JPH0646849A - キチナーゼ、キチナーゼ遺伝子及びキチナーゼの製法 - Google Patents
キチナーゼ、キチナーゼ遺伝子及びキチナーゼの製法Info
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- JPH0646849A JPH0646849A JP20142792A JP20142792A JPH0646849A JP H0646849 A JPH0646849 A JP H0646849A JP 20142792 A JP20142792 A JP 20142792A JP 20142792 A JP20142792 A JP 20142792A JP H0646849 A JPH0646849 A JP H0646849A
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Abstract
伝子を単離し、さらに、この遺伝子を用いて糸状菌キチ
ナーゼを生産する。 【構成】 リゾプス・オリゴスポラスから新規キチナー
ゼを精製し、この遺伝子を単離し、この遺伝子を用いて
酵母で前記キチナーゼを生産させる。さらに前記遺伝子
を用いて、リゾプス・ニベウスからキチナーゼ遺伝子を
単離する。
Description
ゼ遺伝子、キチナーゼ遺伝子を有する酵母及びキチナー
ゼの製造方法に関する。
存在する。例えば、トマトでは、(葉カビ)Cladospori
um fulvum,(灰色カビ)Botrytis cinerea等が病原菌
として知られている。
主要成分の一つとしてキチンを有している。キチンは、
N−アセチルグルコサミンのβ−グルコシド結合による
重合体であり、キチナーゼ(EC 3.2.1.14)により加水分
解される。
ーゼを生産する。この糸状菌キチナーゼは、菌糸の先端
生長あるいは分岐に重要な役割を果しているのではない
かと推測されてきた。すなわち、菌糸先端部分で細胞壁
のキチンの分解と合成がバランス良く行われることによ
って菌糸は先端生長し、また先端より後方のすでに結晶
化し硬い構造となった細胞壁にキチナーゼなどの分解酵
素が作用することによってこれを柔らかくし、菌糸が分
岐生長するのを助けるという考えである。酵母Saccharo
myces cerevisiaeにおいては、キチナーゼ遺伝子の遺伝
子破壊による実験から、細胞が分裂する際キチナーゼ活
性が必要であることが、最近示されている。
があり、菌糸の伸長にキチナーゼは不要であるという説
もあり、キチナーゼの機能については推測の域を脱し得
ないのが現状である。しかし、Aspergillus nidulansで
は細胞壁にキチナーゼ活性が検出されること(107)、ま
たMucor mucedoなどではキチナーゼがキチン合成酵素と
同様膜画分に不活性型として存在すること等から、糸状
菌キチナーゼが糸状菌自身の細胞壁中のキチンを分解す
るためのものであることは論を待たない。
り、これが病原菌に対する防御機構として機能している
と考えられている。この観点から、植物の病原菌に対す
る防御機構の強化を目的として、バクテリア由来のキチ
ナーゼ遺伝子の植物への導入が試みられているが、この
ような目的には抗糸状菌活性の高い糸状菌のキチナーゼ
を利用した方が、より効果的であると考えられる。
子を植物の防御機構として応用するためには、その遺伝
子が必要であるが、糸状菌のキチナーゼは活性としては
知られているのみであり、遺伝子が単離されていないば
かりか、タンパクとしての性質もほとんど知られていな
い。したがって、糸状菌キチナーゼに関する研究を行う
ためにも、糸状菌キチナーゼを容易に得られる手段が望
まれる。
り、精製された糸状菌のキチナーゼを得、その遺伝子を
単離し、さらに、この遺伝子を用いて糸状菌キチナーゼ
を生産することを課題とする。
解決するために、糸状菌キチナーゼを精製して一部の構
造を決定し、これを基にキチナーゼ遺伝子を単離するこ
とに成功し、本発明に至った。
のキチナーゼ、このキチナーゼ遺伝子、及びこのキチナ
ーゼ遺伝子を有する酵母、さらにキチナーゼ遺伝子を有
する酵母を培養し、この培養上清からキチナーゼを取り
出すことを特徴とするキチナーゼの製造方法である。
とによっても得られるが、キチナーゼ生産菌からキチナ
ーゼ遺伝子を単離し、これをベクターに組み込み、でき
たプラスミドを微生物に導入し、得られた形質転換体を
培養することによっても得られる。
は、キチナーゼ生産菌を培養し、培養液から、イオン交
換、ゲル濾過等のクロマトグラフィー、硫安塩析、有機
溶媒沈澱等により精製すればよい。キチナーゼの精製法
として、リゾプス属の糸状菌から精製する方法を後述の
実施例に示した。
スからは2種のキチナーゼが得られ、分子量の小さいも
のをキチナーゼ1、大きいものをキチナーゼ2と命名し
た。精製において、酵素画分の検出は、例えば酵素活性
を測定することにより行う。酵素活性の測定法として、
コロイダルキチンを用いた方法を以下に例示する。
拌しながらゆっくりと加える。徐々に温度を上げ、37
℃まで加温し、キチンを溶解させる。溶けきらなかった
キチンは、ガラスフィルターで濾過して除く。濾液を4
℃で、水に攪拌しながら徐々に加え、キチンが再沈澱
し、溶液が白く濁ってからさらに攪拌した後、攪拌をや
め、一晩4℃に静置する。
加え攪拌し、これを遠心、洗滌して上清のpHが中性にな
るまで繰り返し、再び水に懸濁し、これをコロイダルキ
チン溶液とする。
した後、可溶性となった糖をReissig法を用いて定量す
ることによってキチナーゼ活性を測定する。酵素溶液、
コロイダルキチン溶液、McIlvaine緩衝液(61mM クエン
酸、77mM Na2HPO4、pH4.0)を混合し、37℃、2時間
保温する。5000rpmで5分間遠心した後、試験管
内で上清を、KOHでpHを10.2に調整した0.8M ホウ
酸カリウム水溶液と混合し、アルミキャップで蓋をした
後、沸騰湯浴中に3分間保ち加温する。
ノベンツアルデヒド(DMAB)試薬を加え混合した後、37
℃に20分間保ち、585nmの吸収を測定する。DMAB
試薬としては、DMABを10%(v/v)の濃塩酸を含む氷酢
酸に溶かし、4℃に保存しておき、使用直前に氷酢酸で
10倍に希釈したものを使用する。
性、分子量、アミノ酸配列等の構造、反応至適pH、熱
安定性等を調べることにより行う。基質特異性は、例え
ば、キチンを酵素分解してできる反応生産物の解析や、
N,N'-ジアセチルキトビオースあるいはN,N',N''-トリア
セチルキトトリオースを基質として酵素反応を行い、反
応の有無により調べることができる。分子量は、SDS
−PAGE(SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動)
やゲル濾過等により測定することができる。また、アミ
ノ酸配列は、エドマン分解やカルボキシペプチダーゼ等
の反応を利用した常法により決定することができる。反
応至適pHは、異なるpH条件下で酵素活性を比較する
ことにより、熱安定性は、一定条件下で熱処理を行った
後の酵素の残存活性を比較することにより測定する。
ゴスポラスの生産する2種のキチナーゼの性質を以下に
示す。 (キチナーゼ1) (1)キチンのβ−1,4グリコシド結合を切断する活性
を有し、β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を実
質的に有しない。 (2)SDS−PAGEにより決定した分子量:約50,
000(糖鎖を除去した分子量:約4,4500) (3)熱安定性:pH4、60℃、10分間の熱処理後の
残存活性70〜75% (4)至適pH:4.0付近 (5)成熟酵素のN末端30アミノ酸の配列は、配列番号
1で表される。
を有し、β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を実
質的に有しない。 (2)SDS−PAGEにより決定した分子量:約52,
000(糖鎖を除去した分子量:約4,6500) (3)熱安定性:pH4、60℃、10分間の熱処理後の
残存活性55〜60% (4)至適pH:3.5付近 (5)成熟酵素のN末端30アミノ酸の配列は、配列番号
2で表される。
5において1〜518のアミノ酸番号で表されるアミノ
酸配列を有し、キチナーゼ2成熟酵素は、配列番号6に
おいて1〜525のアミノ酸番号で表されるアミノ酸配
列を有すると推定される。
法を使用することができる。例えば、酵素を精製し、ア
ミノ酸配列を決定し、この配列をもとに合成オリゴヌク
レオチドプローブを作製し、ハイブリダイゼーションに
より遺伝子ライブラリーから選択する。
ションの方法は、各操作に使用する市販の酵素、コンピ
テントセルに添付されている説明書に記載されている。
また、これらの操作、遺伝子の塩基配列の決定、ハイブ
リダイゼーション等一般の遺伝子組換えに必要な方法
は、Molecular cloning (Maniatis T. et al. Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press)に記載されている。
数のクローンから得られる断片を繋ぎ代えることによ
り、全長を有する配列を得ることができる。遺伝子クロ
ーニングに先だって、サザン・ブロッティング等により
解析を行っておくと、遺伝子の同定等がしやすい。
から得られた2種のキチナーゼ遺伝子、及びリゾプス・
ニベウスから得られた4種のキチナーゼ遺伝子の配列
を、配列表の配列番号5〜10に示した。
ター系に導入する。宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵
母、糸状菌、培養細胞等を挙げることができるが、ベク
ターの安定性、活性を有する形での発現、あるいは菌体
外生産の可否等を考慮すると、酵母が好ましい。
シエ(Sacchromyces cerevisiae) EH13−4、SHY
3、D13−1A、MC16等の株を挙げることができ
る。これらの菌株は栄養要求性変異を有するので、それ
らの変異を相補する遺伝子を酵母中で複製可能なプラス
ミドに組み込むことにより、ベクターを作製することが
できる。
求する。この要求性を相補する遺伝子をプラスミドにの
せて酵母に入れたとき、ロイシン非要求性となったもの
は、一般にこのプラスミドを保持していると考えられ
る。
いわゆるYIp、YRp、YEp、YCpのいずれのタイプも使用す
ることができるが、コピー数及び安定性の面からYEpタ
イプが好ましい。これらのプラスミドは一般に不要な配
列を含んでいるので、プラスミドの安定性のため、ある
いはプラスミドの改変を容易にするために、必要でない
配列を削除して用いることが好ましい。
次のステップとして、適当なプロモーター、必要に応じ
てターミネーターを連結することが必要となる。ただ
し、宿主内で元株のプロモーターが効率よく機能する場
合はこの限りではない。
れば、trp、lac、taq、λPL 等を使用することができ
る。宿主が酵母であればGAL1、GAL7、ADH、TPI、PHO5等
のプロモーターが好ましく、これらの中では、GAL1、GA
L7(Nogi Y. et al. Nucl. Acids Res. 11, 8555-8568
(1983)) が強力であり、誘導が可能であるので特に好ま
しい。
DH、GAL10等を挙げることができる。上記プロモータ
ー、本発明のキチナーゼ遺伝子、上記ターミネーターを
この順序で連結したものを上記ベクターに挿入すること
によって、本発明のプラスミドを作製することができ
る。
EH13-4、GAL1プロモーター、GAPDHターミネーターを用
いて作製したプラスミドの例を後述の実施例に示した。
サッカロマイセス・セレビシエでキチナーゼ1成熟酵素
を発現するプラスミドpCHIM2をトランスフォーメーショ
ンして得られた大腸菌の形質転換体は、微工研菌寄第1
3061号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。
る大腸菌、及びリゾプス・ニベウスのchi1遺伝子を有す
る大腸菌は、それぞれ微工研菌寄第13059号、13
060号として寄託されている(以上宿主はMV1190株、
ベクターはpUC19)。
カロマイセス・セレビシエ 上記のようにして作製したプラスミドを微生物に導入す
ることにより、本発明のキチナーゼを生産する微生物を
作製することができる。これは、プラスミドで微生物細
胞を形質転換することにより得られる。例えば、上記寄
託菌株からプラスミドを回収し、サッカロマイセス・セ
レビシエの形質転換を行えばよい。
は、常法に従って行えばよい。
より、本発明のキチナーゼを生産することができる。培
養に際しては、誘導可能なプロモーターを使用した場合
には誘導を行うことが好ましい。
エ形質転換体の培養法の例を説明する。形質転換体を、
SD培地を用いて30℃で1晩振盪培養(300r.p.
m)し、この培養液を10倍量のSD−カザミノ酸培地
(カザミノ酸(Difco製)を終濃度2%含むSD培地)
に移して30℃で培養を行う。ガラクトースで誘導をか
ける場合には、SD−カザミノ酸培地で24時間培養し
た後、滅菌水で菌体を洗滌してから等量のSG−カザミ
ノ酸培地(SD−カザミノ酸培地のグルコースの代わり
にガラクトースを添加した培地)に移し、30℃で培養
する。尚、SD培地の組成は、以下の通りである。
菌と同様にして行えばよい。また、精製された酵素は、
凍結乾燥、限外濾過膜、有機溶媒沈澱等により濃縮する
ことができる。
ポラスを用いた例を説明する。
性質を調べた実施例を説明する。
l、水:480ml)、B液(グルコース:20g、
水:490ml)を別々にオートクレーブした後、混合
する。ただし、50倍濃縮液の組成は、以下の通りであ
る。
る。 クエン酸塩酸塩 : 2g Fe(NO3)3・9H2O : 1.5g ZnSO4・7H2O : 1g MnSO4・H2O : 300mg CuSO4・5H2O : 50mg NaMoO4・2H2O : 50mg 水 : 1000ml
キチンは、以下のようにして作製した。キチン粉末(和
光純薬、生化学用試薬)2gを氷冷しておいた濃塩酸8
0mlに、攪拌しながらゆっくりと加えた。徐々に温度を
あげ、37℃まで加温し、キチンを溶解させた。溶けき
らなかったキチンは、G−3ガラスフィルターで濾過し
て除いた。濾液を4℃で、水800mlに攪拌しながら徐
々に加えた。キチンが再沈澱し、溶液が白く濁ってから
さらに30分間攪拌した後、攪拌をやめ、一晩4℃に静
置した。上清をデカンテーションで除いた後、800ml
の水を加え攪拌し、これを遠心管に移し、5000×
g、10分間遠心し上清を捨てた。上清のpHが中性にな
るまで遠心による洗浄を続けた後、150mlの水に懸
濁し、これをコロイダルキチン溶液として4℃に保存し
た。
は、コロイダルキチンと酵素溶液を混合、保温した後、
可溶性となった糖をReissig法(114)を用いて定量するこ
とによって測定した。
液250μl、McIlvaine緩衝液(61mM クエン酸、77mM
Na2HPO4、pH4.0)250μlを混合し、37℃、2時間
保温した。5000rpmで5分間遠心した後、試験管
内で上清500μlを、KOHでpHを10.2に調整した
0.8M ホウ酸カリウム水溶液100μlと混合し、アルミ
キャップで蓋をした後、沸騰湯浴中に正確に3分間保ち
加温した。
ノベンツアルデヒド(DMAB)試薬を3.0ml加え混合した
後、37℃に20分間保ち、585nmの吸収を測定し
た。ただし、DMAB試薬として、DMAB10gを10%(v/
v)の濃塩酸を含む氷酢酸100mlに溶かし、4℃に保存
しておき、使用直前に氷酢酸で10倍に希釈したものを
使用した。
グルコサミンに相当する糖を可溶化させる活性を1単位
とした。
シ、キトサン10B)1gをビーカーに入れ、スターラ
ーで攪拌しながら徐々に10%氷酢酸20mlを加え、
キトサンが溶解し、溶液がシロップ状になるまで攪拌を
続けた後、室温に一晩放置した。これをG−3ガラスフ
ィルターで濾過し、濾液に90mlのメタノールを加
え、攪拌しながら1.5mlの無水酢酸をゆっくり滴下
した。1〜2分間攪拌を続け、溶液がゲル状になり、攪
拌棒が回転しなくなった後、室温に30分間以上放置し
た。ゲルをスパーテルである程度細かくした後、ホモジ
ナイザーを用いてさらに細かく砕いた。これをブフナー
漏斗上、ワットマンNo.2濾紙を用いて充分に水で洗
浄した後、再生キチンとした。
動(SDS-PAGE))SDS-PAGEはLaemmliの方法(Nature 227,
680 (1970))に従い、主に10%ゲルを用いて行っ
た。蛋白質は、クーマシー・ブリリアント・ブルー R
−250染色あるいは銀染色によって検出した。銀染色
は銀染色キットワコー(和光純薬)を用いて行い、方法
はキットの説明書に従った。
ら糖鎖を除去する方法として、酵素的に行う方法と化学
的に行う方法の2通りの方法を用いた。
ゼH(生化学工業)を用いて行った。精製したキチナー
ゼ10μl(約5μg)に重量比で1.2倍になるように
SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を加え、沸騰水浴中で
3分間加熱した。室温まで冷やした後、50mM リン
酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)、1mM フェニルメチルス
ルホニルフルオライド、20mU/ml エンドグリコ
シダーゼH中、37℃で約12時間反応させた。
スルホン酸(TFMS、半井化学)を用いて行った。精製した
キチナーゼ約10μgを乾燥後、窒素ガス下で15μlの
TFMSに溶解し、氷中に1時間放置した。その後、氷冷し
ておいた10%(v/v)n−ヘキサンを含むジエチルエー
テルを加え、ドライアイス−エタノール中に20分間お
いた。ピリジンを1滴加え、さらにドライアイス−エタ
ノール中に40分間放置し、5000r.p.m.、3分間遠
心し沈澱を集めた。沈澱をジエチルエーテルで洗浄し、
さらに95%エタノールで洗浄後、15000r.p.m.、
3分間遠心した。沈澱を乾燥後、0.1M リン酸ナト
リウム緩衝液(pH6.0)、0.1%SDS溶液に溶解し試
料とした。
緩衝液を、McIlvaine緩衝液を用いて作製し、各pHに
おいて精製したキチナーゼ約2μgを用いてその活性を
測定した。
2μgを、pH4.0、60℃、10分間加熱した後の
残存する活性を測定することによって行った。
としてシリカゲルプレート(silica gel 60:Merk社、5
×10cm)を用いた。このプレートに試料をスポットし、
室温で1−ブタノール:酢酸:水(3:3:2)を展開溶媒と
してクロマトグラフィーを行った。検出は、アニリンフ
タレート試薬を噴霧した後、105℃で加熱することに
よって行った。ただし、アニリンフタレート試薬とは、
アニリン0.93g、フタル酸1.66gを水飽和1−ブ
タノール100mlに溶解して調整したものである。
性測定法)酵素溶液750μl、McIlvaine緩衝液(pH4.
0)250μlを混合し、37℃、5分間保温した後、2m
g/ml p−ニトロフェニル−β−N−アセチルグルコサ
ミニド(Sigma社)溶液を200μl添加し、37℃、
16分間保温した。その後、1M Na2CO3溶液500μl
を加え、溶液の420nmにおける吸光度を測定した。
活性は、1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを遊
離させる活性を1単位とした。尚、1μmol/mlのp−
ニトロフェノールの420nmにおける吸収を0.004
5とした。
白質試料を蒸留水に対して充分に透析した後、セントリ
コン−10(アミコン製)を用いて濃縮した。このよう
にして調製した試料のうち約0.5nmolをプロテイ
ンシークエンサー(Applied Biosystems社 Model44
7A)にかけ分析した。
るキチナーゼの精製 リゾプス・オリゴスポラスは、リゾプス・ニベウスとは
異なり、培養後期に自己溶菌が認められることからキチ
ナーゼ活性が高いのではないかと考え、リゾプス・オリ
ゴスポラスの培養上清中のキチナーゼ活性の検出を試み
た。
ml容三角フラスコにリゾプス・オリゴスポラス IF
O8631株の胞子を植菌し、30℃、静置培養した
後、培養上清のキチナーゼ活性を測定した。その結果、
培養日数が経過するに従い上清中のキチナーゼ活性も増
加した。
の操作は、特に示さない限り0〜4℃の範囲で行った。 (1)培養と集菌 リゾプス・オリゴスポラスの培養は、6個の5l容三角
フラスコにそれぞれ80mlのSIV液体培地を入れ、
これらにリゾプス・オリゴスポラスの胞子を植菌した
後、30℃、8日間静置培養することによって行った。
培養後、三角フラスコを4℃に移し、十分に冷えた後、
培養液を攪拌し一晩4℃に放置した。その後、濾過によ
って菌体を除き、濾液を培養上清とした。
03g/l)となるように硫酸アンモニウムを徐々に加
え溶解させた。一晩放置した後、10000×gで30
分間遠心し、上清を捨てた後、沈澱を40mlの20mM N
aHCO3(pH8.4)に溶解し、同じ緩衝液に対し一晩透析し
た。透析後の試料を硫酸アンモニウム沈澱画分とした。
ラフィー 再生キチンをカラム(カラムサイズ 2.6×10cm)につ
め、カラムを20mM NaHCO 3(pH8.4)で平衡化させた後、前
記で得られた硫酸アンモニウム画分をチャージし、20mM
NaHCO3(pH8.4)で洗浄した後、100mlの20mM酢
酸(pH5.4)と100mlの20mM酢酸(pH3.2)によるp
H勾配で浄し、20mM酢酸(pH3.2)で溶出させた。流
速は52ml/hrで行い、溶出液は10mlずつ分取
した。
をすぐに1Mトリス−塩酸(pH7.5)と2M水酸化ナトリ
ウム水溶液を用いて、終濃度20mMトリス−塩酸(pH
7.5)となるようにした。溶出パターン図1に示した。5
0〜69番目の画分をまとめてキチンカラム溶出画分と
した。
ムクロマトグラフィー 上述のキチンカラム溶出画分をYM-10メンブレンフィル
ター(Amicon)を用いて約5mlまで濃縮し、20mM Tris-H
Cl(pH7.5)で平衡化したセファデックスG−75(カラ
ムサイズ 2.6×66cm)にチャージし、同緩衝液
で溶出させた。流速は15.3ml/hrで行い、溶出
液は10mlずつ分取した。溶出パターンを図2に示し
た。14〜18番目の画分をセファデックスG−75溶
出画分とした。
るカラムクロマトグラフィー セファデックスG−75溶出画分を、20mMトリス−
塩酸(pH7.5)で平衡化したDEAE−トヨパール650
M(東ソー:カラムサイズ 1.6×16cm)にチャ
ージし、同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液300mlと
20mMトリス−塩酸(pH7.5)、30mM食塩溶液30
0mlを用いて、食塩の直線的濃度勾配で溶出させた。
0mlずつ分取した。溶出パターンを図3に示した。こ
のカラムクロマトグラフィーにより、キチナーゼは2つ
のピークに分離し、SDS-PAGE上でそれぞれほぼ一本のバ
ンドになるまで精製された。ピークI、IIに対応するキ
チナーゼをそれぞれキチナーゼ1、2と命名した。
た。初めに反応至適pHについて検討した。各pHにおける
活性を最大活性に対する百分率で表したものが図4であ
る。両酵素の至適pHは、キチナーゼ1ではpH4.0付
近、キチナーゼ2ではpH3.5付近であった。
60℃、10分間の熱処理後、キチナーゼ1では73.
3%、キチナーゼ2では58.5%の活性が残存してい
た。次に、両キチナーゼの分子量と糖鎖について検討し
た。キチナーゼ1、2の分子量はSDS-PAGEの結果からそ
れぞれ約50000、約52000と推定された。
は未処理のものと電気泳動における易動度が同じであっ
たが、TFMS処理によってこれらの易動度は大きくなり、
両酵素には糖鎖が付加され、その糖鎖はエンドクリコシ
ダーゼHに耐性であることが明かとなった。また、糖鎖
を除去したキチナーゼ1、2の分子量はそれぞれ約44
500、約46500と推定された。
物の同定 キチナーゼ1、2によるキチン分解反応生成物を同定す
るため、両酵素をコロイダルキチンに対し過剰時間作用
させた後、その反応液を薄層クロマトグラフィーによっ
て解析した。主要生成物としてN,N'-ジアセチルキトビ
オースが、またN-アセチルグルコサミンとN,N',N''-ト
リアセチルキトトリオースが少量認められた。
いはN,N',N''-トリアセチルキトトリオースを基質とし
て酵素反応を行った。その結果を表2に示した。
N''-トリアセチルキトトリオースは基質として利用でき
るが、N,N'-ジアセチルキトビオースは利用できないこ
とが示唆された。
分解するβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼ活性につい
て他の基質、p−パラニトロフェニル-β-N-アセチルヘ
キソサミニドを用いて測定した。その結果を表3に示し
た。
セチルヘキソサミニダーゼ活性が検出されたが、キチナ
ーゼ1、2には認められなかった。次に、Reissig法(11
4)による糖の検出系について検討した。N-アセチルグル
コサミン、N,N'-ジアセチルキトビオース、N,N',N''-ト
リアセチルキトトリオースを適量用いてそれぞれ発色さ
せた。その結果を表4に示した。
トリアセチルキトトリオースに対する感度はN-アセチル
グルコサミンに対する感度の100分の1以下であっ
た。Reissig法によるキチナーゼ1、2の活性の検出が
可能であったのは、キチナーゼ1、2の反応生成物とし
て、N-アセチルグルコサミンが産生されていたからであ
ると推定された。
ミノ酸配列の解析を行った。キチナーゼ1については、
30アミノ酸を決定し、その配列は配列番号1に示した
配列であった。
ノ酸を決定し、その配列は配列番号2に示した配列であ
った。両者のN末端アミノ酸の配列は非常によく似てお
り、5番目のアミノ酸がキチナーゼ1ではAsnであった
のに対し、キチナーゼ2ではHisであっただけの違いで
あった。
明する。 (1)染色体DNAの調製法 菌体をガラスフィルターで濾過して集菌し、液体窒素で
凍結した。菌体が再び溶解しないうちに破砕し、TE緩
衝液を8ml加え、50ml容の容器に移し、更に10
%SDSを含むTE緩衝液を4ml加え、60℃で30
分間保温した。
アミルアルコール(25:24:1)を12ml加え、激しく
振盪した後、1mlの5M酢酸カリウムを加え、氷中に
1時間以上放置した。これを、15000r.p.m.で15
分間遠心し、水層を別の容器に移し、2.5倍容のエタ
ノールを加え核酸をエタノール沈澱させた。
衝液に溶解し、10mg/mlのRNAse A溶液を5μl加え、3
7℃で1時間保温し、さらに20mg/mlのプロテイナーゼ
K溶液を5μl加え、37℃で1時間保温して、RNA
及びタンパクを分解させた。これをフェノール抽出4
回、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール
抽出を2回行なってさらにタンパクを除去した後、エタ
ノール沈澱させた。
した後、120μlのポリエチレングリコール溶液(2
0%ポリエチレングリコール6000、2.5M NaCl)を
加え、DNAを沈澱させ、さらに沈澱を70%エタノー
ルで洗滌、乾燥後、適当量のTE緩衝液に溶解した。
fco)を終濃度0.1%となるように加える。
作製 オリゴヌクレオチドの合成は、アプライドバイオシステ
ム社のDNAシンセサイザー Model 391を用いて行った
(以下同じ)。合成したDNAの樹脂からの抽出、精製
は機械の説明書の方法に従った。
M HClに20分、 0.6MNaCl, 0.4N NaOH 溶液に15分間
づつ2回、1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl(pH7.5)溶液に2
0分間、ゆっくり振盪しながら浸漬した。
0.3M クエン酸ナトリウム溶液)に浸した濾紙の上に置
き、さらにその上にナイロンメンブレン:Hybond-C (Am
ersham社製)を重ねた。濾紙の端は20×SSCに漬け
て、10×SSCが吸い上げられるようにしておいた。
メンブレンの上にさらにペーパータオルを積み上げて、
10×SSCがゲル及びメンブレンを通して濾紙から吸
い上げられるようにした。1晩放置後、メンブレンを風
乾した後、減圧下、80℃で2時間ベイキングし、DN
Aを固定した。
た合成オリゴヌクレオチドをプレハイブリダイゼーショ
ン溶液に加え、20merのプローブの場合は42℃で、
14merのプローブの場合は室温で少なくとも12時間
以上行った。フィルターの洗浄は、6×SSC、0.1
%SDS溶液を用い、20merのプローブの場合は55
℃で、14merのプローブの場合は37℃で行った。
に露出させ、オートラジオグラムを撮った。
-N+(Amersham社製)に移し取った。ブロットしたDNA
のメンブレンへの固定は、Hybond-Nの場合には2時間、
80℃で処理し、Hybond-N+の場合には0.4M水酸化
ナトリウムによるアルカリ固定を行った。
析と同じ条件で行い、ついで洗浄、乾燥後x線フィルム
に露出させ、オートラジオグラムを撮った。フィルム上
のポジティブシグナルの位置から、プローブがハイブリ
ダイズしたプラークを同定した。
して行なった。 λファージ溶液30μl、E. coli PLKー1
7の一晩培養液30μl、10mM MgCl2/10mM CaCl2溶液30
μlを混合し、室温に10分間、さらに37℃で15分
間保温した。これを10ml NZC培地に移し、37℃で振盪
培養した。8〜12時間後、溶菌が認められた後すぐに
100μlのクロロホルムを加え良く混合し、10,000r.p.
m.、10分間遠心して上清を取った。
7.4)、10mM MgSO4)を加え、さらに1mg/ml DNaseI溶液を
320μl加え、37℃で15分間保温した。これに、2mlの5M
NaCl、2.2gのPEG6000を加え良く混合した後、氷中に15
分間以上放置した。これを12,000r.p.m.で10分間遠心
し、沈澱を300μlのTM bufferに溶解した後、1.5ml容の
ミクロ遠心チューブに移した。これに300μlのクロロホ
ルムを加え良く混合し、遠心した後水層を別のチューブ
に移した。このクロロホルム抽出を再度繰り返した後、
水層に15μlの0.5M EDTA(pH8.0)、30μlの5M NaClを加
え、さらに350μlのTE飽和フェノールを加えボルテック
スで良く混合した。
し、875μlのエタノールを加えドライアイスに10分間以
上放置した。10分間遠心した後、沈澱を70%エタノール
で洗浄し乾燥させた。これを10μg/mlの濃度でRNase A
を含むTE bufferに溶解し、染色体DNA溶液とした。
のリン酸化、脱リン酸化、塩基配列決定等、DNA組換
えの手法は、常法により行った。これらの手法は、Mole
cularcloning (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbo
r Laboratory Press)に詳しい。
NAライブラリーの作製 リゾプス・オリゴスポラスの全DNAをSau3AIで部分消
化した後、アルカリホスファターゼ処理を用いて5’末
端の脱リン酸化を行った。これをアガロースゲル電気泳
動で分画し、10〜20kbp(キロ塩基対)の大きさの
DNA断片をアガロースゲルから回収した。一方、ベク
ターとして使用するλ2001(フナコシ(株)から購
入)は、EcoRIとBamHIで二重消化を行った。
トリス−塩酸(pH7.6)、5mM MgCl2、300mM食塩溶液
に置換し、ライゲーションキット(宝酒造(株))を用
いて連結した。インビトロ・パッケージングキット(Gi
ga pack gold:フナコシ(株)から購入)を用いて前記
DNAのパッケージを行い、大腸菌P2PLK-17株(STRATA
GENE製)に感染させ、ライブラリーの大きさを確認し
た。
づつの、10バッチに分けライブラリーの増幅を行い、
ライブラリーを得た。尚、増幅させたライブラリーのス
クリーニングは大腸菌PLK17株(STRATAGENE製)を用い
て行った。
列番号3、4に示した配列を有する、それぞれ20me
r、14merの合成オリゴヌクレオチドプローブを作製し
た。20merプローブは、キチナーゼ1、キチナーゼ2
両遺伝子にハイブリダイズするように、14merプロー
ブはキチナーゼ1にはハイブリダイズするがキチナーゼ
2にはハイブリダイズしないようにデザインした。
Aのサザン解析を行った。EcoRI、HindIIIでそれぞれ消
化した全DNA染色体DNAを電気泳動後、フィルターに
移し、32Pで標識した20merプローブを前記条件でハ
イブリダイズさせ、洗滌、乾燥後オートラジオグラフを
撮った。
bpの位置に1本のバンドが、HindIII消化した場合には
3.6kbp、11.5kbpの位置に2本のバンドが検出さ
れた。このことから20merプローブを用い、同条件で
キチナーゼ1、キチナーゼ2の単離が可能と考えられ
た。
したリゾプス・オリゴスポラスDNAライブラリーを同
じ条件でスクリーニングした。得られた陽性クローンよ
りDNAを抽出し、20mer及び14merプローブを用い
たサザン解析を行った。
は、2.9kbp EcoRI断片と3.6kbp HindIII断片にハ
イブリダイズするグループ1と、2.9kbp EcoRI断片
と11.5kbp HindIII断片にハイブリダイズするグル
ープ2の2つのグループに分かれた。また14merプロ
ーブはグループ1にのみハイブリダイズした。
する領域をサブクローン化し、塩基配列を決定した。そ
の結果を配列番号5、6に示した。グループ1に属する
クローンにおいては、プローブに用いた20mer、14m
erの各オリゴヌチレオチドと完全に一致する配列があ
り、さらに塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、精
製したキチナーゼ1から決定した30アミノ酸からなる
配列と一致する配列が存在していたことから、このクロ
ーンにキチナーゼ1遺伝子(chi1)が含まれていると結
論した。
ては、20merプローブと完全に一致する配列があり、
さらに塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、精製し
たキチナーゼ2から決定した16アミノ酸からなる配列
と一致する配列が存在していたことから、このクローン
にキチナーゼ2遺伝子(chi2)が含まれていると結論し
た。
るアミノ酸配列には、精製したキチナーゼのN末端(Ala
+1)の上流に、22アミノ酸(Met-22〜Ala-1)からなる典
型的な分秘シグナル様配列が存在しており、このMetを
コードするATG配列が開始コドンであると推定した。
357bp、chi2の場合313bp 3'下流にイン・フレー
ムで終始コドンが存在し、イントロンが存在することが
推定された。堀内らによって提唱されているリゾプスの
イントロンのコンセンサス配列(119)に従い、それぞれA
sp+80の位置にそれぞれ52bp、53bpからなるイント
ロンを推定すると共に、それぞれ540、542アミノ
酸をコードする翻訳領域を推定した。
ーゼのC末端アミノ酸配列とアミノ酸組成の解析 (1)C末端アミノ酸配列の分析 精製したキチナーゼを蒸留水に対して充分に透析した
後、セントリコン-10(アミコン製)を用いて濃縮した
試料約5nmol(約120μl)を用いて、カルボキシペプチダ
ーゼで消化し、遊離されるアミノ酸を同定することによ
ってC末端アミノ酸配列の分析を行った。
シペプチダーゼA(Sigma社)とカルボキシペプチダーゼ
B(フナコシ(株))を使用した。カルボキシペプチダ
ーゼAは、市販の懸濁液10μlを冷水1mlで3回洗浄し
た後、沈澱を50mM トリメチルアミン−酢酸緩衝液(pH8.
0)1mlに溶解して調製した。
溶液30μlを、遊離アミノ酸を除くため蒸留水に対し
て2時間以上透析した後、上述の緩衝液1mlあるいは2
mlで希釈して調製した。
l(約5nmol)に、同緩衝液(pH8.0)を200μl、上述の
ようにして調製したカルボキシペプチダーゼA、B溶液
をそれぞれ10μlずつ混合し、37℃で保温した。反
応液から経時的に50μlずつサンプリングし、あらか
じめ5μlの氷酢酸を分注しておいたチューブに移し反
応を停止した。
を使用して乾燥後、エタノール:水:トリエチルアミン
(2:2:1)溶液10μlで洗浄し、再び乾燥させた。これに
エタノール:トリエチルアミン:水:イソチオシアン酸
フェニル(7:1:1:1)を20μl加え、室温に20分間放置
してアミノ酸をフェニルチオカルバモイル化した後、乾
燥させた。これをWatanabeらの方法(122)に従って、Pic
o-Tagカラムを用いたHPLC(高速液体クロマトグラフィ
ー)によって分析し、アミノ酸の同定を行った。
配列は-Ser-Ala、キチナーゼ2のC末端アミノ酸配列は
-Tyr-(Ser,Lys)-(Val,Ala)であることが明らかとなっ
た。一方、chi1、chi2遺伝子配列から推定されるC末端
アミノ酸配列は-Phe-Lysであり、確かにC末端領域の切
断が起きていることが示された。
おいて、-Ser-Alaの配列は7箇所存在する。すなわち、A
la+60、Ala+188、Ala+204、Ala+327、Ala+395、Al
a+397、Ala+514である。このうち、糖鎖を除去したキチ
ナーゼ1の分子量が44.5kDaであることを考慮すると、A
la+395、Ala+397の2箇所がC末端切断箇所であると考
えられ、さらに以下に述べる理由でAla+395がC末端ア
ミノ酸であると結論した。
で遊離するAlaとSerは同じような割合で増加することか
ら、C末端アミノ酸配列が-Ser-Ala-Ser-Alaであるより
は-Ser-Alaである可能性が高い。また、長時間カルボキ
シペプチダーゼA、Bを作用させてもAla、Ser以外のア
ミノ酸が遊離しないことから、C末端アミノ酸配列が(P
ro)-Ser-Alaである可能性が高い。さらに、以下に述べ
るように、chi1、chi2の遺伝子産物が、非常に類似して
いるにもかかわらずC末端領域の切断箇所が異なるの
は、chi2遺伝子産物においてAla+395に相当するアミノ
酸がValに置換しているためと考えられることからも、
C末端は-Ser-Alaであると考えられる。
C末端アミノ酸であると結論した。Ala+424が切断点で
あるとすると、C末端アミノ酸配列は-(Pro)-Tyr-Lys-A
la-Ser-Lys-Val-Alaとなり、カルボキシペプチダーゼ
A、Bによる消化の結果である-Tyr-(Lys,Ser)-(Val,Al
a)と矛盾しない。また、この箇所以外にカルボキシぺプ
チダーゼA、Bによる消化の結果と適合する箇所はなか
った。
と、キチナーゼ1よりC末端領域のアミノ酸が28アミ
ノ酸分だけ長くなり、実施例1で述べたように、糖鎖を
除いたキチナーゼ2の方がキチナーゼ1より約2kDa分
だけペプチド鎖が長いという結果と一致する。さらに、
この28アミノ酸の中にはLys、Argという正電荷のアミ
ノ酸が4個含まれており、そのためにキチナーゼ2がDE
AE-トヨパール 650Mカラムクロマトグラフィーにおいて
非吸着画分に溶出されてきたと考えられる。
後、セントリコン-10を用いて濃縮した。約1nmol(約5
0μl)をWaters社 Pico-Tag WORK STATIONを使用して、
1%フェノールを含む6N 塩酸により窒素ガス中で10
5℃、24時間加水分解を行なった。これを上記と同様
にフェニルチオカルバモイル化した後、Pico-Tagカラム
を用いて分離し、各アミノ酸を定量した。結果を表5に
示す。
も、+1〜+395のアミノ酸組成と良く一致し、このこと
は、Ala+395がC末端であることを支持する。chi1、chi
2両遺伝子産物はプレプロ構造を成しており、小胞体膜
の透過の際にプレ配列であるシグナル配列が切断され、
その後さらにC末端領域にあるプロ配列が切断されてキ
チナーゼ1、2が産生されることが明かとなった。以
降、プレ配列だけが除去されたものを前駆体型、プレ配
列、プロ配列の両方が除去されたものを成熟型と呼ぶ。
列表の配列番号5、6に示した通りである。chi2全長を
有するプラスミドpOCHI-2を保持する大腸菌(宿主 MV11
90)は、微工研菌寄第13059号として寄託されてい
る。
明する。 (サッカロマイセス・セレビシエの培養方法)小スケー
ルで培養する場合には直径19mmの試験管に培地5ml
という条件で行った。前培養として、SD培地で一晩、3
0℃、300r.p.m.、レシプロ振盪培養し、この培養液
50mlをSD-カザミノ酸培地に移してさらに30℃で培
養した。
は、SD-カザミノ酸培地で24時間培養した後、滅菌水
で菌体を1回洗浄してからSG-カザミノ酸培地2mlに懸
濁し、30℃で培養した。
0mlスケールで行ない、本培養は5l容三角フラスコに
1lの培地を入れて120r.p.m.の振盪培養を行なう以
外は小スケールの場合と同様の方法で行った。
テアーゼとして、リゾプスsp.のプロテアーゼ(Sigma社)
とトリプシン(Sigma社)の2種を使用した。リゾプスsp.
のプロテアーゼを用いる場合は、キチナーゼ試料とプロ
テアーゼをMcIlvaine 緩衝液(pH4.0)中で、37℃で1
5分間保温した後、ぺプスタチンA(Sigma社)を加えプ
ロテアーゼを失活させ、キチナーゼ活性を測定した。コ
ントロールとしてはペプスタチンAを先にキチナーゼ試
料と混合し、これにプロテアーゼを添加して37℃、1
5分間保温したものを用いた。
て大豆由来のトリプシンインヒヒター(Sigma社)を用い
たこと、また20mM Tris-HCl(pH8.0)内で処理を行なった
以外は、リゾプスsp.のプロテアーゼを用いた場合と同
様の方法で行なった。
ダルキチン溶液50μlを遠心して上清を吸い取った
後、キチナーゼ試料50μl(約5μg、20mM Tris-HCl(pH
8.0))を加え良く混合し、氷中1.5時間放置した。こ
れを遠心し、上清を別のチューブに移し、キチン非結合
画分とした。沈澱を100μlの20mM Tris-HCl(pH8.0)
で2回洗浄した後、2%SDS、5%β−メルカプトエタ
ノール溶液50μlに懸濁し、100℃、4分間加熱処
理をした上清をキチン結合画分としてSDS-PAGEによる解
析の試料とした。
るキチナーゼの生産 (1)キチナーゼ生産プラスミドの作製 サッカロマイセス・セレビシエでキチナーゼ1の改変体
を発現させるため、部位指定変異の手法を用いてchi1に
対し変異を導入した。 図5に、本実験で使用した合成
オリゴヌクレオチドの配列を、chi1の相当する配列とと
もに示した。合成オリゴヌクレオチド451は、chi1から
推定されるイントロンを除去するために、合成オリゴヌ
クレオチド452は、chi1のプロモーターを交換できるよ
うにするため、開始コドンATGの上流5bpの位置にHindI
II部位を導入するために作製した。
ナーゼ1のC末端アミノ酸であるAla +395の直下に停止
コドンTAAとHindIII部位を導入するために、合成オリゴ
ヌクレオチド454はキチナーゼ2の末端アミノ酸に相当
するAla+422の直下に、同様に停止コドンとHindIII部位
を導入するために作製したものである。
6、457はchi1から推定されるアミノ酸配列に存在する3
箇所のAsn結合型の糖鎖付加部位を破壊するために作製
したものである。
chi1を含む3.6Kbp HindIII断片(図6)をプラスミドp
UC119に挿入したプラスミドpCHI6を鋳型として部位指定
変異を行ない、図7に示したような改変体を作製した。
これらの改変体は、成熟型(M)の場合は1.25Kbp Hin
dIII断片として、また、前駆体型(P)の場合は1.6bp
HindIII-SspI断片(図6参照)として、ターミネーターを
除いた形で得ることが可能である。
8)由来の8.1Kbp EcoRI-SalI断片と連結し、プラス
ミドpCHIM2、pCHIM3、pCHIP2、pCHIP3、pCHIM22、pCHIM
23、pCHIMdg2、pCHIMdg3、pCHIPdg2、pCHIPdg3を作製し
た(図7)。この場合、プラスミドの最後の数字の2と
3は、それぞれpYPR2831、pYPR3831由来のEcoRI-SalI断
片と連結したことを示すものであり、よって末尾が2で
あるものはグリセルアルデヒド−3−ホスフェイトデヒ
ドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子プロモーター下流に、3で
あるものはGAL1プロモーター下流に改変体遺伝子が挿入
されていることになる。
した大腸菌(宿主 MV1190株)は、微工研菌寄第130
61号として寄託した。
産するキチナーゼ 上記で得られたプラスミドを用いてサッカロマイセス・
セレビシエ EH13-4を形質転換した。
による形質転換体の解析を行なった。これらの形質転換
体を液体培養し、その培養上清のキチナーゼ活性を測定
した。その結果を表6、7に示した。
E209による形質転換体ではその上清にキチナーゼ活性は
ほとんど認められなかったが、前駆体型、成熟型を、GA
PDH遺伝子プロモーターあるいはGAL1プロモーターのど
ちらかによって発現させた場合には上清に有意なキチナ
ーゼ活性が認められた。
駆体型を発現させた場合と比較して2〜15倍高い活性
を示した。またコロイダルキチンを含む寒天培地にpYE2
09、pCHIM2、pCHIP2による形質転換遺体を植菌したとこ
ろ、pCHIM2による形質転換体は、pCHIP2による形質転換
体と比較してより大きなハローを形成した。
よりキチナーゼ活性が高いことが示唆された。しかし、
この場合、キチナーゼ活性の違いはそれぞれの蛋白質の
分泌量の違いの結果である可能性も考えられる。そこ
で、サッカロマイセス・セレビシエを用いて生産される
成熟型と前駆体型の部分精製を試みた。尚、前駆体型と
しては、pCHIPdg2によるものも合わせて部分精製を試み
た。
換体を500mlスケールで培養し、ガラクトースで12
時間誘導した後の培養上清を20mM Tris-HCl(pH7.5)に対
し透析した後、DEAE-トヨパール 650M(カラムサイズ1.6
×16cm)にチャージし、0〜30mMの食塩の直線的濃度
勾配により溶出し、活性を有する画分を集めて行った。
Pdg2による形質転換体を900mlスケールで30℃、7
2時間培養した後の培養上清を限外濾過により濃縮し、
20mMTris-HCl(pH8.0)に対し透析した後、DEAE-トヨパー
ル 650M(カラムサイズ1.6×16cm)にチャージし、樹脂に
吸着せずに溶出してきたピークを集めて行った。
グリコシダーゼH処理を行ったものについてSDS-PAGEを
行った。その結果、どの場合においても高分子量域にス
メアーなバンドが検出されたが、エンドグリコシダーゼ
H処理で消失することから、Asn結合型糖鎖が高度に付
加されたものと考えられる。
が、前駆体型はエンドグリコシダーゼH処理で約63KD
aのほぼ一本のバンドとなり、成熟型より精製度は高い
と思われる。しかし、約55KDa付近にもバンドが若干
あり、このバンドは成熟型に主要なバンドと位置が一致
していることこから、これらの試料にはサッカロマイセ
ス・セレビシエのプロテアーゼによって一部C末端領域
が切断されているものが含まれていると考えられた。
定した。また、リゾプスsp.由来のプロテアーゼ、ある
いは、トリプシン処理を行なった後のキチナーゼ活性も
測定し、結果を表8に示した。
べ9〜16倍高く、先に述べたように、培養上清中の活
性が成熟型を分泌させた場合の方が高かったのは、分泌
量の差によるのではないことが示された。また、それぞ
れプロテアーゼ処理を行った後キチナーゼ活性を測定し
た場合、成熟型ではその活性にほとんど変化が認められ
ないのに対し、前駆体型では活性の上昇が認められた。
り、リゾプス・オリゴスポラスのキチナーゼは、不活性
型として合成され、C末端領域がプロテアーゼによって
切断されて活性化することが強く示唆された。次に、成
熟型と前駆体型のキチン結合能について、SDS-PAGEによ
り検討した。その結果、成熟型、前駆体型共にキチン吸
着画分に濃縮されるバンドが認められ、どちらもキチン
に結合能を示すことが明らかになった。
g3による形質転換体の検討を行なった。pCHIM22、pCHIM
dg2による形質転換体を、pCHIM2、pCHIP2、pCHIPdg2に
よる形質転換体とともにコロイダルキチンを含む寒天培
地に植菌し、それらのハロー形成を調べた。
成が認められ、この改変体にキチナーゼ活性があると考
えられたが、pCHIMdg2によるものではハローは認められ
なかった。さらにキチナーゼ活性を定量的に検討するた
めに、pCHIM23、pCHIMdg3による形質転換体を液体培養
し、その培養上清のキチナーゼ活性を測定した結果(表
9)、pCHIM3の場合と比較してpCHIM23の場合で約6分
の1、pCHIMdg3の場合で約10分の1に活性が低下し
た。
いは分泌に何等かの役割を果していることが示唆され
る。
mazaki IFO4810株)のキチナーゼ遺伝子の単離を行った
実施例を説明する。
含む1.2Kbp KpnI-EcoRI断片(図6参照)をプローブ
として、56℃の穏やかな条件でHindIIIで消化したリ
ゾプス・ニベウスの全DNAに対しサザン解析を行なっ
た。その結果、1.0Kb、1.25Kbp、2.3Kbp、
3.6Kbp、6.0kbpの5本のバンドが検出され、リゾ
プス・ニベウスにもリゾプス・オリゴスポラスのキチナ
ーゼ遺伝子と相同性のある遺伝子が存在し、この条件を
用いてそれらの単離が可能であることが示唆された。
をベクターとして作製したリゾプス・ニベウスの染色体
ライブラリー(リゾプス・オリゴスポラスの染色体ライ
ブラリーと同様にして作製したもの)、あるいはpUC11
9、λ2001をベクターベクターとして作製したサブジェ
ノミック ライブラリーをスクリーニングすることによ
って図9に示したような4種の断片を単離した。
消化したリゾプス・ニベウスの全DNAに対するサザン解
析で検出された1.25Kbp、2.3Kbp、3.6Kbp、
6.0kbpのバンドに対応する断片がそれぞれ含まれて
いる。これらの断片の塩基配列を決定した結果、リゾプ
ス・オリゴスポラスのキチナーゼと相同性が認められた
ため、それぞれの遺伝子をchi1、chi2、chi3、chi4と命
名した。
の相同性からイントロンを推定し、アミノ酸配列を推定
した結果を、塩基配列と共に配列番号7〜10に示し
た。このうち、chi1を有するpNCHI-1を保持する大腸菌
は、微工研究菌寄第13060号として寄託した。
1212..1270,1500..1571, 1731..1794 特徴を決定した方法:S 配列 CAATGCAAAA AATCTGGGCT GAACAAGAAG ACATAGAAAA GGTTCAATGG GGATGTAAAA 60 TAGCTAAAGA GGTTTTGAAT GGAAAATAAT AATAATAATA GAAAAAATGG TATTTTGTTA 120 TTCTAGAATA AAAAAAAATA GGTGCCATTT AGACGATATT TCAATTAATA ATTTTGTTGC 180 TAAAAAGTAG AATCAGTTTA TGAGATTCCT CTTTTTCTCT CTTTCTTCTT TGTTGCAA 238 ATG AAA AAA ACC TTG GTC GTT ATC TCT GCA ATT CTT GGA ATA ACT ACA 286 Met Lys Lys Thr Leu Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Gly Ile Thr Thr 1 5 10 15 GCA TTT GAT GTAAATTTAA ATAATGTTCG TATAAAGTTG ACCATTGCAT 335 Ala Phe Asp TAAGCACTTC TTATTCTAG AAT GCT TGT AAT CAT AAC GTT GTA GGC T 382 Asn Ala Cys Asn His Asn Val Val Gly 20 25 GTAAGTACAA ACACGCTTTT TAATAGCCAA ATAATAAACA TATATAAAAA AAG AT TGG 440 Tyr Trp GGA CAG AAT TCT TTT GGT GCT GCC AAT GGA CAG GAC AGA TCA GGC TGG 488 Gly Gln Asn Ser Phe Gly Ala Ala Asn Gly Gln Asp Arg Ser Gly Trp 30 35 40 CAA AAG TCC ATA AGC TTT TAT TGT GAT GAT GAT TCT TTT GAC GTA TTC 536 Gln Lys Ser Ile Ser Phe Tyr Cys Asp Asp Asp Ser Phe Asp Val Phe 45 50 55 CCA ATT TCC TTT TTA ACA ACT TTC TTC GGT CCT GAT GGT ACG CCT CAA 584 Pro Ile Ser Phe Leu Thr Thr Phe Phe Gly Pro Asp Gly Thr Pro Gln 60 65 70 75 ATC AAC CTT GCC AAT GTAGAAAAAA AGAAGAATAT GTCTTATTAC AACAGACTAA 639 Ile Asn Leu Ala Asn 80 TAATTTCTTA G ACA TGT AAC AAT GTT GAT AAT GCT ACT TTT CCC GGA ACT 689 Thr Cys Asn Asn Val Asp Asn Ala Thr Phe Pro Gly Thr 85 90 ACT CTA GCC AAT TGT CAA ACA ATG GCC CCT GAT ATT AAG TAT TGC CAA 737 Thr Leu Ala Asn Cys Gln Thr Met Ala Pro Asp Ile Lys Tyr Cys Gln 95 100 105 TCA AAG GGC AAG TTA GTT ACC CTT TCT TTG GGT GGG GCT ACG GGC GGT 785 Ser Lys Gly Lys Leu Val Thr Leu Ser Leu Gly Gly Ala Thr Gly Gly 110 115 120 GTT GGA TTC CAG TCT GAT TCT CAA GCT ACC TCA TTT GCT GAT ACT ATT 833 Val Gly Phe Gln Ser Asp Ser Gln Ala Thr Ser Phe Ala Asp Thr Ile 125 130 135 140 TGG AAT CTA TTT CTT GGT GGT GAA TCA TCC ATT CGT CCA TTT GGT GAT 881 Trp Asn Leu Phe Leu Gly Gly Glu Ser Ser Ile Arg Pro Phe Gly Asp 145 150 155 GCT ATC TTA GAC GG GTATACTTGC TTCCGAACAG ACTCATCTTA AAACAAAATA 935 Ala Ile Leu Asp Gly 160 TCTAAACCCT TCATATGTAT ATAG T ATC GAT TTG GAT ATT GAA GGT GGC GGA 987 Ile Asp Leu Asp Ile Glu Gly Gly Gly 165 170 TCT AAC C GTAGTGTATA GAAAAAATAA ACAAAAAGAA AAGGTACAGA TAACTTTGTTT 1044 Ser Asn ATACGTGCAT ATAG AT TAT ACA ACT TTT TTG CAA GCG CTA AGC TCA CAT 1093 His Tyr Thr Thr Phe Leu Gln Ala Leu Ser Ser His 175 180 TTT GTC AAC GCT TCA AAA AAA TAT TAC ATT ACT GCC GCT CCG CAA TGT 1141 Phe Val Asn Ala Ser Lys Lys Tyr Tyr Ile Thr Ala Ala Pro Gln Cys 185 190 195 200 GTG TTC CCT GAT GCC AAC CTC CAA GCT ACC CTA AAT AGT TTT TCA TTT 1189 Val Phe Pro Asp Ala Asn Leu Gln Ala Thr Leu Asn Ser Phe Ser Phe 205 210 215 GAC GCG ATC TAT GGT CAA TTC T GTAAAGCATT TATAATTTAG GAAGGACAAG 1241 Asp Ala Ile Tyr Gly Gln Phe 220 GACTAACCCA CTTTTAAAAT TAAAAAAAG AC CAC AAA CCT TGT GGT CCT CAA 1294 Tyr His Lys Pro Cys Gly Pro Gln 225 230 TTT TTT AAC ACA ATT CAG TGG AAC TTT GGT GTT TGG GAA AAT TGG GCA 1342 Phe Phe Asn Thr Ile Gln Trp Asn Phe Gly Val Trp Glu Asn Trp Ala 235 240 245 CGT ACC TCG TCT CCC AAT CCT AAT GTG AAA GGT TAT ATA GGT GCT CCT 1390 Arg Thr Ser Ser Pro Asn Pro Asn Val Lys Gly Tyr Ile Gly Ala Pro 250 255 260 GCC AGT TCT TCA GCT GCT GGT AGT GGT TAT GTA TCT GCT TCG ACT TTG 1438 Ala Ser Ser Ser Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Val Ser Ala Ser Thr Leu 265 270 275 CTT AAC ATT GCT TTA GAT ACA AGG AAT TAT TTT CCT AGT TTT GGA GGT 1486 Leu Asn Ile Ala Leu Asp Thr Arg Asn Tyr Phe Pro Ser Phe Gly Gly 280 285 290 295 ATT ATG TTT TGG G GTAAAGTTAG AAGAAGAAAA AGCTTCCAGA CCTTACTTCA 1539 Ile Met Phe Trp AAAGAGTGTT TCTTATAATT TGGTTTGAAC AG AT GTT TCG CAA GCA TAC GGA 1591 Asp Val Ser Gln Ala Tyr Gly 300 305 AAT AAC AAA TTT GGG GCT TTT CTA AAG AAT GGG CTA TCC TCT GGC TCA 1639 Asn Asn Lys Phe Gly Ala Phe Leu Lys Asn Gly Leu Ser Ser Gly Ser 310 315 320 AGC TGT AAT GGC AAG TTT AAT TTC TTA CCA TGC ACT GCA CCT GCT TAT 1687 Ser Cys Asn Gly Lys Phe Asn Phe Leu Pro Cys Thr Ala Pro Ala Tyr 325 330 335 GTT AGT GGT ACC GGT TAT AGT GGA GGA AGC AGA GTT CTT ATA A 1730 Val Ser Gly Thr Gly Tyr Ser Gly Gly Ser Arg Val Leu Ile 340 345 350 GTAAGCTATC AAGCATGAAT TTGTATTTAT GTTATCAACT AATATTATTC TAAAAAAAAA 1790 ACAG TG GAT ATA CTT GGA TT GTAAGTTCAA AGTATCTTTA TAATGAATTT 1840 Met Asp Ile Leu Gly Leu 355 TTCAACTAAT TTCAAACAAT AATAGGCTAG A TGG TAT GCC TCT TCG GCT CCT 1892 Trp Tyr Ala Ser Ser Ala Pro 360 365 TCC TCT AGT CCT AGC TCA GAA TGG CTG CCT ATA ATG GCA TGT TCC AAT 1940 Ser Ser Ser Pro Ser Ser Glu Trp Leu Pro Ile Met Ala Cys Ser Asn 370 375 380 GAC AAT AGT GGT TCA ACT TCC GGA TCT TAT ACT TCC AAA ACA TTA CCA 1988 Asp Asn Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Tyr Thr Ser Lys Thr Leu Pro 385 390 395 TCT GGT ACC AAT GCC TCC TCA TCT AGA ATT AAT ATA TCT AGC ACT CCT 2036 Ser Gly Thr Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ile Asn Ile Ser Ser Thr Pro 400 405 410 CAA TCA GTC CAA CCA TCT GCT AGC ATG TCT ACT ACT ACA TTT TAT ACT 2084 Gln Ser Val Gln Pro Ser Ala Ser Met Ser Thr Thr Thr Phe Tyr Thr 415 420 425 AAA TCT AGC GCT GTC CCA AGT ACA ACA TCC TCA GCA GCA ATA ATT TCA 2132 Lys Ser Ser Ala Val Pro Ser Thr Thr Ser Ser Ala Ala Ile Ile Ser 430 435 440 445 TCT CGT TGT GCT AGC ACC CTC CCT TGG TCT CCT TCA GTC GCC TAT ACT 2180 Ser Arg Cys Ala Ser Thr Leu Pro Trp Ser Pro Ser Val Ala Tyr Thr 450 455 460 GGT GGA GTC AAT GTT TAT TAC AAC AAT GCT ATT TGG AGA GCA AAA TGG 2228 Gly Gly Val Asn Val Tyr Tyr Asn Asn Ala Ile Trp Arg Ala Lys Trp 465 470 475 TGG TCT CAA AAT GAT GTC CCC GGA GGC ATC GCT GGC GTT TGG GAA AAG 2276 Trp Ser Gln Asn Asp Val Pro Gly Gly Ile Ala Gly Val Trp Glu Lys 480 485 490 GTT GAA TCT TGC GAA CCA GAG AGA ACA TTG TCT TCT CGA TCT ATC CTG 2324 Val Glu Ser Cys Glu Pro Glu Arg Thr Leu Ser Ser Arg Ser Ile Leu 495 500 505 AAA GGT AAA ATA TAAAGCAAGC AGTCATACAA CTCAGTTAAA ATGTTTCTTT 2376 Lys Gly Lys Ile 510 TAGCGGCCTC ACAAATCAAT TGCAAGCGGA ACATTTTAAG GTGGAGCAAA CTTAAGAACT 2346 ATACCAAAGG GAATAGAGTT TTTTATAAGT AACGACCGAC GAGAAAACGA AAGGAACTTT 2496 TAAATAATTA TCTTTATTTT ATAGAGGAGT AATCTATGCT GCTTCTAGGC CTAACCTTGT 2556 AAGACGTCAC TATAGCACAT GTGTATTATT CGCTAACTTT TTCCTTTTTT TTTTTCGCTT 2616 TTGCACAAAT AGAATCAACA ACCAAACATC AACTCTTTTG ATTGGGAG 2664
9, 1212..1270,1500..1571, 1731..1794 特徴を決定した方法:S 配列 GGGTACATGT CCTTTTCGGT CTCTTTCCGT ATGATCATCT TACGTAAACC AAGTACTCAT 60 TAATGATCAA GTAAGTGAAT AAAGGGTTCC CATGATTAGC AACACCTCTC AATTAACAAT 120 TTTATACTGT TTGAAACTTG AATTTTTTTT TAAAGAAAAA AAACCTATAA ATACGTCTAG 180 TTTGACAAGA ATCCTCCTTC TTTTTAAAAA ATACACATTT TTCAAAGAAA CAAAT ATG 238 Met 1 AAT CAC TGG TTC ATA ATC ACC TTC CTC TGC ATC CTT CTC TAT AAA GCT 286 Asn His Trp Phe Ile Ile Thr Phe Leu Cys Ile Leu Leu Tyr Lys Ala 5 10 15 CAA GCC AGC TTT CTT GAT TCC CCT TCG ATT GCG ACA TAT TGG GGA CAG 334 Gln Ala Ser Phe Leu Asp Ser Pro Ser Ile Ala Thr Tyr Trp Gly Gln 20 25 30 GTAAACCAGA TTTGTTTCTA GAGGGGGGGG GGAAACTCAC TGCTGTTTGT TTTCCTTTTG 394 ATAG AAT TCA AAA GGA GGC TCC GAC ACA CAG CAT TCA CTT GCT ACT TAT 443 Asn Ser Lys Gly Gly Ser Asp Thr Gln His Ser Leu Ala Thr Tyr 35 40 45 TGT GAT GGT AAA TCG GAT GTT ATC ATC CTA GCT TTT GTT CTT GAC TTT 491 Cys Asp Gly Lys Ser Asp Val Ile Ile Leu Ala Phe Val Leu Asp Phe 50 55 60 AGG AAT AAG GAG CTT CCT CAA CTT AAC CTT GCA AAT TCA TGT GAC GGA 539 Arg Asn Lys Glu Leu Pro Gln Leu Asn Leu Ala Asn Ser Cys Asp Gly 65 70 75 CCT CGA TTT CCA GGC ACC AAT CTC TTA CAA TGC CCT GAA GTT GGA AAA 587 Pro Arg Phe Pro Gly Thr Asn Leu Leu Gln Cys Pro Glu Val Gly Lys 80 85 90 95 G GTAAATAGGA TTGAATGTTG GATCGATTTT TTGACGATTT CAATAAAATA TGTAG 643 AT ATC AAG ACC TGT CAA AAG AAG GGT AAA ACG ATC TTG TTG TCC TTG 690 Asp Ile Lys Thr Cys Gln Lys Lys Gly Lys Thr Ile Leu Leu Ser Leu 100 105 110 GGT GGT GCT GCT GGC GCT TAT GGG TTT GCT AAT GAC AAA GAT GCT GTT 738 Gly Gly Ala Ala Gly Ala Tyr Gly Phe Ala Asn Asp Lys Asp Ala Val 115 120 125 GCG TTT GCT GAC ACA CTT TGG GCA ACC TTT GGT GGT GGA AAA AGT GAA 786 Ala Phe Ala Asp Thr Leu Trp Ala Thr Phe Gly Gly Gly Lys Ser Glu 130 135 140 AGA CGA CCC TTT GGC GAT GCG GTC GTT GAT GGA TTT GAT CTT GAT ATT 834 Arg Arg Pro Phe Gly Asp Ala Val Val Asp Gly Phe Asp Leu Asp Ile 145 150 155 GAA GGG GGT GGA TCT ACT GGT TAT GCA GTG A GTAACCACTT TCATTCCTTG 885 Glu Gly Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Val 160 165 ACAGACACTC ATCAGTTCAC TTTCACAGGC CATGGTCAAA CGACTTCGCT CTCATTTTAA 945 TTCAG AC AGG TCC AAG AAA TAT TAC ATC ACA GGC GCT CCA CAG TGT CCA 994 Asn Arg Ser Lys Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Ala Pro Gln Cys Pro 170 175 180 TTC CCT GAC GCT ATG CTT GGG CCT GCT TTG GAC GCA TCT GAA TTT GAT 1042 Phe Pro Asp Ala Met Leu Gly Pro Ala Leu Asp Ala Ser Glu Phe Asp 185 190 195 200 GCT GTG TTT GTT CAG TTC TAT AAC AAT TAC TGT TCT ACG ACC AGT GGG 1090 Ala Val Phe Val Gln Phe Tyr Asn Asn Tyr Cys Ser Thr Thr Ser Gly 205 210 215 AAT TTC AAT TTT GAA ACA TGG GAT CAG TGG GCA AGG CAC ACC TCA CCT 1138 Asn Phe Asn Phe Glu Thr Trp Asp Gln Trp Ala Arg His Thr Ser Pro 220 225 230 AAT AGA AAC GTC AAG GTG TTC TTG GGC CTG CCG GGA TCA AGT GCA GCA 1186 Asn Arg Asn Val Lys Val Phe Leu Gly Leu Pro Gly Ser Ser Ala Ala 235 240 245 GCC GGT AGT GGT TAT GTG CCT TAT AAG ACA TTA GAA CCA GTC ATC AGG 1234 Ala Gly Ser Gly Tyr Val Pro Tyr Lys Thr Leu Glu Pro Val Ile Arg 250 255 260 CAC TTG TAT TCA ACC TAT TCG AGC TTT GGA GGT GTG ATG TTA TGG G 1280 His Leu Tyr Ser Thr Tyr Ser Ser Phe Gly Gly Val Met Leu Trp 265 270 275 GTAAGTCAGA GAGGGATGAA TACGAAAACA GATGCCAAAT GACTCCTTTT TTATTGTAG 1339 450 AC GCA TCC GCA TCC TAT AGC AAC AAG GAA GTA TCC CCC CAC TAC CAA 1786 Asp Ala Ser Ala Ser Tyr Ser Asn Lys Glu Val Ser Pro His Tyr Gln 280 285 290 295 GCT GCC ATA TTC AAA TTA TTA TCT AGC CTA AGC AAA GGC GGA CCT AGC 1434 Ala Ala Ile Phe Lys Leu Leu Ser Ser Leu Ser Lys Gly Gly Pro Ser 300 305 310 AAA GGC GGA TCT AGC AAA ACA ATC AAG AAC ACA AAA ACA ATC TCT TCT 1482 Lys Gly Gly Ser Ser Lys Thr Ile Lys Asn Thr Lys Thr Ile Ser Ser 315 320 325 CAT ACA ACC AAG ACC ACA AAG TCC CAT CGA CCT ACA GAC ACC CCC TCT 1530 His Thr Thr Lys Thr Thr Lys Ser His Arg Pro Thr Asp Thr Pro Ser 330 335 340 GTG AGA GAG TGT GTA CAA AAA GAC CAA CCT TGT TCT GGC GGG TTT GCA 1578 Val Arg Glu Cys Val Gln Lys Asp Gln Pro Cys Ser Gly Gly Phe Ala 345 350 355 TGC TCT GGA AAC TCC TTT GCT ACC TGT GTC CAC GGT CGG TGG CTT CTT 1626 Cys Ser Gly Asn Ser Phe Ala Thr Cys Val His Gly Arg Trp Leu Leu 360 365 370 375 CGA CCC TGT CCA GAG GGA CTT GTC TGC CTG TCT TCA ACA GAC GGT GTG 1674 Arg Pro Cys Pro Glu Gly Leu Val Cys Leu Ser Ser Thr Asp Gly Val 380 385 390 TCT GCC TAC TGT GCT CAA GGT AAG GCA AAG ACA TGC ACC CGT CAA GGA 1722 Ser Ala Tyr Cys Ala Gln Gly Lys Ala Lys Thr Cys Thr Arg Gln Gly 395 400 405 TCC TTT CAG GCT TTG GCG GCC GTG GAT TCA TCC GTG GCC AAG GCT TAC 1770 Ser Phe Gln Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Ala Lys Ala Tyr 410 415 420 ACC GGT CGT TCA GTC ACT GCC CAA TTC TCC TTC ATC GGA GCT CGG CAG 1818 Thr Gly Arg Ser Val Thr Ala Gln Phe Ser Phe Ile Gly Ala Arg Gln 425 430 435 CAT CGG TTT ACG GCC ATC CTG AAC GCT CGC TGC TTG TCC CAC CAG GCC 1866 His Arg Phe Thr Ala Ile Leu Asn Ala Arg Cys Leu Ser His Gln Ala 440 445 450 455 TTT GGA GAG AGG GTG AAG GTT CAA TTG AAA GTC AGC CAA GGT ATC AAA 1914 Phe Gly Glu Arg Val Lys Val Gln Leu Lys Val Ser Gln Gly Ile Lys 460 465 470 ATC ACC CAA GTC AAA GGG GGT ACA GTT CGT CAG CAA GGA GAC ACG GTC 1962 Ile Thr Gln Val Lys Gly Gly Thr Val Arg Gln Gln Gly Asp Thr Val 475 480 485 CTC ATC CAC TAT CAC AAT CCG ATT GAC AAG GCC ATG GCC ATT GTG AAT 2010 Leu Ile His Tyr His Asn Pro Ile Asp Lys Ala Met Ala Ile Val Ile 490 495 500 CAG ATG CAG GGG CTG ATG CCA ACC CAT GGG GTG TTT ATA GGA CCA TCG 2058 Gln Met Gln Gly Leu Met Pro Thr His Gly Val Phe Ile Gly Pro Ser 505 510 515 ATG GAT AGC ATC AAG TTT TAT TAGAGATGGA CATGTTTGTG GTTACAAAAG 2109 Met Asp Ser Ile Lys Phe Tyr 520 525 ATAGCAGCAT GCTTGTACAA CCCATCTTTT TACACTAGAA TACAAATAAA GCAGGAAAGA 2169 CGTTCATCTC TTCCTTCTTT ACGTACATTC CACCTTCTTT ATCCTGATTG AGGTTCATTC 2229 TGAATGATGG AAAGGCAAAT GAATAAGGGT CATCACATGG GCTTGAGGAA GGTATTGCTG 2289 CTTTGCTTTG GGACTTTTAT GAAAGATTTC TTTGTTTACA TTTCTGTAGN ACAAGATAAA 2349 GACTGTTTAT TGTTTGTGGA TGNAGAGGCA GAAAAGCAGT AGGATGAATG CACTGGTCAT 2409 TTTTCAAGTT GAACAATGTG TCGAC 2434
スより2種の新規キチナーゼ及びこれらの遺伝子が単離
された。また、この遺伝子を酵母に導入したことによ
り、酵母により前記新規キチナーゼを生産することが可
能となった。
規キチナーゼ遺伝子と推定される遺伝子が単離された。
ターン。
溶出パターン。
フ。
を示した図。
の制限酵素地図。
ゼ遺伝子、キチナーゼ遺伝子を有する酵母及びキチナー
ゼの製造方法に関する。
存在する。例えば、トマトでは、(葉カビ)Cladospori
um fulvum,(灰色カビ)Botrytis cinerea等が病原菌
として知られている。
主要成分の一つとしてキチンを有している。キチンは、
N−アセチルグルコサミンのβ−グルコシド結合による
重合体であり、キチナーゼ(EC 3.2.1.14)により加水分
解される。
ーゼを生産する。この糸状菌キチナーゼは、菌糸の先端
生長あるいは分岐に重要な役割を果しているのではない
かと推測されてきた。すなわち、菌糸先端部分で細胞壁
のキチンの分解と合成がバランス良く行われることによ
って菌糸は先端生長し、また先端より後方のすでに結晶
化し硬い構造となった細胞壁にキチナーゼなどの分解酵
素が作用することによってこれを柔らかくし、菌糸が分
岐生長するのを助けるという考えである。酵母Saccharo
myces cerevisiaeにおいては、キチナーゼ遺伝子の遺伝
子破壊による実験から、細胞が分裂する際キチナーゼ活
性が必要であることが、最近示されている。
があり、菌糸の伸長にキチナーゼは不要であるという説
もあり、キチナーゼの機能については推測の域を脱し得
ないのが現状である。しかし、Aspergillus nidulansで
は細胞壁にキチナーゼ活性が検出されること(107)、ま
たMucor mucedoなどではキチナーゼがキチン合成酵素と
同様膜画分に不活性型として存在すること等から、糸状
菌キチナーゼが糸状菌自身の細胞壁中のキチンを分解す
るためのものであることは論を待たない。
り、これが病原菌に対する防御機構として機能している
と考えられている。この観点から、植物の病原菌に対す
る防御機構の強化を目的として、バクテリア由来のキチ
ナーゼ遺伝子の植物への導入が試みられているが、この
ような目的には抗糸状菌活性の高い糸状菌のキチナーゼ
を利用した方が、より効果的であると考えられる。
子を植物の防御機構として応用するためには、その遺伝
子が必要であるが、糸状菌のキチナーゼは活性としては
知られているのみであり、遺伝子が単離されていないば
かりか、タンパクとしての性質もほとんど知られていな
い。したがって、糸状菌キチナーゼに関する研究を行う
ためにも、糸状菌キチナーゼを容易に得られる手段が望
まれる。
り、精製された糸状菌のキチナーゼを得、その遺伝子を
単離し、さらに、この遺伝子を用いて糸状菌キチナーゼ
を生産することを課題とする。
解決するために、糸状菌キチナーゼを精製して一部の構
造を決定し、これを基にキチナーゼ遺伝子を単離するこ
とに成功し、本発明に至った。
のキチナーゼ、このキチナーゼ遺伝子、及びこのキチナ
ーゼ遺伝子を有する酵母、さらにキチナーゼ遺伝子を有
する酵母を培養し、この培養上清からキチナーゼを取り
出すことを特徴とするキチナーゼの製造方法である。
とによっても得られるが、キチナーゼ生産菌からキチナ
ーゼ遺伝子を単離し、これをベクターに組み込み、でき
たプラスミドを微生物に導入し、得られた形質転換体を
培養することによっても得られる。
は、キチナーゼ生産菌を培養し、培養液から、イオン交
換、ゲル濾過等のクロマトグラフィー、硫安塩析、有機
溶媒沈澱等により精製すればよい。キチナーゼの精製法
として、リゾプス属の糸状菌から精製する方法を後述の
実施例に示した。
スからは2種のキチナーゼが得られ、分子量の小さいも
のをキチナーゼ1、大きいものをキチナーゼ2と命名し
た。精製において、酵素画分の検出は、例えば酵素活性
を測定することにより行う。酵素活性の測定法として、
コロイダルキチンを用いた方法を以下に例示する。
拌しながらゆっくりと加える。徐々に温度を上げ、37
℃まで加温し、キチンを溶解させる。溶けきらなかった
キチンは、ガラスフィルターで濾過して除く。濾液を4
℃で、水に攪拌しながら徐々に加え、キチンが再沈澱
し、溶液が白く濁ってからさらに攪拌した後、攪拌をや
め、一晩4℃に静置する。
加え攪拌し、これを遠心、洗滌して上清のpHが中性にな
るまで繰り返し、再び水に懸濁し、これをコロイダルキ
チン溶液とする。
した後、可溶性となった糖をReissig法を用いて定量す
ることによってキチナーゼ活性を測定する。酵素溶液、
コロイダルキチン溶液、McIlvaine緩衝液(61mM クエン
酸、77mM Na2HPO4、pH4.0)を混合し、37℃、2時間
保温する。5000rpmで5分間遠心した後、試験管
内で上清を、KOHでpHを10.2に調整した0.8M ホウ
酸カリウム水溶液と混合し、アルミキャップで蓋をした
後、沸騰湯浴中に3分間保ち加温する。
ノベンツアルデヒド(DMAB)試薬を加え混合した後、37
℃に20分間保ち、585nmの吸収を測定する。DMAB
試薬としては、DMABを10%(v/v)の濃塩酸を含む氷酢
酸に溶かし、4℃に保存しておき、使用直前に氷酢酸で
10倍に希釈したものを使用する。
性、分子量、アミノ酸配列等の構造、反応至適pH、熱
安定性等を調べることにより行う。基質特異性は、例え
ば、キチンを酵素分解してできる反応生産物の解析や、
N,N'-ジアセチルキトビオースあるいはN,N',N''-トリア
セチルキトトリオースを基質として酵素反応を行い、反
応の有無により調べることができる。分子量は、SDS
−PAGE(SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動)
やゲル濾過等により測定することができる。また、アミ
ノ酸配列は、エドマン分解やカルボキシペプチダーゼ等
の反応を利用した常法により決定することができる。反
応至適pHは、異なるpH条件下で酵素活性を比較する
ことにより、熱安定性は、一定条件下で熱処理を行った
後の酵素の残存活性を比較することにより測定する。
ゴスポラスの生産する2種のキチナーゼの性質を以下に
示す。 (キチナーゼ1) (1)キチンのβ−1,4グリコシド結合を切断する活性
を有し、β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を実
質的に有しない。 (2)SDS−PAGEにより決定した分子量:約50,
000(糖鎖を除去した分子量:約4,4500) (3)熱安定性:pH4、60℃、10分間の熱処理後の
残存活性70〜75% (4)至適pH:4.0付近 (5)成熟酵素のN末端30アミノ酸の配列は、配列番号
1で表される。
を有し、β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を実
質的に有しない。 (2)SDS−PAGEにより決定した分子量:約52,
000(糖鎖を除去した分子量:約4,6500) (3)熱安定性:pH4、60℃、10分間の熱処理後の
残存活性55〜60% (4)至適pH:3.5付近 (5)成熟酵素のN末端30アミノ酸の配列は、配列番号
2で表される。
5において1〜518のアミノ酸番号で表されるアミノ
酸配列を有し、キチナーゼ2成熟酵素は、配列番号6に
おいて1〜525のアミノ酸番号で表されるアミノ酸配
列を有すると推定される。
法を使用することができる。例えば、酵素を精製し、ア
ミノ酸配列を決定し、この配列をもとに合成オリゴヌク
レオチドプローブを作製し、ハイブリダイゼーションに
より遺伝子ライブラリーから選択する。
ションの方法は、各操作に使用する市販の酵素、コンピ
テントセルに添付されている説明書に記載されている。
また、これらの操作、遺伝子の塩基配列の決定、ハイブ
リダイゼーション等一般の遺伝子組換えに必要な方法
は、Molecular cloning (Maniatis T. et al. Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press)に記載されている。
数のクローンから得られる断片を繋ぎ代えることによ
り、全長を有する配列を得ることができる。遺伝子クロ
ーニングに先だって、サザン・ブロッティング等により
解析を行っておくと、遺伝子の同定等がしやすい。
から得られた2種のキチナーゼ遺伝子、及びリゾプス・
ニベウスから得られた4種のキチナーゼ遺伝子の配列
を、配列表の配列番号5〜10に示した。
ター系に導入する。宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵
母、糸状菌、培養細胞等を挙げることができるが、ベク
ターの安定性、活性を有する形での発現、あるいは菌体
外生産の可否等を考慮すると、酵母が好ましい。
シエ(Sacchromyces cerevisiae) EH13−4、SHY
3、D13−1A、MC16等の株を挙げることができ
る。これらの菌株は栄養要求性変異を有するので、それ
らの変異を相補する遺伝子を酵母中で複製可能なプラス
ミドに組み込むことにより、ベクターを作製することが
できる。
求する。この要求性を相補する遺伝子をプラスミドにの
せて酵母に入れたとき、ロイシン非要求性となったもの
は、一般にこのプラスミドを保持していると考えられ
る。
いわゆるYIp、YRp、YEp、YCpのいずれのタイプも使用す
ることができるが、コピー数及び安定性の面からYEpタ
イプが好ましい。これらのプラスミドは一般に不要な配
列を含んでいるので、プラスミドの安定性のため、ある
いはプラスミドの改変を容易にするために、必要でない
配列を削除して用いることが好ましい。
次のステップとして、適当なプロモーター、必要に応じ
てターミネーターを連結することが必要となる。ただ
し、宿主内で元株のプロモーターが効率よく機能する場
合はこの限りではない。
れば、trp、lac、taq、λPL 等を使用することができ
る。宿主が酵母であればGAL1、GAL7、ADH、TPI、PHO5等
のプロモーターが好ましく、これらの中では、GAL1、GA
L7(Nogi Y. et al. Nucl. Acids Res. 11, 8555-8568
(1983)) が強力であり、誘導が可能であるので特に好ま
しい。
DH、GAL10等を挙げることができる。上記プロモータ
ー、本発明のキチナーゼ遺伝子、上記ターミネーターを
この順序で連結したものを上記ベクターに挿入すること
によって、本発明のプラスミドを作製することができ
る。
EH13-4、GAL1プロモーター、GAPDHターミネーターを用
いて作製したプラスミドの例を後述の実施例に示した。
サッカロマイセス・セレビシエでキチナーゼ1成熟酵素
を発現するプラスミドpCHIM2をトランスフォーメーショ
ンして得られた大腸菌の形質転換体は、微工研菌寄第1
3061号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。
る大腸菌、及びリゾプス・ニベウスのchi1遺伝子を有す
る大腸菌は、それぞれ微工研菌寄第13059号、13
060号として寄託されている(以上宿主はMV1190株、
ベクターはpUC19)。
カロマイセス・セレビシエ 上記のようにして作製したプラスミドを微生物に導入す
ることにより、本発明のキチナーゼを生産する微生物を
作製することができる。これは、プラスミドで微生物細
胞を形質転換することにより得られる。例えば、上記寄
託菌株からプラスミドを回収し、サッカロマイセス・セ
レビシエの形質転換を行えばよい。
は、常法に従って行えばよい。
より、本発明のキチナーゼを生産することができる。培
養に際しては、誘導可能なプロモーターを使用した場合
には誘導を行うことが好ましい。
エ形質転換体の培養法の例を説明する。形質転換体を、
SD培地を用いて30℃で1晩振盪培養(300r.p.
m)し、この培養液を10倍量のSD−カザミノ酸培地
(カザミノ酸(Difco製)を終濃度2%含むSD培地)
に移して30℃で培養を行う。ガラクトースで誘導をか
ける場合には、SD−カザミノ酸培地で24時間培養し
た後、滅菌水で菌体を洗滌してから等量のSG−カザミ
ノ酸培地(SD−カザミノ酸培地のグルコースの代わり
にガラクトースを添加した培地)に移し、30℃で培養
する。尚、SD培地の組成は、以下の通りである。
菌と同様にして行えばよい。また、精製された酵素は、
凍結乾燥、限外濾過膜、有機溶媒沈澱等により濃縮する
ことができる。
ポラスを用いた例を説明する。
性質を調べた実施例を説明する。
l、水:480ml)、B液(グルコース:20g、
水:490ml)を別々にオートクレーブした後、混合
する。ただし、50倍濃縮液の組成は、以下の通りであ
る。
る。 クエン酸塩酸塩 : 2g Fe(NO3)3・9H2O : 1.5g ZnSO4・7H2O : 1g MnSO4・H2O : 300mg CuSO4・5H2O : 50mg NaMoO4・2H2O : 50mg 水 : 1000ml
キチンは、以下のようにして作製した。キチン粉末(和
光純薬、生化学用試薬)2gを氷冷しておいた濃塩酸8
0mlに、攪拌しながらゆっくりと加えた。徐々に温度を
あげ、37℃まで加温し、キチンを溶解させた。溶けき
らなかったキチンは、G−3ガラスフィルターで濾過し
て除いた。濾液を4℃で、水800mlに攪拌しながら徐
々に加えた。キチンが再沈澱し、溶液が白く濁ってから
さらに30分間攪拌した後、攪拌をやめ、一晩4℃に静
置した。上清をデカンテーションで除いた後、800ml
の水を加え攪拌し、これを遠心管に移し、5000×
g、10分間遠心し上清を捨てた。上清のpHが中性にな
るまで遠心による洗浄を続けた後、150mlの水に懸
濁し、これをコロイダルキチン溶液として4℃に保存し
た。
は、コロイダルキチンと酵素溶液を混合、保温した後、
可溶性となった糖をReissig法(114)を用いて定量するこ
とによって測定した。
液250μl、McIlvaine緩衝液(61mM クエン酸、77mM
Na2HPO4、pH4.0)250μlを混合し、37℃、2時間
保温した。5000rpmで5分間遠心した後、試験管
内で上清500μlを、KOHでpHを10.2に調整した
0.8M ホウ酸カリウム水溶液100μlと混合し、アルミ
キャップで蓋をした後、沸騰湯浴中に正確に3分間保ち
加温した。
ノベンツアルデヒド(DMAB)試薬を3.0ml加え混合した
後、37℃に20分間保ち、585nmの吸収を測定し
た。ただし、DMAB試薬として、DMAB10gを10%(v/
v)の濃塩酸を含む氷酢酸100mlに溶かし、4℃に保存
しておき、使用直前に氷酢酸で10倍に希釈したものを
使用した。
グルコサミンに相当する糖を可溶化させる活性を1単位
とした。
シ、キトサン10B)1gをビーカーに入れ、スターラ
ーで攪拌しながら徐々に10%氷酢酸20mlを加え、
キトサンが溶解し、溶液がシロップ状になるまで攪拌を
続けた後、室温に一晩放置した。これをG−3ガラスフ
ィルターで濾過し、濾液に90mlのメタノールを加
え、攪拌しながら1.5mlの無水酢酸をゆっくり滴下
した。1〜2分間攪拌を続け、溶液がゲル状になり、攪
拌棒が回転しなくなった後、室温に30分間以上放置し
た。ゲルをスパーテルである程度細かくした後、ホモジ
ナイザーを用いてさらに細かく砕いた。これをブフナー
漏斗上、ワットマンNo.2濾紙を用いて充分に水で洗
浄した後、再生キチンとした。
動(SDS-PAGE))SDS-PAGEはLaemmliの方法(Nature 227,
680 (1970))に従い、主に10%ゲルを用いて行っ
た。蛋白質は、クーマシー・ブリリアント・ブルー R
−250染色あるいは銀染色によって検出した。銀染色
は銀染色キットワコー(和光純薬)を用いて行い、方法
はキットの説明書に従った。
ら糖鎖を除去する方法として、酵素的に行う方法と化学
的に行う方法の2通りの方法を用いた。
ゼH(生化学工業)を用いて行った。精製したキチナー
ゼ10μl(約5μg)に重量比で1.2倍になるように
SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を加え、沸騰水浴中で
3分間加熱した。室温まで冷やした後、50mM リン
酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)、1mM フェニルメチルス
ルホニルフルオライド、20mU/ml エンドグリコ
シダーゼH中、37℃で約12時間反応させた。
スルホン酸(TFMS、半井化学)を用いて行った。精製した
キチナーゼ約10μgを乾燥後、窒素ガス下で15μlの
TFMSに溶解し、氷中に1時間放置した。その後、氷冷し
ておいた10%(v/v)n−ヘキサンを含むジエチルエー
テルを加え、ドライアイス−エタノール中に20分間お
いた。ピリジンを1滴加え、さらにドライアイス−エタ
ノール中に40分間放置し、5000r.p.m.、3分間遠
心し沈澱を集めた。沈澱をジエチルエーテルで洗浄し、
さらに95%エタノールで洗浄後、15000r.p.m.、
3分間遠心した。沈澱を乾燥後、0.1M リン酸ナト
リウム緩衝液(pH6.0)、0.1%SDS溶液に溶解し試
料とした。
緩衝液を、McIlvaine緩衝液を用いて作製し、各pHに
おいて精製したキチナーゼ約2μgを用いてその活性を
測定した。
2μgを、pH4.0、60℃、10分間加熱した後の
残存する活性を測定することによって行った。
としてシリカゲルプレート(silica gel 60:Merk社、5
×10cm)を用いた。このプレートに試料をスポットし、
室温で1−ブタノール:酢酸:水(3:3:2)を展開溶媒と
してクロマトグラフィーを行った。検出は、アニリンフ
タレート試薬を噴霧した後、105℃で加熱することに
よって行った。ただし、アニリンフタレート試薬とは、
アニリン0.93g、フタル酸1.66gを水飽和1−ブ
タノール100mlに溶解して調整したものである。
性測定法)酵素溶液750μl、McIlvaine緩衝液(pH4.
0)250μlを混合し、37℃、5分間保温した後、2m
g/ml p−ニトロフェニル−β−N−アセチルグルコサ
ミニド(Sigma社)溶液を200μl添加し、37℃、
16分間保温した。その後、1M Na2CO3溶液500μl
を加え、溶液の420nmにおける吸光度を測定した。
活性は、1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを遊
離させる活性を1単位とした。尚、1μmol/mlのp−
ニトロフェノールの420nmにおける吸収を0.004
5とした。
白質試料を蒸留水に対して充分に透析した後、セントリ
コン−10(アミコン製)を用いて濃縮した。このよう
にして調製した試料のうち約0.5nmolをプロテイ
ンシークエンサー(Applied Biosystems社 Model44
7A)にかけ分析した。
るキチナーゼの精製 リゾプス・オリゴスポラスは、リゾプス・ニベウスとは
異なり、培養後期に自己溶菌が認められることからキチ
ナーゼ活性が高いのではないかと考え、リゾプス・オリ
ゴスポラスの培養上清中のキチナーゼ活性の検出を試み
た。
ml容三角フラスコにリゾプス・オリゴスポラス IF
O8631株の胞子を植菌し、30℃、静置培養した
後、培養上清のキチナーゼ活性を測定した。その結果、
培養日数が経過するに従い上清中のキチナーゼ活性も増
加した。
の操作は、特に示さない限り0〜4℃の範囲で行った。 (1)培養と集菌 リゾプス・オリゴスポラスの培養は、6個の5l容三角
フラスコにそれぞれ80mlのSIV液体培地を入れ、
これらにリゾプス・オリゴスポラスの胞子を植菌した
後、30℃、8日間静置培養することによって行った。
培養後、三角フラスコを4℃に移し、十分に冷えた後、
培養液を攪拌し一晩4℃に放置した。その後、濾過によ
って菌体を除き、濾液を培養上清とした。
03g/l)となるように硫酸アンモニウムを徐々に加
え溶解させた。一晩放置した後、10000×gで30
分間遠心し、上清を捨てた後、沈澱を40mlの20mM N
aHCO3(pH8.4)に溶解し、同じ緩衝液に対し一晩透析し
た。透析後の試料を硫酸アンモニウム沈澱画分とした。
ラフィー 再生キチンをカラム(カラムサイズ 2.6×10cm)につ
め、カラムを20mM NaHCO 3(pH8.4)で平衡化させた後、前
記で得られた硫酸アンモニウム画分をチャージし、20mM
NaHCO3(pH8.4)で洗浄した後、100mlの20mM酢
酸(pH5.4)と100mlの20mM酢酸(pH3.2)によるp
H勾配で浄し、20mM酢酸(pH3.2)で溶出させた。流
速は52ml/hrで行い、溶出液は10mlずつ分取
した。
をすぐに1Mトリス−塩酸(pH7.5)と2M水酸化ナトリ
ウム水溶液を用いて、終濃度20mMトリス−塩酸(pH
7.5)となるようにした。溶出パターン図1に示した。5
0〜69番目の画分をまとめてキチンカラム溶出画分と
した。
ムクロマトグラフィー 上述のキチンカラム溶出画分をYM-10メンブレンフィル
ター(Amicon)を用いて約5mlまで濃縮し、20mM Tris-H
Cl(pH7.5)で平衡化したセファデックスG−75(カラ
ムサイズ 2.6×66cm)にチャージし、同緩衝液
で溶出させた。流速は15.3ml/hrで行い、溶出
液は10mlずつ分取した。溶出パターンを図2に示し
た。14〜18番目の画分をセファデックスG−75溶
出画分とした。
るカラムクロマトグラフィー セファデックスG−75溶出画分を、20mMトリス−
塩酸(pH7.5)で平衡化したDEAE−トヨパール650
M(東ソー:カラムサイズ 1.6×16cm)にチャ
ージし、同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液300mlと
20mMトリス−塩酸(pH7.5)、30mM食塩溶液30
0mlを用いて、食塩の直線的濃度勾配で溶出させた。
0mlずつ分取した。溶出パターンを図3に示した。こ
のカラムクロマトグラフィーにより、キチナーゼは2つ
のピークに分離し、SDS-PAGE上でそれぞれほぼ一本のバ
ンドになるまで精製された。ピークI、IIに対応するキ
チナーゼをそれぞれキチナーゼ1、2と命名した。
た。初めに反応至適pHについて検討した。各pHにおける
活性を最大活性に対する百分率で表したものが図4であ
る。両酵素の至適pHは、キチナーゼ1ではpH4.0付
近、キチナーゼ2ではpH3.5付近であった。
60℃、10分間の熱処理後、キチナーゼ1では73.
3%、キチナーゼ2では58.5%の活性が残存してい
た。次に、両キチナーゼの分子量と糖鎖について検討し
た。キチナーゼ1、2の分子量はSDS-PAGEの結果からそ
れぞれ約50000、約52000と推定された。
は未処理のものと電気泳動における易動度が同じであっ
たが、TFMS処理によってこれらの易動度は大きくなり、
両酵素には糖鎖が付加され、その糖鎖はエンドクリコシ
ダーゼHに耐性であることが明かとなった。また、糖鎖
を除去したキチナーゼ1、2の分子量はそれぞれ約44
500、約46500と推定された。
物の同定 キチナーゼ1、2によるキチン分解反応生成物を同定す
るため、両酵素をコロイダルキチンに対し過剰時間作用
させた後、その反応液を薄層クロマトグラフィーによっ
て解析した。主要生成物としてN,N'-ジアセチルキトビ
オースが、またN-アセチルグルコサミンとN,N',N''-ト
リアセチルキトトリオースが少量認められた。
いはN,N',N''-トリアセチルキトトリオースを基質とし
て酵素反応を行った。その結果を表2に示した。
N''-トリアセチルキトトリオースは基質として利用でき
るが、N,N'-ジアセチルキトビオースは利用できないこ
とが示唆された。
分解するβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼ活性につい
て他の基質、p−パラニトロフェニル-β-N-アセチルヘ
キソサミニドを用いて測定した。その結果を表3に示し
た。
セチルヘキソサミニダーゼ活性が検出されたが、キチナ
ーゼ1、2には認められなかった。次に、Reissig法(11
4)による糖の検出系について検討した。N-アセチルグル
コサミン、N,N'-ジアセチルキトビオース、N,N',N''-ト
リアセチルキトトリオースを適量用いてそれぞれ発色さ
せた。その結果を表4に示した。
トリアセチルキトトリオースに対する感度はN-アセチル
グルコサミンに対する感度の100分の1以下であっ
た。Reissig法によるキチナーゼ1、2の活性の検出が
可能であったのは、キチナーゼ1、2の反応生成物とし
て、N-アセチルグルコサミンが産生されていたからであ
ると推定された。
ミノ酸配列の解析を行った。キチナーゼ1については、
30アミノ酸を決定し、その配列は配列番号1に示した
配列であった。
ノ酸を決定し、その配列は配列番号2に示した配列であ
った。両者のN末端アミノ酸の配列は非常によく似てお
り、5番目のアミノ酸がキチナーゼ1ではAsnであった
のに対し、キチナーゼ2ではHisであっただけの違いで
あった。
明する。 (1)染色体DNAの調製法 菌体をガラスフィルターで濾過して集菌し、液体窒素で
凍結した。菌体が再び溶解しないうちに破砕し、TE緩
衝液を8ml加え、50ml容の容器に移し、更に10
%SDSを含むTE緩衝液を4ml加え、60℃で30
分間保温した。
アミルアルコール(25:24:1)を12ml加え、激しく
振盪した後、1mlの5M酢酸カリウムを加え、氷中に
1時間以上放置した。これを、15000r.p.m.で15
分間遠心し、水層を別の容器に移し、2.5倍容のエタ
ノールを加え核酸をエタノール沈澱させた。
衝液に溶解し、10mg/mlのRNAse A溶液を5μl加え、3
7℃で1時間保温し、さらに20mg/mlのプロテイナーゼ
K溶液を5μl加え、37℃で1時間保温して、RNA
及びタンパクを分解させた。これをフェノール抽出4
回、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール
抽出を2回行なってさらにタンパクを除去した後、エタ
ノール沈澱させた。
した後、120μlのポリエチレングリコール溶液(2
0%ポリエチレングリコール6000、2.5M NaCl)を
加え、DNAを沈澱させ、さらに沈澱を70%エタノー
ルで洗滌、乾燥後、適当量のTE緩衝液に溶解した。
fco)を終濃度0.1%となるように加える。
作製 オリゴヌクレオチドの合成は、アプライドバイオシステ
ム社のDNAシンセサイザー Model 391を用いて行った
(以下同じ)。合成したDNAの樹脂からの抽出、精製
は機械の説明書の方法に従った。
M HClに20分、 0.6MNaCl, 0.4N NaOH 溶液に15分間
づつ2回、1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl(pH7.5)溶液に2
0分間、ゆっくり振盪しながら浸漬した。
0.3M クエン酸ナトリウム溶液)に浸した濾紙の上に置
き、さらにその上にナイロンメンブレン:Hybond-C (Am
ersham社製)を重ねた。濾紙の端は20×SSCに漬け
て、10×SSCが吸い上げられるようにしておいた。
メンブレンの上にさらにペーパータオルを積み上げて、
10×SSCがゲル及びメンブレンを通して濾紙から吸
い上げられるようにした。1晩放置後、メンブレンを風
乾した後、減圧下、80℃で2時間ベイキングし、DN
Aを固定した。
た合成オリゴヌクレオチドをプレハイブリダイゼーショ
ン溶液に加え、20merのプローブの場合は42℃で、
14merのプローブの場合は室温で少なくとも12時間
以上行った。フィルターの洗浄は、6×SSC、0.1
%SDS溶液を用い、20merのプローブの場合は55
℃で、14merのプローブの場合は37℃で行った。
に露出させ、オートラジオグラムを撮った。
-N+(Amersham社製)に移し取った。ブロットしたDNA
のメンブレンへの固定は、Hybond-Nの場合には2時間、
80℃で処理し、Hybond-N+の場合には0.4M水酸化
ナトリウムによるアルカリ固定を行った。
析と同じ条件で行い、ついで洗浄、乾燥後x線フィルム
に露出させ、オートラジオグラムを撮った。フィルム上
のポジティブシグナルの位置から、プローブがハイブリ
ダイズしたプラークを同定した。
して行なった。 λファージ溶液30μl、E. coli PLKー1
7の一晩培養液30μl、10mM MgCl2/10mM CaCl2溶液30
μlを混合し、室温に10分間、さらに37℃で15分
間保温した。これを10ml NZC培地に移し、37℃で振盪
培養した。8〜12時間後、溶菌が認められた後すぐに
100μlのクロロホルムを加え良く混合し、10,000r.p.
m.、10分間遠心して上清を取った。
7.4)、10mM MgSO4)を加え、さらに1mg/ml DNaseI溶液を
320μl加え、37℃で15分間保温した。これに、2mlの5M
NaCl、2.2gのPEG6000を加え良く混合した後、氷中に15
分間以上放置した。これを12,000r.p.m.で10分間遠心
し、沈澱を300μlのTM bufferに溶解した後、1.5ml容の
ミクロ遠心チューブに移した。これに300μlのクロロホ
ルムを加え良く混合し、遠心した後水層を別のチューブ
に移した。このクロロホルム抽出を再度繰り返した後、
水層に15μlの0.5M EDTA(pH8.0)、30μlの5M NaClを加
え、さらに350μlのTE飽和フェノールを加えボルテック
スで良く混合した。
し、875μlのエタノールを加えドライアイスに10分間以
上放置した。10分間遠心した後、沈澱を70%エタノール
で洗浄し乾燥させた。これを10μg/mlの濃度でRNase A
を含むTE bufferに溶解し、染色体DNA溶液とした。
のリン酸化、脱リン酸化、塩基配列決定等、DNA組換
えの手法は、常法により行った。これらの手法は、Mole
cularcloning (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbo
r Laboratory Press)に詳しい。
NAライブラリーの作製 リゾプス・オリゴスポラスの全DNAをSau3AIで部分消
化した後、アルカリホスファターゼ処理を用いて5’末
端の脱リン酸化を行った。これをアガロースゲル電気泳
動で分画し、10〜20kbp(キロ塩基対)の大きさの
DNA断片をアガロースゲルから回収した。一方、ベク
ターとして使用するλ2001(フナコシ(株)から購
入)は、EcoRIとBamHIで二重消化を行った。
トリス−塩酸(pH7.6)、5mM MgCl2、300mM食塩溶液
に置換し、ライゲーションキット(宝酒造(株))を用
いて連結した。インビトロ・パッケージングキット(Gi
ga pack gold:フナコシ(株)から購入)を用いて前記
DNAのパッケージを行い、大腸菌P2PLK-17株(STRATA
GENE製)に感染させ、ライブラリーの大きさを確認し
た。
づつの、10バッチに分けライブラリーの増幅を行い、
ライブラリーを得た。尚、増幅させたライブラリーのス
クリーニングは大腸菌PLK17株(STRATAGENE製)を用い
て行った。
列番号3、4に示した配列を有する、それぞれ20me
r、14merの合成オリゴヌクレオチドプローブを作製し
た。20merプローブは、キチナーゼ1、キチナーゼ2
両遺伝子にハイブリダイズするように、14merプロー
ブはキチナーゼ1にはハイブリダイズするがキチナーゼ
2にはハイブリダイズしないようにデザインした。
Aのサザン解析を行った。EcoRI、HindIIIでそれぞれ消
化した全DNA染色体DNAを電気泳動後、フィルターに
移し、32Pで標識した20merプローブを前記条件でハ
イブリダイズさせ、洗滌、乾燥後オートラジオグラフを
撮った。
bpの位置に1本のバンドが、HindIII消化した場合には
3.6kbp、11.5kbpの位置に2本のバンドが検出さ
れた。このことから20merプローブを用い、同条件で
キチナーゼ1、キチナーゼ2の単離が可能と考えられ
た。
したリゾプス・オリゴスポラスDNAライブラリーを同
じ条件でスクリーニングした。得られた陽性クローンよ
りDNAを抽出し、20mer及び14merプローブを用い
たサザン解析を行った。
は、2.9kbp EcoRI断片と3.6kbp HindIII断片にハ
イブリダイズするグループ1と、2.9kbp EcoRI断片
と11.5kbp HindIII断片にハイブリダイズするグル
ープ2の2つのグループに分かれた。また14merプロ
ーブはグループ1にのみハイブリダイズした。
する領域をサブクローン化し、塩基配列を決定した。そ
の結果を配列番号5、6に示した。グループ1に属する
クローンにおいては、プローブに用いた20mer、14m
erの各オリゴヌチレオチドと完全に一致する配列があ
り、さらに塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、精
製したキチナーゼ1から決定した30アミノ酸からなる
配列と一致する配列が存在していたことから、このクロ
ーンにキチナーゼ1遺伝子(chi1)が含まれていると結
論した。
ては、20merプローブと完全に一致する配列があり、
さらに塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、精製し
たキチナーゼ2から決定した16アミノ酸からなる配列
と一致する配列が存在していたことから、このクローン
にキチナーゼ2遺伝子(chi2)が含まれていると結論し
た。
るアミノ酸配列には、精製したキチナーゼのN末端(Ala
+1)の上流に、22アミノ酸(Met-22〜Ala-1)からなる典
型的な分秘シグナル様配列が存在しており、このMetを
コードするATG配列が開始コドンであると推定した。
357bp、chi2の場合313bp 3'下流にイン・フレー
ムで終始コドンが存在し、イントロンが存在することが
推定された。堀内らによって提唱されているリゾプスの
イントロンのコンセンサス配列(119)に従い、それぞれA
sp+80の位置にそれぞれ52bp、53bpからなるイント
ロンを推定すると共に、それぞれ540、542アミノ
酸をコードする翻訳領域を推定した。
ーゼのC末端アミノ酸配列とアミノ酸組成の解析 (1)C末端アミノ酸配列の分析 精製したキチナーゼを蒸留水に対して充分に透析した
後、セントリコン-10(アミコン製)を用いて濃縮した
試料約5nmol(約120μl)を用いて、カルボキシペプチダ
ーゼで消化し、遊離されるアミノ酸を同定することによ
ってC末端アミノ酸配列の分析を行った。
シペプチダーゼA(Sigma社)とカルボキシペプチダーゼ
B(フナコシ(株))を使用した。カルボキシペプチダ
ーゼAは、市販の懸濁液10μlを冷水1mlで3回洗浄し
た後、沈澱を50mM トリメチルアミン−酢酸緩衝液(pH8.
0)1mlに溶解して調製した。
溶液30μlを、遊離アミノ酸を除くため蒸留水に対し
て2時間以上透析した後、上述の緩衝液1mlあるいは2
mlで希釈して調製した。
l(約5nmol)に、同緩衝液(pH8.0)を200μl、上述の
ようにして調製したカルボキシペプチダーゼA、B溶液
をそれぞれ10μlずつ混合し、37℃で保温した。反
応液から経時的に50μlずつサンプリングし、あらか
じめ5μlの氷酢酸を分注しておいたチューブに移し反
応を停止した。
を使用して乾燥後、エタノール:水:トリエチルアミン
(2:2:1)溶液10μlで洗浄し、再び乾燥させた。これに
エタノール:トリエチルアミン:水:イソチオシアン酸
フェニル(7:1:1:1)を20μl加え、室温に20分間放置
してアミノ酸をフェニルチオカルバモイル化した後、乾
燥させた。これをWatanabeらの方法(122)に従って、Pic
o-Tagカラムを用いたHPLC(高速液体クロマトグラフィ
ー)によって分析し、アミノ酸の同定を行った。
配列は-Ser-Ala、キチナーゼ2のC末端アミノ酸配列は
-Tyr-(Ser,Lys)-(Val,Ala)であることが明らかとなっ
た。一方、chi1、chi2遺伝子配列から推定されるC末端
アミノ酸配列は-Phe-Lysであり、確かにC末端領域の切
断が起きていることが示された。
おいて、-Ser-Alaの配列は7箇所存在する。すなわち、A
la+60、Ala+188、Ala+204、Ala+327、Ala+395、Al
a+397、Ala+514である。このうち、糖鎖を除去したキチ
ナーゼ1の分子量が44.5kDaであることを考慮すると、A
la+395、Ala+397の2箇所がC末端切断箇所であると考
えられ、さらに以下に述べる理由でAla+395がC末端ア
ミノ酸であると結論した。
で遊離するAlaとSerは同じような割合で増加することか
ら、C末端アミノ酸配列が-Ser-Ala-Ser-Alaであるより
は-Ser-Alaである可能性が高い。また、長時間カルボキ
シペプチダーゼA、Bを作用させてもAla、Ser以外のア
ミノ酸が遊離しないことから、C末端アミノ酸配列が(P
ro)-Ser-Alaである可能性が高い。さらに、以下に述べ
るように、chi1、chi2の遺伝子産物が、非常に類似して
いるにもかかわらずC末端領域の切断箇所が異なるの
は、chi2遺伝子産物においてAla+395に相当するアミノ
酸がValに置換しているためと考えられることからも、
C末端は-Ser-Alaであると考えられる。
C末端アミノ酸であると結論した。Ala+424が切断点で
あるとすると、C末端アミノ酸配列は-(Pro)-Tyr-Lys-A
la-Ser-Lys-Val-Alaとなり、カルボキシペプチダーゼ
A、Bによる消化の結果である-Tyr-(Lys,Ser)-(Val,Al
a)と矛盾しない。また、この箇所以外にカルボキシぺプ
チダーゼA、Bによる消化の結果と適合する箇所はなか
った。
と、キチナーゼ1よりC末端領域のアミノ酸が28アミ
ノ酸分だけ長くなり、実施例1で述べたように、糖鎖を
除いたキチナーゼ2の方がキチナーゼ1より約2kDa分
だけペプチド鎖が長いという結果と一致する。さらに、
この28アミノ酸の中にはLys、Argという正電荷のアミ
ノ酸が4個含まれており、そのためにキチナーゼ2がDE
AE-トヨパール 650Mカラムクロマトグラフィーにおいて
非吸着画分に溶出されてきたと考えられる。
後、セントリコン-10を用いて濃縮した。約1nmol(約5
0μl)をWaters社 Pico-Tag WORK STATIONを使用して、
1%フェノールを含む6N 塩酸により窒素ガス中で10
5℃、24時間加水分解を行なった。これを上記と同様
にフェニルチオカルバモイル化した後、Pico-Tagカラム
を用いて分離し、各アミノ酸を定量した。結果を表5に
示す。
も、+1〜+395のアミノ酸組成と良く一致し、このこと
は、Ala+395がC末端であることを支持する。chi1、chi
2両遺伝子産物はプレプロ構造を成しており、小胞体膜
の透過の際にプレ配列であるシグナル配列が切断され、
その後さらにC末端領域にあるプロ配列が切断されてキ
チナーゼ1、2が産生されることが明かとなった。以
降、プレ配列だけが除去されたものを前駆体型、プレ配
列、プロ配列の両方が除去されたものを成熟型と呼ぶ。
列表の配列番号5、6に示した通りである。chi2全長を
有するプラスミドpOCHI-2を保持する大腸菌(宿主 MV11
90)は、微工研菌寄第13059号として寄託されてい
る。
明する。 (サッカロマイセス・セレビシエの培養方法)小スケー
ルで培養する場合には直径19mmの試験管に培地5ml
という条件で行った。前培養として、SD培地で一晩、3
0℃、300r.p.m.、レシプロ振盪培養し、この培養液
50mlをSD-カザミノ酸培地に移してさらに30℃で培
養した。
は、SD-カザミノ酸培地で24時間培養した後、滅菌水
で菌体を1回洗浄してからSG-カザミノ酸培地2mlに懸
濁し、30℃で培養した。
0mlスケールで行ない、本培養は5l容三角フラスコに
1lの培地を入れて120r.p.m.の振盪培養を行なう以
外は小スケールの場合と同様の方法で行った。
テアーゼとして、リゾプスsp.のプロテアーゼ(Sigma社)
とトリプシン(Sigma社)の2種を使用した。リゾプスsp.
のプロテアーゼを用いる場合は、キチナーゼ試料とプロ
テアーゼをMcIlvaine 緩衝液(pH4.0)中で、37℃で1
5分間保温した後、ぺプスタチンA(Sigma社)を加えプ
ロテアーゼを失活させ、キチナーゼ活性を測定した。コ
ントロールとしてはペプスタチンAを先にキチナーゼ試
料と混合し、これにプロテアーゼを添加して37℃、1
5分間保温したものを用いた。
て大豆由来のトリプシンインヒヒター(Sigma社)を用い
たこと、また20mM Tris-HCl(pH8.0)内で処理を行なった
以外は、リゾプスsp.のプロテアーゼを用いた場合と同
様の方法で行なった。
ダルキチン溶液50μlを遠心して上清を吸い取った
後、キチナーゼ試料50μl(約5μg、20mM Tris-HCl(pH
8.0))を加え良く混合し、氷中1.5時間放置した。こ
れを遠心し、上清を別のチューブに移し、キチン非結合
画分とした。沈澱を100μlの20mM Tris-HCl(pH8.0)
で2回洗浄した後、2%SDS、5%β−メルカプトエタ
ノール溶液50μlに懸濁し、100℃、4分間加熱処
理をした上清をキチン結合画分としてSDS-PAGEによる解
析の試料とした。
るキチナーゼの生産 (1)キチナーゼ生産プラスミドの作製 サッカロマイセス・セレビシエでキチナーゼ1の改変体
を発現させるため、部位指定変異の手法を用いてchi1に
対し変異を導入した。 図5に、本実験で使用した合成
オリゴヌクレオチドの配列を、chi1の相当する配列とと
もに示した。合成オリゴヌクレオチド451は、chi1から
推定されるイントロンを除去するために、合成オリゴヌ
クレオチド452は、chi1のプロモーターを交換できるよ
うにするため、開始コドンATGの上流5bpの位置にHindI
II部位を導入するために作製した。
ナーゼ1のC末端アミノ酸であるAla +395の直下に停止
コドンTAAとHindIII部位を導入するために、合成オリゴ
ヌクレオチド454はキチナーゼ2の末端アミノ酸に相当
するAla+422の直下に、同様に停止コドンとHindIII部位
を導入するために作製したものである。
6、457はchi1から推定されるアミノ酸配列に存在する3
箇所のAsn結合型の糖鎖付加部位を破壊するために作製
したものである。
chi1を含む3.6Kbp HindIII断片(図6)をプラスミドp
UC119に挿入したプラスミドpCHI6を鋳型として部位指定
変異を行ない、図7に示したような改変体を作製した。
これらの改変体は、成熟型(M)の場合は1.25Kbp Hin
dIII断片として、また、前駆体型(P)の場合は1.6bp
HindIII-SspI断片(図6参照)として、ターミネーターを
除いた形で得ることが可能である。
8)由来の8.1Kbp EcoRI-SalI断片と連結し、プラス
ミドpCHIM2、pCHIM3、pCHIP2、pCHIP3、pCHIM22、pCHIM
23、pCHIMdg2、pCHIMdg3、pCHIPdg2、pCHIPdg3を作製し
た(図7)。この場合、プラスミドの最後の数字の2と
3は、それぞれpYPR2831、pYPR3831由来のEcoRI-SalI断
片と連結したことを示すものであり、よって末尾が2で
あるものはグリセルアルデヒド−3−ホスフェイトデヒ
ドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子プロモーター下流に、3で
あるものはGAL1プロモーター下流に改変体遺伝子が挿入
されていることになる。
した大腸菌(宿主 MV1190株)は、微工研菌寄第130
61号として寄託した。
産するキチナーゼ 上記で得られたプラスミドを用いてサッカロマイセス・
セレビシエ EH13-4を形質転換した。
による形質転換体の解析を行なった。これらの形質転換
体を液体培養し、その培養上清のキチナーゼ活性を測定
した。その結果を表6、7に示した。
E209による形質転換体ではその上清にキチナーゼ活性は
ほとんど認められなかったが、前駆体型、成熟型を、GA
PDH遺伝子プロモーターあるいはGAL1プロモーターのど
ちらかによって発現させた場合には上清に有意なキチナ
ーゼ活性が認められた。
駆体型を発現させた場合と比較して2〜15倍高い活性
を示した。またコロイダルキチンを含む寒天培地にpYE2
09、pCHIM2、pCHIP2による形質転換遺体を植菌したとこ
ろ、pCHIM2による形質転換体は、pCHIP2による形質転換
体と比較してより大きなハローを形成した。
よりキチナーゼ活性が高いことが示唆された。しかし、
この場合、キチナーゼ活性の違いはそれぞれの蛋白質の
分泌量の違いの結果である可能性も考えられる。そこ
で、サッカロマイセス・セレビシエを用いて生産される
成熟型と前駆体型の部分精製を試みた。尚、前駆体型と
しては、pCHIPdg2によるものも合わせて部分精製を試み
た。
換体を500mlスケールで培養し、ガラクトースで12
時間誘導した後の培養上清を20mM Tris-HCl(pH7.5)に対
し透析した後、DEAE-トヨパール 650M(カラムサイズ1.6
×16cm)にチャージし、0〜30mMの食塩の直線的濃度
勾配により溶出し、活性を有する画分を集めて行った。
Pdg2による形質転換体を900mlスケールで30℃、7
2時間培養した後の培養上清を限外濾過により濃縮し、
20mMTris-HCl(pH8.0)に対し透析した後、DEAE-トヨパー
ル 650M(カラムサイズ1.6×16cm)にチャージし、樹脂に
吸着せずに溶出してきたピークを集めて行った。
グリコシダーゼH処理を行ったものについてSDS-PAGEを
行った。その結果、どの場合においても高分子量域にス
メアーなバンドが検出されたが、エンドグリコシダーゼ
H処理で消失することから、Asn結合型糖鎖が高度に付
加されたものと考えられる。
が、前駆体型はエンドグリコシダーゼH処理で約63KD
aのほぼ一本のバンドとなり、成熟型より精製度は高い
と思われる。しかし、約55KDa付近にもバンドが若干
あり、このバンドは成熟型に主要なバンドと位置が一致
していることこから、これらの試料にはサッカロマイセ
ス・セレビシエのプロテアーゼによって一部C末端領域
が切断されているものが含まれていると考えられた。
定した。また、リゾプスsp.由来のプロテアーゼ、ある
いは、トリプシン処理を行なった後のキチナーゼ活性も
測定し、結果を表8に示した。
べ9〜16倍高く、先に述べたように、培養上清中の活
性が成熟型を分泌させた場合の方が高かったのは、分泌
量の差によるのではないことが示された。また、それぞ
れプロテアーゼ処理を行った後キチナーゼ活性を測定し
た場合、成熟型ではその活性にほとんど変化が認められ
ないのに対し、前駆体型では活性の上昇が認められた。
り、リゾプス・オリゴスポラスのキチナーゼは、不活性
型として合成され、C末端領域がプロテアーゼによって
切断されて活性化することが強く示唆された。次に、成
熟型と前駆体型のキチン結合能について、SDS-PAGEによ
り検討した。その結果、成熟型、前駆体型共にキチン吸
着画分に濃縮されるバンドが認められ、どちらもキチン
に結合能を示すことが明らかになった。
g3による形質転換体の検討を行なった。pCHIM22、pCHIM
dg2による形質転換体を、pCHIM2、pCHIP2、pCHIPdg2に
よる形質転換体とともにコロイダルキチンを含む寒天培
地に植菌し、それらのハロー形成を調べた。
成が認められ、この改変体にキチナーゼ活性があると考
えられたが、pCHIMdg2によるものではハローは認められ
なかった。さらにキチナーゼ活性を定量的に検討するた
めに、pCHIM23、pCHIMdg3による形質転換体を液体培養
し、その培養上清のキチナーゼ活性を測定した結果(表
9)、pCHIM3の場合と比較してpCHIM23の場合で約6分
の1、pCHIMdg3の場合で約10分の1に活性が低下し
た。
いは分泌に何等かの役割を果していることが示唆され
る。
mazaki IFO4810株)のキチナーゼ遺伝子の単離を行った
実施例を説明する。
含む1.2Kbp KpnI-EcoRI断片(図6参照)をプローブ
として、56℃の穏やかな条件でHindIIIで消化したリ
ゾプス・ニベウスの全DNAに対しサザン解析を行なっ
た。その結果、1.0Kb、1.25Kbp、2.3Kbp、
3.6Kbp、6.0kbpの5本のバンドが検出され、リゾ
プス・ニベウスにもリゾプス・オリゴスポラスのキチナ
ーゼ遺伝子と相同性のある遺伝子が存在し、この条件を
用いてそれらの単離が可能であることが示唆された。
をベクターとして作製したリゾプス・ニベウスの染色体
ライブラリー(リゾプス・オリゴスポラスの染色体ライ
ブラリーと同様にして作製したもの)、あるいはpUC11
9、λ2001をベクターベクターとして作製したサブジェ
ノミック ライブラリーをスクリーニングすることによ
って図9に示したような4種の断片を単離した。
消化したリゾプス・ニベウスの全DNAに対するサザン解
析で検出された1.25Kbp、2.3Kbp、3.6Kbp、
6.0kbpのバンドに対応する断片がそれぞれ含まれて
いる。これらの断片の塩基配列を決定した結果、リゾプ
ス・オリゴスポラスのキチナーゼと相同性が認められた
ため、それぞれの遺伝子をchi1、chi2、chi3、chi4と命
名した。
の相同性からイントロンを推定し、アミノ酸配列を推定
した結果を、塩基配列と共に配列番号7〜10に示し
た。このうち、chi1を有するpNCHI-1を保持する大腸菌
は、微工研究菌寄第13060号として寄託した。
スより2種の新規キチナーゼ及びこれらの遺伝子が単離
された。また、この遺伝子を酵母に導入したことによ
り、酵母により前記新規キチナーゼを生産することが可
能となった。さらに、リゾプス・ニベウスより4種の新
規キチナーゼ遺伝子と推定される遺伝子が単離された。
1212..1270,1500..1571, 1731..1794 特徴を決定した方法:S 配列 CAATGCAAAA AATCTGGGCT GAACAAGAAG ACATAGAAAA GGTTCAATGG GGATGTAAAA 60 TAGCTAAAGA GGTTTTGAAT GGAAAATAAT AATAATAATA GAAAAAATGG TATTTTGTTA 120 TTCTAGAATA AAAAAAAATA GGTGCCATTT AGACGATATT TCAATTAATA ATTTTGTTGC 180 TAAAAAGTAG AATCAGTTTA TGAGATTCCT CTTTTTCTCT CTTTCTTCTT TGTTGCAA 238 ATG AAA AAA ACC TTG GTC GTT ATC TCT GCA ATT CTT GGA ATA ACT ACA 286 Met Lys Lys Thr Leu Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Gly Ile Thr Thr 1 5 10 15 GCA TTT GAT GTAAATTTAA ATAATGTTCG TATAAAGTTG ACCATTGCAT 335 Ala Phe Asp TAAGCACTTC TTATTCTAG AAT GCT TGT AAT CAT AAC GTT GTA GGC T 382 Asn Ala Cys Asn His Asn Val Val Gly 20 25 GTAAGTACAA ACACGCTTTT TAATAGCCAA ATAATAAACA TATATAAAAA AAG AT TGG 440 Tyr Trp GGA CAG AAT TCT TTT GGT GCT GCC AAT GGA CAG GAC AGA TCA GGC TGG 488 Gly Gln Asn Ser Phe Gly Ala Ala Asn Gly Gln Asp Arg Ser Gly Trp 30 35 40 CAA AAG TCC ATA AGC TTT TAT TGT GAT GAT GAT TCT TTT GAC GTA TTC 536 Gln Lys Ser Ile Ser Phe Tyr Cys Asp Asp Asp Ser Phe Asp Val Phe 45 50 55 CCA ATT TCC TTT TTA ACA ACT TTC TTC GGT CCT GAT GGT ACG CCT CAA 584 Pro Ile Ser Phe Leu Thr Thr Phe Phe Gly Pro Asp Gly Thr Pro Gln 60 65 70 75 ATC AAC CTT GCC AAT GTAGAAAAAA AGAAGAATAT GTCTTATTAC AACAGACTAA 639 Ile Asn Leu Ala Asn 80 TAATTTCTTA G ACA TGT AAC AAT GTT GAT AAT GCT ACT TTT CCC GGA ACT 689 Thr Cys Asn Asn Val Asp Asn Ala Thr Phe Pro Gly Thr 85 90 ACT CTA GCC AAT TGT CAA ACA ATG GCC CCT GAT ATT AAG TAT TGC CAA 737 Thr Leu Ala Asn Cys Gln Thr Met Ala Pro Asp Ile Lys Tyr Cys Gln 95 100 105 TCA AAG GGC AAG TTA GTT ACC CTT TCT TTG GGT GGG GCT ACG GGC GGT 785 Ser Lys Gly Lys Leu Val Thr Leu Ser Leu Gly Gly Ala Thr Gly Gly 110 115 120 GTT GGA TTC CAG TCT GAT TCT CAA GCT ACC TCA TTT GCT GAT ACT ATT 833 Val Gly Phe Gln Ser Asp Ser Gln Ala Thr Ser Phe Ala Asp Thr Ile 125 130 135 140 TGG AAT CTA TTT CTT GGT GGT GAA TCA TCC ATT CGT CCA TTT GGT GAT 881 Trp Asn Leu Phe Leu Gly Gly Glu Ser Ser Ile Arg Pro Phe Gly Asp 145 150 155 GCT ATC TTA GAC GG GTATACTTGC TTCCGAACAG ACTCATCTTA AAACAAAATA 935 Ala Ile Leu Asp Gly 160 TCTAAACCCT TCATATGTAT ATAG T ATC GAT TTG GAT ATT GAA GGT GGC GGA 987 Ile Asp Leu Asp Ile Glu Gly Gly Gly 165 170 TCT AAC C GTAGTGTATA GAAAAAATAA ACAAAAAGAA AAGGTACAGA TAACTTTGTTT 1044 Ser Asn ATACGTGCAT ATAG AT TAT ACA ACT TTT TTG CAA GCG CTA AGC TCA CAT 1093 His Tyr Thr Thr Phe Leu Gln Ala Leu Ser Ser His 175 180 TTT GTC AAC GCT TCA AAA AAA TAT TAC ATT ACT GCC GCT CCG CAA TGT 1141 Phe Val Asn Ala Ser Lys Lys Tyr Tyr Ile Thr Ala Ala Pro Gln Cys 185 190 195 200 GTG TTC CCT GAT GCC AAC CTC CAA GCT ACC CTA AAT AGT TTT TCA TTT 1189 Val Phe Pro Asp Ala Asn Leu Gln Ala Thr Leu Asn Ser Phe Ser Phe 205 210 215 GAC GCG ATC TAT GGT CAA TTC T GTAAAGCATT TATAATTTAG GAAGGACAAG 1241 Asp Ala Ile Tyr Gly Gln Phe 220 GACTAACCCA CTTTTAAAAT TAAAAAAAG AC CAC AAA CCT TGT GGT CCT CAA 1294 Tyr His Lys Pro Cys Gly Pro Gln 225 230 TTT TTT AAC ACA ATT CAG TGG AAC TTT GGT GTT TGG GAA AAT TGG GCA 1342 Phe Phe Asn Thr Ile Gln Trp Asn Phe Gly Val Trp Glu Asn Trp Ala 235 240 245 CGT ACC TCG TCT CCC AAT CCT AAT GTG AAA GGT TAT ATA GGT GCT CCT 1390 Arg Thr Ser Ser Pro Asn Pro Asn Val Lys Gly Tyr Ile Gly Ala Pro 250 255 260 GCC AGT TCT TCA GCT GCT GGT AGT GGT TAT GTA TCT GCT TCG ACT TTG 1438 Ala Ser Ser Ser Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Val Ser Ala Ser Thr Leu 265 270 275 CTT AAC ATT GCT TTA GAT ACA AGG AAT TAT TTT CCT AGT TTT GGA GGT 1486 Leu Asn Ile Ala Leu Asp Thr Arg Asn Tyr Phe Pro Ser Phe Gly Gly 280 285 290 295 ATT ATG TTT TGG G GTAAAGTTAG AAGAAGAAAA AGCTTCCAGA CCTTACTTCA 1539 Ile Met Phe Trp AAAGAGTGTT TCTTATAATT TGGTTTGAAC AG AT GTT TCG CAA GCA TAC GGA 1591 Asp Val Ser Gln Ala Tyr Gly 300 305 AAT AAC AAA TTT GGG GCT TTT CTA AAG AAT GGG CTA TCC TCT GGC TCA 1639 Asn Asn Lys Phe Gly Ala Phe Leu Lys Asn Gly Leu Ser Ser Gly Ser 310 315 320 AGC TGT AAT GGC AAG TTT AAT TTC TTA CCA TGC ACT GCA CCT GCT TAT 1687 Ser Cys Asn Gly Lys Phe Asn Phe Leu Pro Cys Thr Ala Pro Ala Tyr 325 330 335 GTT AGT GGT ACC GGT TAT AGT GGA GGA AGC AGA GTT CTT ATA A 1730 Val Ser Gly Thr Gly Tyr Ser Gly Gly Ser Arg Val Leu Ile 340 345 350 GTAAGCTATC AAGCATGAAT TTGTATTTAT GTTATCAACT AATATTATTC TAAAAAAAAA 1790 ACAG TG GAT ATA CTT GGA TT GTAAGTTCAA AGTATCTTTA TAATGAATTT 1840 Met Asp Ile Leu Gly Leu 355 TTCAACTAAT TTCAAACAAT AATAGGCTAG A TGG TAT GCC TCT TCG GCT CCT 1892 Trp Tyr Ala Ser Ser Ala Pro 360 365 TCC TCT AGT CCT AGC TCA GAA TGG CTG CCT ATA ATG GCA TGT TCC AAT 1940 Ser Ser Ser Pro Ser Ser Glu Trp Leu Pro Ile Met Ala Cys Ser Asn 370 375 380 GAC AAT AGT GGT TCA ACT TCC GGA TCT TAT ACT TCC AAA ACA TTA CCA 1988 Asp Asn Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Tyr Thr Ser Lys Thr Leu Pro 385 390 395 TCT GGT ACC AAT GCC TCC TCA TCT AGA ATT AAT ATA TCT AGC ACT CCT 2036 Ser Gly Thr Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ile Asn Ile Ser Ser Thr Pro 400 405 410 CAA TCA GTC CAA CCA TCT GCT AGC ATG TCT ACT ACT ACA TTT TAT ACT 2084 Gln Ser Val Gln Pro Ser Ala Ser Met Ser Thr Thr Thr Phe Tyr Thr 415 420 425 AAA TCT AGC GCT GTC CCA AGT ACA ACA TCC TCA GCA GCA ATA ATT TCA 2132 Lys Ser Ser Ala Val Pro Ser Thr Thr Ser Ser Ala Ala Ile Ile Ser 430 435 440 445 TCT CGT TGT GCT AGC ACC CTC CCT TGG TCT CCT TCA GTC GCC TAT ACT 2180 Ser Arg Cys Ala Ser Thr Leu Pro Trp Ser Pro Ser Val Ala Tyr Thr 450 455 460 GGT GGA GTC AAT GTT TAT TAC AAC AAT GCT ATT TGG AGA GCA AAA TGG 2228 Gly Gly Val Asn Val Tyr Tyr Asn Asn Ala Ile Trp Arg Ala Lys Trp 465 470 475 TGG TCT CAA AAT GAT GTC CCC GGA GGC ATC GCT GGC GTT TGG GAA AAG 2276 Trp Ser Gln Asn Asp Val Pro Gly Gly Ile Ala Gly Val Trp Glu Lys 480 485 490 GTT GAA TCT TGC GAA CCA GAG AGA ACA TTG TCT TCT CGA TCT ATC CTG 2324 Val Glu Ser Cys Glu Pro Glu Arg Thr Leu Ser Ser Arg Ser Ile Leu 495 500 505 AAA GGT AAA ATA TAAAGCAAGC AGTCATACAA CTCAGTTAAA ATGTTTCTTT 2376 Lys Gly Lys Ile 510 TAGCGGCCTC ACAAATCAAT TGCAAGCGGA ACATTTTAAG GTGGAGCAAA CTTAAGAACT 2346 ATACCAAAGG GAATAGAGTT TTTTATAAGT AACGACCGAC GAGAAAACGA AAGGAACTTT 2496 TAAATAATTA TCTTTATTTT ATAGAGGAGT AATCTATGCT GCTTCTAGGC CTAACCTTGT 2556 AAGACGTCAC TATAGCACAT GTGTATTATT CGCTAACTTT TTCCTTTTTT TTTTTCGCTT 2616 TTGCACAAAT AGAATCAACA ACCAAACATC AACTCTTTTG ATTGGGAG 2664
9, 1212..1270,1500..1571, 1731..1794 特徴を決定した方法:S 配列 GGGTACATGT CCTTTTCGGT CTCTTTCCGT ATGATCATCT TACGTAAACC AAGTACTCAT 60 TAATGATCAA GTAAGTGAAT AAAGGGTTCC CATGATTAGC AACACCTCTC AATTAACAAT 120 TTTATACTGT TTGAAACTTG AATTTTTTTT TAAAGAAAAA AAACCTATAA ATACGTCTAG 180 TTTGACAAGA ATCCTCCTTC TTTTTAAAAA ATACACATTT TTCAAAGAAA CAAAT ATG 238 Met 1 AAT CAC TGG TTC ATA ATC ACC TTC CTC TGC ATC CTT CTC TAT AAA GCT 286 Asn His Trp Phe Ile Ile Thr Phe Leu Cys Ile Leu Leu Tyr Lys Ala 5 10 15 CAA GCC AGC TTT CTT GAT TCC CCT TCG ATT GCG ACA TAT TGG GGA CAG 334 Gln Ala Ser Phe Leu Asp Ser Pro Ser Ile Ala Thr Tyr Trp Gly Gln 20 25 30 GTAAACCAGA TTTGTTTCTA GAGGGGGGGG GGAAACTCAC TGCTGTTTGT TTTCCTTTTG 394 ATAG AAT TCA AAA GGA GGC TCC GAC ACA CAG CAT TCA CTT GCT ACT TAT 443 Asn Ser Lys Gly Gly Ser Asp Thr Gln His Ser Leu Ala Thr Tyr 35 40 45 TGT GAT GGT AAA TCG GAT GTT ATC ATC CTA GCT TTT GTT CTT GAC TTT 491 Cys Asp Gly Lys Ser Asp Val Ile Ile Leu Ala Phe Val Leu Asp Phe 50 55 60 AGG AAT AAG GAG CTT CCT CAA CTT AAC CTT GCA AAT TCA TGT GAC GGA 539 Arg Asn Lys Glu Leu Pro Gln Leu Asn Leu Ala Asn Ser Cys Asp Gly 65 70 75 CCT CGA TTT CCA GGC ACC AAT CTC TTA CAA TGC CCT GAA GTT GGA AAA 587 Pro Arg Phe Pro Gly Thr Asn Leu Leu Gln Cys Pro Glu Val Gly Lys 80 85 90 95 G GTAAATAGGA TTGAATGTTG GATCGATTTT TTGACGATTT CAATAAAATA TGTAG 643 AT ATC AAG ACC TGT CAA AAG AAG GGT AAA ACG ATC TTG TTG TCC TTG 690 Asp Ile Lys Thr Cys Gln Lys Lys Gly Lys Thr Ile Leu Leu Ser Leu 100 105 110 GGT GGT GCT GCT GGC GCT TAT GGG TTT GCT AAT GAC AAA GAT GCT GTT 738 Gly Gly Ala Ala Gly Ala Tyr Gly Phe Ala Asn Asp Lys Asp Ala Val 115 120 125 GCG TTT GCT GAC ACA CTT TGG GCA ACC TTT GGT GGT GGA AAA AGT GAA 786 Ala Phe Ala Asp Thr Leu Trp Ala Thr Phe Gly Gly Gly Lys Ser Glu 130 135 140 AGA CGA CCC TTT GGC GAT GCG GTC GTT GAT GGA TTT GAT CTT GAT ATT 834 Arg Arg Pro Phe Gly Asp Ala Val Val Asp Gly Phe Asp Leu Asp Ile 145 150 155 GAA GGG GGT GGA TCT ACT GGT TAT GCA GTG A GTAACCACTT TCATTCCTTG 885 Glu Gly Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Val 160 165 ACAGACACTC ATCAGTTCAC TTTCACAGGC CATGGTCAAA CGACTTCGCT CTCATTTTAA 945 TTCAG AC AGG TCC AAG AAA TAT TAC ATC ACA GGC GCT CCA CAG TGT CCA 994 Asn Arg Ser Lys Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Ala Pro Gln Cys Pro 170 175 180 TTC CCT GAC GCT ATG CTT GGG CCT GCT TTG GAC GCA TCT GAA TTT GAT 1042 Phe Pro Asp Ala Met Leu Gly Pro Ala Leu Asp Ala Ser Glu Phe Asp 185 190 195 200 GCT GTG TTT GTT CAG TTC TAT AAC AAT TAC TGT TCT ACG ACC AGT GGG 1090 Ala Val Phe Val Gln Phe Tyr Asn Asn Tyr Cys Ser Thr Thr Ser Gly 205 210 215 AAT TTC AAT TTT GAA ACA TGG GAT CAG TGG GCA AGG CAC ACC TCA CCT 1138 Asn Phe Asn Phe Glu Thr Trp Asp Gln Trp Ala Arg His Thr Ser Pro 220 225 230 AAT AGA AAC GTC AAG GTG TTC TTG GGC CTG CCG GGA TCA AGT GCA GCA 1186 Asn Arg Asn Val Lys Val Phe Leu Gly Leu Pro Gly Ser Ser Ala Ala 235 240 245 GCC GGT AGT GGT TAT GTG CCT TAT AAG ACA TTA GAA CCA GTC ATC AGG 1234 Ala Gly Ser Gly Tyr Val Pro Tyr Lys Thr Leu Glu Pro Val Ile Arg 250 255 260 CAC TTG TAT TCA ACC TAT TCG AGC TTT GGA GGT GTG ATG TTA TGG G 1280 His Leu Tyr Ser Thr Tyr Ser Ser Phe Gly Gly Val Met Leu Trp 265 270 275 GTAAGTCAGA GAGGGATGAA TACGAAAACA GATGCCAAAT GACTCCTTTT TTATTGTAG 1339 450 AC GCA TCC GCA TCC TAT AGC AAC AAG GAA GTA TCC CCC CAC TAC CAA 1786 Asp Ala Ser Ala Ser Tyr Ser Asn Lys Glu Val Ser Pro His Tyr Gln 280 285 290 295 GCT GCC ATA TTC AAA TTA TTA TCT AGC CTA AGC AAA GGC GGA CCT AGC 1434 Ala Ala Ile Phe Lys Leu Leu Ser Ser Leu Ser Lys Gly Gly Pro Ser 300 305 310 AAA GGC GGA TCT AGC AAA ACA ATC AAG AAC ACA AAA ACA ATC TCT TCT 1482 Lys Gly Gly Ser Ser Lys Thr Ile Lys Asn Thr Lys Thr Ile Ser Ser 315 320 325 CAT ACA ACC AAG ACC ACA AAG TCC CAT CGA CCT ACA GAC ACC CCC TCT 1530 His Thr Thr Lys Thr Thr Lys Ser His Arg Pro Thr Asp Thr Pro Ser 330 335 340 GTG AGA GAG TGT GTA CAA AAA GAC CAA CCT TGT TCT GGC GGG TTT GCA 1578 Val Arg Glu Cys Val Gln Lys Asp Gln Pro Cys Ser Gly Gly Phe Ala 345 350 355 TGC TCT GGA AAC TCC TTT GCT ACC TGT GTC CAC GGT CGG TGG CTT CTT 1626 Cys Ser Gly Asn Ser Phe Ala Thr Cys Val His Gly Arg Trp Leu Leu 360 365 370 375 CGA CCC TGT CCA GAG GGA CTT GTC TGC CTG TCT TCA ACA GAC GGT GTG 1674 Arg Pro Cys Pro Glu Gly Leu Val Cys Leu Ser Ser Thr Asp Gly Val 380 385 390 TCT GCC TAC TGT GCT CAA GGT AAG GCA AAG ACA TGC ACC CGT CAA GGA 1722 Ser Ala Tyr Cys Ala Gln Gly Lys Ala Lys Thr Cys Thr Arg Gln Gly 395 400 405 TCC TTT CAG GCT TTG GCG GCC GTG GAT TCA TCC GTG GCC AAG GCT TAC 1770 Ser Phe Gln Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Ala Lys Ala Tyr 410 415 420 ACC GGT CGT TCA GTC ACT GCC CAA TTC TCC TTC ATC GGA GCT CGG CAG 1818 Thr Gly Arg Ser Val Thr Ala Gln Phe Ser Phe Ile Gly Ala Arg Gln 425 430 435 CAT CGG TTT ACG GCC ATC CTG AAC GCT CGC TGC TTG TCC CAC CAG GCC 1866 His Arg Phe Thr Ala Ile Leu Asn Ala Arg Cys Leu Ser His Gln Ala 440 445 450 455 TTT GGA GAG AGG GTG AAG GTT CAA TTG AAA GTC AGC CAA GGT ATC AAA 1914 Phe Gly Glu Arg Val Lys Val Gln Leu Lys Val Ser Gln Gly Ile Lys 460 465 470 ATC ACC CAA GTC AAA GGG GGT ACA GTT CGT CAG CAA GGA GAC ACG GTC 1962 Ile Thr Gln Val Lys Gly Gly Thr Val Arg Gln Gln Gly Asp Thr Val 475 480 485 CTC ATC CAC TAT CAC AAT CCG ATT GAC AAG GCC ATG GCC ATT GTG AAT 2010 Leu Ile His Tyr His Asn Pro Ile Asp Lys Ala Met Ala Ile Val Ile 490 495 500 CAG ATG CAG GGG CTG ATG CCA ACC CAT GGG GTG TTT ATA GGA CCA TCG 2058 Gln Met Gln Gly Leu Met Pro Thr His Gly Val Phe Ile Gly Pro Ser 505 510 515 ATG GAT AGC ATC AAG TTT TAT TAGAGATGGA CATGTTTGTG GTTACAAAAG 2109 Met Asp Ser Ile Lys Phe Tyr 520 525 ATAGCAGCAT GCTTGTACAA CCCATCTTTT TACACTAGAA TACAAATAAA GCAGGAAAGA 2169 CGTTCATCTC TTCCTTCTTT ACGTACATTC CACCTTCTTT ATCCTGATTG AGGTTCATTC 2229 TGAATGATGG AAAGGCAAAT GAATAAGGGT CATCACATGG GCTTGAGGAA GGTATTGCTG 2289 CTTTGCTTTG GGACTTTTAT GAAAGATTTC TTTGTTTACA TTTCTGTAGN ACAAGATAAA 2349 GACTGTTTAT TGTTTGTGGA TGNAGAGGCA GAAAAGCAGT AGGATGAATG CACTGGTCAT 2409 TTTTCAAGTT GAACAATGTG TCGAC 2434
Claims (16)
- 【請求項1】 以下の性質を有するキチナーゼ。 (イ)キチンのβ−1,4グリコシド結合を切断する活
性を有し、β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を
実質的に有しない。 (ロ)SDS−PAGEにより決定した分子量:約5
0,000(糖鎖を除去した分子量:約4,4500) (ロ)熱安定性:pH4、60℃、10分間の熱処理後
の残存活性70〜75% (ハ)至適pH:4.0付近 (ニ)成熟酵素のN末端30アミノ酸の配列は、配列番
号1で表される。 - 【請求項2】 以下の性質を有するキチナーゼ。 (イ)キチンのβ−1,4グリコシド結合を切断する活
性を有し、β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を
実質的に有しない。 (ロ)SDS−PAGEにより決定した分子量:約5
2,000(糖鎖を除去した分子量:約4,6500) (ロ)熱安定性:pH4、60℃、10分間の熱処理後
の残存活性55〜60% (ハ)至適pH:3.5付近 (ニ)成熟酵素のN末端30アミノ酸の配列は、配列番
号2で表される。 - 【請求項3】 リゾプス・オリゴスポラス(Rhizopus ol
igosporus)により生産されることを特徴とする請求項1
記載のキチナーゼ。 - 【請求項4】 リゾプス・オリゴスポラスにより生産さ
れることを特徴とする請求項2記載のキチナーゼ。 - 【請求項5】 配列番号5(アミノ酸番号1〜518)
で表されるアミノ酸配列を有する請求項1又は3に記載
のキチナーゼ。 - 【請求項6】 配列番号6(アミノ酸番号1〜525)
で表されるアミノ酸配列を有する請求項2又は4に記載
のキチナーゼ。 - 【請求項7】 配列番号5で表されるアミノ酸配列(ア
ミノ酸番号1〜518)を有するキチナーゼをコードす
る遺伝子。 - 【請求項8】 配列番号6で表されるアミノ酸配列(ア
ミノ酸番号1〜525)を有するキチナーゼをコードす
る遺伝子。 - 【請求項9】 配列番号5で表される塩基配列(塩基番
号410〜2015、任意のイントロンを含んでいても
よい)を有する請求項7記載のキチナーゼ遺伝子。 - 【請求項10】 配列番号6で表される塩基配列(塩基
番号414〜2024、任意のイントロンを含んでいて
もよい)を有する請求項8記載のキチナーゼ遺伝子。 - 【請求項11】 配列番号7で表されるアミノ酸配列を
コードするキチナーゼ遺伝子。 - 【請求項12】 配列番号8で表されるアミノ酸配列を
コードするキチナーゼ遺伝子。 - 【請求項13】 配列番号9で表されるアミノ酸配列を
コードするキチナーゼ遺伝子。 - 【請求項14】 配列番号10で表されるアミノ酸配列
をコードするキチナーゼ遺伝子。 - 【請求項15】 配列番号5で表されるアミノ酸配列
(アミノ酸番号1〜518)をコードするキチナーゼ遺
伝子を導入したことを特徴とする酵母。 - 【請求項16】 請求項15記載の酵母を培養し、この
培養上清からキチナーゼを取り出すことを特徴とするキ
チナーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20142792A JPH0824573B2 (ja) | 1992-07-28 | 1992-07-28 | キチナーゼ、キチナーゼ遺伝子及びキチナーゼの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20142792A JPH0824573B2 (ja) | 1992-07-28 | 1992-07-28 | キチナーゼ、キチナーゼ遺伝子及びキチナーゼの製法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0646849A true JPH0646849A (ja) | 1994-02-22 |
JPH0824573B2 JPH0824573B2 (ja) | 1996-03-13 |
Family
ID=16440908
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP20142792A Expired - Fee Related JPH0824573B2 (ja) | 1992-07-28 | 1992-07-28 | キチナーゼ、キチナーゼ遺伝子及びキチナーゼの製法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0824573B2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6020540A (en) * | 1993-04-14 | 2000-02-01 | Cornell Research Foundation, Inc. | Gene encoding endochitinase |
US6512166B1 (en) | 1991-06-17 | 2003-01-28 | Cornell Research Foundation, Inc. | Combinations of fungal cell wall degrading enzyme and fungal cell membrane affecting compound |
CN114807094A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-07-29 | 中国海洋大学 | 甲壳素酶SvChiAJ54及其编码基因与应用 |
US11728055B2 (en) | 2016-06-09 | 2023-08-15 | Shine Technologies, Llc | System and method for performing active scanning of a nuclear fuel rod |
-
1992
- 1992-07-28 JP JP20142792A patent/JPH0824573B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6512166B1 (en) | 1991-06-17 | 2003-01-28 | Cornell Research Foundation, Inc. | Combinations of fungal cell wall degrading enzyme and fungal cell membrane affecting compound |
US6020540A (en) * | 1993-04-14 | 2000-02-01 | Cornell Research Foundation, Inc. | Gene encoding endochitinase |
US11728055B2 (en) | 2016-06-09 | 2023-08-15 | Shine Technologies, Llc | System and method for performing active scanning of a nuclear fuel rod |
CN114807094A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-07-29 | 中国海洋大学 | 甲壳素酶SvChiAJ54及其编码基因与应用 |
CN114807094B (zh) * | 2022-05-05 | 2023-11-28 | 中国海洋大学 | 甲壳素酶SvChiAJ54及其编码基因与应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0824573B2 (ja) | 1996-03-13 |
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