JPH0646849A - キチナーゼ、キチナーゼ遺伝子及びキチナーゼの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 精製された糸状菌のキチナーゼを得、その遺
伝子を単離し、さらに、この遺伝子を用いて糸状菌キチ
ナーゼを生産する。 【構成】 リゾプス・オリゴスポラスから新規キチナー
ゼを精製し、この遺伝子を単離し、この遺伝子を用いて
酵母で前記キチナーゼを生産させる。さらに前記遺伝子
を用いて、リゾプス・ニベウスからキチナーゼ遺伝子を
単離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、キチナーゼ、キチナー
ゼ遺伝子、キチナーゼ遺伝子を有する酵母及びキチナー
ゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物には糸状菌が原因となる病気が種々
存在する。例えば、トマトでは、（葉カビ）Cladospori
um fulvum，（灰色カビ）Botrytis cinerea等が病原菌
として知られている。

【０００３】ところで糸状菌は、その細胞壁を構成する
主要成分の一つとしてキチンを有している。キチンは、
Ｎ−アセチルグルコサミンのβ−グルコシド結合による
重合体であり、キチナーゼ(EC 3.2.1.14)により加水分
解される。

【０００４】それにもにもかかわらず、糸状菌はキチナ
ーゼを生産する。この糸状菌キチナーゼは、菌糸の先端
生長あるいは分岐に重要な役割を果しているのではない
かと推測されてきた。すなわち、菌糸先端部分で細胞壁
のキチンの分解と合成がバランス良く行われることによ
って菌糸は先端生長し、また先端より後方のすでに結晶
化し硬い構造となった細胞壁にキチナーゼなどの分解酵
素が作用することによってこれを柔らかくし、菌糸が分
岐生長するのを助けるという考えである。酵母Saccharo
myces cerevisiaeにおいては、キチナーゼ遺伝子の遺伝
子破壊による実験から、細胞が分裂する際キチナーゼ活
性が必要であることが、最近示されている。

【０００５】一方、糸状菌の菌糸先端の細胞壁は柔軟性
があり、菌糸の伸長にキチナーゼは不要であるという説
もあり、キチナーゼの機能については推測の域を脱し得
ないのが現状である。しかし、Aspergillus nidulansで
は細胞壁にキチナーゼ活性が検出されること(107)、ま
たMucor mucedoなどではキチナーゼがキチン合成酵素と
同様膜画分に不活性型として存在すること等から、糸状
菌キチナーゼが糸状菌自身の細胞壁中のキチンを分解す
るためのものであることは論を待たない。

【０００６】ところで、植物もキチナーゼを有してお
り、これが病原菌に対する防御機構として機能している
と考えられている。この観点から、植物の病原菌に対す
る防御機構の強化を目的として、バクテリア由来のキチ
ナーゼ遺伝子の植物への導入が試みられているが、この
ような目的には抗糸状菌活性の高い糸状菌のキチナーゼ
を利用した方が、より効果的であると考えられる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】糸状菌キチナーゼ遺伝
子を植物の防御機構として応用するためには、その遺伝
子が必要であるが、糸状菌のキチナーゼは活性としては
知られているのみであり、遺伝子が単離されていないば
かりか、タンパクとしての性質もほとんど知られていな
い。したがって、糸状菌キチナーゼに関する研究を行う
ためにも、糸状菌キチナーゼを容易に得られる手段が望
まれる。

【０００８】本発明は、上記観点からなされたものであ
り、精製された糸状菌のキチナーゼを得、その遺伝子を
単離し、さらに、この遺伝子を用いて糸状菌キチナーゼ
を生産することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために、糸状菌キチナーゼを精製して一部の構
造を決定し、これを基にキチナーゼ遺伝子を単離するこ
とに成功し、本発明に至った。

【００１０】すなわち本発明は、糸状菌の生産する特定
のキチナーゼ、このキチナーゼ遺伝子、及びこのキチナ
ーゼ遺伝子を有する酵母、さらにキチナーゼ遺伝子を有
する酵母を培養し、この培養上清からキチナーゼを取り
出すことを特徴とするキチナーゼの製造方法である。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。 ＜１＞本発明のキチナーゼ 本発明のキチナーゼは、キチナーゼ生産菌を培養するこ
とによっても得られるが、キチナーゼ生産菌からキチナ
ーゼ遺伝子を単離し、これをベクターに組み込み、でき
たプラスミドを微生物に導入し、得られた形質転換体を
培養することによっても得られる。

【００１２】キチナーゼ生産菌からキチナーゼを得るに
は、キチナーゼ生産菌を培養し、培養液から、イオン交
換、ゲル濾過等のクロマトグラフィー、硫安塩析、有機
溶媒沈澱等により精製すればよい。キチナーゼの精製法
として、リゾプス属の糸状菌から精製する方法を後述の
実施例に示した。

【００１３】このようにして、リゾプス・オリゴスポラ
スからは２種のキチナーゼが得られ、分子量の小さいも
のをキチナーゼ１、大きいものをキチナーゼ２と命名し
た。精製において、酵素画分の検出は、例えば酵素活性
を測定することにより行う。酵素活性の測定法として、
コロイダルキチンを用いた方法を以下に例示する。

【００１４】キチン粉末を氷冷しておいた濃塩酸に、攪
拌しながらゆっくりと加える。徐々に温度を上げ、３７
℃まで加温し、キチンを溶解させる。溶けきらなかった
キチンは、ガラスフィルターで濾過して除く。濾液を４
℃で、水に攪拌しながら徐々に加え、キチンが再沈澱
し、溶液が白く濁ってからさらに攪拌した後、攪拌をや
め、一晩４℃に静置する。

【００１５】上清をデカンテーションにより除き、水を
加え攪拌し、これを遠心、洗滌して上清のpHが中性にな
るまで繰り返し、再び水に懸濁し、これをコロイダルキ
チン溶液とする。

【００１６】コロイダルキチンと酵素溶液を混合、保温
した後、可溶性となった糖をReissig法を用いて定量す
ることによってキチナーゼ活性を測定する。酵素溶液、
コロイダルキチン溶液、McIlvaine緩衝液（61mM クエン
酸、77mM Na₂HPO₄、pH4.0）を混合し、３７℃、２時間
保温する。５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、試験管
内で上清を、KOHでｐＨを１０．２に調整した0.8M ホウ
酸カリウム水溶液と混合し、アルミキャップで蓋をした
後、沸騰湯浴中に３分間保ち加温する。

【００１７】これを加熱後、急冷し、ｐ−ジメチルアミ
ノベンツアルデヒド(DMAB)試薬を加え混合した後、３７
℃に２０分間保ち、５８５ｎｍの吸収を測定する。DMAB
試薬としては、DMABを１０％(v/v)の濃塩酸を含む氷酢
酸に溶かし、４℃に保存しておき、使用直前に氷酢酸で
１０倍に希釈したものを使用する。

【００１８】精製されたキチナーゼの性質は、基質特異
性、分子量、アミノ酸配列等の構造、反応至適ｐＨ、熱
安定性等を調べることにより行う。基質特異性は、例え
ば、キチンを酵素分解してできる反応生産物の解析や、
N,N'-ジアセチルキトビオースあるいはN,N',N''-トリア
セチルキトトリオースを基質として酵素反応を行い、反
応の有無により調べることができる。分子量は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）
やゲル濾過等により測定することができる。また、アミ
ノ酸配列は、エドマン分解やカルボキシペプチダーゼ等
の反応を利用した常法により決定することができる。反
応至適ｐＨは、異なるｐＨ条件下で酵素活性を比較する
ことにより、熱安定性は、一定条件下で熱処理を行った
後の酵素の残存活性を比較することにより測定する。

【００１９】上述のようにして精製したリゾプス・オリ
ゴスポラスの生産する２種のキチナーゼの性質を以下に
示す。 （キチナーゼ１） (1)キチンのβ−１，４グリコシド結合を切断する活性
を有し、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を実
質的に有しない。 (2)ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した分子量：約５０，
０００（糖鎖を除去した分子量：約４，４５００） (3)熱安定性：ｐＨ４、６０℃、１０分間の熱処理後の
残存活性７０〜７５％ (4)至適ｐＨ：４．０付近 (5)成熟酵素のＮ末端３０アミノ酸の配列は、配列番号
１で表される。

【００２０】（キチナーゼ２） (1)キチンのβ−１，４グリコシド結合を切断する活性
を有し、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を実
質的に有しない。 (2)ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した分子量：約５２，
０００（糖鎖を除去した分子量：約４，６５００） (3)熱安定性：ｐＨ４、６０℃、１０分間の熱処理後の
残存活性５５〜６０％ (4)至適ｐＨ：３．５付近 (5)成熟酵素のＮ末端３０アミノ酸の配列は、配列番号
２で表される。

【００２１】また、キチナーゼ１成熟酵素は、配列番号
５において１〜５１８のアミノ酸番号で表されるアミノ
酸配列を有し、キチナーゼ２成熟酵素は、配列番号６に
おいて１〜５２５のアミノ酸番号で表されるアミノ酸配
列を有すると推定される。

【００２２】＜２＞キチナーゼをコードする遺伝子 遺伝子を単離するには、通常の遺伝子のクローニング方
法を使用することができる。例えば、酵素を精製し、ア
ミノ酸配列を決定し、この配列をもとに合成オリゴヌク
レオチドプローブを作製し、ハイブリダイゼーションに
より遺伝子ライブラリーから選択する。

【００２３】ＤＮＡの切断、連結、トランスフォーメー
ションの方法は、各操作に使用する市販の酵素、コンピ
テントセルに添付されている説明書に記載されている。
また、これらの操作、遺伝子の塩基配列の決定、ハイブ
リダイゼーション等一般の遺伝子組換えに必要な方法
は、Molecular cloning (Maniatis T. et al. Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press)に記載されている。

【００２４】得られた遺伝子が全長に満たない場合、複
数のクローンから得られる断片を繋ぎ代えることによ
り、全長を有する配列を得ることができる。遺伝子クロ
ーニングに先だって、サザン・ブロッティング等により
解析を行っておくと、遺伝子の同定等がしやすい。

【００２５】このようにしてリゾプス・オリゴスポラス
から得られた２種のキチナーゼ遺伝子、及びリゾプス・
ニベウスから得られた４種のキチナーゼ遺伝子の配列
を、配列表の配列番号５〜１０に示した。

【００２６】＜３＞本発明のプラスミド 上記のようにして得られた遺伝子を、適当な宿主−ベク
ター系に導入する。宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵
母、糸状菌、培養細胞等を挙げることができるが、ベク
ターの安定性、活性を有する形での発現、あるいは菌体
外生産の可否等を考慮すると、酵母が好ましい。

【００２７】酵母としては、サッカロマイセス・セレビ
シエ(Sacchromyces cerevisiae) ＥＨ１３−４、ＳＨＹ
３、Ｄ１３−１Ａ、ＭＣ１６等の株を挙げることができ
る。これらの菌株は栄養要求性変異を有するので、それ
らの変異を相補する遺伝子を酵母中で複製可能なプラス
ミドに組み込むことにより、ベクターを作製することが
できる。

【００２８】例えば、ＭＣ１６株は生育にロイシンを要
求する。この要求性を相補する遺伝子をプラスミドにの
せて酵母に入れたとき、ロイシン非要求性となったもの
は、一般にこのプラスミドを保持していると考えられ
る。

【００２９】酵母中で複製可能なプラスミドとしては、
いわゆるYIp、YRp、YEp、YCpのいずれのタイプも使用す
ることができるが、コピー数及び安定性の面からYEpタ
イプが好ましい。これらのプラスミドは一般に不要な配
列を含んでいるので、プラスミドの安定性のため、ある
いはプラスミドの改変を容易にするために、必要でない
配列を削除して用いることが好ましい。

【００３０】適当な宿主−ベクター系を選択、作製した
次のステップとして、適当なプロモーター、必要に応じ
てターミネーターを連結することが必要となる。ただ
し、宿主内で元株のプロモーターが効率よく機能する場
合はこの限りではない。

【００３１】プロモーターとしては、宿主が大腸菌であ
れば、trp、lac、taq、λP_L 等を使用することができ
る。宿主が酵母であればGAL1、GAL7、ADH、TPI、PHO5等
のプロモーターが好ましく、これらの中では、GAL1、GA
L7(Nogi Y. et al. Nucl. Acids Res. 11, 8555-8568
(1983)) が強力であり、誘導が可能であるので特に好ま
しい。

【００３２】ターミネーターとしては、GAL1、TPI、GAP
DH、GAL10等を挙げることができる。上記プロモータ
ー、本発明のキチナーゼ遺伝子、上記ターミネーターを
この順序で連結したものを上記ベクターに挿入すること
によって、本発明のプラスミドを作製することができ
る。

【００３３】宿主としてサッカロマイセス・セレビシエ
EH13-4、GAL1プロモーター、GAPDHターミネーターを用
いて作製したプラスミドの例を後述の実施例に示した。
サッカロマイセス・セレビシエでキチナーゼ１成熟酵素
を発現するプラスミドpCHIM2をトランスフォーメーショ
ンして得られた大腸菌の形質転換体は、微工研菌寄第１
３０６１号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。

【００３４】また、chi2全長を含むプラスミドを保持す
る大腸菌、及びリゾプス・ニベウスのchi1遺伝子を有す
る大腸菌は、それぞれ微工研菌寄第１３０５９号、１３
０６０号として寄託されている（以上宿主はMV1190株、
ベクターはpUC19）。

【００３５】＜４＞本発明のプラスミドを保持するサッ
カロマイセス・セレビシエ 上記のようにして作製したプラスミドを微生物に導入す
ることにより、本発明のキチナーゼを生産する微生物を
作製することができる。これは、プラスミドで微生物細
胞を形質転換することにより得られる。例えば、上記寄
託菌株からプラスミドを回収し、サッカロマイセス・セ
レビシエの形質転換を行えばよい。

【００３６】サッカロマイセス・セレビシエの形質転換
は、常法に従って行えばよい。

【００３７】＜５＞キチナーゼの生産法 前記プラスミドを保持する形質転換体を培養することに
より、本発明のキチナーゼを生産することができる。培
養に際しては、誘導可能なプロモーターを使用した場合
には誘導を行うことが好ましい。

【００３８】以下に、上記サッカロマイセス・セレビシ
エ形質転換体の培養法の例を説明する。形質転換体を、
ＳＤ培地を用いて３０℃で１晩振盪培養（３００r.p.
m）し、この培養液を１０倍量のＳＤ−カザミノ酸培地
（カザミノ酸（Difco製）を終濃度２％含むＳＤ培地）
に移して３０℃で培養を行う。ガラクトースで誘導をか
ける場合には、ＳＤ−カザミノ酸培地で２４時間培養し
た後、滅菌水で菌体を洗滌してから等量のＳＧ−カザミ
ノ酸培地（ＳＤ−カザミノ酸培地のグルコースの代わり
にガラクトースを添加した培地）に移し、３０℃で培養
する。尚、ＳＤ培地の組成は、以下の通りである。

【００３９】ＳＤ培地 yeast nitrogen base w/o amino acids (Difco) ７ｇ グルコース ２０ｇ 水 １０００ｍｌ 生産されたキチナーゼの精製は、上記のキチナーゼ生産
菌と同様にして行えばよい。また、精製された酵素は、
凍結乾燥、限外濾過膜、有機溶媒沈澱等により濃縮する
ことができる。

【００４０】

【実施例】本発明の実施例として、リゾプス・オリゴス
ポラスを用いた例を説明する。

【００４１】

【実施例１】はじめに、本発明のキチナーゼを精製し、
性質を調べた実施例を説明する。

【００４２】（培地） ＳＩＶ培地 Ａ液（L-アスパラギン：２ｇ、５０倍濃縮液：２０ｍ
ｌ、水：４８０ｍｌ）、Ｂ液（グルコース：２０ｇ、
水：４９０ｍｌ）を別々にオートクレーブした後、混合
する。ただし、５０倍濃縮液の組成は、以下の通りであ
る。

【００４３】 KH₂PO₄ ： ２５０ｇ MgSO₄・7H₂O ： ２５ｇ 微量元素溶液 ： ５ｍｌ １４重量％CaCl₂溶液 ： １０ｍｌ 塩酸チアミン ： １００ｍｇ 水 ： １０００ｍｌ

【００４４】微量元素溶液の組成は、以下の通りであ
る。 クエン酸塩酸塩 ： ２ｇ Fe(NO₃)₃・9H₂O ： １．５ｇ ZnSO₄・7H₂O ： １ｇ MnSO₄・H₂O ： ３００ｍｇ CuSO₄・5H₂O ： ５０ｍｇ NaMoO₄・2H₂O ： ５０ｍｇ 水 ： １０００ｍｌ

【００４５】（コロイダルキチンの作製法）コロイダル
キチンは、以下のようにして作製した。キチン粉末（和
光純薬、生化学用試薬）２ｇを氷冷しておいた濃塩酸８
０mlに、攪拌しながらゆっくりと加えた。徐々に温度を
あげ、３７℃まで加温し、キチンを溶解させた。溶けき
らなかったキチンは、Ｇ−３ガラスフィルターで濾過し
て除いた。濾液を４℃で、水８００mlに攪拌しながら徐
々に加えた。キチンが再沈澱し、溶液が白く濁ってから
さらに３０分間攪拌した後、攪拌をやめ、一晩４℃に静
置した。上清をデカンテーションで除いた後、８００ml
の水を加え攪拌し、これを遠心管に移し、５０００×
ｇ、１０分間遠心し上清を捨てた。上清のpHが中性にな
るまで遠心による洗浄を続けた後、１５０ｍｌの水に懸
濁し、これをコロイダルキチン溶液として４℃に保存し
た。

【００４６】（キチナーゼ活性測定法）キチナーゼ活性
は、コロイダルキチンと酵素溶液を混合、保温した後、
可溶性となった糖をReissig法(114)を用いて定量するこ
とによって測定した。

【００４７】酵素溶液５００μl、コロイダルキチン溶
液２５０μl、McIlvaine緩衝液（61mM クエン酸、77mM
Na₂HPO₄、pH4.0）２５０μlを混合し、３７℃、２時間
保温した。５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、試験管
内で上清５００μlを、KOHでｐＨを１０．２に調整した
0.8M ホウ酸カリウム水溶液１００μlと混合し、アルミ
キャップで蓋をした後、沸騰湯浴中に正確に３分間保ち
加温した。

【００４８】これを加熱後、急冷し、ｐ−ジメチルアミ
ノベンツアルデヒド(DMAB)試薬を３．０ml加え混合した
後、３７℃に２０分間保ち、５８５ｎｍの吸収を測定し
た。ただし、DMAB試薬として、DMAB１０ｇを１０％(v/
v)の濃塩酸を含む氷酢酸１００mlに溶かし、４℃に保存
しておき、使用直前に氷酢酸で１０倍に希釈したものを
使用した。

【００４９】活性は、１分間に１μmolのＮ−アセチル
グルコサミンに相当する糖を可溶化させる活性を１単位
とした。

【００５０】（再生キチンの作製法）キトサン（フナコ
シ、キトサン１０Ｂ）１ｇをビーカーに入れ、スターラ
ーで攪拌しながら徐々に１０％氷酢酸２０ｍｌを加え、
キトサンが溶解し、溶液がシロップ状になるまで攪拌を
続けた後、室温に一晩放置した。これをＧ−３ガラスフ
ィルターで濾過し、濾液に９０ｍｌのメタノールを加
え、攪拌しながら１．５ｍｌの無水酢酸をゆっくり滴下
した。１〜２分間攪拌を続け、溶液がゲル状になり、攪
拌棒が回転しなくなった後、室温に３０分間以上放置し
た。ゲルをスパーテルである程度細かくした後、ホモジ
ナイザーを用いてさらに細かく砕いた。これをブフナー
漏斗上、ワットマンＮｏ．２濾紙を用いて充分に水で洗
浄した後、再生キチンとした。

【００５１】（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動(SDS-PAGE)）SDS-PAGEはLaemmliの方法（Nature 227,
680 (1970)）に従い、主に１０％ゲルを用いて行っ
た。蛋白質は、クーマシー・ブリリアント・ブルー Ｒ
−２５０染色あるいは銀染色によって検出した。銀染色
は銀染色キットワコー（和光純薬）を用いて行い、方法
はキットの説明書に従った。

【００５２】（キチナーゼの糖鎖の除去）キチナーゼか
ら糖鎖を除去する方法として、酵素的に行う方法と化学
的に行う方法の２通りの方法を用いた。

【００５３】酵素的に行う場合にはエンドグリコシダー
ゼＨ（生化学工業）を用いて行った。精製したキチナー
ゼ１０μl（約５μg）に重量比で１．２倍になるように
SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を加え、沸騰水浴中で
３分間加熱した。室温まで冷やした後、５０ｍＭ リン
酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)、１ｍＭ フェニルメチルス
ルホニルフルオライド、２０ｍＵ／ｍｌ エンドグリコ
シダーゼＨ中、３７℃で約１２時間反応させた。

【００５４】化学的に行う場合にはトリフルオロメチル
スルホン酸(TFMS、半井化学)を用いて行った。精製した
キチナーゼ約１０μgを乾燥後、窒素ガス下で１５μlの
TFMSに溶解し、氷中に１時間放置した。その後、氷冷し
ておいた１０％(v/v)ｎ−ヘキサンを含むジエチルエー
テルを加え、ドライアイス−エタノール中に２０分間お
いた。ピリジンを１滴加え、さらにドライアイス−エタ
ノール中に４０分間放置し、５０００r.p.m.、３分間遠
心し沈澱を集めた。沈澱をジエチルエーテルで洗浄し、
さらに９５％エタノールで洗浄後、１５０００r.p.m.、
３分間遠心した。沈澱を乾燥後、０．１Ｍ リン酸ナト
リウム緩衝液(pH6.0)、０．１％ＳＤＳ溶液に溶解し試
料とした。

【００５５】（反応至適ｐＨの測定）ｐＨ２．６〜７の
緩衝液を、McIlvaine緩衝液を用いて作製し、各ｐＨに
おいて精製したキチナーゼ約２μgを用いてその活性を
測定した。

【００５６】（熱安定性の測定）精製したキチナーゼ約
２μgを、ｐＨ４．０、６０℃、１０分間加熱した後の
残存する活性を測定することによって行った。

【００５７】（薄層クロマトグラフィー）薄層プレート
としてシリカゲルプレート（silica gel 60：Merk社、5
×10cm）を用いた。このプレートに試料をスポットし、
室温で１−ブタノール：酢酸：水(3:3:2)を展開溶媒と
してクロマトグラフィーを行った。検出は、アニリンフ
タレート試薬を噴霧した後、１０５℃で加熱することに
よって行った。ただし、アニリンフタレート試薬とは、
アニリン０．９３g、フタル酸１．６６gを水飽和１−ブ
タノール１００mlに溶解して調整したものである。

【００５８】（β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活
性測定法）酵素溶液７５０μl、McIlvaine緩衝液(pH4.
0)２５０μlを混合し、３７℃、５分間保温した後、２m
g／ml ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニド（Sigma社）溶液を２００μｌ添加し、３７℃、
１６分間保温した。その後、1M Na₂CO₃溶液５００μｌ
を加え、溶液の４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。
活性は、１分間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを遊
離させる活性を１単位とした。尚、１μmol／mlのｐ−
ニトロフェノールの４２０nmにおける吸収を０．００４
５とした。

【００５９】（Ｎ末端アミノ酸配列の分析）精製した蛋
白質試料を蒸留水に対して充分に透析した後、セントリ
コン−１０（アミコン製）を用いて濃縮した。このよう
にして調製した試料のうち約０．５ｎｍｏｌをプロテイ
ンシークエンサー（Applied Biosystems社 Model４４
７Ａ）にかけ分析した。

【００６０】＜１＞リゾプス・オリゴスポラスの生産す
るキチナーゼの精製 リゾプス・オリゴスポラスは、リゾプス・ニベウスとは
異なり、培養後期に自己溶菌が認められることからキチ
ナーゼ活性が高いのではないかと考え、リゾプス・オリ
ゴスポラスの培養上清中のキチナーゼ活性の検出を試み
た。

【００６１】１０ｍｌのＳＩＶ液体培地を入れた３００
ｍｌ容三角フラスコにリゾプス・オリゴスポラス ＩＦ
Ｏ８６３１株の胞子を植菌し、３０℃、静置培養した
後、培養上清のキチナーゼ活性を測定した。その結果、
培養日数が経過するに従い上清中のキチナーゼ活性も増
加した。

【００６２】次にこのキチナーゼの精製を行った。以下
の操作は、特に示さない限り０〜４℃の範囲で行った。 （１）培養と集菌 リゾプス・オリゴスポラスの培養は、６個の５ｌ容三角
フラスコにそれぞれ８０ｍｌのＳＩＶ液体培地を入れ、
これらにリゾプス・オリゴスポラスの胞子を植菌した
後、３０℃、８日間静置培養することによって行った。
培養後、三角フラスコを４℃に移し、十分に冷えた後、
培養液を攪拌し一晩４℃に放置した。その後、濾過によ
って菌体を除き、濾液を培養上清とした。

【００６３】（２）硫酸アンモニウム沈澱 ｐＨを７に保ちながら、前記培養上清に９０％飽和（６
０３ｇ／ｌ）となるように硫酸アンモニウムを徐々に加
え溶解させた。一晩放置した後、１００００×ｇで３０
分間遠心し、上清を捨てた後、沈澱を４０ｍｌの20mM N
aHCO₃(pH8.4)に溶解し、同じ緩衝液に対し一晩透析し
た。透析後の試料を硫酸アンモニウム沈澱画分とした。

【００６４】（３）再生キチンによるカラムクロマトグ
ラフィー 再生キチンをカラム（カラムサイズ 2.6×10cm）につ
め、カラムを20mM NaHCO ₃(pH8.4)で平衡化させた後、前
記で得られた硫酸アンモニウム画分をチャージし、20mM
NaHCO₃(pH8.4)で洗浄した後、１００ｍｌの２０ｍＭ酢
酸(pH5.4)と１００ｍｌの２０ｍＭ酢酸(pH3.2)によるｐ
Ｈ勾配で浄し、２０ｍＭ酢酸(pH3.2)で溶出させた。流
速は５２ｍｌ／ｈｒで行い、溶出液は１０ｍｌずつ分取
した。

【００６５】２０ｍＭ酢酸で溶出させた場合は、溶出液
をすぐに１Ｍトリス−塩酸(pH7.5)と２Ｍ水酸化ナトリ
ウム水溶液を用いて、終濃度２０ｍＭトリス−塩酸(pH
7.5)となるようにした。溶出パターン図１に示した。５
０〜６９番目の画分をまとめてキチンカラム溶出画分と
した。

【００６６】（４）セファデックスＧ−７５によるカラ
ムクロマトグラフィー 上述のキチンカラム溶出画分をYM-10メンブレンフィル
ター(Amicon)を用いて約5mlまで濃縮し、２０mM Tris-H
Cl(pH7.5)で平衡化したセファデックスＧ−７５（カラ
ムサイズ ２．６×６６ｃｍ）にチャージし、同緩衝液
で溶出させた。流速は１５．３ｍｌ／ｈｒで行い、溶出
液は１０ｍｌずつ分取した。溶出パターンを図２に示し
た。１４〜１８番目の画分をセファデックスＧ−７５溶
出画分とした。

【００６７】（５）ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍによ
るカラムクロマトグラフィー セファデックスＧ−７５溶出画分を、２０ｍＭトリス−
塩酸(pH7.5)で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０
Ｍ（東ソー：カラムサイズ １．６×１６ｃｍ）にチャ
ージし、同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液３００ｍｌと
２０ｍＭトリス−塩酸(pH7.5)、３０ｍＭ食塩溶液３０
０ｍｌを用いて、食塩の直線的濃度勾配で溶出させた。

【００６８】流速は１５ｍｌ／ｈｒで行い、溶出液は１
０ｍｌずつ分取した。溶出パターンを図３に示した。こ
のカラムクロマトグラフィーにより、キチナーゼは２つ
のピークに分離し、SDS-PAGE上でそれぞれほぼ一本のバ
ンドになるまで精製された。ピークＩ、IIに対応するキ
チナーゼをそれぞれキチナーゼ１、２と命名した。

【００６９】これまでの精製の結果を表１にまとめた。

【００７０】

【表１】

【００７１】（６）精製したキチナーゼの諸性質 精製した試料を用いてこれらの酵素の諸性質を検討し
た。初めに反応至適pHについて検討した。各pHにおける
活性を最大活性に対する百分率で表したものが図４であ
る。両酵素の至適pHは、キチナーゼ１ではｐＨ４．０付
近、キチナーゼ２ではｐＨ３．５付近であった。

【００７２】次に熱安定性について検討した。ｐＨ４、
６０℃、１０分間の熱処理後、キチナーゼ１では７３．
３％、キチナーゼ２では５８．５％の活性が残存してい
た。次に、両キチナーゼの分子量と糖鎖について検討し
た。キチナーゼ１、２の分子量はSDS-PAGEの結果からそ
れぞれ約５００００、約５２０００と推定された。

【００７３】エンドグリコシダーゼＨ処理を行った場合
は未処理のものと電気泳動における易動度が同じであっ
たが、TFMS処理によってこれらの易動度は大きくなり、
両酵素には糖鎖が付加され、その糖鎖はエンドクリコシ
ダーゼＨに耐性であることが明かとなった。また、糖鎖
を除去したキチナーゼ１、２の分子量はそれぞれ約４４
５００、約４６５００と推定された。

【００７４】（７）キチナーゼ１、２によるキチン分解
物の同定 キチナーゼ１、２によるキチン分解反応生成物を同定す
るため、両酵素をコロイダルキチンに対し過剰時間作用
させた後、その反応液を薄層クロマトグラフィーによっ
て解析した。主要生成物としてN,N'-ジアセチルキトビ
オースが、またN-アセチルグルコサミンとN,N',N''-ト
リアセチルキトトリオースが少量認められた。

【００７５】次に、N,N'-ジアセチルキトビオースある
いはN,N',N''-トリアセチルキトトリオースを基質とし
て酵素反応を行った。その結果を表２に示した。

【００７６】

【表２】

【００７７】この結果からキチナーゼ１、２ともN,N',
N''-トリアセチルキトトリオースは基質として利用でき
るが、N,N'-ジアセチルキトビオースは利用できないこ
とが示唆された。

【００７８】さらに、N,N'-ジアセチルキトビオースを
分解するβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼ活性につい
て他の基質、ｐ−パラニトロフェニル-β-N-アセチルヘ
キソサミニドを用いて測定した。その結果を表３に示し
た。

【００７９】

【表３】

【００８０】再生キチンに吸着しなかった画分にはN-ア
セチルヘキソサミニダーゼ活性が検出されたが、キチナ
ーゼ１、２には認められなかった。次に、Reissig法(11
4)による糖の検出系について検討した。N-アセチルグル
コサミン、N,N'-ジアセチルキトビオース、N,N',N''-ト
リアセチルキトトリオースを適量用いてそれぞれ発色さ
せた。その結果を表４に示した。

【００８１】

【表４】

【００８２】N,N'-ジアセチルキトビオース、N,N',N''-
トリアセチルキトトリオースに対する感度はN-アセチル
グルコサミンに対する感度の１００分の１以下であっ
た。Reissig法によるキチナーゼ１、２の活性の検出が
可能であったのは、キチナーゼ１、２の反応生成物とし
て、N-アセチルグルコサミンが産生されていたからであ
ると推定された。

【００８３】（７）Ｎ末端アミノ酸配列の解析 精製したキチナーゼ１、２を用いてそれぞれのＮ末端ア
ミノ酸配列の解析を行った。キチナーゼ１については、
３０アミノ酸を決定し、その配列は配列番号１に示した
配列であった。

【００８４】また、キチナーゼ２については、１６アミ
ノ酸を決定し、その配列は配列番号２に示した配列であ
った。両者のＮ末端アミノ酸の配列は非常によく似てお
り、５番目のアミノ酸がキチナーゼ１ではAsnであった
のに対し、キチナーゼ２ではHisであっただけの違いで
あった。

【００８５】

【実施例２】次に、キチナーゼ遺伝子の単離について説
明する。 （１）染色体ＤＮＡの調製法 菌体をガラスフィルターで濾過して集菌し、液体窒素で
凍結した。菌体が再び溶解しないうちに破砕し、ＴＥ緩
衝液を８ｍｌ加え、５０ｍｌ容の容器に移し、更に１０
％ＳＤＳを含むＴＥ緩衝液を４ｍｌ加え、６０℃で３０
分間保温した。

【００８６】その後、フェノール・クロロホルム・イソ
アミルアルコール（25:24:1）を１２ｍｌ加え、激しく
振盪した後、１ｍｌの５Ｍ酢酸カリウムを加え、氷中に
１時間以上放置した。これを、１５０００r.p.m.で１５
分間遠心し、水層を別の容器に移し、２．５倍容のエタ
ノールを加え核酸をエタノール沈澱させた。

【００８７】この沈澱を乾燥させた後、１ｍｌのＴＥ緩
衝液に溶解し、10mg/mlのRNAse A溶液を５μｌ加え、３
７℃で１時間保温し、さらに20mg/mlのプロテイナーゼ
Ｋ溶液を５μｌ加え、３７℃で１時間保温して、ＲＮＡ
及びタンパクを分解させた。これをフェノール抽出４
回、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール
抽出を２回行なってさらにタンパクを除去した後、エタ
ノール沈澱させた。

【００８８】この沈澱を２００μｌのＴＥ緩衝液に溶解
した後、１２０μｌのポリエチレングリコール溶液（２
０％ポリエチレングリコール６０００、2.5M NaCl）を
加え、ＤＮＡを沈澱させ、さらに沈澱を７０％エタノー
ルで洗滌、乾燥後、適当量のＴＥ緩衝液に溶解した。

【００８９】（２）培地は、以下の培地を使用した。 ＰＤ（ポテト・デキストロース）培地 potato dextrose broth (Difco) ： ２４ｇ 水 ：１０００ｍｌ ＬＢ培地 トリプトン（Difco） ： ８ｇ イースト・エキストラクト（Difco）： ５ｇ ＮａＣｌ ： ５ｇ 水 ：１０００ｍｌ λ培地 トリプトン（Difco） ： １０ｇ ＮａＣｌ ： ２．５ｇ 水 ：１０００ｍｌ ＮＺＣ培地 ＮＺアミン タイプＡ（和光純薬） ： １０ｇ ＮａＣｌ ： ５ｇ MgCl₂・6H₂O ： ２ｇ 水 ：１０００ｍｌ これを３０分間オートクレーブした後、カザミノ酸（Di
fco）を終濃度０．１％となるように加える。

【００９０】（３）合成オリゴヌクレオチドプローブの
作製 オリゴヌクレオチドの合成は、アプライドバイオシステ
ム社のＤＮＡシンセサイザー Model 391を用いて行った
（以下同じ）。合成したＤＮＡの樹脂からの抽出、精製
は機械の説明書の方法に従った。

【００９１】（４）サザン解析 ＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動した後、ゲルを0.25
M HClに２０分、 0.6MNaCl, 0.4N NaOH 溶液に１５分間
づつ２回、1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl(pH7.5)溶液に２
０分間、ゆっくり振盪しながら浸漬した。

【００９２】この後、ゲルを２０×ＳＳＣ（3.0M NaCl
0.3M クエン酸ナトリウム溶液）に浸した濾紙の上に置
き、さらにその上にナイロンメンブレン：Hybond-C (Am
ersham社製)を重ねた。濾紙の端は２０×ＳＳＣに漬け
て、１０×ＳＳＣが吸い上げられるようにしておいた。
メンブレンの上にさらにペーパータオルを積み上げて、
１０×ＳＳＣがゲル及びメンブレンを通して濾紙から吸
い上げられるようにした。１晩放置後、メンブレンを風
乾した後、減圧下、８０℃で２時間ベイキングし、ＤＮ
Ａを固定した。

【００９３】ハイブリダイゼーションは、³²Ｐで標識し
た合成オリゴヌクレオチドをプレハイブリダイゼーショ
ン溶液に加え、２０merのプローブの場合は４２℃で、
１４merのプローブの場合は室温で少なくとも１２時間
以上行った。フィルターの洗浄は、６×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ溶液を用い、２０merのプローブの場合は５５
℃で、１４merのプローブの場合は３７℃で行った。

【００９４】フィルターを洗滌、乾燥後、ｘ線フィルム
に露出させ、オートラジオグラムを撮った。

【００９５】（５）プラークハイブリダイゼーション 組換えファージのプラークを、Hybond-NもしくはHybond
-N⁺(Amersham社製)に移し取った。ブロットしたＤＮＡ
のメンブレンへの固定は、Hybond-Nの場合には２時間、
８０℃で処理し、Hybond-N⁺の場合には０．４Ｍ水酸化
ナトリウムによるアルカリ固定を行った。

【００９６】ハイブリダイゼーションは、前記サザン解
析と同じ条件で行い、ついで洗浄、乾燥後ｘ線フィルム
に露出させ、オートラジオグラムを撮った。フィルム上
のポジティブシグナルの位置から、プローブがハイブリ
ダイズしたプラークを同定した。

【００９７】（６）λファージからのDNAの抽出 λファージからのDNAの抽出はDavisらの方法を一部改変
して行なった。 λファージ溶液30μl、E. coli PLKー1
7の一晩培養液30μl、10mM MgCl²/10mM CaCl²溶液３０
μlを混合し、室温に１０分間、さらに３７℃で１５分
間保温した。これを10ml NZC培地に移し、３７℃で振盪
培養した。８〜１２時間後、溶菌が認められた後すぐに
100μlのクロロホルムを加え良く混合し、10,000r.p.
m.、１０分間遠心して上清を取った。

【００９８】上清に10mlのTM buffer(50mM Tris-HCI(pH
7.4)、10mM MgSO₄)を加え、さらに1mg/ml DNaseI溶液を
320μl加え、37℃で15分間保温した。これに、2mlの5M
NaCl、2.2gのPEG6000を加え良く混合した後、氷中に15
分間以上放置した。これを12,000r.p.m.で１０分間遠心
し、沈澱を300μlのTM bufferに溶解した後、1.5ml容の
ミクロ遠心チューブに移した。これに300μlのクロロホ
ルムを加え良く混合し、遠心した後水層を別のチューブ
に移した。このクロロホルム抽出を再度繰り返した後、
水層に15μlの0.5M EDTA(pH8.0)、30μlの5M NaClを加
え、さらに350μlのTE飽和フェノールを加えボルテック
スで良く混合した。

【００９９】これを遠心し、水層を別のチューブに移
し、875μlのエタノールを加えドライアイスに10分間以
上放置した。10分間遠心した後、沈澱を70％エタノール
で洗浄し乾燥させた。これを10μg/mlの濃度でRNase A
を含むTE bufferに溶解し、染色体ＤＮＡ溶液とした。

【０１００】（７）ＤＮＡの制限酵素による反応、末端
のリン酸化、脱リン酸化、塩基配列決定等、ＤＮＡ組換
えの手法は、常法により行った。これらの手法は、Mole
cularcloning (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbo
r Laboratory Press)に詳しい。

【０１０１】＜１＞リゾプス・オリゴスポラス染色体Ｄ
ＮＡライブラリーの作製 リゾプス・オリゴスポラスの全ＤＮＡをSau3AIで部分消
化した後、アルカリホスファターゼ処理を用いて５’末
端の脱リン酸化を行った。これをアガロースゲル電気泳
動で分画し、１０〜２０kbp（キロ塩基対）の大きさの
ＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。一方、ベク
ターとして使用するλ２００１（フナコシ（株）から購
入）は、EcoRIとBamHIで二重消化を行った。

【０１０２】これらのＤＮＡを混合した後、１００ｍＭ
トリス−塩酸(pH7.6)、5mM MgCl₂、３００ｍＭ食塩溶液
に置換し、ライゲーションキット（宝酒造（株））を用
いて連結した。インビトロ・パッケージングキット（Gi
ga pack gold：フナコシ（株）から購入）を用いて前記
ＤＮＡのパッケージを行い、大腸菌P2PLK-17株（STRATA
GENE製）に感染させ、ライブラリーの大きさを確認し
た。

【０１０３】その後、同株を用いて約５０００クローン
づつの、１０バッチに分けライブラリーの増幅を行い、
ライブラリーを得た。尚、増幅させたライブラリーのス
クリーニングは大腸菌PLK17株（STRATAGENE製）を用い
て行った。

【０１０４】＜２＞キチナーゼクローンの検索 キチナーゼ１、２のＮ末端アミノ酸配列を基にして、配
列番号３、４に示した配列を有する、それぞれ２０me
r、１４merの合成オリゴヌクレオチドプローブを作製し
た。２０merプローブは、キチナーゼ１、キチナーゼ２
両遺伝子にハイブリダイズするように、１４merプロー
ブはキチナーゼ１にはハイブリダイズするがキチナーゼ
２にはハイブリダイズしないようにデザインした。

【０１０５】はじめに、リゾプス・オリゴスポラスＤＮ
Ａのサザン解析を行った。EcoRI、HindIIIでそれぞれ消
化した全DNA染色体ＤＮＡを電気泳動後、フィルターに
移し、³²Ｐで標識した２０merプローブを前記条件でハ
イブリダイズさせ、洗滌、乾燥後オートラジオグラフを
撮った。

【０１０６】その結果、EcoRI消化した場合には２．９k
bpの位置に１本のバンドが、HindIII消化した場合には
３．６kbp、１１．５kbpの位置に２本のバンドが検出さ
れた。このことから２０merプローブを用い、同条件で
キチナーゼ１、キチナーゼ２の単離が可能と考えられ
た。

【０１０７】そこで、λ２００１をベクターとして作製
したリゾプス・オリゴスポラスＤＮＡライブラリーを同
じ条件でスクリーニングした。得られた陽性クローンよ
りＤＮＡを抽出し、２０mer及び１４merプローブを用い
たサザン解析を行った。

【０１０８】その結果、２０merプローブ陽性クローン
は、２．９kbp EcoRI断片と３．６kbp HindIII断片にハ
イブリダイズするグループ１と、２．９kbp EcoRI断片
と１１．５kbp HindIII断片にハイブリダイズするグル
ープ２の２つのグループに分かれた。また１４merプロ
ーブはグループ１にのみハイブリダイズした。

【０１０９】そこでこれらのプローブがハイブリダイズ
する領域をサブクローン化し、塩基配列を決定した。そ
の結果を配列番号５、６に示した。グループ１に属する
クローンにおいては、プローブに用いた２０mer、１４m
erの各オリゴヌチレオチドと完全に一致する配列があ
り、さらに塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、精
製したキチナーゼ１から決定した３０アミノ酸からなる
配列と一致する配列が存在していたことから、このクロ
ーンにキチナーゼ１遺伝子（chi1）が含まれていると結
論した。

【０１１０】一方、グループ２に属するクローンにおい
ては、２０merプローブと完全に一致する配列があり、
さらに塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、精製し
たキチナーゼ２から決定した１６アミノ酸からなる配列
と一致する配列が存在していたことから、このクローン
にキチナーゼ２遺伝子（chi2）が含まれていると結論し
た。

【０１１１】また、chi1、chi2の塩基配列から推定され
るアミノ酸配列には、精製したキチナーゼのＮ末端(Ala
⁺¹)の上流に、２２アミノ酸(Met^-22〜Ala^-1)からなる典
型的な分秘シグナル様配列が存在しており、このMetを
コードするATG配列が開始コドンであると推定した。

【０１１２】さらに、開始コドンATGより、chi1の場合
３５７bp、chi2の場合３１３bp 3'下流にイン・フレー
ムで終始コドンが存在し、イントロンが存在することが
推定された。堀内らによって提唱されているリゾプスの
イントロンのコンセンサス配列(119)に従い、それぞれA
sp⁺⁸⁰の位置にそれぞれ５２bp、５３bpからなるイント
ロンを推定すると共に、それぞれ５４０、５４２アミノ
酸をコードする翻訳領域を推定した。

【０１１３】＜３＞リゾプス・オリゴスポラスのキチナ
ーゼのＣ末端アミノ酸配列とアミノ酸組成の解析 （１）Ｃ末端アミノ酸配列の分析 精製したキチナーゼを蒸留水に対して充分に透析した
後、セントリコン-10（アミコン製）を用いて濃縮した
試料約５nmol(約120μl)を用いて、カルボキシペプチダ
ーゼで消化し、遊離されるアミノ酸を同定することによ
ってＣ末端アミノ酸配列の分析を行った。

【０１１４】カルボキシぺプチダーゼとして、カルボキ
シペプチダーゼＡ(Sigma社)とカルボキシペプチダーゼ
Ｂ（フナコシ（株））を使用した。カルボキシペプチダ
ーゼＡは、市販の懸濁液１０μlを冷水１mlで3回洗浄し
た後、沈澱を50mM トリメチルアミン−酢酸緩衝液(pH8.
0)１mlに溶解して調製した。

【０１１５】カルボキシペプチダーゼＢは、市販の酵素
溶液３０μlを、遊離アミノ酸を除くため蒸留水に対し
て２時間以上透析した後、上述の緩衝液１mlあるいは２
mlで希釈して調製した。

【０１１６】精製したキチナーゼ１、２試料各１２０μ
l(約５nmol)に、同緩衝液(pH8.0)を２００μl、上述の
ようにして調製したカルボキシペプチダーゼＡ、Ｂ溶液
をそれぞれ１０μlずつ混合し、３７℃で保温した。反
応液から経時的に５０μlずつサンプリングし、あらか
じめ５μlの氷酢酸を分注しておいたチューブに移し反
応を停止した。

【０１１７】これらをWaters社 Pico-Tag WORK STATION
を使用して乾燥後、エタノール：水：トリエチルアミン
(2:2:1)溶液１０μlで洗浄し、再び乾燥させた。これに
エタノール：トリエチルアミン：水：イソチオシアン酸
フェニル(7:1:1:1)を２０μl加え、室温に２０分間放置
してアミノ酸をフェニルチオカルバモイル化した後、乾
燥させた。これをWatanabeらの方法⁽¹²²⁾に従って、Pic
o-Tagカラムを用いたHPLC（高速液体クロマトグラフィ
ー）によって分析し、アミノ酸の同定を行った。

【０１１８】その結果、キチナーゼ１のＣ末端アミノ酸
配列は-Ser-Ala、キチナーゼ２のＣ末端アミノ酸配列は
-Tyr-(Ser,Lys)-(Val,Ala)であることが明らかとなっ
た。一方、chi1、chi2遺伝子配列から推定されるＣ末端
アミノ酸配列は-Phe-Lysであり、確かにＣ末端領域の切
断が起きていることが示された。

【０１１９】また、chi1から推定されるアミノ酸配列に
おいて、-Ser-Alaの配列は7箇所存在する。すなわち、A
la⁺⁶⁰、Ala⁺¹⁸⁸、Ala⁺²⁰⁴、Ala⁺³²⁷、Ala⁺³⁹⁵、Al
a⁺³⁹⁷、Ala⁺⁵¹⁴である。このうち、糖鎖を除去したキチ
ナーゼ１の分子量が44.5kDaであることを考慮すると、A
la⁺³⁹⁵、Ala⁺³⁹⁷の２箇所がＣ末端切断箇所であると考
えられ、さらに以下に述べる理由でAla⁺³⁹⁵がＣ末端ア
ミノ酸であると結論した。

【０１２０】カルボキシペプチダーゼＡ、Ｂによる消化
で遊離するAlaとSerは同じような割合で増加することか
ら、Ｃ末端アミノ酸配列が-Ser-Ala-Ser-Alaであるより
は-Ser-Alaである可能性が高い。また、長時間カルボキ
シペプチダーゼＡ、Ｂを作用させてもAla、Ser以外のア
ミノ酸が遊離しないことから、Ｃ末端アミノ酸配列が(P
ro)-Ser-Alaである可能性が高い。さらに、以下に述べ
るように、chi1、chi2の遺伝子産物が、非常に類似して
いるにもかかわらずＣ末端領域の切断箇所が異なるの
は、chi2遺伝子産物においてAla⁺³⁹⁵に相当するアミノ
酸がValに置換しているためと考えられることからも、
Ｃ末端は-Ser-Alaであると考えられる。

【０１２１】一方、chi2遺伝子においては、Ala⁺⁴²⁴が
Ｃ末端アミノ酸であると結論した。Ala⁺⁴²⁴が切断点で
あるとすると、Ｃ末端アミノ酸配列は-(Pro)-Tyr-Lys-A
la-Ser-Lys-Val-Alaとなり、カルボキシペプチダーゼ
Ａ、Ｂによる消化の結果である-Tyr-(Lys,Ser)-(Val,Al
a)と矛盾しない。また、この箇所以外にカルボキシぺプ
チダーゼＡ、Ｂによる消化の結果と適合する箇所はなか
った。

【０１２２】また、Ala⁺⁴²⁴をＣ末端アミノ酸とする
と、キチナーゼ１よりＣ末端領域のアミノ酸が２８アミ
ノ酸分だけ長くなり、実施例１で述べたように、糖鎖を
除いたキチナーゼ２の方がキチナーゼ１より約２kDa分
だけペプチド鎖が長いという結果と一致する。さらに、
この２８アミノ酸の中にはLys、Argという正電荷のアミ
ノ酸が４個含まれており、そのためにキチナーゼ２がDE
AE-トヨパール 650Mカラムクロマトグラフィーにおいて
非吸着画分に溶出されてきたと考えられる。

【０１２３】（２）キチナーゼのアミノ酸組成の分析 精製したキチナーゼを蒸留水に対して充分に透析した
後、セントリコン-10を用いて濃縮した。約１nmol(約５
０μl)をWaters社 Pico-Tag WORK STATIONを使用して、
1％フェノールを含む６Ｎ 塩酸により窒素ガス中で１０
５℃、２４時間加水分解を行なった。これを上記と同様
にフェニルチオカルバモイル化した後、Pico-Tagカラム
を用いて分離し、各アミノ酸を定量した。結果を表５に
示す。

【０１２４】

【表５】

【０１２５】この結果は、+1〜+518のアミノ酸組成より
も、+1〜+395のアミノ酸組成と良く一致し、このこと
は、Ala⁺³⁹⁵がＣ末端であることを支持する。chi1、chi
2両遺伝子産物はプレプロ構造を成しており、小胞体膜
の透過の際にプレ配列であるシグナル配列が切断され、
その後さらにＣ末端領域にあるプロ配列が切断されてキ
チナーゼ１、２が産生されることが明かとなった。以
降、プレ配列だけが除去されたものを前駆体型、プレ配
列、プロ配列の両方が除去されたものを成熟型と呼ぶ。

【０１２６】以上の結果から、chi1、chi2の配列は、配
列表の配列番号５、６に示した通りである。chi2全長を
有するプラスミドpOCHI-2を保持する大腸菌（宿主 MV11
90）は、微工研菌寄第１３０５９号として寄託されてい
る。

【０１２７】

【実施例３】酵母におけるキチナーゼの生産について説
明する。 （サッカロマイセス・セレビシエの培養方法）小スケー
ルで培養する場合には直径１９ｍｍの試験管に培地５ml
という条件で行った。前培養として、SD培地で一晩、３
０℃、３００r.p.m.、レシプロ振盪培養し、この培養液
５０mlをSD-カザミノ酸培地に移してさらに３０℃で培
養した。

【０１２８】ガラクトースによる誘導をかける場合に
は、SD-カザミノ酸培地で２４時間培養した後、滅菌水
で菌体を１回洗浄してからSG-カザミノ酸培地２mlに懸
濁し、３０℃で培養した。

【０１２９】大スケールで行なう場合には、前培養を１
０mlスケールで行ない、本培養は５ｌ容三角フラスコに
１ｌの培地を入れて１２０r.p.m.の振盪培養を行なう以
外は小スケールの場合と同様の方法で行った。

【０１３０】（キチナーゼのプロテアーゼ処理法）プロ
テアーゼとして、リゾプスsp.のプロテアーゼ(Sigma社)
とトリプシン(Sigma社)の２種を使用した。リゾプスsp.
のプロテアーゼを用いる場合は、キチナーゼ試料とプロ
テアーゼをMcIlvaine 緩衝液(pH4.0)中で、３７℃で１
５分間保温した後、ぺプスタチンＡ(Sigma社)を加えプ
ロテアーゼを失活させ、キチナーゼ活性を測定した。コ
ントロールとしてはペプスタチンＡを先にキチナーゼ試
料と混合し、これにプロテアーゼを添加して３７℃、１
５分間保温したものを用いた。

【０１３１】トリプシンを用いる場合には、阻害剤とし
て大豆由来のトリプシンインヒヒター(Sigma社)を用い
たこと、また20mM Tris-HCl(pH8.0)内で処理を行なった
以外は、リゾプスsp.のプロテアーゼを用いた場合と同
様の方法で行なった。

【０１３２】（キチナーゼのキチン結合試験法）コロイ
ダルキチン溶液５０μlを遠心して上清を吸い取った
後、キチナーゼ試料５０μl(約5μg、20mM Tris-HCl(pH
8.0))を加え良く混合し、氷中１．５時間放置した。こ
れを遠心し、上清を別のチューブに移し、キチン非結合
画分とした。沈澱を１００μlの20mM Tris-HCl(pH8.0)
で２回洗浄した後、２％SDS、５％β−メルカプトエタ
ノール溶液５０μlに懸濁し、１００℃、４分間加熱処
理をした上清をキチン結合画分としてSDS-PAGEによる解
析の試料とした。

【０１３３】＜１＞サッカロマイセス・セレビシエによ
るキチナーゼの生産 （１）キチナーゼ生産プラスミドの作製 サッカロマイセス・セレビシエでキチナーゼ１の改変体
を発現させるため、部位指定変異の手法を用いてchi1に
対し変異を導入した。 図５に、本実験で使用した合成
オリゴヌクレオチドの配列を、chi1の相当する配列とと
もに示した。合成オリゴヌクレオチド451は、chi1から
推定されるイントロンを除去するために、合成オリゴヌ
クレオチド452は、chi1のプロモーターを交換できるよ
うにするため、開始コドンATGの上流５bpの位置にHindI
II部位を導入するために作製した。

【０１３４】また、合成オリゴヌクレオチド453はキチ
ナーゼ１のＣ末端アミノ酸であるAla ⁺³⁹⁵の直下に停止
コドンTAAとHindIII部位を導入するために、合成オリゴ
ヌクレオチド454はキチナーゼ２の末端アミノ酸に相当
するAla⁺⁴²²の直下に、同様に停止コドンとHindIII部位
を導入するために作製したものである。

【０１３５】さらに、合成オリゴヌクレオチド455、45
6、457はchi1から推定されるアミノ酸配列に存在する3
箇所のAsn結合型の糖鎖付加部位を破壊するために作製
したものである。

【０１３６】これらの合成オリゴヌクレオチドを用い、
chi1を含む３．６Kbp HindIII断片(図６)をプラスミドp
UC119に挿入したプラスミドpCHI6を鋳型として部位指定
変異を行ない、図７に示したような改変体を作製した。
これらの改変体は、成熟型(M)の場合は１．２５Kbp Hin
dIII断片として、また、前駆体型(P)の場合は１．６bp
HindIII-SspI断片(図６参照)として、ターミネーターを
除いた形で得ることが可能である。

【０１３７】これらの断片をpYPR2831、pYPR3831（図
８）由来の８．１Kbp EcoRI-SalI断片と連結し、プラス
ミドpCHIM2、pCHIM3、pCHIP2、pCHIP3、pCHIM22、pCHIM
23、pCHIMdg2、pCHIMdg3、pCHIPdg2、pCHIPdg3を作製し
た（図７）。この場合、プラスミドの最後の数字の２と
３は、それぞれpYPR2831、pYPR3831由来のEcoRI-SalI断
片と連結したことを示すものであり、よって末尾が２で
あるものはグリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデヒ
ドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子プロモーター下流に、３で
あるものはGAL1プロモーター下流に改変体遺伝子が挿入
されていることになる。

【０１３８】これらのプラスミドのうち、pCHIM2を導入
した大腸菌（宿主 MV1190株）は、微工研菌寄第１３０
６１号として寄託した。

【０１３９】（２）サッカロマイセス・セレビシエの生
産するキチナーゼ 上記で得られたプラスミドを用いてサッカロマイセス・
セレビシエ EH13-4を形質転換した。

【０１４０】初めに、pCHIM2、pCHIM3、pCHIP2、pCHIP3
による形質転換体の解析を行なった。これらの形質転換
体を液体培養し、その培養上清のキチナーゼ活性を測定
した。その結果を表６、７に示した。

【０１４１】

【表６】

【０１４２】

【表７】

【０１４３】キチナーゼ遺伝子を含まないプラスミドpY
E209による形質転換体ではその上清にキチナーゼ活性は
ほとんど認められなかったが、前駆体型、成熟型を、GA
PDH遺伝子プロモーターあるいはGAL1プロモーターのど
ちらかによって発現させた場合には上清に有意なキチナ
ーゼ活性が認められた。

【０１４４】また、成熟型を発現させた場合の方が、前
駆体型を発現させた場合と比較して２〜１５倍高い活性
を示した。またコロイダルキチンを含む寒天培地にpYE2
09、pCHIM2、pCHIP2による形質転換遺体を植菌したとこ
ろ、pCHIM2による形質転換体は、pCHIP2による形質転換
体と比較してより大きなハローを形成した。

【０１４５】これらの結果より、成熟型の方が前駆体型
よりキチナーゼ活性が高いことが示唆された。しかし、
この場合、キチナーゼ活性の違いはそれぞれの蛋白質の
分泌量の違いの結果である可能性も考えられる。そこ
で、サッカロマイセス・セレビシエを用いて生産される
成熟型と前駆体型の部分精製を試みた。尚、前駆体型と
しては、pCHIPdg2によるものも合わせて部分精製を試み
た。

【０１４６】成熟型キチナーゼは、pCHIM3による形質転
換体を５００mlスケールで培養し、ガラクトースで１２
時間誘導した後の培養上清を20mM Tris-HCl(pH7.5)に対
し透析した後、DEAE-トヨパール 650M(カラムサイズ1.6
×16cm)にチャージし、０〜３０mMの食塩の直線的濃度
勾配により溶出し、活性を有する画分を集めて行った。

【０１４７】また、前駆体型キチナーゼはpCHIP2、pCHI
Pdg2による形質転換体を９００mlスケールで３０℃、７
２時間培養した後の培養上清を限外濾過により濃縮し、
20mMTris-HCl(pH8.0)に対し透析した後、DEAE-トヨパー
ル 650M(カラムサイズ1.6×16cm)にチャージし、樹脂に
吸着せずに溶出してきたピークを集めて行った。

【０１４８】このようにして調製した試料を各々エンド
グリコシダーゼＨ処理を行ったものについてSDS-PAGEを
行った。その結果、どの場合においても高分子量域にス
メアーなバンドが検出されたが、エンドグリコシダーゼ
Ｈ処理で消失することから、Asn結合型糖鎖が高度に付
加されたものと考えられる。

【０１４９】成熟型の場合、複数のバンドが認められる
が、前駆体型はエンドグリコシダーゼＨ処理で約６３KD
aのほぼ一本のバンドとなり、成熟型より精製度は高い
と思われる。しかし、約５５KDa付近にもバンドが若干
あり、このバンドは成熟型に主要なバンドと位置が一致
していることこから、これらの試料にはサッカロマイセ
ス・セレビシエのプロテアーゼによって一部Ｃ末端領域
が切断されているものが含まれていると考えられた。

【０１５０】これらの試料を用いてキチナーゼ活性を測
定した。また、リゾプスsp.由来のプロテアーゼ、ある
いは、トリプシン処理を行なった後のキチナーゼ活性も
測定し、結果を表８に示した。

【０１５１】

【表８】

【０１５２】成熟型の比活性は、前駆体型の比活性に比
べ９〜１６倍高く、先に述べたように、培養上清中の活
性が成熟型を分泌させた場合の方が高かったのは、分泌
量の差によるのではないことが示された。また、それぞ
れプロテアーゼ処理を行った後キチナーゼ活性を測定し
た場合、成熟型ではその活性にほとんど変化が認められ
ないのに対し、前駆体型では活性の上昇が認められた。

【０１５３】以上の結果から前駆体型は不活性型であ
り、リゾプス・オリゴスポラスのキチナーゼは、不活性
型として合成され、Ｃ末端領域がプロテアーゼによって
切断されて活性化することが強く示唆された。次に、成
熟型と前駆体型のキチン結合能について、SDS-PAGEによ
り検討した。その結果、成熟型、前駆体型共にキチン吸
着画分に濃縮されるバンドが認められ、どちらもキチン
に結合能を示すことが明らかになった。

【０１５４】次にpCHIM22、pCHIM23、pCHIMdg2、pCHIMd
g3による形質転換体の検討を行なった。pCHIM22、pCHIM
dg2による形質転換体を、pCHIM2、pCHIP2、pCHIPdg2に
よる形質転換体とともにコロイダルキチンを含む寒天培
地に植菌し、それらのハロー形成を調べた。

【０１５５】pCHIM22による形質転換体では、ハロー形
成が認められ、この改変体にキチナーゼ活性があると考
えられたが、pCHIMdg2によるものではハローは認められ
なかった。さらにキチナーゼ活性を定量的に検討するた
めに、pCHIM23、pCHIMdg3による形質転換体を液体培養
し、その培養上清のキチナーゼ活性を測定した結果（表
９）、pCHIM3の場合と比較してpCHIM23の場合で約６分
の１、pCHIMdg3の場合で約１０分の１に活性が低下し
た。

【０１５６】

【表９】

【０１５７】このことから、糖鎖がキチナーゼ活性ある
いは分泌に何等かの役割を果していることが示唆され
る。

【０１５８】

【実施例４】次に、リゾプス・ニベウス（R. niveus Ya
mazaki IFO4810株）のキチナーゼ遺伝子の単離を行った
実施例を説明する。

【０１５９】リゾプス・オリゴスポラスのchi2の一部を
含む１．２Kbp KpnI-EcoRI断片（図６参照）をプローブ
として、５６℃の穏やかな条件でHindIIIで消化したリ
ゾプス・ニベウスの全ＤＮＡに対しサザン解析を行なっ
た。その結果、１．０Kb、１．２５Kbp、２．３Kbp、
３．６Kbp、６．０kbpの５本のバンドが検出され、リゾ
プス・ニベウスにもリゾプス・オリゴスポラスのキチナ
ーゼ遺伝子と相同性のある遺伝子が存在し、この条件を
用いてそれらの単離が可能であることが示唆された。

【０１６０】そこで、上述のプローブを用いて、pBR322
をベクターとして作製したリゾプス・ニベウスの染色体
ライブラリー（リゾプス・オリゴスポラスの染色体ライ
ブラリーと同様にして作製したもの）、あるいはpUC11
9、λ2001をベクターベクターとして作製したサブジェ
ノミック ライブラリーをスクリーニングすることによ
って図９に示したような４種の断片を単離した。

【０１６１】これら４種のＤＮＡ断片には、HindIIIで
消化したリゾプス・ニベウスの全DNAに対するサザン解
析で検出された１．２５Kbp、２．３Kbp、３．６Kbp、
６．０kbpのバンドに対応する断片がそれぞれ含まれて
いる。これらの断片の塩基配列を決定した結果、リゾプ
ス・オリゴスポラスのキチナーゼと相同性が認められた
ため、それぞれの遺伝子をchi1、chi2、chi3、chi4と命
名した。

【０１６２】リゾプス・オリゴスポラスのキチナーゼと
の相同性からイントロンを推定し、アミノ酸配列を推定
した結果を、塩基配列と共に配列番号７〜１０に示し
た。このうち、chi1を有するpNCHI-1を保持する大腸菌
は、微工研究菌寄第１３０６０号として寄託した。

【０１６３】

【配列表】

【０１６４】配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・オリコ゛スホ゜ラス(Rhizopus oligosporus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列 Ara Trp Ser Ser Asn Gly Pro Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly Gln Asn 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly Ser Asn Thr Gln Ala Ser Leu Gly Thr Tyr 20 25 30

【０１６５】配列番号：２ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・オリコ゛スホ゜ラス(Rhizopus oligosporus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列 Ala Trp Ser Ser His Gly Pro Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly Gln Asn 1 5 10 15

【０１６６】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGTAYTAYT GGGGNCARAA 20

【０１６７】配列番号：４ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAYGGNCCNA AYGT 14

【０１６８】配列番号：５ 配列の長さ：2527 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・オリコ゛スホ゜ラス(Rhizopus oligosporus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：344..2015 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：344..409 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：410..2015 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：intron 存在位置：648..699 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCATGCACAT AGTAAACAAT GCTTAAACCA GATGACATGC ATACATCTAC AAATGCAACT 60 GACTGATCAT GAAATGGCCG CTTCTTTGTT TTCGAATGAT ATCTCTATCA TTTCTTCCTT 120 TTTATTTCAA TGTAACATGA GTTTTAATAG ATAATATATT ACTTGATATT ATTACTTGAT 180 ATTACCTATG ACCCTAAACT TATTCAGTAA CGTGTAACTT GAGCTGCAAT GGGAAAAAAA 240 GATAATGAAG ACATGGCAAC ATTAGCGCAC ACATATAAAT ACTCACTGGA CATCCTGACA 300 TCAAATCGTT ATCTTTATAC TTTTCTTTCC CTTATTCTTC AAC ATG CTC GCT CGT 355 Met Leu Ala Arg -20 ACT TTC CTT GGA ATG GCT ATA TCT GCC TTT TTG GCG TCG ACT GGT GTT 403 Thr Phe Leu Gly Met Ala Ile Ser Ala Phe Leu Ala Ser Thr Gly Val -15 -10 -5 CAA GCT GCT TGG TCC TCT AAC GGC CCT AAT GTC ATG TAC TAC TGG GGT 451 Gln Ala Ala Trp Ser Ser Asn Gly Pro Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 CAA AAT TCT GCT GGT GGA TCA AAT ACA CAA GCA TCC TTA GGC ACT TAC 499 Gln Asn Ser Ala Gly Gly Ser Asn Thr Gln Ala Ser Leu Gly Thr Tyr 15 20 25 30 TGT GAA TCT GGC CAA GTC GAT GCC GTC CTC CTG TCC TTC CTT CAC GTC 547 Cys Glu Ser Gly Gln Val Asp Ala Val Leu Leu Ser Phe Leu His Val 35 40 45 TTT AAC GTT GGT GGT ACT CCT GAA ATC AAT CTT TCT AGT GCC TGC GCT 595 Phe Asn Val Gly Gly Thr Pro Glu Ile Asn Leu Ser Ser Ala Cys Ala 50 55 60 GGT ACC TAT TTT CCT AAT ACT CAA CTA CTT AGT TGC CCT GCT GTT GGT 643 Gly Thr Tyr Phe Pro Asn Thr Gln Leu Leu Ser Cys Pro Ala Val Gly 65 70 75 GCT G GTAAGTGTTT ATCTTTTGTT GTCGAAGTCT CTTAACATCT CTTTCTTGAT AG 699 Ala AT ATC AAG AAA TGT CAA GAC AAG GGC GTC AAG GTC ATT CTC TCT CTT 746 Asp Ile Lys Lys Cys Gln Asp Lys Gly Val Lys Val Ile Leu Ser Leu 80 85 90 95 GGC GGT GCT GCT GGT GTG TAT GGT TTC ACA AGC GAT GCC CAA GGA CAA 794 Gly Gly Ala Ala Gly Val Tyr Gly Phe Thr Ser Asp Ala Gln Gly Gln 100 105 110 CAG TTC GCA CAG ACG ATC TGG AAC CTC TTT GGT GGC GGA AGC TCA GAC 842 Gln Phe Ala Gln Thr Ile Trp Asn Leu Phe Gly Gly Gly Ser Ser Asp 115 120 125 ACA CGT CCA TTT GGT GAT GCT GTT ATT GAC GGT GTC GAT CTT GAC ATC 890 Thr Arg Pro Phe Gly Asp Ala Val Ile Asp Gly Val Asp Leu Asp Ile 130 135 140 GAA GGT GGC GCA TCT ACG GGT TAT GCT GCC TTT GTG AAT GCT CTT CGT 938 Glu Gly Gly Ala Ser Thr Gly Tyr Ala Ala Phe Val Asn Ala Leu Arg 145 150 155 CAA AAG TTC TCC AGC AAC TTC CTT ATC GGT GCT GCT CCT CAG TGC CCC 986 Gln Lys Phe Ser Ser Asn Phe Leu Ile Gly Ala Ala Pro Gln Cys Pro 160 165 170 175 TTC CCT GAC GCC ATC CTC GGC AGT GTG TTA AAC TCG GCT AGT TTT GAC 1034 Phe Pro Asp Ala Ile Leu Gly Ser Val Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp 180 185 190 TAC GTC AAT GTT CAG TTC TAC AAC AAC TAT TGT TCT GCT ACT GGT TCC 1082 Tyr Val Asn Val Gln Phe Tyr Asn Asn Tyr Cys Ser Ala Thr Gly Ser 195 200 205 TCC TTC AAC TTT GAC ACC TGG GAT AAC TGG GCC AAG ACG ACG TCA CCT 1130 Ser Phe Asn Phe Asn Thr Trp Asp Asn Trp Ala Lys Thr Thr Ser Pro 210 215 220 AAC AAG AAC GTC AAG ATC ATG TTT ACA ATT CCT GGT TCA CCT ACT GCT 1178 Asn Lys Asn Val Lys Ile Met Phe Thr Ile Pro Gly Ser Pro Thr Ala 225 230 235 GCA GGC AGC GGC TAC GTT CCC ATG TCT ACT CTT CAA ACT ATC GTT CCT 1226 Ala Gly Ser Gly Tyr Val Pro Met Ser Thr Leu Gln Thr Ile Val Pro 240 245 250 255 TCT CTT GCT TCC GAG TAC TCG AGC TAT GGT GGT GTC TCG GTC TGG GAT 1274 Ser Leu Ala Ser Glu Tyr Ser Ser Tyr Gly Gly Val Ser Val Trp Asp 260 265 270 GCC TCT CAA GCC TGG AAT AAC GGT GAC TTC AGC TCT CAA CTC TAC TCA 1322 Ala Ser Gln Ala Trp Asn Asn Gly Asp Phe Ser Ser Gln Leu Tyr Ser 275 280 285 CTT GTT CAC AGC GGT GGC TCC ACT CCT CCT CCT TCC TCT TCA ACT ATC 1370 Leu Val His Ser Gly Gly Ser Thr Pro Pro Pro Ser Ser Ser Thr Ile 290 295 300 AAG ACA ACA ACA AAA GCG ACA ACA ACA AGC ACC AAG ACG ACG ACT ACG 1418 Lys Thr Thr Thr Lys Ala Thr Thr Thr Ser Thr Lys Thr Thr Thr Thr 305 310 315 GCT GCC CCT ACT GCT ACC AGC GCA CCT GGC AGT TGT CCT GTT GCC AAT 1466 Ala Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Gly Ser Cys Pro Val Ala Asn 320 325 330 335 CAA TCT TGC TCT ACT CAA AAC CAA TAT GCT TGT ACA GCC GAT GGC AAG 1514 Gln Ser Cys Ser Thr Gln Asn Gln Tyr Ala Cys Thr Ala Asp Gly Lys 340 345 350 TAT GCT GTC TGC GAC CAT GGG AAA TGG GTT GTC TCC TCC TGC CCC TCC 1562 Tyr Ala Val Cys Asp His Gly Lys Trp Val Val Ser Ser Cys Pro Ser 355 360 365 GGC ACT GTC TGC ATT CCT ACT ACC GAT GGC ACC TCT ATC TAT TGT GGT 1610 Gly Thr Val Cys Ile Pro Thr Thr Asp Gly Thr Ser Ile Tyr Cys Gly 370 375 380 TAT GCT ACT GGT TCT GGT AGC ACT TGT CCT TCA GCC AGC GCA CTC GAA 1658 Tyr Ala Thr Gly Ser Gly Ser Thr Cys Pro Ser Ala Ser Ala Leu Glu 385 390 395 ATT GCA GCT GCT TCC TTC GGC TCT AAG AAT GGC CCT GTA CCT CGT CCA 1706 Ile Ala Ala Ala Ser Phe Gly Ser Lys Asn Gly Pro Val Pro Arg Pro 400 405 410 415 TAC AAG GCT TCC AAG GTT GCT GCT CAA CTC GCT GTT ACT TCC ACT GAC 1754 Tyr Lys Ala Ser Lys Val Ala Ala Gln Leu Ala Val Thr Ser Thr Asp 420 425 430 AAG AAT AGC TTT GAA GCC GTT ATC AAT GCT CGT CGT ACC ACG CTC ACT 1802 Lys Asn Ser Phe Glu Ala Val Ile Asn Ala Arg Arg Thr Thr Leu Thr 435 440 445 CCC TTT GAA AAA TCT GTT ACT ATC GAA TTC ACT ACA CCT TCC AAC ATC 1850 Pro Phe Glu Lys Ser Val Thr Ile Glu Phe Thr Thr Pro Ser Asn Ile 450 455 460 AAG TTT ACC GAA TCT GAT ATG GGT CCC GTT CGT CAA GTC GGT AAC AAG 1898 Lys Phe Thr Glu Ser Asp Met Gly Pro Val Arg Gln Val Gly Asn Lys 465 470 475 GTT CGT ATT CAA GCC AAG AAT GAC TAT AAC GAA TCC ATG ACA CTC GTC 1946 Val Arg Ile Gln Ala Lys Asn Asp Tyr Asn Glu Ser Met Thr Leu Val 480 485 490 495 GTC AAA GTC AAG GGT TCC ATC AAC TCA GGC GTC TTT GTG GCT CCC AGT 1994 Val Lys Val Lys Gly Ser Ile Asn Ser Gly Val Phe Val Ala Pro Ser 500 505 510 ACT TCT GCT TGG AAG TTT AAA TAAATATTAT ATTAGATAAT AATAAAAAAG 2045 Thr Ser Ala Trp Lys Phe Lys 515 TGCAATAACG TTTTATTGTA CGTATTGAAG CAGAATTACG TAGTATTATA TTATTAAAAT 2105 TATATTGTAT ATGAATTGTG TGAAAAGATG GTGGAAGAGC GTGTGGATGT ATGTATATTA 2165 TATATATGTA TAGAACAGTG TCATAGCAAT AATTTACAAT GTGTGTTTTG CGTCAAAAAA 2225 AATCAAAAAG GGGAAAAAGT TTGTACAAAA GATTCTTCTT AAAAGTGGAG TGATAAAGGT 2285 GGTGTACTGT TGTGCTTTGG CGTTGCTGCT ATTAAAAAAC AAGAGTTCAG TTTTGGTTGC 2345 TTCTTATTTT TATATATTTA CCTTCATTCA ACTGCTGTTG AGCAGCAGCC ATGGCCATCT 2405 GCATAGCCGT AGCCTTGTTT GCACTGGACG TACCATTCAC AACAGCAGCC ATGTTAGCAG 2465 CAATCATACC ATTGGCCATG GCCACTGCTG CCTGTTGAGG CGTTAGTTTC GTGCGGCTGG 2525 CT 2527

【０１６９】配列番号：６ 配列の長さ：2119 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・オリコ゛スホ゜ラス(Rhizopus oligosporus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：346..2071 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：346..411 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：412..2071 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：intron 存在位置：650..702 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCATGCGCAT AGTAAACAAT GCTTAAACCA GATGACATAC ATACGTCTAT GAATGCAACT 60 GATTGATCAT GAAATAGCCG CTTCTTTGTT TTCGAATGAT ATCCCTACCA TTTCTTCCTT 120 TTTATTTCAA TGTAACATGA GTTTTAATAG GTAATATATT ACTTGATATT ATTACTTGAT 180 ATTACCTATG ACCCTAATCT TATTCATTAA CGTGTAACTT GAGCTGCAAT GGGAAAAAAA 240 AAGATAATGA AGACATGGCA ACATTAGCCC ACGCATATAA ATACTCACTG GACATCCTGA 300 CATCAAATCA TTATCTTTAC ACTTTTCTTT CCCTTATTCT TCAAC ATG CTC ACT CGT 357 Met Leu Thr Arg -20 ACT TTC CTT GGA ATG GCT ATA TCT GCC TTC TTG GCA TCA ACT GGT GTT 405 Thr Phe Leu Gly Met Ala Ile Ser Ala Phe Leu Ala Ser Thr Gly Val -15 -10 -5 CAA GCT GCT TGG TCC TCT CAT GGC CCT AAT GTC ATG TAC TAC TGG GGT 453 Gln Ala Ala Trp Ser Ser His Gly Pro Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 CAA AAT TCT GCT GGC GGA TCA AAT ACA CAA GCA TCC TTA GGC ACT TAC 501 Gln Asn Ser Ala Gly Gly Ser Asn Thr Gln Ala Ser Leu Gly Thr Tyr 15 20 25 30 TGT GAG TCT GGC CAA GTC GAT GCC GTC CTC CTG TCC TTC CTT CAC GTC 549 Cys Glu Ser Gly Gln Val Asp Ala Val Leu Leu Ser Phe Leu His Val 35 40 45 TTT AAC GTT GGT GGT ATC CCT GAA ATC AAT CTT TCT AGC GCC TGT GCT 597 Phe Asn Val Gly Gly Ile Pro Glu Ile Asn Leu Ser Ser Ala Cys Ala 50 55 60 GGT ACC TAT TTT CCC AAT ACT CAA CTA CTT AGT TGT CCT GCT GTT GGT 645 Gly Thr Tyr Phe Pro Asn Thr Gln Leu Leu Ser Cys Pro Ala Val Gly 65 70 75 GCT G GTAAGTGTTA AACCTTTTGT TGTCGGGGTC TCTTAACATC TCTTTCTTGA TAG 702 Ala AT ATC AAG AAA TGT CAA GAC AAG GGC GTC AAG GTC ATA CTC TCT CTT 749 Asp Ile Lys Lys Cys Gln Asp Lys Gly Val Lys Val Ile Leu Ser Leu 80 85 90 95 GGT GGT GCT GCT GGT GTC TAT GGT TTC ACA AGC GAT GCC CAA GGA CAA 797 Gly Gly Ala Ala Gly Val Tyr Gly Phe Thr Ser Asp Ala Gln Gly Gln 100 105 110 CAG TTC GCA CAG ACG ATC TGG AAC CTC TTT GGT GGT GGA AAC TCA GAC 845 Gln Phe Ala Gln Thr Ile Trp Asn Leu Phe Gly Gly Gly Asn Ser Asp 115 120 125 ACA CGT CCA TTT GGT GAT GCT GTT ATT GAC GGT GTC GAT CTT GAC ATT 893 Thr Arg Pro Phe Gly Asp Ala Val Ile Asp Gly Val Asp Leu Asp Ile 135 140 145 GAA GGT GGC TCA TCT ACG GGT TAT GTC GCC TTT GTG AAT GCT CTT CGT 941 Glu Gly Gly Ser Ser Thr Gly Tyr Val Ala Phe Val Asn Ala Leu Arg 150 155 160 CAA AAG TTC TCC AGC AAC TTC CTT ATT GGT GCT GCT CCT CAA TGC CCC 989 Gln Lys Phe Ser Ser Asn Phe Leu Ile Gly Ala Ala Pro Gln Cys Pro 165 170 175 180 TTC CCT GAC GCC ATC CTC GGC AGT GTG TTG AAC TCG GCT AGT TTC GAC 1037 Phe Pro Asp Ala Ile Leu Gly Ser Val Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp 185 190 195 TAC GTC AAT GTT CAG TTC TAT AAC AAC TAT TGC TCT GCT ACT GGT TCC 1085 Tyr Val Asn Val Gln Phe Tyr Asn Asn Tyr Cys Ser Ala Thr Gly Ser 200 205 210 TCC TTC AAC TTT GAC ACC TGG GAT AAC TGG GCC AAG ACG ACG TCA CCT 1133 Ser Phe Asn Phe Asp Thr Trp Asp Asn Trp Ala Lys Thr Thr Ser Pro 215 220 225 AAC AAG AAC GTC AAG ATC ATG TTT ACG GTT CCT GGC TCA TCT ACT GCT 1181 Asn Lys Asn Val Lys Ile Met Phe Thr Val Pro Gly SerSer Thr Ala 230 235 240 GCA GGC AGC GGC TAC GTT CCC ATG TCT ACT CTT CAA ACT ATA GTT CCT 1229 Ala Gly Ser Gly Tyr Val Pro Met Ser Thr Leu Gln Thr Ile Val Pro 245 250 255 260 TCT CTT GCT TCC AAG TAC TCC AGC TAC GGC GGT GTC TCA GTC TGG GAT 1277 Ser Leu Ala Ser Lys Tyr Ser Ser Tyr Gly Gly Val Ser Val Trp Asp 265 270 275 GCC TCT CAA GCC TGG AAT AAC GGT GGC TTC AAC TCT CAA CTC TAC TCG 1325 Ala Ser Gln Ala Trp Asn Asn Gly Gly Phe Asn Ser Gln Leu Tyr Ser 280 285 290 CTT GTC CAC AGC GGT GGC TCC ACT CCT CCT CCT CCT TCC TCT TCT TCA 1373 Leu Val His Ser Gly Gly Ser Thr Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Ser 295 300 305 GCT ACC AAG ACA ACA ACA AAA ACG ACA GCA ACA AGC ACC AAG ACG ACG 1421 Ala Thr Lys Thr Thr Thr Lys Thr Thr Ala Thr Ser Thr Lys Thr Thr 310 315 320 ACT ACG ACT GCC CCT ACT GCT ACC AGC ACA CCT GGC AGT TGT CCT GTT 1469 Thr Thr Thr Ala Pro Thr Ala Thr Ser Thr Pro Gly Ser Cys Pro Val 325 330 335 340 GCC AAT CAG CCT TGC TCT ACT CAA AAT CAA TAT GCT TGT ACA GCC GAT 1517 Ala Asn Gln Pro Cys Ser Thr Gln Asn Gln Tyr Ala Cys Thr Ala Asp 345 350 355 GGC AAG TAC GCT GTC TGC GAC CAT GGC AAA TGG GTT GCC TCC TCC TGC 1565 Gly Lys Tyr Ala Val Cys Asp His Gly Lys Trp Val Ala Ser Ser Cys 360 365 370 CCC TCC AAC ACT GTC TGC ATT CCT ACT ACC GAT GGT GCC TCT ATC TAC 1613 Pro Ser Asn Thr Val Cys Ile Pro Thr Thr Asp Gly Ala Ser Ile Tyr 375 380 385 TGT GGT TAT GCT ACT GGC TCT GGC AGC ACT TGT CCT TCA GTC AGC GCA 1661 Cys Gly Tyr Ala Thr Gly Ser Gly Ser Thr Cys Pro Ser Val Ser Ala 390 395 400 CTC GAA ATT ACA GCT GCT TCT CTC GGC TCT AAG AAT GGC CCC GTA CCT 1709 Leu Glu Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly Ser Lys Asn Gly Pro Val Pro 405 410 415 420 CGC CCA TAC AAG GCT TCC AAG GTT GCT GCT CAA CTC GCT GTT ACT TCC 1757 Arg Pro Tyr Lys Ala Ser Lys Val Ala Ala Gln Leu Ala Val Thr Ser 425 430 435 ACT GAC AAG AAT AGC TTT GAA GCT GTT ATC AAT GCT CGT CGC ACC ACG 1805 Thr Asp Lys Asn Ser Phe Glu Ala Val Ile Asn Ala Arg Arg Thr Thr 440 445 450 CTC ACT CCC TTT GAA AAA TCT GTT ACT ATC GAA TTC ACT ACA CCT TCC 1853 Leu Thr Pro Phe Glu Lys Ser Val Thr Ile Glu Phe Thr Thr Pro Ser 455 460 465 AAC ATC AAG TTT ACC GAA TCT GAT ATG GGT CCC GTT CGT CAA GTC GGC 1901 Asn Ile Lys Phe Thr Glu Ser Asp Met Gly Pro Val Arg Gln Val Gly 470 475 480 AAC AAG GTT CGT ATT CAA GCC AAG AAT GAT TAT AAC GAA TCC ATG ACT 1949 Asn Lys Val Arg Ile Gln Ala Lys Asn Asp Tyr Asn Glu Ser Met Thr 485 490 495 500 CTC GTC GTC AAA GTC AAG GGT TCC ATC AAT TCA GGC GTC TTT GTG GCT 1997 Leu Val Val Lys Val Lys Gly Ser Ile Asn Ser Gly Val Phe Val Ala 505 510 515 CCC AGT ACT TCT GCT TGG AAC TTT AAA TAAATATTGT ATTAGATAAT 2044 Pro Ser Thr Ser Ala Trp Asn Phe Lys 520 525 AATAATAATA AAAAAAGTGC AATAACGTTT TATTGTACGT ATTGAAGCAG ATTTATGTGT 2104 ATTATATTAT TAAAA 2119

【０１７０】配列番号：７ 配列の長さ：2255 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・ニヘ゛ウス(Rhizopus niveus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：138..1747 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：intron 存在位置：243..305, 499..566 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AAGCTTTATA ATAATACATA CTCCTCTTAT TGTTGTTACT TTTTAAAAAA AATAAATAAA 60 GAGTATAAAT ACCTTTAATA GAAAACTAGA CAACTCTTTC ATCTTTCTCG TCTTCCATTC 120 ATTTCTTTAC TGTTAAT ATG ATT TCA TGC AAC ATC CTT GGA ATA ACC ATT 170 Met Ile Ser Cys Asn Ile Leu Gly Ile Thr Ile 1 5 10 GCT GCC TTC ATA ACC AGT ACT CTA GCT GCT TAC TCT TCT AAT GGT GTA 218 Ala Ala Phe Ile Thr Ser Thr Leu Ala Ala Tyr Ser Ser Asn Gly Val 15 20 25 AAT GTG ATG TAT TAT TGG GGT CAG GTAAGTCTAT TTTGCTACTT TTACAAAAGG 272 Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly Gln 30 35 TGCAACTTGT TGACAGCATT TGTGGTCTTT TAG AAC TCT GCC GGT GGT TCC AAT 326 Asn Ser Ala Gly Gly Ser Asn 40 ACA CAA GGT TCA TTG GTG AGT TAT TGC CAG TCA GGT CAA GTA GAT GTG 374 Thr Gln Gly Ser Leu Val Ser Tyr Cys Gln Ser Gly Gln Val Asp Val 45 50 55 ATC ATT TTA TCC TTT TTA AAC AAA TTC AAC ATG GGC GGA CTT CCT GAA 422 Ile Ile Leu Ser Phe Leu Asn Lys Phe Asn Met Gly Gly Leu Pro Glu 60 65 70 ATT AAC TTG GCA AGT GCT TGC GAA CAA ACA TTC TTT CCA AAC ACG AAC 470 Ile Asn Leu Ala Ser Ala Cys Glu Gln Thr Phe Phe Pro Asn Thr Asn 75 80 85 90 TTG CTT CAT TGT CCC ACT GTG GGG TCT G GTAATTAAAT ACTTTGCGAA 518 Leu Leu His Cys Pro Thr Val Gly Ser 95 AAGAACTTTT TTTTAAAAAG CATGTGTTTT TGTTGCTACA AATTATAG AC ATT AAA 574 Asp Ile Lys 100 ACA TGC CAA AGC AAT GGT GTC AAA GTA CTT TTA TCT CTT GGT GGA GCT 622 Thr Cys Gln Ser Asn Gly Val Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly Ala 105 110 115 GCT GGT TCT TAT GGC TTT AGC AGT GAC TCT GAA GGG CAA ACT TTC GCA 670 Ala Gly Ser Tyr Gly Phe Ser Ser Asp Ser Glu Gly Gln Thr Phe Ala 120 125 130 GAG ACC ATT TGG AAT TTA TTT GGC GGT GGC ACT TCT GAT ACA CGC CCA 718 Glu Thr Ile Trp Asn Leu Phe Gly Gly Gly Thr Ser Asp Thr Arg Pro 135 140 145 150 TTT GAC GAT GCG GTA ATT GAT GGT ATT GAT CTC GAC ATT GAA GGC GGA 766 Phe Asp Asp Ala Val Ile Asp Gly Ile Asp Leu Asp Ile Glu Gly Gly 155 160 165 TCA TCT ACT GGT TAT GCT GCC TTT GTC ACC GCT CTT CGT TCA AAG GGT 814 Ser Ser Thr Gly Tyr Ala Ala Phe Val Thr Ala Leu Arg Ser Lys Gly 170 175 180 CAT TTT TTG ATT GGT GCT GCC CCT CAG TGT CCT TTC CCA GAT GCC ATC 862 His Phe Leu Ile Gly Ala Ala Pro Gln Cys Pro Phe Pro Asp Ala Ile 185 190 195 CTT GGA TCT GTT ATC GAT GCA GTT GGA TTG GAT TTC GTC AAT GTT CAA 910 Leu Gly Ser Val Ile Asp Ala Val Gly Leu Asp Phe Val Asn Val Gln 200 205 210 TTC TAC AAT AAT GTC TGT TCT GTT GCC TCA GGC TCT TCC TTT AAC TTT 958 Phe Tyr Asn Asn Val Cys Ser Val Ala Ser Gly Ser Ser Phe Asn Phe 215 220 225 230 GAT GTC TGG AAC GAT TGG GCC AAG AAC AAA TCA CCC AAT AAG AAC ATC 1006 Asp Val Trp Asn Asp Trp Ala Lys Asn Lys Ser Pro Asn Lys Asn Ile 235 240 245 AAG GTG ATG CTG ACC GTT CCT GGC TCC TCC ACT GCT GCT GGA AGT GGC 1054 Lys Val Met Leu Thr Val Pro Gly Ser Ser Thr Ala Ala Gly Ser Gly 250 255 260 TAT GCT TCC ATA GCA GAG CTT GGC CCC ATC GTT TCT TCA GTC ATT TCT 1102 Tyr Ala Ser Ile Ala Glu Leu Gly Pro Ile Val Ser Ser Val Ile Ser 265 270 275 CAG TAT TCT AGC TTT GGT GGC GTC TCT GTC TGG GAT GCG TCA CAA GCC 1150 Gln Tyr Ser Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Trp Asp Ala Ser Gln Ala 280 285 290 TGG AAT AAC AAC GGG TTT CAT TCT GAA CTT TAC AGC ATT GTT CAC GGG 1198 Trp Asn Asn Asn Gly Phe His Ser Glu Leu Tyr Ser Ile Val His Gly 295 300 305 310 TCA AGT GCA GCT TTA GGT CAA GCA GCC AGA AAA ACA CCG TTC CCG AAT 1246 Ser Ser Ala Ala Leu Gly Gln Ala Ala Arg Lys Thr Pro Phe Pro Asn 315 320 325 ACC TCT TCC ATC ACT ACT ACA TCC TTG GCT ACT GCT TCA TCT GCC TTG 1294 Thr Ser Ser Ile Thr Thr Thr Ser Leu Ala Thr Ala Ser Ser Ala Leu 330 335 340 TTC CCT CTT CTA TAT GCT GGT CGG TCT TGC TCT TCT CAA AGC AAA GTG 1342 Phe Pro Leu Leu Tyr Ala Gly Arg Ser Cys Ser Ser Gln Ser Lys Val 345 350 355 TCT TGC ACA TCC ACA GGA TCC TAC ACC ATC TGC AAT TAT GGG AAA TGG 1390 Ser Cys Thr Ser Thr Gly Ser Tyr Thr Ile Cys Asn Tyr Gly Lys Trp 360 365 370 GTC ACT GCT CCT TGT CCT CCA GGT GTA ATT TGC CTC TCA AGC GCC CAA 1438 Val Thr Ala Pro Cys Pro Pro Gly Val Ile Cys Leu Ser Ser Ala Gln 375 380 385 390 TCG AAC AAT ACA GAT CTC ACA GTC TCT GCT CAG TTC TTT ATC ACA TCC 1486 Ser Asn Asn Thr Asp Leu Thr Val Ser Ala Gln Phe Phe Ile Thr Ser 395 400 405 TTC GCC GGG GGA TCT TTT AAA GCT ATC ATC AAT GCA CGT CGT ACA ACA 1534 Phe Ala Gly Gly Ser Phe Lys Ala Ile Ile Asn Ala Arg Arg Thr Thr 410 415 420 TTG ACT CCA TTT GAA AAG ATG AAA ACT ATC GAA TTC ACC GTA CCA GAC 1582 Leu Thr Pro Phe Glu Lys Met Lys Thr Ile Glu Phe Thr Val Pro Asp 425 430 435 CAT GTT CGA TTG AGC CAG TGT AAT TTG GGC AAG ATT GAG CAA GTA GGC 1630 His Val Arg Leu Ser Gln Cys Asn Leu Gly Lys Ile Glu Gln Val Gly 440 445 450 CGC AGT GTC CGC ATT CGA CTC AAG GAT CAT CCA AAT ATG GCA TTT GTG 1678 Arg Ser Val Arg Ile Arg Leu Lys Asp His Pro Asn Met Ala Phe Val 455 460 465 470 CTA AAT CTT AGC GGA AAT GTT TCT TCT GAT GCC TTT GTG GCT CCT GAC 1726 Leu Asn Leu Ser Gly Asn Val Ser Ser Asp Ala Phe Val Ala Pro Asp 475 480 485 CCT TCT TCT TGG CGC TTT AGC TAAAAACATA ATATTTTCTT ATTTGCTAAA 1777 Pro Ser Ser Trp Arg Phe Ser 490 ATATATTAAA AAAAAACAAA AGAGTATGGA TATAATAGAT GGGGTTTGAC CTTTTTTTAT 1837 TGGAGTGTAG GAGGAAGTAT TATTAAAAAA AAGTAATAAG AATTGTCTTA AAATATATAT 1897 AATGTTTGTA TGAGACATGA TTTCATCATA ATTTACAGAG AAAAACGAAA AAAAAAGTGA 1957 AAAGAAAAAA ACGTTTGTAC AACTAGTTTT TCTTTGAAGG GTGAGGACTA GAAATGAAGT 2017 GATAAAGGTG GATTGTTATG TTTTGGAGTA GTTGCTATAT AAAATAAAAT GAGTCAACAT 2077 GTTTAATGTG TATTTTTTTA TTTTAGTCCT TACCTTCGTT TAATTGTTGT TGAGCGGCGG 2137 CCATTGCCAT TTGCATAGCT GCTTTATTTG TATTGGATGA GCCATTGACA ACAGCAGCCA 2197 TGTTGGCAGC GATCATGCCA TTAGCCATAG CAACAGCGGC TTGCTGGGGA GTAAGCTT 2255

【０１７１】配列番号：８ 配列の長さ：2288 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・ニヘ゛ウス(Rhizopus niveus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：526..2220 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：intron 存在位置：628..675, 869..917 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AAGCTTACAC TGACTACCCT CCTCTTGGTC GTTTCGCTGT TCGTGACATG CGTCAAACCG 60 TTGCTGTCGG TGTCATCAAG TCCGTTGAAA AGGTCGACAA GGCCGGTAAG GTCACCAAGG 120 CCGCTGCCAA GGCCGGTAAG AAATAAATTG CTTAATTCTG TTTACCCACT TTGAAAAAAA 180 AAACACATTT TGTGATTTGG TTGAAAAATA ATAAAAAATA AAATTATTAT ATAAAAAGAC 240 ATGTCTTTGA AAGTATTTGA AGTGATTTGG TTGTAAGACA AAGTAGTATG TGTATAATCT 300 TCATTTTGAA ATGATTGACA CTTGATGTGT TGATAAAGCA AGTAGCCCAT ATACCCATAA 360 TCATGGCGTG TATTCTCGTA CATAAATAGG ATGATTCTAC AGAACATGGC ATGTTGTTCA 420 TCAAGGTTTT ATCAAAATGA AAACAACAAC TTTTTTGGAT TTAAAATGTG GAAAGGAAGG 480 AATTTTTTTT GTTTCTTTTA TTATTCTTGA AGACTTTCTT ACTCT ATG TTT ATC CTT 537 Met Phe Ile Leu 1 GGT ATG GTC ATT GCT GGC CTG TTA AAG GCT TTA CAT GTT CAA GCA GCT 585 Gly Met Val Ile Ala Gly Leu Leu Lys Ala Leu His Val Gln Ala Ala 5 10 15 20 TAT TCT TCA AAT GGC CCT AAC GTG ATG TAT TAT TGG GGA CAA 627 Tyr Ser Ser Asn Gly Pro Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly Gln 25 30 GTAAGTGGTA TAAGCTGTCA AAAGGTAAAT TCTTATGGGG ATGGTTAT AAC TCT GCT 684 Asn Ser Ala 35 GGT GGC GCG ACA ACT CAA GGT ACA TTA TCA AGT TAC TGC CAA TCA GGC 732 Gly Gly Ala Thr Thr Gln Gly Thr Leu Ser Ser Tyr Cys Gln Ser Gly 40 45 50 AAA GCA GAC ATC ATC CTC TTG TCA TTT CTT CAT ATC TTC AAT CTG GGT 780 Lys Ala Asp Ile Ile Leu Leu Ser Phe Leu His Ile Phe Asn Leu Gly 55 60 65 GGA TTA CCT CAA ATC AAC CTA TCG AAT GCA TGT GAA AAC ACT TTC TTT 828 Gly Leu Pro Gln Ile Asn Leu Ser Asn Ala Cys Glu Asn Thr Phe Phe 70 75 80 85 CCA AAC AGC CAA CTA CTT TCA TGT CCT GCT ATC GGA TCA G GTAGACTAGT 878 Pro Asn Ser Gln Leu Leu Ser Cys Pro Ala Ile Gly Ser 90 95 CCATGCTGGC CCTCCTTCAA ACGATCTCAT GACTTATAG AC TTC AAG ACA TGT CAA 934 Asp Ile Lys Thr Cys Gln 100 GCC AAA GGA GTC AAG ATT CTC TTG TCT CTG GGT GGG GCT ACT GGG GCT 982 Ala Lys Gly Val Lys Ile Leu Leu Ser Leu Gly Gly Ala Thr Gly Ala 105 110 115 120 TAT GGA TTT ACA AGT GAT GCT GAA GGA CAG CAG TTT GCG GAA ACG CTC 1030 Tyr Gly Phe Thr Ser Asp Ala Glu Gly Gln Gln Phe Ala Glu Thr Leu 125 130 135 TGG AAC TTA TTT GGC CGT GGG TCG TCC GAG ACG CGG CCC TTT GGT GAT 1078 Trp Asn Leu Phe Gly Arg Gly Ser Ser Glu Thr Arg Pro Phe Gly Asp 140 145 150 GCG ATC ATT GAC GGG ATC GAT TTT GAC ATC GAA GGG GGT TCG TCT GGG 1126 Ala Ile Ile Asp Gly Ile Asp Phe Asp Ile Glu Gly Gly Ser Ser Gly 155 160 165 GGC TAT GCG GCC TTG GTC ACT GCC CTT CGT TCG AAA TCA GCC AGC CAG 1174 Gly Tyr Ala Ala Leu Val Thr Ala Leu Arg Ser Lys Ser Ala Ser Gln 170 175 180 GAC TTC TTG ATC GGT GCG GCT CCT CAA TGC CCC TTC CCG GAT GCT CTC 1222 Asp Phe Leu Ile Gly Ala Ala Pro Gln Cys Pro Phe Pro Asp Ala Leu 185 190 195 200 CTT GGA CCG GTG ATC GAT GCG GTC GGA TTG GAT TAT GTC AAT GTT CAG 1270 Leu Gly Pro Val Ile Asp Ala Val Gly Leu Asp Tyr Val Asn Val Gln 205 210 215 220 TTT TAC AAC AAT TAT TGT TCT GCG CTC GGT GCG TCC TTT AAC TTT GAT 1318 Phe Tyr Asn Asn Tyr Cys Ser Ala Leu Gly Ala Ser Phe Asn Phe Asp 225 230 235 GTG TGG GAC ACA TGG GCC AAG ACA CAG TCG GCC AAC AAG CAG ATC AAG 1366 Val Trp Asp Thr Trp Ala Lys Thr Gln Ser Ala Asn Lys Gln Ile Lys 240 245 250 GTC TAT CTG ACC CTA CCT GGC TCT CCT CGT GCT GCT GGC AGT GGC TAT 1414 Val Tyr Leu Thr Leu Pro Gly Ser Pro Arg Ala Ala Gly Ser Gly Tyr 255 260 265 GTC GAC ATG ACC AGC TTG AGT CGT CTG GTG CCT TCT GTC GCG TCT CGG 1462 Val Asp Met Thr Ser Leu Ser Arg Leu Val Pro Ser Val Ala Ser Arg 270 275 280 285 TAC GCA AGC TAT GGC GGT GTG TCT GTG TGG GAT GCA TCC CAG GCT TGG 1510 Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Val Ser Val Trp Asp Ala Ser Gln Ala Trp 300 305 310 AAC AAT CCC GGA TTC CCT TCG TCG CTT TAC GAT CTC GTG CAC GGA TCT 1558 Asn Asn Pro Gly Phe Pro Ser Ser Leu Tyr Asp Leu Val His Gly Ser 315 320 325 GCT CCA GCC CTG ACC ACT TCA ACC GCC AGT CGC AGC ACT TCC TCA CCG 1606 Ala Pro Ala Leu Thr Thr Ser Thr Ala Ser Arg Ser Thr Ser Ser Pro 330 335 340 ATG CCG ACC GTC CCC TCG TCT GGT GCA TGC ACC TCC GAT CAA GCC TGT 1654 Met Pro Thr Val Pro Ser Ser Gly Ala Cys Thr Ser Asp Gln Ala Cys 345 350 355 TCC GTA CCA GGT CAA TAC ATC TGT ACA CCC CAT GGG GCC TAT GCT TTC 1702 Ser Val Pro Gly Gln Tyr Ile Cys Thr Pro His Gly Ala Tyr Ala Phe 360 365 370 375 TGT GTG CAC GGC CAG TGG CTC ACG GCG TCC TGT CCA CCC GGT ACG GTT 1750 Cys Val His Gly Gln Trp Leu Thr Ala Ser Cys Pro Pro Gly Thr Val 380 385 390 TGC ATT CCG ACG GTG GAT GGT GCT TCG ATC TAC TGT GGC TAT GGT ACA 1798 Cys Ile Pro Thr Val Asp Gly Ala Ser Ile Tyr Cys Gly Tyr Gly Thr 395 400 405 CCT GGA TCG AGT TGC GTC CAT GGT CTC AAT GCA TCG AGT GTC GCC CTG 1846 Pro Gly Ser Ser Cys Val His Gly Leu Asn Ala Ser Ser Val Ala Leu 410 415 420 AAC ACC CAG CCA GTC CCT CGT CCT TAC CGT CTT TCA AAC ACG CAT GTT 1894 Asn Thr Gln Pro Val Pro Arg Pro Tyr Arg Leu Ser Asn Thr His Val 425 430 435 CAA CTG GTC ATC ACT TCC TTT TCG GAC CAT GTC TTT GAG GCA ATG ATC 1942 Gln Leu Val Ile Thr Ser Phe Ser Asp His Val Phe Glu Ala Met Ile 440 445 450 455 CAC GCG CGT CGT ACG ACC CTT TTT CCA TTC CAT CCA ACC ATC ACC CTT 1990 His Ala Arg Arg Thr Thr Leu Phe Pro Phe His Pro Thr Ile Thr Leu 460 465 470 GAA TTG AAC GTG TCT GAT CAG GTC CAG TTG GAT CCA TCC AAG GGG GTC 2038 Glu Leu Asn Val Ser Asp Gln Val Gln Leu Asp Pro Ser Lys Gly Val 475 480 485 CAG CAA AAA GAT AAA ACG GTA CGT GTG AAG GTG ATC AAT CCA TCG AAT 2086 Gln Gln Lys Asp Lys Thr Val Arg Val Lys Val Ile Asn Pro Ser Asn 490 495 500 CAA ACC ATG GCC CTT GTT CTT CAC CTC ACC GGA TCT GTA TCT TCC GAT 2134 Gln Thr Met Ala Leu Val Leu His Leu Thr Gly Ser Val Ser Ser Asp 505 510 515 GTC TTT GTG GCC CCT GCT TCC TTG CGT TTC AAC TAAAAACATC TTTATGCTAC 2187 Val Phe Val Ala Pro Ala Ser Leu Arg Phe Asn 520 525 530 ATAAAAAAAA TAAACGGATT GCGATTCAAA GAGAAATACT CGTATAAATG CCCTTGACCA 2247 AGGAGTTTTA TGTTAAAATG AAAAAGGCTG TATCTGAGAA T 2288

【０１７２】配列番号：９ 配列の長さ：2664 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・ニヘ゛ウス(Rhizopus niveus) 株名：ＩＦＯ４８１０ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：239..2388 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：intron 存在位置：296..354, 600..380, 896..960, 995..1058,
1212..1270,1500..1571, 1731..1794 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CAATGCAAAA AATCTGGGCT GAACAAGAAG ACATAGAAAA GGTTCAATGG GGATGTAAAA 60 TAGCTAAAGA GGTTTTGAAT GGAAAATAAT AATAATAATA GAAAAAATGG TATTTTGTTA 120 TTCTAGAATA AAAAAAAATA GGTGCCATTT AGACGATATT TCAATTAATA ATTTTGTTGC 180 TAAAAAGTAG AATCAGTTTA TGAGATTCCT CTTTTTCTCT CTTTCTTCTT TGTTGCAA 238 ATG AAA AAA ACC TTG GTC GTT ATC TCT GCA ATT CTT GGA ATA ACT ACA 286 Met Lys Lys Thr Leu Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Gly Ile Thr Thr 1 5 10 15 GCA TTT GAT GTAAATTTAA ATAATGTTCG TATAAAGTTG ACCATTGCAT 335 Ala Phe Asp TAAGCACTTC TTATTCTAG AAT GCT TGT AAT CAT AAC GTT GTA GGC T 382 Asn Ala Cys Asn His Asn Val Val Gly 20 25 GTAAGTACAA ACACGCTTTT TAATAGCCAA ATAATAAACA TATATAAAAA AAG AT TGG 440 Tyr Trp GGA CAG AAT TCT TTT GGT GCT GCC AAT GGA CAG GAC AGA TCA GGC TGG 488 Gly Gln Asn Ser Phe Gly Ala Ala Asn Gly Gln Asp Arg Ser Gly Trp 30 35 40 CAA AAG TCC ATA AGC TTT TAT TGT GAT GAT GAT TCT TTT GAC GTA TTC 536 Gln Lys Ser Ile Ser Phe Tyr Cys Asp Asp Asp Ser Phe Asp Val Phe 45 50 55 CCA ATT TCC TTT TTA ACA ACT TTC TTC GGT CCT GAT GGT ACG CCT CAA 584 Pro Ile Ser Phe Leu Thr Thr Phe Phe Gly Pro Asp Gly Thr Pro Gln 60 65 70 75 ATC AAC CTT GCC AAT GTAGAAAAAA AGAAGAATAT GTCTTATTAC AACAGACTAA 639 Ile Asn Leu Ala Asn 80 TAATTTCTTA G ACA TGT AAC AAT GTT GAT AAT GCT ACT TTT CCC GGA ACT 689 Thr Cys Asn Asn Val Asp Asn Ala Thr Phe Pro Gly Thr 85 90 ACT CTA GCC AAT TGT CAA ACA ATG GCC CCT GAT ATT AAG TAT TGC CAA 737 Thr Leu Ala Asn Cys Gln Thr Met Ala Pro Asp Ile Lys Tyr Cys Gln 95 100 105 TCA AAG GGC AAG TTA GTT ACC CTT TCT TTG GGT GGG GCT ACG GGC GGT 785 Ser Lys Gly Lys Leu Val Thr Leu Ser Leu Gly Gly Ala Thr Gly Gly 110 115 120 GTT GGA TTC CAG TCT GAT TCT CAA GCT ACC TCA TTT GCT GAT ACT ATT 833 Val Gly Phe Gln Ser Asp Ser Gln Ala Thr Ser Phe Ala Asp Thr Ile 125 130 135 140 TGG AAT CTA TTT CTT GGT GGT GAA TCA TCC ATT CGT CCA TTT GGT GAT 881 Trp Asn Leu Phe Leu Gly Gly Glu Ser Ser Ile Arg Pro Phe Gly Asp 145 150 155 GCT ATC TTA GAC GG GTATACTTGC TTCCGAACAG ACTCATCTTA AAACAAAATA 935 Ala Ile Leu Asp Gly 160 TCTAAACCCT TCATATGTAT ATAG T ATC GAT TTG GAT ATT GAA GGT GGC GGA 987 Ile Asp Leu Asp Ile Glu Gly Gly Gly 165 170 TCT AAC C GTAGTGTATA GAAAAAATAA ACAAAAAGAA AAGGTACAGA TAACTTTGTTT 1044 Ser Asn ATACGTGCAT ATAG AT TAT ACA ACT TTT TTG CAA GCG CTA AGC TCA CAT 1093 His Tyr Thr Thr Phe Leu Gln Ala Leu Ser Ser His 175 180 TTT GTC AAC GCT TCA AAA AAA TAT TAC ATT ACT GCC GCT CCG CAA TGT 1141 Phe Val Asn Ala Ser Lys Lys Tyr Tyr Ile Thr Ala Ala Pro Gln Cys 185 190 195 200 GTG TTC CCT GAT GCC AAC CTC CAA GCT ACC CTA AAT AGT TTT TCA TTT 1189 Val Phe Pro Asp Ala Asn Leu Gln Ala Thr Leu Asn Ser Phe Ser Phe 205 210 215 GAC GCG ATC TAT GGT CAA TTC T GTAAAGCATT TATAATTTAG GAAGGACAAG 1241 Asp Ala Ile Tyr Gly Gln Phe 220 GACTAACCCA CTTTTAAAAT TAAAAAAAG AC CAC AAA CCT TGT GGT CCT CAA 1294 Tyr His Lys Pro Cys Gly Pro Gln 225 230 TTT TTT AAC ACA ATT CAG TGG AAC TTT GGT GTT TGG GAA AAT TGG GCA 1342 Phe Phe Asn Thr Ile Gln Trp Asn Phe Gly Val Trp Glu Asn Trp Ala 235 240 245 CGT ACC TCG TCT CCC AAT CCT AAT GTG AAA GGT TAT ATA GGT GCT CCT 1390 Arg Thr Ser Ser Pro Asn Pro Asn Val Lys Gly Tyr Ile Gly Ala Pro 250 255 260 GCC AGT TCT TCA GCT GCT GGT AGT GGT TAT GTA TCT GCT TCG ACT TTG 1438 Ala Ser Ser Ser Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Val Ser Ala Ser Thr Leu 265 270 275 CTT AAC ATT GCT TTA GAT ACA AGG AAT TAT TTT CCT AGT TTT GGA GGT 1486 Leu Asn Ile Ala Leu Asp Thr Arg Asn Tyr Phe Pro Ser Phe Gly Gly 280 285 290 295 ATT ATG TTT TGG G GTAAAGTTAG AAGAAGAAAA AGCTTCCAGA CCTTACTTCA 1539 Ile Met Phe Trp AAAGAGTGTT TCTTATAATT TGGTTTGAAC AG AT GTT TCG CAA GCA TAC GGA 1591 Asp Val Ser Gln Ala Tyr Gly 300 305 AAT AAC AAA TTT GGG GCT TTT CTA AAG AAT GGG CTA TCC TCT GGC TCA 1639 Asn Asn Lys Phe Gly Ala Phe Leu Lys Asn Gly Leu Ser Ser Gly Ser 310 315 320 AGC TGT AAT GGC AAG TTT AAT TTC TTA CCA TGC ACT GCA CCT GCT TAT 1687 Ser Cys Asn Gly Lys Phe Asn Phe Leu Pro Cys Thr Ala Pro Ala Tyr 325 330 335 GTT AGT GGT ACC GGT TAT AGT GGA GGA AGC AGA GTT CTT ATA A 1730 Val Ser Gly Thr Gly Tyr Ser Gly Gly Ser Arg Val Leu Ile 340 345 350 GTAAGCTATC AAGCATGAAT TTGTATTTAT GTTATCAACT AATATTATTC TAAAAAAAAA 1790 ACAG TG GAT ATA CTT GGA TT GTAAGTTCAA AGTATCTTTA TAATGAATTT 1840 Met Asp Ile Leu Gly Leu 355 TTCAACTAAT TTCAAACAAT AATAGGCTAG A TGG TAT GCC TCT TCG GCT CCT 1892 Trp Tyr Ala Ser Ser Ala Pro 360 365 TCC TCT AGT CCT AGC TCA GAA TGG CTG CCT ATA ATG GCA TGT TCC AAT 1940 Ser Ser Ser Pro Ser Ser Glu Trp Leu Pro Ile Met Ala Cys Ser Asn 370 375 380 GAC AAT AGT GGT TCA ACT TCC GGA TCT TAT ACT TCC AAA ACA TTA CCA 1988 Asp Asn Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Tyr Thr Ser Lys Thr Leu Pro 385 390 395 TCT GGT ACC AAT GCC TCC TCA TCT AGA ATT AAT ATA TCT AGC ACT CCT 2036 Ser Gly Thr Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ile Asn Ile Ser Ser Thr Pro 400 405 410 CAA TCA GTC CAA CCA TCT GCT AGC ATG TCT ACT ACT ACA TTT TAT ACT 2084 Gln Ser Val Gln Pro Ser Ala Ser Met Ser Thr Thr Thr Phe Tyr Thr 415 420 425 AAA TCT AGC GCT GTC CCA AGT ACA ACA TCC TCA GCA GCA ATA ATT TCA 2132 Lys Ser Ser Ala Val Pro Ser Thr Thr Ser Ser Ala Ala Ile Ile Ser 430 435 440 445 TCT CGT TGT GCT AGC ACC CTC CCT TGG TCT CCT TCA GTC GCC TAT ACT 2180 Ser Arg Cys Ala Ser Thr Leu Pro Trp Ser Pro Ser Val Ala Tyr Thr 450 455 460 GGT GGA GTC AAT GTT TAT TAC AAC AAT GCT ATT TGG AGA GCA AAA TGG 2228 Gly Gly Val Asn Val Tyr Tyr Asn Asn Ala Ile Trp Arg Ala Lys Trp 465 470 475 TGG TCT CAA AAT GAT GTC CCC GGA GGC ATC GCT GGC GTT TGG GAA AAG 2276 Trp Ser Gln Asn Asp Val Pro Gly Gly Ile Ala Gly Val Trp Glu Lys 480 485 490 GTT GAA TCT TGC GAA CCA GAG AGA ACA TTG TCT TCT CGA TCT ATC CTG 2324 Val Glu Ser Cys Glu Pro Glu Arg Thr Leu Ser Ser Arg Ser Ile Leu 495 500 505 AAA GGT AAA ATA TAAAGCAAGC AGTCATACAA CTCAGTTAAA ATGTTTCTTT 2376 Lys Gly Lys Ile 510 TAGCGGCCTC ACAAATCAAT TGCAAGCGGA ACATTTTAAG GTGGAGCAAA CTTAAGAACT 2346 ATACCAAAGG GAATAGAGTT TTTTATAAGT AACGACCGAC GAGAAAACGA AAGGAACTTT 2496 TAAATAATTA TCTTTATTTT ATAGAGGAGT AATCTATGCT GCTTCTAGGC CTAACCTTGT 2556 AAGACGTCAC TATAGCACAT GTGTATTATT CGCTAACTTT TTCCTTTTTT TTTTTCGCTT 2616 TTGCACAAAT AGAATCAACA ACCAAACATC AACTCTTTTG ATTGGGAG 2664

【０１７３】配列番号：10 配列の長さ：2434 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・ニヘ゛ウス(Rhizopus niveus) 株名：ＩＦ４８１０ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：236..2130 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：intron 存在位置：335..398, 589..643, 866..950, 1281..133
9, 1212..1270,1500..1571, 1731..1794 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGGTACATGT CCTTTTCGGT CTCTTTCCGT ATGATCATCT TACGTAAACC AAGTACTCAT 60 TAATGATCAA GTAAGTGAAT AAAGGGTTCC CATGATTAGC AACACCTCTC AATTAACAAT 120 TTTATACTGT TTGAAACTTG AATTTTTTTT TAAAGAAAAA AAACCTATAA ATACGTCTAG 180 TTTGACAAGA ATCCTCCTTC TTTTTAAAAA ATACACATTT TTCAAAGAAA CAAAT ATG 238 Met 1 AAT CAC TGG TTC ATA ATC ACC TTC CTC TGC ATC CTT CTC TAT AAA GCT 286 Asn His Trp Phe Ile Ile Thr Phe Leu Cys Ile Leu Leu Tyr Lys Ala 5 10 15 CAA GCC AGC TTT CTT GAT TCC CCT TCG ATT GCG ACA TAT TGG GGA CAG 334 Gln Ala Ser Phe Leu Asp Ser Pro Ser Ile Ala Thr Tyr Trp Gly Gln 20 25 30 GTAAACCAGA TTTGTTTCTA GAGGGGGGGG GGAAACTCAC TGCTGTTTGT TTTCCTTTTG 394 ATAG AAT TCA AAA GGA GGC TCC GAC ACA CAG CAT TCA CTT GCT ACT TAT 443 Asn Ser Lys Gly Gly Ser Asp Thr Gln His Ser Leu Ala Thr Tyr 35 40 45 TGT GAT GGT AAA TCG GAT GTT ATC ATC CTA GCT TTT GTT CTT GAC TTT 491 Cys Asp Gly Lys Ser Asp Val Ile Ile Leu Ala Phe Val Leu Asp Phe 50 55 60 AGG AAT AAG GAG CTT CCT CAA CTT AAC CTT GCA AAT TCA TGT GAC GGA 539 Arg Asn Lys Glu Leu Pro Gln Leu Asn Leu Ala Asn Ser Cys Asp Gly 65 70 75 CCT CGA TTT CCA GGC ACC AAT CTC TTA CAA TGC CCT GAA GTT GGA AAA 587 Pro Arg Phe Pro Gly Thr Asn Leu Leu Gln Cys Pro Glu Val Gly Lys 80 85 90 95 G GTAAATAGGA TTGAATGTTG GATCGATTTT TTGACGATTT CAATAAAATA TGTAG 643 AT ATC AAG ACC TGT CAA AAG AAG GGT AAA ACG ATC TTG TTG TCC TTG 690 Asp Ile Lys Thr Cys Gln Lys Lys Gly Lys Thr Ile Leu Leu Ser Leu 100 105 110 GGT GGT GCT GCT GGC GCT TAT GGG TTT GCT AAT GAC AAA GAT GCT GTT 738 Gly Gly Ala Ala Gly Ala Tyr Gly Phe Ala Asn Asp Lys Asp Ala Val 115 120 125 GCG TTT GCT GAC ACA CTT TGG GCA ACC TTT GGT GGT GGA AAA AGT GAA 786 Ala Phe Ala Asp Thr Leu Trp Ala Thr Phe Gly Gly Gly Lys Ser Glu 130 135 140 AGA CGA CCC TTT GGC GAT GCG GTC GTT GAT GGA TTT GAT CTT GAT ATT 834 Arg Arg Pro Phe Gly Asp Ala Val Val Asp Gly Phe Asp Leu Asp Ile 145 150 155 GAA GGG GGT GGA TCT ACT GGT TAT GCA GTG A GTAACCACTT TCATTCCTTG 885 Glu Gly Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Val 160 165 ACAGACACTC ATCAGTTCAC TTTCACAGGC CATGGTCAAA CGACTTCGCT CTCATTTTAA 945 TTCAG AC AGG TCC AAG AAA TAT TAC ATC ACA GGC GCT CCA CAG TGT CCA 994 Asn Arg Ser Lys Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Ala Pro Gln Cys Pro 170 175 180 TTC CCT GAC GCT ATG CTT GGG CCT GCT TTG GAC GCA TCT GAA TTT GAT 1042 Phe Pro Asp Ala Met Leu Gly Pro Ala Leu Asp Ala Ser Glu Phe Asp 185 190 195 200 GCT GTG TTT GTT CAG TTC TAT AAC AAT TAC TGT TCT ACG ACC AGT GGG 1090 Ala Val Phe Val Gln Phe Tyr Asn Asn Tyr Cys Ser Thr Thr Ser Gly 205 210 215 AAT TTC AAT TTT GAA ACA TGG GAT CAG TGG GCA AGG CAC ACC TCA CCT 1138 Asn Phe Asn Phe Glu Thr Trp Asp Gln Trp Ala Arg His Thr Ser Pro 220 225 230 AAT AGA AAC GTC AAG GTG TTC TTG GGC CTG CCG GGA TCA AGT GCA GCA 1186 Asn Arg Asn Val Lys Val Phe Leu Gly Leu Pro Gly Ser Ser Ala Ala 235 240 245 GCC GGT AGT GGT TAT GTG CCT TAT AAG ACA TTA GAA CCA GTC ATC AGG 1234 Ala Gly Ser Gly Tyr Val Pro Tyr Lys Thr Leu Glu Pro Val Ile Arg 250 255 260 CAC TTG TAT TCA ACC TAT TCG AGC TTT GGA GGT GTG ATG TTA TGG G 1280 His Leu Tyr Ser Thr Tyr Ser Ser Phe Gly Gly Val Met Leu Trp 265 270 275 GTAAGTCAGA GAGGGATGAA TACGAAAACA GATGCCAAAT GACTCCTTTT TTATTGTAG 1339 450 AC GCA TCC GCA TCC TAT AGC AAC AAG GAA GTA TCC CCC CAC TAC CAA 1786 Asp Ala Ser Ala Ser Tyr Ser Asn Lys Glu Val Ser Pro His Tyr Gln 280 285 290 295 GCT GCC ATA TTC AAA TTA TTA TCT AGC CTA AGC AAA GGC GGA CCT AGC 1434 Ala Ala Ile Phe Lys Leu Leu Ser Ser Leu Ser Lys Gly Gly Pro Ser 300 305 310 AAA GGC GGA TCT AGC AAA ACA ATC AAG AAC ACA AAA ACA ATC TCT TCT 1482 Lys Gly Gly Ser Ser Lys Thr Ile Lys Asn Thr Lys Thr Ile Ser Ser 315 320 325 CAT ACA ACC AAG ACC ACA AAG TCC CAT CGA CCT ACA GAC ACC CCC TCT 1530 His Thr Thr Lys Thr Thr Lys Ser His Arg Pro Thr Asp Thr Pro Ser 330 335 340 GTG AGA GAG TGT GTA CAA AAA GAC CAA CCT TGT TCT GGC GGG TTT GCA 1578 Val Arg Glu Cys Val Gln Lys Asp Gln Pro Cys Ser Gly Gly Phe Ala 345 350 355 TGC TCT GGA AAC TCC TTT GCT ACC TGT GTC CAC GGT CGG TGG CTT CTT 1626 Cys Ser Gly Asn Ser Phe Ala Thr Cys Val His Gly Arg Trp Leu Leu 360 365 370 375 CGA CCC TGT CCA GAG GGA CTT GTC TGC CTG TCT TCA ACA GAC GGT GTG 1674 Arg Pro Cys Pro Glu Gly Leu Val Cys Leu Ser Ser Thr Asp Gly Val 380 385 390 TCT GCC TAC TGT GCT CAA GGT AAG GCA AAG ACA TGC ACC CGT CAA GGA 1722 Ser Ala Tyr Cys Ala Gln Gly Lys Ala Lys Thr Cys Thr Arg Gln Gly 395 400 405 TCC TTT CAG GCT TTG GCG GCC GTG GAT TCA TCC GTG GCC AAG GCT TAC 1770 Ser Phe Gln Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Ala Lys Ala Tyr 410 415 420 ACC GGT CGT TCA GTC ACT GCC CAA TTC TCC TTC ATC GGA GCT CGG CAG 1818 Thr Gly Arg Ser Val Thr Ala Gln Phe Ser Phe Ile Gly Ala Arg Gln 425 430 435 CAT CGG TTT ACG GCC ATC CTG AAC GCT CGC TGC TTG TCC CAC CAG GCC 1866 His Arg Phe Thr Ala Ile Leu Asn Ala Arg Cys Leu Ser His Gln Ala 440 445 450 455 TTT GGA GAG AGG GTG AAG GTT CAA TTG AAA GTC AGC CAA GGT ATC AAA 1914 Phe Gly Glu Arg Val Lys Val Gln Leu Lys Val Ser Gln Gly Ile Lys 460 465 470 ATC ACC CAA GTC AAA GGG GGT ACA GTT CGT CAG CAA GGA GAC ACG GTC 1962 Ile Thr Gln Val Lys Gly Gly Thr Val Arg Gln Gln Gly Asp Thr Val 475 480 485 CTC ATC CAC TAT CAC AAT CCG ATT GAC AAG GCC ATG GCC ATT GTG AAT 2010 Leu Ile His Tyr His Asn Pro Ile Asp Lys Ala Met Ala Ile Val Ile 490 495 500 CAG ATG CAG GGG CTG ATG CCA ACC CAT GGG GTG TTT ATA GGA CCA TCG 2058 Gln Met Gln Gly Leu Met Pro Thr His Gly Val Phe Ile Gly Pro Ser 505 510 515 ATG GAT AGC ATC AAG TTT TAT TAGAGATGGA CATGTTTGTG GTTACAAAAG 2109 Met Asp Ser Ile Lys Phe Tyr 520 525 ATAGCAGCAT GCTTGTACAA CCCATCTTTT TACACTAGAA TACAAATAAA GCAGGAAAGA 2169 CGTTCATCTC TTCCTTCTTT ACGTACATTC CACCTTCTTT ATCCTGATTG AGGTTCATTC 2229 TGAATGATGG AAAGGCAAAT GAATAAGGGT CATCACATGG GCTTGAGGAA GGTATTGCTG 2289 CTTTGCTTTG GGACTTTTAT GAAAGATTTC TTTGTTTACA TTTCTGTAGN ACAAGATAAA 2349 GACTGTTTAT TGTTTGTGGA TGNAGAGGCA GAAAAGCAGT AGGATGAATG CACTGGTCAT 2409 TTTTCAAGTT GAACAATGTG TCGAC 2434

【０１７４】

【発明の効果】本発明により、リゾプス・オリゴスポラ
スより２種の新規キチナーゼ及びこれらの遺伝子が単離
された。また、この遺伝子を酵母に導入したことによ
り、酵母により前記新規キチナーゼを生産することが可
能となった。

【０１７５】さらに、リゾプス・ニベウスより４種の新
規キチナーゼ遺伝子と推定される遺伝子が単離された。

【図面の簡単な説明】

【図１】 再生キチンカラムからの溶出パターン

【図２】 セファデックスＧ−７５カラムからの溶出パ
ターン。

【図３】 ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラムからの
溶出パターン。

【図４】 キチナーセ１、２の至適ｐＨを示したグラ
フ。

【図５】 合成オリゴヌクレオチドとchi1の配列の対比
を示した図。

【図６】 chi1、chi2の制限酵素地図。

【図７】 chi1の改変体の構築を示す図。

【図８】 プラスミドpYPR2831、pYPR3831の概略図。

【図９】 リゾプス・ニベウスchi1、chi2、chi3、chi4
の制限酵素地図。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年２月１２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の詳細な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、キチナーゼ、キチナー
ゼ遺伝子、キチナーゼ遺伝子を有する酵母及びキチナー
ゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物には糸状菌が原因となる病気が種々
存在する。例えば、トマトでは、（葉カビ）Cladospori
um fulvum，（灰色カビ）Botrytis cinerea等が病原菌
として知られている。

【０００３】ところで糸状菌は、その細胞壁を構成する
主要成分の一つとしてキチンを有している。キチンは、
Ｎ−アセチルグルコサミンのβ−グルコシド結合による
重合体であり、キチナーゼ(EC 3.2.1.14)により加水分
解される。

【０００４】それにもにもかかわらず、糸状菌はキチナ
ーゼを生産する。この糸状菌キチナーゼは、菌糸の先端
生長あるいは分岐に重要な役割を果しているのではない
かと推測されてきた。すなわち、菌糸先端部分で細胞壁
のキチンの分解と合成がバランス良く行われることによ
って菌糸は先端生長し、また先端より後方のすでに結晶
化し硬い構造となった細胞壁にキチナーゼなどの分解酵
素が作用することによってこれを柔らかくし、菌糸が分
岐生長するのを助けるという考えである。酵母Saccharo
myces cerevisiaeにおいては、キチナーゼ遺伝子の遺伝
子破壊による実験から、細胞が分裂する際キチナーゼ活
性が必要であることが、最近示されている。

【０００５】一方、糸状菌の菌糸先端の細胞壁は柔軟性
があり、菌糸の伸長にキチナーゼは不要であるという説
もあり、キチナーゼの機能については推測の域を脱し得
ないのが現状である。しかし、Aspergillus nidulansで
は細胞壁にキチナーゼ活性が検出されること(107)、ま
たMucor mucedoなどではキチナーゼがキチン合成酵素と
同様膜画分に不活性型として存在すること等から、糸状
菌キチナーゼが糸状菌自身の細胞壁中のキチンを分解す
るためのものであることは論を待たない。

【０００６】ところで、植物もキチナーゼを有してお
り、これが病原菌に対する防御機構として機能している
と考えられている。この観点から、植物の病原菌に対す
る防御機構の強化を目的として、バクテリア由来のキチ
ナーゼ遺伝子の植物への導入が試みられているが、この
ような目的には抗糸状菌活性の高い糸状菌のキチナーゼ
を利用した方が、より効果的であると考えられる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】糸状菌キチナーゼ遺伝
子を植物の防御機構として応用するためには、その遺伝
子が必要であるが、糸状菌のキチナーゼは活性としては
知られているのみであり、遺伝子が単離されていないば
かりか、タンパクとしての性質もほとんど知られていな
い。したがって、糸状菌キチナーゼに関する研究を行う
ためにも、糸状菌キチナーゼを容易に得られる手段が望
まれる。

【０００８】本発明は、上記観点からなされたものであ
り、精製された糸状菌のキチナーゼを得、その遺伝子を
単離し、さらに、この遺伝子を用いて糸状菌キチナーゼ
を生産することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために、糸状菌キチナーゼを精製して一部の構
造を決定し、これを基にキチナーゼ遺伝子を単離するこ
とに成功し、本発明に至った。

【００１０】すなわち本発明は、糸状菌の生産する特定
のキチナーゼ、このキチナーゼ遺伝子、及びこのキチナ
ーゼ遺伝子を有する酵母、さらにキチナーゼ遺伝子を有
する酵母を培養し、この培養上清からキチナーゼを取り
出すことを特徴とするキチナーゼの製造方法である。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。 ＜１＞本発明のキチナーゼ 本発明のキチナーゼは、キチナーゼ生産菌を培養するこ
とによっても得られるが、キチナーゼ生産菌からキチナ
ーゼ遺伝子を単離し、これをベクターに組み込み、でき
たプラスミドを微生物に導入し、得られた形質転換体を
培養することによっても得られる。

【００１２】キチナーゼ生産菌からキチナーゼを得るに
は、キチナーゼ生産菌を培養し、培養液から、イオン交
換、ゲル濾過等のクロマトグラフィー、硫安塩析、有機
溶媒沈澱等により精製すればよい。キチナーゼの精製法
として、リゾプス属の糸状菌から精製する方法を後述の
実施例に示した。

【００１３】このようにして、リゾプス・オリゴスポラ
スからは２種のキチナーゼが得られ、分子量の小さいも
のをキチナーゼ１、大きいものをキチナーゼ２と命名し
た。精製において、酵素画分の検出は、例えば酵素活性
を測定することにより行う。酵素活性の測定法として、
コロイダルキチンを用いた方法を以下に例示する。

【００１４】キチン粉末を氷冷しておいた濃塩酸に、攪
拌しながらゆっくりと加える。徐々に温度を上げ、３７
℃まで加温し、キチンを溶解させる。溶けきらなかった
キチンは、ガラスフィルターで濾過して除く。濾液を４
℃で、水に攪拌しながら徐々に加え、キチンが再沈澱
し、溶液が白く濁ってからさらに攪拌した後、攪拌をや
め、一晩４℃に静置する。

【００１５】上清をデカンテーションにより除き、水を
加え攪拌し、これを遠心、洗滌して上清のpHが中性にな
るまで繰り返し、再び水に懸濁し、これをコロイダルキ
チン溶液とする。

【００１６】コロイダルキチンと酵素溶液を混合、保温
した後、可溶性となった糖をReissig法を用いて定量す
ることによってキチナーゼ活性を測定する。酵素溶液、
コロイダルキチン溶液、McIlvaine緩衝液（61mM クエン
酸、77mM Na₂HPO₄、pH4.0）を混合し、３７℃、２時間
保温する。５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、試験管
内で上清を、KOHでｐＨを１０．２に調整した0.8M ホウ
酸カリウム水溶液と混合し、アルミキャップで蓋をした
後、沸騰湯浴中に３分間保ち加温する。

【００１７】これを加熱後、急冷し、ｐ−ジメチルアミ
ノベンツアルデヒド(DMAB)試薬を加え混合した後、３７
℃に２０分間保ち、５８５ｎｍの吸収を測定する。DMAB
試薬としては、DMABを１０％(v/v)の濃塩酸を含む氷酢
酸に溶かし、４℃に保存しておき、使用直前に氷酢酸で
１０倍に希釈したものを使用する。

【００１８】精製されたキチナーゼの性質は、基質特異
性、分子量、アミノ酸配列等の構造、反応至適ｐＨ、熱
安定性等を調べることにより行う。基質特異性は、例え
ば、キチンを酵素分解してできる反応生産物の解析や、
N,N'-ジアセチルキトビオースあるいはN,N',N''-トリア
セチルキトトリオースを基質として酵素反応を行い、反
応の有無により調べることができる。分子量は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）
やゲル濾過等により測定することができる。また、アミ
ノ酸配列は、エドマン分解やカルボキシペプチダーゼ等
の反応を利用した常法により決定することができる。反
応至適ｐＨは、異なるｐＨ条件下で酵素活性を比較する
ことにより、熱安定性は、一定条件下で熱処理を行った
後の酵素の残存活性を比較することにより測定する。

【００１９】上述のようにして精製したリゾプス・オリ
ゴスポラスの生産する２種のキチナーゼの性質を以下に
示す。 （キチナーゼ１） (1)キチンのβ−１，４グリコシド結合を切断する活性
を有し、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を実
質的に有しない。 (2)ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した分子量：約５０，
０００（糖鎖を除去した分子量：約４，４５００） (3)熱安定性：ｐＨ４、６０℃、１０分間の熱処理後の
残存活性７０〜７５％ (4)至適ｐＨ：４．０付近 (5)成熟酵素のＮ末端３０アミノ酸の配列は、配列番号
１で表される。

【００２０】（キチナーゼ２） (1)キチンのβ−１，４グリコシド結合を切断する活性
を有し、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を実
質的に有しない。 (2)ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した分子量：約５２，
０００（糖鎖を除去した分子量：約４，６５００） (3)熱安定性：ｐＨ４、６０℃、１０分間の熱処理後の
残存活性５５〜６０％ (4)至適ｐＨ：３．５付近 (5)成熟酵素のＮ末端３０アミノ酸の配列は、配列番号
２で表される。

【００２１】また、キチナーゼ１成熟酵素は、配列番号
５において１〜５１８のアミノ酸番号で表されるアミノ
酸配列を有し、キチナーゼ２成熟酵素は、配列番号６に
おいて１〜５２５のアミノ酸番号で表されるアミノ酸配
列を有すると推定される。

【００２２】＜２＞キチナーゼをコードする遺伝子 遺伝子を単離するには、通常の遺伝子のクローニング方
法を使用することができる。例えば、酵素を精製し、ア
ミノ酸配列を決定し、この配列をもとに合成オリゴヌク
レオチドプローブを作製し、ハイブリダイゼーションに
より遺伝子ライブラリーから選択する。

【００２３】ＤＮＡの切断、連結、トランスフォーメー
ションの方法は、各操作に使用する市販の酵素、コンピ
テントセルに添付されている説明書に記載されている。
また、これらの操作、遺伝子の塩基配列の決定、ハイブ
リダイゼーション等一般の遺伝子組換えに必要な方法
は、Molecular cloning (Maniatis T. et al. Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press)に記載されている。

【００２４】得られた遺伝子が全長に満たない場合、複
数のクローンから得られる断片を繋ぎ代えることによ
り、全長を有する配列を得ることができる。遺伝子クロ
ーニングに先だって、サザン・ブロッティング等により
解析を行っておくと、遺伝子の同定等がしやすい。

【００２５】このようにしてリゾプス・オリゴスポラス
から得られた２種のキチナーゼ遺伝子、及びリゾプス・
ニベウスから得られた４種のキチナーゼ遺伝子の配列
を、配列表の配列番号５〜１０に示した。

【００２６】＜３＞本発明のプラスミド 上記のようにして得られた遺伝子を、適当な宿主−ベク
ター系に導入する。宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵
母、糸状菌、培養細胞等を挙げることができるが、ベク
ターの安定性、活性を有する形での発現、あるいは菌体
外生産の可否等を考慮すると、酵母が好ましい。

【００２７】酵母としては、サッカロマイセス・セレビ
シエ(Sacchromyces cerevisiae) ＥＨ１３−４、ＳＨＹ
３、Ｄ１３−１Ａ、ＭＣ１６等の株を挙げることができ
る。これらの菌株は栄養要求性変異を有するので、それ
らの変異を相補する遺伝子を酵母中で複製可能なプラス
ミドに組み込むことにより、ベクターを作製することが
できる。

【００２８】例えば、ＭＣ１６株は生育にロイシンを要
求する。この要求性を相補する遺伝子をプラスミドにの
せて酵母に入れたとき、ロイシン非要求性となったもの
は、一般にこのプラスミドを保持していると考えられ
る。

【００２９】酵母中で複製可能なプラスミドとしては、
いわゆるYIp、YRp、YEp、YCpのいずれのタイプも使用す
ることができるが、コピー数及び安定性の面からYEpタ
イプが好ましい。これらのプラスミドは一般に不要な配
列を含んでいるので、プラスミドの安定性のため、ある
いはプラスミドの改変を容易にするために、必要でない
配列を削除して用いることが好ましい。

【００３０】適当な宿主−ベクター系を選択、作製した
次のステップとして、適当なプロモーター、必要に応じ
てターミネーターを連結することが必要となる。ただ
し、宿主内で元株のプロモーターが効率よく機能する場
合はこの限りではない。

【００３１】プロモーターとしては、宿主が大腸菌であ
れば、trp、lac、taq、λP_L 等を使用することができ
る。宿主が酵母であればGAL1、GAL7、ADH、TPI、PHO5等
のプロモーターが好ましく、これらの中では、GAL1、GA
L7(Nogi Y. et al. Nucl. Acids Res. 11, 8555-8568
(1983)) が強力であり、誘導が可能であるので特に好ま
しい。

【００３２】ターミネーターとしては、GAL1、TPI、GAP
DH、GAL10等を挙げることができる。上記プロモータ
ー、本発明のキチナーゼ遺伝子、上記ターミネーターを
この順序で連結したものを上記ベクターに挿入すること
によって、本発明のプラスミドを作製することができ
る。

【００３３】宿主としてサッカロマイセス・セレビシエ
EH13-4、GAL1プロモーター、GAPDHターミネーターを用
いて作製したプラスミドの例を後述の実施例に示した。
サッカロマイセス・セレビシエでキチナーゼ１成熟酵素
を発現するプラスミドpCHIM2をトランスフォーメーショ
ンして得られた大腸菌の形質転換体は、微工研菌寄第１
３０６１号として工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。

【００３４】また、chi2全長を含むプラスミドを保持す
る大腸菌、及びリゾプス・ニベウスのchi1遺伝子を有す
る大腸菌は、それぞれ微工研菌寄第１３０５９号、１３
０６０号として寄託されている（以上宿主はMV1190株、
ベクターはpUC19）。

【００３５】＜４＞本発明のプラスミドを保持するサッ
カロマイセス・セレビシエ 上記のようにして作製したプラスミドを微生物に導入す
ることにより、本発明のキチナーゼを生産する微生物を
作製することができる。これは、プラスミドで微生物細
胞を形質転換することにより得られる。例えば、上記寄
託菌株からプラスミドを回収し、サッカロマイセス・セ
レビシエの形質転換を行えばよい。

【００３６】サッカロマイセス・セレビシエの形質転換
は、常法に従って行えばよい。

【００３７】＜５＞キチナーゼの生産法 前記プラスミドを保持する形質転換体を培養することに
より、本発明のキチナーゼを生産することができる。培
養に際しては、誘導可能なプロモーターを使用した場合
には誘導を行うことが好ましい。

【００３８】以下に、上記サッカロマイセス・セレビシ
エ形質転換体の培養法の例を説明する。形質転換体を、
ＳＤ培地を用いて３０℃で１晩振盪培養（３００r.p.
m）し、この培養液を１０倍量のＳＤ−カザミノ酸培地
（カザミノ酸（Difco製）を終濃度２％含むＳＤ培地）
に移して３０℃で培養を行う。ガラクトースで誘導をか
ける場合には、ＳＤ−カザミノ酸培地で２４時間培養し
た後、滅菌水で菌体を洗滌してから等量のＳＧ−カザミ
ノ酸培地（ＳＤ−カザミノ酸培地のグルコースの代わり
にガラクトースを添加した培地）に移し、３０℃で培養
する。尚、ＳＤ培地の組成は、以下の通りである。

【００３９】ＳＤ培地 yeast nitrogen base w/o amino acids (Difco) ７ｇ グルコース ２０ｇ 水 １０００ｍｌ 生産されたキチナーゼの精製は、上記のキチナーゼ生産
菌と同様にして行えばよい。また、精製された酵素は、
凍結乾燥、限外濾過膜、有機溶媒沈澱等により濃縮する
ことができる。

【００４０】

【実施例】本発明の実施例として、リゾプス・オリゴス
ポラスを用いた例を説明する。

【００４１】

【実施例１】はじめに、本発明のキチナーゼを精製し、
性質を調べた実施例を説明する。

【００４２】（培地） ＳＩＶ培地 Ａ液（L-アスパラギン：２ｇ、５０倍濃縮液：２０ｍ
ｌ、水：４８０ｍｌ）、Ｂ液（グルコース：２０ｇ、
水：４９０ｍｌ）を別々にオートクレーブした後、混合
する。ただし、５０倍濃縮液の組成は、以下の通りであ
る。

【００４３】 KH₂PO₄ ： ２５０ｇ MgSO₄・7H₂O ： ２５ｇ 微量元素溶液 ： ５ｍｌ １４重量％CaCl₂溶液 ： １０ｍｌ 塩酸チアミン ： １００ｍｇ 水 ： １０００ｍｌ

【００４４】微量元素溶液の組成は、以下の通りであ
る。 クエン酸塩酸塩 ： ２ｇ Fe(NO₃)₃・9H₂O ： １．５ｇ ZnSO₄・7H₂O ： １ｇ MnSO₄・H₂O ： ３００ｍｇ CuSO₄・5H₂O ： ５０ｍｇ NaMoO₄・2H₂O ： ５０ｍｇ 水 ： １０００ｍｌ

【００４５】（コロイダルキチンの作製法）コロイダル
キチンは、以下のようにして作製した。キチン粉末（和
光純薬、生化学用試薬）２ｇを氷冷しておいた濃塩酸８
０mlに、攪拌しながらゆっくりと加えた。徐々に温度を
あげ、３７℃まで加温し、キチンを溶解させた。溶けき
らなかったキチンは、Ｇ−３ガラスフィルターで濾過し
て除いた。濾液を４℃で、水８００mlに攪拌しながら徐
々に加えた。キチンが再沈澱し、溶液が白く濁ってから
さらに３０分間攪拌した後、攪拌をやめ、一晩４℃に静
置した。上清をデカンテーションで除いた後、８００ml
の水を加え攪拌し、これを遠心管に移し、５０００×
ｇ、１０分間遠心し上清を捨てた。上清のpHが中性にな
るまで遠心による洗浄を続けた後、１５０ｍｌの水に懸
濁し、これをコロイダルキチン溶液として４℃に保存し
た。

【００４６】（キチナーゼ活性測定法）キチナーゼ活性
は、コロイダルキチンと酵素溶液を混合、保温した後、
可溶性となった糖をReissig法(114)を用いて定量するこ
とによって測定した。

【００４７】酵素溶液５００μl、コロイダルキチン溶
液２５０μl、McIlvaine緩衝液（61mM クエン酸、77mM
Na₂HPO₄、pH4.0）２５０μlを混合し、３７℃、２時間
保温した。５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、試験管
内で上清５００μlを、KOHでｐＨを１０．２に調整した
0.8M ホウ酸カリウム水溶液１００μlと混合し、アルミ
キャップで蓋をした後、沸騰湯浴中に正確に３分間保ち
加温した。

【００４８】これを加熱後、急冷し、ｐ−ジメチルアミ
ノベンツアルデヒド(DMAB)試薬を３．０ml加え混合した
後、３７℃に２０分間保ち、５８５ｎｍの吸収を測定し
た。ただし、DMAB試薬として、DMAB１０ｇを１０％(v/
v)の濃塩酸を含む氷酢酸１００mlに溶かし、４℃に保存
しておき、使用直前に氷酢酸で１０倍に希釈したものを
使用した。

【００４９】活性は、１分間に１μmolのＮ−アセチル
グルコサミンに相当する糖を可溶化させる活性を１単位
とした。

【００５０】（再生キチンの作製法）キトサン（フナコ
シ、キトサン１０Ｂ）１ｇをビーカーに入れ、スターラ
ーで攪拌しながら徐々に１０％氷酢酸２０ｍｌを加え、
キトサンが溶解し、溶液がシロップ状になるまで攪拌を
続けた後、室温に一晩放置した。これをＧ−３ガラスフ
ィルターで濾過し、濾液に９０ｍｌのメタノールを加
え、攪拌しながら１．５ｍｌの無水酢酸をゆっくり滴下
した。１〜２分間攪拌を続け、溶液がゲル状になり、攪
拌棒が回転しなくなった後、室温に３０分間以上放置し
た。ゲルをスパーテルである程度細かくした後、ホモジ
ナイザーを用いてさらに細かく砕いた。これをブフナー
漏斗上、ワットマンＮｏ．２濾紙を用いて充分に水で洗
浄した後、再生キチンとした。

【００５１】（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動(SDS-PAGE)）SDS-PAGEはLaemmliの方法（Nature 227,
680 (1970)）に従い、主に１０％ゲルを用いて行っ
た。蛋白質は、クーマシー・ブリリアント・ブルー Ｒ
−２５０染色あるいは銀染色によって検出した。銀染色
は銀染色キットワコー（和光純薬）を用いて行い、方法
はキットの説明書に従った。

【００５２】（キチナーゼの糖鎖の除去）キチナーゼか
ら糖鎖を除去する方法として、酵素的に行う方法と化学
的に行う方法の２通りの方法を用いた。

【００５３】酵素的に行う場合にはエンドグリコシダー
ゼＨ（生化学工業）を用いて行った。精製したキチナー
ゼ１０μl（約５μg）に重量比で１．２倍になるように
SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を加え、沸騰水浴中で
３分間加熱した。室温まで冷やした後、５０ｍＭ リン
酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)、１ｍＭ フェニルメチルス
ルホニルフルオライド、２０ｍＵ／ｍｌ エンドグリコ
シダーゼＨ中、３７℃で約１２時間反応させた。

【００５４】化学的に行う場合にはトリフルオロメチル
スルホン酸(TFMS、半井化学)を用いて行った。精製した
キチナーゼ約１０μgを乾燥後、窒素ガス下で１５μlの
TFMSに溶解し、氷中に１時間放置した。その後、氷冷し
ておいた１０％(v/v)ｎ−ヘキサンを含むジエチルエー
テルを加え、ドライアイス−エタノール中に２０分間お
いた。ピリジンを１滴加え、さらにドライアイス−エタ
ノール中に４０分間放置し、５０００r.p.m.、３分間遠
心し沈澱を集めた。沈澱をジエチルエーテルで洗浄し、
さらに９５％エタノールで洗浄後、１５０００r.p.m.、
３分間遠心した。沈澱を乾燥後、０．１Ｍ リン酸ナト
リウム緩衝液(pH6.0)、０．１％ＳＤＳ溶液に溶解し試
料とした。

【００５５】（反応至適ｐＨの測定）ｐＨ２．６〜７の
緩衝液を、McIlvaine緩衝液を用いて作製し、各ｐＨに
おいて精製したキチナーゼ約２μgを用いてその活性を
測定した。

【００５６】（熱安定性の測定）精製したキチナーゼ約
２μgを、ｐＨ４．０、６０℃、１０分間加熱した後の
残存する活性を測定することによって行った。

【００５７】（薄層クロマトグラフィー）薄層プレート
としてシリカゲルプレート（silica gel 60：Merk社、5
×10cm）を用いた。このプレートに試料をスポットし、
室温で１−ブタノール：酢酸：水(3:3:2)を展開溶媒と
してクロマトグラフィーを行った。検出は、アニリンフ
タレート試薬を噴霧した後、１０５℃で加熱することに
よって行った。ただし、アニリンフタレート試薬とは、
アニリン０．９３g、フタル酸１．６６gを水飽和１−ブ
タノール１００mlに溶解して調整したものである。

【００５８】（β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活
性測定法）酵素溶液７５０μl、McIlvaine緩衝液(pH4.
0)２５０μlを混合し、３７℃、５分間保温した後、２m
g／ml ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニド（Sigma社）溶液を２００μｌ添加し、３７℃、
１６分間保温した。その後、1M Na₂CO₃溶液５００μｌ
を加え、溶液の４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。
活性は、１分間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを遊
離させる活性を１単位とした。尚、１μmol／mlのｐ−
ニトロフェノールの４２０nmにおける吸収を０．００４
５とした。

【００５９】（Ｎ末端アミノ酸配列の分析）精製した蛋
白質試料を蒸留水に対して充分に透析した後、セントリ
コン−１０（アミコン製）を用いて濃縮した。このよう
にして調製した試料のうち約０．５ｎｍｏｌをプロテイ
ンシークエンサー（Applied Biosystems社 Model４４
７Ａ）にかけ分析した。

【００６０】＜１＞リゾプス・オリゴスポラスの生産す
るキチナーゼの精製 リゾプス・オリゴスポラスは、リゾプス・ニベウスとは
異なり、培養後期に自己溶菌が認められることからキチ
ナーゼ活性が高いのではないかと考え、リゾプス・オリ
ゴスポラスの培養上清中のキチナーゼ活性の検出を試み
た。

【００６１】１０ｍｌのＳＩＶ液体培地を入れた３００
ｍｌ容三角フラスコにリゾプス・オリゴスポラス ＩＦ
Ｏ８６３１株の胞子を植菌し、３０℃、静置培養した
後、培養上清のキチナーゼ活性を測定した。その結果、
培養日数が経過するに従い上清中のキチナーゼ活性も増
加した。

【００６２】次にこのキチナーゼの精製を行った。以下
の操作は、特に示さない限り０〜４℃の範囲で行った。 （１）培養と集菌 リゾプス・オリゴスポラスの培養は、６個の５ｌ容三角
フラスコにそれぞれ８０ｍｌのＳＩＶ液体培地を入れ、
これらにリゾプス・オリゴスポラスの胞子を植菌した
後、３０℃、８日間静置培養することによって行った。
培養後、三角フラスコを４℃に移し、十分に冷えた後、
培養液を攪拌し一晩４℃に放置した。その後、濾過によ
って菌体を除き、濾液を培養上清とした。

【００６３】（２）硫酸アンモニウム沈澱 ｐＨを７に保ちながら、前記培養上清に９０％飽和（６
０３ｇ／ｌ）となるように硫酸アンモニウムを徐々に加
え溶解させた。一晩放置した後、１００００×ｇで３０
分間遠心し、上清を捨てた後、沈澱を４０ｍｌの20mM N
aHCO₃(pH8.4)に溶解し、同じ緩衝液に対し一晩透析し
た。透析後の試料を硫酸アンモニウム沈澱画分とした。

【００６４】（３）再生キチンによるカラムクロマトグ
ラフィー 再生キチンをカラム（カラムサイズ 2.6×10cm）につ
め、カラムを20mM NaHCO ₃(pH8.4)で平衡化させた後、前
記で得られた硫酸アンモニウム画分をチャージし、20mM
NaHCO₃(pH8.4)で洗浄した後、１００ｍｌの２０ｍＭ酢
酸(pH5.4)と１００ｍｌの２０ｍＭ酢酸(pH3.2)によるｐ
Ｈ勾配で浄し、２０ｍＭ酢酸(pH3.2)で溶出させた。流
速は５２ｍｌ／ｈｒで行い、溶出液は１０ｍｌずつ分取
した。

【００６５】２０ｍＭ酢酸で溶出させた場合は、溶出液
をすぐに１Ｍトリス−塩酸(pH7.5)と２Ｍ水酸化ナトリ
ウム水溶液を用いて、終濃度２０ｍＭトリス−塩酸(pH
7.5)となるようにした。溶出パターン図１に示した。５
０〜６９番目の画分をまとめてキチンカラム溶出画分と
した。

【００６６】（４）セファデックスＧ−７５によるカラ
ムクロマトグラフィー 上述のキチンカラム溶出画分をYM-10メンブレンフィル
ター(Amicon)を用いて約5mlまで濃縮し、２０mM Tris-H
Cl(pH7.5)で平衡化したセファデックスＧ−７５（カラ
ムサイズ ２．６×６６ｃｍ）にチャージし、同緩衝液
で溶出させた。流速は１５．３ｍｌ／ｈｒで行い、溶出
液は１０ｍｌずつ分取した。溶出パターンを図２に示し
た。１４〜１８番目の画分をセファデックスＧ−７５溶
出画分とした。

【００６７】（５）ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍによ
るカラムクロマトグラフィー セファデックスＧ−７５溶出画分を、２０ｍＭトリス−
塩酸(pH7.5)で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０
Ｍ（東ソー：カラムサイズ １．６×１６ｃｍ）にチャ
ージし、同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液３００ｍｌと
２０ｍＭトリス−塩酸(pH7.5)、３０ｍＭ食塩溶液３０
０ｍｌを用いて、食塩の直線的濃度勾配で溶出させた。

【００６８】流速は１５ｍｌ／ｈｒで行い、溶出液は１
０ｍｌずつ分取した。溶出パターンを図３に示した。こ
のカラムクロマトグラフィーにより、キチナーゼは２つ
のピークに分離し、SDS-PAGE上でそれぞれほぼ一本のバ
ンドになるまで精製された。ピークＩ、IIに対応するキ
チナーゼをそれぞれキチナーゼ１、２と命名した。

【００６９】これまでの精製の結果を表１にまとめた。

【００７０】

【表１】

【００７１】（６）精製したキチナーゼの諸性質 精製した試料を用いてこれらの酵素の諸性質を検討し
た。初めに反応至適pHについて検討した。各pHにおける
活性を最大活性に対する百分率で表したものが図４であ
る。両酵素の至適pHは、キチナーゼ１ではｐＨ４．０付
近、キチナーゼ２ではｐＨ３．５付近であった。

【００７２】次に熱安定性について検討した。ｐＨ４、
６０℃、１０分間の熱処理後、キチナーゼ１では７３．
３％、キチナーゼ２では５８．５％の活性が残存してい
た。次に、両キチナーゼの分子量と糖鎖について検討し
た。キチナーゼ１、２の分子量はSDS-PAGEの結果からそ
れぞれ約５００００、約５２０００と推定された。

【００７３】エンドグリコシダーゼＨ処理を行った場合
は未処理のものと電気泳動における易動度が同じであっ
たが、TFMS処理によってこれらの易動度は大きくなり、
両酵素には糖鎖が付加され、その糖鎖はエンドクリコシ
ダーゼＨに耐性であることが明かとなった。また、糖鎖
を除去したキチナーゼ１、２の分子量はそれぞれ約４４
５００、約４６５００と推定された。

【００７４】（７）キチナーゼ１、２によるキチン分解
物の同定 キチナーゼ１、２によるキチン分解反応生成物を同定す
るため、両酵素をコロイダルキチンに対し過剰時間作用
させた後、その反応液を薄層クロマトグラフィーによっ
て解析した。主要生成物としてN,N'-ジアセチルキトビ
オースが、またN-アセチルグルコサミンとN,N',N''-ト
リアセチルキトトリオースが少量認められた。

【００７５】次に、N,N'-ジアセチルキトビオースある
いはN,N',N''-トリアセチルキトトリオースを基質とし
て酵素反応を行った。その結果を表２に示した。

【００７６】

【表２】

【００７７】この結果からキチナーゼ１、２ともN,N',
N''-トリアセチルキトトリオースは基質として利用でき
るが、N,N'-ジアセチルキトビオースは利用できないこ
とが示唆された。

【００７８】さらに、N,N'-ジアセチルキトビオースを
分解するβ-N-アセチルヘキソサミニダーゼ活性につい
て他の基質、ｐ−パラニトロフェニル-β-N-アセチルヘ
キソサミニドを用いて測定した。その結果を表３に示し
た。

【００７９】

【表３】

【００８０】再生キチンに吸着しなかった画分にはN-ア
セチルヘキソサミニダーゼ活性が検出されたが、キチナ
ーゼ１、２には認められなかった。次に、Reissig法(11
4)による糖の検出系について検討した。N-アセチルグル
コサミン、N,N'-ジアセチルキトビオース、N,N',N''-ト
リアセチルキトトリオースを適量用いてそれぞれ発色さ
せた。その結果を表４に示した。

【００８１】

【表４】

【００８２】N,N'-ジアセチルキトビオース、N,N',N''-
トリアセチルキトトリオースに対する感度はN-アセチル
グルコサミンに対する感度の１００分の１以下であっ
た。Reissig法によるキチナーゼ１、２の活性の検出が
可能であったのは、キチナーゼ１、２の反応生成物とし
て、N-アセチルグルコサミンが産生されていたからであ
ると推定された。

【００８３】（７）Ｎ末端アミノ酸配列の解析 精製したキチナーゼ１、２を用いてそれぞれのＮ末端ア
ミノ酸配列の解析を行った。キチナーゼ１については、
３０アミノ酸を決定し、その配列は配列番号１に示した
配列であった。

【００８４】また、キチナーゼ２については、１６アミ
ノ酸を決定し、その配列は配列番号２に示した配列であ
った。両者のＮ末端アミノ酸の配列は非常によく似てお
り、５番目のアミノ酸がキチナーゼ１ではAsnであった
のに対し、キチナーゼ２ではHisであっただけの違いで
あった。

【００８５】

【実施例２】次に、キチナーゼ遺伝子の単離について説
明する。 （１）染色体ＤＮＡの調製法 菌体をガラスフィルターで濾過して集菌し、液体窒素で
凍結した。菌体が再び溶解しないうちに破砕し、ＴＥ緩
衝液を８ｍｌ加え、５０ｍｌ容の容器に移し、更に１０
％ＳＤＳを含むＴＥ緩衝液を４ｍｌ加え、６０℃で３０
分間保温した。

【００８６】その後、フェノール・クロロホルム・イソ
アミルアルコール（25:24:1）を１２ｍｌ加え、激しく
振盪した後、１ｍｌの５Ｍ酢酸カリウムを加え、氷中に
１時間以上放置した。これを、１５０００r.p.m.で１５
分間遠心し、水層を別の容器に移し、２．５倍容のエタ
ノールを加え核酸をエタノール沈澱させた。

【００８７】この沈澱を乾燥させた後、１ｍｌのＴＥ緩
衝液に溶解し、10mg/mlのRNAse A溶液を５μｌ加え、３
７℃で１時間保温し、さらに20mg/mlのプロテイナーゼ
Ｋ溶液を５μｌ加え、３７℃で１時間保温して、ＲＮＡ
及びタンパクを分解させた。これをフェノール抽出４
回、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール
抽出を２回行なってさらにタンパクを除去した後、エタ
ノール沈澱させた。

【００８８】この沈澱を２００μｌのＴＥ緩衝液に溶解
した後、１２０μｌのポリエチレングリコール溶液（２
０％ポリエチレングリコール６０００、2.5M NaCl）を
加え、ＤＮＡを沈澱させ、さらに沈澱を７０％エタノー
ルで洗滌、乾燥後、適当量のＴＥ緩衝液に溶解した。

【００８９】（２）培地は、以下の培地を使用した。 ＰＤ（ポテト・デキストロース）培地 potato dextrose broth (Difco) ： ２４ｇ 水 ：１０００ｍｌ ＬＢ培地 トリプトン（Difco） ： ８ｇ イースト・エキストラクト（Difco）： ５ｇ ＮａＣｌ ： ５ｇ 水 ：１０００ｍｌ λ培地 トリプトン（Difco） ： １０ｇ ＮａＣｌ ： ２．５ｇ 水 ：１０００ｍｌ ＮＺＣ培地 ＮＺアミン タイプＡ（和光純薬） ： １０ｇ ＮａＣｌ ： ５ｇ MgCl₂・6H₂O ： ２ｇ 水 ：１０００ｍｌ これを３０分間オートクレーブした後、カザミノ酸（Di
fco）を終濃度０．１％となるように加える。

【００９０】（３）合成オリゴヌクレオチドプローブの
作製 オリゴヌクレオチドの合成は、アプライドバイオシステ
ム社のＤＮＡシンセサイザー Model 391を用いて行った
（以下同じ）。合成したＤＮＡの樹脂からの抽出、精製
は機械の説明書の方法に従った。

【００９１】（４）サザン解析 ＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動した後、ゲルを0.25
M HClに２０分、 0.6MNaCl, 0.4N NaOH 溶液に１５分間
づつ２回、1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl(pH7.5)溶液に２
０分間、ゆっくり振盪しながら浸漬した。

【００９２】この後、ゲルを２０×ＳＳＣ（3.0M NaCl
0.3M クエン酸ナトリウム溶液）に浸した濾紙の上に置
き、さらにその上にナイロンメンブレン：Hybond-C (Am
ersham社製)を重ねた。濾紙の端は２０×ＳＳＣに漬け
て、１０×ＳＳＣが吸い上げられるようにしておいた。
メンブレンの上にさらにペーパータオルを積み上げて、
１０×ＳＳＣがゲル及びメンブレンを通して濾紙から吸
い上げられるようにした。１晩放置後、メンブレンを風
乾した後、減圧下、８０℃で２時間ベイキングし、ＤＮ
Ａを固定した。

【００９３】ハイブリダイゼーションは、³²Ｐで標識し
た合成オリゴヌクレオチドをプレハイブリダイゼーショ
ン溶液に加え、２０merのプローブの場合は４２℃で、
１４merのプローブの場合は室温で少なくとも１２時間
以上行った。フィルターの洗浄は、６×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ溶液を用い、２０merのプローブの場合は５５
℃で、１４merのプローブの場合は３７℃で行った。

【００９４】フィルターを洗滌、乾燥後、ｘ線フィルム
に露出させ、オートラジオグラムを撮った。

【００９５】（５）プラークハイブリダイゼーション 組換えファージのプラークを、Hybond-NもしくはHybond
-N⁺(Amersham社製)に移し取った。ブロットしたＤＮＡ
のメンブレンへの固定は、Hybond-Nの場合には２時間、
８０℃で処理し、Hybond-N⁺の場合には０．４Ｍ水酸化
ナトリウムによるアルカリ固定を行った。

【００９６】ハイブリダイゼーションは、前記サザン解
析と同じ条件で行い、ついで洗浄、乾燥後ｘ線フィルム
に露出させ、オートラジオグラムを撮った。フィルム上
のポジティブシグナルの位置から、プローブがハイブリ
ダイズしたプラークを同定した。

【００９７】（６）λファージからのDNAの抽出 λファージからのDNAの抽出はDavisらの方法を一部改変
して行なった。 λファージ溶液30μl、E. coli PLKー1
7の一晩培養液30μl、10mM MgCl²/10mM CaCl²溶液３０
μlを混合し、室温に１０分間、さらに３７℃で１５分
間保温した。これを10ml NZC培地に移し、３７℃で振盪
培養した。８〜１２時間後、溶菌が認められた後すぐに
100μlのクロロホルムを加え良く混合し、10,000r.p.
m.、１０分間遠心して上清を取った。

【００９８】上清に10mlのTM buffer(50mM Tris-HCI(pH
7.4)、10mM MgSO₄)を加え、さらに1mg/ml DNaseI溶液を
320μl加え、37℃で15分間保温した。これに、2mlの5M
NaCl、2.2gのPEG6000を加え良く混合した後、氷中に15
分間以上放置した。これを12,000r.p.m.で１０分間遠心
し、沈澱を300μlのTM bufferに溶解した後、1.5ml容の
ミクロ遠心チューブに移した。これに300μlのクロロホ
ルムを加え良く混合し、遠心した後水層を別のチューブ
に移した。このクロロホルム抽出を再度繰り返した後、
水層に15μlの0.5M EDTA(pH8.0)、30μlの5M NaClを加
え、さらに350μlのTE飽和フェノールを加えボルテック
スで良く混合した。

【００９９】これを遠心し、水層を別のチューブに移
し、875μlのエタノールを加えドライアイスに10分間以
上放置した。10分間遠心した後、沈澱を70％エタノール
で洗浄し乾燥させた。これを10μg/mlの濃度でRNase A
を含むTE bufferに溶解し、染色体ＤＮＡ溶液とした。

【０１００】（７）ＤＮＡの制限酵素による反応、末端
のリン酸化、脱リン酸化、塩基配列決定等、ＤＮＡ組換
えの手法は、常法により行った。これらの手法は、Mole
cularcloning (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbo
r Laboratory Press)に詳しい。

【０１０１】＜１＞リゾプス・オリゴスポラス染色体Ｄ
ＮＡライブラリーの作製 リゾプス・オリゴスポラスの全ＤＮＡをSau3AIで部分消
化した後、アルカリホスファターゼ処理を用いて５’末
端の脱リン酸化を行った。これをアガロースゲル電気泳
動で分画し、１０〜２０kbp（キロ塩基対）の大きさの
ＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。一方、ベク
ターとして使用するλ２００１（フナコシ（株）から購
入）は、EcoRIとBamHIで二重消化を行った。

【０１０２】これらのＤＮＡを混合した後、１００ｍＭ
トリス−塩酸(pH7.6)、5mM MgCl₂、３００ｍＭ食塩溶液
に置換し、ライゲーションキット（宝酒造（株））を用
いて連結した。インビトロ・パッケージングキット（Gi
ga pack gold：フナコシ（株）から購入）を用いて前記
ＤＮＡのパッケージを行い、大腸菌P2PLK-17株（STRATA
GENE製）に感染させ、ライブラリーの大きさを確認し
た。

【０１０３】その後、同株を用いて約５０００クローン
づつの、１０バッチに分けライブラリーの増幅を行い、
ライブラリーを得た。尚、増幅させたライブラリーのス
クリーニングは大腸菌PLK17株（STRATAGENE製）を用い
て行った。

【０１０４】＜２＞キチナーゼクローンの検索 キチナーゼ１、２のＮ末端アミノ酸配列を基にして、配
列番号３、４に示した配列を有する、それぞれ２０me
r、１４merの合成オリゴヌクレオチドプローブを作製し
た。２０merプローブは、キチナーゼ１、キチナーゼ２
両遺伝子にハイブリダイズするように、１４merプロー
ブはキチナーゼ１にはハイブリダイズするがキチナーゼ
２にはハイブリダイズしないようにデザインした。

【０１０５】はじめに、リゾプス・オリゴスポラスＤＮ
Ａのサザン解析を行った。EcoRI、HindIIIでそれぞれ消
化した全DNA染色体ＤＮＡを電気泳動後、フィルターに
移し、³²Ｐで標識した２０merプローブを前記条件でハ
イブリダイズさせ、洗滌、乾燥後オートラジオグラフを
撮った。

【０１０６】その結果、EcoRI消化した場合には２．９k
bpの位置に１本のバンドが、HindIII消化した場合には
３．６kbp、１１．５kbpの位置に２本のバンドが検出さ
れた。このことから２０merプローブを用い、同条件で
キチナーゼ１、キチナーゼ２の単離が可能と考えられ
た。

【０１０７】そこで、λ２００１をベクターとして作製
したリゾプス・オリゴスポラスＤＮＡライブラリーを同
じ条件でスクリーニングした。得られた陽性クローンよ
りＤＮＡを抽出し、２０mer及び１４merプローブを用い
たサザン解析を行った。

【０１０８】その結果、２０merプローブ陽性クローン
は、２．９kbp EcoRI断片と３．６kbp HindIII断片にハ
イブリダイズするグループ１と、２．９kbp EcoRI断片
と１１．５kbp HindIII断片にハイブリダイズするグル
ープ２の２つのグループに分かれた。また１４merプロ
ーブはグループ１にのみハイブリダイズした。

【０１０９】そこでこれらのプローブがハイブリダイズ
する領域をサブクローン化し、塩基配列を決定した。そ
の結果を配列番号５、６に示した。グループ１に属する
クローンにおいては、プローブに用いた２０mer、１４m
erの各オリゴヌチレオチドと完全に一致する配列があ
り、さらに塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、精
製したキチナーゼ１から決定した３０アミノ酸からなる
配列と一致する配列が存在していたことから、このクロ
ーンにキチナーゼ１遺伝子（chi1）が含まれていると結
論した。

【０１１０】一方、グループ２に属するクローンにおい
ては、２０merプローブと完全に一致する配列があり、
さらに塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、精製し
たキチナーゼ２から決定した１６アミノ酸からなる配列
と一致する配列が存在していたことから、このクローン
にキチナーゼ２遺伝子（chi2）が含まれていると結論し
た。

【０１１１】また、chi1、chi2の塩基配列から推定され
るアミノ酸配列には、精製したキチナーゼのＮ末端(Ala
⁺¹)の上流に、２２アミノ酸(Met^-22〜Ala^-1)からなる典
型的な分秘シグナル様配列が存在しており、このMetを
コードするATG配列が開始コドンであると推定した。

【０１１２】さらに、開始コドンATGより、chi1の場合
３５７bp、chi2の場合３１３bp 3'下流にイン・フレー
ムで終始コドンが存在し、イントロンが存在することが
推定された。堀内らによって提唱されているリゾプスの
イントロンのコンセンサス配列(119)に従い、それぞれA
sp⁺⁸⁰の位置にそれぞれ５２bp、５３bpからなるイント
ロンを推定すると共に、それぞれ５４０、５４２アミノ
酸をコードする翻訳領域を推定した。

【０１１３】＜３＞リゾプス・オリゴスポラスのキチナ
ーゼのＣ末端アミノ酸配列とアミノ酸組成の解析 （１）Ｃ末端アミノ酸配列の分析 精製したキチナーゼを蒸留水に対して充分に透析した
後、セントリコン-10（アミコン製）を用いて濃縮した
試料約５nmol(約120μl)を用いて、カルボキシペプチダ
ーゼで消化し、遊離されるアミノ酸を同定することによ
ってＣ末端アミノ酸配列の分析を行った。

【０１１４】カルボキシぺプチダーゼとして、カルボキ
シペプチダーゼＡ(Sigma社)とカルボキシペプチダーゼ
Ｂ（フナコシ（株））を使用した。カルボキシペプチダ
ーゼＡは、市販の懸濁液１０μlを冷水１mlで3回洗浄し
た後、沈澱を50mM トリメチルアミン−酢酸緩衝液(pH8.
0)１mlに溶解して調製した。

【０１１５】カルボキシペプチダーゼＢは、市販の酵素
溶液３０μlを、遊離アミノ酸を除くため蒸留水に対し
て２時間以上透析した後、上述の緩衝液１mlあるいは２
mlで希釈して調製した。

【０１１６】精製したキチナーゼ１、２試料各１２０μ
l(約５nmol)に、同緩衝液(pH8.0)を２００μl、上述の
ようにして調製したカルボキシペプチダーゼＡ、Ｂ溶液
をそれぞれ１０μlずつ混合し、３７℃で保温した。反
応液から経時的に５０μlずつサンプリングし、あらか
じめ５μlの氷酢酸を分注しておいたチューブに移し反
応を停止した。

【０１１７】これらをWaters社 Pico-Tag WORK STATION
を使用して乾燥後、エタノール：水：トリエチルアミン
(2:2:1)溶液１０μlで洗浄し、再び乾燥させた。これに
エタノール：トリエチルアミン：水：イソチオシアン酸
フェニル(7:1:1:1)を２０μl加え、室温に２０分間放置
してアミノ酸をフェニルチオカルバモイル化した後、乾
燥させた。これをWatanabeらの方法⁽¹²²⁾に従って、Pic
o-Tagカラムを用いたHPLC（高速液体クロマトグラフィ
ー）によって分析し、アミノ酸の同定を行った。

【０１１８】その結果、キチナーゼ１のＣ末端アミノ酸
配列は-Ser-Ala、キチナーゼ２のＣ末端アミノ酸配列は
-Tyr-(Ser,Lys)-(Val,Ala)であることが明らかとなっ
た。一方、chi1、chi2遺伝子配列から推定されるＣ末端
アミノ酸配列は-Phe-Lysであり、確かにＣ末端領域の切
断が起きていることが示された。

【０１１９】また、chi1から推定されるアミノ酸配列に
おいて、-Ser-Alaの配列は7箇所存在する。すなわち、A
la⁺⁶⁰、Ala⁺¹⁸⁸、Ala⁺²⁰⁴、Ala⁺³²⁷、Ala⁺³⁹⁵、Al
a⁺³⁹⁷、Ala⁺⁵¹⁴である。このうち、糖鎖を除去したキチ
ナーゼ１の分子量が44.5kDaであることを考慮すると、A
la⁺³⁹⁵、Ala⁺³⁹⁷の２箇所がＣ末端切断箇所であると考
えられ、さらに以下に述べる理由でAla⁺³⁹⁵がＣ末端ア
ミノ酸であると結論した。

【０１２０】カルボキシペプチダーゼＡ、Ｂによる消化
で遊離するAlaとSerは同じような割合で増加することか
ら、Ｃ末端アミノ酸配列が-Ser-Ala-Ser-Alaであるより
は-Ser-Alaである可能性が高い。また、長時間カルボキ
シペプチダーゼＡ、Ｂを作用させてもAla、Ser以外のア
ミノ酸が遊離しないことから、Ｃ末端アミノ酸配列が(P
ro)-Ser-Alaである可能性が高い。さらに、以下に述べ
るように、chi1、chi2の遺伝子産物が、非常に類似して
いるにもかかわらずＣ末端領域の切断箇所が異なるの
は、chi2遺伝子産物においてAla⁺³⁹⁵に相当するアミノ
酸がValに置換しているためと考えられることからも、
Ｃ末端は-Ser-Alaであると考えられる。

【０１２１】一方、chi2遺伝子においては、Ala⁺⁴²⁴が
Ｃ末端アミノ酸であると結論した。Ala⁺⁴²⁴が切断点で
あるとすると、Ｃ末端アミノ酸配列は-(Pro)-Tyr-Lys-A
la-Ser-Lys-Val-Alaとなり、カルボキシペプチダーゼ
Ａ、Ｂによる消化の結果である-Tyr-(Lys,Ser)-(Val,Al
a)と矛盾しない。また、この箇所以外にカルボキシぺプ
チダーゼＡ、Ｂによる消化の結果と適合する箇所はなか
った。

【０１２２】また、Ala⁺⁴²⁴をＣ末端アミノ酸とする
と、キチナーゼ１よりＣ末端領域のアミノ酸が２８アミ
ノ酸分だけ長くなり、実施例１で述べたように、糖鎖を
除いたキチナーゼ２の方がキチナーゼ１より約２kDa分
だけペプチド鎖が長いという結果と一致する。さらに、
この２８アミノ酸の中にはLys、Argという正電荷のアミ
ノ酸が４個含まれており、そのためにキチナーゼ２がDE
AE-トヨパール 650Mカラムクロマトグラフィーにおいて
非吸着画分に溶出されてきたと考えられる。

【０１２３】（２）キチナーゼのアミノ酸組成の分析 精製したキチナーゼを蒸留水に対して充分に透析した
後、セントリコン-10を用いて濃縮した。約１nmol(約５
０μl)をWaters社 Pico-Tag WORK STATIONを使用して、
1％フェノールを含む６Ｎ 塩酸により窒素ガス中で１０
５℃、２４時間加水分解を行なった。これを上記と同様
にフェニルチオカルバモイル化した後、Pico-Tagカラム
を用いて分離し、各アミノ酸を定量した。結果を表５に
示す。

【０１２４】

【表５】

【０１２５】この結果は、+1〜+518のアミノ酸組成より
も、+1〜+395のアミノ酸組成と良く一致し、このこと
は、Ala⁺³⁹⁵がＣ末端であることを支持する。chi1、chi
2両遺伝子産物はプレプロ構造を成しており、小胞体膜
の透過の際にプレ配列であるシグナル配列が切断され、
その後さらにＣ末端領域にあるプロ配列が切断されてキ
チナーゼ１、２が産生されることが明かとなった。以
降、プレ配列だけが除去されたものを前駆体型、プレ配
列、プロ配列の両方が除去されたものを成熟型と呼ぶ。

【０１２６】以上の結果から、chi1、chi2の配列は、配
列表の配列番号５、６に示した通りである。chi2全長を
有するプラスミドpOCHI-2を保持する大腸菌（宿主 MV11
90）は、微工研菌寄第１３０５９号として寄託されてい
る。

【０１２７】

【実施例３】酵母におけるキチナーゼの生産について説
明する。 （サッカロマイセス・セレビシエの培養方法）小スケー
ルで培養する場合には直径１９ｍｍの試験管に培地５ml
という条件で行った。前培養として、SD培地で一晩、３
０℃、３００r.p.m.、レシプロ振盪培養し、この培養液
５０mlをSD-カザミノ酸培地に移してさらに３０℃で培
養した。

【０１２８】ガラクトースによる誘導をかける場合に
は、SD-カザミノ酸培地で２４時間培養した後、滅菌水
で菌体を１回洗浄してからSG-カザミノ酸培地２mlに懸
濁し、３０℃で培養した。

【０１２９】大スケールで行なう場合には、前培養を１
０mlスケールで行ない、本培養は５ｌ容三角フラスコに
１ｌの培地を入れて１２０r.p.m.の振盪培養を行なう以
外は小スケールの場合と同様の方法で行った。

【０１３０】（キチナーゼのプロテアーゼ処理法）プロ
テアーゼとして、リゾプスsp.のプロテアーゼ(Sigma社)
とトリプシン(Sigma社)の２種を使用した。リゾプスsp.
のプロテアーゼを用いる場合は、キチナーゼ試料とプロ
テアーゼをMcIlvaine 緩衝液(pH4.0)中で、３７℃で１
５分間保温した後、ぺプスタチンＡ(Sigma社)を加えプ
ロテアーゼを失活させ、キチナーゼ活性を測定した。コ
ントロールとしてはペプスタチンＡを先にキチナーゼ試
料と混合し、これにプロテアーゼを添加して３７℃、１
５分間保温したものを用いた。

【０１３１】トリプシンを用いる場合には、阻害剤とし
て大豆由来のトリプシンインヒヒター(Sigma社)を用い
たこと、また20mM Tris-HCl(pH8.0)内で処理を行なった
以外は、リゾプスsp.のプロテアーゼを用いた場合と同
様の方法で行なった。

【０１３２】（キチナーゼのキチン結合試験法）コロイ
ダルキチン溶液５０μlを遠心して上清を吸い取った
後、キチナーゼ試料５０μl(約5μg、20mM Tris-HCl(pH
8.0))を加え良く混合し、氷中１．５時間放置した。こ
れを遠心し、上清を別のチューブに移し、キチン非結合
画分とした。沈澱を１００μlの20mM Tris-HCl(pH8.0)
で２回洗浄した後、２％SDS、５％β−メルカプトエタ
ノール溶液５０μlに懸濁し、１００℃、４分間加熱処
理をした上清をキチン結合画分としてSDS-PAGEによる解
析の試料とした。

【０１３３】＜１＞サッカロマイセス・セレビシエによ
るキチナーゼの生産 （１）キチナーゼ生産プラスミドの作製 サッカロマイセス・セレビシエでキチナーゼ１の改変体
を発現させるため、部位指定変異の手法を用いてchi1に
対し変異を導入した。 図５に、本実験で使用した合成
オリゴヌクレオチドの配列を、chi1の相当する配列とと
もに示した。合成オリゴヌクレオチド451は、chi1から
推定されるイントロンを除去するために、合成オリゴヌ
クレオチド452は、chi1のプロモーターを交換できるよ
うにするため、開始コドンATGの上流５bpの位置にHindI
II部位を導入するために作製した。

【０１３４】また、合成オリゴヌクレオチド453はキチ
ナーゼ１のＣ末端アミノ酸であるAla ⁺³⁹⁵の直下に停止
コドンTAAとHindIII部位を導入するために、合成オリゴ
ヌクレオチド454はキチナーゼ２の末端アミノ酸に相当
するAla⁺⁴²²の直下に、同様に停止コドンとHindIII部位
を導入するために作製したものである。

【０１３５】さらに、合成オリゴヌクレオチド455、45
6、457はchi1から推定されるアミノ酸配列に存在する3
箇所のAsn結合型の糖鎖付加部位を破壊するために作製
したものである。

【０１３６】これらの合成オリゴヌクレオチドを用い、
chi1を含む３．６Kbp HindIII断片(図６)をプラスミドp
UC119に挿入したプラスミドpCHI6を鋳型として部位指定
変異を行ない、図７に示したような改変体を作製した。
これらの改変体は、成熟型(M)の場合は１．２５Kbp Hin
dIII断片として、また、前駆体型(P)の場合は１．６bp
HindIII-SspI断片(図６参照)として、ターミネーターを
除いた形で得ることが可能である。

【０１３７】これらの断片をpYPR2831、pYPR3831（図
８）由来の８．１Kbp EcoRI-SalI断片と連結し、プラス
ミドpCHIM2、pCHIM3、pCHIP2、pCHIP3、pCHIM22、pCHIM
23、pCHIMdg2、pCHIMdg3、pCHIPdg2、pCHIPdg3を作製し
た（図７）。この場合、プラスミドの最後の数字の２と
３は、それぞれpYPR2831、pYPR3831由来のEcoRI-SalI断
片と連結したことを示すものであり、よって末尾が２で
あるものはグリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデヒ
ドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子プロモーター下流に、３で
あるものはGAL1プロモーター下流に改変体遺伝子が挿入
されていることになる。

【０１３８】これらのプラスミドのうち、pCHIM2を導入
した大腸菌（宿主 MV1190株）は、微工研菌寄第１３０
６１号として寄託した。

【０１３９】（２）サッカロマイセス・セレビシエの生
産するキチナーゼ 上記で得られたプラスミドを用いてサッカロマイセス・
セレビシエ EH13-4を形質転換した。

【０１４０】初めに、pCHIM2、pCHIM3、pCHIP2、pCHIP3
による形質転換体の解析を行なった。これらの形質転換
体を液体培養し、その培養上清のキチナーゼ活性を測定
した。その結果を表６、７に示した。

【０１４１】

【表６】

【０１４２】

【表７】

【０１４３】キチナーゼ遺伝子を含まないプラスミドpY
E209による形質転換体ではその上清にキチナーゼ活性は
ほとんど認められなかったが、前駆体型、成熟型を、GA
PDH遺伝子プロモーターあるいはGAL1プロモーターのど
ちらかによって発現させた場合には上清に有意なキチナ
ーゼ活性が認められた。

【０１４４】また、成熟型を発現させた場合の方が、前
駆体型を発現させた場合と比較して２〜１５倍高い活性
を示した。またコロイダルキチンを含む寒天培地にpYE2
09、pCHIM2、pCHIP2による形質転換遺体を植菌したとこ
ろ、pCHIM2による形質転換体は、pCHIP2による形質転換
体と比較してより大きなハローを形成した。

【０１４５】これらの結果より、成熟型の方が前駆体型
よりキチナーゼ活性が高いことが示唆された。しかし、
この場合、キチナーゼ活性の違いはそれぞれの蛋白質の
分泌量の違いの結果である可能性も考えられる。そこ
で、サッカロマイセス・セレビシエを用いて生産される
成熟型と前駆体型の部分精製を試みた。尚、前駆体型と
しては、pCHIPdg2によるものも合わせて部分精製を試み
た。

【０１４６】成熟型キチナーゼは、pCHIM3による形質転
換体を５００mlスケールで培養し、ガラクトースで１２
時間誘導した後の培養上清を20mM Tris-HCl(pH7.5)に対
し透析した後、DEAE-トヨパール 650M(カラムサイズ1.6
×16cm)にチャージし、０〜３０mMの食塩の直線的濃度
勾配により溶出し、活性を有する画分を集めて行った。

【０１４７】また、前駆体型キチナーゼはpCHIP2、pCHI
Pdg2による形質転換体を９００mlスケールで３０℃、７
２時間培養した後の培養上清を限外濾過により濃縮し、
20mMTris-HCl(pH8.0)に対し透析した後、DEAE-トヨパー
ル 650M(カラムサイズ1.6×16cm)にチャージし、樹脂に
吸着せずに溶出してきたピークを集めて行った。

【０１４８】このようにして調製した試料を各々エンド
グリコシダーゼＨ処理を行ったものについてSDS-PAGEを
行った。その結果、どの場合においても高分子量域にス
メアーなバンドが検出されたが、エンドグリコシダーゼ
Ｈ処理で消失することから、Asn結合型糖鎖が高度に付
加されたものと考えられる。

【０１４９】成熟型の場合、複数のバンドが認められる
が、前駆体型はエンドグリコシダーゼＨ処理で約６３KD
aのほぼ一本のバンドとなり、成熟型より精製度は高い
と思われる。しかし、約５５KDa付近にもバンドが若干
あり、このバンドは成熟型に主要なバンドと位置が一致
していることこから、これらの試料にはサッカロマイセ
ス・セレビシエのプロテアーゼによって一部Ｃ末端領域
が切断されているものが含まれていると考えられた。

【０１５０】これらの試料を用いてキチナーゼ活性を測
定した。また、リゾプスsp.由来のプロテアーゼ、ある
いは、トリプシン処理を行なった後のキチナーゼ活性も
測定し、結果を表８に示した。

【０１５１】

【表８】

【０１５２】成熟型の比活性は、前駆体型の比活性に比
べ９〜１６倍高く、先に述べたように、培養上清中の活
性が成熟型を分泌させた場合の方が高かったのは、分泌
量の差によるのではないことが示された。また、それぞ
れプロテアーゼ処理を行った後キチナーゼ活性を測定し
た場合、成熟型ではその活性にほとんど変化が認められ
ないのに対し、前駆体型では活性の上昇が認められた。

【０１５３】以上の結果から前駆体型は不活性型であ
り、リゾプス・オリゴスポラスのキチナーゼは、不活性
型として合成され、Ｃ末端領域がプロテアーゼによって
切断されて活性化することが強く示唆された。次に、成
熟型と前駆体型のキチン結合能について、SDS-PAGEによ
り検討した。その結果、成熟型、前駆体型共にキチン吸
着画分に濃縮されるバンドが認められ、どちらもキチン
に結合能を示すことが明らかになった。

【０１５４】次にpCHIM22、pCHIM23、pCHIMdg2、pCHIMd
g3による形質転換体の検討を行なった。pCHIM22、pCHIM
dg2による形質転換体を、pCHIM2、pCHIP2、pCHIPdg2に
よる形質転換体とともにコロイダルキチンを含む寒天培
地に植菌し、それらのハロー形成を調べた。

【０１５５】pCHIM22による形質転換体では、ハロー形
成が認められ、この改変体にキチナーゼ活性があると考
えられたが、pCHIMdg2によるものではハローは認められ
なかった。さらにキチナーゼ活性を定量的に検討するた
めに、pCHIM23、pCHIMdg3による形質転換体を液体培養
し、その培養上清のキチナーゼ活性を測定した結果（表
９）、pCHIM3の場合と比較してpCHIM23の場合で約６分
の１、pCHIMdg3の場合で約１０分の１に活性が低下し
た。

【０１５６】

【表９】

【０１５７】このことから、糖鎖がキチナーゼ活性ある
いは分泌に何等かの役割を果していることが示唆され
る。

【０１５８】

【実施例４】次に、リゾプス・ニベウス（R. niveus Ya
mazaki IFO4810株）のキチナーゼ遺伝子の単離を行った
実施例を説明する。

【０１５９】リゾプス・オリゴスポラスのchi2の一部を
含む１．２Kbp KpnI-EcoRI断片（図６参照）をプローブ
として、５６℃の穏やかな条件でHindIIIで消化したリ
ゾプス・ニベウスの全ＤＮＡに対しサザン解析を行なっ
た。その結果、１．０Kb、１．２５Kbp、２．３Kbp、
３．６Kbp、６．０kbpの５本のバンドが検出され、リゾ
プス・ニベウスにもリゾプス・オリゴスポラスのキチナ
ーゼ遺伝子と相同性のある遺伝子が存在し、この条件を
用いてそれらの単離が可能であることが示唆された。

【０１６０】そこで、上述のプローブを用いて、pBR322
をベクターとして作製したリゾプス・ニベウスの染色体
ライブラリー（リゾプス・オリゴスポラスの染色体ライ
ブラリーと同様にして作製したもの）、あるいはpUC11
9、λ2001をベクターベクターとして作製したサブジェ
ノミック ライブラリーをスクリーニングすることによ
って図９に示したような４種の断片を単離した。

【０１６１】これら４種のＤＮＡ断片には、HindIIIで
消化したリゾプス・ニベウスの全DNAに対するサザン解
析で検出された１．２５Kbp、２．３Kbp、３．６Kbp、
６．０kbpのバンドに対応する断片がそれぞれ含まれて
いる。これらの断片の塩基配列を決定した結果、リゾプ
ス・オリゴスポラスのキチナーゼと相同性が認められた
ため、それぞれの遺伝子をchi1、chi2、chi3、chi4と命
名した。

【０１６２】リゾプス・オリゴスポラスのキチナーゼと
の相同性からイントロンを推定し、アミノ酸配列を推定
した結果を、塩基配列と共に配列番号７〜１０に示し
た。このうち、chi1を有するpNCHI-1を保持する大腸菌
は、微工研究菌寄第１３０６０号として寄託した。

【０１６３】

【発明の効果】本発明により、リゾプス・オリゴスポラ
スより２種の新規キチナーゼ及びこれらの遺伝子が単離
された。また、この遺伝子を酵母に導入したことによ
り、酵母により前記新規キチナーゼを生産することが可
能となった。さらに、リゾプス・ニベウスより４種の新
規キチナーゼ遺伝子と推定される遺伝子が単離された。

【０１６４】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・オリコ゛スホ゜ラス(Rhizopus oligosporus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列 Ara Trp Ser Ser Asn Gly Pro Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly Gln Asn 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly Ser Asn Thr Gln Ala Ser Leu Gly Thr Tyr 20 25 30

【０１６５】配列番号：２ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・オリコ゛スホ゜ラス(Rhizopus oligosporus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列 Ala Trp Ser Ser His Gly Pro Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly Gln Asn 1 5 10 15

【０１６６】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGTAYTAYT GGGGNCARAA 20

【０１６７】配列番号：４ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAYGGNCCNA AYGT 14

【０１６８】配列番号：５ 配列の長さ：2527 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・オリコ゛スホ゜ラス(Rhizopus oligosporus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：344..2015 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：344..409 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：410..2015 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：intron 存在位置：648..699 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCATGCACAT AGTAAACAAT GCTTAAACCA GATGACATGC ATACATCTAC AAATGCAACT 60 GACTGATCAT GAAATGGCCG CTTCTTTGTT TTCGAATGAT ATCTCTATCA TTTCTTCCTT 120 TTTATTTCAA TGTAACATGA GTTTTAATAG ATAATATATT ACTTGATATT ATTACTTGAT 180 ATTACCTATG ACCCTAAACT TATTCAGTAA CGTGTAACTT GAGCTGCAAT GGGAAAAAAA 240 GATAATGAAG ACATGGCAAC ATTAGCGCAC ACATATAAAT ACTCACTGGA CATCCTGACA 300 TCAAATCGTT ATCTTTATAC TTTTCTTTCC CTTATTCTTC AAC ATG CTC GCT CGT 355 Met Leu Ala Arg -20 ACT TTC CTT GGA ATG GCT ATA TCT GCC TTT TTG GCG TCG ACT GGT GTT 403 Thr Phe Leu Gly Met Ala Ile Ser Ala Phe Leu Ala Ser Thr Gly Val -15 -10 -5 CAA GCT GCT TGG TCC TCT AAC GGC CCT AAT GTC ATG TAC TAC TGG GGT 451 Gln Ala Ala Trp Ser Ser Asn Gly Pro Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 CAA AAT TCT GCT GGT GGA TCA AAT ACA CAA GCA TCC TTA GGC ACT TAC 499 Gln Asn Ser Ala Gly Gly Ser Asn Thr Gln Ala Ser Leu Gly Thr Tyr 15 20 25 30 TGT GAA TCT GGC CAA GTC GAT GCC GTC CTC CTG TCC TTC CTT CAC GTC 547 Cys Glu Ser Gly Gln Val Asp Ala Val Leu Leu Ser Phe Leu His Val 35 40 45 TTT AAC GTT GGT GGT ACT CCT GAA ATC AAT CTT TCT AGT GCC TGC GCT 595 Phe Asn Val Gly Gly Thr Pro Glu Ile Asn Leu Ser Ser Ala Cys Ala 50 55 60 GGT ACC TAT TTT CCT AAT ACT CAA CTA CTT AGT TGC CCT GCT GTT GGT 643 Gly Thr Tyr Phe Pro Asn Thr Gln Leu Leu Ser Cys Pro Ala Val Gly 65 70 75 GCT G GTAAGTGTTT ATCTTTTGTT GTCGAAGTCT CTTAACATCT CTTTCTTGAT AG 699 Ala AT ATC AAG AAA TGT CAA GAC AAG GGC GTC AAG GTC ATT CTC TCT CTT 746 Asp Ile Lys Lys Cys Gln Asp Lys Gly Val Lys Val Ile Leu Ser Leu 80 85 90 95 GGC GGT GCT GCT GGT GTG TAT GGT TTC ACA AGC GAT GCC CAA GGA CAA 794 Gly Gly Ala Ala Gly Val Tyr Gly Phe Thr Ser Asp Ala Gln Gly Gln 100 105 110 CAG TTC GCA CAG ACG ATC TGG AAC CTC TTT GGT GGC GGA AGC TCA GAC 842 Gln Phe Ala Gln Thr Ile Trp Asn Leu Phe Gly Gly Gly Ser Ser Asp 115 120 125 ACA CGT CCA TTT GGT GAT GCT GTT ATT GAC GGT GTC GAT CTT GAC ATC 890 Thr Arg Pro Phe Gly Asp Ala Val Ile Asp Gly Val Asp Leu Asp Ile 130 135 140 GAA GGT GGC GCA TCT ACG GGT TAT GCT GCC TTT GTG AAT GCT CTT CGT 938 Glu Gly Gly Ala Ser Thr Gly Tyr Ala Ala Phe Val Asn Ala Leu Arg 145 150 155 CAA AAG TTC TCC AGC AAC TTC CTT ATC GGT GCT GCT CCT CAG TGC CCC 986 Gln Lys Phe Ser Ser Asn Phe Leu Ile Gly Ala Ala Pro Gln Cys Pro 160 165 170 175 TTC CCT GAC GCC ATC CTC GGC AGT GTG TTA AAC TCG GCT AGT TTT GAC 1034 Phe Pro Asp Ala Ile Leu Gly Ser Val Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp 180 185 190 TAC GTC AAT GTT CAG TTC TAC AAC AAC TAT TGT TCT GCT ACT GGT TCC 1082 Tyr Val Asn Val Gln Phe Tyr Asn Asn Tyr Cys Ser Ala Thr Gly Ser 195 200 205 TCC TTC AAC TTT GAC ACC TGG GAT AAC TGG GCC AAG ACG ACG TCA CCT 1130 Ser Phe Asn Phe Asn Thr Trp Asp Asn Trp Ala Lys Thr Thr Ser Pro 210 215 220 AAC AAG AAC GTC AAG ATC ATG TTT ACA ATT CCT GGT TCA CCT ACT GCT 1178 Asn Lys Asn Val Lys Ile Met Phe Thr Ile Pro Gly Ser Pro Thr Ala 225 230 235 GCA GGC AGC GGC TAC GTT CCC ATG TCT ACT CTT CAA ACT ATC GTT CCT 1226 Ala Gly Ser Gly Tyr Val Pro Met Ser Thr Leu Gln Thr Ile Val Pro 240 245 250 255 TCT CTT GCT TCC GAG TAC TCG AGC TAT GGT GGT GTC TCG GTC TGG GAT 1274 Ser Leu Ala Ser Glu Tyr Ser Ser Tyr Gly Gly Val Ser Val Trp Asp 260 265 270 GCC TCT CAA GCC TGG AAT AAC GGT GAC TTC AGC TCT CAA CTC TAC TCA 1322 Ala Ser Gln Ala Trp Asn Asn Gly Asp Phe Ser Ser Gln Leu Tyr Ser 275 280 285 CTT GTT CAC AGC GGT GGC TCC ACT CCT CCT CCT TCC TCT TCA ACT ATC 1370 Leu Val His Ser Gly Gly Ser Thr Pro Pro Pro Ser Ser Ser Thr Ile 290 295 300 AAG ACA ACA ACA AAA GCG ACA ACA ACA AGC ACC AAG ACG ACG ACT ACG 1418 Lys Thr Thr Thr Lys Ala Thr Thr Thr Ser Thr Lys Thr Thr Thr Thr 305 310 315 GCT GCC CCT ACT GCT ACC AGC GCA CCT GGC AGT TGT CCT GTT GCC AAT 1466 Ala Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Gly Ser Cys Pro Val Ala Asn 320 325 330 335 CAA TCT TGC TCT ACT CAA AAC CAA TAT GCT TGT ACA GCC GAT GGC AAG 1514 Gln Ser Cys Ser Thr Gln Asn Gln Tyr Ala Cys Thr Ala Asp Gly Lys 340 345 350 TAT GCT GTC TGC GAC CAT GGG AAA TGG GTT GTC TCC TCC TGC CCC TCC 1562 Tyr Ala Val Cys Asp His Gly Lys Trp Val Val Ser Ser Cys Pro Ser 355 360 365 GGC ACT GTC TGC ATT CCT ACT ACC GAT GGC ACC TCT ATC TAT TGT GGT 1610 Gly Thr Val Cys Ile Pro Thr Thr Asp Gly Thr Ser Ile Tyr Cys Gly 370 375 380 TAT GCT ACT GGT TCT GGT AGC ACT TGT CCT TCA GCC AGC GCA CTC GAA 1658 Tyr Ala Thr Gly Ser Gly Ser Thr Cys Pro Ser Ala Ser Ala Leu Glu 385 390 395 ATT GCA GCT GCT TCC TTC GGC TCT AAG AAT GGC CCT GTA CCT CGT CCA 1706 Ile Ala Ala Ala Ser Phe Gly Ser Lys Asn Gly Pro Val Pro Arg Pro 400 405 410 415 TAC AAG GCT TCC AAG GTT GCT GCT CAA CTC GCT GTT ACT TCC ACT GAC 1754 Tyr Lys Ala Ser Lys Val Ala Ala Gln Leu Ala Val Thr Ser Thr Asp 420 425 430 AAG AAT AGC TTT GAA GCC GTT ATC AAT GCT CGT CGT ACC ACG CTC ACT 1802 Lys Asn Ser Phe Glu Ala Val Ile Asn Ala Arg Arg Thr Thr Leu Thr 435 440 445 CCC TTT GAA AAA TCT GTT ACT ATC GAA TTC ACT ACA CCT TCC AAC ATC 1850 Pro Phe Glu Lys Ser Val Thr Ile Glu Phe Thr Thr Pro Ser Asn Ile 450 455 460 AAG TTT ACC GAA TCT GAT ATG GGT CCC GTT CGT CAA GTC GGT AAC AAG 1898 Lys Phe Thr Glu Ser Asp Met Gly Pro Val Arg Gln Val Gly Asn Lys 465 470 475 GTT CGT ATT CAA GCC AAG AAT GAC TAT AAC GAA TCC ATG ACA CTC GTC 1946 Val Arg Ile Gln Ala Lys Asn Asp Tyr Asn Glu Ser Met Thr Leu Val 480 485 490 495 GTC AAA GTC AAG GGT TCC ATC AAC TCA GGC GTC TTT GTG GCT CCC AGT 1994 Val Lys Val Lys Gly Ser Ile Asn Ser Gly Val Phe Val Ala Pro Ser 500 505 510 ACT TCT GCT TGG AAG TTT AAA TAAATATTAT ATTAGATAAT AATAAAAAAG 2045 Thr Ser Ala Trp Lys Phe Lys 515 TGCAATAACG TTTTATTGTA CGTATTGAAG CAGAATTACG TAGTATTATA TTATTAAAAT 2105 TATATTGTAT ATGAATTGTG TGAAAAGATG GTGGAAGAGC GTGTGGATGT ATGTATATTA 2165 TATATATGTA TAGAACAGTG TCATAGCAAT AATTTACAAT GTGTGTTTTG CGTCAAAAAA 2225 AATCAAAAAG GGGAAAAAGT TTGTACAAAA GATTCTTCTT AAAAGTGGAG TGATAAAGGT 2285 GGTGTACTGT TGTGCTTTGG CGTTGCTGCT ATTAAAAAAC AAGAGTTCAG TTTTGGTTGC 2345 TTCTTATTTT TATATATTTA CCTTCATTCA ACTGCTGTTG AGCAGCAGCC ATGGCCATCT 2405 GCATAGCCGT AGCCTTGTTT GCACTGGACG TACCATTCAC AACAGCAGCC ATGTTAGCAG 2465 CAATCATACC ATTGGCCATG GCCACTGCTG CCTGTTGAGG CGTTAGTTTC GTGCGGCTGG 2525 CT 2527

【０１６９】配列番号：６ 配列の長さ：2119 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・オリコ゛スホ゜ラス(Rhizopus oligosporus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：346..2071 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：346..411 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：412..2071 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：intron 存在位置：650..702 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCATGCGCAT AGTAAACAAT GCTTAAACCA GATGACATAC ATACGTCTAT GAATGCAACT 60 GATTGATCAT GAAATAGCCG CTTCTTTGTT TTCGAATGAT ATCCCTACCA TTTCTTCCTT 120 TTTATTTCAA TGTAACATGA GTTTTAATAG GTAATATATT ACTTGATATT ATTACTTGAT 180 ATTACCTATG ACCCTAATCT TATTCATTAA CGTGTAACTT GAGCTGCAAT GGGAAAAAAA 240 AAGATAATGA AGACATGGCA ACATTAGCCC ACGCATATAA ATACTCACTG GACATCCTGA 300 CATCAAATCA TTATCTTTAC ACTTTTCTTT CCCTTATTCT TCAAC ATG CTC ACT CGT 357 Met Leu Thr Arg -20 ACT TTC CTT GGA ATG GCT ATA TCT GCC TTC TTG GCA TCA ACT GGT GTT 405 Thr Phe Leu Gly Met Ala Ile Ser Ala Phe Leu Ala Ser Thr Gly Val -15 -10 -5 CAA GCT GCT TGG TCC TCT CAT GGC CCT AAT GTC ATG TAC TAC TGG GGT 453 Gln Ala Ala Trp Ser Ser His Gly Pro Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 CAA AAT TCT GCT GGC GGA TCA AAT ACA CAA GCA TCC TTA GGC ACT TAC 501 Gln Asn Ser Ala Gly Gly Ser Asn Thr Gln Ala Ser Leu Gly Thr Tyr 15 20 25 30 TGT GAG TCT GGC CAA GTC GAT GCC GTC CTC CTG TCC TTC CTT CAC GTC 549 Cys Glu Ser Gly Gln Val Asp Ala Val Leu Leu Ser Phe Leu His Val 35 40 45 TTT AAC GTT GGT GGT ATC CCT GAA ATC AAT CTT TCT AGC GCC TGT GCT 597 Phe Asn Val Gly Gly Ile Pro Glu Ile Asn Leu Ser Ser Ala Cys Ala 50 55 60 GGT ACC TAT TTT CCC AAT ACT CAA CTA CTT AGT TGT CCT GCT GTT GGT 645 Gly Thr Tyr Phe Pro Asn Thr Gln Leu Leu Ser Cys Pro Ala Val Gly 65 70 75 GCT G GTAAGTGTTA AACCTTTTGT TGTCGGGGTC TCTTAACATC TCTTTCTTGA TAG 702 Ala AT ATC AAG AAA TGT CAA GAC AAG GGC GTC AAG GTC ATA CTC TCT CTT 749 Asp Ile Lys Lys Cys Gln Asp Lys Gly Val Lys Val Ile Leu Ser Leu 80 85 90 95 GGT GGT GCT GCT GGT GTC TAT GGT TTC ACA AGC GAT GCC CAA GGA CAA 797 Gly Gly Ala Ala Gly Val Tyr Gly Phe Thr Ser Asp Ala Gln Gly Gln 100 105 110 CAG TTC GCA CAG ACG ATC TGG AAC CTC TTT GGT GGT GGA AAC TCA GAC 845 Gln Phe Ala Gln Thr Ile Trp Asn Leu Phe Gly Gly Gly Asn Ser Asp 115 120 125 ACA CGT CCA TTT GGT GAT GCT GTT ATT GAC GGT GTC GAT CTT GAC ATT 893 Thr Arg Pro Phe Gly Asp Ala Val Ile Asp Gly Val Asp Leu Asp Ile 135 140 145 GAA GGT GGC TCA TCT ACG GGT TAT GTC GCC TTT GTG AAT GCT CTT CGT 941 Glu Gly Gly Ser Ser Thr Gly Tyr Val Ala Phe Val Asn Ala Leu Arg 150 155 160 CAA AAG TTC TCC AGC AAC TTC CTT ATT GGT GCT GCT CCT CAA TGC CCC 989 Gln Lys Phe Ser Ser Asn Phe Leu Ile Gly Ala Ala Pro Gln Cys Pro 165 170 175 180 TTC CCT GAC GCC ATC CTC GGC AGT GTG TTG AAC TCG GCT AGT TTC GAC 1037 Phe Pro Asp Ala Ile Leu Gly Ser Val Leu Asn Ser Ala Ser Phe Asp 185 190 195 TAC GTC AAT GTT CAG TTC TAT AAC AAC TAT TGC TCT GCT ACT GGT TCC 1085 Tyr Val Asn Val Gln Phe Tyr Asn Asn Tyr Cys Ser Ala Thr Gly Ser 200 205 210 TCC TTC AAC TTT GAC ACC TGG GAT AAC TGG GCC AAG ACG ACG TCA CCT 1133 Ser Phe Asn Phe Asp Thr Trp Asp Asn Trp Ala Lys Thr Thr Ser Pro 215 220 225 AAC AAG AAC GTC AAG ATC ATG TTT ACG GTT CCT GGC TCA TCT ACT GCT 1181 Asn Lys Asn Val Lys Ile Met Phe Thr Val Pro Gly SerSer Thr Ala 230 235 240 GCA GGC AGC GGC TAC GTT CCC ATG TCT ACT CTT CAA ACT ATA GTT CCT 1229 Ala Gly Ser Gly Tyr Val Pro Met Ser Thr Leu Gln Thr Ile Val Pro 245 250 255 260 TCT CTT GCT TCC AAG TAC TCC AGC TAC GGC GGT GTC TCA GTC TGG GAT 1277 Ser Leu Ala Ser Lys Tyr Ser Ser Tyr Gly Gly Val Ser Val Trp Asp 265 270 275 GCC TCT CAA GCC TGG AAT AAC GGT GGC TTC AAC TCT CAA CTC TAC TCG 1325 Ala Ser Gln Ala Trp Asn Asn Gly Gly Phe Asn Ser Gln Leu Tyr Ser 280 285 290 CTT GTC CAC AGC GGT GGC TCC ACT CCT CCT CCT CCT TCC TCT TCT TCA 1373 Leu Val His Ser Gly Gly Ser Thr Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Ser 295 300 305 GCT ACC AAG ACA ACA ACA AAA ACG ACA GCA ACA AGC ACC AAG ACG ACG 1421 Ala Thr Lys Thr Thr Thr Lys Thr Thr Ala Thr Ser Thr Lys Thr Thr 310 315 320 ACT ACG ACT GCC CCT ACT GCT ACC AGC ACA CCT GGC AGT TGT CCT GTT 1469 Thr Thr Thr Ala Pro Thr Ala Thr Ser Thr Pro Gly Ser Cys Pro Val 325 330 335 340 GCC AAT CAG CCT TGC TCT ACT CAA AAT CAA TAT GCT TGT ACA GCC GAT 1517 Ala Asn Gln Pro Cys Ser Thr Gln Asn Gln Tyr Ala Cys Thr Ala Asp 345 350 355 GGC AAG TAC GCT GTC TGC GAC CAT GGC AAA TGG GTT GCC TCC TCC TGC 1565 Gly Lys Tyr Ala Val Cys Asp His Gly Lys Trp Val Ala Ser Ser Cys 360 365 370 CCC TCC AAC ACT GTC TGC ATT CCT ACT ACC GAT GGT GCC TCT ATC TAC 1613 Pro Ser Asn Thr Val Cys Ile Pro Thr Thr Asp Gly Ala Ser Ile Tyr 375 380 385 TGT GGT TAT GCT ACT GGC TCT GGC AGC ACT TGT CCT TCA GTC AGC GCA 1661 Cys Gly Tyr Ala Thr Gly Ser Gly Ser Thr Cys Pro Ser Val Ser Ala 390 395 400 CTC GAA ATT ACA GCT GCT TCT CTC GGC TCT AAG AAT GGC CCC GTA CCT 1709 Leu Glu Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly Ser Lys Asn Gly Pro Val Pro 405 410 415 420 CGC CCA TAC AAG GCT TCC AAG GTT GCT GCT CAA CTC GCT GTT ACT TCC 1757 Arg Pro Tyr Lys Ala Ser Lys Val Ala Ala Gln Leu Ala Val Thr Ser 425 430 435 ACT GAC AAG AAT AGC TTT GAA GCT GTT ATC AAT GCT CGT CGC ACC ACG 1805 Thr Asp Lys Asn Ser Phe Glu Ala Val Ile Asn Ala Arg Arg Thr Thr 440 445 450 CTC ACT CCC TTT GAA AAA TCT GTT ACT ATC GAA TTC ACT ACA CCT TCC 1853 Leu Thr Pro Phe Glu Lys Ser Val Thr Ile Glu Phe Thr Thr Pro Ser 455 460 465 AAC ATC AAG TTT ACC GAA TCT GAT ATG GGT CCC GTT CGT CAA GTC GGC 1901 Asn Ile Lys Phe Thr Glu Ser Asp Met Gly Pro Val Arg Gln Val Gly 470 475 480 AAC AAG GTT CGT ATT CAA GCC AAG AAT GAT TAT AAC GAA TCC ATG ACT 1949 Asn Lys Val Arg Ile Gln Ala Lys Asn Asp Tyr Asn Glu Ser Met Thr 485 490 495 500 CTC GTC GTC AAA GTC AAG GGT TCC ATC AAT TCA GGC GTC TTT GTG GCT 1997 Leu Val Val Lys Val Lys Gly Ser Ile Asn Ser Gly Val Phe Val Ala 505 510 515 CCC AGT ACT TCT GCT TGG AAC TTT AAA TAAATATTGT ATTAGATAAT 2044 Pro Ser Thr Ser Ala Trp Asn Phe Lys 520 525 AATAATAATA AAAAAAGTGC AATAACGTTT TATTGTACGT ATTGAAGCAG ATTTATGTGT 2104 ATTATATTAT TAAAA 2119

【０１７０】配列番号：７ 配列の長さ：2255 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・ニヘ゛ウス(Rhizopus niveus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：138..1747 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：intron 存在位置：243..305, 499..566 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AAGCTTTATA ATAATACATA CTCCTCTTAT TGTTGTTACT TTTTAAAAAA AATAAATAAA 60 GAGTATAAAT ACCTTTAATA GAAAACTAGA CAACTCTTTC ATCTTTCTCG TCTTCCATTC 120 ATTTCTTTAC TGTTAAT ATG ATT TCA TGC AAC ATC CTT GGA ATA ACC ATT 170 Met Ile Ser Cys Asn Ile Leu Gly Ile Thr Ile 1 5 10 GCT GCC TTC ATA ACC AGT ACT CTA GCT GCT TAC TCT TCT AAT GGT GTA 218 Ala Ala Phe Ile Thr Ser Thr Leu Ala Ala Tyr Ser Ser Asn Gly Val 15 20 25 AAT GTG ATG TAT TAT TGG GGT CAG GTAAGTCTAT TTTGCTACTT TTACAAAAGG 272 Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly Gln 30 35 TGCAACTTGT TGACAGCATT TGTGGTCTTT TAG AAC TCT GCC GGT GGT TCC AAT 326 Asn Ser Ala Gly Gly Ser Asn 40 ACA CAA GGT TCA TTG GTG AGT TAT TGC CAG TCA GGT CAA GTA GAT GTG 374 Thr Gln Gly Ser Leu Val Ser Tyr Cys Gln Ser Gly Gln Val Asp Val 45 50 55 ATC ATT TTA TCC TTT TTA AAC AAA TTC AAC ATG GGC GGA CTT CCT GAA 422 Ile Ile Leu Ser Phe Leu Asn Lys Phe Asn Met Gly Gly Leu Pro Glu 60 65 70 ATT AAC TTG GCA AGT GCT TGC GAA CAA ACA TTC TTT CCA AAC ACG AAC 470 Ile Asn Leu Ala Ser Ala Cys Glu Gln Thr Phe Phe Pro Asn Thr Asn 75 80 85 90 TTG CTT CAT TGT CCC ACT GTG GGG TCT G GTAATTAAAT ACTTTGCGAA 518 Leu Leu His Cys Pro Thr Val Gly Ser 95 AAGAACTTTT TTTTAAAAAG CATGTGTTTT TGTTGCTACA AATTATAG AC ATT AAA 574 Asp Ile Lys 100 ACA TGC CAA AGC AAT GGT GTC AAA GTA CTT TTA TCT CTT GGT GGA GCT 622 Thr Cys Gln Ser Asn Gly Val Lys Val Leu Leu Ser Leu Gly Gly Ala 105 110 115 GCT GGT TCT TAT GGC TTT AGC AGT GAC TCT GAA GGG CAA ACT TTC GCA 670 Ala Gly Ser Tyr Gly Phe Ser Ser Asp Ser Glu Gly Gln Thr Phe Ala 120 125 130 GAG ACC ATT TGG AAT TTA TTT GGC GGT GGC ACT TCT GAT ACA CGC CCA 718 Glu Thr Ile Trp Asn Leu Phe Gly Gly Gly Thr Ser Asp Thr Arg Pro 135 140 145 150 TTT GAC GAT GCG GTA ATT GAT GGT ATT GAT CTC GAC ATT GAA GGC GGA 766 Phe Asp Asp Ala Val Ile Asp Gly Ile Asp Leu Asp Ile Glu Gly Gly 155 160 165 TCA TCT ACT GGT TAT GCT GCC TTT GTC ACC GCT CTT CGT TCA AAG GGT 814 Ser Ser Thr Gly Tyr Ala Ala Phe Val Thr Ala Leu Arg Ser Lys Gly 170 175 180 CAT TTT TTG ATT GGT GCT GCC CCT CAG TGT CCT TTC CCA GAT GCC ATC 862 His Phe Leu Ile Gly Ala Ala Pro Gln Cys Pro Phe Pro Asp Ala Ile 185 190 195 CTT GGA TCT GTT ATC GAT GCA GTT GGA TTG GAT TTC GTC AAT GTT CAA 910 Leu Gly Ser Val Ile Asp Ala Val Gly Leu Asp Phe Val Asn Val Gln 200 205 210 TTC TAC AAT AAT GTC TGT TCT GTT GCC TCA GGC TCT TCC TTT AAC TTT 958 Phe Tyr Asn Asn Val Cys Ser Val Ala Ser Gly Ser Ser Phe Asn Phe 215 220 225 230 GAT GTC TGG AAC GAT TGG GCC AAG AAC AAA TCA CCC AAT AAG AAC ATC 1006 Asp Val Trp Asn Asp Trp Ala Lys Asn Lys Ser Pro Asn Lys Asn Ile 235 240 245 AAG GTG ATG CTG ACC GTT CCT GGC TCC TCC ACT GCT GCT GGA AGT GGC 1054 Lys Val Met Leu Thr Val Pro Gly Ser Ser Thr Ala Ala Gly Ser Gly 250 255 260 TAT GCT TCC ATA GCA GAG CTT GGC CCC ATC GTT TCT TCA GTC ATT TCT 1102 Tyr Ala Ser Ile Ala Glu Leu Gly Pro Ile Val Ser Ser Val Ile Ser 265 270 275 CAG TAT TCT AGC TTT GGT GGC GTC TCT GTC TGG GAT GCG TCA CAA GCC 1150 Gln Tyr Ser Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Trp Asp Ala Ser Gln Ala 280 285 290 TGG AAT AAC AAC GGG TTT CAT TCT GAA CTT TAC AGC ATT GTT CAC GGG 1198 Trp Asn Asn Asn Gly Phe His Ser Glu Leu Tyr Ser Ile Val His Gly 295 300 305 310 TCA AGT GCA GCT TTA GGT CAA GCA GCC AGA AAA ACA CCG TTC CCG AAT 1246 Ser Ser Ala Ala Leu Gly Gln Ala Ala Arg Lys Thr Pro Phe Pro Asn 315 320 325 ACC TCT TCC ATC ACT ACT ACA TCC TTG GCT ACT GCT TCA TCT GCC TTG 1294 Thr Ser Ser Ile Thr Thr Thr Ser Leu Ala Thr Ala Ser Ser Ala Leu 330 335 340 TTC CCT CTT CTA TAT GCT GGT CGG TCT TGC TCT TCT CAA AGC AAA GTG 1342 Phe Pro Leu Leu Tyr Ala Gly Arg Ser Cys Ser Ser Gln Ser Lys Val 345 350 355 TCT TGC ACA TCC ACA GGA TCC TAC ACC ATC TGC AAT TAT GGG AAA TGG 1390 Ser Cys Thr Ser Thr Gly Ser Tyr Thr Ile Cys Asn Tyr Gly Lys Trp 360 365 370 GTC ACT GCT CCT TGT CCT CCA GGT GTA ATT TGC CTC TCA AGC GCC CAA 1438 Val Thr Ala Pro Cys Pro Pro Gly Val Ile Cys Leu Ser Ser Ala Gln 375 380 385 390 TCG AAC AAT ACA GAT CTC ACA GTC TCT GCT CAG TTC TTT ATC ACA TCC 1486 Ser Asn Asn Thr Asp Leu Thr Val Ser Ala Gln Phe Phe Ile Thr Ser 395 400 405 TTC GCC GGG GGA TCT TTT AAA GCT ATC ATC AAT GCA CGT CGT ACA ACA 1534 Phe Ala Gly Gly Ser Phe Lys Ala Ile Ile Asn Ala Arg Arg Thr Thr 410 415 420 TTG ACT CCA TTT GAA AAG ATG AAA ACT ATC GAA TTC ACC GTA CCA GAC 1582 Leu Thr Pro Phe Glu Lys Met Lys Thr Ile Glu Phe Thr Val Pro Asp 425 430 435 CAT GTT CGA TTG AGC CAG TGT AAT TTG GGC AAG ATT GAG CAA GTA GGC 1630 His Val Arg Leu Ser Gln Cys Asn Leu Gly Lys Ile Glu Gln Val Gly 440 445 450 CGC AGT GTC CGC ATT CGA CTC AAG GAT CAT CCA AAT ATG GCA TTT GTG 1678 Arg Ser Val Arg Ile Arg Leu Lys Asp His Pro Asn Met Ala Phe Val 455 460 465 470 CTA AAT CTT AGC GGA AAT GTT TCT TCT GAT GCC TTT GTG GCT CCT GAC 1726 Leu Asn Leu Ser Gly Asn Val Ser Ser Asp Ala Phe Val Ala Pro Asp 475 480 485 CCT TCT TCT TGG CGC TTT AGC TAAAAACATA ATATTTTCTT ATTTGCTAAA 1777 Pro Ser Ser Trp Arg Phe Ser 490 ATATATTAAA AAAAAACAAA AGAGTATGGA TATAATAGAT GGGGTTTGAC CTTTTTTTAT 1837 TGGAGTGTAG GAGGAAGTAT TATTAAAAAA AAGTAATAAG AATTGTCTTA AAATATATAT 1897 AATGTTTGTA TGAGACATGA TTTCATCATA ATTTACAGAG AAAAACGAAA AAAAAAGTGA 1957 AAAGAAAAAA ACGTTTGTAC AACTAGTTTT TCTTTGAAGG GTGAGGACTA GAAATGAAGT 2017 GATAAAGGTG GATTGTTATG TTTTGGAGTA GTTGCTATAT AAAATAAAAT GAGTCAACAT 2077 GTTTAATGTG TATTTTTTTA TTTTAGTCCT TACCTTCGTT TAATTGTTGT TGAGCGGCGG 2137 CCATTGCCAT TTGCATAGCT GCTTTATTTG TATTGGATGA GCCATTGACA ACAGCAGCCA 2197 TGTTGGCAGC GATCATGCCA TTAGCCATAG CAACAGCGGC TTGCTGGGGA GTAAGCTT 2255

【０１７１】配列番号：８ 配列の長さ：2288 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・ニヘ゛ウス(Rhizopus niveus) 株名：ＩＦＯ８６３１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：526..2220 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：intron 存在位置：628..675, 869..917 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AAGCTTACAC TGACTACCCT CCTCTTGGTC GTTTCGCTGT TCGTGACATG CGTCAAACCG 60 TTGCTGTCGG TGTCATCAAG TCCGTTGAAA AGGTCGACAA GGCCGGTAAG GTCACCAAGG 120 CCGCTGCCAA GGCCGGTAAG AAATAAATTG CTTAATTCTG TTTACCCACT TTGAAAAAAA 180 AAACACATTT TGTGATTTGG TTGAAAAATA ATAAAAAATA AAATTATTAT ATAAAAAGAC 240 ATGTCTTTGA AAGTATTTGA AGTGATTTGG TTGTAAGACA AAGTAGTATG TGTATAATCT 300 TCATTTTGAA ATGATTGACA CTTGATGTGT TGATAAAGCA AGTAGCCCAT ATACCCATAA 360 TCATGGCGTG TATTCTCGTA CATAAATAGG ATGATTCTAC AGAACATGGC ATGTTGTTCA 420 TCAAGGTTTT ATCAAAATGA AAACAACAAC TTTTTTGGAT TTAAAATGTG GAAAGGAAGG 480 AATTTTTTTT GTTTCTTTTA TTATTCTTGA AGACTTTCTT ACTCT ATG TTT ATC CTT 537 Met Phe Ile Leu 1 GGT ATG GTC ATT GCT GGC CTG TTA AAG GCT TTA CAT GTT CAA GCA GCT 585 Gly Met Val Ile Ala Gly Leu Leu Lys Ala Leu His Val Gln Ala Ala 5 10 15 20 TAT TCT TCA AAT GGC CCT AAC GTG ATG TAT TAT TGG GGA CAA 627 Tyr Ser Ser Asn Gly Pro Asn Val Met Tyr Tyr Trp Gly Gln 25 30 GTAAGTGGTA TAAGCTGTCA AAAGGTAAAT TCTTATGGGG ATGGTTAT AAC TCT GCT 684 Asn Ser Ala 35 GGT GGC GCG ACA ACT CAA GGT ACA TTA TCA AGT TAC TGC CAA TCA GGC 732 Gly Gly Ala Thr Thr Gln Gly Thr Leu Ser Ser Tyr Cys Gln Ser Gly 40 45 50 AAA GCA GAC ATC ATC CTC TTG TCA TTT CTT CAT ATC TTC AAT CTG GGT 780 Lys Ala Asp Ile Ile Leu Leu Ser Phe Leu His Ile Phe Asn Leu Gly 55 60 65 GGA TTA CCT CAA ATC AAC CTA TCG AAT GCA TGT GAA AAC ACT TTC TTT 828 Gly Leu Pro Gln Ile Asn Leu Ser Asn Ala Cys Glu Asn Thr Phe Phe 70 75 80 85 CCA AAC AGC CAA CTA CTT TCA TGT CCT GCT ATC GGA TCA G GTAGACTAGT 878 Pro Asn Ser Gln Leu Leu Ser Cys Pro Ala Ile Gly Ser 90 95 CCATGCTGGC CCTCCTTCAA ACGATCTCAT GACTTATAG AC TTC AAG ACA TGT CAA 934 Asp Ile Lys Thr Cys Gln 100 GCC AAA GGA GTC AAG ATT CTC TTG TCT CTG GGT GGG GCT ACT GGG GCT 982 Ala Lys Gly Val Lys Ile Leu Leu Ser Leu Gly Gly Ala Thr Gly Ala 105 110 115 120 TAT GGA TTT ACA AGT GAT GCT GAA GGA CAG CAG TTT GCG GAA ACG CTC 1030 Tyr Gly Phe Thr Ser Asp Ala Glu Gly Gln Gln Phe Ala Glu Thr Leu 125 130 135 TGG AAC TTA TTT GGC CGT GGG TCG TCC GAG ACG CGG CCC TTT GGT GAT 1078 Trp Asn Leu Phe Gly Arg Gly Ser Ser Glu Thr Arg Pro Phe Gly Asp 140 145 150 GCG ATC ATT GAC GGG ATC GAT TTT GAC ATC GAA GGG GGT TCG TCT GGG 1126 Ala Ile Ile Asp Gly Ile Asp Phe Asp Ile Glu Gly Gly Ser Ser Gly 155 160 165 GGC TAT GCG GCC TTG GTC ACT GCC CTT CGT TCG AAA TCA GCC AGC CAG 1174 Gly Tyr Ala Ala Leu Val Thr Ala Leu Arg Ser Lys Ser Ala Ser Gln 170 175 180 GAC TTC TTG ATC GGT GCG GCT CCT CAA TGC CCC TTC CCG GAT GCT CTC 1222 Asp Phe Leu Ile Gly Ala Ala Pro Gln Cys Pro Phe Pro Asp Ala Leu 185 190 195 200 CTT GGA CCG GTG ATC GAT GCG GTC GGA TTG GAT TAT GTC AAT GTT CAG 1270 Leu Gly Pro Val Ile Asp Ala Val Gly Leu Asp Tyr Val Asn Val Gln 205 210 215 220 TTT TAC AAC AAT TAT TGT TCT GCG CTC GGT GCG TCC TTT AAC TTT GAT 1318 Phe Tyr Asn Asn Tyr Cys Ser Ala Leu Gly Ala Ser Phe Asn Phe Asp 225 230 235 GTG TGG GAC ACA TGG GCC AAG ACA CAG TCG GCC AAC AAG CAG ATC AAG 1366 Val Trp Asp Thr Trp Ala Lys Thr Gln Ser Ala Asn Lys Gln Ile Lys 240 245 250 GTC TAT CTG ACC CTA CCT GGC TCT CCT CGT GCT GCT GGC AGT GGC TAT 1414 Val Tyr Leu Thr Leu Pro Gly Ser Pro Arg Ala Ala Gly Ser Gly Tyr 255 260 265 GTC GAC ATG ACC AGC TTG AGT CGT CTG GTG CCT TCT GTC GCG TCT CGG 1462 Val Asp Met Thr Ser Leu Ser Arg Leu Val Pro Ser Val Ala Ser Arg 270 275 280 285 TAC GCA AGC TAT GGC GGT GTG TCT GTG TGG GAT GCA TCC CAG GCT TGG 1510 Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Val Ser Val Trp Asp Ala Ser Gln Ala Trp 300 305 310 AAC AAT CCC GGA TTC CCT TCG TCG CTT TAC GAT CTC GTG CAC GGA TCT 1558 Asn Asn Pro Gly Phe Pro Ser Ser Leu Tyr Asp Leu Val His Gly Ser 315 320 325 GCT CCA GCC CTG ACC ACT TCA ACC GCC AGT CGC AGC ACT TCC TCA CCG 1606 Ala Pro Ala Leu Thr Thr Ser Thr Ala Ser Arg Ser Thr Ser Ser Pro 330 335 340 ATG CCG ACC GTC CCC TCG TCT GGT GCA TGC ACC TCC GAT CAA GCC TGT 1654 Met Pro Thr Val Pro Ser Ser Gly Ala Cys Thr Ser Asp Gln Ala Cys 345 350 355 TCC GTA CCA GGT CAA TAC ATC TGT ACA CCC CAT GGG GCC TAT GCT TTC 1702 Ser Val Pro Gly Gln Tyr Ile Cys Thr Pro His Gly Ala Tyr Ala Phe 360 365 370 375 TGT GTG CAC GGC CAG TGG CTC ACG GCG TCC TGT CCA CCC GGT ACG GTT 1750 Cys Val His Gly Gln Trp Leu Thr Ala Ser Cys Pro Pro Gly Thr Val 380 385 390 TGC ATT CCG ACG GTG GAT GGT GCT TCG ATC TAC TGT GGC TAT GGT ACA 1798 Cys Ile Pro Thr Val Asp Gly Ala Ser Ile Tyr Cys Gly Tyr Gly Thr 395 400 405 CCT GGA TCG AGT TGC GTC CAT GGT CTC AAT GCA TCG AGT GTC GCC CTG 1846 Pro Gly Ser Ser Cys Val His Gly Leu Asn Ala Ser Ser Val Ala Leu 410 415 420 AAC ACC CAG CCA GTC CCT CGT CCT TAC CGT CTT TCA AAC ACG CAT GTT 1894 Asn Thr Gln Pro Val Pro Arg Pro Tyr Arg Leu Ser Asn Thr His Val 425 430 435 CAA CTG GTC ATC ACT TCC TTT TCG GAC CAT GTC TTT GAG GCA ATG ATC 1942 Gln Leu Val Ile Thr Ser Phe Ser Asp His Val Phe Glu Ala Met Ile 440 445 450 455 CAC GCG CGT CGT ACG ACC CTT TTT CCA TTC CAT CCA ACC ATC ACC CTT 1990 His Ala Arg Arg Thr Thr Leu Phe Pro Phe His Pro Thr Ile Thr Leu 460 465 470 GAA TTG AAC GTG TCT GAT CAG GTC CAG TTG GAT CCA TCC AAG GGG GTC 2038 Glu Leu Asn Val Ser Asp Gln Val Gln Leu Asp Pro Ser Lys Gly Val 475 480 485 CAG CAA AAA GAT AAA ACG GTA CGT GTG AAG GTG ATC AAT CCA TCG AAT 2086 Gln Gln Lys Asp Lys Thr Val Arg Val Lys Val Ile Asn Pro Ser Asn 490 495 500 CAA ACC ATG GCC CTT GTT CTT CAC CTC ACC GGA TCT GTA TCT TCC GAT 2134 Gln Thr Met Ala Leu Val Leu His Leu Thr Gly Ser Val Ser Ser Asp 505 510 515 GTC TTT GTG GCC CCT GCT TCC TTG CGT TTC AAC TAAAAACATC TTTATGCTAC 2187 Val Phe Val Ala Pro Ala Ser Leu Arg Phe Asn 520 525 530 ATAAAAAAAA TAAACGGATT GCGATTCAAA GAGAAATACT CGTATAAATG CCCTTGACCA 2247 AGGAGTTTTA TGTTAAAATG AAAAAGGCTG TATCTGAGAA T 2288

【０１７２】配列番号：９ 配列の長さ：2664 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・ニヘ゛ウス(Rhizopus niveus) 株名：ＩＦＯ４８１０ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：239..2388 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：intron 存在位置：296..354, 600..380, 896..960, 995..1058,
1212..1270,1500..1571, 1731..1794 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CAATGCAAAA AATCTGGGCT GAACAAGAAG ACATAGAAAA GGTTCAATGG GGATGTAAAA 60 TAGCTAAAGA GGTTTTGAAT GGAAAATAAT AATAATAATA GAAAAAATGG TATTTTGTTA 120 TTCTAGAATA AAAAAAAATA GGTGCCATTT AGACGATATT TCAATTAATA ATTTTGTTGC 180 TAAAAAGTAG AATCAGTTTA TGAGATTCCT CTTTTTCTCT CTTTCTTCTT TGTTGCAA 238 ATG AAA AAA ACC TTG GTC GTT ATC TCT GCA ATT CTT GGA ATA ACT ACA 286 Met Lys Lys Thr Leu Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Gly Ile Thr Thr 1 5 10 15 GCA TTT GAT GTAAATTTAA ATAATGTTCG TATAAAGTTG ACCATTGCAT 335 Ala Phe Asp TAAGCACTTC TTATTCTAG AAT GCT TGT AAT CAT AAC GTT GTA GGC T 382 Asn Ala Cys Asn His Asn Val Val Gly 20 25 GTAAGTACAA ACACGCTTTT TAATAGCCAA ATAATAAACA TATATAAAAA AAG AT TGG 440 Tyr Trp GGA CAG AAT TCT TTT GGT GCT GCC AAT GGA CAG GAC AGA TCA GGC TGG 488 Gly Gln Asn Ser Phe Gly Ala Ala Asn Gly Gln Asp Arg Ser Gly Trp 30 35 40 CAA AAG TCC ATA AGC TTT TAT TGT GAT GAT GAT TCT TTT GAC GTA TTC 536 Gln Lys Ser Ile Ser Phe Tyr Cys Asp Asp Asp Ser Phe Asp Val Phe 45 50 55 CCA ATT TCC TTT TTA ACA ACT TTC TTC GGT CCT GAT GGT ACG CCT CAA 584 Pro Ile Ser Phe Leu Thr Thr Phe Phe Gly Pro Asp Gly Thr Pro Gln 60 65 70 75 ATC AAC CTT GCC AAT GTAGAAAAAA AGAAGAATAT GTCTTATTAC AACAGACTAA 639 Ile Asn Leu Ala Asn 80 TAATTTCTTA G ACA TGT AAC AAT GTT GAT AAT GCT ACT TTT CCC GGA ACT 689 Thr Cys Asn Asn Val Asp Asn Ala Thr Phe Pro Gly Thr 85 90 ACT CTA GCC AAT TGT CAA ACA ATG GCC CCT GAT ATT AAG TAT TGC CAA 737 Thr Leu Ala Asn Cys Gln Thr Met Ala Pro Asp Ile Lys Tyr Cys Gln 95 100 105 TCA AAG GGC AAG TTA GTT ACC CTT TCT TTG GGT GGG GCT ACG GGC GGT 785 Ser Lys Gly Lys Leu Val Thr Leu Ser Leu Gly Gly Ala Thr Gly Gly 110 115 120 GTT GGA TTC CAG TCT GAT TCT CAA GCT ACC TCA TTT GCT GAT ACT ATT 833 Val Gly Phe Gln Ser Asp Ser Gln Ala Thr Ser Phe Ala Asp Thr Ile 125 130 135 140 TGG AAT CTA TTT CTT GGT GGT GAA TCA TCC ATT CGT CCA TTT GGT GAT 881 Trp Asn Leu Phe Leu Gly Gly Glu Ser Ser Ile Arg Pro Phe Gly Asp 145 150 155 GCT ATC TTA GAC GG GTATACTTGC TTCCGAACAG ACTCATCTTA AAACAAAATA 935 Ala Ile Leu Asp Gly 160 TCTAAACCCT TCATATGTAT ATAG T ATC GAT TTG GAT ATT GAA GGT GGC GGA 987 Ile Asp Leu Asp Ile Glu Gly Gly Gly 165 170 TCT AAC C GTAGTGTATA GAAAAAATAA ACAAAAAGAA AAGGTACAGA TAACTTTGTTT 1044 Ser Asn ATACGTGCAT ATAG AT TAT ACA ACT TTT TTG CAA GCG CTA AGC TCA CAT 1093 His Tyr Thr Thr Phe Leu Gln Ala Leu Ser Ser His 175 180 TTT GTC AAC GCT TCA AAA AAA TAT TAC ATT ACT GCC GCT CCG CAA TGT 1141 Phe Val Asn Ala Ser Lys Lys Tyr Tyr Ile Thr Ala Ala Pro Gln Cys 185 190 195 200 GTG TTC CCT GAT GCC AAC CTC CAA GCT ACC CTA AAT AGT TTT TCA TTT 1189 Val Phe Pro Asp Ala Asn Leu Gln Ala Thr Leu Asn Ser Phe Ser Phe 205 210 215 GAC GCG ATC TAT GGT CAA TTC T GTAAAGCATT TATAATTTAG GAAGGACAAG 1241 Asp Ala Ile Tyr Gly Gln Phe 220 GACTAACCCA CTTTTAAAAT TAAAAAAAG AC CAC AAA CCT TGT GGT CCT CAA 1294 Tyr His Lys Pro Cys Gly Pro Gln 225 230 TTT TTT AAC ACA ATT CAG TGG AAC TTT GGT GTT TGG GAA AAT TGG GCA 1342 Phe Phe Asn Thr Ile Gln Trp Asn Phe Gly Val Trp Glu Asn Trp Ala 235 240 245 CGT ACC TCG TCT CCC AAT CCT AAT GTG AAA GGT TAT ATA GGT GCT CCT 1390 Arg Thr Ser Ser Pro Asn Pro Asn Val Lys Gly Tyr Ile Gly Ala Pro 250 255 260 GCC AGT TCT TCA GCT GCT GGT AGT GGT TAT GTA TCT GCT TCG ACT TTG 1438 Ala Ser Ser Ser Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Val Ser Ala Ser Thr Leu 265 270 275 CTT AAC ATT GCT TTA GAT ACA AGG AAT TAT TTT CCT AGT TTT GGA GGT 1486 Leu Asn Ile Ala Leu Asp Thr Arg Asn Tyr Phe Pro Ser Phe Gly Gly 280 285 290 295 ATT ATG TTT TGG G GTAAAGTTAG AAGAAGAAAA AGCTTCCAGA CCTTACTTCA 1539 Ile Met Phe Trp AAAGAGTGTT TCTTATAATT TGGTTTGAAC AG AT GTT TCG CAA GCA TAC GGA 1591 Asp Val Ser Gln Ala Tyr Gly 300 305 AAT AAC AAA TTT GGG GCT TTT CTA AAG AAT GGG CTA TCC TCT GGC TCA 1639 Asn Asn Lys Phe Gly Ala Phe Leu Lys Asn Gly Leu Ser Ser Gly Ser 310 315 320 AGC TGT AAT GGC AAG TTT AAT TTC TTA CCA TGC ACT GCA CCT GCT TAT 1687 Ser Cys Asn Gly Lys Phe Asn Phe Leu Pro Cys Thr Ala Pro Ala Tyr 325 330 335 GTT AGT GGT ACC GGT TAT AGT GGA GGA AGC AGA GTT CTT ATA A 1730 Val Ser Gly Thr Gly Tyr Ser Gly Gly Ser Arg Val Leu Ile 340 345 350 GTAAGCTATC AAGCATGAAT TTGTATTTAT GTTATCAACT AATATTATTC TAAAAAAAAA 1790 ACAG TG GAT ATA CTT GGA TT GTAAGTTCAA AGTATCTTTA TAATGAATTT 1840 Met Asp Ile Leu Gly Leu 355 TTCAACTAAT TTCAAACAAT AATAGGCTAG A TGG TAT GCC TCT TCG GCT CCT 1892 Trp Tyr Ala Ser Ser Ala Pro 360 365 TCC TCT AGT CCT AGC TCA GAA TGG CTG CCT ATA ATG GCA TGT TCC AAT 1940 Ser Ser Ser Pro Ser Ser Glu Trp Leu Pro Ile Met Ala Cys Ser Asn 370 375 380 GAC AAT AGT GGT TCA ACT TCC GGA TCT TAT ACT TCC AAA ACA TTA CCA 1988 Asp Asn Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Tyr Thr Ser Lys Thr Leu Pro 385 390 395 TCT GGT ACC AAT GCC TCC TCA TCT AGA ATT AAT ATA TCT AGC ACT CCT 2036 Ser Gly Thr Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ile Asn Ile Ser Ser Thr Pro 400 405 410 CAA TCA GTC CAA CCA TCT GCT AGC ATG TCT ACT ACT ACA TTT TAT ACT 2084 Gln Ser Val Gln Pro Ser Ala Ser Met Ser Thr Thr Thr Phe Tyr Thr 415 420 425 AAA TCT AGC GCT GTC CCA AGT ACA ACA TCC TCA GCA GCA ATA ATT TCA 2132 Lys Ser Ser Ala Val Pro Ser Thr Thr Ser Ser Ala Ala Ile Ile Ser 430 435 440 445 TCT CGT TGT GCT AGC ACC CTC CCT TGG TCT CCT TCA GTC GCC TAT ACT 2180 Ser Arg Cys Ala Ser Thr Leu Pro Trp Ser Pro Ser Val Ala Tyr Thr 450 455 460 GGT GGA GTC AAT GTT TAT TAC AAC AAT GCT ATT TGG AGA GCA AAA TGG 2228 Gly Gly Val Asn Val Tyr Tyr Asn Asn Ala Ile Trp Arg Ala Lys Trp 465 470 475 TGG TCT CAA AAT GAT GTC CCC GGA GGC ATC GCT GGC GTT TGG GAA AAG 2276 Trp Ser Gln Asn Asp Val Pro Gly Gly Ile Ala Gly Val Trp Glu Lys 480 485 490 GTT GAA TCT TGC GAA CCA GAG AGA ACA TTG TCT TCT CGA TCT ATC CTG 2324 Val Glu Ser Cys Glu Pro Glu Arg Thr Leu Ser Ser Arg Ser Ile Leu 495 500 505 AAA GGT AAA ATA TAAAGCAAGC AGTCATACAA CTCAGTTAAA ATGTTTCTTT 2376 Lys Gly Lys Ile 510 TAGCGGCCTC ACAAATCAAT TGCAAGCGGA ACATTTTAAG GTGGAGCAAA CTTAAGAACT 2346 ATACCAAAGG GAATAGAGTT TTTTATAAGT AACGACCGAC GAGAAAACGA AAGGAACTTT 2496 TAAATAATTA TCTTTATTTT ATAGAGGAGT AATCTATGCT GCTTCTAGGC CTAACCTTGT 2556 AAGACGTCAC TATAGCACAT GTGTATTATT CGCTAACTTT TTCCTTTTTT TTTTTCGCTT 2616 TTGCACAAAT AGAATCAACA ACCAAACATC AACTCTTTTG ATTGGGAG 2664

【０１７３】配列番号：10 配列の長さ：2434 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リソ゛フ゜ス・ニヘ゛ウス(Rhizopus niveus) 株名：ＩＦ４８１０ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：236..2130 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：intron 存在位置：335..398, 589..643, 866..950, 1281..133
9, 1212..1270,1500..1571, 1731..1794 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGGTACATGT CCTTTTCGGT CTCTTTCCGT ATGATCATCT TACGTAAACC AAGTACTCAT 60 TAATGATCAA GTAAGTGAAT AAAGGGTTCC CATGATTAGC AACACCTCTC AATTAACAAT 120 TTTATACTGT TTGAAACTTG AATTTTTTTT TAAAGAAAAA AAACCTATAA ATACGTCTAG 180 TTTGACAAGA ATCCTCCTTC TTTTTAAAAA ATACACATTT TTCAAAGAAA CAAAT ATG 238 Met 1 AAT CAC TGG TTC ATA ATC ACC TTC CTC TGC ATC CTT CTC TAT AAA GCT 286 Asn His Trp Phe Ile Ile Thr Phe Leu Cys Ile Leu Leu Tyr Lys Ala 5 10 15 CAA GCC AGC TTT CTT GAT TCC CCT TCG ATT GCG ACA TAT TGG GGA CAG 334 Gln Ala Ser Phe Leu Asp Ser Pro Ser Ile Ala Thr Tyr Trp Gly Gln 20 25 30 GTAAACCAGA TTTGTTTCTA GAGGGGGGGG GGAAACTCAC TGCTGTTTGT TTTCCTTTTG 394 ATAG AAT TCA AAA GGA GGC TCC GAC ACA CAG CAT TCA CTT GCT ACT TAT 443 Asn Ser Lys Gly Gly Ser Asp Thr Gln His Ser Leu Ala Thr Tyr 35 40 45 TGT GAT GGT AAA TCG GAT GTT ATC ATC CTA GCT TTT GTT CTT GAC TTT 491 Cys Asp Gly Lys Ser Asp Val Ile Ile Leu Ala Phe Val Leu Asp Phe 50 55 60 AGG AAT AAG GAG CTT CCT CAA CTT AAC CTT GCA AAT TCA TGT GAC GGA 539 Arg Asn Lys Glu Leu Pro Gln Leu Asn Leu Ala Asn Ser Cys Asp Gly 65 70 75 CCT CGA TTT CCA GGC ACC AAT CTC TTA CAA TGC CCT GAA GTT GGA AAA 587 Pro Arg Phe Pro Gly Thr Asn Leu Leu Gln Cys Pro Glu Val Gly Lys 80 85 90 95 G GTAAATAGGA TTGAATGTTG GATCGATTTT TTGACGATTT CAATAAAATA TGTAG 643 AT ATC AAG ACC TGT CAA AAG AAG GGT AAA ACG ATC TTG TTG TCC TTG 690 Asp Ile Lys Thr Cys Gln Lys Lys Gly Lys Thr Ile Leu Leu Ser Leu 100 105 110 GGT GGT GCT GCT GGC GCT TAT GGG TTT GCT AAT GAC AAA GAT GCT GTT 738 Gly Gly Ala Ala Gly Ala Tyr Gly Phe Ala Asn Asp Lys Asp Ala Val 115 120 125 GCG TTT GCT GAC ACA CTT TGG GCA ACC TTT GGT GGT GGA AAA AGT GAA 786 Ala Phe Ala Asp Thr Leu Trp Ala Thr Phe Gly Gly Gly Lys Ser Glu 130 135 140 AGA CGA CCC TTT GGC GAT GCG GTC GTT GAT GGA TTT GAT CTT GAT ATT 834 Arg Arg Pro Phe Gly Asp Ala Val Val Asp Gly Phe Asp Leu Asp Ile 145 150 155 GAA GGG GGT GGA TCT ACT GGT TAT GCA GTG A GTAACCACTT TCATTCCTTG 885 Glu Gly Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Val 160 165 ACAGACACTC ATCAGTTCAC TTTCACAGGC CATGGTCAAA CGACTTCGCT CTCATTTTAA 945 TTCAG AC AGG TCC AAG AAA TAT TAC ATC ACA GGC GCT CCA CAG TGT CCA 994 Asn Arg Ser Lys Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Ala Pro Gln Cys Pro 170 175 180 TTC CCT GAC GCT ATG CTT GGG CCT GCT TTG GAC GCA TCT GAA TTT GAT 1042 Phe Pro Asp Ala Met Leu Gly Pro Ala Leu Asp Ala Ser Glu Phe Asp 185 190 195 200 GCT GTG TTT GTT CAG TTC TAT AAC AAT TAC TGT TCT ACG ACC AGT GGG 1090 Ala Val Phe Val Gln Phe Tyr Asn Asn Tyr Cys Ser Thr Thr Ser Gly 205 210 215 AAT TTC AAT TTT GAA ACA TGG GAT CAG TGG GCA AGG CAC ACC TCA CCT 1138 Asn Phe Asn Phe Glu Thr Trp Asp Gln Trp Ala Arg His Thr Ser Pro 220 225 230 AAT AGA AAC GTC AAG GTG TTC TTG GGC CTG CCG GGA TCA AGT GCA GCA 1186 Asn Arg Asn Val Lys Val Phe Leu Gly Leu Pro Gly Ser Ser Ala Ala 235 240 245 GCC GGT AGT GGT TAT GTG CCT TAT AAG ACA TTA GAA CCA GTC ATC AGG 1234 Ala Gly Ser Gly Tyr Val Pro Tyr Lys Thr Leu Glu Pro Val Ile Arg 250 255 260 CAC TTG TAT TCA ACC TAT TCG AGC TTT GGA GGT GTG ATG TTA TGG G 1280 His Leu Tyr Ser Thr Tyr Ser Ser Phe Gly Gly Val Met Leu Trp 265 270 275 GTAAGTCAGA GAGGGATGAA TACGAAAACA GATGCCAAAT GACTCCTTTT TTATTGTAG 1339 450 AC GCA TCC GCA TCC TAT AGC AAC AAG GAA GTA TCC CCC CAC TAC CAA 1786 Asp Ala Ser Ala Ser Tyr Ser Asn Lys Glu Val Ser Pro His Tyr Gln 280 285 290 295 GCT GCC ATA TTC AAA TTA TTA TCT AGC CTA AGC AAA GGC GGA CCT AGC 1434 Ala Ala Ile Phe Lys Leu Leu Ser Ser Leu Ser Lys Gly Gly Pro Ser 300 305 310 AAA GGC GGA TCT AGC AAA ACA ATC AAG AAC ACA AAA ACA ATC TCT TCT 1482 Lys Gly Gly Ser Ser Lys Thr Ile Lys Asn Thr Lys Thr Ile Ser Ser 315 320 325 CAT ACA ACC AAG ACC ACA AAG TCC CAT CGA CCT ACA GAC ACC CCC TCT 1530 His Thr Thr Lys Thr Thr Lys Ser His Arg Pro Thr Asp Thr Pro Ser 330 335 340 GTG AGA GAG TGT GTA CAA AAA GAC CAA CCT TGT TCT GGC GGG TTT GCA 1578 Val Arg Glu Cys Val Gln Lys Asp Gln Pro Cys Ser Gly Gly Phe Ala 345 350 355 TGC TCT GGA AAC TCC TTT GCT ACC TGT GTC CAC GGT CGG TGG CTT CTT 1626 Cys Ser Gly Asn Ser Phe Ala Thr Cys Val His Gly Arg Trp Leu Leu 360 365 370 375 CGA CCC TGT CCA GAG GGA CTT GTC TGC CTG TCT TCA ACA GAC GGT GTG 1674 Arg Pro Cys Pro Glu Gly Leu Val Cys Leu Ser Ser Thr Asp Gly Val 380 385 390 TCT GCC TAC TGT GCT CAA GGT AAG GCA AAG ACA TGC ACC CGT CAA GGA 1722 Ser Ala Tyr Cys Ala Gln Gly Lys Ala Lys Thr Cys Thr Arg Gln Gly 395 400 405 TCC TTT CAG GCT TTG GCG GCC GTG GAT TCA TCC GTG GCC AAG GCT TAC 1770 Ser Phe Gln Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Ala Lys Ala Tyr 410 415 420 ACC GGT CGT TCA GTC ACT GCC CAA TTC TCC TTC ATC GGA GCT CGG CAG 1818 Thr Gly Arg Ser Val Thr Ala Gln Phe Ser Phe Ile Gly Ala Arg Gln 425 430 435 CAT CGG TTT ACG GCC ATC CTG AAC GCT CGC TGC TTG TCC CAC CAG GCC 1866 His Arg Phe Thr Ala Ile Leu Asn Ala Arg Cys Leu Ser His Gln Ala 440 445 450 455 TTT GGA GAG AGG GTG AAG GTT CAA TTG AAA GTC AGC CAA GGT ATC AAA 1914 Phe Gly Glu Arg Val Lys Val Gln Leu Lys Val Ser Gln Gly Ile Lys 460 465 470 ATC ACC CAA GTC AAA GGG GGT ACA GTT CGT CAG CAA GGA GAC ACG GTC 1962 Ile Thr Gln Val Lys Gly Gly Thr Val Arg Gln Gln Gly Asp Thr Val 475 480 485 CTC ATC CAC TAT CAC AAT CCG ATT GAC AAG GCC ATG GCC ATT GTG AAT 2010 Leu Ile His Tyr His Asn Pro Ile Asp Lys Ala Met Ala Ile Val Ile 490 495 500 CAG ATG CAG GGG CTG ATG CCA ACC CAT GGG GTG TTT ATA GGA CCA TCG 2058 Gln Met Gln Gly Leu Met Pro Thr His Gly Val Phe Ile Gly Pro Ser 505 510 515 ATG GAT AGC ATC AAG TTT TAT TAGAGATGGA CATGTTTGTG GTTACAAAAG 2109 Met Asp Ser Ile Lys Phe Tyr 520 525 ATAGCAGCAT GCTTGTACAA CCCATCTTTT TACACTAGAA TACAAATAAA GCAGGAAAGA 2169 CGTTCATCTC TTCCTTCTTT ACGTACATTC CACCTTCTTT ATCCTGATTG AGGTTCATTC 2229 TGAATGATGG AAAGGCAAAT GAATAAGGGT CATCACATGG GCTTGAGGAA GGTATTGCTG 2289 CTTTGCTTTG GGACTTTTAT GAAAGATTTC TTTGTTTACA TTTCTGTAGN ACAAGATAAA 2349 GACTGTTTAT TGTTTGTGGA TGNAGAGGCA GAAAAGCAGT AGGATGAATG CACTGGTCAT 2409 TTTTCAAGTT GAACAATGTG TCGAC 2434

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:845） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 堀内 裕之 東京都世田谷区北沢２−30−３ (72)発明者 太田 明徳 埼玉県大宮市プラザ57−２ (72)発明者 田中 宥司 栃木県那須郡西那須野町東三島６丁目393 番地13 (72)発明者 原田 聰 栃木県那須郡西那須野町南郷屋２−148Ａ −102

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の性質を有するキチナーゼ。 （イ）キチンのβ−１，４グリコシド結合を切断する活
   性を有し、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を
   実質的に有しない。 （ロ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した分子量：約５
   ０，０００（糖鎖を除去した分子量：約４，４５００） （ロ）熱安定性：ｐＨ４、６０℃、１０分間の熱処理後
   の残存活性７０〜７５％ （ハ）至適ｐＨ：４．０付近 （ニ）成熟酵素のＮ末端３０アミノ酸の配列は、配列番
   号１で表される。
2. 【請求項２】 以下の性質を有するキチナーゼ。 （イ）キチンのβ−１，４グリコシド結合を切断する活
   性を有し、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を
   実質的に有しない。 （ロ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した分子量：約５
   ２，０００（糖鎖を除去した分子量：約４，６５００） （ロ）熱安定性：ｐＨ４、６０℃、１０分間の熱処理後
   の残存活性５５〜６０％ （ハ）至適ｐＨ：３．５付近 （ニ）成熟酵素のＮ末端３０アミノ酸の配列は、配列番
   号２で表される。
3. 【請求項３】 リゾプス・オリゴスポラス(Rhizopus ol
   igosporus)により生産されることを特徴とする請求項１
   記載のキチナーゼ。
4. 【請求項４】 リゾプス・オリゴスポラスにより生産さ
   れることを特徴とする請求項２記載のキチナーゼ。
5. 【請求項５】 配列番号５（アミノ酸番号１〜５１８）
   で表されるアミノ酸配列を有する請求項１又は３に記載
   のキチナーゼ。
6. 【請求項６】 配列番号６（アミノ酸番号１〜５２５）
   で表されるアミノ酸配列を有する請求項２又は４に記載
   のキチナーゼ。
7. 【請求項７】 配列番号５で表されるアミノ酸配列（ア
   ミノ酸番号１〜５１８）を有するキチナーゼをコードす
   る遺伝子。
8. 【請求項８】 配列番号６で表されるアミノ酸配列（ア
   ミノ酸番号１〜５２５）を有するキチナーゼをコードす
   る遺伝子。
9. 【請求項９】 配列番号５で表される塩基配列（塩基番
   号４１０〜２０１５、任意のイントロンを含んでいても
   よい）を有する請求項７記載のキチナーゼ遺伝子。
10. 【請求項１０】 配列番号６で表される塩基配列（塩基
    番号４１４〜２０２４、任意のイントロンを含んでいて
    もよい）を有する請求項８記載のキチナーゼ遺伝子。
11. 【請求項１１】 配列番号７で表されるアミノ酸配列を
    コードするキチナーゼ遺伝子。
12. 【請求項１２】 配列番号８で表されるアミノ酸配列を
    コードするキチナーゼ遺伝子。
13. 【請求項１３】 配列番号９で表されるアミノ酸配列を
    コードするキチナーゼ遺伝子。
14. 【請求項１４】 配列番号１０で表されるアミノ酸配列
    をコードするキチナーゼ遺伝子。
15. 【請求項１５】 配列番号５で表されるアミノ酸配列
    （アミノ酸番号１〜５１８）をコードするキチナーゼ遺
    伝子を導入したことを特徴とする酵母。
16. 【請求項１６】 請求項１５記載の酵母を培養し、この
    培養上清からキチナーゼを取り出すことを特徴とするキ
    チナーゼの製造方法。