CN102827782A

CN102827782A - 一株酿酒酵母菌及其在乙醇发酵中的应用

Info

Publication number: CN102827782A
Application number: CN2012102924556A
Authority: CN
Inventors: 董晓宇; 汪江伟; 袁玉莲
Original assignee: Dalian University
Current assignee: Dalian University
Priority date: 2012-08-16
Filing date: 2012-08-16
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2032-08-16
Also published as: CN102827782B

Abstract

本发明公开一株酿酒酵母，它涉及一种微生物。它从酵母浸粉中分离获得，应用于微生物转化葡萄糖生产乙醇，解决目前发酵过程中较高浓度葡萄糖抑制菌体生产乙醇能力的问题。菌株DL5168保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6184。本发明还公开了该菌株26S rDNAD₁/D₂区序列（SEQ ID NO.1），并且经序列比对证明该段序列与酿酒酵母26S rDNA D1/D2区序列同源性为100%。本发明的酿酒酵母DL5168发酵葡萄糖生产乙醇的最终浓度和转化率分别为112.9g/L和0.63g/g，比模式菌GGMCC No.2.604分别高出36%和37%。该菌在微生物生产乙醇方面具有良好应用前景。

Description

一株酿酒酵母菌及其在乙醇发酵中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株高产乙醇的酿酒酵母的筛选、鉴定和其在乙醇发酵中的应用。

背景技术

乙醇具有“绿色石油”和“液体黄金”之称，与石油相比，具有可再生、污染小、可减少温室效应等优点，是一种清洁能源。目前，乙醇的生产方法包括化学合成法和微生物发酵法。前者用石油裂解产生的乙烯与水合成乙醇，随着石油资源的日益枯竭，乙醇的这一合成方法也受到限制。微生物发酵生产乙醇，利用可再生资源作为发酵底物，具有绿色环保的优点，因此，该方法在未来更具有发展前景。

酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）是工业上生产乙醇的重要菌株，能发酵葡萄糖生产乙醇。然而在发酵过程中，高浓度底物（葡萄糖）和高浓度产物（乙醇）都会抑制酿酒酵母菌的生长和乙醇生成，导致乙醇产量和转化率不高。因此，对野生型酿酒酵母菌株的分离、筛选和鉴定，以期获得具有遗传性状稳定、耐受高浓度底物和产物抑制、又高产乙醇的酿酒酵母菌，是非常必要的。

发明内容

本发明目的是提供一株酿酒酵母菌，并应用于高浓度底物（葡萄糖）发酵生产乙醇过程中，提高乙醇产量。

本发明所公开的酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）DL5168是从酵母粉中分离得到的，其保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏日期为2012年6月1日，保藏号为CGMCCNo.6184，属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，半子囊菌纲Hemiascomycetes，酵母目Saccharomycetales，酵母科Saccharomycetaceae，酵母属Saccharomyces。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明酿酒酵母菌DL5168（CGMCC No.6184）首先经TTC琼脂培养基初筛，30℃培养2d后，挑选菌落红色最深的一株菌，接种到YPD液体培养基中培养24h，无菌水稀释10^-5倍，涂布于WL琼脂培养基，30℃培养5d后观察，筛选出一株颜色为奶油色，稍带绿色，球形突起的、表面光滑、不透明、奶油状的菌株；在赖氨酸培养基上培养15d不能生长，说明DL5168菌株不能采用赖氨酸作为氮源，这与模式菌GGMCC No.2.604一致。

本发明酿酒酵母菌DL5168（CGMCC No.6184）细胞学形态观察为单个或成对，椭圆形，大小为9.8±0.24～7.8±0.24，繁殖方式为芽殖；与模式菌GGMCC No.2.604细胞学形态不同之处在于，模式菌GGMCC No.2.604细胞大小较小，为7.9±0.17～7.2±0.11。

本发明酿酒酵母菌DL5168（CGMCC No.6184）群体学形态观察，即单一菌落观察：通过对YPD琼脂平板上生长的酿酒酵母菌DL5168和模式菌GGMCC No.2.604两株菌菌落形态观察发现，生长3-5d的两株菌落形态没有很大区别，但培养15天后的巨大菌落形态观察发现，DL5168菌落为圆形，边缘整齐，中心有明显的突起，菌落颜色中心处乳白色，四周逐渐变浅，趋于透明。模式菌GGMCC No.2.604菌落亦为圆形，边缘整齐，中心有明显的突起，菌落为乳白色，不同之处在于菌落透明度较差，质地光滑湿润，较厚。两株菌菌落大小有明显区别，DL5168菌株其菌落直径可达到18cm，而模式菌GGMCC No.2.604菌落直径仅能达到15cm。

本发明酿酒酵母菌DL5168（CGMCC No.6184）糖发酵鉴定结果表明，DL5168菌株对葡萄糖和果糖的发酵产气泡速度最快，半乳糖和蔗糖次之，棉籽糖和可溶性淀粉发酵产气泡速度较为缓慢，对乳糖和木糖不发酵，这与模式菌GGMCC No.2.604发酵结果一致；碳同化实验比较表明，DL5168菌株可以同化葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖，对柠檬酸和可溶性淀粉呈现弱阳性，不能同化木糖、乳糖和肌醇，模式菌GGMCC No.2.604除了不能同化柠檬酸，其它结果与DL5168一致；氮源同化实验表明，DL5168菌株可以同化硝酸钠和硫酸铵，不能同化亚硝酸钠和L-赖氨酸，模式菌GGMCC No.2.604不能同化亚硝酸钠和L-赖氨酸，对硝酸钠和硫酸铵呈现弱阳性。

本发明酿酒酵母菌DL5168（CGMCC No.6184）通过26S rDNA D1/D2区基因序列测序（SEQ ID NO.1）并通过在线软件进行比对分析，与其亲缘关系最近的种属是酵母属酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），相似性为100%，结合菌株筛选、细胞形态特征，菌落形态特征、糖发酵、生理生化鉴定结果分析，确定其为酵母属酿酒酵母菌，命名为酿酒酵母菌DL5168（Saccharomyces cerevisiae）。

本发明还公开了酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）DL5168在发酵乙醇中的应用。经优化实验，确定DL5168最适发酵温度30℃，最适底物浓度180g/L。在优化温度和底物浓度下摇瓶发酵，发酵8h至16h之间，DL5168菌株生长快于模式菌GGMCC No.2.604，16h之后GGMCC No.2.604生长快于DL5168，发酵结束时，DL5168的OD值为14.8，低于GGMCC No.2.604的OD值15.8。发酵终期，DL5168乙醇浓度为112.9g/L，比GGMCC No.2.604菌株的乙醇浓度提高36%。这些结果表明，本发明所筛选分离出的菌株DL5168单位细胞生产乙醇的能力高于模式菌GGMCC No.2.604。本发明酿酒酵母DL5168（CGMCC No.6184）在微生物发酵生产燃料乙醇方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是酿酒酵母菌在TTC培养基上的菌落形态。菌株编号为DL1~11号，其中菌落DL9颜色（红色）最深（说明该菌生产乙醇的能力较强），将其用于进一步复筛。

图2是初筛所得菌落DL9在WL培养基上复筛的菌落形态。将菌株DL9在2%葡萄糖YPD培养液中30℃培养24h，然后涂布于WL培养基上，30℃培养5d，培养基上菌落编号为DL9-1~DL9-7，其中菌株DL9-7菌落形态较大，球形突起、表面光滑、不透明、绿色奶油状，命名为酿酒酵母菌DL5168（CGMCCNO.6184）。

图3是菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604在赖氨酸琼脂培养基上生长15d的状况。酿酒酵母不能采用赖氨酸作为酵母氮源，因而在赖氨酸培养基上不能生长。由图3可知，赖氨酸琼脂培养基上均没有任何菌体生长，证明菌株DL5168不能采用赖氨酸作为氮源，这与模式菌GGMCC No.2.604一致。

图4是菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604在油镜下的细胞形态。显微镜形态观察表明，两菌株细胞形态均为圆形或椭圆形，单个或成对，繁殖方式为出芽生殖。经测量，菌株DL5168细胞大小为9.8±0.24～7.8±0.24μm，大于模式菌GGMCC No.2.604细胞大小（7.9±0.17～7.2±0.11μm）。

图5是菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604培养15d菌落形态。菌株DL5168菌落为圆形，边缘整齐，中心有明显突起，菌落颜色中心处乳白色，四周逐渐变浅，趋于透明。模式菌GGMCC No.2.604菌落亦为圆形，边缘整齐，中心有明显的突起，菌落为乳白色，不同之处在于菌落透明度较差，质地光滑湿润，较厚。两株菌落大小有明显区别，DL5168菌株其菌落直径可达到18cm，而模式菌GGMCC No.2.604菌落直径仅能达到15cm。

图6是菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604摇瓶发酵动力学比较。摇瓶发酵8h至16h之间，DL5168菌株生长快于模式菌GGMCC No.2.604，16h之后GGMCC No.2.604生长快于菌株DL5168，发酵结束时，菌株DL5168的OD值为14.8，略低于GGMCC No.2.604的OD值（15.8）。但是，发酵终期菌株DL5168乙醇浓度为112.9g/L，比GGMCC No.2.604菌株的乙醇浓度提高36%。这些结果表明，本发明所筛选分离出的菌株DL5168单位细胞生成乙醇的能力高于模式菌GGMCC No.2.604。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下列培养基配置方法均为本领域技术人员的常规操作技术。本发明实施例中所述及的分离、培养、筛选细菌的方法也为本领域技术人员的常规操作技术。

培养基的配制（w/v）：配制下述培养基中，所述的自然pH值是指配完培养基不用调节pH即可使用。

（1）YPD种子培养液

酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%；

若配制YPD种子固体培养基，则再向YPD种子培养液中加入2%琼脂粉，蒸馏水配制1L，自然pH值，0.1Mpa灭菌20min。

（2）YPD发酵培养基

酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖18%，蒸馏水配制1L，pH=7.0，0.1Mpa灭菌20min。

（3）TTC培养基

下层培养基：葡萄糖3%，琼脂2%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，蒸馏水配制1L；

上层培养基：葡萄糖0.5%，琼脂2%，TTC0.05%，蒸馏水配制1L；

0.1Mpa灭菌20min。

（4）WL琼脂培养基

酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，琼脂2%，磷酸二氢钾0.055%，氯化钾0.0425%，氯化钙0.0125%，氯化铁0.00025%，硫酸镁0.0125%，硫酸锰0.00025%，溴甲酚绿0.0022%。蒸馏水配制1L，pH=6.5，0.1Mpa灭菌20min。

（5）赖氨酸培养基

溶液A：硼酸0.01%，硫酸锌0.04%，钼酸铵0.002%，硫酸锰0.004%，硫酸亚铁0.025%，加水至1L。

溶液B：葡萄糖5%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.2%，氯化钙0.02%，氯化钠0.01%，腺嘌呤0.0002%，DL-蛋氨酸0.0001%，L-组氨酸0.0001%，DL-色氨酸0.0001%，溶液A1mL，乳酸钾（50%v/v）12g，琼脂2%，加水至1L，以乳酸调pH至5.0~5.5。

溶液C：L-赖氨酸1%，加水1L。

溶液D：肌醇0.2%，泛酸钙0.02%，盐酸硫胺素0.004%，吡哆醇0.004%，对氨基苯甲酸0.002%，烟碱酸0.004%，核黄素0.004%，生物素0.00002%，叶酸0.00001%，加水1L。

上述溶液灭菌后在45~50℃下按照B：C：D的体积比98：1：1混合，倒入培养皿中制成平板，在37℃下保温过夜备用。

（6）糖发酵基础培养基

12.5%豆芽汁培养基：黄豆芽125g加水1L，煮沸0.5h，过滤后补充蒸馏水至1L，即制成12.5%豆芽汁。

按每100mL12.5%豆芽汁加入2%待测糖，即为糖发酵培养基，0.1MPa灭菌20min。

（7）同化碳源基础培养基

硫酸铵0.5%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，酵母膏0.02%，琼脂2%，蒸馏水配制1L，过滤后分装试管，0.1MPa灭菌20min。

加入不同待测碳源即为同化碳源培养基，待测碳源浓度为2%（m/v）。

（8）同化氮源基础培养基

葡萄糖2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，酵母膏0.02%，琼脂2%，蒸馏水配制1L，过滤后分装试管，0.1MPa灭菌20min。

加入不同待测氮源即为同化氮源培养基，待测氮源浓度为0.5%（m/v）。

实施例1酵母菌的分离

1.菌种

实施例中所述菌种，分离自酵母浸粉（北京奥博星生物技术有限责任公司）。

对照菌为酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）GGMCC No.2.604，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。

2.取0.05g酵母浸粉加入到已灭菌的9mL YPD种子培养液中，30℃、170rpm培养24h，增菌，再转入酒精浓度为10%（w/v）的YPD种子培养液中，30℃、170rpm培养24h，再转入酒精浓度为18%（w/v）的YPD种子培养液中，30℃、170rpm培养72h，镜检，有无活菌存在，若有则取1mL,接入YPD种子固体培养基中，30℃培养2-3d，待长出菌落后，选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步划线分离2-3次，经镜检为纯种后分别转入YPD种子固体培养基上，4℃保存。

实施例2菌株DL5168的筛选

（1）TTC琼脂培养基初筛酿酒酵母菌

将上述YPD种子固体培养基上的酵母菌活化，然后接入YPD种子培养液中，30℃、170rpm培养24h，涂布于TTC上层培养基上，30℃培养48h，直至菌落出现，肉眼可见。然后倒入融化的TTC上层培养基，在30℃培养3h使无色的TTC上层培养基被活细胞内的脱氢酶还原，变成红色。脱氢酶活性与红色的深度成正比，而脱氢酶活性又与菌落的乙醇生产能力密切相关。因此，从DL1~11号菌落中挑选出培养基上菌落红色最深，形态最好的菌落DL9（如图1所示），进一步复筛。

（2）WL琼脂培养基复筛酿酒酵母菌

将初筛得到的菌株DL9在YPD种子培养液中活化培养24h，然后涂布于WL琼脂培养基上，30℃培养5d，观察菌落形态，菌落DL9-1~DL9-7中挑选得到一株菌落形态较大，球形突起、表面光滑、不透明、绿色奶油状的菌株DL9-7（如图2所示），命名为酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）DL5168；并在2012年6月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏编号为GGMCCNo.6184。下文为方便描述，简称菌株DL5168。

（3）赖氨酸培养基属内鉴定

酿酒酵母菌不能采用赖氨酸作为酵母氮源，因而在赖氨酸培养基上不能生长。将菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604，分别接种于YPD种子培养液中，30℃、170rpm培养24h，按照1%接种量接种于5mL无菌生理盐水中进行饥饿处理，7d后接种至赖氨酸培养基中，30℃静置培养15d，结果如图3所示，菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604的培养基上均无菌落生长，进一步证明我们所分离的菌株DL5168是酿酒酵母。

实施例3菌株DL5168形态学观察

（1）菌株DL5168细胞形态观察

取在YPD种子固体培养基上保存的菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604，分别接种于YPD种子培养液中，30℃、170rpm培养24h，分别观察其形态及繁殖方式，并分别测量其菌体大小。图4是菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604在油镜下的细胞形态。显微镜形态观察表明，两菌株细胞形态均为圆形或椭圆形，单个或成对，繁殖方式为出芽生殖。经测量，菌株DL5168细胞大小为9.8±0.24～7.8±0.24μm，大于模式菌GGMCC No.2.604细胞大小（7.9±0.17～7.2±0.11μm）。观察结果总结如表1所示。

表1菌株DL5168和GGMCC NO.2.604细胞学形态比较

菌种	形态	大小（μm）	繁殖方式
				DL5168	单个或成对，椭圆形	9.8±0.24～7.8±0.24	芽殖
GGMCC NO.2.604	单个或成对，圆形或椭圆形	7.9±0.17～7.2±0.11	芽殖

（2）菌株DL5168群体形态观察

将（1）中所述DL5168菌液和模式菌GGMCC No.2.604，分别涂布于YPD种子固体培养基上，30℃下静置培养15d，观察巨大菌落形态，如图5所示。菌株DL5168菌落为圆形，边缘整齐，中心有明显突起，菌落中心处乳白色，四周逐渐变浅，趋于透明。模式菌GGMCC No.2.604菌落亦为圆形，边缘整齐，中心有明显突起，菌落为乳白色，不同之处在于模式菌菌落透明度较差，质地光滑湿润，较厚。两株菌落大小有明显区别，菌株DL5168菌落直径可达到18cm，而模式菌GGMCC No.2.604菌落直径仅能达到15cm，上述观察结果总结如表2所示。

表2菌株DL5168和GGMCC NO.2.604菌落比较

实施例4菌株DL5168生理生化鉴定

（1）糖发酵鉴定：

取洁净的试管，分别加入待测糖浓度为2%的糖发酵培养基4mL，待测糖包括葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖和可溶性淀粉，并于每支试管内放入一倒置的小套管，试管口加棉花塞，包扎后高压灭菌备用。将实施例2（1）中获得的酵母菌培养液按1%接种量分别接种于各组含糖试管中，置30℃培养箱内静置培养，观察小套管内有无气泡产生和气泡产生的快慢。有气泡存在则表明菌株DL5168可发酵该种糖类，否则不可发酵该种糖类。气泡出现的快，说明菌株DL5168对该糖的发酵能力强。模式菌GGMCC No.2.604作为对照组，与菌株DL5168所做实验相同。实验结果如表3所示，菌株DL5168发酵糖类产气实验与模式菌GGMCC No.2.604实验结果一致，对葡萄糖和果糖的发酵速度最快，半乳糖和蔗糖次之，棉籽糖和可溶性淀粉发酵速度较为缓慢，对木糖和乳糖不发酵。

表3菌株DL5168和GGMCC NO.2.604杜氏管发酵糖类产气试验

注：+：发酵；-：不发酵；-+：发酵但不产气；+(0)：发酵产气泡且慢；++：发酵产气泡；+++：发酵产气泡多且快

（2）碳源同化鉴定

同化碳源基础培养基中分别加入经滤菌处理的待测碳源制成同化碳源培养基，使待测碳源浓度为2%；待测碳源有葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、棉籽糖、肌醇、柠檬酸、可溶性淀粉。若待测碳源为有机酸，可将其加入至同化碳源基础培养基后，用0.1M NaOH调pH值至5.7后灭菌；其它同化碳源培养基用盐酸调pH值至5.7。取在实施例2中的YPD种子固体培养基上保存的菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604，分别接种于YPD种子培养液中，30℃、170rpm培养24h，发酵液经无菌生理盐水稀释10^-5倍后，分别涂布于同化碳源培养基上。30℃静置培养5d后，观察菌落生长情况，阴性对照为不含碳源的基础培养基。碳源同化鉴定结果如表4所示。

表4菌株DL5168和GGMCC NO.2.604同化碳源试验比较

注：+：阳性；-：阴性；-+：弱阳性

DL5168菌株可以同化葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖，对柠檬酸和可溶性淀粉呈现弱阳性，不能同化木糖、乳糖和肌醇，模式菌GGMCC No.2.604除了不能同化柠檬酸，其它结果与DL5168一致。

（3）氮源同化鉴定

同化氮源基础培养基中分别加入0.5%的硝酸钠、硫酸铵、亚硝酸钠、L-赖氨酸，灭菌制成同化碳源培养基。取在YPD种子固体培养基上保存的菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604，分别接种于YPD种子培养液中，30℃、170rpm培养24h，发酵液经无菌生理盐水稀释10-5倍后，分别涂布于同化氮源培养基上。30℃静置培养5d后，观察菌落生长情况，阴性对照中不加相应的氮源。氮源同化鉴定结果如表5所示，DL5168菌株可以同化硝酸钠和硫酸铵，不能同化亚硝酸钠和L-赖氨酸，模式菌GGMCC No.2.604不能同化亚硝酸钠和L-赖氨酸，对硝酸钠和硫酸铵呈现弱阳性。这些结果说明两株酵母菌均不能利用亚硝酸钠盐和L-赖氨酸作为氮源进行生长，但对硝酸盐的利用能力有所不同。

表5菌株DL5168和GGMCC NO.2.604氮源同化比较

菌株	硝酸钠	硫酸铵	亚硝酸钠	L-赖氨酸
					DL5168	+	+	-	-
GGMCC NO.2.604	-+	-+	-	-

注：+：阳性；-：阴性；-+：弱阳性

实施例526S rDNA D1/D2区域基因序列分析

分子测序：宝生物公司进行序列测定。

序列分析：测序结果查询GenBank数据库，使用Blast在线软件进行相似性分析。

真菌基因组中26S rDNAD₁/D₂区序列适合于真菌鉴定，用于亲缘关系较近的菌株之间的分类研究。对所筛选的菌株DL5168进行26S rDNA片段D₁/D₂区序列测定，其测序结果如SEQ ID NO.1，再通过使用Blast在线软件进行相似性分析，如表6所示，与表中所列酿酒酵母菌26S rDNAD1/D2区具有高度同源性，序列同源性为100%。这进一步从分子生物学角度确定本发明所分离的菌株DL5168为酿酒酵母菌。

表6菌株DL5168与模式菌株Saccharomyces cerevisiae D1/D2序列同源性比较

模式菌株	序列同源性
		Saccharomyces cerevisiae D3C	100%
Saccharomyces cerevisiae D3A	100%

Saccharomyces cerevisiae C2M	100%
		Saccharomyces cerevisiae YJM789	100%
Saccharomyces cerevisiae T	100%
		Saccharomyces cerevisiae TA337	100%
Saccharomyces cerevisiae BJ103	100%
		Saccharomyces cerevisiae D3.1	100%
Saccharomyces cerevisiae L8.9	100%
		Saccharomyces cerevisiae L6.10	100%
Saccharomyces cerevisiae L6.6	100%
		Saccharomyces cerevisiae L9.5	100%
Saccharomyces cerevisiae L1.12	100%
		Saccharomyces cerevisiae L6.14	100%
Saccharomyces cerevisiae L7.19	100%
		Saccharomyces cerevisiae L7.20	100%
Saccharomyces cerevisiae L6.3	100%
		Saccharomyces cerevisiae130	100%

实施例6菌株DL5168发酵温度和底物浓度优化

（1）菌株DL5168发酵温度优化

将菌株DL5168划线至YPD种子固体培养基上，30℃静置培养24h，挑一环菌至YPD种子培养液中，30℃，170rpm培养至对数生长期，按10%（v/v）接种量接入YPD发酵培养基中，170rpm，培养24h，培养温度分别为30℃，40℃，通过721分光光度计检测两株菌在600nm处的菌体密度（OD₆₀₀）、利用3,5-二硝基水杨酸比色法测定剩余葡萄糖浓度、采用GB-14B型气相色谱仪测定乙醇浓度。结果如表7所示。

表7菌株DL5168在不同发酵温度下乙醇发酵情况

发酵温度（℃）	30	40
			消耗葡萄糖（g/L)	179.6	120
乙醇浓度（g/L）	113.8	68.4
			转化率（g/g）	0.63	0.57

结果表明，菌株DL5168在发酵温度为30℃时，乙醇浓度为113.8g/L，转化率为0.63g/g，比发酵温度40℃条件下分别提高66%和11%，这一结果说明菌株DL5168最适的发酵温度为30℃。

（2）菌株DL5168发酵底物浓度优化

将菌株DL5168划线至YPD种子固体培养基上，30℃静置培养24h，挑一环菌至YPD种子培养液中，30℃，170rpm培养至对数生长期，按10%（v/v）接种量接入YPD发酵培养基中，170rpm，培养24h，培养温度30℃，YPD发酵培养基中葡萄糖浓度分别为100g/L、180g/L和300g/L。通过721分光光度计检测两株菌在600nm处的菌体密度（OD₆₀₀）、利用3,5-二硝基水杨酸比色法测定剩余葡萄糖浓度、采用GB-14B型气相色谱仪测定乙醇浓度。结果如表8所示。

表8菌株DL5168在不同葡萄糖浓度下乙醇发酵情况

葡萄糖浓度（g/L)	消耗葡萄糖（g/L)	乙醇浓度（g/L）	转化率（g/g）
				100	97.2	46.5	0.48
180	178.6	114.3	0.64
				300	241	91.2	0.38

结果表明，葡萄糖初始浓度为180g/L条件下，发酵24h时，乙醇的浓度最高，达到114.3g/L；乙醇转化率最高，达到0.64g/g，这一结果说明菌株DL5168发酵的最适葡萄糖初始浓度为180g/L。

实施例7菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604在优化条件下摇瓶发酵比较

将菌株DL5168和模式菌GGMCC No.2.604分别划线至YPD种子固体培养基上，30℃静置培养24h，挑一环菌至YPD种子培养液中，30℃，170rpm培养至对数生长期，按10%（v/v）接种量接入YPD发酵培养基中（葡萄糖含量18%），30℃，170rpm，培养24h，通过721分光光度计检测两株菌在600nm处的菌体密度（OD₆₀₀）、利用3,5-二硝基水杨酸比色法测定剩余葡萄糖浓度、采用GB-14B型气相色谱仪测定乙醇浓度，结果如图6所示。

由图6可知，摇瓶发酵8h至16h之间，DL5168菌株生长快于模式菌GGMCC No.2.604，16h之后GGMCC No.2.604生长快于菌株DL5168，发酵结束时，菌株DL5168的OD值为14.8，略低于GGMCC No.2.604的OD值（15.8）。但是，发酵终期菌株DL5168乙醇浓度为112.9g/L，比GGMCC No.2.604菌株的乙醇浓度提高36%；乙醇转化率为0.63g/g，比对照提高37%。。这些结果表明，本发明所筛选分离出的菌株DL5168单位细胞生产乙醇的能力高于模式菌GGMCC No.2.604。

Claims

1.一株酿酒酵母菌，该菌株为酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）DL5168，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为GGMCC No.6184。

2.如权利要求1所述的酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）DL5168在发酵乙醇中的应用。