JPH0576381A - ポリペプチド合成方法 - Google Patents
ポリペプチド合成方法Info
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- JPH0576381A JPH0576381A JP23929791A JP23929791A JPH0576381A JP H0576381 A JPH0576381 A JP H0576381A JP 23929791 A JP23929791 A JP 23929791A JP 23929791 A JP23929791 A JP 23929791A JP H0576381 A JPH0576381 A JP H0576381A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は最終生産物と共に得られるＡＭＰ，Ｇ
ＤＰ及びピロリン酸を用いてＡＴＰ，ＧＴＰを自動的に
再生することにより操作性を向上させ、実用化に適した
無細胞蛋白質合成系を用いたポリペプチド合成方法を提
供する。 【構成】無細胞蛋白質合成系反応部１，基質溶液混合添
加部２，混合撹拌モータ３，添加用基質溶液保持部４，
基質溶液添加用電磁弁５，混合基質溶液添加用電磁弁
６，再生基質溶液添加用電磁弁７，ポンプ８，ポリペプ
チド捕集部９，再生基質反応部１０，制御装置（ＣＰ
Ｕ）１１，流路１２から構成する。 【効果】本発明により、操作性が向上して実用化が図ら
れると共に、ランニングコストが低減される。
ＤＰ及びピロリン酸を用いてＡＴＰ，ＧＴＰを自動的に
再生することにより操作性を向上させ、実用化に適した
無細胞蛋白質合成系を用いたポリペプチド合成方法を提
供する。 【構成】無細胞蛋白質合成系反応部１，基質溶液混合添
加部２，混合撹拌モータ３，添加用基質溶液保持部４，
基質溶液添加用電磁弁５，混合基質溶液添加用電磁弁
６，再生基質溶液添加用電磁弁７，ポンプ８，ポリペプ
チド捕集部９，再生基質反応部１０，制御装置（ＣＰ
Ｕ）１１，流路１２から構成する。 【効果】本発明により、操作性が向上して実用化が図ら
れると共に、ランニングコストが低減される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分子生物学及び生物工
学において、無細胞蛋白合成系（無細胞翻訳系，cell-f
ree translation system）によるポリペプチドを製造す
る方法に関する。
学において、無細胞蛋白合成系（無細胞翻訳系，cell-f
ree translation system）によるポリペプチドを製造す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の無細胞蛋白合成系を用いたポリペ
プチド合成方法は、特開平1−503119号公報に記載のよ
うに、ＡＴＰ，ＧＴＰ及びアミノ酸を基質として含んで
いるリボソームの無細胞蛋白質合成系において、最終生
産物、ＡＭＰ，ＧＤＰ，ピロリン酸塩及び無機リン酸塩
を含んでいる翻訳生産物を、前記系から取り出し、それ
と同時にＡＴＰ，ＧＴＰ及びアミノ酸の形態の基質をそ
れらの初期濃度を維持するために前記系へ追加すること
により達成されていた。
プチド合成方法は、特開平1−503119号公報に記載のよ
うに、ＡＴＰ，ＧＴＰ及びアミノ酸を基質として含んで
いるリボソームの無細胞蛋白質合成系において、最終生
産物、ＡＭＰ，ＧＤＰ，ピロリン酸塩及び無機リン酸塩
を含んでいる翻訳生産物を、前記系から取り出し、それ
と同時にＡＴＰ，ＧＴＰ及びアミノ酸の形態の基質をそ
れらの初期濃度を維持するために前記系へ追加すること
により達成されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記従来技術は、ＡＴ
Ｐ，ＧＴＰ及びアミノ酸という基質を、無細胞蛋白質合
成系を運転中は、常に添加していなければならない。こ
の操作は手間がかかり、実用化には向きにくく、かつ比
較的高価なＡＴＰ，ＧＴＰを常時添加することにより、
ランニングコストが高くなる問題があった。
Ｐ，ＧＴＰ及びアミノ酸という基質を、無細胞蛋白質合
成系を運転中は、常に添加していなければならない。こ
の操作は手間がかかり、実用化には向きにくく、かつ比
較的高価なＡＴＰ，ＧＴＰを常時添加することにより、
ランニングコストが高くなる問題があった。
【０００４】そこで、本発明は最終生産物と共に得られ
るＡＭＰ，ＧＤＰ及びピロリン酸を用いてＡＴＰ，ＧＴ
Ｐを自動的に再生することにより操作性を向上すること
を目的としており、さらにランニングコストの比較的低
い、実用化に適した無細胞蛋白合成系を用いたポリペプ
チド合成方法を提供することを目的とする。
るＡＭＰ，ＧＤＰ及びピロリン酸を用いてＡＴＰ，ＧＴ
Ｐを自動的に再生することにより操作性を向上すること
を目的としており、さらにランニングコストの比較的低
い、実用化に適した無細胞蛋白合成系を用いたポリペプ
チド合成方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、最終生産物、ＡＭＰ，ＧＤＰ，ピロリン酸塩及び無
機リン酸塩を含んでいる翻訳生産物を無細胞蛋白合成系
から取り出した後、酵素反応によってＡＭＰ及びＧＤＰ
とピロリン酸から、ＡＴＰ及びＧＴＰを生成する再生反
応部と、再生した基質溶液をアミノ酸溶液と混合し、無
細胞蛋白合成系にその基質溶液を添加する混合添加部
と、添加及び混合する無細胞蛋白合成系内の全ての基質
溶液濃度が、常に一定になるように制御するＣＰＵを設
けることにしたものである。
に、最終生産物、ＡＭＰ，ＧＤＰ，ピロリン酸塩及び無
機リン酸塩を含んでいる翻訳生産物を無細胞蛋白合成系
から取り出した後、酵素反応によってＡＭＰ及びＧＤＰ
とピロリン酸から、ＡＴＰ及びＧＴＰを生成する再生反
応部と、再生した基質溶液をアミノ酸溶液と混合し、無
細胞蛋白合成系にその基質溶液を添加する混合添加部
と、添加及び混合する無細胞蛋白合成系内の全ての基質
溶液濃度が、常に一定になるように制御するＣＰＵを設
けることにしたものである。
【０００６】
【作用】リボソームとｔＲＮＡと蛋白質合成に必要な各
種の因子及び翻訳の鋳型であるｍＲＮＡを含む無細胞蛋
白合成系は、混合添加部から添加された基質溶液により
ポリペプチドの合成をおこなうが、この中は一定速度で
基質溶液が流れており、連続的にポリペプチド捕集部に
翻訳生産物が流出する。この時、上記翻訳生産物以外は
半透膜に包まれており流失せず、連続使用される。流出
した翻訳生産物は、ポリペプチド捕集部で最終生産物で
あるポリペプチドが取り除かれた後、ピルビン酸キナー
ゼ（この場合、再生反応部の基質としてＰＥＰ（フォス
フォエノールピルビン酸）が必要で、基質溶液中にアミ
ノ酸と共に含む。）などのヌクレオシド三リン酸合成酵
素系（半透膜に包まれており反応部から流失しない。）
により、ＡＴＰ及びＧＴＰがＡＭＰ，ＧＤＰとピロリン
酸（Ｐ）から生成される。次に、無細胞蛋白合成系に混
合添加部から添加される基質溶液が、無細胞蛋白合成系
内で一定濃度になるように、ＣＰＵの制御により電磁弁
等の調節機構の調節を行い、再生されたＡＴＰ及びＧＴ
Ｐ溶液がアミノ酸溶液（無細胞蛋白合成系内での濃度よ
りも、ＡＴＰ・ＧＴＰ溶液と混合希釈される分高くなっ
ている。）と混合添加部にて混合され、無細胞蛋白合成
系内に基質溶液として一定速度で落差方式あるいは、ポ
ンプにより添加される。この一連の動作がＣＰＵの制御
により連続的に繰り返され、上記目的が達成される。
種の因子及び翻訳の鋳型であるｍＲＮＡを含む無細胞蛋
白合成系は、混合添加部から添加された基質溶液により
ポリペプチドの合成をおこなうが、この中は一定速度で
基質溶液が流れており、連続的にポリペプチド捕集部に
翻訳生産物が流出する。この時、上記翻訳生産物以外は
半透膜に包まれており流失せず、連続使用される。流出
した翻訳生産物は、ポリペプチド捕集部で最終生産物で
あるポリペプチドが取り除かれた後、ピルビン酸キナー
ゼ（この場合、再生反応部の基質としてＰＥＰ（フォス
フォエノールピルビン酸）が必要で、基質溶液中にアミ
ノ酸と共に含む。）などのヌクレオシド三リン酸合成酵
素系（半透膜に包まれており反応部から流失しない。）
により、ＡＴＰ及びＧＴＰがＡＭＰ，ＧＤＰとピロリン
酸（Ｐ）から生成される。次に、無細胞蛋白合成系に混
合添加部から添加される基質溶液が、無細胞蛋白合成系
内で一定濃度になるように、ＣＰＵの制御により電磁弁
等の調節機構の調節を行い、再生されたＡＴＰ及びＧＴ
Ｐ溶液がアミノ酸溶液（無細胞蛋白合成系内での濃度よ
りも、ＡＴＰ・ＧＴＰ溶液と混合希釈される分高くなっ
ている。）と混合添加部にて混合され、無細胞蛋白合成
系内に基質溶液として一定速度で落差方式あるいは、ポ
ンプにより添加される。この一連の動作がＣＰＵの制御
により連続的に繰り返され、上記目的が達成される。
【０００７】
【実施例】以下、本発明の一実施例を図１により説明す
る。本発明は、図１に示すように、無細胞蛋白質合成系
反応部１，基質溶液混合添加部２，混合撹拌モータ３，
添加用基質溶液保持部４，基質溶液添加用電磁弁５，混
合基質溶液添加用電磁弁６，再生基質溶液添加用電磁弁
７，ポンプ８，ポリペプチド捕集部９，再生基質反応部
１０，制御装置（ＣＰＵ）１１，流路１２からシステム
構成されており、ＣＰＵ１１を除く各構成要素は流路１
２で結合されている。
る。本発明は、図１に示すように、無細胞蛋白質合成系
反応部１，基質溶液混合添加部２，混合撹拌モータ３，
添加用基質溶液保持部４，基質溶液添加用電磁弁５，混
合基質溶液添加用電磁弁６，再生基質溶液添加用電磁弁
７，ポンプ８，ポリペプチド捕集部９，再生基質反応部
１０，制御装置（ＣＰＵ）１１，流路１２からシステム
構成されており、ＣＰＵ１１を除く各構成要素は流路１
２で結合されている。
【０００８】まず、無細胞蛋白質合成系反応部１は半透
膜と外套のカラムから成り、半透膜中に１２mＭ２−メ
ルカプトエタノール−９０mＭＮＨ4ＣＬ−１０mＭＭｇ
ＣＬ2−１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ＰＨ７.４）及び、
０.６ｎmol／ｍｌの大腸菌７０Ｓリボソーム，１ｍｇ／
ｍｌのＳ１００画分，０.６ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ，０.
０６ｎmol／ｍｌのファージＴ4 蛋白質のｍＲＮＡ，５
μｇ／ｍｌのヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、
０.１μｇ／ｍｌ プロテアーゼインヒビター（ロイペプ
チン）が入っている。また、本システム運転開始時に
は、基質溶液混合添加部２に１２ｍＭ２−メルカプトエ
タノール−９０ｍＭＮＨ4ＣＬ−１０ｍＭＭｇＣＬ2−１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ＰＨ７.４）及び３０μＭの
２０種類アミノ酸と５ｍＭフォスフォエノールピルビン
酸が保持されている。さらに、添加用基質溶液保持部４
には、１２ｍＭ２−メルカプトエタノール−９０ｍＭＮ
Ｈ4ＣＬ−１０ｍＭＭｇＣＬ2−１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ＰＨ７.４）及び３００μＭの２０種類アミノ酸と
５ｍＭフォスフォエノールピルビン酸（ＰＥＰ）が保持
されている。
膜と外套のカラムから成り、半透膜中に１２mＭ２−メ
ルカプトエタノール−９０mＭＮＨ4ＣＬ−１０mＭＭｇ
ＣＬ2−１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ＰＨ７.４）及び、
０.６ｎmol／ｍｌの大腸菌７０Ｓリボソーム，１ｍｇ／
ｍｌのＳ１００画分，０.６ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ，０.
０６ｎmol／ｍｌのファージＴ4 蛋白質のｍＲＮＡ，５
μｇ／ｍｌのヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、
０.１μｇ／ｍｌ プロテアーゼインヒビター（ロイペプ
チン）が入っている。また、本システム運転開始時に
は、基質溶液混合添加部２に１２ｍＭ２−メルカプトエ
タノール−９０ｍＭＮＨ4ＣＬ−１０ｍＭＭｇＣＬ2−１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ＰＨ７.４）及び３０μＭの
２０種類アミノ酸と５ｍＭフォスフォエノールピルビン
酸が保持されている。さらに、添加用基質溶液保持部４
には、１２ｍＭ２−メルカプトエタノール−９０ｍＭＮ
Ｈ4ＣＬ−１０ｍＭＭｇＣＬ2−１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ＰＨ７.４）及び３００μＭの２０種類アミノ酸と
５ｍＭフォスフォエノールピルビン酸（ＰＥＰ）が保持
されている。
【０００９】運転を開始するとＣＰＵ１１が混合撹拌モ
ータ３を回転させる。混合撹拌モータ３は運転停止の信
号がＣＰＵ１１から与えられるまで回転を続ける。次
に、混合基質溶液添加用電磁弁６がＣＰＵ１１の制御に
より、一定タイミングで開閉を繰り返す。流路１２を通
って基質溶液が無細胞蛋白質合成系反応部１に導入さ
れ、短時間でその半透膜の内外の基質（アミノ酸）濃度
が一定となる。この時すでにポリペプチド合成が開始さ
れている。また、以後、この基質（アミノ酸）濃度を一
定に保つように基質溶液添加用電磁弁５，混合基質溶液
添加用電磁弁６，再生基質溶液添加用電磁弁７の開閉及
びポンプ８の動作をＣＰＵ１１が制御することになる。
一定速度で基質溶液が無細胞蛋白質合成系反応部１に導
入されるため、半透膜を透過したポリペプチドを含んだ
基質溶液（アミノ酸及びＡＴＰ，GTPは消費されてい
る。）がポリペプチド捕集部９に流れる。ポリペプチド
捕集部９は、最終生産物であるＴ4 ファージ蛋白質に対
する免疫吸着剤が充填されたカラムで、ポリペプチドは
この免疫吸着剤に吸着されるため、このカラムから流出
する基質溶液にはポリペプチドは含まれない。この後、
再生基質反応部１０に基質溶液がポンプ８を経て導入さ
れる。再生基質反応部１０は、半透膜と外套のカラムか
ら成り、半透膜の中には１０μｇ／ｍｌピルビン酸キナ
ーゼ（ＰＫ）及びヌクレオシドフォスフォキナーゼ（Ｎ
ＰＫ）が基質溶液と同じ組成の緩衝液と共に保持されて
いる。この半透膜の中で化１及び化２に示す反応が起き
て、ＡＴＰ，ＧＴＰが再生される。次に、再生されたＡ
ＴＰ，ＧＴＰを含む基質溶液は、流路１２を通って基質
溶液混合添加部２にＣＰＵ１１の制御により再生基質溶
液添加用電磁弁７が調節され、一定速度で添加される。
そこで、この添加混合による基質溶液混合添加部２のア
ミノ酸の濃度が低下することを防ぐために、添加用基質
溶液保持部４から比較的高濃度のアミノ酸を含む基質溶
液を、ＣＰＵ１１の制御により基質溶液添加用電磁弁５
が調節され、一定速度で基質溶液混合添加部２に添加さ
れる。ここで、無細胞蛋白質合成系反応部１及び基質溶
液混合添加部２の基質溶液濃度が一定になるように、あ
らかじめ、各電磁弁５，６，７とポンプ８のＣＰＵ１１
による制御は、プログラムされているものとする。
ータ３を回転させる。混合撹拌モータ３は運転停止の信
号がＣＰＵ１１から与えられるまで回転を続ける。次
に、混合基質溶液添加用電磁弁６がＣＰＵ１１の制御に
より、一定タイミングで開閉を繰り返す。流路１２を通
って基質溶液が無細胞蛋白質合成系反応部１に導入さ
れ、短時間でその半透膜の内外の基質（アミノ酸）濃度
が一定となる。この時すでにポリペプチド合成が開始さ
れている。また、以後、この基質（アミノ酸）濃度を一
定に保つように基質溶液添加用電磁弁５，混合基質溶液
添加用電磁弁６，再生基質溶液添加用電磁弁７の開閉及
びポンプ８の動作をＣＰＵ１１が制御することになる。
一定速度で基質溶液が無細胞蛋白質合成系反応部１に導
入されるため、半透膜を透過したポリペプチドを含んだ
基質溶液（アミノ酸及びＡＴＰ，GTPは消費されてい
る。）がポリペプチド捕集部９に流れる。ポリペプチド
捕集部９は、最終生産物であるＴ4 ファージ蛋白質に対
する免疫吸着剤が充填されたカラムで、ポリペプチドは
この免疫吸着剤に吸着されるため、このカラムから流出
する基質溶液にはポリペプチドは含まれない。この後、
再生基質反応部１０に基質溶液がポンプ８を経て導入さ
れる。再生基質反応部１０は、半透膜と外套のカラムか
ら成り、半透膜の中には１０μｇ／ｍｌピルビン酸キナ
ーゼ（ＰＫ）及びヌクレオシドフォスフォキナーゼ（Ｎ
ＰＫ）が基質溶液と同じ組成の緩衝液と共に保持されて
いる。この半透膜の中で化１及び化２に示す反応が起き
て、ＡＴＰ，ＧＴＰが再生される。次に、再生されたＡ
ＴＰ，ＧＴＰを含む基質溶液は、流路１２を通って基質
溶液混合添加部２にＣＰＵ１１の制御により再生基質溶
液添加用電磁弁７が調節され、一定速度で添加される。
そこで、この添加混合による基質溶液混合添加部２のア
ミノ酸の濃度が低下することを防ぐために、添加用基質
溶液保持部４から比較的高濃度のアミノ酸を含む基質溶
液を、ＣＰＵ１１の制御により基質溶液添加用電磁弁５
が調節され、一定速度で基質溶液混合添加部２に添加さ
れる。ここで、無細胞蛋白質合成系反応部１及び基質溶
液混合添加部２の基質溶液濃度が一定になるように、あ
らかじめ、各電磁弁５，６，７とポンプ８のＣＰＵ１１
による制御は、プログラムされているものとする。
【００１０】そして、上記の一連の動作が繰り返され、
ポリペプチドが連続的に合成される。最終的に、本シス
テムの停止指示がＣＰＵ１１から実行されると、各電磁
弁５，６，７が閉じられポンプ８が停止する。次に、無
細胞蛋白質合成系反応部１を取り出し、最終生産物（ポ
リペプチド）がカラムから溶出され、脱塩及び生成操作
に移行する。これにより、無細胞蛋白質合成系の実用化
が可能となる。
ポリペプチドが連続的に合成される。最終的に、本シス
テムの停止指示がＣＰＵ１１から実行されると、各電磁
弁５，６，７が閉じられポンプ８が停止する。次に、無
細胞蛋白質合成系反応部１を取り出し、最終生産物（ポ
リペプチド）がカラムから溶出され、脱塩及び生成操作
に移行する。これにより、無細胞蛋白質合成系の実用化
が可能となる。
【００１１】 ＰＥＰ＋ＡＤＰ＋Ｐ −＞ ＡＴＰ＋ピルビン酸 …(化１) ＡＴＰ＋ＧＤＰ −＞ ＧＴＰ＋ＡＤＰ …(化２)
【００１２】
【発明の効果】本発明により、操作性が向上するため、
自動化無細胞蛋白合成系の実用化が可能となり、また、
比較的高価な基質の再生が行えるためランニングコスト
を半減できる。
自動化無細胞蛋白合成系の実用化が可能となり、また、
比較的高価な基質の再生が行えるためランニングコスト
を半減できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例のシステム構成図を示す。
１…無細胞蛋白質合成系反応部、２…基質溶液混合添加
部、９…ポリペプチド捕集部、１０…再生基質反応部、
１１…制御装置（ＣＰＵ）。
部、９…ポリペプチド捕集部、１０…再生基質反応部、
１１…制御装置（ＣＰＵ）。
Claims (1)
- 【請求項１】ＡＴＰ，ＧＴＰ及びアミノ酸を基質として
含むリボソームの無細胞蛋白質合成系において、エネル
ギー中間体として消費されるＡＴＰ及びＧＴＰを自動的
に再生する機能を持つことを特徴とするポリペプチド合
成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23929791A JPH0576381A (ja) | 1991-09-19 | 1991-09-19 | ポリペプチド合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23929791A JPH0576381A (ja) | 1991-09-19 | 1991-09-19 | ポリペプチド合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576381A true JPH0576381A (ja) | 1993-03-30 |
Family
ID=17042640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23929791A Pending JPH0576381A (ja) | 1991-09-19 | 1991-09-19 | ポリペプチド合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0576381A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0652497A3 (en) * | 1993-11-05 | 1996-05-08 | Seiko Instr Inc | Electronic watch. |
| US6783957B1 (en) | 1999-03-25 | 2004-08-31 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for synthesis of polypeptides in cell-free systems |
| WO2005123936A1 (ja) * | 2004-06-15 | 2005-12-29 | Zoegene Corporation | ポリペプチド合成方法 |
| WO2010147111A1 (ja) | 2009-06-15 | 2010-12-23 | トヨタ自動車株式会社 | 無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法 |
-
1991
- 1991-09-19 JP JP23929791A patent/JPH0576381A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0652497A3 (en) * | 1993-11-05 | 1996-05-08 | Seiko Instr Inc | Electronic watch. |
| US6783957B1 (en) | 1999-03-25 | 2004-08-31 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for synthesis of polypeptides in cell-free systems |
| WO2005123936A1 (ja) * | 2004-06-15 | 2005-12-29 | Zoegene Corporation | ポリペプチド合成方法 |
| WO2010147111A1 (ja) | 2009-06-15 | 2010-12-23 | トヨタ自動車株式会社 | 無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法 |
| US9005920B2 (en) | 2009-06-15 | 2015-04-14 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Solution for cell-free protein synthesis, kit for cell-free protein synthesis, and method of protein synthesis |
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