JP2022552271A - 非天然ポリペプチドのインビボ合成のための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

非天然アミノ酸を非天然ポリペプチドに組み込んでいる細胞のための組成物、方法およびキットが、本明細書に開示される。細胞によって合成される非天然ポリペプチドの活性および収量を増加させるための組成物、方法およびキットも本明細書に開示される。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１９年１０月１０日に出願された米国仮出願第６２／９１３，６６４号および２０２０年３月１２日に出願の米国仮出願第６２／９８８，８８２号に対する優先権を主張し、その各々は参照によって完全に本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１０年１０月６日に作成され、「３６２７１－８０９＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称であり、２１キロバイトのサイズである。
連邦政府が後援する研究に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所による助成金番号ＧＭ１１８１７８の米国政府の支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
参照による組入れ
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み入れられることが具体的および個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。参照により組み入れられる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示に矛盾する限り、本明細書は任意のそのような矛盾する材料に取って代わり、および／または優先するものである。
天然の遺伝子コードは、遺伝子アルファベットの４つの文字によって可能になった６４のコドンからなる。３つのコドンが終止コドンとして使用されて、残りは、タンパク質のもととなる２０個のアミノ酸のうちの１つを有する同族のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（本明細書において単にｔＲＮＡシンテターゼとも呼ばれる）によってチャージされる転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）によって認識される６１個のセンスコドンである。正規のアミノ酸は生物の著しい多様性を可能にしているが、それらが提供しない多くの化学的機能および関連する反応性がある。非天然または非正規のアミノ酸（ｎｃＡＡ）を含むように遺伝子コードを拡張する能力は、タンパク質に所望の機能または活性を授け、治療薬開発などのタンパク質の多くの公知のおよび新生の適用を劇的に容易にする可能性がある。非天然アミノ酸を含有する非天然タンパク質または非天然ポリペプチドを合成する現行の方法は限界がある。注目すべきことに、ほとんどの方法は、単一の非天然アミノ酸または１種の非天然アミノ酸の数コピーを非天然ポリペプチドに導入することを可能にするだけである。同じく、今日利用できる方法によって合成される非天然ポリペプチドは、低減された酵素活性、溶解性または収量をしばしば有する。
これらの限界に対処する１つの代わりの解決方法は、無細胞またはインビトロの発現系で非天然ポリペプチドを合成することである。しかし、そのような発現系は、非天然ポリペプチドの酸化還元特性および合成された非天然ポリペプチドの他の翻訳後修飾が完全に実現される翻訳後修飾環境を提供するのに不適当である。したがって、非天然アミノ酸を含有する非天然ポリペプチドのインビボ合成のための組成物および方法の必要性がまだある。
非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質のインビボ合成のための組成物、方法、細胞（非工学操作されたおよび工学操作された）、半合成生物（ＳＳＯ）、試薬、遺伝物質、プラスミドおよびキットが本明細書に記載され、ここで、各非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質は細胞によって解読される２つ以上の非天然アミノ酸を含む。
非天然ポリペプチドを合成するインビボ方法であって：少なくとも４つの非天然塩基対を含む少なくとも１つの非天然デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を提供する工程；少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させて少なくとも２つの非天然コドンを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を与える工程；少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させて少なくとも１つの非天然アンチコドンを各々含む少なくとも２つの転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子を与える工程であって、対応するＤＮＡ中の少なくとも２つの非天然塩基対が、ｍＲＮＡ分子の非天然コドンがｔＲＮＡ分子の各々の非天然アンチコドンに相補的であるような配列コンテキストにある工程；および少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子を利用して非天然ｍＲＮＡ分子を翻訳することによって非天然ポリペプチドを合成する工程であって、各非天然アンチコドンは、非天然ポリペプチドへの非天然アミノ酸の部位特異的組み込みを導く工程を含む方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの非天然塩基対は、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１またはｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１から選択される塩基対を含む。
いくつかの実施形態では、非天然ポリペプチドを合成する方法であって：少なくとも４つの非天然塩基対を含む少なくとも１つの非天然デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を提供する工程であって、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は、（ｉ）少なくとも第１および第２の非天然コドンを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、ならびに（ｉｉ）少なくとも第１および第２の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子をコードし、第１のｔＲＮＡ分子は第１の非天然アンチコドンを含み、第２のｔＲＮＡ分子は第２の非天然アンチコドンを含み、少なくとも１つのＤＮＡ分子中の少なくとも４つの非天然塩基対が、ｍＲＮＡ分子の第１および第２の非天然コドンが第１および第２の非天然アンチコドンにそれぞれ相補的であるような配列コンテキストにある工程；少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させてｍＲＮＡを与える工程；少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させて少なくとも第１および第２のｔＲＮＡ分子を与える工程；ならびに少なくとも第１および第２の非天然ｔＲＮＡ分子を利用して非天然ｍＲＮＡ分子を翻訳することによって非天然ポリペプチドを合成する工程であって、少なくとも第１および第２の非天然アンチコドンの各々は、非天然ポリペプチドへの非天然アミノ酸の部位特異的組み込みを導く工程を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、これらの方法は少なくとも２つの非天然コドンを含み、各々はコドンの第１の位置、第２の位置または第３の位置に配置される第１の非天然ヌクレオチドを含み、場合により、第１の非天然ヌクレオチドはコドンの第２の位置または第３の位置に配置される。いくつかの例において、これらの方法は少なくとも２つの非天然コドンを含み、各々は核酸配列ＮＮＸまたはＮＸＮを含み、非天然アンチコドンは核酸配列ＸＮＮ、ＹＮＮ、ＮＸＮまたはＮＹＮを含むことで、ＮＮＸ－ＸＮＮ、ＮＮＸ－ＹＮＮまたはＮＸＮ－ＮＹＮを含む非天然コドン－アンチコドン対を形成し、ここで、Ｎは任意の天然のヌクレオチドであり、Ｘは第１の非天然ヌクレオチドであり、Ｙは第１の非天然ヌクレオチドと異なる第２の非天然ヌクレオチドであり、Ｘ－ＹはＤＮＡ中で非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成する。
いくつかの実施形態では、非天然ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を容易にするために、ＵＢＰがｍＲＮＡのコドン配列とｔＲＮＡのアンチコドン配列の間で形成される。コドン－アンチコドンＵＢＰは、いくつかの例において、ｍＲＮＡの５’から３’へ読み取られる３つの連続した核酸を含むコドン配列（例えば、ＵＵＸ）、およびｔＲＮＡの５’から３’へ読み取られる３つの連続した核酸を含むアンチコドン配列（例えば、ＹＡＡまたはＸＡＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＵＵＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＹＡＡまたはＸＡＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＵＧＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＹＣＡまたはＸＣＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＣＧＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＹＣＧまたはＸＣＧである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＡＧＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＹＣＵまたはＸＣＵである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＧＡＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＹＵＣまたはＸＵＣである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＣＡＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＹＵＧまたはＸＵＧである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＧＸＵである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＡＹＣである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＣＸＵである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＡＹＧである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＧＸＧである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＣＹＣである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＡＸＧである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＣＹＵである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＧＸＣである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＧＹＣである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＡＸＣである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＧＹＵである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＧＸＡである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＵＹＣである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＣＸＣである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＧＹＧである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＵＸＣである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＧＹＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＡＵＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＹＡＵまたはＸＡＵである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＣＵＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＸＡＧまたはＹＡＧである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＵＵＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＸＡＡまたはＹＡＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＧＵＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＸＡＣまたはＹＡＣである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＵＡＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＸＵＡまたはＹＵＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコドンがＧＧＸである場合、ｔＲＮＡアンチコドンはＸＣＣまたはＹＣＣである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は、本明細書に記載される非天然塩基（例えば、ｄ５ＳＩＣＳ、ｄＮａＭ、ｄＴＰＴ３、ｄＭＴＭＯ、ｄＣＮＭＯ、ｄＴＡＴ１）を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される。例示的なｍＲＮＡコドンは、ＴＴＸ、ＴＧＸ、ＣＧＸ、ＡＧＸ、ＧＡＸ、ＣＡＸ、ＧＸＴ、ＣＸＴ、ＧＸＧ、ＡＸＧ、ＧＸＣ、ＡＸＣ、ＧＸＡ、ＣＸＣ、ＴＸＣ、ＡＴＸ、ＣＴＸ、ＴＴＸ、ＧＴＸ、ＴＡＸまたはＧＧＸを含む３つの連続したデオキシリボヌクレオチド（ＮＮＮ）を含む非天然ＤＮＡの例示的な領域によってコードされ、ここでＸは２’デオキシリボシル部分に結合する非天然塩基である。例示的な非天然ＤＮＡの転写からもたらされる例示的なｍＲＮＡコドンは、ＵＵＸ、ＵＧＸ、ＣＧＸ、ＡＧＸ、ＧＡＸ、ＣＡＸ、ＧＸＵ、ＣＸＵ、ＧＸＧ、ＡＸＧ、ＧＸＣ、ＡＸＣ、ＧＸＡ、ＣＸＣ、ＵＸＣ、ＡＵＸ、ＣＵＸ、ＵＵＸ、ＧＵＸ、ＵＡＸまたはＧＧＸをそれぞれ含む３つの連続したリボヌクレオチド（ＮＮＮ）を含み、ここで、Ｘはリボシル部分に結合する非天然塩基である。いくつかの実施形態では、非天然塩基はコドン配列（Ｘ－Ｎ－Ｎ）の第１の位置にある。いくつかの実施形態では、非天然塩基はコドン配列（Ｎ－Ｘ－Ｎ）の第２（または中央）の位置にある。いくつかの実施形態では、非天然塩基はコドン配列（Ｎ－Ｎ－Ｘ）の第３（最後）の位置にある。
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つのＧを含むコドンおよび少なくとも１つのＣを含むアンチコドンを含む。いくつかの例において、本方法はＸおよびＹを含み、ここでＸおよびＹは以下からなる群から独立して選択される：（ｉ）２－チオウラシル、２’－デオキシウリジン、４－チオウラシル、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、５－ハロウラシル；５－プロピニル－ウラシル、６－アゾ－ウラシル、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、シュードウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシルまたはジヒドロウラシル；（ｉｉ）５－ヒドロキシメチルシトシン、５－トリフルオロメチルシトシン、５－ハロシトシン、５－プロピニルシトシン、５－ヒドロキシシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５，６－ジヒドロシトシン、５－ニトロシトシン、６－アゾシトシン、アザシトシン、Ｎ４－エチルシトシン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノキサジンシチジン（９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、またはピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）；（ｉｉｉ）２－アミノアデニン、２－プロピルアデニン、２－アミノ－アデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－プロピル－アデニン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、３－デアザアデニン、７－メチルアデニン、７－デアザ－アデニン、８－アザアデニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシル置換アデニン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、２－メチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニンまたは６－アザアデニン；（ｉｖ）２－メチルグアニン、グアニンの２－プロピルおよびアルキル誘導体、３－デアザグアニン、６－チオグアニン、７－メチルグアニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアノシン、７－デアザ－８－アザグアニン、８－アザグアニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシル置換グアニン、１－メチルグアニン、２，２－ジメチルグアニン、７－メチルグアニンまたは６－アザグアニン；ならびに（ｖ）ヒポキサンチン、キサンチン、１－メチルイノシン、ケオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、ワイブトキソシン、ヒドロキシ尿素、（ａｃｐ３）ｗ、２－アミノピリジンまたは２－ピリドン。いくつかの実施形態では、ＸおよびＹは以下からなる群から独立して選択される：
Figure 2022552271000002
 いくつかの例において、Ｘは、
Figure 2022552271000003
 である。
いくつかの実施形態では、Ｙは
Figure 2022552271000004
 である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、非天然コドン－アンチコドン対ＮＮＸ－ＸＮＮを含み、ここで、ＮＮＸ－ＸＮＮは、ＵＵＸ－ＸＡＡ、ＵＧＸ－ＸＣＡ、ＣＧＸ－ＸＣＧ、ＡＧＸ－ＸＣＵ、ＧＡＸ－ＸＵＣ、ＣＡＸ－ＸＵＧ、ＡＵＸ－ＸＡＵ、ＣＵＸ－ＸＡＧ、ＧＵＸ－ＸＡＣ、ＵＡＸ－ＸＵＡおよびＧＧＸ－ＸＣＣからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、非天然コドン－アンチコドン対ＮＮＸ－ＹＮＮを含み、ここで、ＮＮＸ－ＹＮＮは、ＵＵＸ－ＹＡＡ、ＵＧＸ－ＹＣＡ、ＣＧＸ－ＹＣＧ、ＡＧＸ－ＹＣＵ、ＧＡＸ－ＹＵＣ、ＣＡＸ－ＹＵＧ、ＡＵＸ－ＹＡＵ、ＣＵＸ－ＹＡＧ、ＧＵＸ－ＹＡＣ、ＵＡＸ－ＹＵＡおよびＧＧＸ－ＹＣＣからなる群から選択される。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、非天然コドン－アンチコドン対ＮＸＮ－ＮＹＮを含み、ここで、ＮＸＮ－ＮＹＮは、ＧＸＵ－ＡＹＣ、ＣＸＵ－ＡＹＧ、ＧＸＧ－ＣＹＣ、ＡＸＧ－ＣＹＵ、ＧＸＣ－ＧＹＣ、ＡＸＣ－ＧＹＵ、ＧＸＡ－ＵＹＣ、ＣＸＣ－ＧＹＧおよびＵＸＣ－ＧＹＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、各々異なる非天然アンチコドンを含む少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子を含む。いくつかの例において、少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子は、メタノサルシーナ属からのピロリシルｔＲＮＡおよびＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉからのチロシルｔＲＮＡまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、本方法はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによって少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子をチャージすることを含む。いくつかの例において、ｔＲＮＡシンテターゼは、キメラＰｙｌＲＳ（ｃｈＰｙｌＲＳ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＡｚＦＲＳ（ＭｊｐＡｚＦＲＳ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも２つの異なるｔＲＮＡシンテターゼによって少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子をチャージすることを含む。いくつかの例において、少なくとも２つの異なるｔＲＮＡシンテターゼは、キメラＰｙｌＲＳ（ｃｈＰｙｌＲＳ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＡｚＦＲＳ（ＭｊｐＡｚＦＲＳ）を含む。
いくつかの実施形態では、非天然ポリペプチドのインビボ合成の方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、非天然ポリペプチドは、２、３またはそれより多くの非天然アミノ酸を含む。いくつかの例において、非天然ポリペプチドは、同じである少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、非天然ポリペプチドは、少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸を含む。いくつかの例において、非天然アミノ酸は：
リジン類似体；芳香族側鎖；アジド基；アルキン基；またはアルデヒドもしくはケトン基を含む。いくつかの例において、非天然アミノ酸は芳香族側鎖を含まない。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、Ｎ６－（プロパルギルオキシ）－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒＫ）、ｐ－アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸、セレノシステイン、Ｎ６－（（（２－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ６－（（（３－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、およびＮ６－（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンから選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非天然ポリペプチドのインビボ合成の方法は、プラスミドの形態の少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を含む。いくつかの例において、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は、細胞のゲノムに組み入れられる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は、非天然ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、非天然ＤＮＡ分子のインビボ複製および転写、ならびに細胞性生物での転写されたｍＲＮＡ分子のインビボ翻訳を含む。いくつかの実施形態では、細胞性生物は微生物である。いくつかの実施形態では、細胞性生物は原核生物である。いくつかの実施形態では、細胞性生物は細菌である。いくつかの例において、細胞性生物はグラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、細胞性生物はグラム陰性細菌である。いくつかの例において、細胞性生物は大腸菌である。いくつかの実施形態では、細胞性生物はヌクレオシド三リン酸輸送体を含む。いくつかの例において、ヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＰｔＮＴＴ２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列を含む。一部の代替形態では、ＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列は、配列番号１によってコードされるＰｔＮＴＴ２と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、細胞性生物は少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は少なくとも１つのプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は、細胞のゲノムに組み入れられる。いくつかの例において、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は、非天然ポリペプチドをコードする。いくつかの例において、本開示に記載される方法は、無細胞系で非天然ポリペプチドを合成することを含むインビトロ方法であってよい。
いくつかの実施形態では、非天然ポリペプチドのインビボ合成の方法が本明細書に記載され、ここで非天然ポリペプチドは非天然糖部分を含む。いくつかの実施形態では、非天然塩基対は、非天然糖部分を含む少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、非天然糖部分は、以下からなる群から選択される：ＯＨ、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３、（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換もしくは非のＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０アルキニル、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２および－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であってもよく、ｎおよびｍは、１から約１０である）；ならびに／または５’位における修飾：５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）；４’位における修飾：４’－Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、およびそれらの任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態では、非天然ポリペプチドのインビボ合成のための細胞であって、少なくとも２つの異なる非天然コドン－アンチコドン対を含む細胞が本明細書に記載され、ここで、各非天然コドン－アンチコドン対は非天然メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からの非天然コドンおよび非天然転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）からの非天然アンチコドンを含み、前記非天然コドンは第１の非天然ヌクレオチドを含み、前記非天然アンチコドンは第２の非天然ヌクレオチドを含み；少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸が対応する非天然ｔＲＮＡに各々共有結合している。いくつかの例において、細胞は、少なくとも４つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然ポリペプチドのインビボ合成のための細胞であって、少なくとも４つの非天然塩基対を含む少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を含む細胞が本明細書に記載され、ここで、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は、（ｉ）非天然ポリペプチドをコードし、少なくとも第１および第２の非天然コドンを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、ならびに（ｉｉ）少なくとも第１および第２の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子をコードし、第１のｔＲＮＡ分子は第１の非天然アンチコドンを含み、第２のｔＲＮＡ分子は第２の非天然アンチコドンを含み、少なくとも１つのＤＮＡ分子中の少なくとも４つの非天然塩基対は、ｍＲＮＡ分子の第１および第２の非天然コドンが第１および第２の非天然アンチコドンにそれぞれ相補的であるような配列コンテキストにある。いくつかの実施形態では、細胞はｍＲＮＡ分子ならびに少なくとも第１および第２のｔＲＮＡ分子をさらに含む。細胞のいくつかの実施形態では、少なくとも第１および第２のｔＲＮＡ分子は非天然アミノ酸に共有結合させられる。いくつかの実施形態では、細胞は非天然ポリペプチドをさらに含む。
いくつかの実施形態では、第１の非天然ヌクレオチドは非天然コドンの第２または第３の位置に配置され、非天然アンチコドンの第２の非天然ヌクレオチドと相補的に塩基対を形成する。いくつかの例において、第１の非天然ヌクレオチドおよび第２の非天然ヌクレオチドは、
Figure 2022552271000005
 からなる群から独立して選択される第１および第２の塩基を含み、場合により、第２の塩基は第１の塩基と異なる。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも４つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子をさらに含む。いくつかの例において、少なくとも４つの非天然塩基対は、ｄＣＮＭＯ／ｄＴＰＴ３、ｄＮａＭ／ｄＴＰＴ３、ｄＣＮＭＯ／ｄＴＡＴ１またはｄＮａＭ／ｄＴＡＴ１からなる群から独立して選択される。いくつかの例において、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は少なくとも１つのプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は、細胞のゲノムに組み入れられる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は非天然ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞はヌクレオシド三リン酸輸送体を発現する。一部の代替形態では、ヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＰｔＮＴＴ２のアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、ヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列を含み、場合により、ＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列は、配列番号１によってコードされるＰｔＮＴＴ２と少なくとも８０％同一である。いくつかの実施形態では、細胞は少なくとも２つのｔＲＮＡシンテターゼを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのｔＲＮＡシンテターゼは、キメラＰｙｌＲＳ（ｃｈＰｙｌＲＳ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＡｚＦＲＳ（ＭｊｐＡｚＦＲＳ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、非天然糖部分を含む非天然ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、非天然糖部分は、以下からなる群から選択される：２’位における修飾：ＯＨ、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル；
Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３、（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０アルキニル、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２および－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であってもよく、ｎおよびｍは、１から約１０である）；ならびに／または５’位における修飾：５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）；４’位における修飾：４’－Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、およぶそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、細胞は、転写の間にＲＮＡポリメラーゼによって認識される少なくとも１つの非天然ヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞は、少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む少なくとも１つの非天然ポリペプチドを翻訳する。いくつかの例において、少なくとも２つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、Ｎ６－（プロパルギルオキシ）－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒＫ）、ｐ－アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸、セレノシステイン、Ｎ６－（（（２－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ６－（（（３－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、およびＮ６－（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンからなる群から独立して選択される。いくつかの例において、本明細書に記載される細胞は単離された細胞である。一部の代替形態では、本明細書に記載される細胞は原核生物である。いくつかの例において、本明細書に記載される細胞は細胞系を含む。
本開示の様々な態様が、添付の請求項において詳細に示される。本開示の構成および利点のより深い理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明および付随図への参照によって得られる。
非天然Ｘ－Ｙ塩基対を使用して非正規アミノ酸（ｎｃＡＡ）を非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質へ部位特異的に組み込むための非天然塩基対（ＵＢＰ）を使用したワークフローを例示する図である。非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質への３つのｎｃＡＡの組み込みは、一例として示されるだけである；任意の数のｎｃＡＡを組み込むことができる。 例示的な非天然ヌクレオチド塩基対（ＵＢＰ）を表す図である。 デオキシリボＸ類似体を表す図である。デオキシリボースおよびリン酸は、明瞭さのために省略された。 図４Ａ－Ｂは、リボヌクレオチド類似体を例示する図である。図４ＡはリボヌクレオチドＸ類似体を表し、リボースおよびリン酸は明瞭さのために省略されている。図４ＢはリボヌクレオチドＹ類似体を表し、リボースおよびリン酸は明瞭さのために省略されている。 例示的な非天然アミノ酸を例示する図である。図５Ａは、Ｙｏｕｎｇら、「Ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ２０ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ：ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｅｘｉｃｏｎ」、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８５（１５）：１１０３９～１１０４４（２０１０）の図２から採られている。 例示的な非天然アミノ酸を例示する図である。図５Ｂは、例示的な非天然アミノ酸リジン誘導体である。 例示的な非天然アミノ酸を例示する図である。図５Ｃは、例示的な非天然アミノ酸フェニルアラニン誘導体である。 例示的な非天然アミノ酸を例示する図である。図５Ｄ～５Ｇは、例示的な非天然アミノ酸を例示する。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質に遺伝子的にコードされている（図５Ｄ－ＵＡＡ＃１～４２；図５Ｅ－ＵＡＡ＃４３～８９；図５Ｆ－ＵＡＡ＃９０～１２８；図５Ｇ－ＵＡＡ＃１２９～１６７）。図５Ｄ～５Ｇは、Ｄｕｍａｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５、６、５０～６９の表１から採られている。 例示的な非天然アミノ酸を例示する図である。図５Ｄ～５Ｇは、例示的な非天然アミノ酸を例示する。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質に遺伝子的にコードされている（図５Ｄ－ＵＡＡ＃１～４２；図５Ｅ－ＵＡＡ＃４３～８９；図５Ｆ－ＵＡＡ＃９０～１２８；図５Ｇ－ＵＡＡ＃１２９～１６７）。図５Ｄ～５Ｇは、Ｄｕｍａｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５、６、５０～６９の表１から採られている。 例示的な非天然アミノ酸を例示する図である。図５Ｄ～５Ｇは、例示的な非天然アミノ酸を例示する。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質に遺伝子的にコードされている（図５Ｄ－ＵＡＡ＃１～４２；図５Ｅ－ＵＡＡ＃４３～８９；図５Ｆ－ＵＡＡ＃９０～１２８；図５Ｇ－ＵＡＡ＃１２９～１６７）。図５Ｄ～５Ｇは、Ｄｕｍａｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５、６、５０～６９の表１から採られている。 例示的な非天然アミノ酸を例示する図である。図５Ｄ～５Ｇは、例示的な非天然アミノ酸を例示する。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質に遺伝子的にコードされている（図５Ｄ－ＵＡＡ＃１～４２；図５Ｅ－ＵＡＡ＃４３～８９；図５Ｆ－ＵＡＡ＃９０～１２８；図５Ｇ－ＵＡＡ＃１２９～１６７）。図５Ｄ～５Ｇは、Ｄｕｍａｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５、６、５０～６９の表１から採られている。 図６Ａ－Ｄは、非天然コドンおよびアンチコドンを使用した非クローンＳＳＯでのタンパク質生成を例示する図である。非天然コドンおよび非天然アンチコドンは、それらのＤＮＡコード配列で書かれている。図６Ａは、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３ ＵＢＰの化学構造である。図６Ｂは、ｎｃＡＡ、ＡｚＫ、ＰｒＫおよびｐＡｚＦの化学構造である。図６Ｃは、ｓｆＧＦＰ１５１（ＮＮＮ）およびＭ．ｍａｚｅｉ ｔＲＮＡＰｙｌ（ＮＮＮ）を発現させるために使用した遺伝子カセットの概略図であり、ＮＮＮは任意の指定されたコドンまたはアンチコドンを指す。図６Ｄは、培地中のＡｚＫの有る無しで指定されたコドンおよびアンチコドンを使用した、タンパク質発現のエンドポイント（すなわち、ｔ＝ａＴｃの添加の１８０分後）における非クローンＳＳＯ培養からの正規化された蛍光を表す（ａ．ｕ．、恣意的単位）。各重複培養は、ＵＢＰを有するプラスミドで形質転換されたコンピテントＳＳＯスターター細胞の異なるバッチを起源とする（ｎ＝３、生物学的反復）。平均を個々のデータポイントと示す。ＳＳＯ培養からのＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯによるＳＰＡＡＣにかけた、精製されたｓｆＧＦＰの１つの代表的な切り取られたウエスタンブロットを各コドンおよびアンチコドンの上に示す（α－ＧＦＰチャネルだけ）。図６Ｄの挿入図は、ＡｚＫの存在下での平均エンドポイント蛍光（図６Ｄから）対ＳＰＡＡＣによって誘導された定量化された相対的タンパク質シフトの平均の散布図である（ｎ＝３；生物学的反復）。さらなる分析のために選択されたトップの７つのコドンは囲まれている。 図６－１の続き。 図７Ａ－Ｂは、クローンＳＳＯでのタンパク質生成およびコドン直交性の分析を例示する図である。非天然コドンおよび非天然アンチコドンは、それらのＤＮＡコード配列で書かれている。図７Ａは、ＡｚＫの有る無しのトップの７つのコドンおよびアンチコドン（左）ならびに４つの他の選択されたコドン（右）のタンパク質発現のエンドポイント（すなわち、ｔ＝ａＴｃの添加の１８０分後）における、クローンＳＳＯからの正規化された蛍光を表す。各重複培養は、個々のＳＳＯコロニーから増殖させた（左：ｎ＝３、右：ｎ＝［５、４、３、３］；生物学的反復）。平均を個々のデータポイントと示す。ＳＳＯ培養からのＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯによるＳＰＡＡＣにかけた、精製されたｓｆＧＦＰの１つの代表的な切り取られたウエスタンブロットを示す（α－ＧＦＰチャネルだけ）。図７Ｂは、ＡＸＣ、ＧＸＴおよびＡＧＸコドンならびにＧＹＴ、ＡＹＣおよびＸＣＴアンチコドンの発現のエンドポイントにおけるクローンＳＳＯ培養からの正規化された蛍光を表す。培地中のＡｚＫの有る無しの、ならびに培地中のリボヌクレオシド三リン酸ＮａＭＴＰおよびＴＰＴ３ＴＰ無しの両方の全てのペアワイズ組み合わせを試験した。各培養は単一のコロニーから増殖させ、平均±標準偏差が示される（黒色のテキスト；ｎ＝３；生物学的反復）。 図８Ａ－Ｆは、２つの非天然コドンの同時解読を例示する図である。非天然コドンおよび非天然アンチコドンは、それらのＤＮＡコード配列で書かれている。図８Ａは、ｓｆＧＦＰ１９０、２００（ＧＸＴ、ＡＸＣ）、Ｍ．ｍａｚｅｉ ｔＲＮＡＰｙｌ（ＡＹＣ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡｐＡｚＦ（ＧＹＴ）を含有する遺伝子カセットの概略図である。図８Ｂ～Ｃ、表示されたｎｃＡＡの存在下でのｓｆＧＦＰ発現の間の正規化された蛍光の継時的プロット。ＩＰＴＧはｔ＝－６０分に加え、ａＴｃはｔ＝０で加えた。各反復発現は、個々のＳＳＯコロニーから増殖させた培養で実行した（ｎ＝３；生物学的反復）。平均および個々のデータポイントを示す。図８Ｂは図８Ａのカセットならびに適当なｔＲＮＡと単一のコドンだけを含有するカセットの発現を示す対照のクローンＳＳＯ発現を例示する。図８Ｃは、同じく示されるｓｆＧＦＰ１９０、２００（ＴＡＡ、ＴＡＧ）、Ｍ．ｍａｚｅｉ ｔＲＮＡＰｙｌ（ＴＴＡ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡｐＡｚＦ（ＣＴＡ）を含有するカセット、ならびに適当なサプレッサーｔＲＮＡと単一の終止コドンを含有する対照カセットのクローン発現を例示する。図８Ｄは、ＳＰＡＡＣによるＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯへのコンジュゲーションの有る無しの、α－ＧＦＰおよび図８Ｂ～ＣのＳＳＯからの精製されたｓｆＧＦＰのＴＡＭＲＡ蛍光スキャンの疑似着色ウエスタンブロットを示す。画像は同じブロット（ＵＢＰ構築物および終止コドンサプレッサー）から切り取られるが、電気泳動遊走の比較を容易にするために未シフトバンドを整列させるために配置される。図８Ｅは、ＰｒＫおよびｐＡｚＦを添加した、図８Ｂ～Ｃからの二重コドン／ｔＲＮＡカセットのクローン発現の間の正規化された蛍光の継時的プロットを示す。平均および個々のデータポイントを示す（ｎ＝３；生物学的反復）。図８Ｆは、ＳＰＡＡＣによるＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯへの、およびＣｕＡＡＣによるＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－アジドへのコンジュゲーションの有る無しの、α－ＧＦＰおよび図８ＥのＳＳＯからの精製されたｓｆＧＦＰのＴＡＭＲＡ蛍光スキャンの疑似着色ウエスタンブロットを示す。 図８－１の続き。 図９Ａ－Ｃは、３つの非天然コドンの同時解読を例示する図である。非天然コドンおよび非天然アンチコドンは、それらのＤＮＡコード配列で書かれている。図９Ａは、ｓｆＧＦＰ１５１、１９０、２００（ＡＸＣ、ＧＸＴ、ＡＧＸ）、Ｍ．ｍａｚｅｉ ｔＲＮＡＰｙｌ（ＸＣＴ）、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡｐＡｚＦ（ＧＹＴ）および大腸菌ｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＹＣ）を含有する遺伝子カセットの概略図である。図９Ｂは、ＡｚＫおよび／またはｐＡｚＦの非存在下または存在下におけるｓｆＧＦＰ発現の間の正規化された蛍光の継時的プロットである。ＩＰＴＧはｔ＝－６０分に加え、ａＴｃはｔ＝０で加えた。各反復発現は、個々のＳＳＯコロニーから増殖させた培養で実行した（ｎ＝３；生物学的反復）。平均および個々のデータポイントを示す。図９Ｃは、図９ＢのＳＳＯから精製されたインタクトのｓｆＧＦＰのＨＲＭＳ分析からの代表的な解析された質量スペクトルである。ピーク標識は、他の関連種と比較した各ピークの分子量ならびに定量を表す。使用した標準の一文字アミノ酸コード。これらの種（ｎ＝３）の各々のために平均±標準偏差を示す。 非クローンＳＳＯにおける非天然コドンの最初のスクリーニングを例示する図である。非天然コドンおよび非天然アンチコドンは、それらのＤＮＡコード配列で書かれている。コドンの第１、第２または第３の位置のいずれかにＵＢＰを有する選ばれたコドン／アンチコドン対のための、タンパク質発現のエンドポイント（すなわち、ｔ＝ａＴｃの追加の１８０分後）におけるＳＳＯ細胞からの正規化された蛍光の対にされたストリップチャート。プラス／マイナスは、培地への２０ｍＭ ＡｚＫの添加を表す。各反復は、コンピテントＳＳＯスターター細胞の異なるバッチに由来する（ｎ＝３；生物学的反復）。 図１１Ａ－Ｂは、非クローンＳＳＯ発現のためのウエスタンブロットおよび蛍光スキャンを例示する図である。非天然コドンおよび非天然アンチコドンは、それらのＤＮＡコード配列で書かれている。図１１Ａは、ＳＰＡＡＣによるＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯへコンジュゲーションしている、α－ＧＦＰおよび図６Ｄの培養からの精製されたｓｆＧＦＰのＴＡＭＲＡ蛍光スキャンの疑似着色ウエスタンブロットである。プラス／マイナス符号は、ＳＰＡＡＣが実行されたかどうかを表す。３つの試験を実行した（１、２、３で表す；生物学的反復）。各セット（ＮＸＮ／ＮＹＮおよびＮＮＸ／ＸＮＮ）の３つの試験を並行して処理した。図１１Ｂ、指定されたコドン／アンチコドン対のためのウエスタンブロット（図１１Ａ）における相対的シフトの定量（すなわち、シフトしたバンドのシグナルをシフトしたおよび未シフトのバンドの全シグナルによって割る）。プラス／マイナス符号は、ＳＰＡＡＣが実行されたかどうかを表す。平均±標準偏差ならびに個々のデータポイントを示す（ｎ＝３）。 図１２Ａ－Ｂは、クローンＳＳＯ発現のためのウエスタンブロットおよび蛍光スキャンを例示する図である。非天然コドンおよび非天然アンチコドンは、それらのＤＮＡコード配列で書かれている。図１２Ａ、ＳＰＡＡＣによるＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯへコンジュゲーションしている、α－ＧＦＰおよび図７Ａの培養からの精製されたｓｆＧＦＰのＴＡＭＲＡ蛍光スキャンの疑似着色ウエスタンブロット。提示された（切り取られた）領域は、３２ｋＤａから２５ｋＤａの標準タンパク質マーカーの間で移動した。図１２Ｂ、指定されたコドンのためのウエスタンブロット（図１２Ａ）における相対的シフトの定量。平均±標準偏差ならびに個々のデータポイントを示す（ＣＸＣのｎ＝５およびＧＸＧのｎ＝４以外はｎ＝３） ＴＰＴ３ＴＰの非存在下でのクローンＳＳＯ発現を例示する図である。非天然コドンおよび非天然アンチコドンは、それらのＤＮＡコード配列で書かれている。トップの４つの自己対形成コドン／アンチコドンのためのタンパク質発現のエンドポイント（すなわち、ｔ＝ａＴｃの追加の１８０分後）におけるクローンＳＳＯからの正規化された蛍光。各反復発現は、図７Ａで実行されたように個々のコロニーから増殖させた培養で実行した（ｎ＝３；生物学的反復）。蛍光および定量化されたウエスタンブロットタンパク質シフト（すなわち、相対的シフト；ゲルは示さない）のために示す平均±標準偏差、ならびに蛍光のための個々のデータポイント。 二重コドン発現のための対照を例示する図である。非天然コドンおよび非天然アンチコドンは、それらのＤＮＡコード配列で書かれている。培地中の表示されたｎｃＡＡの有る無しの、指定された遺伝子型のｓｆＧＦＰ発現の間の正規化された蛍光の継時的プロット。ＩＰＴＧはｔ＝－６０分に加え、ａＴｃはｔ＝０で加えた。各反復発現は、個々のコロニーから増殖させた培養で実行した（ｎ＝３；生物学的反復）。平均および個々のデータポイントを示す。 図１５Ａ－Ｂは、二重コドン発現からのタンパク質のＨＲＭＳ分析を例示する図である。図８Ｂに示す通り培地中にＡｚＫおよびｐＡｚＦを有し、ｓｆＧＦＰ１５１、１９０、２００（ＧＸＴ、ＡＸＣ）、ｔＲＮＡＰｙｌ（ＡＹＣ）およびｔＲＮＡｐＡｚＦ（ＧＹＴ）を発現するＳＳＯから精製されたインタクトのｓｆＧＦＰのＨＲＭＳ分析（ｎ＝３；生物学的反復）。使用した標準の一文字アミノ酸コード。図１５Ａは、関連するピークおよびそれらの互いの相対的存在度のアノテーションと共に解析されたスペクトルを表す。図１５Ｂは、ピークの帰属および解釈を表す。 図１６Ａ－Ｂは、三重コドン発現からのタンパク質のＨＲＭＳ分析を例示する図である。図９Ｂに示す通り培地中にＡｚＫおよびｐＡｚＦを有し、ｓｆＧＦＰ１５１、１９０、２００（ＡＸＣ、ＧＸＴ、ＡＧＸ）、ｔＲＮＡＰｙｌ（ＸＣＴ）、ｔＲＮＡｐＡｚＦ（ＧＹＴ）およびｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＹＣ）を発現するＳＳＯから精製されたインタクトのｓｆＧＦＰのＨＲＭＳ分析、（ｎ＝３、生物学的反復）。使用した標準の一文字アミノ酸コード。図１６Ａは、関連するピークおよびそれらの互いの相対的存在度のアノテーションと共に解析されたスペクトルを表す。図１６Ｂは、ピークの帰属および解釈を表す。
特定の用語
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、特許請求される主題が属する当技術分野の技術者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、例示的かつ説明的なものに過ぎず、請求された主題を限定するものではないことを理解されたい。本出願では、特に明記されていない限り、単数形の使用には複数形を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ（不定冠詞）」、「ａｎ（不定冠詞）」および「ｔｈｅ（定冠詞）」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本出願において、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形式の使用は、限定的ではない。
本明細書で使用される場合、範囲および量は、特定の値または範囲の「約」として表されてもよい。約には正確な量も含まれる。したがって、「約５μＬ」とは「約５μＬ」、また「５μＬ」を意味する。一般に、「約」という用語には、実験誤差の範囲内であると予想される量が含まれる。
本明細書で使用される、合成方法の文脈における「提供するのに適した条件下で」または「生成するのに十分な条件下で」などのようなフレーズは、反応産物の有用な量または収率を提供する、実験者が変化させる通常の技術の範囲内である、時間、温度、溶媒、反応物濃度などの反応条件を指す。所望の反応産物が唯一の反応産物である必要もなく、または出発物質が完全に消費される必要もないが、ただし、これは所望の反応産物が単離され得るか、さもなければさらに使用され得るという条件である。
「化学的に実現可能」とは、一般的に理解されている有機構造の規則に違反しない結合配置または化合物を意味する。例えば、特定の状況において、自然界には存在しない五価の炭素原子を含む特許請求の範囲の定義内の構造は、特許請求の範囲内にないことが理解される。本明細書に開示される構造は、それらの全ての実施形態では、「化学的に実現可能な」構造のみを含むことを意図し、例えば、可変の原子または基で示される構造において、化学的に実現可能ではない、任意の列挙された構造は、本明細書で開示されることも特許請求されることも意図されない。
化学構造の「アナログ」は、本明細書で使用される用語として、親構造から合成的に容易に導き出されない場合があるが、親構造との実質的な類似性を保持する化学構造を指す。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは、非天然ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドアナログは、非天然ヌクレオシドである。親の化学構造から合成的に容易に導き出される関連する化学構造は、「誘導体」と呼ばれる。
したがって、本明細書で使用されるように、用語ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ－またはＲＮＡ様ポリマー、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、非天然塩基などを指し、これらは当技術分野で周知である。ポリヌクレオチドは、自動合成装置で、例えばホスホロアミダイト化学反応または合成装置使用のために適合させた他の化学的アプローチを使用して合成することができる。
ＤＮＡには、限定されずにｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが含まれる。ＤＮＡは共有結合または非共有結合の手段によって、ＲＮＡおよびペプチドを限定されずに含む別の生体分子に結合することができる。ＲＮＡには、コードＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはｒＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、長ｎｃＲＮＡ、またはその任意の組み合わせもしくはハイブリッドである。いくつかの例において、ＲＮＡはリボザイムの成分である。ＤＮＡおよびＲＮＡは、線状、環状、スーパーコイル、一本鎖および二本鎖を限定されずに含む、任意の形態であってもよい。
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ペプチド様主鎖がＤＮＡまたはＲＮＡの糖－リン酸主鎖を置き換える合成ＤＮＡ／ＲＮＡ類似体である。ＰＮＡオリゴマーは相補的ＤＮＡへの結合でより高い結合強度およびより大きな特異性を示し、ＰＮＡ／ＤＮＡ塩基ミスマッチがＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖での類似のミスマッチよりも不安定にしている。この結合強度および特異性は、ＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖にも適用される。ＰＮＡはヌクレアーゼによってもプロテアーゼによっても容易に認識されず、それらを酵素分解に耐性にしている。ＰＮＡは、広いｐＨ範囲でも安定している。Ｎｉｅｌｓｅｎ ＰＥ、Ｅｇｈｏｌｍ Ｍ、Ｂｅｒｇ ＲＨ、Ｂｕｃｈａｒｄｔ Ｏ（１９９１年１２月）。「チミン置換ポリアミドを用いた鎖置換によるＤＮＡの配列選択的認識（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｙｍｉｎｅ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４（５０３７）：１４９７－５００．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１９６２２１０．ＰＭＩＤ １９６２２１０；ならびにＥｇｈｏｌｍ Ｍ、Ｂｕｃｈａｒｄｔ Ｏ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｌ、Ｂｅｈｒｅｎｓ Ｃ、Ｆｒｅｉｅｒ ＳＭ、Ｄｒｉｖｅｒ ＤＡ、Ｂｅｒｇ ＲＨ、Ｋｉｍ ＳＫ、Ｎｏｒｄｅｎ ＢおよびＮｉｅｌｓｅｎ ＰＥ（１９９３）、「ＰＮＡはワトソンクリック水素結合規則に従い相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする（ＰＮＡ Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ ｔｏ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｏｂｅｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｂｏｎｄｉｎｇ Ｒｕｌｅｓ）」）。Ｎａｔｕｒｅ ３６５（６４４６）：５６６～８。ｄｏｉ：１０．１０３８／３６５５６６ａ０。ＰＭＩＤ ７６９２３０４も参照のこと。
ロック核酸（ＬＮＡ）は、改変されたＲＮＡヌクレオチドであり、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続する追加の架橋で修飾されている。この架橋は、３’－エンド（Ｎ）コンフォメーションでリボースを「ロック」し、これは、Ａ形二重鎖でよく見られる。ＬＮＡヌクレオチドは、必要に応じてオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合することができる。そのようなオリゴマーは化学的に合成されてもよく、市販されている。ロックされたリボースコンフォメーションは、塩基のスタッキングおよび骨格事前組織化を強化する。例えば、Ｋａｕｒ、Ｈ；Ａｒｏｒａ、Ａ；Ｗｅｎｇｅｌ、Ｊ；Ｍａｉｔｉ、Ｓ（２００６）、「ＤＮＡ二重鎖へのロックド核酸ヌクレオチドの取り込みのための熱力学的、対イオン、および水和効果（Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ、Ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎ、ａｎｄ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ＤＮＡ Ｄｕｐｌｅｘｅｓ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５（２３）：７３４７～５５。ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ０６０３０７ｗ．ＰＭＩＤ １６７５２９２４；Ｏｗｃｚａｒｚｙ Ｒ．；Ｙｏｕ Ｙ．、Ｇｒｏｔｈ Ｃ．Ｌ．、Ｔａｔａｕｒｏｖ Ａ．Ｖ．（２０１１）、「ロックド核酸－ＤＮＡ二重鎖の安定性およびミスマッチの識別（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘｅｓ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０（４３）：９３５２－９３６７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ２００９０４ｅ．ＰＭＣ ３２０１６７６．ＰＭＩＤ ２１９２８７９５；Ａｌｅｘｅｉ Ａ．Ｋｏｓｈｋｉｎ；Ｓａｎｊａｙ Ｋ．Ｓｉｎｇｈ、Ｐｏｕｌ Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｖｉｖｅｋ Ｋ．Ｒａｊｗａｎｓｈｉ、Ｒａｖｉｎｄｒａ Ｋｕｍａｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｍｅｌｄｇａａｒｄ、Ｃａｒｌ Ｅｒｉｋ Ｏｌｓｅｎ、Ｊｅｓｐｅｒ Ｗｅｎｇｅｌ（１９９８）、「ＬＮＡ（ロックド核酸）：アデニン、シトシン、グアニン、５－メチルシトシン、チミンおよびウラシルビシクロヌクレオシドモノマーの合成、オリゴマー化、ならびに前例のない核酸認識（ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｉｎｅ、ｃｙｔｏｓｉｎｅ、ｇｕａｎｉｎｅ、５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ、ｔｈｙｍｉｎｅ ａｎｄ ｕｒａｃｉｌ ｂｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｎｏｍｅｒｓ、ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ、ａｎｄ ｕｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４（１４）：３６０７－３０．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００４０－４０２０（９８）０００９４－５；ならびに、Ｓａｔｏｓｈｉ Ｏｂｉｋａ；Ｄａｉｓｈｕ Ｎａｎｂｕ、Ｙｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｈａｒｉ、Ｋｅｎ－ｉｃｈｉｒｏ Ｍｏｒｉｏ、Ｙａｓｕｋｏ Ｉｎ、Ｔｏｓｈｉｍａｓａ Ｉｓｈｉｄａ、Ｔａｋｅｓｈｉ Ｉｍａｎｉｓｈｉ（１９９７）、「２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンウリジンおよび－シチジンの合成。固定されたＣ３’－エンド糖パッカリングを有する新規二環式ヌクレオシド（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ －ｃｙｔｉｄｉｎｅ。Ｎｏｖｅｌ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ａ ｆｉｘｅｄ Ｃ３’－ｅｎｄｏ ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ）」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３８（５０）：８７３５－８．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００４０－４０３９（９７）１０３２２－７を参照する。
分子ビーコンまたは分子ビーコンプローブは、均質な溶液中の特定の核酸配列の存在を検出し得るオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。分子ビーコンは、内部でクエンチされたフルオロフォアを備えたヘアピン型の分子であり、標的の核酸配列に結合すると蛍光が回復する。例えば、Ｔｙａｇｉ Ｓ、Ｋｒａｍｅｒ ＦＲ（１９９６）、「分子ビーコン：ハイブリダイゼーション時に蛍光を発するプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ：ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（３）：３０３－８．ＰＭＩＤ ９６３０８９０；Ｔａｐｐ Ｉ、Ｍａｌｍｂｅｒｇ Ｌ、Ｒｅｎｎｅｌ Ｅ、Ｗｉｋ Ｍ、Ｓｙｖａｎｅｎ ＡＣ（２０００年４月）、「一塩基多型の均一スコアリング：５’－ヌクレアーゼＴａｑＭａｎアッセイおよび分子ビーコンプローブの比較（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｃｏｒｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ５’－ｎｕｃｌｅａｓｅ ＴａｑＭａｎ ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ ｐｒｏｂｅｓ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２８（４）：７３２－８．ＰＭＩＤ １０７６９７５２；ならびにＡｋｉｍｉｔｓｕ Ｏｋａｍｏｔｏ（２０１１）、「ＥＣＨＯプローブ：実用的な核酸センシングのための蛍光制御の概念」、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４０：５８１５－５８２８を参照のこと。
いくつかの実施形態では、核酸塩基は、一般的に、ヌクレオシドの複素環式塩基部分である。核酸塩基は、天然に存在してもよく、修飾されてもよく、天然塩基と類似性を有さなくてもよく、例えば、有機合成によって合成されてもよい。ある特定の実施形態では、核酸塩基は、水素結合の使用の有無にかかわらず、別の核酸の塩基と相互作用し得る任意の原子または原子群を含む。ある特定の実施形態では、非天然核酸塩基は、天然核酸塩基に由来しない。非天然核酸塩基は必ずしも塩基性の特性を保有しているわけではないが、簡単にするために核酸塩基と呼ばれることに注意すべきである。いくつかの実施形態では、核酸塩基に言及する場合、「（ｄ）」とは核酸塩基がデオキシリボースまたはリボースに付着し得ることを示す。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシドは、核酸塩基部分および糖部分を含む化合物である。ヌクレオシドとしては、限定するものではないが、天然に存在するヌクレオシド（ＤＮＡおよびＲＮＡに見られる）、無塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、ならびに擬似塩基および／または糖基を有するヌクレオシドが挙げられる。ヌクレオシドとしては、任意の多様な置換基を含むヌクレオシドが挙げられる。ヌクレオシドは、核酸塩基と糖の還元基の間のグリコシド連結によって形成されるグリコシド化合物であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示に記載される非天然ｍＲＮＡコドンおよび非天然ｔＲＮＡアンチコドンは、それらのＤＮＡコード配列で書くことができる。例えば、非天然ｔＲＮＡアンチコドンはＧＹＵまたはＧＹＴと書くことができる。
本明細書で使用されるセクション見出しは組織的な目的のためだけであり、記載された主題を限定するものとして解釈されるべきでない。
非天然ポリペプチドのインビボ合成のための組成物および方法
拡張された遺伝子アルファベットによる非天然ポリペプチドのインビボ合成のための組成物および方法が本明細書に開示される。いくつかの例において、本明細書に記載される組成物および方法は、非天然ポリペプチドをコードする非天然核酸分子を含み、ここで非天然ポリペプチドは非天然アミノ酸を含む。いくつかの例において、非天然ポリペプチドは、少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む。場合によっては、非天然ポリペプチドは、少なくとも３つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの例において、非天然ポリペプチドは２つの非天然アミノ酸を含む。場合によっては、非天然ポリペプチドは３つの非天然アミノ酸を含む。いくつかの例において、非天然ポリペプチドに組み込まれる少なくとも２つの非天然アミノ酸は、同じかまたは異なる非天然アミノ酸であってよい。場合によっては、非天然アミノ酸は非天然ポリペプチドに部位特異的に組み込まれる。場合によっては、非天然ポリペプチドは非天然タンパク質である。
場合によっては、本明細書に記載される組成物および方法は、半合成生物（ＳＳＯ）を含む。いくつかの例において、本方法は少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を少なくとも１つの非天然核酸分子に組み込むことを含む。いくつかの実施形態では、本方法は１つのＵＢＰを少なくとも１つの非天然核酸分子に組み込むことを含む。いくつかの実施形態では、本方法は２つのＵＢＰを少なくとも１つの非天然核酸分子に組み込むことを含む。いくつかの実施形態では、本方法は３つのＵＢＰを少なくとも１つの非天然核酸分子に組み込むことを含む。ＵＢＰ塩基対は、２つの非天然ヌクレオシドの非天然核酸塩基の間の対形成によって形成される。いくつかの実施形態では、非天然核酸分子は非天然ＤＮＡ分子である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然核酸分子は１分子（例えば、プラスミドまたは染色体）であるかそれを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然核酸分子は２分子（例えば、２つのプラスミド、２つの染色体または染色体とプラスミド）であるかまたはそれらを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然核酸分子は３分子（例えば、３つのプラスミド、２つのプラスミドと染色体、プラスミドと２つの染色体、または３つの染色体）であるかまたはそれらを含む。染色体の例には、ＵＢＰが組み入れられたゲノム染色体およびＵＢＰを含む人工染色体（例えば、細菌性人工染色体）が含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの非天然塩基対を含む少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子が使用され、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子が２つ以上の分子である場合、少なくとも４つの非天然塩基対は２つ以上の分子に任意の実行可能な方法で分配されてもよい（例えば、第１のものに１つと第２のものに３つ、第１のものに２つと第２のものに２つ、等々）。
いくつかの例において、場合によりＵＢＰを含んでいる少なくとも１つの非天然核酸分子は、転写されて少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを持つ少なくとも１つの非天然コドンを含むメッセンジャーＲＮＡ分子を与える。いくつかの実施形態では、転写することはＤＮＡ分子の一部に相補的である１つまたはそれ以上のＲＮＡ分子を生成することを指す。場合によっては、非天然ヌクレオチドは、非天然コドンの第１、第２または第３のコドン位置、例えば第２または第３のコドン位置を占有する。場合によっては、２つの非天然ヌクレオチドは、非天然コドンの第１および第２、第１および第３、第２および第３、または第１および第３のコドン位置を占める。場合によっては、３つの非天然ヌクレオチドは、非天然コドンの３つのコドン位置の全てを占有する。場合によっては、非天然ヌクレオチドを持つｍＲＮＡは少なくとも２つの非天然コドンを含む（いくつかの実施形態では、「少なくとも２つの非天然コドン」という表現は、「少なくとも第１および第２の非天然コドン」と交換可能である）。場合によっては、非天然ヌクレオチドを持つｍＲＮＡは２つの非天然コドンを含む。場合によっては、非天然ヌクレオチドを持つｍＲＮＡは３つの非天然コドンを含む。
いくつかの実施形態では、場合によりＵＢＰを含んでいる非天然核酸分子は、転写されて少なくとも１つのｔＲＮＡ分子を与え、ここで、ｔＲＮＡ分子は少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを持つ非天然アンチコドンを含む。場合によっては、非天然ヌクレオチドは、非天然アンチコドンの第１、第２または第３のアンチコドン位置を占有する。場合によっては、２つの非天然ヌクレオチドは、非天然アンチコドンの第１および第２、第１および第３、第２および第３、または第１および第３のアンチコドン位置を占める。場合によっては、３つの非天然ヌクレオチドは、非天然アンチコドンの３つのアンチコドン位置の全てを占有する。場合によっては、場合によりＵＢＰを含んでいる非天然核酸分子は、転写されて少なくとも２つの非天然アンチコドンを含む少なくとも２つのｔＲＮＡを与える。場合には、少なくとも２つの非天然アンチコドンは同じであっても異なってもよい。いくつかの例において、場合によりＵＢＰを含んでいる非天然核酸分子は、転写されて同じであっても異なってもよい非天然アンチコドンを含む２つのｔＲＮＡを与える。いくつかの例において、場合によりＵＢＰを含んでいる非天然核酸分子は、転写されて同じであっても異なってもよい３つの非天然アンチコドンを含む３つのｔＲＮＡを与える。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされる少なくとも１つの非天然コドンは、非天然コドン－アンチコドン対を形成するためにｔＲＮＡの少なくとも１つの非天然アンチコドンに相補的であってよい。場合によっては、本明細書に記載される組成物および方法は、１、２、３またはそれより多くの非天然コドン－アンチコドン対で非天然ポリペプチドを合成することを含む。場合によっては、本明細書に記載される組成物および方法は、２つの非天然コドン－アンチコドン対で非天然ポリペプチドを合成することを含む。場合によっては、本明細書に記載される組成物および方法は、３つの非天然コドン－アンチコドン対で非天然ポリペプチドを合成することを含む。
場合によっては、本明細書に記載される組成物および方法は、１、２、３またはそれより多くの非天然コドン－アンチコドン対を使用して１、２、３またはそれより多くの非天然アミノ酸で非天然ポリペプチドを合成することを含む。場合によっては、本明細書に記載される組成物および方法は、２つの非天然コドン－アンチコドン対を使用して２つの非天然アミノ酸で非天然ポリペプチドを合成することを含む。場合によっては、本明細書に記載される組成物および方法は、３つの非天然コドン－アンチコドン対を使用して３つの非天然アミノ酸で非天然ポリペプチドを合成することを含む。
いくつかの例において、非天然コドンは、核酸配列ＸＮＮ、ＮＸＮ、ＮＮＸ、ＸＸＮ、ＸＮＸ、ＮＸＸまたはＸＸＸを含み、非天然アンチコドンは、核酸配列ＸＮＮ、ＹＮＮ、ＮＸＮ、ＮＹＮ、ＮＮＸ、ＮＮＹ、ＮＸＸ、ＮＹＹ、ＸＮＸ、ＹＮＹ、ＸＸＮ、ＹＹＮまたはＹＹＹを含むことで非天然コドン－アンチコドン対を形成する。場合によっては、非天然コドン－アンチコドン対はＮＮＸ－ＸＮＮ、ＮＮＸ－ＹＮＮまたはＮＸＮ－ＮＹＮを含み、ここで、Ｎは任意の天然ヌクレオチドであり、Ｘは第１の非天然ヌクレオチドであり、Ｙは第２の非天然ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、任意の天然ヌクレオチドには、標準の塩基、例えばアデニン、チミン、ウラシル、グアニンまたはシトシンを有するヌクレオチド、およびシュードウリジン、５－メチルシトシン等の天然に存在する修飾された塩基を有するヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、非天然コドン－アンチコドン対は、コドンに少なくとも１つのＧを、およびアンチコドンに少なくとも１つのＣを含む。いくつかの実施形態では、非天然コドン－アンチコドン対は、コドンに少なくとも１つのＧまたはＣを、およびアンチコドンに少なくとも１つの相補的ＣまたはＧを含む。ＸおよびＹは以下からなる群から各々独立して選択される：（ｉ）２－チオウラシル、２’－デオキシウリジン、４－チオウラシル、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、５－ハロウラシル；５－プロピニル－ウラシル、６－アゾ－ウラシル、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、シュードウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－トリフルオロメチルシトシン、５－ハロシトシン、５－プロピニルシトシン、５－ヒドロキシシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５，６－ジヒドロシトシン、５－ニトロシトシン、６－アゾシトシン、アザシトシン、Ｎ４－エチルシトシン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノキサジンシチジン（９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）、２－アミノアデニン、２－プロピルアデニン、２－アミノ－アデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－プロピル－アデニン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、３－デアザアデニン、７－メチルアデニン、７－デアザ－アデニン、８－アザアデニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシル置換アデニン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、２－メチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、６－アザアデニン、２－メチルグアニン、グアニンの２－プロピルおよびアルキル誘導体、３－デアザグアニン、６－チオグアニン、７－メチルグアニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアノシン、７－デアザ－８－アザグアニン、８－アザグアニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシル置換グアニン、１－メチルグアニン、２，２－ジメチルグアニン、７－メチルグアニン、６－アザグアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、１－メチルイノシン、ケオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、ワイブトキソシン、ヒドロキシ尿素、（ａｃｐ３）ｗ、２－アミノピリジンまたは２－ピリドン。
いくつかの実施形態では、ＸおよびＹは以下からなる群から独立して選択される：
Figure 2022552271000006
場合によっては、非天然コドン－アンチコドン対はＮＮＸ－ＸＮＮを含み、ここでＮＮＸ－ＸＮＮは、ＡＡＸ－ＸＵＵ、ＡＵＸ－ＸＡＵ、ＡＣＸ－ＸＧＵ、ＡＧＸ－ＸＣＵ、ＵＡＸ－ＸＵＡ、ＵＵＸ－ＸＡＡ、ＵＣＸ－ＸＧＡ、ＵＧＸ－ＸＣＡ、ＣＡＸ－ＸＵＧ、ＣＵＸ－ＸＡＧ、ＣＣＸ－ＸＧＧ、ＣＧＸ－ＸＣＧ、ＧＡＸ－ＸＵＣ、ＧＵＸ－ＸＡＣ、ＧＣＸ－ＸＧＣおよびＧＧＸ－ＸＣＣからなる群から選択される。場合によっては、非天然コドン－アンチコドン対はＮＮＸ－ＹＮＮを含み、ここでＮＮＸ－ＹＮＮは、ＡＡＸ－ＹＵＵ、ＡＵＸ－ＹＡＵ、ＡＣＸ－ＹＧＵ、ＡＧＸ－ＹＣＵ、ＵＡＸ－ＹＵＡ、ＵＵＸ－ＹＡＡ、ＵＣＸ－ＹＧＡ、ＵＧＸ－ＹＣＡ、ＣＡＸ－ＹＵＧ、ＣＵＸ－ＹＡＧ、ＣＣＸ－ＹＧＧ、ＣＧＸ－ＹＣＧ、ＧＡＸ－ＹＵＣ、ＧＵＸ－ＹＡＣ、ＧＣＸ－ＹＧＣおよびＧＧＸ－ＹＣＣからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然コドン－アンチコドン対はＮＸＮ－ＮＸＮを含み、ここでＮＸＮ－ＮＸＮは、ＡＸＡ－ＵＸＵ、ＡＸＵ－ＡＸＵ、ＡＸＣ－ＧＸＵ、ＡＸＧ－ＣＸＵ、ＵＸＡ－ＵＸＡ、ＵＸＵ－ＡＸＡ、ＵＸＣ－ＧＸＡ、ＵＸＧ－ＣＸＡ、ＣＸＡ－ＵＸＧ、ＣＸＵ－ＡＸＧ、ＣＸＣ－ＧＸＧ、ＣＸＧ－ＣＸＧ、ＧＸＡ－ＵＸＣ、ＧＸＵ－ＡＸＣ、ＧＸＣ－ＧＸＣおよびＧＸＧ－ＣＸＣからなる群から選択される。いくつかの例において、非天然コドン－アンチコドン対はＮＸＮ－ＮＹＮを含み、ここでＮＸＮ－ＮＹＮは、ＡＸＡ－ＵＹＵ、ＡＸＵ－ＡＹＵ、ＡＸＣ－ＧＹＵ、ＡＸＧ－ＣＹＵ、ＵＸＡ－ＵＹＡ、ＵＸＵ－ＡＹＡ、ＵＸＣ－ＧＹＡ、ＵＸＧ－ＣＹＡ、ＣＸＡ－ＵＹＧ、ＣＸＵ－ＡＹＧ、ＣＸＣ－ＧＹＧ、ＣＸＧ－ＣＹＧ、ＧＸＡ－ＵＹＣ、ＧＸＵ－ＡＹＣ、ＧＸＣ－ＧＹＣおよびＧＸＧ－ＣＹＣからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、非天然コドン－アンチコドン対はＸＮＮ－ＮＮＸを含み、ここでＸＮＮ－ＮＮＸは、ＸＡＡ－ＵＵＸ、ＸＡＵ－ＡＵＸ、ＸＡＣ－ＡＧＸ、ＸＡＧ－ＣＵＸ、ＸＵＡ－ＵＡＸ、ＸＵＵ－ＡＡＸ、ＸＵＣ－ＧＡＸ、ＸＵＧ－ＣＡＸ、ＸＣＡ－ＵＧＸ、ＸＣＵ－ＡＧＸ、ＸＣＣ－ＧＧＸ、ＸＣＧ－ＣＧＸ、ＸＧＡ－ＵＣＸ、ＸＧＵ－ＡＣＸ、ＸＧＣ－ＧＣＸおよびＸＧＧ－ＣＣＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然コドン－アンチコドン対はＸＮＮ－ＮＮＹを含み、ここでＸＮＮ－ＮＮＹは、ＸＡＡ－ＵＵＹ、ＸＡＵ－ＡＵＹ、ＸＡＣ－ＡＧＹ、ＸＡＧ－ＣＵＹ、ＸＵＡ－ＵＡＹ、ＸＵＵ－ＡＡＹ、ＸＵＣ－ＧＡＹ、ＸＵＧ－ＣＡＹ、ＸＣＡ－ＵＧＹ、ＸＣＵ－ＡＧＹ、ＸＣＣ－ＧＧＹ、ＸＣＧ－ＣＧＹ、ＸＧＡ－ＵＣＹ、ＸＧＵ－ＡＣＹ、ＸＧＣ－ＧＣＹおよびＸＧＧ－ＣＣＹからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、非天然コドン－アンチコドン対はＸＸＮ－ＮＸＸを含み、ここでＸＸＮ－ＮＸＸは、ＸＸＡ－ＵＸＸ、ＸＸＵ－ＡＸＸ、ＸＸＣ－ＧＸＸおよびＸＸＧ－ＣＸＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然コドン－アンチコドン対はＸＸＮ－ＮＹＹを含み、ここでＸＸＮ－ＮＹＹは、ＸＸＡ－ＵＹＹ、ＸＸＵ－ＡＹＹ、ＸＸＣ－ＧＹＹおよびＸＸＧ－ＣＹＹからなる群から選択される。一部の代替形態では、非天然コドン－アンチコドン対はＸＮＸ－ＸＮＸを含み、ここでＸＮＸ－ＸＮＸは、ＸＡＸ－ＸＵＸ、ＸＵＸ－ＸＡＸ、ＸＣＸ－ＸＧＸおよびＸＧＸ－ＸＣＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然コドン－アンチコドン対はＸＮＸ－ＹＮＹを含み、ここでＸＮＸ－ＹＮＹは、ＸＡＸ－ＹＵＹ、ＸＵＸ－ＹＡＹ、ＸＣＸ－ＹＧＹおよびＸＧＸ－ＹＣＹからなる群から選択される。場合によっては、非天然コドン－アンチコドン対はＮＸＸ－ＸＸＮを含み、ここでＮＸＸ－ＸＸＮは、ＡＸＸ－ＸＸＵ、ＵＸＸ－ＸＸＡ、ＣＸＸ－ＸＸＧおよびＧＸＸ－ＸＸＣからなる群から選択される。いくつかの例において、非天然コドン－アンチコドン対はＮＸＸ－ＹＹＮを含み、ここでＮＸＸ－ＹＹＮは、ＡＸＸ－ＹＹＵ、ＵＸＸ－ＹＹＡ、ＣＸＸ－ＹＹＧおよびＧＸＸ－ＹＹＣからなる群から選択される。場合によっては、非天然コドン－アンチコドン対はＸＸＸ－ＸＸＸまたはＸＸＸ－ＹＹＹを含む。
拡張された遺伝子アルファベット（図２）で非天然ポリペプチドを生成する方法の例示的なワークフロー１００（図１）では、相補的非天然核酸塩基（Ｘ、Ｙ）を各々含むタンパク質１０２およびｔＲＮＡ１０３をコードするＤ
ＮＡ１０１は、転写１０４されてｔＲＮＡ１０６およびｍＲＮＡ１０７を生成する。Ｘは第１の非天然ヌクレオチドであり、Ｙは第２の非天然ヌクレオチドである。ｔＲＮＡを非天然アミノ酸１０５でチャージした後、ｍＲＮＡ１０７は、翻訳１０８されて、１つまたはそれ以上の非天然アミノ酸１０９を含むタンパク質１１０が生じる。本明細書に記載の方法および組成物は、いくつかの例において、高い忠実度および収率で、非天然アミノ酸の部位特異的組み込みを可能にする。拡張された遺伝子アルファベットを含む半合成生物、少なくとも１つの非天然アミノ酸残基を含むものを含むタンパク質産物を生成するための半合成生物を使用するための方法も本明細書に記載する。
非天然核酸塩基の選択は、本明細書に記載の方法における１つまたはそれ以上の工程の最適化を可能にする。例えば、核酸塩基は、高効率の複製、転写および／または翻訳のために選択される。いくつかの例において、１つ以上の非天然核酸塩基対は、本明細書に記載の方法のために利用される。例えば、デオキシリボ部分を含む核酸塩基の第１のセットは、ＤＮＡ複製のために使用され（例えば、第１の塩基対を形成するように構成する第１の核酸塩基および第２の核酸塩基）、核酸塩基の第２のセット（例えば、リボースに結合し、第２の塩基対を形成するように構成されている第３の核酸塩基および第４の核酸塩基）は、転写／翻訳のために使用される。第１のセットの核酸塩基および第２のセットの核酸塩基の間の相補的な対形成は、いくつかの例において、第１のセットからの核酸塩基を含むＤＮＡテンプレートからｔＲＮＡまたはタンパク質を生じさせるための遺伝子の転写を可能にする。第２のセットの核酸塩基の間の相補的な対形成（第２の塩基対）は、いくつかの例において、非天然核酸を含むｔＲＮＡおよびｍＲＮＡをマッチさせることによって、翻訳を可能にする。いくつかの場合において、第１のセット中の核酸塩基は、デオキシリボース部分に結合する。いくつかの場合において、第１のセット中の核酸塩基は、リボース部分に結合する。いくつかの例において、両方のセットの核酸塩基は、固有である。いくつかの例において、少なくとも１つの核酸塩基は、両方のセット中で同じである。いくつかの例において、第１の核酸塩基および第３の核酸塩基は、同じである。いくつかの実施形態において、第１の塩基対および第２の塩基対は、同じではない。いくつかの場合において、第１の塩基対、第２の塩基対および第３の塩基対は、同じではない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法によって合成される非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質の収量は、他の方法によって合成される同じ非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質の収量と比較してより高い。いくつかの例において、本明細書に開示される組成物および方法によって合成される非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質の収量は、他の方法によって合成される同じ非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質の収量より少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％高い。他の方法の例には、アンバーコドン抑制を利用した方法が含まれる。
いくつかの例において、本明細書に開示される組成物および方法によって合成される非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質の溶解性は、他の方法によって合成される同じ非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質の溶解性と比較してより高い。いくつかの例において、本明細書に開示される組成物および方法によって合成される非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質の溶解性は、他の方法によって合成される同じ非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質より少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％高い。場合によっては、本明細書に開示される組成物および方法によって合成される非天然タンパク質の生物活性は、他の方法によって合成される同じ非天然タンパク質の生物活性と比較してより高い。いくつかの例において、本明細書に開示される組成物および方法によって合成される非天然タンパク質の生物活性は、他の方法によって合成される同じ非天然タンパク質の生物活性より少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％高い。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非天然ポリペプチドのインビボ合成のための組成物および方法は、半合成生物（ＳＳＯ）を利用または含む。いくつかの実施形態では、ＳＳＯは非天然ポリペプチドの合成の間にクローン拡張を受けている。いくつかの例において、ＳＳＯは非天然ポリペプチドの合成の間にクローン拡張をしていない。場合によっては、ＳＳＯは非天然ポリペプチドの合成の間に細胞周期の任意の段階で停止させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、非天然ポリペプチドをインビトロで合成することができる。場合によっては、本明細書に記載される組成物および方法は、非天然ポリペプチドを合成するために無細胞系を含むことができる。
核酸分子
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、本明細書において、目的の核酸分子とも称する）は、任意の起源または組成物由来、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（短い阻害性ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）由来であり、例えば、任意の形態（例えば、線状、環状、高次コイル状、一本鎖、二本鎖など）である。いくつかの実施形態において、核酸は、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたはポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、核酸は、天然核酸および非天然核酸を含む。いくつかの場合において、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡアナログ（例えば、塩基アナログ、糖アナログおよび／または非ネイティブ骨格などを含有する）などの非天然核酸も含む。「核酸」という用語は、特定の長さのポリヌクレオチド鎖を指さないこと、またはそれを推測しないことが理解され、したがって、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドも、その定義内に含まれる。例示的な天然ヌクレオチドとしては、限定されないが、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＧＭＰが挙げられる。例示的な天然デオキシリボヌクレオチドとしては、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＧＭＰが挙げられる。例示的な天然リボヌクレオチドとしては、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰおよびＧＭＰが挙げられる。天然ＲＮＡについて、ウラシル塩基は、ウリジンである。核酸は、ベクター、プラスミド、ファージミド、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、または宿主細胞中で複製可能であるか、もしくは宿主細胞中で複製される他の核酸である場合がある。いくつかの場合において、非天然核酸は、核酸アナログである。追加の場合において、非天然核酸は、細胞外起源由来である。他の場合において、非天然核酸は、本明細書に提供される生物、例えば、遺伝子改変生物の細胞内空間において利用可能である。いくつかの実施形態において、非天然ヌクレオチドは、天然ヌクレオチドではない。いくつかの実施形態において、天然塩基を含まないヌクレオチドは、非天然核酸塩基を含む。
非天然核酸
ヌクレオチドアナログまたは非天然ヌクレオチドは、塩基、糖またはホスフェート部分のいずれかにいくつかの種類の修飾を含有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、修飾は、化学的修飾を含む。いくつかの場合において、修飾は、３’ＯＨもしくは５’ＯＨ基、主鎖、糖構成成分またはヌクレオチド塩基において起こる。いくつかの例において、修飾は、場合により、天然に存在しないリンカー分子および／または鎖間もしくは鎖内架橋のものを含む。一態様において、修飾された核酸は、３’ＯＨもしくは５’ＯＨ基、主鎖、糖構成成分もしくはヌクレオチド塩基の１つまたはそれ以上の修飾、および／あるいは天然に存在しないリンカー分子の付加を含む。一態様において、修飾された主鎖は、ホスホジエステル主鎖以外の主鎖を含む。一態様において、修飾された糖は、デオキシリボース以外（修飾されたＤＮＡにおいて）、またはリボース以外（修飾されたＲＮＡ）の糖を含む。一態様において、修飾された塩基は、アデニン、グアニン、シトシンもしくはチミン以外の塩基（修飾されたＤＮＡにおいて）、またはアデニン、グアニン、シトシンもしくはウラシル以外の塩基（修飾されたＲＮＡにおいて）を含む。
いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも１つの修飾された塩基を含む。いくつかの例において、核酸は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上の修飾された塩基を含む。いくつかの場合において、塩基部分への修飾は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕの天然ならびに合成修飾だけでなく、異なるプリンまたはピリミジン塩基も含む。いくつかの実施形態において、修飾は、アデニン、グアニン、シトシンもしくはチミンの修飾された形態（修飾されたＤＮＡにおいて）、またはアデニン、グアニン、シトシンもしくはウラシルの修飾された形態（修飾されたＲＮＡ）である。
非天然核酸の修飾された塩基としては、限定されるものではないが、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、２－アミノアデニン－９－イル、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが挙げられる。ある特定の非天然核酸、例えば、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、Ｏ－６置換プリン、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、５－メチルシトシン、二本鎖形成の安定性を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、乱雑な核酸、サイズが拡大された核酸、フッ素化核酸、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリンは、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチル、他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシル、５－ハロシトシン、５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシル、５－プロピニルシトシン、ピリミジン核酸の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に、５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環で置き換えられたもの、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、２－ピリドン、アザシトシン、５－ブロモシトシン、ブロモウラシル、５－クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５－フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６－ジヒドロシトシン、５－ヨードシトシン、ヒドロキシウレア、ヨードウラシル、５－ニトロシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシルおよび５－ヨードウラシル、２－アミノ－アデニン、６－チオ－グアニン、２－チオ－チミン、４－チオ－チミン、５－プロピニル－ウラシル、４－チオ－ウラシル、Ｎ４－エチルシトシン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、５－ヒドロキシシトシン、２’－デオキシウリジン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、ならびに米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，８４５，２０５号；同第４，９１０，３００号；同第４，９４８，８８２号；同第５，０９３，２３２号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６４５，９８５号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第５，７６３，５８８号；同第５，８３０，６５３号および同第６，００５，０９６号；国際公開第９９／６２９２３号；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、（２００１）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９巻：８０７～８１３頁；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ、Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０、８５８～８５９頁；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、６１３頁；およびＳａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣｒｏｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３、２７３～２８８頁に記載のものを含む。追加の塩基修飾は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、６１３頁に見ることができる。いくつかの例において、非天然核酸は、図３の核酸塩基を含む。いくつかの例において、非天然核酸は、図４Ａの核酸塩基を含む。いくつかの例において、非天然核酸は、図４Ｂの核酸塩基を含む。
様々な複素環塩基および様々な糖部分（および糖アナログ）を含む非天然核酸は、当技術分野において利用可能であり、いくつかの場合において、核酸は、天然に存在する核酸の主要な５つの塩基構成成分以外の１つまたはいくつかの複素環塩基を含む。例えば、複素環塩基としては、いくつかの場合において、ウラシル－５－イル、シトシン－５－イル、アデニン－７－イル、アデニン－８－イル、グアニン－７－イル、グアニン－８－イル、４－アミノピロロ［２．３－ｄ］ピリミジン－５－イル、２－アミノ－４－オキソピロロ［２、３－ｄ］ピリミジン－５－イル、２－アミノ－４－オキソピロロ［２．３－ｄ］ピリミジン－３－イル基が挙げられ、ここで、プリンは、９位を介して核酸の糖部分に、１位を介してピリミジンに、７位を介してピロロピリミジンに、および１位を介してピラゾロピリミジンに結合する。
いくつかの実施形態において、非天然核酸の修飾された塩基を下記に表し、ここで、波線またはＲは、デオキシリボースまたはリボースへの結合点を特定する。
Figure 2022552271000007
Figure 2022552271000008
Figure 2022552271000009
Figure 2022552271000010
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログはまた、ホスフェート部分において修飾される。修飾されたホスフェート部分としては、限定されるものではないが、２つのヌクレオチド間の連結における修飾を有するものが挙げられ、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルならびにボラノホスフェートを含む。２つのヌクレオチド間のこれらのホスフェートまたは修飾されたホスフェートの連結は、３’－５’連結または２’－５’連結によってであり、連結は、３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’などの逆の方向性を含むことが理解される。さまざまな塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。多数の米国特許が、修飾されたホスフェートを含有するヌクレオチドの作製方法および使用方法を教示しており、限定されるものではないが、第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；および第５，６２５，０５０号が挙げられる。
いくつかの実施形態において、非天然核酸は、２’，３’－ジデオキシ－２’，３’－ジデヒドロ－ヌクレオシド（ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００６４６０号）、５’－置換ＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３９６１号；Ｓａｈａら、Ｊ．Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．、１９９５、６０巻、７８８～７８９頁；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９９、９巻、８８５～８９０頁；およびＭｉｋｈａｉｌｏｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９１、１０巻（１～３号）、３３９～３４３頁；Ｌｅｏｎｉｄら、１９９５、１４巻（３～５号）、９０１～９０５頁；およびＥｐｐａｃｈｅｒら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２００４、８７巻、３００４～３０２０頁；ＰＣＴ／ＪＰ２０００／００４７２０号；ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００２３４２号；ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３２１６号；ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０２０４３５号；ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１５４７９号；ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２４４８４号；ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５６７１８号；ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０６７５６０号）、または修飾された塩基を用いてモノホスフェートとして作製された５’－置換モノマー（Ｗａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、２００４、２３巻（１および２号）、３１７～３３７頁）を含む。
いくつかの実施形態において、非天然核酸は、糖の環の５’位および２’位における修飾（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２９９３号）、例えば、５’－ＣＨ２置換２’－Ｏ－保護ヌクレオシド（Ｗｕら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２０００、８３巻、１１２７～１１４３頁およびＷｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９９、１０巻、９２１～９２４）を含む。いくつかの場合において、非天然核酸は、オリゴヌクレオチドへの組み込みのために製造されたアミド連結ヌクレオシドダイマーを含み、ここで、ダイマー中の３’連結ヌクレオシド（５’から３’）は、２’－ＯＣＨ３および５’－（Ｓ）－ＣＨ３（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、１９９７、１２８７～１２９０頁）を含む。非天然核酸は、２’－置換５’－ＣＨ２（またはＯ）修飾ヌクレオシド（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１０２０号）を含むことができる。非天然核酸は、５’－メチレンホスホネートＤＮＡおよびＲＮＡモノマーおよびダイマー（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、１９９３、３４巻、２７２３～２７２６頁；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、１９９５、７巻、７０３～７０５頁；およびＨｕｔｔｅｒら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、２００２、８５巻、２７７７～２８０６頁）を含むことができる。非天然核酸は、２’－置換を有する５’－ホスホネートモノマー（米国特許出願公開第２００６／００７４０３５号）および他の修飾された５’－ホスホネートモノマー（国際公開第１９９７／３５８６９号）を含むことができる。非天然核酸は、５’－修飾されたメチレンホスホネートモノマー（欧州特許出願公開第６１４９０７号および欧州特許出願公開第６２９６３３号）を含むことができる。非天然核酸は、５’および／もしくは６’位にヒドロキシル基を含む５’または６’－ホスホネートリボヌクレオシドのアナログ（Ｃｈｅｎら、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，Ｓｕｌｆｕｒ ａｎｄ Ｓｉｌｉｃｏｎ、２００２、７７７巻、１７８３～１７８６頁；Ｊｕｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０００、８巻、２５０１～２５０９頁；Ｇａｌｌｉｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００７、９２５～９３３頁；およびＨａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９７６、１９巻（８号）、１０２９～１０３３頁）を含むことができる。非天然核酸は、５’－ホスフェート基を有する５’－ホスホネートデオキシリボヌクレオシドモノマーおよびダイマー（Ｎａｗｒｏｔら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００６、１６巻（１号）、６８～８２頁）を含むことができる。非天然核酸は、６’－ホスホネート基を有するヌクレオシドを含むことができ、ここで、５’または／および６’位は、無置換、またはチオ－ｔｅｒｔ－ブチル基（ＳＣ（ＣＨ３）３）（およびそのアナログ）；メチレンアミノ基（ＣＨ２ＮＨ２）（およびそのアナログ）またはシアノ基（ＣＮ）（およびそのアナログ）（Ｆａｉｒｈｕｒｓｔら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、２００１、４巻、４６７～４７２頁；Ｋａｐｐｌｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８６、２９巻、１０３０～１０３８頁；Ｋａｐｐｌｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８２、２５巻、１１７９～１１８４頁；Ｖｒｕｄｈｕｌａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８７、３０巻、８８８～８９４頁；Ｈａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９７６、１９巻、１３７１～１３７７頁；Ｇｅｚｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１９８３、１０５巻（２６号）、７６３８～７６４０頁；およびＨａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１９７３、９５巻（１３号）、４４０４～４４１４頁）で置換される。
いくつかの実施形態において、非天然核酸は、糖部分の修飾も含む。いくつかの場合において、核酸は、糖基が修飾された１つまたはそれ以上のヌクレオシドを含有する。そのような糖が修飾されたヌクレオシドは、増強されたヌクレアーゼ安定性、増加した結合親和性、またはいくつかの他の有利な生物学的性質が付与される場合がある。ある特定の実施形態において、核酸は、化学修飾されたリボフラノース環部分を含む。化学修飾されたリボフラノース環の例としては、限定されないが、置換基の付加（５’および／または２’置換基；二環式核酸（ＢＮＡ）を形成する２つの環原子の架橋；リボシル環の酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）もしくはＣ（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ＝Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルまたは保護基）による置き換え；ならびにそれらの組み合わせを含む）が挙げられる。化学修飾された糖の例は、国際公開第２００８／１０１１５７号、米国特許出願公開第２００５／０１３０９２３号および国際公開第２００７／１３４１８１号に見ることができる。
いくつかの例において、修飾された核酸は、修飾された糖または糖アナログを含む。したがって、リボースおよびデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、または糖の「アナログ」のシクロペンチル基であることができる。糖は、ピラノシルまたはフラノシルの形態であることができる。糖部分は、リボース、デオキシリボース、アラビノースまたは２’－Ｏ－アルキルリボースのフラノシドであることができ、糖は、［アルファ］または［ベータ］アノマー配置のいずれかのそれぞれの複素環塩基に結合することができる。糖修飾としては、限定されるものではないが、２’－アルコキシ－ＲＮＡアナログ、２’－アミノ－ＲＮＡアナログ、２’－フルオロ－ＤＮＡおよび２’－アルコキシ－またはアミノ－ＲＮＡ／ＤＮＡキメラが挙げられる。例えば、糖修飾としては、２’－Ｏ－メチル－ウリジンまたは２’－Ｏ－メチル－シチジンを挙げることができる。糖修飾としては、２’－Ｏ－アルキル置換デオキシリボヌクレオシドおよび２’－Ｏ－エチレングリコール様リボヌクレオシドが挙げられる。そのような糖または糖アナログが複素環塩基（核酸塩基）に結合する、これらの糖または糖アナログおよびそれぞれの「ヌクレオシド」の製造は、公知である。糖修飾はまた、他の修飾を用いて作製し、それと組み合わせることができる。
糖部分への修飾は、リボースおよびデオキシリボースの天然修飾、ならびに非天然修飾を含む。糖修飾としては、限定されるものではないが、以下の２位における修飾：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルが挙げられ、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または無置換のＣ１～Ｃ１０アルキルもしくはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。２’糖修飾としては、限定されるものではないが、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２および－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは、１～約１０である）も挙げられる。
２’位における他の修飾としては、限定されるものではないが、Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル、Ｏ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、および類似の性質を有する他の置換基が挙げられる。類似の修飾はまた、糖の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチドまたは２’－５’連結オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位において行うことができる。修飾された糖は、ＣＨ２およびＳなどの架橋している環の酸素において修飾を含有するものも含む。ヌクレオチドの糖アナログは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖ミメティックを有することもできる。米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；および同第５，７００，９２０号などの、そのような修飾された糖構造の製造を教示し、塩基修飾の範囲を詳述および記載する多数の米国特許があり、それらのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
修飾された糖部分を有する核酸の例としては、限定されないが、５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）、４’－Ｓ、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３および２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含む核酸が挙げられる。２’位における置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ－アリル、Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１Ｏアルキル）、ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２－Ｏ－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）およびＯ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）（式中、それぞれのＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈ、または置換もしくは無置換のＣ１～Ｃ１０アルキルである）から選択することもできる。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の核酸は、１つまたはそれ以上の二環式核酸を含む。ある特定のそのような実施形態において、二環式核酸は、４’および２’リボシル環原子の間の架橋を含む。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、１つまたはそれ以上の二環式核酸を含み、ここで、架橋は、４’－２’二環式核酸を含む。そのような４’－２’二環式核酸の例としては、限定されるものではないが、式：４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’、ならびにそれらのアナログ（米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’およびそのアナログ（国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２００８／１５０７２９号、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号、米国特許第７，４２７，６７２号、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２０９巻、７４号、１１８～１３４頁および国際公開第２００８／１５４４０１号を参照されたい）の１つが挙げられる。例えば、Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９８、４巻、４５５～４５６頁；Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４巻、３６０７～３６３０頁；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７巻、５６３３～５６３８頁；Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、８巻、２２１９～２２２２頁；Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、６３巻、１００３５～１００３９頁；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００７、１２９巻（２６号）８３６２～８３７９頁；Ｅｌａｙａｄｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ、２００１、２巻、５５８～５６１頁；Ｂｒａａｓｃｈら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ、２００１、８巻、１～７頁；Ｏｒａｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００１、３巻、２３９～２４３頁；米国特許第４，８４９，５１３号：同第５，０１５，７３３号：同第５，１１８，８００号：同第５，１１８，８０２号：同第７，０５３，２０７号：同第６，２６８，４９０号：同第６，７７０，７４８号：同第６，７９４，４９９号：同第７，０３４，１３３号：同第６，５２５，１９１号：同第６，６７０，４６１号：および同第７，３９９，８４５号；国際公開第２００４／１０６３５６号、国際公開第１９９４／１４２２６号、国際公開第２００５／０２１５７０号、国際公開第２００７／０９００７１および国際公開第２００７／１３４１８１号；米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号、同第２００７／０２８７８３１号および同第２００８／００３９６１８号；米国仮出願第６０／９８９，５７４号、同第６１／０２６，９９５号、同第６１／０２６，９９８号、同第６１／０５６，５６４号、同第６１／０８６，２３１号、同第６１／０９７，７８７号および同第６１／０９９，８４４号；ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１号、同第ＰＣＴ ＵＳ２００８／０６６１５４号、同第ＰＣＴ ＵＳ２００８／０６８９２２号および同第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３号も参照されたい。
ある特定の実施形態において、核酸は、連結された核酸を含む。核酸は、任意の核酸間の連結を使用して、一緒に連結することができる。核酸間連結基の２つの主なクラスは、リン原子の存在または非存在によって定義される。代表的なリン含有核酸間連結としては、限定されるものではないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよびホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）が挙げられる。代表的なリン不含有核酸間連結基としては、限定されるものではないが、メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－）、チオジエステル（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｓ－）、チオノカルバメート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）－Ｓ－）；シロキサン（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）；およびＮ，Ｎ＊－ジメチルヒドラジン（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３））が挙げられる。ある特定の実施形態において、キラル原子を有する核酸間連結は、ラセミ混合物として、別々のエナンチオマー、例えば、アルキルホスホネートおよびホスホロチオエートとして、製造することができる。非天然核酸は、単一の修飾を含有することができる。非天然核酸は、１つの部分内に、または異なる部分の間に、複数の修飾を含有することができる。
核酸に対する主鎖のホスフェートの修飾としては、限定されるものではないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート（架橋または非架橋）、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、ホスホジチオエートおよびボラノホスフェートが挙げられ、任意の組み合わせで使用することができる。他の非ホスフェート連結を使用することもできる。
いくつかの実施形態において、主鎖の修飾（例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびホスホロジチオエートのヌクレオチド間連結）は、修飾された核酸における免疫調節活性を付与することができ、および／またはインビボでのそれらの安定性を増強することができる。
いくつかの例において、リン誘導体（または修飾されたホスフェート基）は、糖または糖アナログ部分に結合し、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどであることができる。修飾されたホスフェート連結または非ホスフェート連結を含有する例示的なポリヌクレオチドは、Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４巻：１８４１～１８４８頁；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４巻：２３１８～２３２３頁；およびＳｃｈｕｌｔｚら、（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４巻：２９６６～２９７３頁；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、１９９７、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ：ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ」ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ、（ＣｈａｄｗｉｃｋおよびＣａｒｄｅｗ編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｚｏｎ、１９９３、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ」ｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１６５～１９０頁；Ｍｉｌｌｅｒら、１９７１、ＪＡＣＳ ９３巻：６６５７～６６６５頁；Ｊａｇｅｒら、１９８８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７巻：７２４７～７２４６頁；Ｎｅｌｓｏｎら、１９９７、ＪＯＣ ６２巻：７２７８～７２８７頁；米国特許第５，４５３，４９６号；ならびにＭｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ、２００１、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８巻：１１５７～１１７９頁に見ることができる。
いくつかの場合において、主鎖の修飾は、アニオン性、中性またはカチオン性基などの代替部分でホスホジエステル連結を置き換えることを含む。そのような修飾の例としては、アニオン性ヌクレオシド間連結；Ｎ３’－Ｐ５’ホスホルアミデート修飾；ボラノホスフェートＤＮＡ；プロオリゴヌクレオチド；中性ヌクレオシド間連結、例えば、メチルホスホネート；アミド連結ＤＮＡ；メチレン（メチルイミノ）連結；ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール連結；スルホニル基を含有する主鎖；モルホリノオリゴ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；ならびに正に荷電したデオキシリボ核酸グアニジン（ＤＮＧ）オリゴ（Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ、２００１、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８巻：１１５７～１１７９頁）が挙げられる。修飾された核酸は、１つまたはそれ以上の修飾、例えば、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート連結の組み合わせなどのホスフェート連結の組み合わせを含むキメラまたは混合主鎖を含むことができる。
ホスフェートについての代替物としては、例えば、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、または１つもしくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環のヌクレオシド間連結が挙げられる。これらとしては、モルホリノ連結を有するもの（一部分において、ヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有する他のものが挙げられる。多数の米国特許が、これらの種類のホスフェート置き換えの作製方法および使用方法を開示しており、限定されるものではないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が挙げられる。ヌクレオチド代替物において、ヌクレオチドの糖およびホスフェート部分の両方を、例えば、アミド型連結（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置き換えることができることも理解される。米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子の作製方法および使用方法を教示しており、そのそれぞれは、参照によって本明細書に組み入れられる。Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４巻、１４９７～１５００頁も参照されたい。例えば、細胞の取り込みを増強するために、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに他の種類の分子を連結する（コンジュゲートする）ことも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に連結することができる。そのようなコンジュゲートとしては、限定されるものではないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６巻、６５５３～６５５６頁）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４、４巻、１０５３～１０６０頁）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．ＫＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０巻、３０６～３０９頁；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３、３巻、２７６５～２７７０頁）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２、２０巻、５３３～５３８頁）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭ５ＯＪ、１９９１、１０巻、１１１１～１１１８頁；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９巻、３２７～３３０頁；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５巻、４９～５４頁）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウムｌ－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－Ｓ－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６巻、３６５１～３６５４頁；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０、１８巻、３７７７～３７８３頁）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４巻、９６９～９７３頁）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６巻、３６５１～３６５４頁）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４巻、２２９～２３７頁）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７巻、９２３～９３７）が挙げられる。多数の米国特許が、そのようなコンジュゲートの製造を教示しており、限定されるものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号が挙げられる。
非天然アミノ酸のタンパク質への複製、転写、翻訳および組み込みのための組成物ならびに方法において使用される核酸塩基を本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸塩基は、構造：
Figure 2022552271000011
 ［式中、それぞれのＸは、独立して、炭素または窒素であり；Ｒ２は、任意であり、存在する場合、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノまたはアジド基であり；それぞれのＹは、独立して、硫黄、酸素、セレンまたは第二級アミンであり；それぞれのＥは、独立して、酸素、硫黄またはセレンであり；波線は、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシルもしくはジデオキシリボシル部分、またはそれらのアナログは、遊離形態であるか、場合によりα－チオトリホスフェート、β－チオトリホスフェートもしくはγ－チオトリホスフェート基を含むモノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェート基に接続されるか、あるいはＲＮＡもしくはＤＮＡ中、またはＲＮＡアナログもしくはＤＮＡアナログ中に含まれる］を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、低級アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ６）、水素またはハロゲンである。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、Ｒ２は、フルオロである。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、Ｘは、炭素である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、Ｅは、硫黄である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、Ｙは、硫黄である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、構造：
Figure 2022552271000012
 を有する。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、Ｅは、硫黄であり、Ｙは、硫黄である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、波線は、リボシルまたはデオキシリボシル部分との結合点を示す。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、波線は、トリホスフェート基に接続されるリボシルまたはデオキシリボシル部分との結合点を示す。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸ポリマーの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ｔＲＮＡの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ｔＲＮＡ中のアンチコドンの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ｍＲＮＡの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ｍＲＮＡのコドンの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ＲＮＡまたはＤＮＡの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、ＤＮＡ中のコドンの構成成分である。本明細書に記載の核酸塩基のいくつかの実施形態において、核酸塩基は、別の相補的な核酸塩基との核酸塩基対を形成する。
核酸の塩基対形成性
いくつかの実施形態において、非天然ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡへの組み込みの間またはその後に、別の非天然ヌクレオチドと塩基対（非天然塩基対；ＵＢＰ）を形成する。いくつかの実施形態において、安定に組み込まれた非天然核酸は、別の核酸、例えば、天然または非天然核酸と塩基対を形成することができる非天然核酸である。いくつかの実施形態において、安定に組み込まれた非天然核酸は、別の非天然核酸と塩基対（非天然核酸塩基対（ＵＢＰ））を形成することができる非天然核酸である。例えば、第１の非天然核酸は、第２の非天然核酸と塩基対を形成することができる。例えば、核酸への組み込みの間、またはその後に塩基対形成することができる非天然ヌクレオシド三リン酸の１つの対としては、（ｄ）５ＳＩＣＳのトリホスフェート（（ｄ）５ＳＩＣＳＴＰ）および（ｄ）ＮａＭのトリホスフェート（（ｄ）ＮａＭＴＰ）が挙げられる。他の例としては、限定されるものではないが、（ｄ）ＣＮＭＯのトリホスフェート（（ｄ）ＣＮＭＯＴＰ）および（ｄ）ＴＰＴ３のトリホスフェート（（ｄ）ＴＰＴ３ＴＰ）が挙げられる。そのような非天然ヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボース糖部分（「（ｄ）」によって示される）を有することができる。例えば、核酸に組み込まれる場合に塩基対形成することができる非天然ヌクレオシド三リン酸の１つの対としては、ＴＡＴ１のトリホスフェート（ＴＡＴ１ＴＰ）およびＮａＭのトリホスフェート（ＮａＭＴＰ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸に組み込まれる場合に塩基対形成することができる非天然ヌクレオシド三リン酸の１つの対としては、ｄＣＮＭＯのトリホスフェート（ｄＣＮＭＯＴＰ）およびＴＡＴ１のトリホスフェート（ＴＡＴ１ＴＰ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸に組み込まれる場合に塩基対形成することができる非天然ヌクレオシド三リン酸の１つの対としては、ｄＴＰＴ３のトリホスフェート（ｄＴＰＴ３ＴＰ）およびＮａＭのトリホスフェート（ＮａＭＴＰ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、非天然核酸は、実質的に、天然核酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）と塩基対を形成しない。いくつかの実施形態において、安定に組み込まれた非天然核酸は、天然核酸と塩基対を形成することができる。
いくつかの実施形態において、安定に組み込まれた非天然（デオキシ）リボヌクレオチドは、ＵＢＰを形成することができる非天然（デオキシ）リボヌクレオチドであるが、実質的に、それぞれの天然（デオキシ）リボヌクレオチドのいずれかと塩基対を形成しない。いくつかの実施形態において、安定に組み込まれた非天然（デオキシ）リボヌクレオチドは、ＵＢＰを形成することができる非天然（デオキシ）リボヌクレオチドであるが、実質的に、１つまたはそれ以上の天然核酸と塩基対を形成しない。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ａ、ＴおよびＣと塩基対を形成することができないが、Ｇと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ａ、ＴおよびＧと塩基対を形成することができないが、Ｃと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ｃ、ＧおよびＡと塩基対を形成することができないが、Ｔと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ｃ、ＧおよびＴと塩基対を形成することができないが、Ａと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＡおよびＴと塩基対を形成することができないが、ＣおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＡおよびＣと塩基対を形成することができないが、ＴおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＡおよびＧと塩基対を形成することができないが、ＣおよびＴと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＣおよびＴと塩基対を形成することができないが、ＡおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＣおよびＧと塩基対を形成することができないが、ＴおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、ＴおよびＧと塩基対を形成することができないが、ＡおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ｇと塩基対を形成することができないが、Ａ、ＴおよびＣと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ａと塩基対を形成することができないが、Ｇ、ＴおよびＣと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ｔと塩基対を形成することができないが、Ｇ、ＡおよびＣと塩基対を形成することができる。例えば、安定に組み込まれた非天然核酸は、実質的に、Ｃと塩基対を形成することができないが、Ｇ、ＴおよびＡと塩基対を形成することができる。
例示的には、インビボでの条件下で、非天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基対（ＵＢＰ）を形成することができる非天然ヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、５ＳＩＣＳ、ｄ５ＳＩＣＳ、ＮａＭ、ｄＮａＭ、ｄＴＰＴ３、ｄＭＴＭＯ、ｄＣＮＭＯ、ＴＡＴ１、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、非天然ヌクレオチド塩基対としては、限定されるものではないが、
Figure 2022552271000013
 が挙げられる。
操作された生物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法およびプラスミドは、工学操作された生物、例えば、非天然ヌクレオチドまたは非天然核酸塩基対（ＵＢＰ）を組み込んで複製し、非天然ヌクレオチドを含有する核酸を使用して、少なくとも１つの非天然アミノ酸残基を含有する非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質を翻訳するために使用されるｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを転写することもできる生物を生成するためにさらに使用される。場合によっては、非天然アミノ酸残基は、非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に部位特異的に組み込まれる。いくつかの例において、生物は、非ヒト半合成生物（ＳＳＯ）である。いくつかの例において、生物は、半合成生物（ＳＳＯ）である。いくつかの例において、ＳＳＯは、細胞である。いくつかの例において、インビボの方法は、半合成生物（ＳＳＯ）を含む。いくつかの例において、半合成生物は、微生物を含む。いくつかの例において、生物は、細菌を含む。いくつかの例において、生物は、グラム陰性細菌を含む。いくつかの例において、生物は、グラム陽性細菌を含む。いくつかの例において、生物は、大腸菌を含む。そのような改変された生物は、ＤＮＡ修復機構、改変されたポリメラーゼ、ヌクレオチド輸送体、または他の構成成分などの追加の構成成分を、さまざまに含む。いくつかの例において、ＳＳＯは、大腸菌株ＹＺ３を含む。いくつかの例において、ＳＳＯは、大腸菌株ＭＬ１またはＭＬ２、例えばＬｅｄｂｅｔｔｅｒら、Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８、１４０巻（２号）、７５８頁の図１（Ｂ～Ｄ）に記載の株を含む。場合によっては、ＳＳＯは細胞系である。場合によっては、細胞系は不死化細胞系である。いくつかの例において、細胞系は一次細胞を含む。いくつかの例において、細胞系は幹細胞を含む。いくつかの例において、ＳＳＯはオルガノイドである。
いくつかの例において、用いられる細胞は、異種タンパク質、例えば、非天然ヌクレオシド三リン酸を細胞に輸送することができるヌクレオシド三リン酸輸送体、および場合により非天然ヌクレオチドを欠くＤＮＡを排除するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系をコードする発現カセットで遺伝的に形質転換される（例えば、大腸菌株ＹＺ３、ＭＬ１またはＭＬ２）。いくつかの例において、細胞は、非天然核酸の取り込みのための増強された活性をさらに含む。いくつかの場合において、細胞は、非天然核酸の移入のための増強された活性をさらに含む。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９および適切なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、別々のプラスミド上でコードされる。いくつかの例において、ＣＡＳ９およびｓｇＲＮＡは、同じプラスミド上でコードされる。いくつかの場合において、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡをコードする核酸分子、または非天然ヌクレオチドを含む核酸分子は、１つまたはそれ以上のプラスミド上に位置する。いくつかの例において、Ｃａｓ９は、第１のプラスミド上でコードされ、ｓｇＲＮＡ、および非天然ヌクレオチドを含む核酸分子は、第２のプラスミド上でコードされる。いくつかの例において、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、および非天然ヌクレオチドを含む核酸分子は、同じプラスミド上でコードされる。いくつかの例において、核酸分子は、２つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、Ｃａｓ９は、宿主生物のゲノムに組み込まれ、ｓｇＲＮＡは、プラスミド上、または生物のゲノム中でコードされる。
いくつかの例において、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡをコードする第１のプラスミド、ならびに非天然ヌクレオチドを含む核酸分子をコードする第２のプラスミドは、操作された微生物に導入される。いくつかの例において、Ｃａｓ９をコードする第１のプラスミド、ならびにｓｇＲＮＡ、および非天然ヌクレオチドを含む核酸分子をコードする第２のプラスミドは、操作された微生物に導入される。いくつかの例において、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、および非天然ヌクレオチドを含む核酸分子をコードするプラスミドは、操作された微生物に導入される。いくつかの例において、核酸分子は、２つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、そのＤＮＡ（プラスミドまたはゲノム）内に少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む少なくとも１つの非天然核酸分子を組み込まれた生細胞が、作製される。場合によっては、少なくとも１つの非天然核酸分子は、１、２、３、４またはそれより多くのＵＢＰを含む。いくつかの例において、少なくとも１つの非天然核酸分子はプラスミドである。場合によっては、少なくとも１つの非天然核酸分子は、細胞のゲノムに組み入れられる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然核酸分子は、非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質をコードする。場合によっては、少なくとも１つの非天然核酸分子は、転写されてｍＲＮＡの非天然コドンおよびｔＲＮＡの非天然アンチコドンを与える。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然核酸分子は非天然ＤＮＡ分子である。
いくつかの例において、非天然塩基対は、それらのそれぞれのトリホスフェートとしての非天然相互塩基対形成ヌクレオチドが、ヌクレオチド三リン酸輸送体の作用によって細胞に取り込まれる場合、インビボの条件下で非天然塩基対を形成することができる非天然相互塩基対形成ヌクレオチドの対を含む。細胞は、ヌクレオチド三リン酸輸送体が発現し、非天然ヌクレオチドの細胞への輸送が利用可能であるように、ヌクレオチド三リン酸輸送体をコードする発現カセットによって、遺伝的に形質転換することができる。細胞は、原核細胞または真核細胞であり、非天然相互塩基対形成ヌクレオチドの対は、それらのそれぞれのトリホスフェートとして、ｄＴＰＴ３のトリホスフェート（ｄＴＰ３ＴＰ）およびｄＮａＭのトリホスフェート（ｄＮａＭＴＰ）またはｄＣＮＭＯのトリホスフェート（ｄＣＮＭＯＴＰ）であることができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、核酸、例えば、そのような非天然ヌクレオチドを細胞に輸送することができるヌクレオチド三リン酸輸送体をコードする発現カセットで、遺伝的に形質転換される細胞である。細胞は、異種ヌクレオシド三リン酸輸送体を含むことができ、ここで、異種ヌクレオシド三リン酸輸送体は、天然および非天然ヌクレオシド三リン酸を細胞に輸送することができる。
いくつかの場合において、本明細書に記載の方法は、遺伝的に形質転換された細胞を、リン酸カリウムおよび／またはホスファターゼもしくはヌクレオチダーゼの阻害剤の存在下でそれぞれのトリホスフェートと接触させる工程も含む。そのような接触の間、またはその後、細胞は、細胞の増殖および複製に好適な生命維持培地内に置くことができる。細胞は、非天然ヌクレオチドのそれぞれのトリホスフェート形態が、細胞の少なくとも１つの複製サイクルを通して細胞内の核酸に組み込まれるように、生命維持培地中で維持することができる。非天然相互塩基対形成ヌクレオチドの対は、それぞれのトリホスフェートとして、ｄＴＰＴ３のトリホスフェート（ｄＴＰＴ３ＴＰ）およびｄＣＮＭＯまたはｄＮａＭのトリホスフェート（ｄＣＮＯＭまたはｄＮａＭＴＰ）を含むことができ、細胞は、大腸菌であり、ｄＴＰＴ３ＴＰおよびｄＮａＭＴＰは、輸送体ＰｔＮＴＴ２によって大腸菌に移入することができ、Ｐｏｌ ＩＩＩまたはＰｏｌ ＩＩなどの大腸菌ポリメラーゼは、非天然トリホスフェートを使用して、ＵＢＰを含有するＤＮＡを複製し、それにより非天然ヌクレオチドおよび／または非天然塩基対を細胞環境内の細胞の核酸に組み込むことができる。さらに、リボヌクレオチド、例えばＮａＭＴＰおよびＴＡＴ１ＴＰ、５ＦＭＴＰおよびＴＰＴ３ＴＰは、いくつかの例において輸送体ＰｔＮＴＴ２によって大腸菌に移入される。いくつかの例において、リボヌクレオチドを移入するためのＰｔＮＴＴ２はトランケーションされたＰｔＮＴＴ２であり、ここでトランケーションされたＰｔＮＴＴ２は、トランケーションされないＰｔＮＴＴ２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。トランケーションされないＰｔＮＴＴ２（ＮＣＢＩ受託番号ＥＥＣ４９２２７．１、ＧＩ：２１７４０９２９５）の例は、以下のアミノ酸配列（配列番号１）を有する：
1 MRPYPTIALI SVFLSAATRI SATSSHQASA LPVKKGTHVP
41 DSPKLSKLYI MAKTKSVSSS FDPPRGGSTV APTTPLATGG
81 ALRKVRQAVF PIYGNQEVTK FLLIGSIKFF IILALTLTRD
121 TKDTLIVTQC GAEAIAFLKI YGVLPAATAF IALYSKMSNA
161 MGKKMLFYST CIPFFTFFGL FDVFIYPNAE RLHPSLEAVQ
201 AILPGGAASG GMAVLAKIAT HWTSALFYVM AEIYSSVSVG
241 LLFWQFANDV VNVDQAKRFY PLFAQMSGLA PVLAGQYVVR
281 FASKAVNFEA SMHRLTAAVT FAGIMICIFY QLSSSYVERT
321 ESAKPAADNE QSIKPKKKKP KMSMVESGKF LASSQYLRLI
361 AMLVLGYGLS INFTEIMWKS LVKKQYPDPL DYQRFMGNFS
401 SAVGLSTCIV IFFGVHVIRL LGWKVGALAT PGIMAILALP
441 FFACILLGLD SPARLEIAVI FGTIQSLLSK TSKYALFDPT
481 TQMAYIPLDD ESKVKGKAAI DVLGSRIGKS GGSLIQQGLV
521 FVFGNIINAA PVVGVVYYSV LVAWMSAAGR LSGLFQAQTE
561 MDKADKMEAK TNKEK
３つまたはそれ以上の非天然塩基対形成ヌクレオチドの使用を含む組成物および方法を本明細書に記載する。そのような塩基対形成ヌクレオチドは、いくつかの場合において、ヌクレオチド輸送体の使用により、または当技術分野において公知の標準的な核酸形質転換法（例えば、エレクトロポレーション、化学的形質転換または他の方法）により、細胞に入る。いくつかの場合において、塩基対形成非天然ヌクレオチドは、プラスミドなどのポリヌクレオチドの一部として、細胞に入る。ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の一部として細胞に入る１つまたはそれ以上の塩基対形成非天然ヌクレオチドは、それ自身がインビボで複製される必要はない。例えば、第１の非天然塩基対を形成するように構成された塩基を有する第１の非天然デオキシリボヌクレオチドおよび第２の非天然デオキシリボヌクレオチドを含む二本鎖ＤＮＡプラスミドまたは他の核酸は、細胞にエレクトロポレーションされる。細胞培地は、互いに第２の非天然塩基対を形成するように構成された塩基を有する第３の非天然デオキシリボヌクレオチド、第４の非天然デオキシリボヌクレオチドで処理され、ここで、第１の非天然デオキシリボヌクレオチドの塩基および第３の非天然デオキシリボヌクレオチドの塩基は、第２の非天然塩基対を形成し、第２の非天然デオキシリボヌクレオチドの塩基および第４の非天然デオキシリボヌクレオチドの塩基は、第３の非天然塩基対を形成する。いくつかの例において、当初に形質転換された二本鎖ＤＮＡプラスミドのインビボ複製は、その後、第３の非天然デオキシリボヌクレオチドおよび第４の非天然デオキシリボヌクレオチドを含む複製されたプラスミドをもたらす。あるいは、または組み合わせて、第３の非天然デオキシリボヌクレオチドおよび第４の非天然デオキシリボヌクレオチドのリボヌクレオチドのバリアントは、細胞培地に添加される。これらのリボヌクレオチドは、いくつかの例において、ｍＲＮＡまたはｔＲＮＡなどのＲＮＡに組み込まれる。いくつかの例において、第１、第２、第３および第４のデオキシヌクレオチドは、異なる塩基を含む。いくつかの例において、第１、第３および第４のデオキシヌクレオチドは、異なる塩基を含む。いくつかの例において、第１および第３のデオキシヌクレオチドは、同じ塩基を含む。
本開示の方法の実施によって、当業者は、個々の細胞の少なくともいくつかの内で維持される少なくとも１つの核酸内に、少なくとも１つの非天然ヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を有する、生きており、増殖する細胞の集団を得ることができ、ここで、少なくとも１つの核酸は、細胞内で安定に伝播され、細胞は、生物の増殖および複製に好適な生命維持培地中で非天然ヌクレオチドと接触させた（例えば、その存在下で増殖させた）場合に、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドのトリホスフェート形態の細胞取り込みを提供するために好適なヌクレオチド三リン酸輸送体を発現する。
ヌクレオチド三リン酸輸送体による細胞への輸送後、非天然塩基対形成ヌクレオチドは、細胞機構、例えば、細胞自身のＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡポリメラーゼ、異種ポリメラーゼ、または指向進化を使用して進化したポリメラーゼにより細胞内の核酸に組み込まれる（Ｃｈｅｎ Ｔ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ ＦＥ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１４年１月２１日；５８８巻（２号）：２１９～２９頁；Ｂｅｔｚ Ｋら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１３年１２月１１日；１３５巻（４９号）：１８６３７～４３頁）。非天然ヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、構造ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および自己複製核酸（例えば、プラスミド、ウイルスまたはベクター）などの細胞核酸に組み込むことができる。
場合によっては、遺伝子操作された細胞は、細胞への核酸、例えば異種核酸の導入によって作製される。いくつかの例において、細胞に導入される核酸はプラスミドの形態である。場合によっては、細胞に導入される核酸は、細胞のゲノムに組み入れられる。本明細書に記載の任意の細胞は、宿主細胞であり、発現ベクターを含むことができる。一実施形態において、宿主細胞は、原核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、大腸菌である。いくつかの実施形態において、細胞は、１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含む。核酸試薬は、さまざまな技法を使用して、微生物に導入することができる。さまざまな生物に異種核酸を導入するために使用される方法の非限定的な例としては、形質転換、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、超音波媒介形質転換、コンジュゲーション、微粒子銃などが挙げられる。いくつかの例において、担体分子の付加（例えば、ビス－ベンゾイミダゾリル化合物、例えば、米国特許第５，５９５，８９９号を参照されたい）は、典型的には、従来の方法によって形質転換することが困難であると考えられる細胞におけるＤＮＡの取り込みを増加させることができる。形質転換の従来の方法は、当業者には容易に利用可能であり、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．において見ることができる。
いくつかの例において、遺伝的形質転換は、限定されるものではないが、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドおよび人工染色体における発現カセットの直接導入を使用して、または細胞中の遺伝子材料もしくはカチオン性リポソームなどの担体の導入を介して、得られる。そのような方法は、当技術分野において利用可能であり、本明細書に記載の方法における使用のために容易に適合可能である。導入ベクターは、遺伝子を細胞に送達するために使用される任意のヌクレオチド構築物（例えばプラスミド）であるか、または遺伝子を送達する一般的戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルスもしくはアデノウイルスの一部としてである（Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３巻：８３～８８頁、（１９９３））。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、またはエレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散などの物理機械的方法を含む、トランスフェクションのための適切な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻、１４６５～１４６８頁、（１９９０）；および、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻、８１５～８１８頁、（１９９１）に記載されている。
例えば、ヌクレオシド三リン酸輸送体もしくはポリメラーゼ発現カセットをコードするＤＮＡ、および／またはベクターは、限定されるものではないが、カルシウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、微粒子銃などを含む任意の方法によって、細胞に導入することができる。
いくつかの場合において、細胞は、細胞内の１つまたはそれ以上の核酸に組み込まれた非天然ヌクレオシド三リン酸を含む。例えば、細胞は、細胞内に維持されたＤＮＡまたはＲＮＡ内の少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを組み込むことができる生細胞である。細胞は、非天然相互塩基対形成ヌクレオチドの対を含む少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を、インビボ条件下で細胞内の核酸に組み込むこともでき、ここで、非天然相互塩基対形成ヌクレオチド、例えば、それらのそれぞれのトリホスフェートは、ヌクレオシド三リン酸輸送体の作用によって細胞に取り込まれ、遺伝子は、遺伝的形質転換によって細胞に存在する（例えば、導入された）。例えば、細胞内に維持された核酸への組み込みの際に、ｄＴＰＴ３およびｄＣＮＭＯは、例えば、ｄＴＰＴ３ＴＰおよびｄＣＮＭＯＴＰを含む生命維持培地中で増殖する場合に、生物のＤＮＡ複製機構によって安定に伝播される安定な非天然塩基対を形成することができる。
いくつかの場合において、細胞は、非天然ヌクレオチドを含有する核酸を複製することができる。そのような方法としては、インビボ条件下で、それぞれのトリホスフェートとして、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを細胞に輸送することができるヌクレオシド三リン酸輸送体をコードする発現カセットで細胞を遺伝的に形質転換することを含むことができる。あるいは、コードされたヌクレオシド三リン酸輸送体を発現することができる発現カセットで、以前に遺伝的に形質転換された細胞を利用することができる。方法はまた、細胞の増殖および複製のために好適な生命維持培地中で、遺伝的に形質転換された細胞を、リン酸カリウムおよび少なくとも１つの非天然ヌクレオチド（例えば、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成することができる２つの相互塩基対形成ヌクレオチド）のそれぞれのトリホスフェート形態に接触または曝露する工程、ならびにインビボ条件下、細胞の少なくとも１つの複製サイクルにより、少なくとも１つの非天然ヌクレオチド（例えば、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成することができる２つの相互塩基対形成ヌクレオチド）のそれぞれのトリホスフェート形態の存在下、生命維持培地中で形質転換された細胞を維持する工程を含むことができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、安定に組み込まれた非天然核酸を含む。いくつかの実施形態は、細胞内で維持された核酸内のＡ、Ｇ、ＴおよびＣ以外のヌクレオチドを安定に組み込む細胞（例えば大腸菌として）を含む。例えば、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣ以外のヌクレオチドは、ｄ５ＳＩＣＳ、ｄＣＮＭＯ、ｄＮａＭおよび／またはｄＴＰＴ３であり、細胞の核酸への組み込みの際に、核酸内で安定な非天然塩基対を形成することができる。一態様において、非天然ヌクレオチドおよび非天然塩基対は、三リン酸輸送体についての遺伝子で形質転換された生物が、リン酸カリウム、ならびにｄ５ＳＩＣＳ、ｄＮａＭ、ｄＣＮＭＯおよび／またはｄＴＰＴ３のトリホスフェート形態を含む、生命維持培地中で増殖する場合に、生物の複製装置によって安定に伝播される。
いくつかの場合において、細胞は、拡張された遺伝子アルファベットを含む。細胞は、安定に組み込まれた非天然核酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、別の非天然ヌクレオチドと対形成することができる非天然ヌクレオチドを含有する非天然核酸を含む。いくつかの実施形態において、拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、別の核酸に水素結合する非天然核酸を含む。いくつかの実施形態において、拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、塩基対形成された別の核酸に水素結合していない非天然核酸を含む。いくつかの実施形態において、拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、疎水性および／またはパッキング相互作用を介して、核酸塩基または別の非天然ヌクレオチドと塩基対形成する核酸塩基を有する非天然ヌクレオチドを含有する非天然核酸を含む。いくつかの実施形態において、拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、非水素結合相互作用を介して、別の核酸と塩基対形成する非天然核酸を含む。拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、相同核酸をコピーして、非天然核酸を含む核酸を形成することができる細胞である。拡張された遺伝子アルファベットを有する細胞は、別の非天然核酸（非天然核酸塩基対（ＵＢＰ））と塩基対形成された非天然核酸を含む細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は、インビボ条件下、移入された非天然ヌクレオチドから非天然ＤＮＡ塩基対（ＵＢＰ）を形成する。いくつかの実施形態において、リン酸カリウムならびに／またはホスファターゼおよび／もしくはヌクレオチダーゼの阻害剤の活性は、非天然ヌクレオチドの輸送を促進することができる。方法は、異種ヌクレオシド三リン酸輸送体を発現する細胞の使用を含む。そのような細胞が１つまたはそれ以上のヌクレオシド三リン酸と接触する場合、ヌクレオシド三リン酸は、細胞に輸送される。細胞は、リン酸カリウムならびに／またはホスファターゼおよびヌクレオチダーゼの阻害剤の存在下である。非天然ヌクレオシド三リン酸は、細胞の自然機構（すなわち、ポリメラーゼ）によって、細胞内の核酸に組み込むことができ、例えば、相互塩基対形成して細胞の核酸内の非天然塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、非天然塩基を持つＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドの間で形成される。
いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、非天然トリホスフェートに曝露された場合に、細胞または細胞の集団に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、実質的に常に、非天然トリホスフェートに曝露された場合に、細胞または細胞の集団に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、細胞における異種遺伝子、例えば、ヌクレオシド三リン酸輸送体（ＮＴＴ）の発現の誘導は、異種遺伝子の発現の誘導なしの細胞における１つまたはそれ以上の非天然トリホスフェートの増殖および取り込みと比較して、より遅い細胞増殖、および増加した非天然トリホスフェートの取り込みをもたらすことができる。取り込みは、拡散、浸透により、または輸送体の作用を介してなどの、細胞へのヌクレオチドの輸送を様々に含む。いくつかの実施形態において、細胞における異種遺伝子、例えば、ＮＴＴの発現の誘導は、異種遺伝子の発現の誘導なしの細胞の増殖および取り込みと比較して、増加した細胞増殖、および増加した非天然核酸の取り込みをもたらすことができる。
いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、対数増殖期の間に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、非対数増殖期の間に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、実質的に線形増殖期の間に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＵＢＰは、期間にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込まれる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５もしくは５０、またはそれ以上の複製にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間の増殖にわって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１日の増殖にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２か月の増殖にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０年の増殖にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定に組み込むことができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、ＲＮＡポリメラーゼをさらに利用して、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含有するｍＲＮＡを生じさせる。いくつかの例において、細胞は、ポリメラーゼをさらに利用して、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含むアンチコドンを含有するｔＲＮＡを生じさせる。いくつかの例において、ｔＲＮＡは、非天然アミノ酸でチャージされる。いくつかの例において、ｔＲＮＡの非天然アンチコドンは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含有する非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質が合成されるように、翻訳の間にｍＲＮＡの非天然コドンと対になる。
天然および非天然アミノ酸
本明細書で使用される場合、アミノ酸残基とは、アミノ基およびカルボキシル基の両方を含む分子を指してもよい。適切なアミノ酸としては、限定するものではないが、天然に存在するアミノ酸のＤ異性体およびＬ異性体の両方、ならびに有機合成または任意の他の方法によって調製された天然には存在しないアミノ酸が挙げられる。本明細書で使用される用語アミノ酸としては、限定するものではないが、α－アミノ酸、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸アナログが挙げられる。
「α－アミノ酸」という用語は、α－炭素と呼ばれる、炭素に結合したアミノ基およびカルボキシル基の両方を含む分子を指してもよい。例えば：
Figure 2022552271000014
「β－アミノ酸」という用語は、β配置のアミノ基とカルボキシル基の両方を含む分子を指すことができる。
「天然に存在するアミノ酸」とは、自然界で合成されたペプチドに一般的に見出される２０のアミノ酸のうちのいずれか１つを指し得、一文字の略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶとして知られる。
次の表は、天然アミノ酸の特性の要約を示している。
Figure 2022552271000015
「疎水性アミノ酸」としては、小さい疎水性アミノ酸および大きい疎水性アミノ酸が挙げられる。「小さい疎水性アミノ酸」とは、グリシン、アラニン、プロリン、およびそれらのアナログであってもよい。「大きい疎水性アミノ酸」とは、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびそれらのアナログであってもよい。「極性アミノ酸」とは、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、およびそれらのアナログであってもよい。「荷電アミノ酸」は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタメート、およびそれらのアナログであってもよい。
「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸に構造的に類似しており、ペプチド模倣大環状分子の形成においてアミノ酸の代わりになり得る分子であり得る。アミノ酸アナログとしては、限定するものではないが、βアミノ酸およびアミノ酸であって、アミノ基またはカルボキシ基が同様に反応性の基で置換されているもの（例えば、第一級アミンの第二級もしくは第三級アミンによる置換、またはカルボキシ基のエステルによる置換）が挙げられる。
「非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）」または「非天然アミノ酸」とは、自然界で合成されたペプチドに一般的に見られる２０個のアミノ酸のうちの１つではないアミノ酸であり得、１文字の略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶで知られている。ある場合には、非天然アミノ酸は、非標準アミノ酸のサブセットである。
アミノ酸アナログは、β－アミノ酸アナログを含み得る。β－アミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：環状βアミノ酸アナログ；β－アラニン；（Ｒ）－β－フェニルアラニン；（Ｒ）－１，２，３，４－テトラヒドロ－イソキノリン－３－酢酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（１－ナフチル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２，４－ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－クロロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－シアノフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－フルオロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－フリル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－メチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－ナフチル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－チエニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（２－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３，４－ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３，４－ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－ベンゾチエニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－クロロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－シアノフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－フルオロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－メチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－ピリジル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－チエニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（３－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ブロモフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－クロロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－シアノフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ヨードフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－メチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ニトロフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－ピリジル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－（４－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－４－ペンタフルオロ－フェニル酪酸；（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキセン酸；（Ｒ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸；（Ｒ）－３－アミノ－５－フェニルペンタン酸；（Ｒ）－３－アミノ－６－フェニル－５－ヘキセン酸；（Ｓ）－１，２，３，４－テトラヒドロ－イソキノリン－３－酢酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（１－ナフチル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２，４－ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－クロロフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－シアノフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－フルオロフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－フリル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－メチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－ナフチル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－チエニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（２－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３，４－ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３，４－ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－ベンゾチエニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－クロロフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－シアノフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－フルオロフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－メチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－ピリジル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－チエニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（３－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ブロモフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－クロロフェニル）酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－シアノフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ヨードフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－メチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ニトロフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－ピリジル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－（４－トリフルオロメチルフェニル）－酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－４－ペンタフルオロ－フェニル酪酸；（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキセン酸；（Ｓ）－３－アミノ－５－ヘキシン酸；（Ｓ）－３－アミノ－５－フェニルペンタン酸；（Ｓ）－３－アミノ－６－フェニル－５－ヘキセン酸；１，２，５，６－テトラヒドロピリジン－３－カルボン酸；１，２，５，６－テトラヒドロピリジン－４－カルボン酸；３－アミノ－３－（２－クロロフェニル）－プロピオン酸；３－アミノ－３－（２－チエニル）－プロピオン酸；３－アミノ－３－（３－ブロモフェニル）－プロピオン酸；３－アミノ－３－（４－クロロフェニル）－プロピオン酸；３－アミノ－３－（４－メトキシフェニル）－プロピオン酸；３－アミノ－４，４，４－トリフルオロ－酪酸；３－アミノアジピン酸；Ｄ－β－フェニルアラニン；β－ロイシン；Ｌ－β－ホモアラニン；Ｌ－β－ホモアスパラギン酸γ－ベンジルエステル；Ｌ－β－ホモグルタミン酸δ－ベンジルエステル；Ｌ－β－ホモイソロイシン；Ｌ－β－ホモロイシン；Ｌ－β－ホモメチオニン；Ｌ－β－ホモフェニルアラニン；Ｌ－β－ホモプロリン；Ｌ－β－ホモトリプトファン；Ｌ－β－ホモバリン；Ｌ－Ｎω－ベンジルオキシカルボニル－β－ホモリジン；Ｎω－Ｌ－β－ホモアルギニン；Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモヒドロキシプロリン；Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモセリン；Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモトレオニン；Ｏ－ベンジル－Ｌ－β－ホモチロシン；γ－トリチル－Ｌ－β－ホモアスパラギン；（Ｒ）－β－フェニルアラニン；Ｌ－β－ホモアスパラギン酸γ－ｔ－ブチルエステル；Ｌ－β－ホモグルタミン酸δ－ｔ－ブチルエステル；Ｌ－Ｎω－β－ホモリジン；Ｎδ－トリチル－Ｌ－β－ホモグルタミン；Ｎω－２，２，４，６，７－ペンタメチル－ジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル－Ｌ－β－ホモアルギニン；Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモヒドロキシ－プロリン；Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモセリン；Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモトレオニン；Ｏ－ｔ－ブチル－Ｌ－β－ホモチロシン；２－アミノシクロペンタンカルボン酸；および２－アミノシクロヘキサンカルボン酸。
アミノ酸アナログとしては、アラニン、バリン、グリシンまたはロイシンのアナログが挙げられ得る。アラニン、バリン、グリシン、およびロイシンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：α－メトキシグリシン；α－アリル－Ｌ－アラニン；α－アミノイソ酪酸；α－メチル－ロイシン；β－（１－ナフチル）－Ｄ－アラニン；β－（１－ナフチル）－Ｌ－アラニン；β－（２－ナフチル）－Ｄ－アラニン；β－（２－ナフチル）－Ｌ－アラニン；β－（２－ピリジル）－Ｄ－アラニン；β－（２－ピリジル）－Ｌ－アラニン；β－（２－チエニル）－Ｄ－アラニン；β－（２－チエニル）－Ｌ－アラニン；β－（３－ベンゾチエニル）－Ｄ－アラニン；β－（３－ベンゾチエニル）－Ｌ－アラニン；β－（３－ピリジル）－Ｄ－アラニン；β－（３－ピリジル）－Ｌ－アラニン；β－（４－ピリジル）－Ｄ－アラニン；β－（４－ピリジル）－Ｌ－アラニン；β－クロロ－Ｌ－アラニン；β－シアノ－Ｌ－アラニン；β－シクロヘキシル－Ｄ－アラニン；β－シクロヘキシル－Ｌ－アラニン；β－シクロペンテン－１－イル－アラニン；β－シクロペンチル－アラニン；β－シクロプロピル－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；β－ｔ－ブチル－Ｄ－アラニン；β－ｔ－ブチル－Ｌ－アラニン；γ－アミノ酪酸；Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；２，４－ジニトロフェニルグリシン；２，５－ジヒドロ－Ｄ－フェニルグリシン；２－アミノ－４，４，４－トリフルオロ酪酸；２－フルオロ－フェニルグリシン；３－アミノ－４，４，４－トリフルオロ－酪酸；３－フルオロバリン；４，４，４－トリフルオロバリン；４，５－デヒドロ－Ｌ－ｌｅｕ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；４－フルオロ－Ｄ－フェニルグリシン；４－フルオロ－Ｌ－フェニルグリシン；４－ヒドロキシ－Ｄ－フェニルグリシン；５，５，５－トリフルオロロイシン；６－アミノヘキサン酸；シクロペンチル－Ｄ－Ｇｌｙ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；シクロペンチル－Ｇｌｙ－ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ－α，β－ジアミノプロピオン酸；Ｄ－α－アミノ酪酸；Ｄ－α－ｔ－ブチルグリシン；Ｄ－（２－チエニル）グリシン；Ｄ－（３－チエニル）グリシン；Ｄ－２－アミノカプロン酸；Ｄ－２－インダニルグリシン；Ｄ－アリルグリシン－ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ－シクロヘキシルグリシン；Ｄ－ノルバリン；Ｄ－フェニルグリシン；β－アミノ酪酸；β－アミノイソ酪酸；（２－ブロモフェニル）グリシン；（２－メトキシフェニル）グリシン；（２－メチルフェニル）グリシン；（２－チアゾイル）グリシン；（２－チエニル）グリシン；２－アミノ－３－（ジメチルアミノ）－プロピオン酸；Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；Ｌ－α－アミノ酪酸；Ｌ－α－ｔ－ブチルグリシン；Ｌ－（３－チエニル）グリシン；Ｌ－２－アミノ－３－（ジメチルアミノ）－プロピオン酸；Ｌ－２－アミノカプロン酸ジシクロヘキシル－アンモニウム塩；Ｌ－２－インダニルグリシン；Ｌ－アリルグリシンジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｌ－シクロヘキシルグリシン；Ｌ－フェニルグリシン；Ｌ－プロパルギルグリシン；Ｌ－ノルバリン；Ｎ－α－アミノメチル－Ｌ－アラニン；Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸；Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸；β－シクロプロピル－Ｌ－アラニン；（Ｎ－β－（２，４－ジニトロフェニル））－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；（Ｎ－β－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｄ－α，β－ジアミノプロピオン酸；（Ｎ－β－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；（Ｎ－β－４－メチルトリチル）－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；（Ｎ－β－アリルオキシカルボニル）－Ｌ－α，β－ジアミノプロピオン酸；（Ｎ－γ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸；（Ｎ－γ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸；（Ｎ－γ－４－メチルトリチル）－Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸；（Ｎ－γ－４－メチルトリチル）－Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸；（Ｎ－γ－アリルオキシカルボニル）－Ｌ－α，γ－ジアミノ酪酸；Ｄ－α，γ－ジアミノ酪酸；４，５－デヒドロ－Ｌ－ロイシン；シクロペンチル－Ｄ－Ｇｌｙ－ＯＨ；シクロペンチル－Ｇｌｙ－ＯＨ；Ｄ－アリルグリシン；Ｄ－ホモシクロヘキシルアラニン；Ｌ－１－ピレニルアラニン；Ｌ－２－アミノカプロン酸；Ｌ－アリルグリシン；Ｌ－ホモシクロヘキシルアラニン；およびＮ－（２－ヒドロキシ－４－メトキシ－Ｂｚｌ）－Ｇｌｙ－ＯＨ。
アミノ酸アナログとしては、アルギニンまたはリジンのアナログが挙げられ得る。アルギニンおよびリジンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：シトルリン；Ｌ－２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸；Ｌ－２－アミノ－３－ウレイドプロピオン酸；Ｌ－シトルリン；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２－ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｎ３）－ＯＨ；Ｎδ－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－オルニチン；Ｎω－ニトロ－Ｄ－アルギニン；Ｎω－ニトロ－Ｌ－アルギニン；α－メチルオルニチン；２，６－ジアミノヘプタンジオン酸；Ｌ－オルニチン；（Ｎδ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソ－シクロヘキサ－１－イリデン）エチル）－Ｄ－オルニチン；（Ｎδ－１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソ－シクロヘキセン－１－イリデン）エチル）－Ｌ－オルニチン；（Ｎδ－４－メチルトリチル）－Ｄ－オルニチン；（Ｎδ－４－メチルトリチル）－Ｌ－オルニチン；Ｄ－オルニチン；Ｌ－オルニチン；Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）－ＯＨ；Ａｒｇ（Ｍｅ）２－ＯＨ（非対称）；Ａｒｇ（Ｍｅ）２－ＯＨ（対称）；Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）－ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２－ＯＨ．ＨＣｌ；Ｌｙｓ（Ｍｅ３）－ＯＨクロリド；Ｎω－ニトロ－Ｄ－アルギニン；およびＮω－ニトロ－Ｌ－アルギニン。
アミノ酸アナログとしては、アスパラギン酸またはグルタミン酸のアナログが挙げられ得る。アスパラギン酸およびグルタミン酸のアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：α－メチル－Ｄ－アスパラギン酸；α－メチル－グルタミン酸；α－メチル－Ｌ－アスパラギン酸；γ－メチレン－グルタミン酸；（Ｎ－γ－エチル）－Ｌ－グルタミン；［Ｎ－α－（４－アミノベンゾイル）］－Ｌ－グルタミン酸；２，６－ジアミノピメリン酸；Ｌ－α－アミノスベリン酸；Ｄ－２－アミノアジピン酸；Ｄ－α－アミノスベリン酸；α－アミノピメリン酸；イミノ二酢酸；Ｌ－２－アミノアジピン酸；スレオ－β－メチル－アスパラギン酸；γ－カルボキシ－Ｄ－グルタミン酸γ，γ－ジ－ｔ－ブチルエステル；γ－カルボキシ－Ｌ－グルタミン酸γ，γ－ジ－ｔ－ブチルエステル；Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）－ＯＨ；Ｌ－Ａｓｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ；およびピログルタミン酸。
アミノ酸アナログは、システインおよびメチオニンのアナログを含み得る。システインおよびメチオニンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、Ｃｙｓ（ファルネシル）－ＯＨ、Ｃｙｓ（ファルネシル）－ＯＭｅ、α－メチル－メチオニン、Ｃｙｓ（２－ヒドロキシエチル）－ＯＨ、Ｃｙｓ（３－アミノプロピル）－ＯＨ、２－アミノ－４－（エチルチオ）酪酸、ブチオニン、ブチオニンスルホキシミン、エチオニン、メチオニンメチルスルホニウムクロリド、セレノメチオニン、システイン酸、［２－（４－ピリジル）エチル］－ＤＬ－ペニシラミン、［２－（４－ピリジル）エチル］－Ｌ－システイン、４－メトキシベンジル－Ｄ－ペニシラミン、４－メトキシベンジル－Ｌ－ペニシラミン、４－メチルベンジル－Ｄ－ペニシラミン、４－メチルベンジル－Ｌ－ペニシラミン、ベンジル－Ｄ－システイン、ベンジル－Ｌ－システイン、ベンジル－ＤＬ－ホモシステイン、カルバモイル－Ｌ－システイン、カルボキシエチル－Ｌ－システイン、カルボキシメチル－Ｌ－システイン、ジフェニルメチル－Ｌ－システイン、エチル－Ｌ－システイン、メチル－Ｌ－システイン、ｔ－ブチル－Ｄ－システイン、トリチル－Ｌ－ホモシステイン、トリチル－Ｄ－ペニシラミン、シスタチオニン、ホモシスチン、Ｌ－ホモシスチン、（２－アミノエチル）－Ｌ－システイン、セレノ－Ｌ－シスチン、シスタチオニン、Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ、およびアセトアミドメチル－Ｄ－ペニシラミンが挙げられる。
アミノ酸アナログとしては、フェニルアラニンおよびチロシンのアナログが挙げられ得る。フェニルアラニンおよびチロシンのアミノ酸アナログの例としては、β－メチル－フェニルアラニン、β－ヒドロキシフェニルアラニン、α－メチル－３－メトキシ－ＤＬ－フェニルアラニン、α－メチル－Ｄ－フェニルアラニン、α－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、２，４－ジクロロ－フェニルアラニン、２－（トリフルオロメチル）－Ｄ－フェニルアラニン、２－（トリフルオロメチル）－Ｌ－フェニルアラニン、２－ブロモ－Ｄ－フェニルアラニン、２－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、２－クロロ－Ｄ－フェニルアラニン、２－クロロ－Ｌ－フェニルアラニン、２－シアノ－Ｄ－フェニルアラニン、２－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、２－フルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、２－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、２－メチル－Ｄ－フェニルアラニン、２－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、２－ニトロ－Ｄ－フェニルアラニン、２－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、２，４，５－トリヒドロキシ－フェニルアラニン、３，４，５－トリフルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、３，４，５－トリフルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジクロロ－Ｄ－フェニルアラニン、３，４－ジクロロ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジフルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、３，４－ジフルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジヒドロキシ－Ｌ－フェニルアラニン、３，４－ジメトキシ－Ｌ－フェニルアラニン、３，５，３’－トリヨード－Ｌ－チロニン、３，５－ジヨード－Ｄ－チロシン、３，５－ジヨード－Ｌ－チロシン、３，５－ジヨード－Ｌ－チロニン、３－（トリフルオロメチル）－Ｄ－フェニルアラニン、３－（トリフルオロメチル）－Ｌ－フェニルアラニン、３－アミノ－Ｌ－チロシン、３－ブロモ－Ｄ－フェニルアラニン、３－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、３－クロロ－Ｄ－フェニルアラニン、３－クロロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－クロロ－Ｌ－チロシン、３－シアノ－Ｄ－フェニルアラニン、３－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、３－フルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、３－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－フルオロ－チロシン、３－ヨード－Ｄ－フェニルアラニン、３－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、３－ヨード－Ｌ－チロシン、３－メトキシ－Ｌ－チロシン、３－メチル－Ｄ－フェニルアラニン、３－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｄ－フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、３－ニトロ－Ｌ－チロシン、４－（トリフルオロメチル）－Ｄ－フェニルアラニン、４－（トリフルオロメチル）－Ｌ－フェニルアラニン、４－アミノ－Ｄ－フェニルアラニン、４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ベンゾイル－Ｄ－フェニルアラニン、４－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、４－ビス（２－クロロエチル）アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｄ－フェニルアラニン、４－ブロモ－Ｌ－フェニルアラニン、４－クロロ－Ｄ－フェニルアラニン、４－クロロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｄ－フェニルアラニン、４－シアノ－Ｌ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｄ－フェニルアラニン、４－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｄ－フェニルアラニン、４－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、チロキシン、３，３－ジフェニルアラニン、チロニン、エチル－チロシン、およびメチルチロシンが挙げられる。
アミノ酸アナログとしては、プロリンのアナログが挙げられ得る。プロリンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、３，４－デヒドロ－プロリン、４－フルオロ－プロリン、シス－４－ヒドロキシ－プロリン、チアゾリジン－２－カルボン酸、およびトランス－４－フルオロ－プロリンが挙げられる。
アミノ酸アナログとしては、セリンおよびトレオニンのアナログが挙げられ得る。セリンおよびトレオニンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、３－アミノ－２－ヒドロキシ－５－メチルヘキサン酸、２－アミノ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタン酸、２－アミノ－３－エトキシブタン酸、２－アミノ－３－メトキシブタン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン酸、２－アミノ－３－ベンジルオキシプロピオン酸、２－アミノ－３－ベンジルオキシプロピオン酸、２－アミノ－３－エトキシプロピオン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸、およびα－メチルセリンが挙げられる。
アミノ酸アナログとしては、トリプトファンのアナログが挙げられ得る。トリプトファンのアミノ酸アナログの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：α－メチル－トリプトファン；β－（３－ベンゾチエニル）－Ｄ－アラニン；β－（３－ベンゾチエニル）－Ｌ－アラニン；１－メチル－トリプトファン；４－メチル－トリプトファン；５－ベンジルオキシ－トリプトファン；５－ブロモ－トリプトファン；５－クロロ－トリプトファン；５－フルオロ－トリプトファン；５－ヒドロキシトリプトファン；５－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファン；５－メトキシ－トリプトファン；５－メトキシ－Ｌ－トリプトファン；５－メチル－トリプトファン；６－ブロモ－トリプトファン；６－クロロ－Ｄ－トリプトファン；６－クロロ－トリプトファン；６－フルオロ－トリプトファン；６－メチル－トリプトファン；７－ベンジルオキシ－トリプトファン；７－ブロモ－トリプトファン；７－メチル－トリプトファン；Ｄ－１，２，３，４－テトラヒドロ－ノルハルマン－３－カルボン酸；６－メトキシ－１，２，３，４－テトラヒドロノルハルマン－１－カルボン酸；７－アザトリプトファン；Ｌ－１，２，３，４－テトラヒドロ－ノルハルマン－３－カルボン酸；５－メトキシ－２－メチル－トリプトファン；および６－クロロ－Ｌ－トリプトファン。
アミノ酸アナログはラセミ体であってもよい。場合によっては、アミノ酸アナログのＤ異性体が使用される。場合によっては、アミノ酸アナログのＬ異性体が用いられる。場合によっては、アミノ酸アナログは、ＲまたはＳ配置にあるキラル中心を含む。時には、β－アミノ酸アナログのアミノ基は、保護基、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ基）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、トシルなどで置換される。時には、β－アミノ酸アナログのカルボン酸官能基は、例えば、そのエステル誘導体として保護されている。場合によっては、アミノ酸アナログの塩が使用される。
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｌｉｕ Ｃ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｐ．Ｇ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０，７９，４１３に記載される非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｎ６（２－アジドエトキシ）－カルボニル－Ｌ－リジンを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸残基（例えば、タンパク質内）は、コンジュゲート部分に結合する前に、非天然アミノ酸に変異される。場合によっては、非天然アミノ酸への変異は、免疫系の自己抗原応答を防止または最小化する。本明細書で使用される場合、「非天然アミノ酸」という用語は、タンパク質中に天然に存在する２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を指す。非天然アミノ酸の非限定的な例としては、以下が挙げられる：ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－メトキシフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン ｐ－アジド－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ボロノフェニルアラニン、Ｏ－プロパルギルチロシン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、セレノシステイン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｎ６－（プロパルギルオキシ）－カルボニル－Ｌ－リジン（Ｐｒｋ）、アジド－リジン（Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン、ＡｚＫ）、Ｎ６－（（（２－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ６－（（（３－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、およびＮ６－（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、チロシンアミノ酸の非天然アナログ；グルタミンアミノ酸の非天然アナログ；フェニルアラニンアミノ酸の非天然アナログ；セリンアミノ酸の非天然アナログ；トレオニンアミノ酸の非天然アナログ；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸塩、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノ置換アミノ酸、またはそれらの組み合わせ；光活性化可能な架橋剤を有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージおよび／または光異性化可能なアミノ酸；アミノ酸を含むビオチンまたはビオチンアナログ；アミノ酸を含むケト；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に切断可能なまたは光切断可能なアミノ酸；細長い側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素結合糖含有アミノ酸；酸化還元活性アミノ酸；α－ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，α二置換アミノ酸；β－アミノ酸；プロリンまたはヒスチジン以外の環状アミノ酸、およびフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファン以外の芳香族アミノ酸。
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、選択的反応性基、または標的タンパク質もしくはポリペプチドの部位選択的標識のための反応性基を含む。場合によっては、化学反応は、双直交反応（例えば、生体適合性および選択的反応）である。場合によっては、化学反応は、Ｃｕ（Ｉ）触媒または「銅を含まない」アルキンアジドトリアゾール形成反応、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション、逆電子要求Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ（ＩＥＤＤＡ）反応、「フォトクリック」化学、またはオレフィンメタセシスおよび鈴木－宮浦または薗頭クロスカップリングなどの金属媒介プロセスである。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、例えば、ＵＶでの照射時に架橋する光反応性基を含む。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、光ケージアミノ酸を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、パラ置換、メタ置換、またはオルト置換アミノ酸誘導体である。
場合によっては、非天然アミノ酸は、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、ｐ－メトキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、またはイソプロピル－Ｌ－フェニルアラニンを含む。
場合によっては、非天然アミノ酸は、３－アミノチロシン、３－ニトロチロシン、３，４－ジヒドロキシ－フェニルアラニン、または３－ヨードチロシンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、フェニルセレノシステインである。場合によっては、非天然アミノ酸は、ベンゾフェノン、ケトン、ヨウ化物、メトキシ、アセチル、ベンゾイル、またはアジド（フェニルアラニン誘導体を含む）である。場合によっては、非天然アミノ酸は、ベンゾフェノン、ケトン、ヨウ化物、メトキシ、アセチル、ベンゾイル、またはアジド含有リジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸は、芳香族側鎖を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、芳香族側鎖を含まない。場合によっては、非天然アミノ酸は、アジド基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、マイケルアクセプター基を含む。場合によっては、マイケル受容体基は、１，２－付加反応を介して共有結合を形成し得る不飽和部分を含む。場合によっては、マイケルアクセプター基は、電子不足のアルケンまたはアルキンを含む。場合によっては、マイケルアクセプター基としては、限定するものではないが、アルファ、ベータ不飽和：ケトン、アルデヒド、スルホキシド、スルホン、ニトリル、イミン、または芳香族が挙げられる。場合によっては、非天然アミノ酸は、デヒドロアラニンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、アルデヒドまたはケトン基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、アルデヒドまたはケトン基を含むリジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸は、ベータ、ガンマ、またはデルタ位置に１つまたはそれ以上のＯ、Ｎ、Ｓｅ、またはＳ原子を含むリジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸は、ガンマ位置にＯ、Ｎ、Ｓｅ、またはＳ原子を含むリジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸は、イプシロンＮ原子が酸素原子で置き換えられているリジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸は、天然には存在しない翻訳後修飾されたリジンであるリジン誘導体である。
場合によっては、非天然アミノ酸は、側鎖を含むアミノ酸であり、アルファ位置から６番目の原子は、カルボニル基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は側鎖を含むアミノ酸であり、アルファ位置から６番目の原子はカルボニル基を含み、アルファ位置から５番目の原子は窒素である。場合によっては、非天然アミノ酸は側鎖を含むアミノ酸であり、アルファ位置から７番目の原子は酸素原子である。
場合によっては、非天然アミノ酸は、セレンを含むセリン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸はセレノセリン（２－アミノ－３－ヒドロセレノプロパン酸）である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸はセレンを含み、セレンの酸化は、アルケンを含む非天然アミノ酸の形成をもたらす。
場合によっては、非天然アミノ酸はシクロオクチニル基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸はトランスシクロクテニル基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸はノルボルネニル基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、シクロプロペニル基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、ジアジリン基を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、テトラジン基を含む。
場合によっては、非天然アミノ酸は、側鎖窒素がカルバミル化されているリジン誘導体である。場合によっては、非天然アミノ酸はリジン誘導体であり、側鎖窒素がアシル化されている。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－Ｂｏｃ－Ｎ６－メチルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－アセチルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、ピロリシンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－トリフルオロアセチルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（ｐ－ヨードベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（ｐ－ニトロベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－プロリルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（シクロペンタンカルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（テトラヒドロフラン－２－カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（３－エチニルテトラヒドロフラン－２－カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（プロパ－２－イン－１－イルオキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（２－アジドシクロペンチルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（２－アジドエトキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（２－ニトロベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－｛［（２－シクロオクチニルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（２－アミノブタ－３－イノイル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－６－（（２－アミノブタ－３－イノイル）オキシ）ヘキサン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（アリルオキシカルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（ブテニル－４－オキシカルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（ペンテニル－５－オキシカルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（ブタ－３－イン－１－イルオキシ）カルボニル）－リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（ペンタ－４－イン－１－イルオキシ）カルボニル）－リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（チアゾリジン－４－カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－８－オキソノナン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、２－アミノ－８－オキソオクタン酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（２－オキソアセチル）リジンである。いくつかの例において、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（（２－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンである。いくつかの例において、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（（３－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンである。いくつかの例において、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンである。
場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－プロピオニルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－ブチリルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（ブタ－２－エノイル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－イルオキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（スピロ［２．３］ヘキサ－１－エン－５－イルメトキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（（４－（１－（トリフルオロメチル）シクロプロパ－２－エン－１－イル）ベンジル）オキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－５－エン－２－イルメトキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、システイニルリジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エトキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（２－（３－メチル－３Ｈ－ジアジリン－３－イル）エトキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（３－（３－メチル－３Ｈ－ジアジリン－３－イル）プロポキシ）カルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（メタニトロベニルオキシ）Ｎ６－メチルカルボニル）リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメトキシ）カルボニル）－リジンである。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｎ６－（（シクロヘプタ－３－エン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンである。
いくつかの例において、非天然アミノ酸は、２－アミノ－３－（（（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）メチル）セラニル）プロパン酸である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、再利用されたアンバー、オパールまたはオーカーの終止コドンによって非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、４塩基コドンによって非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、再利用された稀なセンスコドンによってタンパク質に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、非天然ヌクレオチドを含む非天然コドンによって非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に組み込まれる。
場合によっては、タンパク質への非天然アミノ酸の取り込みは、直交する改変されたシンテターゼ／ｔＲＮＡの対によって媒介される。そのような直交性対は、非天然ｔＲＮＡに特定の非天然アミノ酸をチャージし得る天然または変異シンテターゼを含み、一方で、しばしばａ）他の内因性アミノ酸または代替の非天然アミノ酸の非天然ｔＲＮＡへのチャージおよびｂ）任意の他の（内因性を含む）ｔＲＮＡのチャージを最小限にする。このような直交性の対は、内因性シンテターゼによって他の内因性アミノ酸がチャージされるのを避けながら、シンテターゼによってチャージされ得るｔＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、そのような対は、細菌、酵母、古細菌、またはヒト源などの様々な生物から同定される。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼ／ｔＲＮＡの対は、単一の生物由来の構成成分を含む。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼ／ｔＲＮＡ対は、２つの異なる生物由来の構成成分を含む。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼ／ｔＲＮＡ対は、修飾の前に、異なるアミノ酸の翻訳を促進する構成成分を含む。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたアラニンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたアルギニンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたアスパラギンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたアスパラギン酸シンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたシステインシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたグルタミンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたグルタミン酸シンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたアラニングリシンである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたヒスチジンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたロイシンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたイソロイシンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたリジンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたメチオニンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたフェニルアラニンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたプロリンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたセリンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたトレオニンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたトリプトファンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたチロシンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたバリンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性シンテターゼは、改変されたホスホセリンシンテターゼである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたアラニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたアルギニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたアスパラギンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたアスパラギン酸ｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたシステインｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたグルタミンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたグルタミン酸ｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたアラニングリシンである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたヒスチジンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたロイシンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたイソロイシンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたリジンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたメチオニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたフェニルアラニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたプロリンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたセリンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたトレオニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたトリプトファンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたチロシンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたバリンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態では、直交性ｔＲＮＡは、改変されたホスホセリンｔＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、アミノアシル（ａａＲＳまたはＲＳ）－ｔＲＮＡシンテターゼｔＲＮＡ対によって非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に組み込まれる。例示的なａａＲＳ－ｔＲＮＡ対としては、限定するものではないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ－Ｔｙｒ）ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＴｙｒＲＳ変異体ｐＡｚＦＲＳ（ＭｊｐＡｚＦＲＳ）、大腸菌ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ－Ｔｙｒ）／Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｔＲＮＡＣＵＡ対、大腸菌ＬｅｕＲＳ（Ｅｃ－Ｌｅｕ）／Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｔＲＮＡＣＵＡ対およびピロリシル－ｔＲＮＡ対が挙げられる。いくつかの例において、非天然アミノ酸は、Ｍｊ－ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ対によって非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に組み込まれる。Ｍｊ－ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ対によって組み込まれ得る例示的な非天然アミノ酸（ＵＡＡ）としては、限定するものではないが、パラ置換フェニルアラニン誘導体、例えばｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡｚＦ）、Ｎ６－（（（２－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ６－（（（３－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ６－（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、ｐ－アミノフェニルアラニンおよびｐ－メトキシフェニルアラニン；メタ置換チロシン誘導体、例えば３－アミノチロシン、３－ニトロチロシン、３，４－ジヒドロキシフェニルアラニンおよび３－ヨードチロシン；フェニルセレノシステイン；ｐ－ボロノフェニルアラニン；ならびにｏ－ニトロベンジルチロシンが挙げられる。
いくつかの例において、非天然アミノ酸は、Ｅｃ－Ｔｙｒ／ｔＲＮＡＣＵＡまたはＥｃ－Ｌｅｕ／ｔＲＮＡＣＵＡ対によって非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に組み込まれる。Ｅｃ－Ｔｙｒ／ｔＲＮＡＣＵＡまたはＥｃ－Ｌｅｕ／ｔＲＮＡＣＵＡ対によって組み込まれ得る例示的なＵＡＡとしては、限定するものではないが、ベンゾフェノン、ケトン、ヨウ化物またはアジド置換基を含むフェニルアラニン誘導体；Ｏ－プロパルギルチロシン；α－アミノカプリン酸、Ｏ－メチルチロシン、Ｏ－ニトロベンジルシステイン；および３－（ナフタレン－２－イルアミノ）－２－アミノプロパン酸が挙げられる。
いくつかの例において、非天然アミノ酸は、ピロリシル－ｔＲＮＡ対によって非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に組み込まれる。場合によっては、ＰｙｌＲＳは古細菌種から、例えばメタン生成古細菌から得ることができる。場合によっては、ＰｙｌＲＳはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉまたはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓから得ることができる。場合によっては、ＰｙｌＲＳはキメラＰｙｌＲＳであってよい。ピロリシル－ｔＲＮＡ対によって組み込まれ得る例示的なＵＡＡとしては、限定するものではないが、アミドおよびカルバメート置換リジン、例えばＮ６－（２－アジドエトキシ）－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－（（（２－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ６－（（（３－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ６－（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、２－アミノ－６－（（Ｒ）－テトラヒドロフラン－２－カルボキシアミド）ヘキサン酸、Ｎ－ε－Ｄ－プロリル－Ｌ－リジンおよびＮ－ε－シクロペンチルオキシカルボニル－Ｌ－リジン；Ｎ－ε－アクリロイル－Ｌ－リジン；Ｎ－ε－［（１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エトキシ）カルボニル］－Ｌ－リジン；ならびにＮ－ε－（１－メチルシクロプロ－２－エネカルボキサミド）リジンが挙げられる。
場合によっては、本明細書に記載される組成物および方法は、少なくとも２つの非天然アミノ酸を非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に組み込むために少なくとも２つのｔＲＮＡシンテターゼを使用することを含む。場合によっては、少なくとも２つのｔＲＮＡシンテターゼは同じであっても異なってもよい。場合によっては、少なくとも２つの非天然アミノ酸は同じであっても異なってもよい。いくつかの例において、非天然ポリペプチドに組み込まれる少なくとも２つの非天然アミノ酸は異なる。いくつかの例において、少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸は、非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に部位特異的に組み込むことができる。
いくつかの例において、非天然アミノ酸は、米国特許第９，９８８，６１９号および米国特許第９，９３８，５１６号に開示されるシンテターゼによって本明細書に記載される非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に組み込むことができる。そのようなシンテターゼによって組み込むことができる例示的なＵＡＡとしては、パラ－メチルアジド－Ｌ－フェニルアラニン、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアラルキル非天然アミノ酸などが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのようなＵＡＡは、ピリジル、ピラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チオフェニル、または他の複素環を含む。いくつかの実施形態におけるそのようなアミノ酸は、アジド、テトラジン、または水溶性部分などのカップリングパートナーにコンジュゲーションし得る他の化学基を含む。いくつかの実施形態では、そのようなシンテターゼは、インビボでタンパク質にＵＡＡを組み込むために発現され、使用される。いくつかの実施形態では、そのようなシンテターゼは、無細胞翻訳システムを使用して、ＵＡＡをタンパク質に組み込むために使用される。
いくつかの例において、非天然アミノ酸は、天然に存在するシンテターゼによって本明細書に記載される非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、１つまたはそれ以上のアミノ酸に対して栄養要求性である生物によって非天然ポリペプチドまたは非天然タンパク質に組み込まれる。いくつかの実施形態では、栄養要求性アミノ酸に対応するシンテターゼは、対応するｔＲＮＡに非天然アミノ酸をチャージし得る。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、セレノシステインまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、セレノメチオニンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、芳香族アミノ酸であり、芳香族アミノ酸は、ヨウ化物などのハロゲン化アリールを含む。実施形態では、非天然アミノ酸は、栄養要求性アミノ酸と構造的に類似している。
場合によっては、非天然アミノ酸は、図５ａに示される非天然アミノ酸を含む。
場合によっては、非天然アミノ酸は、リジンまたはフェニルアラニン誘導体またはアナログを含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、リジン誘導体またはリジンアナログを含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、ピロリシン（Ｐｙｌ）を含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、フェニルアラニン誘導体またはフェニルアラニンアナログを含む。場合によっては、非天然アミノ酸は、Ｗａｎらの「ピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ：通常の酵素であるが、優れた遺伝子コード拡張ツール（Ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ： ａｎ ｏｒｄｉｎａｒｙ ｅｎｚｙｍｅ ｂｕｔ ａｎ ｏｕｔｓｔａｎｄｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｔｏｏｌ）」，Ｂｉｏｃｈｅｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｅｔａ １８４４（６）：１０５９－４０７０（２０１４）に記載されている非天然アミノ酸である。場合によっては、非天然アミノ酸は、図５Ｂおよび図５Ｃに示される非天然アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、図５Ｄ～図５Ｇに示される非天然アミノ酸を含む。（Ｄｕｍａｓら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，６，５０－６９の表１から採用）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質に組み込まれた非天然アミノ酸は、米国特許第９，８４０，４９３号；米国特許第９，６８２，９３４号；米国特許出願公開第２０１７／０２６０１３７号；米国特許第９，９３８，５１６号；または米国特許出願公開第２０１８／００８６７３４号に開示されている。そのようなシンテターゼによって組み込まれ得る例示的なＵＡＡとしては、パラ－メチルアジド－Ｌ－フェニルアラニン、アラルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロアラルキル、ならびにリジン誘導体の非天然アミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、そのようなＵＡＡは、ピリジル、ピラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チオフェニル、または他の複素環を含む。いくつかの実施形態におけるそのようなアミノ酸は、アジド、テトラジン、または水溶性部分などのカップリングパートナーに結合し得る他の化学基を含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキルリンカーを介して芳香族部分に結合されたアジドを含む。いくつかの実施形態では、アルキルリンカーは、Ｃ１－Ｃ１０リンカーである。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキルリンカーを介して芳香族部分に結合されたテトラジンを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アミノ基を介して芳香族部分に結合されたテトラジンを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキルアミノ基を介して芳香族部分に結合されたテトラジンを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキル鎖を介してアミノ酸側鎖の末端窒素（例えば、リジン誘導体のＮ６、またはより短いアルキル側鎖を含む誘導体のＮ５、Ｎ４、もしくはＮ３）に結合したアジドを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキル鎖を介してアミノ酸側鎖の末端窒素に結合したテトラジンを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アルキルリンカーを介してアミドに結合されたアジドまたはテトラジンを含む。いくつかの実施形態では、ＵＡＡは、アジドまたはテトラジン含有カルバメートまたは３－アミノアラニン、セリン、リジン、またはそれらの誘導体のアミドである。いくつかの実施形態では、そのようなＵＡＡは、インビボでタンパク質に組み込まれる。いくつかの実施形態では、そのようなＵＡＡは、無細胞系のタンパク質に組み込まれる。
細胞型
いくつかの実施形態では、多くのタイプの細胞／微生物が、例えば、形質転換または遺伝子工学のために使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、原核生物または真核生物の細胞である。場合によっては、細胞は細菌細胞、真菌細胞、酵母または単細胞原生動物などの微生物である。他の場合では、細胞は、培養された動物、植物、またはヒトの細胞などの真核細胞である。追加の場合には、細胞は、植物または動物などの生物に存在する。
いくつかの実施形態では、操作された微生物は、単細胞生物であり、しばしば分裂および増殖し得る。微生物は、以下の特徴のうちの１つまたはそれ以上を含み得る：好気性、嫌気性、糸状、非糸状、一倍体、二倍体、栄養要求性および／または非栄養要求性。特定の実施形態では、操作された微生物は、原核生物の微生物（例えば、細菌）であり、特定の実施形態では、操作された微生物は、非原核生物の微生物である。いくつかの実施形態では、操作された微生物は、真核生物の微生物（例えば、酵母、真菌、アメーバ）である。いくつかの実施形態では、操作された微生物は真菌である。いくつかの実施形態では、操作された生物は酵母である。
任意の適切な酵母を、宿主微生物、操作された微生物、遺伝子改変生物、または異種もしくは改変ポリヌクレオチドの供給源として選択し得る。酵母としては、限定するものではないが、Ｙａｒｒｏｗｉａ酵母（例えば、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（以前はＣａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａとして分類されていた））、Ｃａｎｄｉｄａ酵母（例えば、Ｃ．ｒｅｖｋａｕｆｉ、Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ酵母（例えば、Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｕｓ、Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ酵母（例えば、Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ酵母、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ酵母（例えば、Ｔ．ｐｕｌｌａｎｓ、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、Ｐｉｃｈｉａ酵母（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、およびＬｉｐｏｍｙｃｅｓ酵母（例えば、Ｌ．ｓｔａｒｋｅｙｉｉ、Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）。いくつかの実施形態では、適切な酵母は、Ａｒａｃｈｎｉｏｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ａｕｘａｒｔｈｒｏｎ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｉｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｉｍ Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｙｍｎｏａｓｃｕｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｍｙｘｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ、Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、またはＹａｒｒｏｗｉａの属の酵母である。いくつかの実施形態では、適切な酵母は、Ａｒａｃｈｎｉｏｔｕｓ ｆｌａｖｏｌｕｔｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ａｕｘａｒｔｈｒｏｎ ｔｈａｘｔｅｒｉ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｆａｍａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌａｍｂｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｔｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｘｅｓｔｏｂｉｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｉｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ ｖａｒ． ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｍａｎｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｇｙｍｎｏａｓｃｕｓ ｄｕｇｗａｙｅｎｓｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｉｓｓｔａｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗａｌｔｉｉ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｍｙｘｏｔｒｉｃｈｕｍ ｄｅｆｌｅｘｕｍ、Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ ｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ ｔａｎｎｏｐｈｉｌｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、またはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（以前はＣａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａとして分類されていた）の種の酵母である。いくつかの実施形態では、酵母は、限定するものではないが、ＡＴＣＣ２０３６２、ＡＴＣＣ８８６２、ＡＴＣＣ１８９４４、ＡＴＣＣ２０２２８、ＡＴＣＣ７６９８２およびＬＧＡＭ Ｓ（７）１株（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ Ｓ．およびＡｇｇｅｌｉｓ Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３－９（２００２））を含むＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株である。特定の実施形態では、酵母は、カンジダ種（すなわち、カンジダ属）酵母である。任意の適切なカンジダ種を使用してもよく、および／または脂肪性ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）の生成のために遺伝子改変してもよい。いくつかの実施形態では、適切なカンジダ種としては、限定するものではないが、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｆａｍａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌａｍｂｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｔｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｘｅｓｔｏｂｉｉ、および本明細書に記載の任意の他のカンジダ種酵母が挙げられる。カンジダ種の株の非限定的な例としては、限定するものではないが、ｓＡＡ００１（ＡＴＣＣ２０３３６）、ｓＡＡ００２（ＡＴＣＣ２０９１３）、ｓＡＡ００３（ＡＴＣＣ２０９６２）、ｓＡＡ４９６（米国特許出願公開第２０１２／００７７２５２号）、ｓＡＡ１０６（米国特許出願公開第２０１２／００７７２５２号）、ＳＵ－２（ｕｒａ３－／ｕｒａ３－）、Ｈ５３４３（ベータ酸化ブロック；米国特許第５６４８２４７号）という株が挙げられる。カンジダ種由来の任意の適切な株酵母は、遺伝子組換えのための親株として利用され得る。
酵母の属、種、および菌株は、遺伝的内容が非常に密接に関連していることが多いため、区別、分類、および／または名前を付けるのが難しい場合がある。場合によっては、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａおよびＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの菌株を区別、分類、および／または命名することが困難であり得、場合によっては、同じ生物と見なされ得る。場合によっては、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉの様々な菌株を区別、分類、および／または命名することが難しい場合がある（例えば、Ａｒｉｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６，２５７－２６２（２０００））を参照のこと。ＡＴＣＣおよび他の商業的または学術的供給源から得られたいくつかのＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ株は、本明細書に記載の実施形態と同等かつ同等に適切であると見なされ得る。いくつかの実施形態では、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓおよびＣ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉのいくつかの親株は、名前のみが異なると見なされる。
任意の適切な真菌を、宿主微生物、操作された微生物、または異種ポリヌクレオチドの供給源として選択し得る。真菌の非限定的な例としては、限定するものではないが、アスペルギルス菌類（例えば、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｆｕｎｇｉ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｆｕｎｇｉおよびＲｈｉｚｏｐｕｓ ｆｕｎｇｉ（例えば、Ｒ．ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ、Ｒ．ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、真菌類は、Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ株であり、これには限定するものではないが、ＡＴＣＣ２４６９０株が挙げられ、および特定の実施形態では、真菌類は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ株であり、これには、限定するものではないが、ＡＴＣＣ３８１６３株が挙げられる。
任意の適切な原核生物を、宿主微生物、操作された微生物、または異種ポリヌクレオチドの供給源として選択し得る。グラム陰性菌またはグラム陽性菌を選択し得る。菌の例としては、限定するものではないが、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌、ノルカルディア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）菌、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）菌、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、株ＤＨ１０Ｂ、Ｓｔｂｌ２、ＤＨ５－アルファ、ＤＢ３、ＤＢ３．１）、ＤＢ４、ＤＢ５、ＪＤＰ６８２およびｃｃｄＡ－ｏｖｅｒ（例えば、米国出願番号０９／５１８，１８８））、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）菌、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）菌（例えば、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｓａｎｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌（例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）菌（例えば、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）が挙げられる。菌としては、また、限定するものではないが、光合成菌（例えば、緑色非硫黄菌（例えば、Ｃｈｏｒｏｆｌｅｘｕｓ菌（例えば、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ菌（例えば、Ｃ．ｇｉｇａｔｅｕｍ））、緑色硫黄菌（例えば、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ菌（例えば、Ｃ．ｌｉｍｉｃｏｌａ）、Ｐｅｌｏｄｉｃｔｙｏｎ菌（例えば、Ｐ．ｌｕｔｅｏｌｕｍ）、紫色硫黄菌（例えば、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）菌（例えば、Ｃ．ｏｋｅｎｉｉ））、および紫色非硫黄菌（例えば、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ菌（例えば、Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）菌（例えば、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、およびロドミクロビウム（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）菌（例えば、Ｒ．ｖａｎｅｌｌｉｉ））が挙げられる。
非微生物由来の細胞は、宿主微生物、操作された微生物、または異種ポリヌクレオチドの供給源として利用され得る。そのような細胞の例としては、限定するものではないが、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（例えば、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ（例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ（例えば、ハイ－ファイブ（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ）細胞）；線虫細胞（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ細胞）；鳥類細胞；両生類細胞（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ細胞）；爬虫類細胞；哺乳類細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶＥＲＯ、Ｃ１２７、ＢＨＫ、Ｐｅｒ－Ｃ６、Ｂｏｗｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａおよびＨｅＬａ細胞）；ならびに植物細胞（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｎｉｃｏｔａｎｉａ ｔａｂａｃｕｍ、Ｃｕｐｈｅａ ａｃｉｎｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｅｑｕｉｐｅｔａｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｖｉｇｅｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｖｉｇｅｒａ ｖａｒ． ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃｕｐｈｅａ ａｘｉｌｌｉｆｌｏｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｂａｈｉｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｂａｉｌｌｏｎｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｂｒａｃｈｙｐｏｄａ、Ｃｕｐｈｅａ ｂｕｓｔａｍａｎｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃａｌｃａｒａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｏｓｔｅｍｏｎ、Ｃｕｐｈｅａ ｃａｒｔｈａｇｅｎｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｃｉｒｃａｅｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｃｏｎｆｅｒｔｉｆｌｏｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃｏｒｄａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃｒａｓｓｉｆｌｏｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｃｙａｎｅａ、Ｃｕｐｈｅａ ｄｅｃａｎｄｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｄｉｓｐｅｒｍａ、Ｃｕｐｈｅａ ｅｐｉｌｏｂｉｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ｅｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｆｌａｖａ、Ｃｕｐｈｅａ ｆｌａｖｉｓｅｔｕｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｆｕｃｈｓｉｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ｇａｕｍｅｒｉ、Ｃｕｐｈｅａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｃｕｐｈｅａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ、Ｃｕｐｈｅａ ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ （Ｍｅｘｉｃａｎ－ｈｅａｔｈｅｒ）、Ｃｕｐｈｅａ ｈｙｓｓｏｐｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｉｇｎｅａ、Ｃｕｐｈｅａ ｉｎｇｒａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｊｏｒｕｌｌｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ、Ｃｕｐｈｅａ ｌｉｎａｒｉｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｌｌａｖｅａ、Ｃｕｐｈｅａ ｌｏｐｈｏｓｔｏｍａ、Ｃｕｐｈｅａ ｌｕｔｅａ、Ｃｕｐｈｅａ ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｍｅｌａｎｉｕｍ、Ｃｕｐｈｅａ ｍｅｌｖｉｌｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｍｉｃｒａｎｔｈａ、Ｃｕｐｈｅａ ｍｉｃｒｏｐｅｔａｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｍｉｍｕｌｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｎｉｔｉｄｕｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｐａｒｓｏｎｓｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ｐａｓｃｕｏｒｕｍ、Ｃｕｐｈｅａ ｐａｕｃｉｐｅｔａｌａ、Ｃｕｐｈｅａ ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｐｓｅｕｄｏｓｉｌｅｎｅ、Ｃｕｐｈｅａ ｐｓｅｕｄｏｖａｃｃｉｎｉｕｍ、Ｃｕｐｈｅａ ｐｕｌｃｈｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｒａｃｅｍｏｓａ、Ｃｕｐｈｅａ ｒｅｐｅｎｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓａｌｖａｄｏｒｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｃｈｕｍａｎｎｉｉ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｅｓｓｉｌｉｆｏｌｉａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｅｔｏｓａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｐｅｒｍａｃｏｃｅ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｐｌｅｎｄｉｄａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｐｌｅｎｄｉｄａ ｖａｒ． ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｔｒｉｇｕｌｏｓａ、Ｃｕｐｈｅａ ｓｕｂｕｌｉｇｅｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｔｅｌｅａｎｄｒａ、Ｃｕｐｈｅａ ｔｈｙｍｏｉｄｅｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｔｏｌｕｃａｎａ、Ｃｕｐｈｅａ ｕｒｅｎｓ、Ｃｕｐｈｅａ ｕｔｒｉｃｕｌｏｓａ、Ｃｕｐｈｅａ ｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ、Ｃｕｐｈｅａ ｗａｔｓｏｎｉａｎａ、Ｃｕｐｈｅａ ｗｒｉｇｈｔｉｉ、Ｃｕｐｈｅａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）が挙げられる。
宿主生物または異種ポリヌクレオチドの供給源として使用される微生物または細胞は市販されている。本明細書に記載の微生物および細胞、ならびに他の適切な微生物および細胞は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、および農業研究文化コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＮＲＲＬ；Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手可能である。宿主微生物および操作された微生物は、任意の適切な形態で提供され得る。例えば、そのような微生物は、液体培養または固体培養（例えば、寒天ベースの培地）で提供され得、これは、初代培養物であってもよいし、または１回またはそれ以上継代されていてもよい（例えば、希釈および培養されていてもよい）。微生物はまた、凍結形態または乾燥形態（例えば、凍結乾燥）で提供されてもよい。微生物は、任意の適切な濃度で提供されてもよい。
ポリメラーゼ
ポリメラーゼの特に有用な機能は、既存の核酸をテンプレートとして使用して、核酸鎖の重合を触媒することである。有用な他の機能は、本明細書の他のいずれかで説明されている。有用なポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
ポリメラーゼ非天然核酸の特異性、処理性、または他の特徴を改善する能力は、例えば、増幅、配列決定、標識、検出、クローニングなどを含む、非天然核酸の取り込みが望まれる様々な状況において非常に望ましい。
いくつかの例では、本明細書に開示されるのは、例えば、ＤＮＡ増幅中に、伸長するテンプレートコピーに非天然核酸を組み込むポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ポリメラーゼの活性部位が、活性部位への非天然核酸の立体侵入阻害を低減するように改変されるように改変され得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、非天然核酸の１つまたはそれ以上の非天然特徴との相補性を提供するように改変され得る。このようなポリメラーゼは、ＵＢＰを細胞に安定して組み込むために細胞内で発現されても、または操作されてもよい。したがって、本開示は、異種または組換えポリメラーゼを含む組成物、およびその使用方法を含む。
ポリメラーゼは、タンパク質工学に関係する方法を使用して改変され得る。例えば、分子モデリングは、結晶構造に基づいて実行され、変異を生じて標的活性を改変し得るポリメラーゼの位置を特定し得る。置換の標的として同定された残基は、Ｂｏｒｄｏら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１７：７２１－７２９（１９９１）およびＨａｙｅｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９９：１５９２６－１５９３１（２００２）に記載されているような、エネルギー最小化モデリング、ホモロジーモデリング、および／または保存的アミノ酸置換を使用して選択された残基で置換されてもよい。
任意の様々なポリメラーゼを、例えば、生物学的系から単離されたタンパク質ベースの酵素およびその機能的バリアントを含む、本明細書に記載の方法または組成物で使用し得る。以下に例示されるような特定のポリメラーゼへの言及は、他に示されない限り、その機能的バリアントを含むと理解されるであろう。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、改変された、または変異体のポリメラーゼである。
活性部位領域への非天然核酸の侵入の改善のための、および活性部位領域中の非天然ヌクレオチドと協調するための特徴を有するポリメラーゼも用いられ得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、改変されたヌクレオチド結合部位を有する。
いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である非天然核酸に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、天然核酸および／または修飾糖を含まない非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である修飾糖を含む非天然核酸に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、天然核酸および／または修飾された塩基を含まない非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である修飾された塩基を含む非天然核酸に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、三リン酸を含む核酸および／または三リン酸を含まない非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である三リン酸を含む非天然核酸に特異性を有する。例えば、修飾または野生型ポリメラーゼは、二リン酸もしくは一リン酸を含むか、またはリン酸を含まないか、またはそれらの組み合わせを有する非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である三リン酸を含む非天然核酸への特異性を有し得る。
いくつかの実施形態では、改変されたまたは野生型のポリメラーゼは、非天然核酸に対して緩和された特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、非天然核酸に対する特異性、および天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である天然核酸に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、修飾糖を含む非天然核酸に対する特異性、および天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である天然核酸に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、修飾された塩基を含む非天然核酸に対する特異性、および天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である天然核酸に対する特異性を有する。
エキソヌクレアーゼ活性の欠如は、野生型の特徴であるか、またはバリアントもしくは操作されたポリメラーゼによって付与される特徴であり得る。例えば、エキソマイナスクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントは、３’から５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を欠くクレノウフラグメントの変異バージョンである。
本開示の方法は、固有の３→５’のエキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を欠くか、または３→５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性が無効にされている（例えば、変異を通して）、任意のＤＮＡポリメラーゼの基質範囲を拡大するために使用され得る。ＤＮＡポリメラーゼの例としては、ｐｏｌＡ、ｐｏｌＢ（例えば、Ｐａｒｒｅｌ＆Ｌｏｅｂ、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ Ｂｉｏｌ ２００１を参照のこと）ｐｏｌＣ、ｐｏｌＤ、ｐｏｌＹ、ｐｏｌＸ、および逆転写酵素（ＲＴ）が挙げられるが、進化性で忠実度の高いポリメラーゼ（ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００４６４３）が好ましい。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたまたは野生型のポリメラーゼは、非天然核酸に対する３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたまたは野生型のポリメラーゼは、３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾または野生型ポリメラーゼは、天然核酸に対して３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有し、非天然核酸に対して３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている。
いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、天然核酸に対する野性型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である非天然核酸に対する３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、非天然核酸に対して３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有し、天然核酸に対する野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、天然核酸の３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、天然核酸に対して野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である天然核酸についての３’→５’のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、核酸からのそれらの解離速度に従って特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、１つまたはそれ以上の天然および非天然核酸に対して比較的低い解離速度を有する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、１つまたはそれ以上の天然および非天然核酸に対して比較的高い解離速度を有する。この解離速度は、ポリメラーゼの活性であって、本明細書に記載の方法において反応速度を調整するために調整され得る。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、特定の天然および／もしくは非天然核酸または天然および／もしくは非天然核酸のコレクションと共に使用されるとき、それらの忠実度に従って特徴付けられる。忠実度とは、一般に、核酸テンプレートのコピーを作製するときに、ポリメラーゼが伸長中の核酸鎖に正しい核酸を組み込む精度を指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、天然および非天然核酸が、例えば、等濃度で存在して、ポリメラーゼ鎖－テンプレート核酸バイナリー複合体の同じ部位で鎖合成を競合する場合、天然および非天然核酸の取り込みが正しい場合の、正しくない場合に対する比率として測定され得る。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、天然および非天然核酸の場合は（ｋｃａｔ／Ｋｍ）、および誤った天然および非天然核酸の場合は（ｋｃａｔ／Ｋｍ）という比率として算出され得る；ここで、ｋｃａｔおよびＫｍは、定常状態の酵素反応速度論におけるミカエリスメンテンパラメーターである（Ｆｅｒｓｈｔ，Ａ．Ｒ．（１９８５）Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、２ｎｄ ｅｄ．，ｐ３５０，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．（参照により本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、プルーフリーディング活性の有無にかかわらず、少なくとも約１００、１０００、１０，０００、１００，０００、または１×１０６の忠実度値を有する。
いくつかの実施形態では、天然の供給源またはそのバリアント由来のポリメラーゼは、特定の構造を有する非天然核酸の取り込みを検出するアッセイを使用してスクリーニングされる。一例では、ポリメラーゼは、非天然核酸またはＵＢＰ（例えば、ｄ５ＳＩＣＳＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄＴＰＴ３ＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ－ｄＴＰＴ３ＴＰ、またはｄ５ＳＩＣＳＴＰ－ｄＮａＭＴＰ ＵＢＰ）を組み込む能力についてスクリーニングしてもよい。野生型ポリメラーゼと比較して、非天然核酸に対して改変された特性を示すポリメラーゼ、例えば、異種ポリメラーゼを使用してもよい。例えば、改変された特性は、例えば、Ｋｍ、ｋｃａｔ、Ｖｍａｘ、非天然核酸（または天然に存在するヌクレオチド）の存在下でのポリメラーゼ処理性、非天然核酸存在下でのポリメラーゼによる平均テンプレート読み取り長、非天然核酸に対するポリメラーゼの特異性、非天然核酸の結合速度、産物（ピロリン酸、三リン酸など）の放出速度、分岐速度、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。一実施形態では、改変された特性は、非天然核酸については減少したＫｍであり、および／または非天然核酸については増加したｋｃａｔ／ＫｍまたはＶｍａｘ／Ｋｍである。同様に、ポリメラーゼは、任意選択で、野生型ポリメラーゼと比較して、非天然核酸の結合速度の増加、産物放出の速度の増加、および／または分岐速度の減少を有する。
同時に、ポリメラーゼは、天然核酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴを、伸長する核酸コピーに組み込み得る。例えば、ポリメラーゼは、任意選択で、対応する野生型ポリメラーゼよりも少なくとも約５％高い（例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％以上）天然核酸に対する比活性、および天然核酸の存在下での野生型ポリメラーゼに対して少なくとも５％高い（例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％以上）テンプレートの存在下での天然核酸による処理性を示す。必要に応じて、ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼに対して、少なくとも約５％高い（例えば、約５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％以上）天然に存在するヌクレオチドに対するｋｃａｔ／ＫｍまたはＶｍａｘ／Ｋｍを表す。
特定の構造の非天然核酸を組み込む能力を有し得る、本明細書で使用されるポリメラーゼはまた、指向進化アプローチを使用して生成されてもよい。核酸合成アッセイを使用して、様々な非天然核酸のいずれかに特異性を有するポリメラーゼバリアントをスクリーニングしてもよい。例えば、ポリメラーゼバリアントは、ＤＮＡテンプレートの非天然ヌクレオチドの反対側に非天然ヌクレオシド三リン酸を組み込む能力についてスクリーニングされ得る（例えば、ｄＣＮＭＯの反対側のｄＴＰＴ３ＴＰ、ｄＴＰＴ３の反対側のｄＣＮＭＯＴＰ、ｄＴＰＴ３の反対側のＮａＭＴＰ、またはｄＣＮＭＯもしくはｄＮａＭの反対側のＴＡＴ１ＴＰ）。いくつかの実施形態では、そのようなアッセイは、例えば、組換えポリメラーゼバリアントを使用するインビトロアッセイである。いくつかの実施形態では、そのようなアッセイは、例えば、細胞においてポリメラーゼバリアントを発現するインビボアッセイである。そのような指向進化技術を使用して、本明細書に記載の任意の非天然核酸に対する活性について、任意の適切なポリメラーゼのバリアントをスクリーニングし得る。場合によっては、本明細書で使用されるポリメラーゼは、非天然リボヌクレオチドをＲＮＡなどの核酸に組み込む能力を有する。例えば、ＮａＭまたはＴＡＴ１リボヌクレオチドは、本明細書に記載のポリメラーゼを使用して核酸に組み込まれる。
記載された組成物の修飾されたポリメラーゼは、任意選択で、改変されたか、および／または組換えのΦ２９型ＤＮＡポリメラーゼであり得る。任意選択で、ポリメラーゼは、改変および／または組換えΦ２９、Ｂ１０３、ＧＡ－１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ－１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ－５、Ｃｐ－７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、またはＬ１７ポリメラーゼであり得る。
記載された組成物の修飾されたポリメラーゼは、任意選択で改変および／または組換え原核生物ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）、ＤＮＡポリメラーゼＩＶ（Ｐｏｌ ＩＶ）、ＤＮＡポリメラーゼＶ（Ｐｏｌ Ｖ）であってもよい。いくつかの実施形態では、修飾されたポリメラーゼは、非指示的損傷ヌクレオチドにまたがってＤＮＡ合成を媒介するポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ（ｐｏｌＢ）、Ｐｏｌｌ ＩＶ（ｄｉｎＢ）、および／またはＰｏｌ Ｖ（ｕｍｕＣＤ）をコードする遺伝子は、操作された細胞、またはＳＳＯにおいて構成的に発現または過剰発現される。いくつかの実施形態では、Ｐｏｌ ＩＩの発現または過剰発現の増大は、操作された細胞、またはＳＳＯにおける非天然塩基対（ＵＢＰ）の保持の増大に寄与する。
本開示において一般的に有用な核酸ポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびそれらの変異型または改変型が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの特性は、とりわけ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ第２版、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）に詳細に記載されている。本開示において有用な公知の従来のＤＮＡポリメラーゼとしては、限定するものではないが、Ｐｙｒｏｃｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１、Ｇｅｎｅ，１０８：１，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｎｎｉｓｄａｅｌｓら、１９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０：１８６－８，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ １９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：７６６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ＳｔｅｎｅｓｈおよびＭｃＧｏｗａｎ，１９７７，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ４７５：３２）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴＩｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる、Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｒｅｓ，１９：４１９３，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ，１９９８ Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、１９７６，Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ，１２７：１５５０）、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ－３ ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ－３、特許出願ＷＯ０１３２８８７から）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ＧＢ－Ｄ（ＰＧＢ－Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる、Ｊｕｎｃｏｓａ－Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：８２０、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（好熱菌Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから；ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ，１９９８ Ｂｒａｚ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ，３１：１２３９；ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから）、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｅｃｏｍｔｅ ａｎｄ Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ、１９８３，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、１９８１、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、および古細菌ＤＰ１Ｉ／ＤＰ２ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｃａｎｎら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１４２５０）が挙げられる。中温性ポリメラーゼおよび好熱性ポリメラーゼの両方が企図されている。好熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、限定するものではないが、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９°Ｎｍ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＴｆＩ、Ｔｔｈ、ＴＩｉ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｖｅｎｔ（商標）およびＤｅｅｐＶｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ－３、ならびにそれらの変異体、バリアントおよび誘導体が挙げられる。３’エキソヌクレアーゼ欠損変異体であるポリメラーゼも企図されている。本開示において有用な逆転写酵素としては、限定するものではないが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ－Ｉ、ＨＴＬＶ－ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶおよび他のレトロウイルス由来の逆転写酵素が挙げられる（Ｌｅｖｉｎ，Ｃｅｌｌ ８８：５－８（１９９７）；Ｖｅｒｍａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．４７３：１－３８（１９７７）；Ｗｕら、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：２８９－３４７（１９７５）を参照のこと）。ポリメラーゼのさらなる例としては、限定するものではないが、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。Ｇａｒｄｎｅｒら（２００４）「ベントＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチドアナログ取り込みの比較速度論（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｅｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１２），１１８３４－１１８４２；ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ「古細菌ＤＮＡポリメラーゼにおけるヌクレオチド糖認識の決定因子（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｕｇａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ａｒｃｈａｅｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７（１２）２５４５－２５５３。）非好熱性生物から単離されたポリメラーゼは、熱不活性化され得る。例としては、ファージからのＤＮＡポリメラーゼがある。任意の様々な供給源由来のポリメラーゼを改変して、高温条件に対するそれらの耐性を増減し得ることが理解される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、好熱性であり得る。いくつかの実施形態では、好熱性ポリメラーゼは、熱不活性化可能であり得る。好熱性ポリメラーゼは、典型的には、高温条件またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術に使用される条件などの熱サイクル条件に有用である。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、Φ２９、Ｂ１０３、ＧＡ－１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ－１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ－５、Ｃｐ－７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、Ｌ１７、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９°Ｎｍ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、ＴｆＩ、Ｔｔｈ、ＴＩｉ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｖｅｎｔ（商標）およびＤｅｅｐＶｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ－３、Ｐｆｕ、Ｔａｑ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ－Ｄ、ＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、古細菌のＤＰ１Ｉ／ＤＰ２ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、９°Ｎ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９ ＤＮＡポリメラーゼ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、ならびにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素を含む。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ（またはクレノウフラグメント）、ベントポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＯＬＢポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素である。
ヌクレオチド輸送体
ヌクレオチド輸送体（ＮＴ）は、細胞膜および小胞を横切るヌクレオチド基質の移動を促進する膜輸送タンパク質の群である。いくつかの実施形態では、２つのタイプのＮＴ、濃縮ヌクレオシド輸送体および平衡ヌクレオシド輸送体が存在する。場合によっては、ＮＴには、有機陰イオン輸送体（ＯΑΤ）および有機陽イオン輸送体（ＯＣＴ）も含まれる。場合によっては、ヌクレオチド輸送体は、ヌクレオシド三リン酸輸送体（ＮＴＴ）である。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸輸送体（ＮＴＴ）は、細菌、植物、または藻類に由来する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＴｐＮＴＴ１、ＴｐＮＴＴ２、ＴｐＮＴＴ３、ＴｐＮＴＴ４、ＴｐＮＴＴ５、ＴｐＮＴＴ６、ＴｐＮＴＴ７、ＴｐＮＴＴ８（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）、ＰｔＮＴＴ１、ＰｔＮＴＴ２、ＰｔＮＴＴ３、ＰｔＮＴＴ４、ＰｔＮＴＴ５、ＰｔＮＴＴ６（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、ＧｓＮＴＴ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）、ＡｔＮＴＴ１、ＡｔＮＴＴ２（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ＣｔＮＴＴ１、ＣｔＮＴＴ２（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ＰａｍＮＴＴ１、ＰａｍＮＴＴ２（Ｐｒｏｔｏｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｍｏｅｂｏｐｈｉｌａ）、ＣｃＮＴＴ（Ｃａｅｄｉｂａｃｔｅｒ ｃａｒｙｏｐｈｉｌｕｓ）、またはＲｐＮＴＴ１（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）である。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、ＣＮＴ１、ＣＮＴ２、ＣＮＴ３、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３、またはＯＣＴ１である。場合によっては、ＮＴＴは、ＰｔＮＴＴ１、ＰｔＮＴＴ２、ＰｔＮＴＴ３、ＰｔＮＴＴ４、ＰｔＮＴＴ５、またはＰｔＮＴＴ６である。
いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、非天然核酸を生物、例えば、細胞に導入する。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、ＮＴＴのヌクレオチド結合部位が、ヌクレオチド結合部位への非天然核酸の立体侵入阻害を低減するために改変されるように、改変されてもよい。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、非天然核酸の１つまたはそれ以上の天然または非天然の特徴との相互作用の増大を提供するように改変されてもよい。このようなＮＴＴは、ＵＢＰを細胞に安定して導入するために、細胞内で発現されても、または操作されてもよい。したがって、本開示は、異種または組換えＮＴＴを含む組成物およびその使用方法を含む。
ＮＴＴは、タンパク質工学に関係する方法を使用して改変され得る。例えば、結晶構造に基づいて分子モデリングを実行して、標的活性または結合部位を変更するために変異が行われ得る、ＮＴＴの位置を特定し得る。置換の標的として同定された残基は、Ｂｏｒｄｏら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１７：７２１－７２９（１９９１）およびＨａｙｅｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９９：１５９２６－１５９３１（２００２）に記載されているような、エネルギー最小化モデリング、ホモロジーモデリング、および／または保存的アミノ酸置換を使用して、選択された残基で置換されてもよい。
様々なＮＴＴのいずれかを、例えば、生物学的システムから単離されたタンパク質ベースの酵素およびその機能的バリアントを含む、本明細書に記載の方法または組成物で使用してもよい。以下に例示されるような特定のＮＴＴへの言及は、他に示されない限り、その機能的バリアントを含むと理解される。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、野生型ＮＴＴである。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、改変された、または変異体のＮＴＴである。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるように、改変または突然変異されたＮＴＴは、Ｎ末端、Ｃ末端またはＮおよびＣの両末端でトランケーションされるＮＴＴである。いくつかの実施形態では、トランケーションされたＮＴＴは、トランケーションされないＮＴＴと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％同一である。一部の場合、本明細書で使用されるＮＴＴは、ＰｔＮＴＴ１、ＰｔＮＴＴ２、ＰｔＮＴＴ３、ＰｔＮＴＴ４、ＰｔＮＴＴ５またはＰｔＮＴＴ６である。一部の場合、本明細書で使用されるＰｔＮＴＴは、Ｎ末端、Ｃ末端またはＮおよびＣの両末端でトランケーションされる。いくつかの実施形態では、トランケーションされたＰｔＮＴＴは、トランケーションされないＰｔＮＴＴと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％同一である。いくつかの例において、本明細書で使用されるＮＴＴはトランケーションされたＰｔＮＴＴ２であり、ここで、トランケーションされたＰｔＮＴＴ２は、トランケーションされないＰｔＮＴＴ２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。トランケーションされないＰｔＮＴＴ２（ＮＣＢＩ受託番号ＥＥＣ４９２２７．１、ＧＩ：２１７４０９２９５）の例は、アミノ酸配列配列番号１を有する。
細胞への非天然核酸の侵入を改善し、およびヌクレオチド結合領域の非天然ヌクレオチドと協調するための特徴を備えたＮＴＴも使用してもよい。いくつかの実施形態では、改変されたＮＴＴは、改変されたヌクレオチド結合部位を有する。いくつかの実施形態では、改変されたまたは野生型のＮＴＴは、非天然核酸に対して特異性が緩和されている。例えば、ＮＴＴは、任意選択で、対応する野生型ＮＴＴに対して、少なくとも約０．１％高い（例えば、約０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、３％、４％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％以上）非天然ヌクレオチドに対する導入の比活性を示す。任意選択で、ＮＴＴは、野生型ＮＴＴに対して、少なくとも約０．１％高い（例えば、約０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．１％、１．２％、１．５％、１．８％、２％、３％、４％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％以上）非天然ヌクレオチドに対するｋｃａｔ／ＫｍまたはＶｍａｘ／Ｋｍを示す。
ＮＴＴは、三リン酸（すなわち、Ｋｍ）に対するそれらの親和性、および／または導入速度（すなわち、Ｖｍａｘ）に従って特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、１つまたはそれ以上の天然および非天然三リン酸に対して相対的にＫｍまたはＶｍａｘを有する。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、１つまたはそれ以上の天然および非天然三リン酸に対して比較的高いＫｍまたはＶｍａｘを有する。
天然源またはそのバリアント由来のＮＴＴは、三リン酸の量を検出するアッセイを使用してスクリーニングされ得る（質量分析、または三リン酸が適切に標識されている場合は放射能のいずれかを使用する）。一例では、ＮＴＴは、非自然の三リン酸（例えば、ｄＴＰＴ３ＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄ５ＳＩＣＳＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ＮａＭＴＰ、および／またはＴＰＴ１ＴＰ）を導入する能力についてスクリーニングされてもよい。ＮＴＴ、例えば、野生型ＮＴＴと比較して、非天然核酸に対して改変された特性を示す、異種ＮＴＴを用いてもよい。例えば、変更された特性とは、例えば、三リン酸の導入の場合、Ｋｍ、ｋｃａｔ、Ｖｍａｘであり得る。一実施形態では、改変された特性は、非天然三リン酸の場合は、減少したＫｍであり、および／または非天然三リン酸の場合は増大したｋｃａｔ／ＫｍもしくはＶｍａｘ／Ｋｍである。同様に、ＮＴＴは、野生型ＮＴＴと比較して、任意選択で、非天然三リン酸の結合速度の増大、細胞内放出の速度の増大、および／または細胞導入速度の増大を有する。
同時に、ＮＴＴは、天然三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、および／またはＴＴＰを細胞に導入し得る。場合によっては、ＮＴＴは、複製および転写をサポートし得る天然核酸の導入の比活性を任意選択で示す。いくつかの実施形態では、ＮＴＴは、複製および転写をサポートし得る天然核酸について、任意選択でｋｃａｔ／ＫｍまたはＶｍａｘ／Ｋｍを示す。
特定の構造の非天然三リン酸を導入する能力を有し得る本明細書で使用されるＮＴＴはまた、指向進化アプローチを使用して生成され得る。核酸合成アッセイを使用して、様々な非天然三リン酸のいずれかに特異性を有するＮＴＴバリアントをスクリーニングし得る。例えば、ＮＴＴバリアントは、非天然三リン酸（例えば、ｄ５ＳＩＣＳＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄＴＰＴ３ＴＰ、ＮａＭＴＰ、および／またはＴＰＴ１ＴＰ）を導入する能力についてスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態では、そのようなアッセイは、例えば、組換えＮＴＴバリアントを使用するインビトロアッセイである。いくつかの実施形態では、そのようなアッセイは、例えば、細胞においてＮＴＴバリアントを発現するインビボアッセイである。このような技術を使用して、本明細書に記載の非天然三リン酸のいずれかに対する活性について、任意の適切なＮＴＴのバリアントをスクリーニングし得る。
核酸試薬およびツール
本明細書に記載される方法、細胞または工学操作された微生物用としてのヌクレオチドおよび／または核酸試薬（または、ポリヌクレオチド）は、非天然ヌクレオチドの有無にかかわらず１つまたはそれ以上のＯＲＦを含む。ＯＲＦは、任意の適切な供給源、時にはゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、逆転写ＲＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または前述の１つまたはそれ以上を含む核酸ライブラリーに由来し得、そして目的の核酸配列、目的のタンパク質、または目的の活性を含む任意の生物種に由来する。ＯＲＦを得ることができる生物の非限定的な例としては、例えば、細菌、酵母、真菌、ヒト、昆虫、線虫、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットまたはマウスが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチドおよび／または核酸試薬または他の試薬は、単離または精製される。公開されているインビトロの方法により、非天然ヌクレオチドを含むＯＲＦを作製し得る。場合によっては、ヌクレオチドまたは核酸試薬は、非天然核酸塩基を含む。
核酸試薬は、ＯＲＦと併せて翻訳され、アミノ酸タグをコードする、ＯＲＦに隣接するヌクレオチド配列を含む場合がある。タグをコードするヌクレオチド配列は、核酸試薬中のＯＲＦの３’および／または５’に位置し、それにより、ＯＲＦによってコードされるタンパク質またはペプチドのＣ末端またはＮ末端でタグをコードしている。インビトロでの転写および／または翻訳を無効にしない任意のタグを利用してもよく、技術者によって適切に選択されてもよい。タグは、培養または発酵培地からの所望のＯＲＦ産物の単離および／または精製を容易にし得る。場合によっては、核酸試薬のライブラリーが、本明細書に記載の方法および組成物と共に使用される。例えば、少なくとも１００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、または５０，０００超の固有のポリヌクレオチドのライブラリーが、ライブラリーに存在し、各ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。
非天然ヌクレオチドを含むかまたは含まない、核酸または核酸試薬は、特定のエレメント、例えば、核酸の使用目的に従ってしばしば選択される調節エレメントを含み得る。以下のエレメントのいずれかを核酸試薬に含めてもよいし、除外してもよい。例えば、核酸試薬は、以下のヌクレオチドエレメントの１つまたはそれ以上または全てを含み得る：１つまたはそれ以上のプロモーターエレメント、１つまたはそれ以上の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、標的ヌクレオチド配列が挿入され得る１つまたはそれ以上の領域（「挿入エレメント」）、１つまたはそれ以上の標的ヌクレオチド配列、１つまたはそれ以上の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および１つまたはそれ以上の選択エレメント。核酸試薬は、そのようなエレメントの１つまたはそれ以上を提供されてもよく、核酸が所望の生物に導入される前に、他のエレメントを核酸に挿入してもよい。いくつかの実施形態では、提供される核酸試薬は、プロモーター、５’ＵＴＲ、任意の３’ＵＴＲ、および標的ヌクレオチド配列がヌクレオチド酸試薬に挿入される（すなわち、クローニングされる）挿入エレメントを含む。特定の実施形態では、提供される核酸試薬は、プロモーター、挿入エレメント、および任意の３’ＵＴＲを含み、そして５’ＵＴＲ／標的ヌクレオチド配列は、任意の３’ＵＴＲと共に挿入される。エレメントは、選択された発現系での発現（例えば、選択された生物での発現、または例えば、無細胞系での発現）に適した任意の順序で配置されてもよく、いくつかの実施形態では、核酸試薬は、５’→３’の方向で以下のエレメントを含む：（１）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、および挿入エレメント；（２）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、および標的ヌクレオチド配列；（３）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、挿入エレメントおよび３’ＵＴＲ；ならびに（４）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、標的ヌクレオチド配列および３’ＵＴＲ。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、完全に天然であるか、または非天然ヌクレオチドを含む、ＯＲＦの転写または翻訳を変更または増大させるように最適化され得る。
核酸試薬、例えば、発現カセットおよび／または発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始配列、転写終結配列および他のエレメントを含む様々な調節エレメントを含んでもよい。「プロモーター」とは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。例えば、プロモーターは、ヌクレオチド三リン酸輸送体核酸セグメントの上流にあり得る。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含み、かつ上流エレメントおよび応答エレメントを含んでもよい。「エンハンサー」とは、一般に、転写開始部位から固定でない距離で機能し、転写ユニットに対して５’または３’’のいずれかであり得るＤＮＡの配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内およびコード配列自体内に存在してもよい。それらは通常長さが１０～３００の間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増大するように機能する。プロモーターと同様、エンハンサーも、転写の調節を媒介する応答エレメントを含む場合が多い。エンハンサーはしばしば発現の調節を決定し、完全に天然であるかまたは非天然ヌクレオチドを含むＯＲＦなどの、ＯＲＦ発現を変更または最適化するために使用され得る。
上記のように、核酸試薬はまた、１つまたはそれ以上の５’ＵＴＲ、および１つまたはそれ以上の３’ＵＴＲを含んでもよい。例えば、真核生物の宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）および原核生物の宿主細胞（例えば、ウイルス、細菌）で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡの発現に影響を与え得る、転写の終了についてシグナル伝達する配列を含んでもよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化セグメントとして転写され得る。３’’の非翻訳領域には、転写終結部位も含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、転写ユニットは、ポリアデニル化領域を含む。この領域の利点の１つは、転写されたユニットがｍＲＮＡのように処理および輸送される可能性が高くなるということである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。いくつかの好ましい実施形態では、相同なポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子構築物において使用され得る。
５’ＵＴＲは、それが由来するヌクレオチド配列に内因性の１つまたはそれ以上のエレメントを含み得、時には１つまたはそれ以上の外因性エレメントを含む。５’ＵＴＲは、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの任意の適切な核酸から、例えば、任意の適切な生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物）から由来し得る。技術者は、選択された発現系（例えば、選択された生物での発現、または、例えば、無細胞系での発現）に基づいて、５’ＵＴＲにとって適切なエレメントを選択し得る。５’ＵＴＲは、技術者に公知の以下のエレメントの１つまたはそれ以上を含む場合がある：エンハンサー配列（例えば、転写または翻訳）、転写開始部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、アクセサリータンパク質結合部位、フィードバック調節剤結合部位、Ｐｒｉｂｎｏｗボックス、ＴＡＴＡボックス、－３５エレメント、Ｅ－ｂｏｘ（ヘリックス－ループ－ヘリックス結合エレメント）、リボソーム結合部位、レプリコン、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、サイレンサーエレメントなど。いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントは、適切な条件付き調節に必要な全ての５’ＵＴＲエレメントが、プロモーターエレメントフラグメント内に、またはプロモーターエレメントフラグメントの機能的部分配列内に含まれるように分離されてもよい。
核酸試薬中の５’ＵＴＲは、翻訳エンハンサーヌクレオチド配列を含んでもよい。翻訳エンハンサーヌクレオチド配列は、多くの場合、核酸試薬のプロモーターと標的ヌクレオチド配列の間に位置している。翻訳エンハンサー配列は、しばしばリボソームに結合し、１８Ｓ ｒＲＮＡ結合リボヌクレオチド配列（すなわち、４０Ｓリボソーム結合配列）である場合もあり、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）である場合もある。ＩＲＥＳは一般に、多数の特定の分子間相互作用を介して４０Ｓリボソームサブユニットと接触する正確に配置されたＲＮＡ三次構造を有するＲＮＡ足場を形成する。リボソームエンハンサー配列の例は公知であり、技術者によって同定され得る（例えば、Ｍｉｇｎｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：Ｄ１４１－Ｄ１４６（２００５）；Ｐａｕｌｏｕｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：７２２－７３３（２００３）；Ａｋｂｅｒｇｅｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：２３９－２４７（２００４）；Ｍｉｇｎｏｎｅら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３（３）：ｒｅｖｉｅｗｓ０００４．１－０００１．１０（２００２）；Ｇａｌｌｉｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３４０１－３４１１（２００２）；Ｓｈａｌｏｉｋｏら、ＤＯＩ：１０．１００２／ｂｉｔ．２０２６７；およびＧａｌｌｉｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：３２５７－３２７３（１９８７））。
翻訳エンハンサー配列は、コザックコンセンサス配列または他の配列（例えば、ヒドロ虫ポリプ配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０７１２８）などの真核生物配列である場合がある。翻訳エンハンサー配列は、シャイン・ダルガルノコンセンサス配列などの原核生物配列である場合がある。特定の実施形態では、翻訳エンハンサー配列は、ウイルスヌクレオチド配列である。翻訳エンハンサー配列は、例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）；タバコエッチウイルス（ＥＴＶ）；ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）；カブモザイク（ポティ）ウイルスおよびエンドウ種子伝染モザイクウイルスなどの植物ウイルスの５’ＵＴＲに由来する場合がある。特定の実施形態では、ＴＭＶから約６７塩基の長さのオメガ配列は、翻訳エンハンサー配列として核酸試薬に含まれる（例えば、グアノシンヌクレオチドを欠き、２５ヌクレオチド長のポリ（ＣＡＡ）中央領域を含む）。
３’ＵＴＲは、それが由来するヌクレオチド配列に内因性の１つまたはそれ以上のエレメントを含んでもよく、１つまたはそれ以上の外因性エレメントを含む場合もある。３’ＵＴＲは、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの任意の適切な核酸から、例えば、任意の適切な生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物）から由来し得る。技術者は、選択された発現系に基づいて、３’ＵＴＲに適切なエレメントを選択し得る（例えば、選択された生物での発現など）。３’ＵＴＲは、技術者に公知の以下のエレメントの１つまたはそれ以上を含む場合がある：転写調節部位、転写開始部位、転写終結部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳終結部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、リボソーム結合部位、レプリコン、エンハンサーエレメント、サイレンサーエレメントおよびポリアデノシンテール。３’ＵＴＲにはポリアデノシンテールが含まれることが多く、含まれない場合もあり、ポリアデノシンテールが存在する場合は、１つまたはそれ以上のアデノシン部分が追加されても、またはそれから削除されてもよい（例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０のアデノシン部分を追加してもまたは削除してもよい）。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの改変を用いて、プロモーターの活性を変更する（例えば、増加、追加、減少、または実質的に排除する）。プロモーター活性の変更は、次いで、改変された５’または３’ＵＴＲを含む作動可能に連結されたプロモーターエレメントからの目的のヌクレオチド配列の転写の変化によって、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の活性（例えば、酵素活性）を変更し得る。例えば、微生物を、新規の活性（例えば、宿主生物には通常見られない活性）を加え得る、または特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列（例えば、目的の相同または異種ヌクレオチド配列）に作動可能に連結された同種または異種プロモーターからの転写を増大させることによって既存の活性の発現を増大し得る改変５’または３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現するように遺伝子改変によって操作してもよい。いくつかの実施形態では、微生物を、特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列に対して作動可能に連結された同種または異種プロモーターからの転写を減少または実質的に排除することによって、活性の発現を減少し得る改変５’または３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現するように遺伝子改変によって操作してもよい。
発現カセットまたは発現ベクターからのヌクレオチド三リン酸輸送体の発現は、原核細胞または真核細胞で発現し得る任意のプロモーターによって制御され得る。プロモーターエレメントは通常、ＤＮＡ合成および／またはＲＮＡ合成に必要である。プロモーターエレメントは、ある遺伝子に対応するＲＮＡの合成の開始部位を提供することにより、特定の遺伝子の転写を促進し得るＤＮＡの領域を含むことが多い。プロモーターは一般に、それらが調節する遺伝子の近くに位置し、遺伝子の上流（例えば、遺伝子の５’）に位置し、いくつかの実施形態では、遺伝子のセンス鎖と同じＤＮＡ鎖上にある。いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントは、遺伝子または生物から単離されてもよく、ポリヌクレオチド配列と機能的に関連して挿入されて、変化されたおよび／または調節された発現を可能にし得る。核酸の発現に使用される非天然プロモーター（例えば、通常は所与の核酸配列に関連しないプロモーター）は、しばしば異種プロモーターと呼ばれる。特定の実施形態では、異種プロモーターおよび／または５’ＵＴＲは、本明細書に記載されるような所望の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に関連して挿入され得る。プロモーターに関して本明細書で使用される「作動可能に連結された」および「機能的に関連して」という用語は、コード配列とプロモーターエレメントとの間の関係を指す。転写を介したコード配列からの発現がプロモーターエレメントによって調節または制御される場合、プロモーターは、コード配列と作動可能に連結されているか、または機能的に関連している。「作動可能に連結された」および「機能的に関連して」という用語は、プロモーターエレメントに関して本明細書で交換可能に使用される。
プロモーターはしばしばＲＮＡポリメラーゼと相互作用する。ポリメラーゼは、既存の核酸試薬を使用して核酸の合成を触媒する酵素である。テンプレートがＤＮＡテンプレートの場合、タンパク質が合成される前にＲＮＡ分子が転写される。本発明の方法での使用に適したポリメラーゼ活性を有する酵素としては、タンパク質を合成するために選択されたテンプレートを用いて、選択されたシステムで活性である任意のポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書においてプロモーターエレメントとも呼ばれるプロモーター（例えば、異種プロモーター）は、ヌクレオチド配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結され得る。プロモーターエレメントからの転写は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列またはＯＲＦ配列に対応するＲＮＡの合成を触媒し得、これは次いで、所望のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の合成をもたらす。
プロモーターエレメントは、調節制御に対して応答性を示すことがある。プロモーターエレメントは、選択的薬剤によって調節され得る場合もある。すなわち、プロモーターエレメントからの転写は、環境、栄養、または内部条件またはシグナル（例えば、熱誘導性プロモーター、光調節プロモーター、フィードバック調節プロモーター、ホルモン影響性プロモーター、組織特異的プロモーター、酸素およびｐＨ影響性プロモーター、選択的薬剤（例えば、カナマイシン）に応答するプロモーターなど）の変化に応じて、オン、オフ、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされ得る場合がある。環境、栄養、または内部シグナルの影響を受けるプロモーターは、そのプロモーターまたはその近くに結合し、特定の条件下で標的配列の発現を増加または減少させるシグナル（直接または間接）の影響を受けることがよくある。本明細書に開示される全ての方法と同様に、天然または改変プロモーターの包含を使用して、完全天然ＯＲＦ（例えば、ＮＴＴまたはａａＲＳ）または非天然ヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡまたはｔＲＮＡ）を含むＯＲＦの発現を変更または最適化し得る。
本明細書に記載の実施形態で使用されるプロモーターエレメントからの転写に影響を与える選択的薬剤または調節剤の非限定的な例としては、限定するものではないが、（１）他の方法では毒性化合物（例えば、抗生物質）に対して耐性を提供する産物をコードする核酸セグメント；（２）他の方法ではレシピエント細胞に欠けている産物（例えば、必須産物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定され得る産物をコードする核酸セグメント（例えば、抗生物質（例えば、β－ラクタマーゼ）、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー）；（５）細胞の生存および／または機能に、他の方法では有害である産物に結合する核酸セグメント；（６）上記の１～５番に記載されている核酸セグメントのいずれかの活性を、他の方法では阻害する核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を改変する産物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に結合する核酸セグメント；（８）所望の分子（例えば、特定のタンパク質結合部位）を単離または同定するために使用され得る核酸セグメント；（９）他の方法では機能し得ない特定のヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の亜集団のＰＣＲ増幅のために）；（１０）存在しない場合、特定の化合物に対する耐性または感受性を直接的または間接的に付与する核酸セグメント；（１１）レシピエント細胞において、毒性であるか、または相対的に非毒性の化合物を毒性化合物（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）に変換する産物をコードする核酸セグメント；（１２）それらを含む核酸分子の複製、分配または遺伝可能性を阻害する核酸セグメント；（１３）条件付き複製機能、例えば、特定の宿主もしくは宿主細胞株における、または特定の環境条件下（例えば、温度、栄養条件など）での複製をコードする核酸セグメント；および／または（１４）非天然ヌクレオチドを含む１つまたはそれ以上のｍＲＮＡまたはｔＲＮＡをコードする核酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、調節剤または選択的薬剤を添加して、生物が供される既存の増殖条件を変更してもよい（例えば、液体培養での増殖、発酵槽での増殖、固体栄養プレートでの増殖など）。
いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントの調節を使用して、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の活性（例えば、酵素活性など）を変更（例えば、増大、追加、減少、または実質的に排除）し得る。例えば、微生物を、新規の活性（例えば、宿主生物には通常見られない活性）を加え得る、または特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列（例えば、目的の相同または異種ヌクレオチド配列）に作動可能に連結された相同性プロモーターまたは異種プロモーターからの転写を増加させることによって既存の活性の発現を増大し得る核酸試薬を発現するように遺伝子改変によって操作してもよい。いくつかの実施形態では、微生物を、特定の実施形態では、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された相同または異種プロモーターからの転写を減少または実質的に排除することによって活性の発現を減少し得る核酸試薬を発現するように遺伝子改変によって操作してもよい。
異種タンパク質、例えば、ヌクレオチド三リン酸輸送体をコードする核酸を、任意の適切な発現系に挿入してもよいし、または使用してもよい。いくつかの実施形態では、核酸試薬は、時には、宿主生物の染色体に安定して組み込まれるか、または核酸試薬は、特定の実施形態では、宿主染色体の一部の欠失であってもよい（例えば、遺伝子改変生物において、宿主ゲノムの変更は、遺伝子改変がある所望の生物を選択的または優先的に維持する能力を付与する）。そのような核酸試薬（例えば、変更されたゲノムが生物に選択可能な形質を与える核酸または遺伝子改変生物）は、所望のタンパク質または核酸分子の産生を誘導するそれらの能力について選択され得る。必要に応じて、核酸試薬は、コドンが（ｉ）ネイティブ配列で指定されたものとは異なるｔＲＮＡを使用して、同じアミノ酸をコードするように、または（ｉｉ）従来とは異なるかまたは非天然アミノ酸（検出可能な標識アミノ酸を含む）を含む、通常とは異なるアミノ酸をコードするように変更してもよい。
組換え発現は、プラスミドなどのベクターの一部であり得る発現カセットを使用して有用に達成される。ベクターは、ヌクレオチド三リン酸輸送体をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。ベクターはまた、本明細書に記載されるように、転写および翻訳に必要な他のエレメントを含んでもよい。発現カセット、発現ベクター、およびカセットまたはベクター中の配列は、非天然ヌクレオチドが接触している細胞に対して異種であり得る。例えば、ヌクレオチド三リン酸輸送体配列は、細胞に対して異種であり得る。
ヌクレオチド三リン酸輸送体を保持するか、コードするか、および／または発現するのに適した様々な原核生物および真核生物の発現ベクターを生成し得る。そのような発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ、および酵母ベクターが挙げられる。ベクターは、例えば、様々なインビボおよびインビトロの状況で使用し得る。使用され得る原核生物プロモーターの非限定的な例としては、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃ、またはマルトースプロモーターが挙げられる。使用され得る真核生物プロモーターの非限定的な例としては、構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーター、ならびに調節可能なプロモーター、例えば、ｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター、およびＣＲＥによって調節される合成プロモーターなどの誘導性または抑制性プロモーターが挙げられる。細菌発現用のベクターとしてはｐＧＥＸ－５Ｘ－３が含まれ、真核生物発現用のベクターとしては、ｐＣＩｎｅｏ－ＣＭＶが挙げられる。使用され得るウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養ウイルス、シンドビスおよび他のウイルスに関連するものが挙げられる。これらのウイルスの特性を共有し、ベクターとしての使用に適した任意のウイルスファミリーも有用である。使用できるレトロウイルスベクターとしては、Ｖｅｒｍａ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９－２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）に記載されているベクターが挙げられる。例えば、そのようなレトロウイルスベクターとしては、マウスマロニー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、および望ましい特性を発現する他のレトロウイルスが挙げられる。通常、ウイルスベクターには、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端リピート、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含む。ベクターとして設計された場合、ウイルスは通常、１つまたはそれ以上の初期遺伝子が除去されており、除去されたウイルス核酸の代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットがウイルスゲノムに挿入される。
クローニング
当技術分野で公知の任意の便利なクローニング戦略を利用して、ＯＲＦなどのエレメントを核酸試薬に組み込んでもよい。以下のような公知の方法を利用して、挿入エレメントとは独立してエレメントをテンプレートに挿入してもよい、例えば、（１）１つまたはそれ以上の既存の制限酵素部位でテンプレートを切断し、目的のエレメントをライゲーションすること、および（２）１つまたはそれ以上の適切な制限酵素部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズし、ポリメラーゼ連鎖反応（本明細書でより詳細に記載される）によって増幅することによって、テンプレートに制限酵素部位を追加すること。他のクローニング戦略は、例えば、ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーション部位、および本明細書に記載される他のものなど、核酸試薬に存在するかまたは挿入される１つまたはそれ以上の挿入部位を利用する。いくつかの実施形態では、クローニング戦略は、組換えなどの遺伝子操作と組み合わせてもよい（例えば、本明細書でさらに説明するように、改変される生物のゲノムへの目的の核酸配列を有する核酸試薬の組換え）。いくつかの実施形態では、クローニングされたＯＲＦは、目的の１つまたはそれ以上のＯＲＦを有する微生物を操作することによって、（直接的または間接的に）改変のまたは野生型のヌクレオチド三リン酸輸送体および／またはポリメラーゼを生成し得、その微生物はヌクレオチド三リン酸輸送体活性またはポリメラーゼ活性の変化した活性を含む。
核酸を１つまたはそれ以上の特異的切断剤と接触させることにより、その核酸を特異的に切断し得る。特定の切断剤は、特定の部位で特定のヌクレオチド配列に従って特異的に切断することが多い。酵素特異的切断剤の例としては、限定するものではないが、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＩＩ）；ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｐ）；Ｃｌｅａｖａｓｅ（商標）酵素；ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ；Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩおよび真核生物構造特異的エンドヌクレアーゼ；マウスＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ；Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、Ａｃｃ Ｉ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ａｌｕ Ｉ、Ａｌｗ４４ Ｉ、Ａｐａ Ｉ、Ａｓｎ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ａｖａ ＩＩ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｂａｎ ＩＩ、Ｂｃｌ Ｉ、Ｂｇｌ Ｉ．Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｌｎ Ｉ、ＢｓａＩ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｓＨ ＩＩ、ＢｓｔＥ ＩＩ、Ｃｆｏ Ｉ、ＣＩａ Ｉ、Ｄｄｅ Ｉ、Ｄｐｎ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、ＥｃＩＸ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ ＩＩ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｈｐａ Ｉ、Ｈｐａ ＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｋｓｐ Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、ＭＩｕＮ Ｉ、Ｍｓｐ Ｉ、Ｎｃｉ Ｉ、Ｎｃｏ Ｉ、Ｎｄｅ Ｉ、Ｎｄｅ ＩＩ、Ｎｈｅ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｎｒｕ Ｉ、Ｎｓｉ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｐｖｕ Ｉ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｒｓａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓａｕ３Ａ Ｉ、Ｓｃａ Ｉ、ＳｃｒＦ Ｉ、Ｓｆｉ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ 、Ｓｐｅ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｓｓｐ Ｉ、Ｓｔｕ Ｉ、Ｓｔｙ Ｉ、Ｓｗａ Ｉ、Ｔａｑ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ）；グリコシラーゼ（例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ、ピリミジン水和物－ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ－ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチ－ＤＮＡグリコシラーゼ、ヒポキサンチン－ＤＮＡグリコシラーゼ、５－ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５－ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、または１，Ｎ６－エテノ－アデニンＤＮＡグリコシラーゼ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）；リボザイム、およびＤＮＡｚｙｍｅｓが挙げられる。サンプル核酸は、化学薬品で処理されてもよいし、または修飾ヌクレオチドを使用して合成されてもよく、修飾核酸を切断してもよい。非限定的な例では、サンプル核酸は、（ｉ）アルキルプリンＤＮＡグリコシラーゼによって認識および切断される、Ｎ３－メチルアデニンおよびＮ３－メチルグアニンを含む、いくつかのアルキル化塩基を生成するメチルニトロソ尿素などのアルキル化剤；（ｉｉ）亜硫酸水素ナトリウムであって、これにより、ＤＮＡのシトシン残基が脱アミノ化され、ウラシルＮ－グリコシラーゼによって切断され得るウラシル残基が形成される、亜硫酸水素ナトリウム；ならびに（ｉｉｉ）グアニンをその酸化型である８－ヒドロキシグアニンに変換する化学薬品（これはホルムアミドピリミジンＤＮＡ Ｎ－グリコシラーゼによって切断され得る）、で処理され得る。化学的切断プロセスの例としては、限定するものではないが、アルキル化（例えば、ホスホロチオエート修飾核酸のアルキル化）；Ｐ３’－Ｎ５’－ホスホロアミデート含有核酸の酸不安定性の切断；ならびに核酸の四酸化オスミウムおよびピペリジン処理が挙げられる。
いくつかの実施形態では、核酸試薬は、１つまたはそれ以上のリコンビナーゼ挿入部位を含む。リコンビナーゼ挿入部位は、組換えタンパク質による組み込み／組換え反応に関与する核酸分子上の認識配列である。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの組換え部位は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対のコア配列（例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５２１－５２７（１９９４））に隣接する２つの１３塩基対の逆方向反復配列（リコンビナーゼ結合部位として機能）で構成される３４塩基対の配列である。組換え部位の他の例としては、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列、ならびに組換えタンパク質λＩｎｔによって、および補助タンパク質組み込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよび切除酵素（Ｘｉｓ）によって認識される、それらの変異体、フラグメント、バリアントおよび誘導体が挙げられる（例えば、米国特許第５，８８８，７３２号；同第６，１４３，５５７号；同第６，１７１，８６１号；同第６，２７０，９６９号；同第６，２７７，６０８号；および同第６，７２０，１４０号；米国特許出願公開第０９／５１７，４６６号、および同第０９／７３２，９１４号；米国特許出願公開第２００２／０００７０５１号；ならびにＬａｎｄｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９－７０７（１９９３））。
リコンビナーゼクローニング核酸の例は、ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にあり、これは、インビボまたはインビトロで所望の核酸分子をクローニングするための少なくとも１つの組換え部位を含む。いくつかの実施形態では、この系は、しばしばバクテリオファージラムダ系（例えば、ａｔｔ１およびａｔｔ２）に基づいて、少なくとも２つの異なる部位特異的組換え部位を含み、野生型（ａｔｔ０）部位から変異しているベクターを利用する。各変異部位は、同じタイプの同族のパートナーａｔｔ部位（すなわち、その結合パートナー組換え部位）に対して固有の特異性を有し（例えば、ａｔｔＢ１とａｔｔＰ１、またはａｔｔＬ１とａｔｔＲ１）、他の変異型の組換え部位とも、または野生型ａｔｔ０部位とも交差反応しない。異なる部位特異性は、所望の分子の方向性のあるクローニングまたは連結を可能にし、したがって、クローニングされた分子の所望の配向を提供する。組換え部位に隣接する核酸フラグメントは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）系を使用して、目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）と呼ばれることもあるレシピエントプラスミド分子上のａｔｔ部位に隣接する選択可能なマーカー（例えば、ｃｃｄＢ）を置き換えることにより、クローニングおよびサブクローニングされる。次いで、ｃｃｄＢ感受性宿主株の形質転換およびレシピエント分子上のマーカーの陽性選択によって、所望のクローンが選択される。陰性選択（例えば、毒性遺伝子の使用）のための同様の戦略は、哺乳類および昆虫のチミジンキナーゼ（ＴＫ）のように他の生物で使用され得る。
核酸試薬は、１つまたはそれ以上の複製起点（ＯＲＩ）エレメントを含むことがある。いくつかの実施形態では、テンプレートは、２つまたはそれ以上のＯＲＩを含み、１つは１つの生物（例えば、細菌）において効率的に機能し、別の生物は別の生物（例えば、酵母のような真核生物）において効率的に機能する。いくつかの実施形態では、ＯＲＩは、１つの種（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）において効率的に機能し得、そして別のＯＲＩは、異なる種（例えば、Ｓ．ｐｏｍｂｅなど）において効率的に機能し得る。核酸試薬はまた、１つまたはそれ以上の転写調節部位を含む場合もある。
核酸試薬、例えば、発現カセットまたはベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。マーカー産物は、ある遺伝子が細胞に送達され、送達された後は発現されているか否かを判断するために使用される。マーカー遺伝子の例としては、β－ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態では、マーカーは、選択可能なマーカーであり得る。そのような選択可能なマーカーが宿主細胞に首尾よく移されるとき、その形質転換された宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に生き残り得る。選択的レジームには、広く使用されている２つの別個のカテゴリーがある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝、および補充された培地から独立して増殖する能力を欠く変異細胞株の使用に基づいている。第２のカテゴリーは優性選択であり、これは任意の細胞型で使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは通常、宿主細胞の増殖を阻止するために薬物を使用する。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、薬剤耐性を運ぶタンパク質を発現し、選択を生き残る。そのような優勢な選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０～４１３（１９８５））を使用する。
核酸試薬は、１つまたはそれ以上の選択エレメント（例えば、核酸試薬の存在を選択するためのエレメントであり、選択的に調節され得るプロモーターエレメントの活性化のためではないエレメント）を含み得る。選択エレメントは、核酸試薬が細胞に含まれるか否かを決定するために公知のプロセスを使用して利用されることが多い。いくつかの実施形態では、核酸試薬は、２つまたはそれ以上の選択エレメントを含み、１つのエレメントは１つの生物において効率的に機能し、他のエレメントは別の生物において効率的に機能する。選択エレメントの例としては、限定するものではないが、（１）他の方法では毒性のある化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードする核酸セグメント；（２）他の方法ではレシピエント細胞に欠けている産物（例えば、必須産物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定され得る産物をコードする核酸セグメント（例えば、抗生物質（例えば、β－ラクタマーゼ）、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質などの表現型マーカー）；（５）細胞の生存および／または機能に対して他の方法では有害な産物に結合する核酸セグメント；（６）上記の１～５番に記載されている核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）のいずれかの活性を他の方法では阻害する核酸セグメント；（７）基質を修飾する産物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に結合する核酸セグメント；（８）所望の分子（例えば、特定のタンパク質結合部位）を単離または同定するために使用され得る核酸セグメント；（９）他の方法では機能しない場合がある特定のヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の亜集団のＰＣＲ増幅のために）；（１０）存在しない場合、特定の化合物に対する耐性または感受性を直接的または間接的に付与する核酸セグメント；（１１）レシピエント細胞において、毒性であるか、または比較的非毒性の化合物を毒性化合物に変換する産物（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）をコードする核酸セグメント；（１２）それらを含む核酸分子の複製、分配または遺伝可能性を阻害する核酸セグメント；ならびに／あるいは（１３）条件付き複製機能、例えば、特定の宿主もしくは宿主細胞株における、または特定の環境条件下（例えば、温度、栄養状態など）での複製をコードする核酸セグメントが挙げられる。
核酸試薬は、インビボ転写および／または翻訳に有用な任意の形態であり得る。核酸は、スーパーコイルプラスミドなどのプラスミドである場合もあれば、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ）である場合もあり、線状核酸（例えば、ＰＣＲまたは制限消化によって産生される線状核酸）である場合もあり、一本鎖である場合もあり、時には二本鎖でもある。核酸試薬は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスまたは転写媒介増幅プロセス（ＴＭＡ）などの増幅プロセスによって調製される場合もある。ＴＭＡでは、２つの酵素が、等温反応で使用され、発光によって検出される増幅産物を生成する（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６ Ｊｕｎ ２５；３５（２５）：８４２９－３８）。標準的なＰＣＲプロセスは公知であり（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；第４，６８３，１９５号；第４，９６５，１８８号；および第５，５６５，４９３号）、一般にサイクルで実施される。各サイクルとしては、熱変性（ここでハイブリッド核酸が解離する）、冷却（ここでプライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする）；およびポリメラーゼ（すなわち、Ｔａｑポリメラーゼ）によるオリゴヌクレオチドの伸長が挙げられる。ＰＣＲ循環プロセスの例は、サンプルを９５℃で５分間処理すること；９５℃で１分間、５９℃で１分間、１０秒間、７２℃で１分３０秒間という４５サイクルを繰り返すこと；次いで、サンプルを７２℃で５分間処理すること。複数のサイクルは、市販のサーマルサイクラーを使用して頻繁に行われる。ＰＣＲ増幅産物は、低温で一時的に保存される場合もあり（例えば、４℃）、分析前に凍結される場合もある（例えば、－２０℃）。
上記のものと類似のクローニング戦略を使用して、非天然ヌクレオチドを含むＤＮＡを生成し得る。例えば、所望の位置に非天然ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、標準的な固相合成を使用して合成され、ＨＰＬＣによって精製される。次いで、オリゴヌクレオチドは、ＢｓａＩ部位などのクローニング部位を使用したクローニング方法（Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリなど）を使用して（ただし、上記で説明した他のものを使用してもよい）、必要な配列コンテキスト（すなわち、ＵＴＲおよびコード配列）を含むプラスミドに挿入される。
キットおよび製造品
特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の方法で使用するためのキットおよび製造品である。そのようなキットとしては、バイアル、チューブなどのような１つまたはそれ以上の容器を受け入れるように区画化された担体、パッケージ、または容器を含み、その容器のそれぞれは、本明細書に記載の方法で使用される別個のエレメントの１つを含んでいる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、および試験管が挙げられる。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
いくつかの実施形態では、キットは、キットの内容物を収容するための適切な包装材料を備える。場合によっては、包装材料は、好ましくは無菌で夾雑物のない環境を提供するために、周知の方法によって構築される。本明細書で使用される包装材料としては、例えば、核酸配列決定システムで使用するために販売されている市販のキットで慣習的に利用されているものが挙げられる。例示的な包装材料としては、限定するものではないが、本明細書に記載の構成成分を一定の範囲内に保持し得るガラス、プラスチック、紙、ホイルなどが挙げられる。
包装材料は、構成成分の特定の用途を示すラベルを備えてもよい。このラベルで示されているキットの使用は、そのキットに存在する構成成分の特定の組み合わせに適切な、本明細書に記載されている方法の１つまたはそれ以上であり得る。例えば、ラベルは、キットがポリヌクレオチドを合成する方法にとって、または核酸の配列を決定する方法にとって有用であることを示し得る。
パッケージングされた試薬または構成成分の使用説明書もキットに含まれてもよい。この説明書には通常、混合されるキット成分およびサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物のメンテナンス期間、温度、緩衝液条件などの反応パラメーターを説明する具体的な表現が含まれる。
特定の反応に必要な全ての構成成分が特定のキットに存在する必要があるわけではないことが理解される。そうではなく、１つまたはそれ以上の追加の構成成分を他の供給源から提供され得る。キットに付属の説明書で、提供される追加の構成成分、及びそれらを入手できる場所が特定され得る。
いくつかの実施形態では、例えば、遺伝子操作された細胞を調製するための本開示によって提供される方法を使用して、非天然核酸を細胞核酸に安定に組み込むために有用なキットが提供される。一実施形態では、本明細書に記載のキットは、遺伝子操作された細胞および１つまたはそれ以上の非天然核酸を含む。
追加の実施形態では、本明細書に記載のキットは、細胞および細胞に導入するための異種遺伝子を含む核酸分子を提供し、それにより、この段落で説明されている上記の任意の実施形態の核酸を含む発現ベクターなどの遺伝子操作された細胞を提供する。
番号付き実施形態。本開示は、以下の非限定的番号付き実施形態を含む：
実施形態１。非天然ポリペプチドを合成する方法であって：
ａ．少なくとも４つの非天然塩基対を含む少なくとも１つの非天然デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を提供する工程；
ｂ．少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させて少なくとも２つの非天然コドンを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を与える工程；
ｃ．少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させて少なくとも１つの非天然アンチコドンを各々含む少なくとも２つの転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子を与える工程であって、対応するＤＮＡ中の少なくとも２つの非天然塩基対が、ｍＲＮＡ分子の非天然コドンがｔＲＮＡ分子の各々の非天然アンチコドンに相補的であるような配列コンテキストにある工程；および
ｄ．少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子を利用して非天然ｍＲＮＡ分子を翻訳することによって非天然ポリペプチドを合成する工程であって、各非天然アンチコドンは非天然ポリペプチドへの非天然アミノ酸の部位特異的組み込みを導く工程
を含む方法。
実施形態１．１。非天然ポリペプチドを合成する方法であって：
ａ．少なくとも４つの非天然塩基対を含む少なくとも１つの非天然デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を提供する工程；
ｂ．少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させて少なくとも２つの非天然コドンを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を与える工程；
ｃ．少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させて少なくとも１つの非天然アンチコドンを各々含む少なくとも２つの転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子を与える工程であって、
対応するＤＮＡ中の少なくとも２つの非天然塩基対が、ｍＲＮＡ分子の非天然コドンのうちの１つがｔＲＮＡ分子のうちの１つの非天然アンチコドンに相補的であり、１つまたはそれ以上の他の非天然コドンのうちの少なくとも１つが、他のｔＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つの非天然アンチコドンに相補的であるような配列コンテキストにある工程；および
ｄ．少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子を利用して非天然ｍＲＮＡ分子を翻訳することによって非天然ポリペプチドを合成する工程であって、各非天然アンチコドンは、非天然ポリペプチドへの非天然アミノ酸の部位特異的組み込みを導く工程
を含む方法。
実施形態２。非天然ポリペプチドを合成する方法であって：
ａ．少なくとも４つの非天然塩基対を含む少なくとも１つの非天然デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を提供する工程であって、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は、（ｉ）少なくとも第１および第２の非天然コドンを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、ならびに（ｉｉ）少なくとも第１および第２の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子をコードし、第１のｔＲＮＡ分子は第１の非天然アンチコドンを含み、第２のｔＲＮＡ分子は第２の非天然アンチコドンを含み、少なくとも１つのＤＮＡ分子中の少なくとも４つの非天然塩基対は、ｍＲＮＡ分子の第１および第２の非天然コドンが第１および第２の非天然アンチコドンにそれぞれ相補的であるような配列コンテキストにある工程；
ｂ．少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させてｍＲＮＡを与える工程；
ｃ．少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させて少なくとも第１および第２のｔＲＮＡ分子を与える工程；および
ｄ．少なくとも第１および第２の非天然ｔＲＮＡ分子を利用して非天然ｍＲＮＡ分子を翻訳することによって非天然ポリペプチドを合成する工程であって、少なくとも第１および第２の非天然アンチコドンの各々は、非天然ポリペプチドへの非天然アミノ酸の部位特異的組み込みを導く工程
を含む方法。
実施形態３。少なくとも２つの非天然コドンはコドンの第１の位置、第２の位置または第３の位置に配置される第１の非天然ヌクレオチドを各々含み、場合により、第１の非天然ヌクレオチドはコドンの第２の位置または第３の位置に配置される、実施形態１、１．１．または２の方法。
実施形態４。少なくとも２つの非天然コドンは核酸配列ＮＮＸまたはＮＸＮを各々含み、非天然アンチコドンは核酸配列ＸＮＮ、ＹＮＮ、ＮＸＮまたはＮＹＮを含むことで、ＮＮＸ－ＸＮＮ、ＮＮＸ－ＹＮＮまたはＮＸＮ－ＮＹＮを含む非天然コドン－アンチコドン対を形成し、ここで、Ｎは任意の天然ヌクレオチドであり、Ｘは第１の非天然ヌクレオチドであり、Ｙは第１の非天然ヌクレオチドと異なる第２の非天然ヌクレオチドであり、Ｘ－ＹまたはＸ－ＸはＤＮＡ中で非天然塩基対を形成する、前記実施形態のいずれか１つの方法。
実施形態４．１。少なくとも２つの非天然コドンは核酸配列ＸＮＮ、ＮＸＮ、ＮＮＸを各々含み、非天然アンチコドンは核酸配列ＮＮＸ、ＮＮＹ、ＮＸＮ、ＮＹＮ、ＮＮＸまたはＮＮＹを含むことで、ＸＮＮ－ＮＮＸ、ＸＮＮ－ＮＮＹ、ＮＸＮ－ＮＸＮ、ＮＸＮ－ＮＹＮ、ＮＮＸ－ＸＮＮまたはＮＮＸ－ＹＮＮを含む非天然コドン－アンチコドン対を形成し、ここで、Ｎは任意の天然ヌクレオチドであり、Ｘは第１の非天然ヌクレオチドであり、Ｙは第１の非天然ヌクレオチドと異なる第２の非天然ヌクレオチドであり、Ｘ－ＸまたはＸ－ＹはＤＮＡ中で非天然塩基対を形成する、前記実施形態のいずれか１つの方法。
実施形態５。コドンは少なくとも１つのＧまたはＣを含み、アンチコドンは少なくとも１つの相補的ＣまたはＧを含む、実施形態４の方法。
実施形態６。ＸおよびＹは：
（ｉ）２－チオウラシル、２’－デオキシウリジン、４－チオウラシル、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、５－ハロウラシル；５－プロピニル－ウラシル、６－アゾ－ウラシル、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、シュードウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシルまたはジヒドロウラシル；
（ｉｉ）５－ヒドロキシメチルシトシン、５－トリフルオロメチルシトシン、５－ハロシトシン、５－プロピニルシトシン、５－ヒドロキシシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５，６－ジヒドロシトシン、５－ニトロシトシン、６－アゾシトシン、アザシトシン、Ｎ４－エチルシトシン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノキサジンシチジン（９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、またはピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）；
（ｉｉｉ）２－アミノアデニン、２－プロピルアデニン、２－アミノ－アデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－プロピル－アデニン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、３－デアザアデニン、７－メチルアデニン、７－デアザ－アデニン、８－アザアデニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシル置換アデニン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、２－メチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニンまたは６－アザアデニン；
（ｉｖ）２－メチルグアニン、グアニンの２－プロピルおよびアルキル誘導体、３－デアザグアニン、６－チオグアニン、７－メチルグアニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアノシン、７－デアザ－８－アザグアニン、８－アザグアニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシル置換グアニン、１－メチルグアニン、２，２－ジメチルグアニン、７－メチルグアニンまたは６－アザグアニン；ならびに
（ｖ）ヒポキサンチン、キサンチン、１－メチルイノシン、ケオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、ワイブトキソシン、ヒドロキシ尿素、（ａｃｐ３）ｗ、２－アミノピリジンまたは２－ピリドン
からなる群から独立して選択される、実施形態４または５の方法。
実施形態７。ＸおよびＹの各々を含む塩基は：
Figure 2022552271000016
 からなる群から独立して選択される、実施形態４または５の方法。
実施形態８。各Ｘを含む塩基は
Figure 2022552271000017
 である、実施形態７の方法。
実施形態９。各Ｙを含む塩基は
Figure 2022552271000018
 である、実施形態７または８の方法。
実施形態１０。ＮＮＸ－ＸＮＮは、ＵＵＸ－ＸＡＡ、ＵＧＸ－ＸＣＡ、ＣＧＸ－ＸＣＧ、ＡＧＸ－ＸＣＵ、ＧＡＸ－ＸＵＣ、ＣＡＸ－ＸＵＧ、ＡＵＸ－ＸＡＵ、ＣＵＸ－ＸＡＧ、ＧＵＸ－ＸＡＣ、ＵＡＸ－ＸＵＡおよびＧＧＸ－ＸＣＣからなる群から選択される、実施形態４～９のいずれか１つの方法。
実施形態１１。ＮＮＸ－ＹＮＮは、ＵＵＸ－ＹＡＡ、ＵＧＸ－ＹＣＡ、ＣＧＸ－ＹＣＧ、ＡＧＸ－ＹＣＵ、ＧＡＸ－ＹＵＣ、ＣＡＸ－ＹＵＧ、ＡＵＸ－ＹＡＵ、ＣＵＸ－ＹＡＧ、ＧＵＸ－ＹＡＣ、ＵＡＸ－ＹＵＡおよびＧＧＸ－ＹＣＣからなる群から選択される、実施形態４～９のいずれか１つの方法。
実施形態１２。ＮＸＮ－ＮＹＮは、ＧＸＵ－ＡＹＣ、ＣＸＵ－ＡＹＧ、ＧＸＧ－ＣＹＣ、ＡＸＧ－ＣＹＵ、ＧＸＣ－ＧＹＣ、ＡＸＣ－ＧＹＵ、ＧＸＡ－ＵＹＣ、ＣＸＣ－ＧＹＧおよびＵＸＣ－ＧＹＡからなる群から選択される、実施形態４～９のいずれか１つの方法。
実施形態１３。ＮＸＮ－ＮＹＮは、ＡＸＧ－ＣＹＵ、ＧＸＣ－ＧＹＣ、ＡＸＣ－ＧＹＵ、ＧＸＡ－ＵＹＣ、ＣＸＣ－ＧＹＧおよびＵＸＣ－ＧＹＡからなる群から選択される、実施形態１２の方法。
実施形態１３．１。ＸＮＮ－ＮＮＹは、ＸＵＵ－ＡＡＹ、ＸＵＧ－ＣＡＹ、ＸＣＧ－ＣＧＹ、ＸＡＧ－ＣＵＹ、ＸＧＡ－ＵＣＹ、ＸＣＡ－ＵＧＹ、ＸＡＵ－ＡＵＹ、ＸＣＵ－ＡＧＹ、ＸＧＵ－ＡＣＹ、ＸＵＡ－ＵＡＹ、ＸＵＣ－ＧＡＹ、ＸＣＣ－ＧＧＹ、ＸＡＡ－ＵＵＹ、ＸＡＣ－ＧＵＹ、ＸＧＣ－ＧＣＹ、ＸＧＧ－ＣＣＹおよびＸＧＧ－ＣＣＹからなる群から選択される、実施形態４．１～９のいずれか１つの方法。
実施形態１３．２。ＸＮＮ－ＮＮＸは、ＸＵＵ－ＡＡＸ、ＸＵＧ－ＣＡＸ、ＸＣＧ－ＣＧＸ、ＸＡＧ－ＣＵＸ、ＸＧＡ－ＵＣＸ、ＸＣＡ－ＵＧＸ、ＸＡＵ－ＡＵＸ、ＸＣＵ－ＡＧＸ、ＸＧＵ－ＡＣＸ、ＸＵＡ－ＵＡＸ、ＸＵＣ－ＧＡＸ、ＸＣＣ－ＧＧＸ、ＸＡＡ－ＵＵＸ、ＸＡＣ－ＧＵＸ、ＸＧＣ－ＧＣＸ、ＸＧＧ－ＣＣＸおよびＸＧＧ－ＣＣＸからなる群から選択される、実施形態４．１～９のいずれか１つの方法。
実施形態１４。少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子は異なる非天然アンチコドンを各々含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
実施形態１５。少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子は、メタノサルシーナ属からのピロリシルｔＲＮＡおよびＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉからのチロシルｔＲＮＡまたはその誘導体を含む、実施形態１４の方法。
実施形態１６。アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによって少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子をチャージすることを含む、実施形態１３、１４または１５のいずれか１つの方法。
実施形態１７。アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはキメラＰｙｌＲＳ（ｃｈＰｙｌＲＳ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＡｚＦＲＳ（ＭｊｐＡｚＦＲＳ）からなる群から選択される、実施形態１６の方法。
実施形態１８。少なくとも２つのｔＲＮＡシンテターゼによって少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子をチャージすることを含む、実施形態１４または１５の方法。
実施形態１９。少なくとも２つのｔＲＮＡシンテターゼはキメラＰｙｌＲＳ（ｃｈＰｙｌＲＳ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＡｚＦＲＳ（ＭｊｐＡｚＦＲＳ）を含む、実施形態１８の方法。
実施形態２０。非天然ポリペプチドは２、３またはそれより多くの非天然アミノ酸を含む、実施形態１～１９のいずれか１つの方法。
実施形態２１。非天然ポリペプチドは同じである少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む、実施形態１～２０のいずれか１つの方法。
実施形態２２。非天然ポリペプチドは少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸を含む、実施形態１～２０のいずれか１つの方法。
実施形態２３。非天然アミノ酸は、
リジン類似体；
芳香族側鎖；
アジド基；
アルキン基；または
アルデヒドもしくはケトン基
を含む、実施形態１～２２のいずれか１つの方法。
実施形態２４。非天然アミノ酸は芳香族側鎖を含まない、実施形態１～２２のいずれか１つの方法。
実施形態２５。非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、Ｎ６－（プロパルギルオキシ）－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒＫ）、ｐ－アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸、セレノシステイン、Ｎ６－（（（２－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ６－（（（３－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、およびＮ６－（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンから選択される、実施形態１～２２のいずれか１つの方法。
実施形態２６。少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子はプラスミドの形態である、前記実施形態のいずれか１つの方法。
実施形態２７。少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は細胞のゲノムに組み入れられる、実施形態１～２６のいずれか１つの方法。
実施形態２８。少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は非天然ポリペプチドをコードする、実施形態２６または２７の方法。
実施形態２９。細胞性生物の中での非天然ＤＮＡ分子のインビボ複製および転写、ならびに転写されたｍＲＮＡ分子のインビボ翻訳を含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
実施形態３０。細胞性生物は微生物である、実施形態２９の方法。
実施形態３１。細胞性生物は原核生物である、実施形態３０の方法。
実施形態３２。細胞性生物は細菌である、実施形態３１の方法。
実施形態３３。細胞性生物はグラム陽性細菌である、実施形態３２の方法。
実施形態３４。細胞性生物はグラム陰性細菌である、実施形態３２の方法。
実施形態３５。細胞性生物は大腸菌である、実施形態３４の方法。
実施形態３６。少なくとも２つの非天然塩基対は、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１またはｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１から選択される塩基対を含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
実施形態３７。細胞性生物はヌクレオシド三リン酸輸送体を含む、実施形態２９～３６のいずれか１つの方法。
実施形態３８。ヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＰｔＮＴＴ２のアミノ酸配列を含む、実施形態３７の方法。
実施形態３９。ヌクレオシド三リン酸輸送体は、ＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列を含む、実施形態３８の方法。
実施形態４０。ＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列は配列番号１によってコードされるＰｔＮＴＴ２と少なくとも８０％同一である、実施形態３９の方法。
実施形態４１。細胞性生物は少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を含む、実施形態２９～４０のいずれか１つの方法。
実施形態４２。少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は少なくとも１つのプラスミドを含む、実施形態４１の方法。
実施形態４３。少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は細胞のゲノムに組み入れられる、実施形態４２の方法。
実施形態４４。少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は非天然ポリペプチドをコードする、実施形態４２または４３の方法。
実施形態４５。無細胞系で非天然ポリペプチドを合成することを含むインビトロ方法である、実施形態１～２６のいずれか１つの方法。
実施形態４６。非天然塩基対は、非天然糖部分を含む少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
実施形態４７。非天然糖部分は：
ＯＨ、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；
Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル；
Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル；
Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル；
Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３、（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０アルキニル、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２および－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であってもよく、ｎおよびｍは、１から約１０である）；
ならびに／または５’位における修飾：
５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）；
４’位における修飾：
４’－Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、およびそれらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される部分を含む、実施形態４６の方法。
実施形態４８。少なくとも４つの非天然塩基対を含む少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を含む細胞であって、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は、（ｉ）非天然ポリペプチドをコードし、少なくとも第１および第２の非天然コドンを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、ならびに（ｉｉ）少なくとも第１および第２の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子をコードし、第１のｔＲＮＡ分子は第１の非天然アンチコドンを含み、第２のｔＲＮＡ分子は第２の非天然アンチコドンを含み、少なくとも１つのＤＮＡ分子中の少なくとも４つの非天然塩基対が、ｍＲＮＡ分子の第１および第２の非天然コドンが第１および第２の非天然アンチコドンにそれぞれ相補的であるような配列コンテキストにある細胞。
実施形態４９。ｍＲＮＡ分子ならびに少なくとも第１および第２のｔＲＮＡ分子をさらに含む、実施形態４８の細胞。
実施形態５０。少なくとも第１および第２のｔＲＮＡ分子は非天然アミノ酸に共有結合している、実施形態４９の細胞。
実施形態５１。非天然ポリペプチドをさらに含む、実施形態５０の細胞。
実施形態５２。細胞であって、
ａ．少なくとも２つの異なる非天然コドン－アンチコドン対であって、各非天然コドン－アンチコドン対は非天然メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からの非天然コドンおよび非天然転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）からの非天然アンチコドンを含み、前記非天然コドンは第１の非天然ヌクレオチドを含み、前記非天然アンチコドンは第２の非天然ヌクレオチドを含む、少なくとも２つの異なる非天然コドン－アンチコドン対；ならびに
ｂ．対応する非天然ｔＲＮＡに各々共有結合している少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸
を含む細胞。
実施形態５３。少なくとも４つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子をさらに含む、実施形態５２の細胞。
実施形態５４。第１の非天然ヌクレオチドは非天然コドンの第２または第３の位置に配置されている、実施形態４８～５３のいずれか１つの細胞。
実施形態５４．１。第１の非天然ヌクレオチドは非天然コドンの第１、第２または第３の位置に配置されている、実施形態４８～５３のいずれか１つの細胞。
実施形態５５。第１の非天然ヌクレオチドは非天然アンチコドンの第２の非天然ヌクレオチドと相補的に塩基対を形成する、実施形態５４または５４．１の細胞。
実施形態５６。第１の非天然ヌクレオチドおよび第２の非天然ヌクレオチドは、
Figure 2022552271000019
 からなる群から独立して選択される第１および第２の塩基をそれぞれ含み、第２の塩基は第１の塩基と異なる、実施形態４８～５５のいずれか１つの細胞。
実施形態５７。少なくとも４つの非天然塩基対は、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１またはｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１からなる群から独立して選択される、実施形態４８または５０～５６のいずれか１つの細胞。
実施形態５８。少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は少なくとも１つのプラスミドを含む、実施形態４８または５０～５７のいずれか１つの細胞。
実施形態５９。少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は細胞のゲノムに組み入れられている、実施形態４８または５０～５８のいずれか１つの細胞。
実施形態６０。少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は非天然ポリペプチドをコードする、実施形態５０～５９のいずれか１つの細胞。
実施形態６１。細胞はヌクレオシド三リン酸輸送体を発現する、実施形態４８～６０のいずれか１つの細胞。
実施形態６２。ヌクレオシド三リン酸輸送体はＰｔＮＴＴ２のアミノ酸配列を含む、実施形態６１の細胞。
実施形態６３。ヌクレオシド三リン酸輸送体はＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列を含む、実施形態６２の方法。
実施形態６４。ＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列は配列番号１によってコードされるＰｔＮＴＴ２と少なくとも８０％同一である、実施形態６３の方法。
実施形態６５。細胞は少なくとも２つのｔＲＮＡシンテターゼを発現する、実施形態４８～６４のいずれか１つの細胞。
実施形態６６。少なくとも２つのｔＲＮＡシンテターゼはキメラＰｙｌＲＳ（ｃｈＰｙｌＲＳ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＡｚＦＲＳ（ＭｊｐＡｚＦＲＳ）である、実施形態６５の細胞。
実施形態６７。細胞は非天然糖部分を含む非天然ヌクレオチドを含む、実施形態４８～６６のいずれか１つの細胞。
実施形態６８。非天然糖部分は：
２’位における修飾：
ＯＨ、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；
Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル；
Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル；
Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル；
Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３、（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０アルキニル、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２および－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であってもよく、ｎおよびｍは、１から約１０である）；
ならびに／または５’位における修飾：
５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）；
４’位における修飾：
４’－Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、およびそれらの任意の組み合わせ
からなる群から選択される、実施形態６７の細胞。
実施形態６９。少なくとも１つの非天然ヌクレオチド塩基は転写の間にＲＮＡポリメラーゼによって認識される、実施形態４８～６８のいずれか１つの細胞。
実施形態７０。細胞は少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む少なくとも１つの非天然ポリペプチドを翻訳する、実施形態４８～６９のいずれか１つの細胞。
実施形態７１。少なくとも２つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、Ｎ６－（プロパルギルオキシ）－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒＫ）、ｐ－アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸、セレノシステイン、Ｎ６－（（（２－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ６－（（（３－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、およびＮ６－（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンからなる群から独立して選択される、実施形態４８～７０のいずれか１つの細胞。
実施形態７２。単離されている、実施形態４８～７１のいずれか１つの細胞。
実施形態７３。原核生物である、実施形態４８～７２のいずれか１つの細胞。
実施形態７４。実施形態４８～７３のいずれか１つの細胞を含む細胞系。
実施例１。最初のコドンスクリーニング
ｎｃＡＡの特にＹ１５１位での組み込みの研究のためのモデルシステムとして、様々な天然のおよびｎｃＡＡ置換に耐えることが示されているｓｆＧＦＰなどの緑色蛍光タンパク質および変異体が使用されている。２つのｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３ ＵＢＰを含有するようにプラスミドを構築し、１つはｓｆＧＦＰのコドン１５１の中に配置され、他はＭ．ｍａｚｅｉ ｔＲＮＡＰｙｌのアンチコドンをコードするように配置され（図６Ｃ）、それはＰｙｌＲＳによってｎｃＡＡ Ｎ６－（（２－アジドエトキシ）－カルボニル）－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）で選択的にチャージされた（図６Ｂ）。２つの最初の位置の非天然コドン（ＸＴＣおよびＸＴＧ；ＸはｄＮａＭを指す）、２つの第２の位置の非天然コドン（ＡＸＣおよびＧＸＡ）および２つの非天然の第３の位置のコドン（ＡＧＸおよびＣＡＸ）を含む６つのコドン、ならびに反対鎖のコンテキストコドン（ＹＴＣ、ＹＴＧ、ＡＹＣ、ＧＹＡ、ＡＧＹおよびＣＡＹ；ＹはｄＴＰＴ３を指す）の解読を調べるためにプラスミドを構築した。
おそらくインビトロ構築の間に誤って組み立てられたプラスミドが排除されることにより、ＳＳＯのクローン集団は純粋な非天然タンパク質のより多くの量を生成することができるが、最初のコドンスクリーニングを促進するために、タンパク質発現を細胞の非クローン集団で先ず調査し、形質転換の直後にタンパク質生成を分析した。大腸菌ＭＬ２（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｌａｃＺＹＡ：ＰｔＮＴＴ２（６６－５７５）ΔｒｅｃＡｐｏｌＢ＋＋）を形質転換するためにキメラピロリシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ｃｈＰｙｌＲＳＩＰＹＥ）をコードするアクセサリープラスミドを持ったプラスミドを使用し、ｄＮａＭＴＰおよびｄＴＰＴ３ＴＰを追加した選択培地で静止期初期まで増殖した後、細胞を新鮮培地へ移した。中間指数増殖期まで増殖した後、培養にＮａＭＴＰ、ＴＰＴ３ＴＰおよびＡｚＫを追加し、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）、ｃｈＰｙｌＲＳＩＰＹＥおよびｔＲＮＡＰｙｌの発現を誘導した。１時間のさらなる増殖の後、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を加えてｓｆＧＦＰの発現を誘導し、それを蛍光によって監視した。
第１の位置のコドンは、ヘテロ対形成または自己対形成アンチコドン（例えば、ＸＴＧの場合にはそれぞれｔＲＮＡＰｙｌ（ＣＡＹ）またはｔＲＮＡＰｙｌ（ＣＡＸ））で解読が試みられたか否かを問わず、ＡｚＫの非存在下でも存在下でも有意な蛍光を示さなかった（図１０）。第２の位置にｄＮａＭを有するコドンはＡｚＫの非存在下でほとんど蛍光を示さなかったが、その存在下ではヘテロ対形成アンチコドンｔＲＮＡＰｙｌ（ＧＹＴ）またはｔＲＮＡＰｙｌ（ＴＹＣ）で再コードしたｔＲＮＡＰｙｌで解読した場合に有意な蛍光を示したが、自己対形成アンチコドンｔＲＮＡＰｙｌ（ＧＸＴ）またはｔＲＮＡＰｙｌ（ＴＸＣ）の場合は違った。第２の位置にｄＴＰＴ３がある場合、ヘテロ対形成または自己対形成ｔＲＮＡで解読が試みられたか否かを問わず、加えられたＡｚＫの有無にかかわらず蛍光は観察されなかった。第３の位置のコドンＣＡＸおよびＣＡＹは、ヘテロ対形成または自己対形成ｔＲＮＡＰｙｌで解読が試みられたか否かを問わず、ＡｚＫの非存在下で高い蛍光を示し、驚くべきことにその添加でより少ない蛍光を示した。この結果は、対応する第３の位置の非天然ｔＲＮＡがリボソームで非生産的に結合し、天然ｔＲＮＡによる非天然コドンリードスルーをブロックすることを示唆する。ＡｚＫの非存在下では、ＡＧＸおよびＡＧＹはほとんど蛍光を示さず、ｔＲＮＡＰｙｌ（ＸＣＴ）によるＡＧＸはＡｚＫの添加で蛍光の増加を示した。
第１の位置のコドンは有望でないようであったので、第２の位置のコドンのより包括的なスクリーニングを実行した。初期の分析はコドン中のＮａＭおよびアンチコドン中のＴＰＴ３だけで潜在的な解読を示したので、ＮＸＮコドンおよび同族のｔＲＮＡＰｙｌ（ＮＹＮ）を検討した。１６個の可能なコドンのうち、対応する配列コンテキストがＳＳＯのＤＮＡで十分に保持されなかったので、ＣＸＡ、ＣＸＧおよびＴＸＧを排除した。以前の結果と一致して、ＡｚＫの非存在下でコドンＡＸＣおよびＧＸＣの使用は蛍光をほとんどあるいは全くもたらさなかったが、ＡｚＫの存在下でそれらは有意な蛍光をもたらした（図６Ｄ）。同様に、ＧＸＴ、ＣＸＣ、ＴＸＣ、ＧＸＧ、ＧＸＡ、ＣＸＴおよびＡＸＧコドンでは、ＡｚＫの添加はＡｚＫを控えた場合と比較して蛍光の有意な増加をもたらした。残りの４つのコドンＡＸＡ、ＡＸＴ、ＴＸＡおよびＴＸＴは、ＡｚＫを加えたか否かを問わずほとんど蛍光を生成せず、少なくとも１つのＧ－Ｃ対へのストリンジェントな要求を明らかにした。
非天然タンパク質生成についてスクリーニングするために、ｓｆＧＦＰはＣ末端のＳｔｒｅｐＩＩ親和性タグを通して精製し、４つのＰＥＧ単位（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＴＡＭＲＡ）によってローダミン色素（ＴＡＭＲＡ）に連結されたジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）との歪促進アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）反応にかけた。以前に示されるように、成功したコンジュゲーションはｎｃＡＡを含有するタンパク質に検出可能な蛍光体で標識をつけるだけでなく、電気泳動移動性で検出可能なシフトも生成し、生成した全タンパク質と比較したＡｚＫ含有タンパク質の定量を可能にする（すなわち、ｎｃＡＡ組み込みの忠実度；図６Ｄ）。以前の結果と一致して、コドンＧＸＣおよびＡＸＣの使用は、ＡｚＫ残基でｓｆＧＦＰの有意な量の生成をもたらした。注目すべきことに、７つのさらなる非天然コドンＧＸＴ、ＣＸＣ、ＴＸＣ、ＧＸＧ、ＧＸＡ、ＣＸＴおよびＡＸＧも、有意なレベルの非天然タンパク質をもたらした（図６Ｄ、図１１）。
最後に、第３の位置のコドンのより包括的なスクリーニングを実行した。最初のスクリーニングではその時だけ自己対形成ｔＲＮＡＰｙｌ（ＸＣＴ）によってＡＧＸだけが解読されるようだったので、同族の自己対形成ｔＲＮＡＰｙｌ（ＸＮＮ）（図６Ｃ）によるコドンの第３の位置にｄＮａＭを有するコドンをさらに調べた。ＮＣＸコドンは、それらが上記のようにＳＳＯのＤＮＡでよく保持されないＮＣＸＡの配列コンテキストをもたらすので排除された。最初の分析と一致して、ＡｚＫの非存在下では、これらのコドンは第２の位置のコドンで観察されたものより多くの蛍光を一般的にもたらしたが、ＡｚＫの存在下では蛍光の変動性の増加が観察された（図６Ｄ）。それにもかかわらず、タンパク質を単離し、前記のように分析したとき、ＣＧＸ、ＡＴＸ、ＣＡＸ、ＡＧＸ、ＧＡＸ、ＴＧＸ、ＣＴＸ、ＴＴＸ、ＧＴＸまたはＴＡＸの使用は、有意なレベルの非天然タンパク質の生成を全てもたらした（図６Ｄ、図１１）。コドンＧＧＸは複数のシフト種を生成し、ｔＲＮＡＰｙｌ（ＸＣＣ）が１つまたはそれ以上の天然のコドンを解読することを示唆した。コドンＡＡＸを使用したとき、非天然タンパク質は検出されなかった。
実施例２。クローンＳＳＯでのコドン特徴付け
上記のコドンスクリーニングで特定された最も有望なコドン／アンチコドン対を選択するために、ＡｚＫの存在下で観察された蛍光および単離されたタンパク質での誘導された移動性シフト（図６Ｄ、はめ込み）を比較した。この分析に基づいて、７つの非天然コドン／アンチコドン対、ＧＸＣ／ＧＹＣ、ＧＸＴ／ＡＹＣ、ＡＸＣ／ＧＹＴ、ＡＧＸ／ＸＣＴ、ＣＧＸ／ＸＣＧ、ＴＴＸ／ＸＡＡ、ＴＧＸ／ＸＣＡをさらなる特徴付けのために選択した。これらのコドン／アンチコドン対は、誤って組み立てられたプラスミドまたはインビトロ構築の間にＵＢＰを失ったプラスミドで形質転換された細胞を排除するクローンＳＳＯで調べた。クローンＳＳＯは、形質転換体をｄＮａＭＴＰおよびｄＴＰＴ３ＴＰを含有する固体増殖培地の上に画線し、個々のコロニーを選択し、プラスミド完全性および高いＵＢＰ保持を確認することによって得られた。高保持クローンを再増殖させ、前記のタンパク質を生成するように誘導した。注目すべきことに、観察された蛍光は７つのコドン／アンチコドン対の各々がアンバー抑制対照に有利に匹敵するレベルでタンパク質を生成することを示し、さらに、ゲルシフトアッセイはｓｆＧＦＰの事実上全てがｎｃＡＡを含有することを実証する（図７Ａ、図１２）。コドン／アンチコドンＡＧＸ／ＸＣＴ、ＣＧＸ／ＸＣＧ、ＴＴＸ／ＸＡＡおよびＴＧＸ／ＸＣＡを使用した解読は、加えたＴＰＴ３ＴＰの有る無しの両方で類似のＡｚＫ含有量により発現培地中のＮａＭＴＰだけに依存してｓｆＧＦＰを生成した（図１３）。
上で分析した７つの非天然コドン／アンチコドン対は、リボソームでの効率的な解読を明らかに媒介した；しかし、予備的非クローンスクリーニングからの他のコドンがクローンＳＳＯで分析した場合に効率的な解読を示した可能性があった。したがって、４つのさらなるコドン／アンチコドン対ＴＸＣ／ＧＹＡ、ＧＸＧ／ＣＹＣ、ＣＸＣ／ＧＹＧおよびＡＸＴ／ＡＹＴによるクローンＳＳＯにおける非天然タンパク質生成を調査した。高いＵＢＰ保持（表１）にもかかわらず、ＡＸＴはＡｚＫの有無にかかわらず蛍光シグナルを示さず、第２の位置のコドンでのＧ－Ｃ対への要求をさらに裏付けた。ＴＸＣ、ＣＸＣおよびＧＸＧのための加えられたＡｚＫによる蛍光は、７つの最初に特徴付けられたコドンのそれと同等だったが、それはＡｚＫの非存在下で若干より高かった（図７Ａ）。ＳＰＡＡＣゲルシフト分析は、ＣＸＣが非クローンＳＳＯによる予備的スクリーニングで観察されたものより有意にシフトしたタンパク質をクローンＳＳＯで明らかにもたらしたことを明らかにし、ＴＸＣおよびＧＸＧもそうであった可能性が高いが、予備的スクリーニングからのデータの比較的より大きな誤差が定量的比較を妨げた（図７Ｂ）。データは、一部のコドンについては、スクリーニングでの最適に満たない性能が、少なくとも一部インビトロプラスミド構築における配列依存性の差からもたらされたことを示唆した。それにもかかわらず、結果は２つのさらなる高忠実度コドン、ＴＸＣおよびＣＸＣを特定し、より生存能力のあるコドンをまだ特定することができることを示唆した。
非天然コドン／アンチコドン対の直交性の評価を開始するために、ＡＸＣ／ＧＹＴ、ＧＸＴ／ＡＹＣおよびＡＧＸ／ＸＣＴを選択して、非天然コドンおよびアンチコドンの全てのペアワイズ組み合わせでクローンＳＳＯにおけるタンパク質生成について調べた。ＡｚＫを加えると、各非天然コドンを同族の非天然アンチコドンと対にした場合、有意な蛍光が観察され、非同族の非天然アンチコドンと対にした場合はバックグラウンドと比べて増加は事実上観察されなかった（図７Ｂ）。したがって、ＡＸＣ／ＧＹＴ、ＧＸＴ／ＡＹＣおよびＡＧＸ／ＸＣＴはＳＳＯで直交性であり、同時使用が可能であった。
実施例３。２つの非天然コドンの同時解読。
複数のコドンの同時解読を探るために、ＧＸＴおよびＡＸＣとそれぞれ置き換えられた位置１９０および２００の天然ｓｆＧＦＰコドン（ｓｆＧＦＰ１９０、２００（ＧＸＴ、ＡＸＣ））で、プラスミドを先ず構築した。さらに、プラスミドはｔＲＮＡＰｙｌ（ＡＹＣ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡｐＡｚＦをコードし、それはＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＴｙｒＲＳ（ＭｊＴｙｒＲＳ）によってｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡｚＦ；図６Ｂ）で選択的にチャージされ、そのアンチコドンはＡＸＣを認識するように再コードされた（ｔＲＮＡｐＡｚＦ（ＧＹＴ）；図８Ａ）。ｃｈＰｙｌＲＳＩＰＹＥおよびＭｊｐＡｚＦＲＳをコードするアクセサリープラスミドを持つ大腸菌ＭＬ２をＵＢＰ含有プラスミドで形質転換させ、クローンＳＳＯを得て増殖させ、前記のようにｓｆＧＦＰを生成するように誘導した。ＡｚＫおよびｐＡｚＦが提供されると、単一コドン構築物による発現と同じタイムスケールで増加した細胞蛍光が観察された（図８Ｂ、図１４）。ｓｆＧＦＰ１９０、２００（ＧＸＴ、ＡＸＣ）からの発現による蛍光のレベルはｓｆＧＦＰ１９０（ＧＸＴ）またはｓｆＧＦＰ２００（ＡＸＣ）で観察されたものの若干半分未満であったが、それは対応するサプレッサーｔＲＮＡで解読されたアンバー、オーカー対照（ｓｆＧＦＰ１９０、２００（ＴＡＡ、ＴＡＧ））から観察されたものより有意に高かった（図８Ｃ、図１４）。いずれの場合も、ＳＰＡＡＣゲルシフトで分析した場合、シフトしていないバンドは明らかでなく、主要バンドの移動性は単一のｎｃＡＡの組み込みで観察されたものと比較してさらに遅れ、２つのｎｃＡＡが実際に組み込まれたことを示唆した（図８Ｄ）。ｐＡｚＦおよびＡｚＫの両方が組み込まれたことを確認するために、定量的インタクトタンパク質質量分析（ＨＲＭＳ ＥＳＩ－ＴＯＦ）を使用して精製タンパク質を分析した。ゲルシフトアッセイと一致して、この分析は単離されたタンパク質の９１±１．１％がｐＡｚＦおよびＡｚＫの両方を含有し、１．７±０．４％は単一のｐＡｚＦを、７．５±０．７８％は単一のＡｚＫを含有することを明らかにした（図１５）。いずれの場合も、特定された不純物の質量はｄＸからｄＴへの突然変異と一貫したアミノ酸置換に対応し、ｎｃＡＡ組み込み忠実度の喪失の大半が複製の間のｄＮａＭまたはｄＴＰＴ３の喪失からもたらされ、転写または翻訳の間の過誤のためでないことを示唆する。ＵＢＰの保持は、ストレプトアビジン－ビオチンシフトアッセイに基づいた。保持は、正規化を実行できなかったｔＲＮＡｐＡｚＦおよびｔＲＮＡＳｅｒを除いて、ｓｓＤＮＡ鋳型対照の相対シフトに正規化された相対シフト（すなわち、シフトしたバンドのシグナルをシフトしたおよび未シフトのバンドの全シグナルによって割る）を含んでいた。平均±標準偏差を示した（表１）。
Figure 2022552271000020
Figure 2022552271000021
ＳＳＯは１６±３．２μｇ・ｍｌ－１の精製タンパク質をもたらしたが、アンバー、オーカー抑制対照は６．８±１．１μｇ・ｍｌ－１をもたらした。しかし、ＳＳＯ培養はアンバー、オーカー対照細胞より低い密度まで増殖することが記され、ＯＤ６００のために正規化したとき、ＳＳＯは１３±１．６μｇ・ｍｌ－１の精製タンパク質をもたらし、他方、アンバー、オーカー抑制は２．８±０．２８μｇ・ｍｌ－１をもたらし、ＳＳＯはＯＤ６００により４．５倍を超えるより多くのタンパク質を生成したことを実証した。全ての収量は、親和性精製の間に過剰なＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ ＸＴビーズを使用したｓｆＧＦＰ捕捉によって決定した。収量は、ｔ＝１８０分の発現時の最終ＯＤ６００に正規化した。平均±標準偏差を示した（表２）。したがって、ＳＳＯは２つのｎｃＡＡで非天然タンパク質を効率的に生成する。
Figure 2022552271000022
異なる官能基を有するｎｃＡＡによるタンパク質の発現を特徴付けるために、ｓｆＧＦＰ１９０、２００（ＧＸＴ、ＡＸＣ）を前記のようにＳＳＯで発現させたが、増殖培地にｃｈＰｙｌＲＳＩＰＹＥによって同じく認識されるＮ６－（プロパルギルオキシ）－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒＫ、図６Ｂ）をＡｚＫの代わりに追加した。ＳＳＯでもアンバー、オーカー対照でも蛍光によって発現への実質的な影響は観察されなかった（図８Ｅ）。各場合に、ＰｒＫおよびｐＡｚＦの正しい組み込みがＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯによるＳＰＡＡＣ、およびそれに続くＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－アジドを使用した銅触媒アルキン－アジド環化付加（ＣｕＡＡＣ）により検証され、両方とも電気泳動移動性で観察可能なシフトを誘導した。ＳＳＯならびにアンバー、オーカー対照によって生成されたタンパク質は、予想されたゲルシフトおよびＴＡＭＲＡシグナルを示す（図８Ｆ）。
実施例４。３つの非天然コドンの同時解読
３つの直交性非天然コドンの同時解読を探るために、内因性セリンｔＲＮＡＳｅｒ、大腸菌ＳｅｒＴを用い、それはアンチコドン認識なしの内因性ＳｅｒＲＳをチャージされ、非天然コドンを解読するように以前に再コードされた。ｃｈＰｙｌＲＳＩＰＹＥおよびＭｊｐＡｚＦＲＳをコードするアクセサリープラスミドを持つ大腸菌ＭＬ２を、ｓｆＧＦＰ１５１、１９０、２００（ＡＸＣ、ＧＸＴ、ＡＧＸ）ならびにｔＲＮＡＰｙｌ（ＸＣＴ）、ｔＲＮＡｐＡｚＦ（ＧＹＴ）およびｔＲＮＡＳｅｒ（ＡＹＣ）を発現するプラスミドで形質転換させ（図９Ａ）、クローンＳＳＯを調製し、増殖させ、前記のようにタンパク質を生成するように誘導した。ＡｚＫおよびｐＡｚＦを培地に加えると有意な蛍光が観察され、２つのコドンの同時解読について上で得られた結果に類似していた（図９Ｂ、図１４）。これらの細胞は１２．１±１．９μｇ ｍｌ－１（７．８±１．１μｇ ｍｌ－１ ＯＤ－１）の単離されたタンパク質をもたらし、それは２つの非天然コドンの解読で単離された量よりわずかに少なかった（表２）。ｐＡｚＦ、ＡｚＫおよびＳｅｒが全て組み込まれたことを確認するために、定量的インタクトタンパク質質量分析（ＨＲＭＳ ＥＳＩ－ＴＯＦ）により精製タンパク質を分析し、単離されたタンパク質の９６±０．６３％がｐＡｚＦ、ＡｚＫおよびＳｅｒを含有し、主要な不純物がＡｚＫおよびＳｅｒだけを含有するｓｆＧＦＰである（３．５±０．６３％）ことを見出した。Ｓｅｒ組み込みのないタンパク質はほとんど検出不能であった（０．２０±０．０８７％）が、ｐＡｚＦおよびＳｅｒだけを含有するタンパク質に対応する質量は検出できなかった（図９Ｃ、図１６）。さらに、Ｓｅｒ、ＡｚＫまたはｐＡｚＦの複数の挿入に対応するいかなる不純物も検出されなかった。
実施例５。非天然ポリペプチドのインビボ発現の方法
材料
使用したオリゴヌクレオチドおよびプラスミドの完全なリストが、表３にある。天然のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびｇＢｌｏｃｋｓを、ＩＤＴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）がシークエンシングを実行した。全てのＤＮＡ精製は、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈシリカカラムキットを使用して実行された。全てのクローニング酵素およびポリメラーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から購入した。全てのバイオコンジュゲーション試薬は、Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）から購入した。この試験で使用した全ての非天然ヌクレオシド三リン酸およびヌクレオシドホスホラミダイトは、民間の供給元から得られた。文献に記載されている通りに合成されたｓｆＧＦＰ２００（ＡＧＸ）を除いて、全てのｓｓＤＮＡ ｄＮａＭ鋳型も民間の供給元から得られた。
Figure 2022552271000023
Figure 2022552271000024
Figure 2022552271000025
増殖条件
リン酸カリウム（５０ｍＭ ｐＨ７）を追加した３００μｌの２×ＹＴ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地で、全ての細菌実験を実行した。増殖は、３７℃で２００ｒ．ｐ．ｍ．の振盪（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｉｎｉｔｒｏｎ）により平底４８ウェルプレート（ＣＥＬＬＳＴＡＲ、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）で実行した。抗生物質は以下の濃度で使用した（特に明記しない限り）：クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびゼオシン（５０μｇ／ｍｌ）。非天然ヌクレオシド三リン酸は、以下の濃度で使用した（特に明記しない限り）：ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（１０μＭ）、ＮａＭＴＰ（２５０μＭ）、ＴＰＴ３ＴＰ（３０μＭ）。ＵＢＰ培地は、ｄＮａＭＴＰおよびｄＴＰＴ３ＴＰを含有する前記２×ＹＴ培地と規定される。
プラスミド構築
大きな挿入（＞１００ｂｐ）、ＭｊｐＡｚＦＲＳ、ｔＲＮＡまたは抗生物質耐性カセットの挿入は、ＰＣＲアンプリコンまたはｇＢｌｏｃｋｓのギブソンアセンブリで実行した。アンプリコンは、５０℃で１．５時間のアセンブリの前に夜間に室温でＤｐｎＩで処理した。欠失または小さい挿入（＜５０ｂｐ；例えば、コドンもしくはアンチコドン突然変異誘発、制限部位の除去またはゴールデンゲート目的部位の導入）は、全体のプラスミドを増幅するように設計されたＰＣＲプライマーオーバーハングへ所望の変化を導入することによって構築した。プライマーは、ＰＣＲの前にＴ４ ＰＮＫを使用してリン酸化し、生じたＰＣＲアンプリコンは夜間に室温でＤｐｎＩにより処理し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して再環化させた。最初のアセンブリ／ライゲーションの後、プラスミドはエレクトロコンピテントＸＬ－１０ゴールド細胞に形質転換させ、選択ＬＢ Ｌｅｎｎｏｘ寒天（ＢＰ Ｄｉｆｃｏ）の上で増殖させた。個々のコロニーからプラスミドを単離し、使用時にサンガーシークエンシングによって検証した。この試験で使用した全てのプラスミドは、表４に見出される。全てのｓｆＧＦＰ読み枠はＰＴ７－ｔｅｔＯによって制御され、全てのｔＲＮＡはＰＴ７－ｌａｃＯによって制御された。主鎖ｐＳＹＮは：複製起点（ｐ１５Ａ）ｂｌｅｏＲを含有する。主鎖ｐＧＥＸは：複製起点（ｐＢＲ３２２）ａｍｐＲを含有する。ゴールデンゲート目的部位（ｄｅｓｔ）は、認識配列ＢｓａＩ－ＫｐｎＩ－ＢｓａＩで構成された。
Figure 2022552271000026
Figure 2022552271000027
ＵＢＰオリゴのＰＣＲ
ＵＢＰ含有配列を有する二本鎖ＤＮＡ挿入断片は、鋳型として化学的に合成されたｄＮａＭ含有ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（リストＢ）を使用した、プライマー（リストＡ）によるＰＣＲ（ＯｎｅＴａｑ標準緩衝液１×、０．０２５単位／μｌ ＯｎｅＴａｑ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．１ｍＭ ｄＴＰＴ３ＴＰ、０．１ｍＭ ｄＮａＭＴＰ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、１．０μＭプライマー、約２０ｐＭ鋳型；サイクル：９６℃ ０：３０分、９６℃ ０：３０分、５４℃ ０：３０分、６８℃ ４：００分、蛍光読取、工程２へ行く＜２４回）から得られた。位置ｓｆＧＦＰ１９０およびｓｆＧＦＰ２００のための挿入断片は、上と同一の条件を使用したが両鋳型が１ｎＭのオーバーラップ伸張によって合わせた。増幅を監視し、ＳＹＢＲ緑色トレースがプラトーに達したとき反応物を氷上に置いた。生成物は、単一のアンプリコンを検証するために天然のＰＡＧＥ（６％アクリルアミド：ビスアクリルアミド２９：１；１×ＴＢＥ中のＳＹＢＲゴールド染色剤）を通して分析し、スピンカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の上で精製し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して定量化した。
ＳＳＯ発現ベクターのゴールデンゲートアセンブリ
ＵＢＰ含有挿入断片は、各挿入断片とエントリーベクターの３：１のモル比によるゴールデンゲートアセンブリ（Ｃｕｔｓｍａｒｔ緩衝液１×、１ｍＭ ＡＴＰ、６．６７単位／μｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、０．６７単位／μｌ ＢｓａＩ－ＨＦｖ２、２０ｎｇ／μｌエントリーベクターＤＮＡ；サイクル：３７℃ １０：００分、３７℃ ５：００分、１６℃ ５：００分、２２℃ ２：００分、工程２から３９回反復する、３７℃ ２０：００分、５５℃ １５：００分、８０℃ ３０：００分）によってｐＳＹＮエントリーベクターフレームワーク（表４）に組み込んだ。図６の実験のために、ＢｓａＩ－ＨＦを使用した。残留線状ＤＮＡおよび未消化エントリーベクターを先ずＫｐｎＩ－ＨＦ（０．３３単位／μｌ、３７℃で１時間）で、続いてＴ５エキソヌクレアーゼ（０．１７単位／μｌ、３７℃で３０分間）で消化した。生成物をスピンカラムの上で精製し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して定量化した。
コンピテントスターター細胞の調製
株ＭＬ２（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｌａｃＺＹＡ：：ＰｔＮＴＴ２（６６－５７５）ΔｒｅｃＡ ｐｏｌＢ＋＋）をアクセサリーｐＧＥＸプラスミド（表４）で形質転換させ、クロラムフェニコールおよびカルベニシリンを含有するＬＢ Ｌｅｎｎｏｘ寒天の上に平板培養した。単一のコロニーを選び出し、前述の通り（Ｚｈａｎｇら、２０１７）放射性［α－３２Ｐ］ｄＡＴＰの取り込みによってＰｔＮＴＴ２活性について検証した。ＵＢＰ複製および翻訳のコンピテント細胞を、０．２５～０．３０のＯＤ６００まで３７℃で２５０ｒ．ｐ．ｍ．のバッフル培養フラスコの中で２×ＹＴ培地で増殖させることによって調製した。前冷却した５０ｍＬファルコン管へ培養を移し、氷水浴の中で２分間静かに振盪した。細胞を遠心分離（１０分間、３２００ｒ．ｐ．ｍ）によってペレットにし、無菌の冷水で洗浄し、ペレットにし、再び洗浄し、その後最後にペレットにし、１０ｍＬの培養につき５０μｌの１０％グリセロールに懸濁させた。細胞は直ちに使用したか、または後の使用のために－８０℃で冷凍した。
非クローン集団実験
新たに調製されたコンピテント細胞を約０．４ｎｇのゴールデンゲートアセンブリ生成物でエレクトロポレーションし（２．５ｋＶ）、リン酸カリウム（５０ｍＭ ｐＨ７）を追加した９５０μｌの２×ＹＴに直ちに懸濁し、そのうちの１０μｌをゼオシンなしの１．２５ＸｄＮａＭＴＰおよびｄＴＰＴ３ＴＰを含有するＵＢＰ培地の４０μｌに希釈した。３７℃で１時間細胞を回収した後に、１５μｌの細胞をゼオシンを含有する２８５μｌのＵＢＰ培地に懸濁させ、４８ウェルプレートの中で振盪させながら３７℃で増殖させた。ＯＤ６００約１の静止期に到達する前に培養を氷へ移し、タンパク質発現のために一晩保存した。
クローンＳＳＯ実験
コンピテント細胞をゴールデンゲートアセンブリ生成物（１～２０ｎｇ）でエレクトロポレーションし、非クローン集団実験のために回収した。１０μｌの回収培養（および、その希釈溶液）を、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ゼオシン、ｄＮａＭＴＰおよびｄＴＰＴ３ＴＰを含有する寒天液滴（２５０μｌの２×ＹＴ ２％寒天 ５０ｍＭリン酸カリウム）の上へ広げることによって平板培養を実行した。概ね０．５ｍｍの直径のコロニーを選び出し、プレート上での増殖（１２～２０時間；３７℃）の後、ＵＢＰ培地（３００μｌ）に懸濁させた。ＯＤ約１の静止期に到達する前に各培養を氷上の予冷管へ移し、タンパク質発現のために一晩保存した。各培養は、１）ストレプトアビジンビオチンシフトアッセイを（下記のように）使用したＵＢＰ保持、および２）培養を発現のための成分（リボヌクレオシド三リン酸、ｎｃＡＡ、ＩＰＴＧおよびアンヒドロテトラサイクリン）を既に含有している培地と１：４で混合することによる定性的ｓｆＧＦＰ発現について事前にスクリーニングした。コロニーは、それらが３７℃で２時間のまたは室温で一晩のインキュベーションの後に適当なｎｃＡＡが加えられた場合にいかなる蛍光シグナルも生成しなかったならば、捨てられた。さらに、ｓｆＧＦＰで＜８０％のＵＢＰ保持のコロニーは捨てられた。３つを超えるコロニーがこれらの判定基準を満たしたならば、材料費を制限するために最も高いＵＢＰ保持を有する３つだけを選択した。図７Ａの破線の右側のデータは、わずかに改変された方法を通して得られた。前記のようにコロニーを事前にスクリーニングする代わりに、多数のコロニーの上で発現を実行したが、タンパク質分析は発現の間に有望な蛍光を示した培養のために実行しただけだった。発現の間、１０ｍＭ ＡｚＫを使用した。さらに、タンパク質精製の間には緩衝液Ｗ２を緩衝液Ｗの代わりに使用した。
事前にクローニングしたＳＳＯ発現ベクター
図７Ｂ、図８および図９の実験では、コロニーの事前スクリーニングを容易にするために（事前にクローニングした）形質転換のための出発プラスミドの役割をさせるために、事前にスクリーニングしたコロニーからのプラスミドを単離した（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）。適当なｎｃＡＡ（複数可）によるｓｆＧＦＰ発現からの定性的蛍光のために、プラスミドを事前にスクリーニングした（上記の通り）。暗いおよび蛍光性シグナルをそれぞれ定性的に生成するために、図７ＢのデータのためのコロニーをＡｚＫの存在下でｒＮａＭＴＰおよびｒＴＰＴ３ＴＰの有る無しで代わりに事前にスクリーニングした。全ての事前にクローニングしたプラスミドを、ｓｆＧＦＰでのＵＢＰ保持（＞８０％）について事前にスクリーニングした。さらに、ｄＸからｄＮへの突然変異を強制するために非天然ヌクレオシド三リン酸無しで標準のＯｎｅＴａｑプロトコール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してこれらのプラスミドをＰＣＲ増幅し、プラスミドにおける天然配列の完全性を検証するために、アンプリコンに対してサンガーシークエンシングを行った。タンパク質コード配列ではサイレント突然変異が許された。
ＵＢＰタンパク質発現
培養は、ＵＢＰ培地でＯＤ６０００．１０～０．１５まで、および３７℃振盪でＯＤ０．５～０．８まで回復させ、その時には５ｍＭ ｐＡｚＦ、２０ｍＭ ＡｚＫまたは１０ｍＭ ＰｒＫでリボヌクレオチド三リン酸をｎｃＡＡと一緒に２５０μＭのＮａＭＴＰおよび３０μＭのＴＰＴ３ＴＰに加えた。二重／三重コドン実験またはその対照では１０ｍＭのＡｚＫだけを使用した（図８、図９）。２０分間のさらなるインキュベーションの後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を加えることによって前誘発を開始し、培養をさらに１時間インキュベートした。最後に、アンヒドロテトラサイクリン（１００ｎｇ／μｌ）を加えることによるｔｅｔＯの脱抑制によって、ｓｆＧＦＰ発現を誘導した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌリーダー（ＯＤ：５９０／２０ｎｍフィルター；ｓｆＧＦＰ：ｅｘ．４８５／１４ｎｍ、ｅｍ．５３５／２５ｎｍ）を使用して、ＯＤ６００およびＧＦＰ蛍光を監視した（３０分ごとに）。３時間の発現の後、培養をペレットにし、後の分析のために－８０℃で保存した。
ＵＢＰ保持についてのストレプトアビジン－ビオチンシフトアッセイ
プラスミドＤＮＡでのＵＢＰ保持は、非天然ヌクレオシド三リン酸ｄ５ＳＩＣＳＴＰならびにビオチン化ｄＮａＭ類似体ｄＭＭＯ２ＢｉｏＴＰを使用したＰＣＲ増幅によって決定した。ＳＳＯからのプラスミドは標準のミニプレップを通して単離し、ＳＳＯ発現プラスミド（ｐＳＹＮ）およびアクセサリープラスミド（ｐＧＥＸ）の混合物をもたらした。合計２ｎｇのプラスミド混合物を、１５μｌのＰＣＲ反応（ＯｎｅＴａｑ標準緩衝液１×、０．０１８単位／μｌのＯｎｅＴａｑ、０．００７単位／μｌのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、０．１ｍＭ ｄ５ＳＩＣＳＴＰ、０．１ｍＭ ｄＭＭＯ２ＢｉｏＴＰ、２．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ＸＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、１．０μＭプライマー；サイクル：９６℃ ２：００分、９６℃ ０：３０分、５０℃ ０：１０分、６８℃ ４：００分、蛍光読取、６８℃ ０：１０分、工程２へ行く＜２４回）で鋳型として使用した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉトレースがプラトーへの増幅を示したので、個々の試料は各サイクルの最後の工程の間に取り出した。生じたビオチン化アンプリコンに、１．５～２．０μｌの未精製ＰＣＲ反応につき１０μｇのストレプトアビジン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を追加した。ストレプトアビジン結合分画は６％天然ＰＡＧＥによるシフトとして可視化し、シフトしたおよびシフトしていないバンドは、シフトの相対的な生のパーセンテージをもたらすＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏＬｉｔｅまたはＦｉｊｉによって定量化した。化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応の鋳型とすることによって生成された対照シフトに生のシフトを正規化することによって、全体のＵＢＰ保持を調査した。ゴールデンゲート挿入断片の外でアニールし、したがって対応する対照オリゴヌクレオチドにアニールしなかったプライマーだけで忠実な増幅が可能であったので、正規化はｔＲＮＡｐＡｚＦでもｔＲＮＡＳｅｒでも可能でなかった。
タンパク質精製
ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（１００μｌ；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１５分間；室温；２２０ｒ．ｐ．ｍ．）を使用してタンパク質発現実験からの細胞ペレット（２００μｌ）を溶解した。細胞溶解物は、５００μｌから使用した親和性ビーズの量を引いたものに等しい最終量まで、緩衝液Ｗ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で次に希釈した。磁気Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ ＸＴビーズ（ＭａｇＳｔｒｅｐ「タイプ３」ＸＴビーズ、ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓの５％（ｖ／ｖ）懸濁液）をルーチン精製の場合は２０μｌで、および全発現収量の推定のためには１００μｌで使用した。タンパク質をビーズに結合させ（３０分間；４℃；静かな回転）、その後ビーズを引き落とし、緩衝液Ｗ（２×５００μｌ）で洗浄した。ＨＲＭＳ分析のためのタンパク質精製では、緩衝液Ｗ２を代わりに使用した（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）。最後に、時折ボルテックスしながら２５μｌの緩衝液ＢＸＴ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ｄ－ビオチン）を室温で１０分間使用して、タンパク質を溶出した。ＨＲＭＳ分析のために、緩衝液ＢＸＴ２（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ｄ－ビオチン）でタンパク質を溶出した。Ｑｕｂｉｔタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を定量のために使用した。
ＴＡＭＲＡコンジュゲートｓｆＧＦＰのウエスタンブロット
暗所の室温で一晩、３３ｎｇ／μｌの純粋なタンパク質を０．１ｍＭ ＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ）とインキュベーションすることによって、ＳＰＡＡＣを実行した。反応はＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング色素（２５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ６、３０％グリセロール、５％βＭＥ、０．０２％ブロムフェノールブルー）と２：１で混合し、９５℃で５分間変性させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは５％アクリルアミドスタッキングゲルであり、位置ｓｆＧＦＰ１５１を分析する場合は１５％アクリルアミド分解ゲルであり、ｓｆＧＦＰ１９０、２００を分析する場合は１７％であった（分解ゲル：１５％または１７％アクリルアミド：ビスアクリルアミド２９：１、０．１％（ｗ／ｖ）ＡＰＳ、０．０４％ＴＥＭＥＤ、０．３７５Ｍトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．８、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；スタッキング：５％アクリルアミド：ビスアクリルアミド２９：１、０．１％（ｗ／ｖ）ＡＰＳ、０．１％ＴＥＭＥＤ、０．１２５Ｍトリス－ＨＣｌ ｐＨ６．８、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）。４０Ｖで１５分間電気泳動を実行し、その後１５％ゲルでは１２０Ｖで約５時間、および１７％ゲルでは約６．５時間流した。ランニングバッファー（２５ｍＭトリス塩基、２００ｍＭグリシン、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を、２時間おきに交換した。冷トランスファー緩衝液（２０％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ、５０ｍＭトリス塩基、４００ｍＭグリシン、０．０３７３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）中のウェットトランスファーを９０Ｖで１時間使用して、生じたゲルをＰＶＤＦ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ０．４５μｍ ＰＶＤＦ－ＦＬ）の上へブロットした。弱く撹拌しながら４℃で一晩ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０）中の５％脱脂ミルク溶液を使用して、膜をブロックした。一次抗体（ウサギα－Ｎｔｅｒｍ－ＧＦＰ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｇ１５４４）をＰＢＳ－Ｔ（１：３，０００）に１時間（室温；弱い撹拌）加えた。ブロットをＰＢＳ－Ｔで洗浄し（５分間）、その後二次抗体（ヤギα－ウサギ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗体、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ａ３２７３３）をＰＢＳ－Ｔ（１：２０，０００）に４５分間（室温；弱い撹拌）加えた。ブロットをＰＢＳ－Ｔで洗浄し（３×５分間）、その後５０～１００μｍの分解能でＴｙｐｈｏｏｎ ９４１０レーザースキャナ（Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｖ５ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して画像化し、先ずＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７のために（Ｅｘ．６３３ｎｍ；Ｅｍ．６７０／３０ｎｍ；ＰＭＴ ５００Ｖ）、次にＴＡＭＲＡ（Ｅｘ．５３２ｎｍ；Ｅｍ．５８０／３０ｎｍ；ＰＭＴ ４００Ｖ）のためにスキャンした。
ＰｒＫ－ｐＡｚＦ標識タンパク質の二重バイオコンジュゲーション
ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（１００μｌ；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；室温で１５分間；２２０ｒ．ｐ．ｍ．）を使用して１ｍＬの培養からの細胞ペレットを溶解した。溶解物を緩衝液Ｗ（６００μｌ）で希釈し、ＭａｇＳｔｒｅｐビーズを加え（２００μｌ）、結合させた（３０分間；４℃；弱い回転）。磁石を使用してビーズを引き落とし、冷たい緩衝液Ｗ（２×１０００μｌ）で洗浄し、その後緩衝液Ｗ（２００μｌ）に懸濁させた。この懸濁液の半分を使用して、ＴＡＭＲＡ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ（０．５ｍＭ）でＳＰＡＡＣを１２～１６時間（室温；静かな回転）実行した。ビーズを無ＥＤＴＡ緩衝液Ｗ（２×５００μｌ；ＨＥＰＥＳ ５０ｍＭ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、その後無ＥＤＴＡ緩衝液Ｗ（１００μｌ）に懸濁させた。この懸濁液の半分を使用して、アジド－ＰＥＧ４－ＴＡＭＲＡ（０．２ｍＭ）ならびに硫酸銅（ＩＩ）（０．５ｍＭ）、トリス（ベンジルトリアゾリルメチル）アミン（２ｍＭ；ＴＨＰＴＡ）およびアスコルビン酸ナトリウム（１５ｍＭ）でＣｕＡＡＣを実行した（１．５時間；室温；弱い回転）。ビーズを緩衝液Ｗ（２×５００μｌ）で洗浄し、その後緩衝液ＢＸＴを使用して溶出を実行した（１０分間；室温；時折ボルテックスした）。
インタクトタンパク質高分解能質量分析
前述のように１４，０００×ｇ（３×１０分間、次に１×１８分間）での１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通した４サイクルの遠心分離によって、精製タンパク質（５μｇ）をＨＰＬＣ級の水（４×５００μｌ）の中に脱塩させた。タンパク質を回収した後に、６μｌのタンパク質をＷａｔｅｒｓ Ｇ２－ＸＳ ＴＯＦに連結されたＷａｔｅｒｓ Ｉ－クラスＬＣに注入した。流動条件は、０．４ｍＬ／分の５０：５０の水：アセトニトリルプラス０．１％ギ酸であった。ＥＳＩ＋によってイオン化を実行し、データをｍ／ｚ５００～２０００のために収集した。質量ピークの主部分でスペクトルの合併を実行し、合併したスペクトルはＷａｔｅｒｓ ＭａｘＥｎｔ１を使用して解析した。分析は、自動化ピーク積算ならびに手動ピーク同定によって実行した（図１５、図１６）。忠実度は、テクニカル不純物（例えば、塩付加物、アルギニン酸化）を考慮せずに、生成物かまたは不純物であると特定された全ての質量の積分と比較した予想される質量の積分として計算した。
本開示の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されたが、そのような実施形態が例としてだけ提供されていることは当業者に明らかになる。本開示を逸脱しない範囲で、当業者は多くの変異形、変更および代替を思いつくだろう。本明細書に記載される本開示の実施形態への様々な代替物を本開示の実施で採用することができることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を規定するものであり、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物はそれらに含まれるものである。

Claims (70)

  1. 非天然ポリペプチドを合成する方法であって：
    ａ．少なくとも４つの非天然塩基対を含む少なくとも１つの非天然デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を提供する工程であって、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は（ｉ）少なくとも第１および第２の非天然コドンを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、ならびに（ｉｉ）少なくとも第１および第２の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子をコードし、第１のｔＲＮＡ分子は第１の非天然アンチコドンを含み、第２のｔＲＮＡ分子は第２の非天然アンチコドンを含み、少なくとも１つのＤＮＡ分子中の少なくとも４つの非天然塩基対は、ｍＲＮＡ分子の第１および第２の非天然コドンが第１および第２の非天然アンチコドンにそれぞれ相補的であるような配列コンテキストにある前記工程と；
    ｂ．少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させてｍＲＮＡを与える工程と；
    ｃ．少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を転写させて少なくとも第１および第２のｔＲＮＡ分子を与える工程と；
    ｄ．少なくとも第１および第２の非天然ｔＲＮＡ分子を利用して非天然ｍＲＮＡ分子を翻訳することによって非天然ポリペプチドを合成する工程であって、少なくとも第１および第２の非天然アンチコドンの各々は、非天然ポリペプチドへの非天然アミノ酸の部位特異的組込みを導く前記工程と
    を含む前記方法。
  2. 少なくとも２つの非天然コドンはコドンの第１の位置、第２の位置または第３の位置に配置される第１の非天然ヌクレオチドを各々含み、場合により、第１の非天然ヌクレオチドはコドンの第２の位置または第３の位置に配置される、請求項１に記載の方法。
  3. 少なくとも２つの非天然コドンは核酸配列ＮＮＸまたはＮＸＮを各々含み、非天然アンチコドンは核酸配列ＸＮＮ、ＹＮＮ、ＮＸＮまたはＮＹＮを含むことで、ＮＮＸ－ＸＮＮ、ＮＮＸ－ＹＮＮまたはＮＸＮ－ＮＹＮを含む非天然コドン－アンチコドン対を形成し、ここで、Ｎは任意の天然のヌクレオチドであり、Ｘは第１の非天然ヌクレオチドであり、Ｙは第１の非天然ヌクレオチドと異なる第２の非天然ヌクレオチドであり、Ｘ－ＹはＤＮＡ中で非天然塩基対を形成する、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
  4. コドンは少なくとも１つのＧまたはＣを含み、アンチコドンは少なくとも１つの相補的ＣまたはＧを含む、請求項３に記載の方法。
  5. ＸおよびＹは：
    （ｉ）２－チオウラシル、２’－デオキシウリジン、４－チオウラシル、ウラシル－５－イル、ヒポキサンチン－９－イル（Ｉ）、５－ハロウラシル；５－プロピニル－ウラシル、６－アゾ－ウラシル、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、シュードウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、ウラシル－５－オキサ酢酸、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシルまたはジヒドロウラシル；
    （ｉｉ）５－ヒドロキシメチルシトシン、５－トリフルオロメチルシトシン、５－ハロシトシン、５－プロピニルシトシン、５－ヒドロキシシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５，６－ジヒドロシトシン、５－ニトロシトシン、６－アゾシトシン、アザシトシン、Ｎ４－エチルシトシン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、４－アセチルシトシン、２－チオシトシン、フェノキサジンシチジン（［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノキサジンシチジン（９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、またはピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）；
    （ｉｉｉ）２－アミノアデニン、２－プロピルアデニン、２－アミノ－アデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－プロピル－アデニン、２－アミノ－２’－デオキシアデノシン、３－デアザアデニン、７－メチルアデニン、７－デアザ－アデニン、８－アザアデニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシル置換アデニン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、２－メチルアデニン、２，６－ジアミノプリン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニンまたは６－アザアデニン；
    （ｉｖ）２－メチルグアニン、グアニンの２－プロピルおよびアルキル誘導体、３－デアザグアニン、６－チオグアニン、７－メチルグアニン、７－デアザグアニン、７－デアザグアノシン、７－デアザ－８－アザグアニン、８－アザグアニン、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキルおよび８－ヒドロキシル置換グアニン、１－メチルグアニン、２，２－ジメチルグアニン、７－メチルグアニンまたは６－アザグアニン；ならびに
    （ｖ）ヒポキサンチン、キサンチン、１－メチルイノシン、ケオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、ワイブトキソシン、ヒドロキシ尿素、（ａｃｐ３）ｗ、２－アミノピリジンまたは２－ピリドン
    からなる群から独立して選択される、請求項３または４に記載の方法。
  6. ＸおよびＹの各々を含む塩基は：
    Figure 2022552271000028
     からなる群から独立して選択される、請求項４または５に記載の方法。
  7. 各Ｘを含む塩基は
    Figure 2022552271000029
     である、請求項６に記載の方法。
  8. 各Ｙを含む塩基は
    Figure 2022552271000030
     である、請求項６または７に記載の方法。
  9. ＮＮＸ－ＸＮＮは、ＵＵＸ－ＸＡＡ、ＵＧＸ－ＸＣＡ、ＣＧＸ－ＸＣＧ、ＡＧＸ－ＸＣＵ、ＧＡＸ－ＸＵＣ、ＣＡＸ－ＸＵＧ、ＡＵＸ－ＸＡＵ、ＣＵＸ－ＸＡＧ、ＧＵＸ－ＸＡＣ、ＵＡＸ－ＸＵＡおよびＧＧＸ－ＸＣＣからなる群から選択される、請求項３～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. ＮＮＸ－ＹＮＮは、ＵＵＸ－ＹＡＡ、ＵＧＸ－ＹＣＡ、ＣＧＸ－ＹＣＧ、ＡＧＸ－ＹＣＵ、ＧＡＸ－ＹＵＣ、ＣＡＸ－ＹＵＧ、ＡＵＸ－ＹＡＵ、ＣＵＸ－ＹＡＧ、ＧＵＸ－ＹＡＣ、ＵＡＸ－ＹＵＡおよびＧＧＸ－ＹＣＣからなる群から選択される、請求項３～８のいずれか１項に記載の方法。
  11. ＮＸＮ－ＮＹＮは、ＧＸＵ－ＡＹＣ、ＣＸＵ－ＡＹＧ、ＧＸＧ－ＣＹＣ、ＡＸＧ－ＣＹＵ、ＧＸＣ－ＧＹＣ、ＡＸＣ－ＧＹＵ、ＧＸＡ－ＵＹＣ、ＣＸＣ－ＧＹＧおよびＵＸＣ－ＧＹＡからなる群から選択される、請求項３～８のいずれか１項に記載の方法。
  12. 少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子は異なる非天然アンチコドンを各々含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子は、メタノサルシーナ属からのピロリシルｔＲＮＡおよびＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉからのチロシルｔＲＮＡまたはその誘導体を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによって少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子をチャージすることを含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. ｔＲＮＡシンテターゼはキメラＰｙｌＲＳ（ｃｈＰｙｌＲＳ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＡｚＦＲＳ（ＭｊｐＡｚＦＲＳ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 少なくとも２つの異なるｔＲＮＡシンテターゼによって少なくとも２つの非天然ｔＲＮＡ分子をチャージすることを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
  17. 少なくとも２つの異なるｔＲＮＡシンテターゼはキメラＰｙｌＲＳ（ｃｈＰｙｌＲＳ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＡｚＦＲＳ（ＭｊｐＡｚＦＲＳ）を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 非天然ポリペプチドは、２、３またはそれより多くの非天然アミノ酸を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 非天然ポリペプチドは、同じである少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 非天然ポリペプチドは少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  21. 非天然アミノ酸は、
    リジン類似体；
    芳香族側鎖；
    アジド基；
    アルキン群；または
    アルデヒドもしくはケトン基
    を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 非天然アミノ酸は芳香族側鎖を含まない、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  23. 非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、Ｎ６－（プロパルギルオキシ）－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒＫ）、ｐ－アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸、セレノシステイン、Ｎ６－（（（２－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ６－（（（３－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、およびＮ６－（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンから選択される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  24. 少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子はプラスミドの形態である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は細胞のゲノムに組み入れられる、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  26. 少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は非天然ポリペプチドをコードする、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 細胞性生物の中での非天然ＤＮＡ分子のインビボ複製および転写、ならびに転写されたｍＲＮＡ分子のインビボ翻訳を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 細胞性生物は微生物である、請求項２７に記載の方法。
  29. 細胞性生物は原核生物である、請求項２８に記載の方法。
  30. 細胞性生物は細菌である、請求項２９に記載の方法。
  31. 細胞性生物はグラム陽性細菌である、請求項３０に記載の方法。
  32. 細胞性生物はグラム陰性細菌である、請求項３０に記載の方法。
  33. 細胞性生物は大腸菌である、請求項３２に記載の方法。
  34. 少なくとも２つの非天然塩基対は、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＰＴ３、ｄＮａＭ－ｄＴＰＴ３、ｄＣＮＭＯ－ｄＴＡＴ１またはｄＮａＭ－ｄＴＡＴ１から選択される塩基対を含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 細胞性生物はヌクレオシド三リン酸輸送体を含む、請求項２７～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. ヌクレオシド三リン酸輸送体はＰｔＮＴＴ２のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. ヌクレオシド三リン酸輸送体はＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列を含み、場合により、ＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列は、配列番号１によってコードされるＰｔＮＴＴ２と少なくとも８０％同一である、請求項３６に記載の方法。
  38. 細胞性生物は少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を含む、請求項２７～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は少なくとも１つのプラスミドを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は細胞のゲノムに組み入れられる、請求項３８に記載の方法。
  41. 少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は非天然ポリペプチドをコードする、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. 無細胞系で非天然ポリペプチドを合成することを含むインビトロ方法である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  43. 非天然塩基対は、非天然糖部分を含む少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 非天然糖部分は：
    以下を含む２’位における修飾：
    ＯＨ、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３またはＮＨ２Ｆ；
    Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキルまたはＮ－アルキル；
    Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニルまたはＮ－アルケニル；
    Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニルまたはＮ－アルキニル；
    Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３、（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０アルキニル、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２または－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であってもよく、ｎおよびｍは、１から約１０である）；
    以下を含む５’位における修飾：
    ５’－ビニル、または５’－メチル（ＲまたはＳ）；または
    ４’位における修飾、４’－Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基；または
    その任意の組合せからなる群
    から選択される部分を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 少なくとも４つの非天然塩基対を含む少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子を含む細胞であって、少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は、（ｉ）非天然ポリペプチドをコードし、少なくとも第１および第２の非天然コドンを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子；ならびに（ｉｉ）少なくとも第１および第２の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子をコードし、第１のｔＲＮＡ分子は第１の非天然アンチコドンを含み、第２のｔＲＮＡ分子は第２の非天然アンチコドンを含み、少なくとも１つのＤＮＡ分子中の少なくとも４つの非天然塩基対は、ｍＲＮＡ分子の第１および第２の非天然コドンが第１および第２の非天然アンチコドンにそれぞれ相補的であるような配列コンテキストにある前記細胞。
  46. ｍＲＮＡ分子ならびに少なくとも第１および第２のｔＲＮＡ分子をさらに含む、請求項４５に記載の細胞。
  47. 少なくとも第１および第２のｔＲＮＡ分子は非天然アミノ酸に共有結合している、請求項４６に記載の細胞。
  48. 非天然ポリペプチドをさらに含む、請求項４７に記載の細胞。
  49. 細胞であって、
    ａ．少なくとも２つの異なる非天然コドン－アンチコドン対であって、各非天然コドン－アンチコドン対は非天然メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からの非天然コドンおよび非天然転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）からの非天然アンチコドンを含み、前記非天然コドンは第１の非天然ヌクレオチドを含み、前記非天然アンチコドンは第２の非天然ヌクレオチドを含む、少なくとも２つの異なる非天然コドン－アンチコドン対；ならびに
    ｂ．対応する非天然ｔＲＮＡに各々共有結合している少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸
    を含む前記細胞。
  50. 少なくとも４つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を含む少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子をさらに含む、請求項４９に記載の細胞。
  51. 第１の非天然ヌクレオチドは非天然コドンの第２または第３の位置に配置されている、請求項４５～５０のいずれか１項に記載の細胞。
  52. 第１の非天然ヌクレオチドは非天然アンチコドンの第２の非天然ヌクレオチドと相補的に塩基対を形成する、請求項５１に記載の細胞。
  53. 第１の非天然ヌクレオチドおよび第２の非天然ヌクレオチドは、
    Figure 2022552271000031
     からなる群から独立して選択される第１および第２の塩基をそれぞれ含み、第２の塩基は第１の塩基と異なる、請求項４５～５２のいずれか１項に記載の細胞。
  54. 少なくとも４つの非天然塩基対は、ｄＣＮＭＯ／ｄＴＰＴ３、ｄＮａＭ／ｄＴＰＴ３、ｄＣＮＭＯ／ｄＴＡＴ１またはｄＮａＭ／ｄＴＡＴ１からなる群から独立して選択される、請求項４５または４７～５３のいずれか１項に記載の細胞。
  55. 少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は少なくとも１つのプラスミドを含む、請求項４５または４７～５４のいずれか１項に記載の細胞。
  56. 少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は細胞のゲノムに組み入れられている、請求項４５または４７～５４のいずれか１項に記載の細胞。
  57. 少なくとも１つの非天然ＤＮＡ分子は非天然ポリペプチドをコードする、請求項４７～５６のいずれか１項に記載の細胞。
  58. ヌクレオシド三リン酸輸送体を発現する、請求項４５～５７のいずれか１項に記載の細胞。
  59. ヌクレオシド三リン酸輸送体はＰｔＮＴＴ２のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の細胞。
  60. ヌクレオシド三リン酸輸送体はＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列を含み、場合により、ＰｔＮＴＴ２のトランケーションされたアミノ酸配列は配列番号１によってコードされるＰｔＮＴＴ２と少なくとも８０％同一である、請求項５９に記載の方法。
  61. 少なくとも２つのｔＲＮＡシンテターゼを発現する、請求項４５～６０のいずれか１項に記載の細胞。
  62. 少なくとも２つのｔＲＮＡシンテターゼはキメラＰｙｌＲＳ（ｃｈＰｙｌＲＳ）およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＡｚＦＲＳ（ＭｊｐＡｚＦＲＳ）である、請求項６１に記載の細胞。
  63. 非天然糖部分を含む非天然ヌクレオチドを含む、請求項４５～６２のいずれか１項に記載の細胞。
  64. 非天然糖部分は：
    以下を含む２’位における修飾：
    ＯＨ、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３またはＮＨ２Ｆ；
    Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキルまたはＮ－アルキル；
    Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニルまたはＮ－アルケニル；
    Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニルまたはＮ－アルキニル；
    Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３、（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０アルキニル、－Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、－Ｏ（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２または－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であってもよく、ｎおよびｍは、１から約１０である）；
    以下を含む５’位における修飾：
    ５’－ビニル、５’－メチル（ＲまたはＳ）；または
    ４’位における修飾、４’－Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基；または
    その任意の組合せ
    からなる群から選択される、請求項６３に記載の細胞。
  65. 少なくとも１つの非天然ヌクレオチド塩基は転写の間にＲＮＡポリメラーゼによって認識される、請求項４５～６４のいずれか１項に記載の細胞。
  66. 少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む少なくとも１つの非天然ポリペプチドを翻訳する、請求項４５～６５のいずれか１項に記載の細胞。
  67. 少なくとも２つの非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、Ｎ６－（プロパルギルオキシ）－カルボニル－Ｌ－リジン（ＰｒＫ）、ｐ－アジドフェニルアラニン（ｐＡｚＦ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸、セレノシステイン、Ｎ６－（（（２－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、Ｎ６－（（（３－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジン、およびＮ６－（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンからなる群から独立して選択される、請求項４５～６６のいずれか１項に記載の細胞。
  68. 単離される、請求項４５～６７のいずれか１項に記載の細胞。
  69. 原核生物である、請求項４５～６８のいずれか１項に記載の細胞。
  70. 請求項４５～６９のいずれか１項に記載の細胞を含む細胞系。
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