JPH04365480A - プロテアーゼ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−アスパラギンのＣ
末端側アミド結合のみを選択特異的に水解するプロテア
ーゼに関する。 【０００２】 【従来の技術】ペプチド鎖中に含まれる特定のアミノ酸
残基を選択特異的に認識してそのＮ末端側又はＣ末端側
ペプチド結合のみを加水分解する方法は、タンパク質の
構造解析、タンパク質の修飾を行う上において極めて重
要な手段である〔綱沢進、崎山文夫、続生化学実験講座
（日本生化学会編）、２、第２６０〜２７７頁（１９８
７）〕。従来、この目的のための手段として、生物化学
的方法としてはＬ−リジンのＣ末端側ペプチド結合の水
解、Ｌ−リジンのＮ末端側ペプチド結合の水解、Ｌ−ア
ルギニンのＣ末端側ペプチド結合の水解、Ｌ−グルタミ
ン酸及びＬ−アスパラギン酸のＣ末端側ペプチド結合の
水解、Ｌ−アスパラギン酸のＮ末端側ペプチド結合の水
解、Ｌ−プロリンのＣ末端側ペプチド結合の水解が知ら
れており、また有機化学的方法としては、Ｌ−メチオニ
ンのＣ末端側ペプチド結合の切断、Ｌ−システィンのＮ
末端側ペプチド結合の切断、Ｌ−トリプトファンのＣ末
端側ペプチド結合の切断が知られている。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】タンパク質工学におい
ては、各種アミノ酸特異的にペプチド結合を切断する方
法が望まれている。しかしながら、上述した方法以外の
アミノ酸に特異的な切断方法は知られていない。本発明
の目的は、Ｌ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみ
を選択特異的に水解するプロテアーゼを提供することに
ある。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明はＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみを選
択特異的に水解するプロテアーゼに関し、下記の酵素化
学的性質： （１）作用：ペプチド鎖中のＬ−アスパラギンのＣ末端
側アミド結合のみを選択特異的に水解する。 （２）基質特異性：ニューロテンシン、β−エンドルフ
ィン、パラサイロイドホルモン（１−３４）、バソアク
ティブインテスティナルペプチド、ペプチドＴ、ボンベ
シン、酸化インシュリンＢ鎖、フィサラミンなるペプチ
ド鎖中のＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみを
選択特異的に水解する。 （３）至適ｐＨ：６．０〜７．０ （４）ｐＨ安定性：４．５〜６．５（１ｍＭ ＤＴＴ
を含む緩衝液中で３７℃、６時間処理） （５）至適温度：４５℃付近 （６）温度安定性：１ｍＭ ＤＴＴを含むｐＨ５．０
の緩衝液中で、５５℃、１５分間の加熱で安定。 （７）分子量：２６５５０（ゲルろ過法）を有すること
を特徴とする。 【０００５】本発明者らは、植物種子中に存在するレク
チンや貯蔵タンパク質のＣ末端側アミノ酸がＬ−アスパ
ラギンであることにかんがみ、植物種子中にペプチド鎖
中のＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみを選択
特異的に水解するプロテアーゼを検索したところ、タチ
ナタマメ（ Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉ
ｓ ） 種子中よりペプチド鎖中のＬ−アスパラギンの
Ｃ末端側アミド結合のみを加水分解するプロテアーゼを
単離、精製することに成功し、本発明を完成させた。本
発明は本酵素の製造方法、酵素の諸性質について検討を
重ね完成されたものである。 【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。 （本酵素の製造方法）本発明で用いられる酵素は、例え
ば、市販のジャックビーンミールを適当な還元剤の存在
下、ｐＨ４〜６の緩衝液中でホモゲナイズすることによ
り本酵素を可溶化した後、不溶物を遠心分離等の手段に
より除去し、種々のイオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ルろ過法等の精製手段により精製度を高め、本酵素の特
異的阻害物質であるパラメルクリ安息香酸（ＰＭＢ）を
アガロースに固定化したアフィニティクロマトグラフィ
ーを行うことにより単一なタンパク質として単離するこ
とができる。 【０００７】（本酵素の測定方法及び単位）基質として
は配列表の配列番号１に示すペプチドが用いられる。 ０．０２ｍＭ本基質、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、酵素及び内部標準物質としての０．００２ｍＭ
ＤＮＰ−Ｌ−Ｓｅｒを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）からなる反応液を３７℃、１０〜２０分間保
温したのち、終濃度１０％となる様にギ酸を添加し反応
を停止、反応液の一部を、例えば、ＯＤＳ−カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィーにより分析し、生成し
た配列表の配列番号２に示す配列を持つ断片量を内部標
準物質であるＤＮＰ−Ｌ−Ｓｅｒと比較定量することに
より本酵素活性を測定することができる。本酵素活性の
単位は１分間に１μｍｏｌの配列表の配列番号２に示す
配列を持つ断片を生成する酵素量を１単位とした。 【０００８】（本酵素の基質特異性）配列表の配列番号
３で表されるニューロテンシン、配列番号４で表される
β−エンドルフィン、配列番号５で表されるパラサイロ
イドホルモンのＮ末端ポリペプチド（１−３４）、配列
番号６で表されるバソアクティブインテスティナルペプ
チド、配列番号７で表されるペプチドＴ、配列番号８で
表されるボンベシン、配列番号９で表される酸化インシ
ュリンＢ鎖、配列番号１０で表されるフィサラミンを基
質として基質（ｎｍｏｌ）と酵素（ｍＵ）の比率を５０
：１とし、ｐＨ５．０で３７℃、１５時間反応を行った
結果Ｌ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみが加水
分解され、他のペプチド結合は全く加水分解されなかっ
た。表１及び表２に基質として用いた合成ペプチド及び
加水分解されたアミド結合部位を示した。 【０００９】 【表１】
表 １────────────────
───────────────────
基 質
水解されたアミド結合
───────────────────────
────────────
５ ↓ ６
ニューロテンシン
Ａｓｎ−
Ｌｙｓ
２０ ↓ ２１
β−エンドルフィン（ヒト）
Ａｓｎ−Ａｌａ
２５ ↓ ２６
Ａｓｎ−Ａｌａ
１０ ↓ １１ パラ
サイロイドホルモン
Ａｓｎ−Ｌｅｕ
（ヒト，１−３４）
１６ ↓ １７
Ａｓｎ−Ｓｅｒ
３３
↓ ３４
Ａｓｎ−Ｐｈｅ
９ ↓ １０ バソアクティ
ブイン
Ａｓｎ−Ｔｙｒ
テスティナルペプチド
２４ ↓ ２５
（ヒト，ブタ）
Ａｓｎ−
Ｓｅｒ
２８ ↓
Ａｓｎ−ＮＨ２ 【００１０】 【表２】
表 ２────────────────
───────────────────
基 質
水解されたアミド結合
───────────────────────
────────────
６ ↓ ７
ペプチドＴ
Ａ
ｓｎ−Ｔｙｒ
６ ↓ ７
ボンベシン
Ａｓｎ−
Ｇｌｎ
３ ↓ ４
酸化インシュリンＢ鎖
Ａｓｎ−Ｇｌｎ
５ ↓ ６ フィサラミン
Ａｓｎ−Ｌｙｓ ─
─────────────────────────
───────── 【００１１】 【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。 【００１２】実施例１ 市販ジャックビーンミール（シグマ社製）５００ｇを１
ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０）でホモゲナイズし遠心分離により上
清を得た。該上清を上記緩衝液中にて透析後、再び生じ
た沈殿物を遠心分離により除去し、ＳＰ−トヨパール６
５０Ｍ（東ソー製）によるイオン交換クロマトグラフィ
ーを行った。ＳＰ−トヨパール６５０Ｍカラムに吸着し
、０．５Ｍ塩化ナトリウムにて溶出した活性画分を６０
％飽和硫安沈殿後、上記緩衝液に対し透析した。続いて
、ＰＭＢをアガロースに固定化して作ったアフィニティ
カラムを用いてアフィニティクロマトグラフィーを行っ
た。同カラムに吸着し、０．５Ｍ塩化ナトリウムにて溶
出した活性画分を再び上記緩衝液に対し透析した。次に
、ロイシルアルギニナールカラム（オルガノ製）による
アフィニティクロマトグラフィーを行い、同カラムに吸
着されない活性画分を回収した。同活性画分を排除分子
量１００００の限外ろ過膜にて濃縮後トヨパールＨＷ−
５５Ｓ（東ソー製）によるゲルろ過を行った。こうして
得られた精製酵素は２．６ｍｇ、活性は１８０ｍＵであ
り、Ｃ４−逆相クロマトグラフィーにおいて単一なタン
パク質であった。 【００１３】実施例２ 実施例１で得られた精製酵素を用い、市販可溶性還元リ
ゾチーム（生化学工業社製）の限定加水分解を行った。 反応条件は１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡを
含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で
、基質濃度０．２ｍＭ、酵素濃度４ｍＵ／ｍｌにて３７
℃、１５時間反応を行った。終濃度１０％となるように
ギ酸を添加することにより反応を停止後、生成したペプ
チドフラグメントをＣ４−逆相クロマトグラフィー（ウ
ォーターズ社製、マイクロボンダスフェアー、３．９×
１５０ｍｍ）にて分離後、各フラグメントについてアミ
ノ酸組成分析、アミノ酸配列分析を行った。 【００１４】可溶性還元リゾチームのアミノ酸配列を配
列表の配列番号１１に、Ｃ４−逆相クロマトグラフィー
を図１に、ピーク番号１〜１６の各フラグメントのアミ
ノ酸配列を、ピーク番号１〜７は配列表の配列番号１２
〜１８、ピーク番号８は配列番号１９及び２０、ピーク
番号９は配列番号２１及び２２、ピーク番号１０〜１４
は配列番号２３〜２７、ピーク番号１５は配列番号２８
、２９及び３０、ピーク番号１６は配列番号３１として
それぞれ示す。図１は可溶性還元リゾチームを本酵素で
消化した後、Ｃ４逆相ＨＰＬＣにて画分したクロマトグ
ラフィーを時間（分、横軸）と２１５ｎｍにおける吸光
度（縦軸）との関係で示したグラフである。この結果本
酵素は、可溶性還元リゾチームに含まれるＬ−アスパラ
ギンのＣ末端側アミド結合のみを切断することが確認さ
れた。 【００１５】 【発明の効果】以上、詳細に説明したように、本発明に
よりペプチド鎖中のＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド
結合のみを選択特異的に水解するプロテアーゼが提供さ
れた。また、本発明により、Ｌ−アスパラギンとＬ−ア
スパラギン酸とを区別することができ、遺伝子工学にお
ける生産物の確認においても有効である。本発明のプロ
テアーゼは、タンパク質の構造解析において極めて重要
な手段として利用することができる。 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： １ ２，４，−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｌ−ｐ
ｒｏｌｉｎｅ４ Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｍｉｄｅ
配列番号：２ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： １ ２，４，−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｌ−ｐ
ｒｏｌｉｎｅ配列番号：３ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： １ Ｌ−ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ配列番
号：４ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒ
ｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ ２０
２５
３０配列番号：５ 配列の長さ：３４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列の種類：ペプチド 配列： Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌ
ｅｕ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙ
ｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ １
５
１０ １５ Ｓ
ｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒ
ｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｈｉｓ
２０ ２５
３０Ａｓｎ Ｐｈｅ 配列番号：６ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： ２８ Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｍｉｄｅ配列： Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔ
ｈｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｎ １
５
１０ １５Ｍｅ
ｔ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｘａａ
２０
２５ 配列番号：７ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： １ Ｌ−ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ１４
Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｍｉｄｅ配列： Ｘａａ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇ
ｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅ
ｕ Ｘａａ １ ５
１０配列番号：
９ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｃ
ｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ ２０ 配列番号：１０ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： １ Ｌ−ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ１１
Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｍｉｄｅ配列番号：１１ 配列の長さ：１２９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： ６ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）
ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ３０ Ｓ−３−（ｔｒ
ｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔ
ｅｉｎｅ６４ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍ
ｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ７６ Ｓ−
３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙ
ｌｃｙｓｔｅｉｎｅ８０ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈ
ｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ９
４ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）
ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ１１５ Ｓ−３−（ｔ
ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓ
ｔｅｉｎｅ１２７ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａ
ｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｘａａ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｙ
ｓ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｙ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ
Ｘａａ Ａｌａ Ａｌａ
２０ ２５
３０Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ａｓｐ ３５
４０
４５Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｘａａ
５０ ５５
６０Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｘａａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐ
ｒｏ Ｘａａ ６５
７０ ７５
８０Ｓｅｒ Ａ
ｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌ
ｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｘａａ
Ａｌａ Ｌｙｓ
８５ ９０
９５Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔ
ｒｐ Ａｒｇ １００
１０５
１１０Ａｓｎ Ａｒｇ Ｘａａ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｌ
ａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｘａａ Ａｒｇ
１１５
１２０ １
２５Ｌｅｕ 配列番号：１２ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：１３配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：１４ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：１５ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ３０ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列番号：１６ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：１７ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ６４ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列番号：１８ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：１９ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ３０ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｘａａ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ ２８
３２
３７ ４２Ａｓ
ｎ 配列番号：２０ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ６０ ｕｎｋｎｏｗｎ 配列： Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａ
ｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓ
ｐ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ ４０
４４
４９ ５４Ｌｅ
ｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｘａａ
５９ 配列番号：２１ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
： Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔ
ｈｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ ４５
４９ ５４
５９配列番号：２
２ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ３０ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ４５ ｕｎｋｎｏｗ
ｎ 配列： Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｘａａ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ ２８
３２
３７ ４２Ａｓ
ｎ Ｘａａ 配列番号：２３ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｎ末端フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ６ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）
ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｘａａ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｙ
ｓ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｙ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ａｓｐ Ａｓｎ 配列番号：２４ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：２５ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｃ末端フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： １１５ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉ
ｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ１２７ Ｓ−３−
（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃ
ｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ａｒｇ Ｘａａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖ
ａｌ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌ
ｙ Ｘａａ Ａｒｇ Ｌｅｕ １１４
１１８
１２３ １２８配列
番号：２６ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ７６ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ８０ Ｓ−３−（ｔ
ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓ
ｔｅｉｎｅ配列： Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｘａａ Ａｓｎ Ｉｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｓｅｒ ６６
７０
７５ ８０配列
番号：２７ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｎ末端フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ６ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）
ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｘａａ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｙ
ｓ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｙ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ
２０
２５配列番号：２８ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ３０ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ４８ ｕｎｋｎｏｗ
ｎ 配列： Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｘａａ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ ２８
３２
３７ ４２Ａｓ
ｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｘａａ
４７ 配列番号：２９ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ６４ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ７６ Ｓ−３−（ｔ
ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓ
ｔｅｉｎｅ８０ ｕｎｋｎｏｗｎ 配列： Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｘａａ Ａｓｎ Ａ
ｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ ６０
６４
６９ ７４Ｘａ
ａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｘａａ
７９ 配列番号：３０ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｃ末端フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： １１５ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉ
ｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ１２７ Ｓ−３−
（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃ
ｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ａｒｇ Ｘａａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖ
ａｌ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌ
ｙ Ｘａａ Ａｒｇ Ｌｅｕ １１４
１１８
１２３ １２８配列
番号：３１ 配列の長さ：２３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｃ末端フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： １１５ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉ
ｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ１２７ Ｓ−３−
（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃ
ｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ａｌａ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａ
ｓｎ Ａｒｇ Ｘａａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓ
ｐ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｌａ １０７
１１１
１１６ １２１Ｔｒ
ｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｘａａ Ａｒｇ Ｌｅｕ
１２６
末端側アミド結合のみを選択特異的に水解するプロテア
ーゼに関する。 【０００２】 【従来の技術】ペプチド鎖中に含まれる特定のアミノ酸
残基を選択特異的に認識してそのＮ末端側又はＣ末端側
ペプチド結合のみを加水分解する方法は、タンパク質の
構造解析、タンパク質の修飾を行う上において極めて重
要な手段である〔綱沢進、崎山文夫、続生化学実験講座
（日本生化学会編）、２、第２６０〜２７７頁（１９８
７）〕。従来、この目的のための手段として、生物化学
的方法としてはＬ−リジンのＣ末端側ペプチド結合の水
解、Ｌ−リジンのＮ末端側ペプチド結合の水解、Ｌ−ア
ルギニンのＣ末端側ペプチド結合の水解、Ｌ−グルタミ
ン酸及びＬ−アスパラギン酸のＣ末端側ペプチド結合の
水解、Ｌ−アスパラギン酸のＮ末端側ペプチド結合の水
解、Ｌ−プロリンのＣ末端側ペプチド結合の水解が知ら
れており、また有機化学的方法としては、Ｌ−メチオニ
ンのＣ末端側ペプチド結合の切断、Ｌ−システィンのＮ
末端側ペプチド結合の切断、Ｌ−トリプトファンのＣ末
端側ペプチド結合の切断が知られている。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】タンパク質工学におい
ては、各種アミノ酸特異的にペプチド結合を切断する方
法が望まれている。しかしながら、上述した方法以外の
アミノ酸に特異的な切断方法は知られていない。本発明
の目的は、Ｌ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみ
を選択特異的に水解するプロテアーゼを提供することに
ある。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明はＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみを選
択特異的に水解するプロテアーゼに関し、下記の酵素化
学的性質： （１）作用：ペプチド鎖中のＬ−アスパラギンのＣ末端
側アミド結合のみを選択特異的に水解する。 （２）基質特異性：ニューロテンシン、β−エンドルフ
ィン、パラサイロイドホルモン（１−３４）、バソアク
ティブインテスティナルペプチド、ペプチドＴ、ボンベ
シン、酸化インシュリンＢ鎖、フィサラミンなるペプチ
ド鎖中のＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみを
選択特異的に水解する。 （３）至適ｐＨ：６．０〜７．０ （４）ｐＨ安定性：４．５〜６．５（１ｍＭ ＤＴＴ
を含む緩衝液中で３７℃、６時間処理） （５）至適温度：４５℃付近 （６）温度安定性：１ｍＭ ＤＴＴを含むｐＨ５．０
の緩衝液中で、５５℃、１５分間の加熱で安定。 （７）分子量：２６５５０（ゲルろ過法）を有すること
を特徴とする。 【０００５】本発明者らは、植物種子中に存在するレク
チンや貯蔵タンパク質のＣ末端側アミノ酸がＬ−アスパ
ラギンであることにかんがみ、植物種子中にペプチド鎖
中のＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみを選択
特異的に水解するプロテアーゼを検索したところ、タチ
ナタマメ（ Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉ
ｓ ） 種子中よりペプチド鎖中のＬ−アスパラギンの
Ｃ末端側アミド結合のみを加水分解するプロテアーゼを
単離、精製することに成功し、本発明を完成させた。本
発明は本酵素の製造方法、酵素の諸性質について検討を
重ね完成されたものである。 【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。 （本酵素の製造方法）本発明で用いられる酵素は、例え
ば、市販のジャックビーンミールを適当な還元剤の存在
下、ｐＨ４〜６の緩衝液中でホモゲナイズすることによ
り本酵素を可溶化した後、不溶物を遠心分離等の手段に
より除去し、種々のイオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ルろ過法等の精製手段により精製度を高め、本酵素の特
異的阻害物質であるパラメルクリ安息香酸（ＰＭＢ）を
アガロースに固定化したアフィニティクロマトグラフィ
ーを行うことにより単一なタンパク質として単離するこ
とができる。 【０００７】（本酵素の測定方法及び単位）基質として
は配列表の配列番号１に示すペプチドが用いられる。 ０．０２ｍＭ本基質、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、酵素及び内部標準物質としての０．００２ｍＭ
ＤＮＰ−Ｌ−Ｓｅｒを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）からなる反応液を３７℃、１０〜２０分間保
温したのち、終濃度１０％となる様にギ酸を添加し反応
を停止、反応液の一部を、例えば、ＯＤＳ−カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィーにより分析し、生成し
た配列表の配列番号２に示す配列を持つ断片量を内部標
準物質であるＤＮＰ−Ｌ−Ｓｅｒと比較定量することに
より本酵素活性を測定することができる。本酵素活性の
単位は１分間に１μｍｏｌの配列表の配列番号２に示す
配列を持つ断片を生成する酵素量を１単位とした。 【０００８】（本酵素の基質特異性）配列表の配列番号
３で表されるニューロテンシン、配列番号４で表される
β−エンドルフィン、配列番号５で表されるパラサイロ
イドホルモンのＮ末端ポリペプチド（１−３４）、配列
番号６で表されるバソアクティブインテスティナルペプ
チド、配列番号７で表されるペプチドＴ、配列番号８で
表されるボンベシン、配列番号９で表される酸化インシ
ュリンＢ鎖、配列番号１０で表されるフィサラミンを基
質として基質（ｎｍｏｌ）と酵素（ｍＵ）の比率を５０
：１とし、ｐＨ５．０で３７℃、１５時間反応を行った
結果Ｌ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみが加水
分解され、他のペプチド結合は全く加水分解されなかっ
た。表１及び表２に基質として用いた合成ペプチド及び
加水分解されたアミド結合部位を示した。 【０００９】 【表１】
表 １────────────────
───────────────────
基 質
水解されたアミド結合
───────────────────────
────────────
５ ↓ ６
ニューロテンシン
Ａｓｎ−
Ｌｙｓ
２０ ↓ ２１
β−エンドルフィン（ヒト）
Ａｓｎ−Ａｌａ
２５ ↓ ２６
Ａｓｎ−Ａｌａ
１０ ↓ １１ パラ
サイロイドホルモン
Ａｓｎ−Ｌｅｕ
（ヒト，１−３４）
１６ ↓ １７
Ａｓｎ−Ｓｅｒ
３３
↓ ３４
Ａｓｎ−Ｐｈｅ
９ ↓ １０ バソアクティ
ブイン
Ａｓｎ−Ｔｙｒ
テスティナルペプチド
２４ ↓ ２５
（ヒト，ブタ）
Ａｓｎ−
Ｓｅｒ
２８ ↓
Ａｓｎ−ＮＨ２ 【００１０】 【表２】
表 ２────────────────
───────────────────
基 質
水解されたアミド結合
───────────────────────
────────────
６ ↓ ７
ペプチドＴ
Ａ
ｓｎ−Ｔｙｒ
６ ↓ ７
ボンベシン
Ａｓｎ−
Ｇｌｎ
３ ↓ ４
酸化インシュリンＢ鎖
Ａｓｎ−Ｇｌｎ
５ ↓ ６ フィサラミン
Ａｓｎ−Ｌｙｓ ─
─────────────────────────
───────── 【００１１】 【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。 【００１２】実施例１ 市販ジャックビーンミール（シグマ社製）５００ｇを１
ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．０）でホモゲナイズし遠心分離により上
清を得た。該上清を上記緩衝液中にて透析後、再び生じ
た沈殿物を遠心分離により除去し、ＳＰ−トヨパール６
５０Ｍ（東ソー製）によるイオン交換クロマトグラフィ
ーを行った。ＳＰ−トヨパール６５０Ｍカラムに吸着し
、０．５Ｍ塩化ナトリウムにて溶出した活性画分を６０
％飽和硫安沈殿後、上記緩衝液に対し透析した。続いて
、ＰＭＢをアガロースに固定化して作ったアフィニティ
カラムを用いてアフィニティクロマトグラフィーを行っ
た。同カラムに吸着し、０．５Ｍ塩化ナトリウムにて溶
出した活性画分を再び上記緩衝液に対し透析した。次に
、ロイシルアルギニナールカラム（オルガノ製）による
アフィニティクロマトグラフィーを行い、同カラムに吸
着されない活性画分を回収した。同活性画分を排除分子
量１００００の限外ろ過膜にて濃縮後トヨパールＨＷ−
５５Ｓ（東ソー製）によるゲルろ過を行った。こうして
得られた精製酵素は２．６ｍｇ、活性は１８０ｍＵであ
り、Ｃ４−逆相クロマトグラフィーにおいて単一なタン
パク質であった。 【００１３】実施例２ 実施例１で得られた精製酵素を用い、市販可溶性還元リ
ゾチーム（生化学工業社製）の限定加水分解を行った。 反応条件は１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡを
含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中で
、基質濃度０．２ｍＭ、酵素濃度４ｍＵ／ｍｌにて３７
℃、１５時間反応を行った。終濃度１０％となるように
ギ酸を添加することにより反応を停止後、生成したペプ
チドフラグメントをＣ４−逆相クロマトグラフィー（ウ
ォーターズ社製、マイクロボンダスフェアー、３．９×
１５０ｍｍ）にて分離後、各フラグメントについてアミ
ノ酸組成分析、アミノ酸配列分析を行った。 【００１４】可溶性還元リゾチームのアミノ酸配列を配
列表の配列番号１１に、Ｃ４−逆相クロマトグラフィー
を図１に、ピーク番号１〜１６の各フラグメントのアミ
ノ酸配列を、ピーク番号１〜７は配列表の配列番号１２
〜１８、ピーク番号８は配列番号１９及び２０、ピーク
番号９は配列番号２１及び２２、ピーク番号１０〜１４
は配列番号２３〜２７、ピーク番号１５は配列番号２８
、２９及び３０、ピーク番号１６は配列番号３１として
それぞれ示す。図１は可溶性還元リゾチームを本酵素で
消化した後、Ｃ４逆相ＨＰＬＣにて画分したクロマトグ
ラフィーを時間（分、横軸）と２１５ｎｍにおける吸光
度（縦軸）との関係で示したグラフである。この結果本
酵素は、可溶性還元リゾチームに含まれるＬ−アスパラ
ギンのＣ末端側アミド結合のみを切断することが確認さ
れた。 【００１５】 【発明の効果】以上、詳細に説明したように、本発明に
よりペプチド鎖中のＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド
結合のみを選択特異的に水解するプロテアーゼが提供さ
れた。また、本発明により、Ｌ−アスパラギンとＬ−ア
スパラギン酸とを区別することができ、遺伝子工学にお
ける生産物の確認においても有効である。本発明のプロ
テアーゼは、タンパク質の構造解析において極めて重要
な手段として利用することができる。 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： １ ２，４，−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｌ−ｐ
ｒｏｌｉｎｅ４ Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｍｉｄｅ
配列番号：２ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： １ ２，４，−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｌ−ｐ
ｒｏｌｉｎｅ配列番号：３ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： １ Ｌ−ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ配列番
号：４ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒ
ｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ ２０
２５
３０配列番号：５ 配列の長さ：３４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列の種類：ペプチド 配列： Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌ
ｅｕ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙ
ｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ １
５
１０ １５ Ｓ
ｅｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒ
ｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｈｉｓ
２０ ２５
３０Ａｓｎ Ｐｈｅ 配列番号：６ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： ２８ Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｍｉｄｅ配列： Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔ
ｈｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｌｅ
ｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｎ １
５
１０ １５Ｍｅ
ｔ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｘａａ
２０
２５ 配列番号：７ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： １ Ｌ−ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ１４
Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｍｉｄｅ配列： Ｘａａ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇ
ｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅ
ｕ Ｘａａ １ ５
１０配列番号：
９ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｃ
ｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌ
ｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ ２０ 配列番号：１０ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： １ Ｌ−ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ１１
Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｍｉｄｅ配列番号：１１ 配列の長さ：１２９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： ６ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）
ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ３０ Ｓ−３−（ｔｒ
ｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔ
ｅｉｎｅ６４ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍ
ｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ７６ Ｓ−
３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙ
ｌｃｙｓｔｅｉｎｅ８０ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈ
ｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ９
４ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）
ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ１１５ Ｓ−３−（ｔ
ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓ
ｔｅｉｎｅ１２７ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａ
ｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｘａａ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｙ
ｓ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｙ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ
Ｘａａ Ａｌａ Ａｌａ
２０ ２５
３０Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ａｓｐ ３５
４０
４５Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｙ
ｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｘａａ
５０ ５５
６０Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｘａａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐ
ｒｏ Ｘａａ ６５
７０ ７５
８０Ｓｅｒ Ａ
ｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｉｌ
ｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｘａａ
Ａｌａ Ｌｙｓ
８５ ９０
９５Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔ
ｒｐ Ａｒｇ １００
１０５
１１０Ａｓｎ Ａｒｇ Ｘａａ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｌ
ａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｘａａ Ａｒｇ
１１５
１２０ １
２５Ｌｅｕ 配列番号：１２ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：１３配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：１４ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：１５ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ３０ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列番号：１６ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：１７ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ６４ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列番号：１８ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：１９ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ３０ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｘａａ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ ２８
３２
３７ ４２Ａｓ
ｎ 配列番号：２０ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ６０ ｕｎｋｎｏｗｎ 配列： Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａ
ｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓ
ｐ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ ４０
４４
４９ ５４Ｌｅ
ｕ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｘａａ
５９ 配列番号：２１ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
： Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔ
ｈｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ ４５
４９ ５４
５９配列番号：２
２ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ３０ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ４５ ｕｎｋｎｏｗ
ｎ 配列： Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｘａａ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ ２８
３２
３７ ４２Ａｓ
ｎ Ｘａａ 配列番号：２３ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｎ末端フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ６ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）
ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｘａａ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｙ
ｓ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｙ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ａｓｐ Ａｓｎ 配列番号：２４ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
番号：２５ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｃ末端フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： １１５ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉ
ｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ１２７ Ｓ−３−
（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃ
ｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ａｒｇ Ｘａａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖ
ａｌ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌ
ｙ Ｘａａ Ａｒｇ Ｌｅｕ １１４
１１８
１２３ １２８配列
番号：２６ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ７６ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ８０ Ｓ−３−（ｔ
ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓ
ｔｅｉｎｅ配列： Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｘａａ Ａｓｎ Ｉｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｘａａ Ｓｅｒ ６６
７０
７５ ８０配列
番号：２７ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｎ末端フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ６ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）
ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｘａａ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｌｙ
ｓ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｙ １
５
１０ １５Ｌｅ
ｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ
２０
２５配列番号：２８ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ３０ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ４８ ｕｎｋｎｏｗ
ｎ 配列： Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｘａａ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ ２８
３２
３７ ４２Ａｓ
ｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｘａａ
４７ 配列番号：２９ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： 中間部フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： ６４ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ
）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ７６ Ｓ−３−（ｔ
ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓ
ｔｅｉｎｅ８０ ｕｎｋｎｏｗｎ 配列： Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｘａａ Ａｓｎ Ａ
ｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ ６０
６４
６９ ７４Ｘａ
ａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｘａａ
７９ 配列番号：３０ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｃ末端フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： １１５ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉ
ｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ１２７ Ｓ−３−
（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃ
ｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ａｒｇ Ｘａａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖ
ａｌ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌ
ｙ Ｘａａ Ａｒｇ Ｌｅｕ １１４
１１８
１２３ １２８配列
番号：３１ 配列の長さ：２３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型： Ｃ末端フラグメント（卵白可溶性還元リゾチーム）配列
の特徴： １１５ Ｓ−３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉ
ｏ）ｐｒｏｐｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ１２７ Ｓ−３−
（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）ｐｒｏｐｙｌｃ
ｙｓｔｅｉｎｅ配列： Ａｌａ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａ
ｓｎ Ａｒｇ Ｘａａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓ
ｐ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｌａ １０７
１１１
１１６ １２１Ｔｒ
ｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｘａａ Ａｒｇ Ｌｅｕ
１２６
【図１】可溶性還元リゾチームを本酵素で消化した後Ｃ
４逆相ＨＰＬＣにて画分したクロマトグラフィーを示し
た図である。
４逆相ＨＰＬＣにて画分したクロマトグラフィーを示し
た図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 下記の酵素化学的性質：（１）作用：
ペプチド鎖中のＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合
のみを選択特異的に水解する。 （２）基質特異性：ニューロテンシン、β−エンドルフ
ィン、パラサイロイドホルモン（１−３４）、バソアク
ティブインテスティナルペプチド、ペプチドＴ、ボンベ
シン、酸化インシュリンＢ鎖、フィサラミンなるペプチ
ド鎖中のＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合のみを
選択特異的に水解する。 （３）至適ｐＨ：６．０〜７．０ （４）ｐＨ安定性：４．５〜６．５（１ｍＭ ＤＴＴ
を含む緩衝液中で３７℃、６時間処理） （５）至適温度：４５℃付近 （６）温度安定性：１ｍＭ ＤＴＴを含むｐＨ５．０
の緩衝液中で、５５℃、１５分間の加熱で安定。 （７）分子量：２６５５０（ゲルろ過法）を有すること
を特徴とするＬ−アスパラギンのＣ末端側アミド結合の
みを選択特異的に水解するプロテアーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3278887A JP2579567B2 (ja) | 1991-10-01 | 1991-10-01 | プロテアーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3278887A JP2579567B2 (ja) | 1991-10-01 | 1991-10-01 | プロテアーゼ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1297450A Division JPH0773508B2 (ja) | 1989-11-17 | 1989-11-17 | Ｌ―アスパラギンのアミド結合の水解方法及び試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04365480A true JPH04365480A (ja) | 1992-12-17 |
| JP2579567B2 JP2579567B2 (ja) | 1997-02-05 |
Family
ID=17603485
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3278887A Expired - Fee Related JP2579567B2 (ja) | 1991-10-01 | 1991-10-01 | プロテアーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2579567B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1758927A2 (en) * | 2004-01-21 | 2007-03-07 | Unigene Laboratories, Inc. | Amidated parathyroid hormone fragments and uses thereof |
-
1991
- 1991-10-01 JP JP3278887A patent/JP2579567B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1758927A2 (en) * | 2004-01-21 | 2007-03-07 | Unigene Laboratories, Inc. | Amidated parathyroid hormone fragments and uses thereof |
| EP1758927A4 (en) * | 2004-01-21 | 2008-09-17 | Unigene Lab Inc | PARATHYROID HORMONE AMIDE FRAGMENTS AND USES THEREOF |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2579567B2 (ja) | 1997-02-05 |
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