JPS63146788A - ペプチダ−ゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵母特にサツカロマイセス酵母が分泌する新
規なペプチダーゼおよびその製造方法に関する。本発明
のペプチダーゼは、−次構造中、・・・Ｌｅｕ−１ｙｓ
・・・なるアミノ酸配列を有するはプチドのＬｅｕのＣ
末端側を特異的に切断する酵素として有用である。

（従来技術） 近年、遺伝子工学の発達により、各種の高等動物ホルモ
ンなどの微生物的製造が可能になりつつあることとあい
まって、ｍＲＮＡの翻訳生成物であるプレプローはブチ
ビを成熟ペプチドに転換する特異的々プロセッシング酵
素が注目されている。

例えば、酵母においてクリアン（Ｋｕｒｊａｎ）　Ｊ、
ら（Ｃｅ１１３０９３３−９４３　（１９８２））及び
ジュリウス（Ｊｕｌｉｕａ）　Ｄ、ら（Ｃｅ１１３２８
３９−８５２（１９８３））は、前駆体ポリはプチト９
をプロセッシングして酵母のα−メイテイングファクタ
ー（以下、α−ＭＦ’と略す）を生成せしめる膜結合ジ
ペプチジルアミノペプチダーゼを報告している。この酵
素は、−Ｇｌｕ　−Ａｌａ−反復配列のＡｌａのカルボ
キシル側を切断する。また、Ｊｕｌｉｕｓ　Ｄ、うば、
　プレプロα−ＭＦ’のプロセッシング酵素として、膜
結合二ンドベブチグーゼとそれをコードする遺伝子の構
造を報告している（Ｃｅｌｌ　３７１０７５−１０８９
（１９８４））。

この酵素は、Ｌｙｓ　−Ａｒｇ間の結合を切断する。さ
らに松属らは、酵母のプロホルモンの活性化酵２として
、菌体内酵素フオルセシン（Ｐｈｏｒｃｅ日１ｎ）Ｙ−
１を報告している。（Ｎａｔｕｒｓ　（Ｌｏｎｄｏｎ）
　３０９（５９６８）　５５８−６０　（１９８４）お
よび特開昭６０−２１７８９４　）。その作用機作は、
Ａｒｇ−Ａｒｇ結合やＡｒｇ　−Ｌ７Ｂ結合の間を特異
的に切断する。この他に、酵母の生産するペプチダーゼ
として、カルボキシルにブチダーゼＹ、プロティナーゼ
Ａ、プロティナーゼＢ、アミノペプチダーゼ、カルボキ
シルイブチダーゼＳが知られている（Ｈ，ホルンアー（
Ｈｏｌｚｅｒ）、　Ｈ，べｙ　ツ（Ｂｅｔｚ）およびＥ
、　エプナー（Ｅｂｎｅｒ）：　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、
　Ｃｅ１１．　Ｒｅｇｕｌ、＋　ｃ＋。

１０３−１５６（１９７５））。

一方、α−ＭＦ’については、次式（Ｉ）；Ｔｒｐ　−
Ｈｉｓ　−Ｔｒｐ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｎ　−Ｌｅｕ　−
Ｌｙｅ　−↑ Ｐｒｏ　−Ｇ１７−　Ｇｌｎ　−Ｐｒｏ　−Ｍｅｔ　−
Ｔｙｒ　　　（１）の−次構造を持つ分子ｉ　１６８４
の２プチドであり、酵母（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）のα型細胞Ｘ　−２１８０１Ｂをバークホルダー培地
で振とう培養することにより得られること、さらに、培
養時間が長くなるにつれて、培地中のα−ＭＦ活性が急
激に低下し、培地中にα−ＭＦ以外の種々のはプチト９
が形成されてくることなどが知られている。田中らは、
長時間の培養で形成されてくる種々のＲプテドを分析し
た結果、α−ＭＦが上式（１）の矢印の部分で切断され
たにプチドをｉｇしたが（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　
８２１６８９−１６９３　（１９７７）　）、その分解
活性はいづれも非常に弱り（２４時間反応させても、α
−ＭＦの生産量数μ９／ｒｔｄの５０係を分解する程度
）、また刷反応も多（、その本体については未だに明確
にされていない。ソーナー（Ｔｈｏｒｎｅｒ）らは、こ
のα−ＭＦ’分解活性の本体を酵母の菌体外に分泌され
るホルモンペプチダーゼと推定している（ノーナー。

Ｊ、、　１９８１．　ｐｈｏｒｅｍｏｎａｘ　ｒｅｇｕ
ｌａｔｉｏｎ　ｏｆｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙａｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。

ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　
ｏｆ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
、　工、　Ｌｉｆｅ　　ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　１ｎｈ８
ｒｉｔａｎｃｅ（Ｊ、ストラザーン（Ｓｔｒａｔｈｅｒ
ｎ　）らＩｌｉ　）、　ｐ　１４３゜コールド°スプリ
ングハーバ−ラボラトリ−。

コールビスフリングハーバー、ニューヨーク）。

しかし、その本体については明確にされていない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、α−ＭＢ’のＬｅｕ　−Ｌｙｓ間結合の分解
活性について、その本体を明らかにし、新規なＬｅｕ　
−Ｌｙｓ結合特異的なペプチダーゼおよびその製造法を
提供するものである。

（問題点解決のための手段） 本発明者らは、酵母菌体を高密度に固定化しく１−２ｇ
湿重菌体／１９ゲル）、培養すると、その培養液のα−
ＭＦ分解活性が、遊離細胞培養液でのα−ＭＦ’分解活
性より、遥かに高いことを見出し、この知見に基づいて
本発明を完成した。

酵素の性質 本発明の酵素の性質は次のとおりである。

（１）作用：ベズチド中にロイシン−リジン（Ｌｅｕ　
−Ｌｙａ　）なるアミノ酸配列が存在する場合、その間
のにプチド結合を加水分解により、特異的に切断する。

（２）基質特異性：例えば次に示す一プチビの矢印で示
した部位を切断する。即ち、分子内（ある↓ Ｌｅｕ　−Ｌｙθ結合のＬｅｕのＣ末端側のみを切断し
、ＬｙｓおよびＬｓｕが他のアミノ酸と結合している場
合は、加水分解しない。

（３）分子量ニジリカゲル系樹脂およびセファクリル系
樹脂を用いた分子ふるいクロマトグラフィーにより測定
した活性のある型での推定分子量は、各々約ｌＯ万と約
７５万であり、５ＤＳ−ＰＡ（Ｊでは約５５キロダルト
ンおよび約６３キロダルトンのサブユニットから構成さ
れる。

（４）最適ｐｉ（および安定…範囲：最適声は約４であ
り、３０℃、２４時間処理で−３〜４５の範囲内で安定
である。

（５）作用適温の範囲＝２０℃〜６０℃の範囲で作用し
、最適温度は３５℃〜４２℃である。

（６）各種の阻害剤に対する応答： ■　セリンプロテアーゼ阻害剤であるフエニールメチル
スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）及ヒシイソブロビル
フルオロホスフエー）　（ＤＦＰ）２Ｘ１０Ｍでは阻害
されない。

■　チオールプロテアーゼの阻害剤であるモノヨード酢
酸及びｐ−クロロマーキュリ（ンゾイックアシッド（Ｐ
ＣＭＥ　）により阻害されない。

■　金属キレート剤であるＥＤＴＡでは阻害されない。

■　一般的トリプシン阻害剤であるトシル−Ｌ−リジン
クロロメチルケトン（ＩＯＭ）及びロイハプチノ（１０
Ｍ）　　では阻害され危い。

■　酸性プロテアーゼの阻害剤であるはプスタチン（１
０＝　Ｍ　）では阻害されない。

酵素の製造方法 本発明のペプチダーゼは、サツカロマイセス属の酵母を
固定化担体に高密度に固定化し、２４時間培養した後、
その培養液より精製して得ることができる。

本発明のペプチダーゼの！Ｍ造に使用するサツカロマイ
セス属酵母は、好ましくはα−接合型酵母テするが、本
発明のペプチダーゼを産生ずるものであればよく、例え
ばサツカロマイセス　セレビシｚ　（ＳａｃｃｈａｒＯ
ａｙｃｅｓ　ｃｅｒｓｖｉｓｉａｅ）、具体的には、例
えば−缶体のサツカロマイセス　セレビシェの代表的ｉ
株テアルＸ　２１８０−　Ｉ　Ｂ　株（ＡＴＣＣ２６７
８７）を挙げることができる。

前記酵母を適当な培地を用いて前培養し、得られた菌体
を集菌して担体内に固定化する。使用する培地は、前記
の酵母が成育し、幽該ペプチダーゼを生産するものであ
ればどのようなものでもよい。炭素源としては、例えば
グルコース、デキストリン、糖蜜等を使用することがで
きるが、グルコースの使用が一番好ましい。窒素源とし
ては、例えばイブトン、カザミノ酸等の蛋白質分解物、
肉エキス、酵母エキス、アミノ酸類、アンモニウム塩な
どを使用することが出来るが、アミノ酸、アンモニウム
塩を使用することが好ましい。また、菌の成育を促進す
る目的で、ビタミン類、核酸関係化合物を添加すること
ができる。前培養にあたっては、固体培地を使用するこ
とも出来るが、多量の菌体を得るには液体培地を用いて
通気攪拌培養または振とう培養を行うことが好ましい。

培養温度、培養時間、培地の液性等の条件は、菌体の増
殖が最大になるよう適当に選択、調整されるが、通常は
、好気的条件で３０℃、２４〜３０時間培養するのが好
ましい。上記の方法にて培養した酵母を常法に従い集菌
し、固定化する。

固定化担体としては、高密度に固定化された菌体が成育
できるものであればよ（、に（カッノξ−）−カラギー
ナン、アルギン酸ナトリウム等の天然多糖類、光架橋性
樹脂（ＥＮＴ　１０００〜６０００　）、ポリビニルア
ルコール系樹脂等の合成プレポリマー等があるが、親水
性光架橋性樹脂ＥＮＴ　２０００を使用するのが菌体を
高密度に固定する上で都合がよい。菌体濃度は１９担体
あたり１〜２ｇ湿重菌体とする。菌体濃度が低いと、目
的とする酵素の生産が充分に得られないので注意を要す
る。例えば１９担体あたり２００■の湿重菌体を固定化
したときの酵素の生産量は、上記範囲の菌体を固定した
場合の１７５０以下である。

固定化の方法は常法に従えばよ（、例えば上記親水性光
架橋性樹脂を用いる場合、光架橋性プレポリマー１９に
対し重合促進剤、例えばインジインエチルエーテル２■
を加え、これを菌体と混合し、近紫外線（３００〜４０
０ｗｍ）を照射することにより、固体化菌体を作成でき
る。

このようにして固定化した酵母を前記の培地、好ましく
はパークホルダー合成培地にて２４時間培養することに
より酵素を生産させ、固定化菌体の外に分泌させる。本
発明の酵素は固定化担体の外に漏出されるため、培養液
中に得ることができろ。

得られた培養液からの酵素の精製は、通常用いられてい
る方法を適当に組み合わせて行う。例えば培養液を遠心
分離またはろ過することにより、不溶物を除去し、この
液を限外ろ過により濃縮した後、水または緩衝液に対し
て透析する。次にＤＥＡＥ−セルロースまたはＤＥＡＥ
−セファデックスよりなる吸着樹脂、例えばＤ　Ｅ　Ａ
　Ｅ　−５ｅｐｈａ−ｃｅｌ等を用いてカラムクロマト
グラフィーによる分別を行い、０．１〜０．６Ｍ、好ま
しくは０．２Ｍ塩化ナトリウムにて溶出される区分を集
める。この区分を分子ふるいクロマトグラフィーにかけ
、高分子（約１０万もしくは約７５万）の区分を集める
と本発明のにブチダーゼを得ることができる。この溶出
液を必要により脱塩し、そのまま使用してもよ（、減圧
乾燥、凍結乾燥等で常法により乾燥品とすることも出来
る。

酵素活性の測定 本発明のペプチダーゼの活性は、合成したα−Ｍ　Ｆ　
（Ｔｒｐ　−Ｈｉｓ　−Ｔｒｐ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｎ　
−Ｌｅｕ　−ＬｙｓＰｒｏ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｎ　−Ｐ
ｒｏ　−Ｍｅｔ　−Ｔｙｒ　）を基質として酵素反応さ
せ、−Ｌｅｕ　−Ｌｙｅ−結合間の切断に伴って生じる
Ｔｒｐ　−Ｈｉｓ　−Ｔｒｐ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｎ　−
Ｌｅｕはプチト’（１−６−Ｅ’ブチドと呼ぶ）の量を
測定することにより求める。例えば、１．０ナノモル（
１，６μｇ）の化学合成したα−ＭＦを基質として含有
する０、０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）　０．４罰に
被検酵素液１０μｌを加え、３０℃、２４時間反応せし
め、この間に生成した分解物（Ｔｒｐ　−Ｈｉｓ　−Ｔ
ｒｐ　−Ｌａｕ　−Ｇｌｎ−ＬθＵ）の量を高速液体ク
ロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略す）Ｋより定量す
る。

ＨＰＬＣは例えば次の条件で行５ことができる。

カラム二μボンダパックＣ工、（日本ウォーターズ）溶
出液二Ａ液＝５チアセトニトリル含有５０−リン酸緩衝
液　−２０ Ｂ液＝　６０　％アセトニトリル含有５０ｍＭリン酸緩
衝液　ｐＨ２，０ 溶出法：流速１．５Ｍ分でＡ液１００ｑ６からＢ液１０
０４へ３０分間の直線グラジェント法で溶出する。

検　出：２８０ｎｍおよび２１４ｙ＋ｗ。

実施例１　　酵素の生産・精製と分子量の推定（ん　酵
母Ｓ、　ｃｏｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｘ　２１８０−　Ｉ　
Ｂをパークホルダー培地にて、３０℃、２８時間振とう
培養し、３０００　ｒｐｔｎ＋　１０分間遠心分離して
、湿菌体を得た。この菌体１．５ｇを、親水性光架橋性
プレポリマーＥＮＴ　２０００　（関西はインド社ｇ）
ｔｇ、重合促進剤インジインエチルエーテル２■と混合
し、近紫外線（３００〜４００ｓｙａ）を照射すること
により重合させ、固定化菌体を作成した。この固定化菌
体をパークホルダー培地にて３０℃、２４時間培養した
。、この培養液のα−ＭＦ’分解活性は１．５μ９α−
ＭＦ／１ＩＬｌ／２４時間であった。この培養液４００
ｄを２．２μ濯のミリポアフィルタ−で無菌的に濾過し
、更Ｋ、限外濾過膜ＰＵ−１０（アミコン社製）を用い
て濃縮した。濾過速度は、４３簡径のフィルターで約２
５ｍ／／３０分、６０Ｗフイルターで約父ｍｌ／３０分
で行なった。

不透過区分を更に七ロファンチェープを用いて水に対し
て透析した。この透析内液を１０．００Ｏｒｐｍ。

１０分間遠心分離後、凍結乾燥して白色粉末状の粗生成
物を得た。尚、この粉末の酵素活性は、少な（とも３ケ
月間安定であり、又、水溶液とした酵素活性も同様に安
定であった。

上記で得た粉末を１０ｍＭ　）　＋）スー塩酸バッファ
ー（ｐ）ｔ＆２）４−に溶解し、その３．５ｄを、ＤＩ
ＡｉＳｅｐｈａｃθ１　（ファルマシア製）を用いたカ
ラムクロマトグラフ４−（０，５Ｘ　２．０ｃ１ｎ）　
Ｋかけ、０．２゜０．４，０．６，０．８，１．０Ｍの
各濃度のＮａ　Ｃ１を含有する１０毒Ｍトリスー塩酸バ
ッファー（ｐＨ８，２）　　で段階的に溶出した（流速
１ｉｕ／１５分）。結果を第１図に示す。第１図の０．
２Ｍ　ＮａＣｌ溶出画分をペプチダーゼ活性部分として
回収した。

次に、当該酵素の分子量をシリカゲル系樹脂であルＴｓ
Ｋ−Ｇｅｘ　Ｇ３０００ＳＷ　（東洋曹達社製）を用い
た分子ふるいクロマトグラフィー（０，７５Ｘω鋼）に
より測定した。即ち、上記で得たＤＥＡＥ−３ｅｐｈａ
ｃｅｌにて精製した０、２Ｍ　ＮａＣｌ溶出画分０．１
ｍ／ヲ、０．１Ｍ　　リン酸カリウムバッファー（０，
２ＭＮａＣｌを含む、ｐＨ７，０）で溶出した（流速０
．７ｍＶ分、２８０　ｎｍ　Ｏ，１００Ｄ　）。その結
果、保持時間２１．２１分のところに本発明の酵素活性
のピークが得られ、分子量公知の標準蛋白質の溶出パタ
ーン（保持時間）との比較から活性のある型での分子量
は約１０万と推定された（第２図）。

（Ｂ）　　上記実施例１−（八に記載と同様な培養法と
濃縮法とによって得たペプチダーゼ濃縮液を、実施例１
−（Ａ）と同様にＤＥＡＥ　−５ｅｐｈａｃｅｌカラＡ
Ｋかげ、０．２　Ｍ　ＮａＣｌで溶出される画分を回収
する実験を５回繰返した。

次に、このよ５ＫＬ、て得た画分について、セファクリ
ル糸樹脂である５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　５００　　（
ファルマシア社製）を用いた分子ふるいクロマトグラフ
ィー（１ｘ　４５ｃｍ）による分子量の測定を行った。

即ち、上で得た活性画分０．１ｍｊを０．１Ｍ酢酢酸浴
溶液ＰＨ６０）　　で溶出した（流速０．１５１分）。

その結果、保持容１３０ｄのところで本酵素の活性ピー
クが得られ、分子量公知の蛋白質の溶出ノ（ターンの比
較から、本酵素の活性のある型での分子量は約７５万と
推定された（第３図）。

なお、実施例１−（Ａ）で推定された分子量と大きく異
なるのは、測定法（分子ふるいカラム）のちがいによる
ものであり、精製された酵素は本質的に同一なものであ
る。シリカゲルカラムの吸着性により分子量が小さくで
たものと思われる。

次に、本酵素のサブユニット構造について、ＳＤＳポリ
アクリル゛アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　）
を用いて解析した。サンプルとしては、上記の５ｅｐｈ
ａｃｒｙｌ　Ｓ−５００カラムにて分別して得た両分を
、透析・脱塩改、凍結乾燥したものを用いた。凍結乾燥
標品を、５ＤＳ２．３係含有６０ｆｒＬＭトリス塩酸緩
衝溶液（ｐＨ６，８）Ｋ溶解後、１３．６チボリアクリ
ルアミビゲル（１６Ｘ　１８ｍＸ　Ｏ，７５鵡）による
５ＤＳ−ＰＡＧＥを行い（電流値４０ｍＡ、　３時間泳
動）、生じる蛋白のバンドをクマシーブリリアントプル
ーＲ２５０で染色した。その結果、分子量公知の蛋白質
の泳動との比較から、本酵素は約５５キロダルトンと約
６３キロダルトンのサブユニットから構成される蛋白質
であると判断された（第４図）。

実施例２　　　＃素の性質 （１）作用最適温度 ＤＥＡＥ　−５ｅｐｈａｃｅｌ−にて精製した０、２Ｍ
　ＮａＣＪ溶出画分１０μノについて、化学合成α−Ｍ
Ｆ　　１．５μ９を基質として、００５Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＩ（４，０）中２０℃〜５０℃の各温度で作用速度を
測定した。

その結果３５〜４２℃が最適であった（第５図）。

（２）　　作用最適− ＤＥＡＥ　−５ｅｐｈａｃｅｌにて精製した０、２Ｍ　
Ｎａ（Ｊ溶出画分１０μｌについて、化学合成α−ＭＦ
　　１．５μｓを基質とし、３０℃でｐＨ２〜８の各０
．０５Ｍ酢酸緩衝液およびリン酸緩衝液中で作用速度を
測定した。その結果、ｐＨ３〜４．５が最適であった（
第６図）。

（３）酵素の基質特異性 酵素の基質特異性はＤＥＡＥ　−５ｅｐｈａｃｅｌクロ
マト０．２Ｍ溶出区分を使用し、０．０５Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４，０）にて３０℃、２４時間反応させＨＰＬＣ
にて基質分解率を調べることにより分析した。基質とし
て１、分子の中央部にＬｅｕ　−Ｌ７θ結合を持つもの ２　分子内部ｉｃ　Ｌｙｓ　−Ｘ、又は、Ｘ−Ｌｙｓノ
結合を持つもの ３、分子内部にＬｅｕ−Ｘ、又は、Ｘ　−Ｌｅｕの結合
を持つもの として各々表１に示すはプチドを用いた。（上記Ｘは２
．の場合Ｌｅｕ以外のアミノ酸を示し、３．の場合Ｌｙ
ｓ以外のアミノ酸を示す。）結果を表２に示す。この結
果によれば、分子内部にＬｅｕ　−Ｌｙｓ結合をもつ、
上記１．に含まれるペプチドのみが分解され、本発明の
酵素がＬｅｕ　−Ｌ７Ｅ！結合に特異的であることが示
された。

表１　酵素の反応特異性試験用ペプチド１、Ｃ１−Ｍ　
Ｆ　　　　Ｔｒｐ　−Ｈｉｓ　−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｎ　−Ｌｅｕ（侶１１６８４．０）　−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
　−０１７−０１ｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ ダイノルフイｙ　Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｓ−Ｌ
ｓｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ケ罎２１４７．５）　−工ｘｅ
−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｅ　−Ｌｅｕ−４−Ｔｒｐ−Ａ
ｓｐ−Ａｓｎ−Ｇ１ｎ ２、＝ニーｏテンシンｐＧ１ｕ−Ｌｓｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（分子量１６７２．９）　−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−工１ｅ−Ｌｅｕ。

タフトシフ　　　Ｔｈｒ−Ｌｙ、ｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（
分子量５００．６） ３、　β−エントリレフイｙ　Ｔｙｒ−Ｇ１７−Ｇ’１
７−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ（分子量１８５９．１）　
−３ｅｒ　−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ
　−Ｐｒｏ−し場−ｖａｌ−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕα−ハン
プ　　Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−８ｅｒ−８ｅ
ｒ（カＩし０８０．５）　−Ｃｙｓ　−Ｐｈｓ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−工１ｅ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−８ｏｒ−Ｇ１ｙ７Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙ
ｒスルチトロピン（ＣＲＦ）Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｘｕ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−工１ｅ　−（分子量４７５７．５　）
　５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−
Ｈｌ　ｓ−レｂｕ−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−Ｇｌｕ−Ｖａ
ｌ−レｐｕ−Ｇ１ｕ−Ｍｅｔ−Ａ１ａ−Ａｒｇ−Ａｌａ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−
Ａｌａ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｙ！３−
Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−１１ｅ−１１ｓ−ＮＨ。

オキシトシンＣｙｓ　−Ｔｙｒ−工１ｅ　−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｎ　−（分子ｔｌＯ０７，５）　Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（５）各種の阻害剤に対する応答 実施例２−（４）に記載の精製酵素を使用して化学合成
したα−ＭＦ’　　１．５μ９を基質とし、０．０５Ｍ
酢酸緩衝液（［）Ｈ４，０）中で種々の阻害剤の酵素活
性に対する影響を調べた。使用した阻害剤とその濃度、
阻害の有無を表３に示した。その結果、本発明のハツチ
ダーゼは、用いた各阻害剤によってはいずれも阻害され
なかった。結果を表３に示す。

表　３．　　　酵素活性に及ぼす ＊　−は阻害されないことを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明の酵素を含む粗精製液の、Ｄ　Ｅ　Ａ
　Ｅ　−５ｅｐｈａｃｅｌ　を用いたカラムクロマトグ
ラフィーにおける溶出Ｈ過を示すグラフである。 第２図および第３図は各々本発明の酵素の、ＴＳＫ−Ｇ
ｏｌ　Ｇ３０００ＳＷ、　オＪ：び５ｅｐｈａｃｒｙ１
８５００分子ふるいを用いた高速液体クロマトグラフィ
ーにおける分子量測定の結果を示すグラフである。 第４図は、本酵素のＳＤＳ、ＰＡＧＥの結果を示す。 第５図は、本発明の酵素の温度特性を示すグラフである
。 第６図は、本発明の酵素の田特性を示すグラフである。 特許出願人　サントリー株式会社 （外５名） 纂４　に

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の性質： ［１］ペプチド鎖中に存在する・・・Ｌｅｕ−Ｌｙｓ・
   ・・なるアミノ酸配列のＬｅｕのＣ末端側を特異的に切
   断する、 ［２］ＤＥＡＥセルロースまたはＤＥＡＥデキストラン
   に吸着され、０．１〜０．６Ｍ　ＮａＣｌで溶出される
   、 ［３］シリカゲル系樹脂を用いた分子ふるいクロマトグ
   ラフィーによる推定分子量が約１０万であり、セフアク
   リル系樹脂を用いた分子ふるいクロマトグラフィーによ
   る推定分子量が約７５万である、 ［４］ＳＤＳ・ＰＡＧＥでは、約５５キロダルトンと約
   ６３キロダルトンのサブユニットで構成される、［５］
   作用最適ｐＨが３〜４．５である。 ［６］作用最適温度が３５℃〜４２℃である、［７］２
   ×１０＾−＾４モル濃度のモノヨード酢酸、フエニルメ
   チルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ｐ−クロロ−
   マーキュリーベンゾイックアシッド（ＰＣＭＢ）、ジイ
   ソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、１×１０
   ＾−＾３モル濃度のトシル−Ｌ−リジンクロロメチルケ
   トン（ＴＬＣＫ）、ＥＤＴＡ、１×１０＾−＾４モル濃
   度のロイペプチン及び１×１０＾−＾５モル濃度のペプ
   スタチンで酵素活性が阻害されない、 を有することを特徴とする、酵母から分泌されるペプチ
   ダーゼ。
2. （２）酵母のα−ファクターであるＴｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔ
   ｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
   ｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒに作用して、Ｔｒ
   ｐ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＬｅｕおよびＬ
   ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ一Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙ
   ｒを与える特許請求の範囲第１項記載のペプチダーゼ。
3. （３）酵母がサッカロマイセス酵母である特許請求の範
   囲第１項記載のペプチダーゼ。
4. （４）サッカロマイセス酵母を固定化担体に高密度で固
   定化して培養し、該培養上清から、ペプチダーゼを回収
   することからなる、次の性質：［１］ペプチド鎖中に存
   在する・・・Ｌｅｕ−Ｌｙｅ・・・なるアミノ酸配列の
   ＬｅｕのＣ末端側を特異的に切断する、 ［２］ＤＥＡＥセルロースまたはＤＥＡＥデキストラン
   に吸着され、０．１〜０．６Ｍ　ＮａＣｌで溶出される
   、 ［３］シリカゲル系樹脂を用いた分子ふるいクロマトグ
   ラフィーによる推定分子量が約１０万であり、セフアク
   リル系樹脂を用いた分子ふるいクロマトグラフィーによ
   る推定分子量が約７５万である、 ［４］ＳＤＳ・ＰＡＧＥでは約５５キロダルトンと約６
   ３キロダルトンのサブユニットで構成される、［５］作
   用最適ｐＨが３〜４．５である、 ［６］作用最適温度が３５℃〜４２℃である、［７］２
   ×１０＾−＾４モル濃度のモノヨード酢酸、フエニルメ
   チルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、Ｐ−クロロー
   マーキュリーベンゾイックアシッド（ＰＣＭＢ）、ジイ
   ソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、１×１０
   ＾−＾３モル濃度のトシル−Ｌ−リジンクロロメチルケ
   トン（ＴＬＣＫ）、ＥＤＴＡ、１×１０＾−＾４モル濃
   度のロイペプチン及び１×１０＾−＾５モル濃度のペプ
   スタチンで酵素活性が阻害されない、 を有することを特徴とする、酵母から分泌されるペプチ
   ダーゼの製造方法。
5. （５）固定化担体が親水性光架橋性樹脂である特許請求
   の範囲第４項記載の方法。
6. （６）酵母を固定化担体１９について１〜２９の密度で
   固定化する特許請求の範囲第４項記載の方法。
7. （７）培養上清からＤＥＡＥセルロースまたはデキスト
   ラン担体および分子ふるい担体を用いて精製する、特許
   請求の範囲第４項記載の方法。