维素分子的各化学键经液化、糖化工序，逐级水解为麦芽糖或葡萄糖，再通过酿酒酵母将餐厨垃圾中糖分发酵，转化成燃料乙醇。
其中，同步糖化发酵(SSF)工艺是在加酶对底物进行糖化作用的同时投加酿酒酵母菌种，使糖化和发酵同时进行。由于酶水解的产生的葡萄糖可以很快被酿酒酵母转化为乙醇，所以能在很大程度上解除产物对酶的反馈抑制作用，同时降低了基质浓度，省去了单独的酶催化水解处理原料的步骤，在工艺上要优于分步水解发酵工艺[6]。
但酶活性受环境影响较大，因此很难保证在发酵全过程中都具有较好的催化水解效果，若想达到垃圾原料充分利用的效果，则需要在发酵中进行酶的补加，这无疑会使发酵工艺复杂化，同时提高了发酵成本[7]。若采用将具有淀粉酶或纤维素酶活性的菌株与酿酒酵母混合进行共发酵的工艺，在发酵全过程中不断会有酶生成，避免了由于酶失活而产生的原料不能水解，发酵液中葡萄糖匮乏，乙醇发酵不能进行的问题；省去了发酵过程中补加酶液的步骤，在简化生产工艺的同时，降低了餐厨垃圾乙醇的生产成本，节约能源，提高了垃圾中淀粉、纤维素等大分子有机物的利用度，为难于处理的厨余垃圾寻找出一条种新的资源化途径。
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发明内容
技术问题：本发明主要提供了一种混菌共发酵餐厨垃圾原料生产燃料乙醇的新方法，解决了餐厨垃圾混菌发酵生产燃料乙醇的相关工艺问题，以提高垃圾原料利用率，降低燃料乙醇生产成本，简化发酵生产工艺。
技术方案：本发明为一种混菌共发酵餐厨垃圾原料生产燃料乙醇的方法，其特征在于该方法以餐厨垃圾为原料，通过以下步骤生产燃料乙醇：首先将餐厨垃圾分拣粉碎，加入3倍体积的水灭菌；然后接入10％酿酒酵母菌种子和5％的米根霉种子，25℃进行静置发酵96小时；接下来将发酵液离心，取上清液进行蒸馏，馏出液即为燃料乙醇。
本发明具有如下优点：采用将同时具有淀粉酶和纤维素酶活性的菌株与酿酒酵母混合进行共发酵的工艺，避免了在发酵全过程由于酶失活而产生的原料不能水解，发酵液中葡萄糖匮乏，乙醇发酵不能进行完全的问题；发酵过程中无需添加任何催化剂及营养物，垃圾中淀粉、纤维素等大分子有机物的利用度高，发酵残渣组分简单，可作直接为单细胞蛋白类饲料添加剂使用。在简化生产工艺的同时，降低了餐厨垃圾乙醇的生产成本，节约能源，所需设备简单，投资费用低，是一种新的，具有良好实用价值的厨余垃圾资源化途径。
附图说明
图1：本发明所提供餐厨垃圾原料生产乙醇方法的工艺流程；
图2：本发明筛选得到的米根霉菌株在纤维素-刚果红培养基表面生长菌落形态；
图3：本发明筛选得到的米根霉菌株在淀粉-无机盐培养基表面生长菌落形态。
具体实施方式
菌种的分离鉴定
收集酒厂发酵糟、及市售小曲样品若干，对不同种类的酒糟、曲药样品进行富集培养。稀释后采用平板稀释法分离法分离出的菌落接种于斜面试管，并进行初步形态学鉴定。
用生理盐水冲洗霉菌斜面试管培养物表面，获得的细胞悬浮液进行梯度稀释，选取合适梯度的稀释液分别涂布于纤维素-刚果红培养基表面和淀粉-无机盐培养基表面进行初筛，将初筛得到的既可以产生纤维素酶又可以产生淀粉酶的菌株分别用产酶培养基复筛，筛选出一株同时具有纤维素酶活性和淀粉酶活性的菌株。
将纯化的菌株划线接种于察氏和PDA培养基上，取无菌的盖玻片以45度角插入培养基中，30℃恒温培养，不定期观察菌落、菌丝以及孢子形态，并参考《真菌鉴定手册》对其进行形态学鉴定。经观察发现：该菌菌落稠密，最初呈白色，后变为褐色。菌丝匍匐爬行，无色；假根发达，分枝呈根状。孢囊梗直立多分支，与假根对生。囊轴卵圆形，淡褐色；孢子囊近球形，孢囊孢子椭圆形、呈黄灰色，直径5-8μm。
采用CTAB法提取该菌总DNA。以所得到的总DNA作为模板，依Takara Fungi Identi-fication PCR Kit进行26S rDNA D1/D2区域扩增。扩增完成后，取2μL于1％的琼脂糖凝胶上电泳检查，其余PCR扩增产物用UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)回收纯化，由上海生工生物工程技术有限公司进行序列测定。所得序列在Genbank上进行核苷酸序列相似性搜索比对，并结合形态学鉴定结果，初步判定其为米根霉(Rhizopus Oryzae)
垃圾原料的预处理
首先将收集的餐厨垃圾进行人工分拣，拣出如大块骨头等体积较大的块状物及金属物、塑料等不能做发酵原材料使用的物质；然后将垃圾打浆粉碎，并加入5％的氨水进行超声，对纤维素进行破晶处理。处理后的垃圾添加3倍体积的水进行高温灭菌，灭菌后即为发酵原液。
共发酵
本实验室保存的酿酒酵母菌株单克隆接入50ml YEPD液体培养活化培养24小时；按10％的接种量接入麦芽汁种子培养基培养24小时以获得酿酒酵母种子。无菌水冲洗米根霉斜面培养物获得孢子悬浮液，血球计数板对悬浮液中的孢子进行计数，在悬浮液中加入无菌水调整每毫升悬浮液中孢子的数目为106个，取5ml孢子悬浮液接入50ml PDA液体培养基活化培养24小时；按10％的接种量接入麦芽汁种子培养基培养24小时以获得米根霉种子。以发酵原液作为培养基，接入10％酿酒酵母种子和5％的米根霉种子，25℃进行静置发酵96小时。
乙醇提纯与检测
发酵液5000转/分钟离心10分钟，上清液取出后控制温度85℃-90℃之间进行蒸馏30分钟，气相色谱检测馏出液中乙醇的浓度及其他组分含量。气相色谱分析按如下条件进行：仪器为FULI 9790 II气相色谱仪，柱子：弹性石英毛细管柱，0.32×30m，固相支持物：聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-diethylene glycol succinate，DEGS)镀膜物：聚酰亚胺。载气：N2。气化室温度：250℃，柱温：80℃，尾吹：50ml/min，检测器：氢火焰离子化检测器。以色谱级无水乙醇为标准品，把上述馏出液样品，进行GC分析，上样量为5μl。色谱分析结果如表1所示。
表1餐厨垃圾混菌发酵馏出液及发酵液中乙醇的含量
| 编号 | 接入菌种及接种量 | 淀粉酶及纤维素酶 | 发酵液中乙醇的含量(％) |
| 1 | 酿酒酵母15％ | 未添加 | 4 |
| 2 | 米根霉15％ | 未添加 | 3 |
| 3 | 酿酒酵母7.5％+米根霉7.5％ | 未添加 | 7.5 |
| 4 | 酿酒酵母10％+米根霉5％ | 未添加 | 12 |
| 5 | 酿酒酵母12％+米根霉3％ | 未添加 | 9 |
| 6 | 酿酒酵母15％ | 添加 | 11 |
| 7 | 米根霉15％ | 添加 | 4.5 |
| 8 | 酿酒酵母7.5％+米根霉7.5％ | 添加 | 8 |
| 9 | 酿酒酵母10％+米根霉5％ | 添加 | 11.5 |
| 10 | 酿酒酵母12％+米根霉3％ | 添加 | 11.5 |
垃圾原液及发酵液糖类组分的检测
垃圾原料及发酵液中可溶性糖--还原糖含量测定采用比色-分光光度法方法测定；淀粉含量采用GB/T 5009.9-2003所列方法进行测定；纤维素含量采用GB 05009-10所列方法进行测定。
测定结果如表2所示。
表2垃圾原料及发酵液糖类组分含量(编号含义同表1)
| 编号 | 还原糖(mg/ml) | 总糖(mg/ml) | 淀粉(mg/ml) | 纤维素(mg/ml) |
| 1 | 0.5 | 3.0 | 2.4 | 5.7 |
| 2 | 1.2 | 3.0 | 1.1 | 2.7 |
| 3 | 0.6 | 0.8 | 0.1 | 2.7 |
| 4 | 0.3 | 0.5 | 0.1 | 2.7 |
| 5 | 0.3 | 0.6 | 0.3 | 2.7 |
| 6 | 0.3 | 0.4 | 0.2 | 2.1 |
| 编号 | 还原糖(mg/ml) | 总糖(mg/ml) | 淀粉(mg/ml) | 纤维素(mg/ml) |
| 7 | 0.4 | 0.6 | 0.1 | 2.4 |
| 8 | 0.4 | 0.7 | 0 | 2.3 |
| 9 | 0.2 | 0.3 | 0.1 | 2.0 |
| 10 | 0.2 | 0.6 | 0.2 | 2.1 |
| 发酵原液 | 2.9 | 4.1 | 1.2 | 6.8 |
Claims (5)
1.一种混菌共发酵餐厨垃圾原料生产燃料乙醇的新方法，其特征在于该方法为：
(1)分离筛选到一株同时具有淀粉酶和纤维素酶活性的米根霉菌株；
(2)按一定比例将酵母菌种子和的米根霉接入仅以餐厨垃圾为原料的培养基，25℃进行静置发酵96小时；发酵液离心后取上清液蒸馏得到燃料乙醇。
2.根据权利要求1所述的一种混菌共发酵餐厨垃圾原料生产燃料乙醇的新方法，其特征在于用于发酵的两株菌株为酿酒酵母和米根霉菌株。
3.根据权利要求1所述的一种混菌共发酵餐厨垃圾原料生产燃料乙醇的新方法，其特征在于仅使用餐厨垃圾作为发酵培养基原料。
4.根据权利要求1所述的一种混菌共发酵餐厨垃圾原料生产燃料乙醇的新方法，其特征在于静置发酵。
5.根据权利要求1所述的一种混菌共发酵餐厨垃圾原料生产燃料乙醇的新方法，其特征在于发酵温度为25℃，发酵时间为96小时。
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