JP7209977B2 - ニコチンアミド誘導体を製造するための組換え微生物及び方法、並びにそれに用いられるベクター - Google Patents
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Description
[1]ニコチンアミド誘導体を産生するための微生物であって、
前記微生物が、ニコチンアミド及び5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸からニコチンアミドモノヌクレオチドを生成するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)を発現する、及び/又は、前記NAMPTのアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記NAMPTによるニコチンアミドからニコチンアミドモノヌクレオチドへの変換効率が、ヒトNAMPTの5倍以上である、組換え微生物。
[2]前記NAMPTが、配列番号3又は配列番号6に示すアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有するポリペプチドからなる、[1]の組換え微生物。
[3]前記微生物が更に、ニコチン酸及び/又はニコチンアミドの細胞内取り込みを促進するナイアシン輸送体を発現する、及び/又は、前記ナイアシン輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記ナイアシン輸送体が、宿主微生物によるニコチン酸及び/又はニコチンアミドの細胞内取り込み効率を1.1倍以上に増加させる、[1]又は[2]の組換え微生物。
[4]前記ナイアシン輸送体が、配列番号9又は配列番号12に示すアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有するポリペプチドからなる、[3]の組換え微生物。
[5]前記微生物が更に、ニコチンアミド誘導体の細胞外排出を促進するニコチンアミド誘導体輸送体を発現する、及び/又は、前記ニコチンアミド誘導体輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記ニコチンアミド誘導体輸送体が、宿主微生物によるニコチンアミド誘導体の細胞外排出効率を3倍以上に増加させる、[1]~[4]の組換え微生物。
[6]前記ニコチンアミド誘導体輸送体が、配列番号15に示すアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有するポリペプチドからなる、[5]の組換え微生物。
[7]前記微生物が更に、グルコース-6-リン酸から5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸を合成する経路を促進する1又は2以上の酵素を更に発現する、及び/又は、前記1又は2以上の酵素のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより更に形質転換されてなる、[1]~[6]の組換え微生物。
[8]前記1又は2以上の酵素が、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、及びホスホリボシルピロリン酸シンターゼからなる群より選択される1又は2以上の酵素である、[7]の組換え微生物。
[9]前記ホスホグルコースイソメラーゼが、配列番号18に示すアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼが、配列番号21に示すアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記6-ホスホグルコノラクトナーゼが、配列番号24に示すアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼが、配列番号27に示すアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記リボース-5-リン酸イソメラーゼが、配列番号30又は33に示すアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有するポリペプチドであり、
前記ホスホリボシルピロリン酸シンターゼが、配列番号36に示すアミノ酸配列と80%以上の配列相同性を有するポリペプチドである、[8]の組換え微生物。
[10]前記ニコチンアミド誘導体が、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸モノヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及び、ニコチン酸アデニンジヌクレオチドからなる群より選択される、[1]~[9]の組換え微生物。
[11]組換え微生物が大腸菌又は酵母である、[1]~[10]の組換え微生物。
[12]ニコチンアミド誘導体を産生するための方法であって、[1]~[11]の組換え微生物にニコチンアミドを供給し、前記微生物により生成されたニコチンアミド誘導体を回収することを含む方法。
[13]回収されたニコチンアミド誘導体を精製することを更に含む[12]の方法。
[14]ニコチンアミド及び5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸からニコチンアミドモノヌクレオチドを生成するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、前記核酸が、配列番号2又は配列番号5に記載の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。
[15]ニコチン酸及び/又はニコチンアミドの細胞内取り込みを促進するナイアシン輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、前記核酸が、配列番号8又は配列番号11に記載の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。
[16]ニコチンアミド誘導体の細胞外排出を促進するニコチンアミド誘導体輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、前記核酸が、配列番号14に記載の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。
まず、本発明の概要から説明する。
・ヘキソキナーゼ(HK)によるグルコース(Glu)からグルコース-6-リン酸(G6P)へのリン酸化。
・ホスホグルコースイソメラーゼ(PGI)によるフルクトース-6-リン酸(F6P)からグルコース-6-リン酸(G6P)への変換。
・グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD)によるG6Pから6-ホスホグルコノ-1,5-ラクトン(6PGL)への変換。
・6-ホスホグルコノラクトナーゼ(PGL)による6PGLから6-ホスホグルコン酸(6PG)への変換。
・6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(PGD)による6PGからリブロース-5-リン酸(Ru5P)への変換。
・リボース-5-リン酸イソメラーゼ(RPI)によるRu5Pからリボース-5-リン酸(R5P)への変換。
・ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ(PRS)によるR5Pから5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸(RRPP)への変換。
次に、本発明で使用されるNAm誘導体の生産に関与する酵素について説明する。
芳香族アミノ酸:F、H、W、Y;
脂肪族アミノ酸:I、L、V;
疎水性アミノ酸:A、C、F、H、I、K、L、M、T、V、W、Y;
荷電アミノ酸:D、E、H、K、R等:
正荷電アミノ酸:H、K、R;
負荷電アミノ酸:D、E;
極性アミノ酸:C、D、E、H、K、N、Q、R、S、T、W、Y;
小型アミノ酸:A、C、D、G、N、P、S、T、V等:
超小型アミノ酸:A、C、G、S;
脂肪族側鎖を有するアミノ酸:G、A、V、L、I;
芳香族側鎖を有するアミノ酸:F、Y、W;
硫黄含有側鎖を有するアミノ酸:C、M;
脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸:S、T;
塩基性側鎖を有するアミノ酸:K、R、H;
酸性アミノ酸及びそれらのアミド誘導体:D、E、N、Q。
NAm及びPRPPからのNMNの合成を触媒するNMN合成酵素(NAMPT)としては、従来、種々の微生物に由来する種々の酵素が知られている。ひいては、斯かる公知の酵素を適宜選択して使用することが可能である。
NAm及び/又はNA(ナイアシン)の細胞内取り込みを促進する輸送体(ナイアシン輸送体)としても、従来、種々の微生物に由来する種々の輸送体タンパク質が知られている。ひいては、斯かる公知の輸送体タンパク質を適宜選択して使用することが可能である。
NMN合成の生産物であるNMN、及び/又は、そこから派生して合成されるNRやNaMN等のNAm誘導体の細胞外排出を促進する輸送体(NAm誘導体輸送体)としても、従来、種々の微生物に由来する種々の輸送体タンパク質が知られている。ひいては、斯かる公知の輸送体タンパク質を適宜選択して使用することが可能である。
G6PからのPRPPの合成に関与する酵素である、ホスホグルコースイソメラーゼ(PGI)、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD)、6-ホスホグルコノラクトナーゼ(PGL)、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(PGD)、リボース-5-リン酸イソメラーゼ(RPI)、及びホスホリボシルピロリン酸シンターゼ(PRS)(これらを総称して適宜「PRPP合成関連酵素」と称する。)としても、従来、種々の微生物に由来する種々の酵素が知られており、各種の宿主微生物に応じた最適化も種々なされている。ひいては、斯かる公知の酵素を適宜選択して使用することが可能である。
次に、本発明で使用されるNMNの生産に関与する酵素を発現するためのベクターについて説明する。
次に、本発明においてNMNを生産するために使用される組換え微生物について説明する。
次に、上述の組換え微生物を用いてNAm誘導体を生産する方法について説明する。
本発明の組換え微生物の細胞数は、特に制限されないが、少なすぎると希釈状態での反応となるため、十分に反応が進行せず、多すぎると目的のNAm誘導体生産以外の副反応が起こる場合がある。そのため、細胞数をその微生物に適した波長で測定した光学濃度(OD)で表すと、一般に、ODが1以上が好ましく、ODが5以上がより好ましく、ODが10以上がさらに好ましい。また、ODが500以下が好ましく、ODが300以下がより好ましい。例えば、大腸菌の場合、600nmの波長で測定したODを用いる。
反応時の温度は、本発明の組換え微生物の至適温度となるように適宜調整すればよいが、反応を進行させる観点から、通常15℃以上、中でも20℃以上とすることが好ましく、また、組換え微生物の耐久性やNAm誘導体の安定性の観点から、通常50℃以下、中でも40℃以下とすることが好ましい。
反応時の雰囲気は、本発明の組換え微生物の至適雰囲気を選択すればよいが、例えば環境雰囲気下、好気性雰囲気下、低酸素雰囲気下、嫌気性雰囲気下等である。
反応時には適宜、反応液に対して震盪や攪拌を加えてもよい。
以上、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明したが、本発明は上述した実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
・NMN定量:
装置:LCMS-2020((株)島津製作所製)
検出器:254nm
カラム:TSKgel Amide-80、3μm、4.6mm×50mm
カラム温度:30℃
注入量:5μl
移動相:
A:0.1%ギ酸水
B:0.1%ギ酸含有アセトニトリル/メタノール(75/25)
流量:1mL/分一定
移動相比:0→2分(B=98%一定)、2→6分(B=98→60%)、6→8分(B=60→45%)、8→12分(B=45→60%)、12→15分(B=60→98%)
測定時間:15.1分
定量方法:NMN標品を水で0g/L、0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.25g/L、1g/L、2.5g/Lに調製し、これらの測定によって得られたNMN面積値から検量線を作成し、各サンプルのNMN面積値からNMNを定量した。なお、0.01g/L未満は定量限界とした。
装置:UVmini-1240((株)島津製作所製)
測定波長:600nm
セル:1.5mLディスポセル(材質:PS)
測定方法:測定値が0.05から1.0未満の範囲に入るように菌体液を水で希釈する。同様の混合比で希釈した培地1mLをセルに加えて装置にセットしゼロ点補正した後、調製したサンプル液1mLをセルに加えて装置にセットし、OD600を測定した。
・大腸菌:
BL21(DE3)株(NEB社製)
pRSFDuet-1(Novagen社製)
pCDFDuet-1(Novagen社製)
pACYCDuet-1(Novagen社製)
キチノファーガ・ピネンシス(Chitinophaga pinensis)由来NAMPT(ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ:NMN合成酵素)
スフィンゴピキシス・CI株(Sphingopyxis sp. C-1)由来NAMPT
ホモサピエンス(Homo sapiens)由来NAMPT
バークホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)由来niaP(ナイアシン輸送体)
ストレプトコッカス・ヒューモニア(Streptococcus pneumoniae)TIGR4株由来niaX(ナイアシン輸送体)
バチルス・ミコイデス(Bacillus mycoides)由来pnuC(ニコチンアミノモノヌクレオチド輸送体)
大腸菌(E. Coli)K12由来pgi(ホスホグルコースイソメラーゼ)
大腸菌(E. Coli)K12由来zwf(グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ)
大腸菌(E. Coli)K12由来pgl(6-ホスホグルコノラクトナーゼ)
大腸菌(E. Coli)K12由来gnd(6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ)
大腸菌(E. Coli)K12由来rpiA(リボース-5-リン酸イソメラーゼ)
大腸菌(E. Coli)K12由来rpiB(リボース-5-リン酸イソメラーゼ)
大腸菌(E. Coli)K12由来prs(ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ)
D-グルコース(ナカライテスク(株)製)
ニコチンアミド(東京化成工業(株)製)
PBS((株)ニッポンジーン製)
リン酸バッファー:リン酸二水素カリウム(ナカライテスク(株)製)1Mとリン酸水素二カリウム(ナカライテスク(株)製)1Mを調製し、pH6.2となるように混合し、オートクレーブ滅菌して調製した。
LB培地:塩化ナトリウム(ナカライテスク(株)製)10g/L、トリプトン(ナカライテスク(株)製)10g/L、乾燥酵母エキス(ナカライテスク(株)製)5g/Lとなるように混合し、オートクレーブ滅菌して調製した。
M9培地:リン酸水素二ナトリウム(ナカライテスク(株)製)48mM、リン酸二水素カリウム(ナカライテスク(株)製)22mM、塩化アンモニウム(ナカライテスク(株)製)19mM、塩化ナトリウム(ナカライテスク(株)製)8.6mMとなるように混合し、オートクレーブ滅菌して調製した。
・pRSF-NAMPT CPの構築:
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化したキチノファーガ・ピネンシス(Chitinophaga pinensis)由来NAMPTの合成遺伝子(配列番号5)を、制限酵素NcoIとEcoRIとで消化処理したpRSFDuet-1に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。これを、制限酵素NcoIとEcoRIにより消化処理したpRSFDuet-1と、In-Fusionクローニング法を用いて連結してpRSF-NAMPT CPを得た。
・フォワード(配列番号40):
AGGAGATATACCATGACCAAAGAAAACCTGATTCTGCTGGCAGATGCA
・リバース(配列番号41):
GCTCGAATTCGGATCTTAGATGGTTGCGTTTTTACGGATCTGCTCAAA
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化したスフィンゴピキシス・CI株(Sphingopyxis sp. C-1)由来NAMPTの合成遺伝子(配列番号2)を、制限酵素NcoIとEcoRIとで消化処理したpRSFDuet-1に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。これを、制限酵素NcoIとEcoRIにより消化処理したpRSFDuet-1と、In-Fusionクローニング法を用いて連結してpRSF-NAMPT SSCを得た。
・フォワード(配列番号42):
AGGAGATATACCATGAAGAATCTGATTCTGGCCACCGATAGCTATAAA
・リバース(配列番号43):
GCTCGAATTCGGATCTTAACGACCTTCGCTACGTTTACGAACTGCATC
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化したホモサピエンス(Homo sapiens)由来NAMPTの合成遺伝子(配列番号38)を、制限酵素NcoIとEcoRIとで消化処理したpRSFDuet-1に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。これを、制限酵素NcoIとEcoRIにより消化処理したpRSFDuet-1と、In-Fusionクローニング法を用いて連結してpRSF-NAMPT HSを得た。
・フォワード(配列番号44):
AGGAGATATACCATGAATCCGGCAGCAGAAGCCGAATTTAACATTCTG
・リバース(配列番号45):
GCTCGAATTCGGATCTTAATGATGTGCTGCTTCCAGTTCAATGTTCAG
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化した大腸菌(E. Coli)K12由来のpgi、zwf、pgl、gnd、rpiA、rpiB、及びprsの各合成遺伝子(配列番号17、20、23、26、29、32、35)を、それぞれ連結可能な相同域ならびにprs以外はpCDFDuet-1と同じRBS領域を含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。最初に、prs、rpiB、rpiA、及びgndの断片を、制限酵素NcoIとSacIにより消化処理したpCDFDuet-1と、Gibson Assemblyシステムを用いて連結した。次に、得られたベクターを制限酵素SacIにより消化処理し、pgl、zwf、及びpgiの断片を、Gibson Assemblyシステムを用いて連結し、pCDF-prs→pgiを得た。
・フォワード(配列番号46):
CGTGATGGTCGTAGCTGGAATGAATTTGAATAAAAGGAGATATACCATGAAGAACATTAATCCGACACAG
・リバース(配列番号47):
ACTTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCGCGCCGTTAACCACGCCAGGCTTTATAAC
・フォワード(配列番号48):
GTCAGGGTCCGATGTGGGTTGTTGTTAATGCACATTAAAAGGAGATATACCATGGCAGTTACCCAGACCG
・リバース(配列番号49):
TTATTCAAATTCATTCCAGCTACG
・フォワード(配列番号50):
AGAAGGTGTGTTTCATACAGAATGGCTGGACTAAAAGGAGATATACCATGAAACAGACCGTGTATATTGC
・リバース(配列番号51):
TTAATGTGCATTAACAACAACCC
・フォワード(配列番号52):
TGGTACACCGGATGGTGTTAAAACCATTGTGAAATAAAAGGAGATATACCATGAGCAAACAGCAGATTGG
・リバース(配列番号53):
CATTATGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCGCGCCGAGCTCTTAGTCCAGCCATTCTGTATGAAAC
・フォワード(配列番号54):
CAATTACCGCAATTGAACAGCGTCGCAATTAAAAGGAGATATACCATGACCCAGGATGAACTGAAAAAAG
・リバース(配列番号55):
TTATTTCACAATGGTTTTAACACCATC
・フォワード(配列番号56):
AATGAAGAAAGCATTAGCGCCATGTTTGAACATTAAAAGGAGATATACCATGAAAAAAATCGCCTTTGGC
・リバース(配列番号57):
TTAATTGCGACGCTGTTC
・フォワード(配列番号58):
ATTCCCCTGTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCGTGCCGGATATGAAACTGTTTG
・リバース(配列番号59):
TTAATGTTCAAACATGGCGC
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化した大腸菌(E. Coli)K12由来pgi、zwf、pgl、gnd、rpiA、rpiB、及びprsの合成遺伝子(配列番号17、20、23、26、29、32、35)を、それぞれ連結可能な相同域ならびにpgi以外はpCDFDuet-1と同じRBS領域を含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。最初に、pgi、zwf、pgl、及びgndの断片を、制限酵素NcoIとSacIにより消化処理したpCDFDuet-1と、Gibson Assemblyシステムを用いて連結した。次に、得られたベクターを制限酵素SacIにより消化処理し、rpiA、rpiB、及びprsの断片を、Gibson Assemblyシステムを用いて連結し、pCDF-pgi→prsを得た。
・フォワード(配列番号60):
TCCCCTGTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGAAGAACATTAATCCGACACAG
・リバース(配列番号61):
TTAACCACGCCAGGCTTTATAAC
・フォワード(配列番号62):
ATGGTCTGATTAATCGTTATAAAGCCTGGCGTGGTTAAAAGGAGATATACCATGGCAGTTACCCAGACCG
・リバース(配列番号63):
TTATTCAAATTCATTCCAGCTACG
・フォワード(配列番号64):
CCGTGATGGTCGTAGCTGGAATGAATTTGAATAAAAGGAGATATACCATGAAACAGACCGTGTATATTGC
・リバース(配列番号65):
TTAATGTGCATTAACAACAACCC
・フォワード(配列番号66):
TCAGGGTCCGATGTGGGTTGTTGTTAATGCACATTAAAAGGAGATATACCATGAGCAAACAGCAGATTGG
・リバース(配列番号67):
CATTATGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCGCGCCGAGCTCTTAGTCCAGCCATTCTGTATGAAAC
・フォワード(配列番号68):
AAGGTGTGTTTCATACAGAATGGCTGGACTAAAAGGAGATATACCATGACCCAGGATGAACTGAAAAAAG
・リバース(配列番号69):
TTATTTCACAATGGTTTTAACACCATC
・フォワード(配列番号70):
GGTACACCGGATGGTGTTAAAACCATTGTGAAATAAAAGGAGATATACCATGAAAAAAATCGCCTTTGGC
・リバース(配列番号71):
TTAATTGCGACGCTGTTC
・フォワード(配列番号72):
AAGCAATTACCGCAATTGAACAGCGTCGCAATTAAAAGGAGATATACCGTGCCGGATATGAAACTGTTTG
・リバース(配列番号73):
TCGACTTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCGCGCCGTTAATGTTCAAACATGGCGC
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化した大腸菌(E. Coli)K12由来pgi、zwf、pgl、gnd、rpiA、rpiB、及びprsの合成遺伝子(配列番号17、20、23、26、29、32、35)を、それぞれ連結可能な相同域ならびにpgi以外はpACYCDuet-1と同じRBS領域を含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。最初に、pgi、zwf、pgl、及びgndの断片を、制限酵素NcoIとSacIにより消化処理したpACYCDuet-1と、Gibson Assemblyシステムを用いて連結した。次に、得られたベクターを制限酵素SacIにより消化処理し、rpiA、rpiB、及びprsの断片を、Gibson Assemblyシステムを用いて連結し、pACYC-pgi→prsを得た。
・フォワード(配列番号60:前出)
・リバース(配列番号61:前出)
・フォワード(配列番号62:前出)
・リバース(配列番号63:前出)
・フォワード(配列番号64:前出)
・リバース(配列番号65:前出)
・フォワード(配列番号66:前出)
・リバース(配列番号67:前出)
・フォワード(配列番号68:前出)
・リバース(配列番号69:前出)
・フォワード(配列番号70:前出)
・リバース(配列番号71:前出)
・フォワード(配列番号72:前出)
・リバース(配列番号73:前出)
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化した大腸菌(E. Coli)K12由来のpgi、zwf、pgl、gnd、rpiA、rpiB、及びprsの各合成遺伝子(配列番号17、20、23、26、29、32、35)を、それぞれ連結可能な相同域ならびにprs以外はpACYCDuet-1と同じRBS領域を含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。最初に、prs、rpiB、rpiA、及びgndの断片を、制限酵素NcoIとSacIにより消化処理したpACYCDuet-1と、Gibson Assemblyシステムを用いて連結した。次に、得られたベクターを制限酵素SacIにより消化処理し、pgl、zwf、及びpgiの断片を、Gibson Assemblyシステムを用いて連結し、pACYC-prs→pgiを得た。
・フォワード(配列番号46:前出)
・リバース(配列番号47:前出)
・フォワード(配列番号48:前出)
・リバース(配列番号49:前出)
・フォワード(配列番号50:前出)
・リバース(配列番号51:前出)
・フォワード(配列番号52:前出)
・リバース(配列番号53:前出)
・フォワード(配列番号54:前出)
・リバース(配列番号55:前出)
・フォワード(配列番号56:前出)
・リバース(配列番号57:前出)
・フォワード(配列番号58:前出)
・リバース(配列番号59:前出)
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化したバークホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)由来niaPの合成遺伝子(配列番号8)を、制限酵素NcoIとEcoRIとで消化処理したpACYCDuet-1に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。これを、制限酵素NcoIとEcoRIにより消化処理したpACYCDuet-1と、In-Fusionクローニング法を用いて連結してpACYC-niaP BCを得た。
・フォワード(配列番号74):
AGGAGATATACCATGCCTGCAGCAACCGCACC
・リバース(配列番号75):
GCTCGAATTCGGATCTTAGCTTGCTTTATCTGCTGCTGTTGCCGGATAAC
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化したストレプトコッカス・ヒューモニア(Streptococcus pneumoniae)TIGR4株由来niaXの合成遺伝子(配列番号11)を、制限酵素NcoIとEcoRIとで消化処理したpACYCDuet-1に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。これを、制限酵素NcoIとEcoRIにより消化処理したpACYCDuet-1と、In-Fusionクローニング法を用いて連結してpACYC-niaX SPTを得た。
・フォワード(配列番号76):
AGGAGATATACCTTGAGCGGTCTGCTGTATCACACCAGCGTTTATGCAG
・リバース(配列番号77):
GCTCGAATTCGGATCTTAGCGACGTTTACGCAGAACTTTATAAACTGCC
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化したバチルス・ミコイデス(Bacillus mycoides)由来pnuCの合成遺伝子(配列番号14)を、制限酵素NcoIとEcoRIとで消化処理したpACYCDuet-1に連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。これを、制限酵素NcoIとEcoRIにより消化処理したpACYCDuet-1と、In-Fusionクローニング法を用いて連結してpACYC-pnuC BMを得た。
・フォワード(配列番号78):
AGGAGATATACCATGGTTCGTAGTCCGCTGTTTCTGCTGATTAGCAGC
・リバース(配列番号79):
GCTCGAATTCGGATCTTAGATGTAGTTGTTCACGCGTTCACGTTCTTTATG
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化したバチルス・ミコイデス(Bacillus mycoides)由来pnuCの合成遺伝子(配列番号14)を、制限酵素BglIIとAvrIIとで消化処理したpRSF-NAMPT CPに連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。これを、制限酵素BglIIとAvrIIにより消化処理したpRSF-NAMPT CPと、In-Fusionクローニング法を用いて連結してpRSF-NAMPT CP+pnuC BMを得た。
・フォワード(配列番号80):
TATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACAATGGTTCGTAGTCCGCTGTTTCTGCTGATTAGCAGC
・リバース(配列番号81):
ATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGTTAGATGTAGTTGTTCACGCGTTCACGTTCTTTATG
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化したバークホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)由来niaPの合成遺伝子(配列番号8)を、制限酵素BglIIとAvrIIとで消化処理したpCDF-pgi→prsに連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。これを、制限酵素BglIIとAvrIIにより消化処理したpCDF-pgi→prsと、In-Fusionクローニング法を用いて連結して、pCDF-pgi→prs+niP BCを得た。
・フォワード(配列番号82):
TATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACAATGCCTGCAGCAACCGCACC
・リバース(配列番号83):
ATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGTTAGCTTGCTTTATCTGCTGCTGTTGCCGGATAAC
大腸菌(E. Coli)で発現させるためにコドンを最適化したバチルス・ミコイデス(Bacillus mycoides)由来pnuCの合成遺伝子(配列番号14)を、制限酵素BglIIとAvrIIとで消化処理したpRSF-NAMPT HSに連結可能な相同域をそれぞれ含む下記プライマー対を用いてPCRにより増幅した。これを、制限酵素BglIIとAvrIIにより消化処理したpRSF-NAMPT HSと、In-Fusionクローニング法を用いて連結してpRSF-NAMPT HS+pnuC BMを得た。
・フォワード(配列番号80:前出)
・リバース(配列番号81:前出)
・BL21/pRSF-NAMPT CP株(実施例1)の作製:
pRSF-NAMPT CPを、ヒートショック法によりBL21(DE3)株に導入し、BL21/pRSF-NAMPT CP株を得た。
pRSF-NAMPT SSCを、ヒートショック法によりBL21(DE3)株に導入し、BL21/pRSF-NAMPT SSC株を得た。
pRSF-NAMPT CPとpCDF-prs→pgiを、ヒートショック法によりBL21(DE3)株に導入し、BL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi株を得た。
pRSF-NAMPT CP及びpCDF-prs→pgiとpACYC-pgi→prsを、ヒートショック法によりBL21(DE3)株に導入し、BL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-pgi→prs株を得た。
pRSF-NAMPT CP及びpCDF-prs→pgiとpACYC-niaP BCを、ヒートショック法によりBL21(DE3)株に導入し、BL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-niaP BC株を得た。
pRSF-NAMPT CP及びpCDF-prs→pgiとpACYC-niaX SPTを、ヒートショック法によりBL21(DE3)株に導入し、BL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-niaX SPT株を得た。
pRSF-NAMPT CP及びpCDF-prs→pgiとpACYC-pnuC BMを、ヒートショック法によりBL21(DE3)株に導入し、BL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-pnuC BM株を得た。
pRSF-NAMPT CP+pnuC BM及びpCDF-pgi→prs+niaP BCとpACYC-prs→pgiを、ヒートショック法によりBL21(DE3)株に導入し、BL21/pRSF-NAMPT CP+pnuC BM/pCDF-pgi→prs+niaP BC/pACYC-prs→pgi株を得た。
pRSF-NAMPT HSを、ヒートショック法によりBL21(DE3)株に導入し、BL21/pRSF-NAMPT HS株を得た。
pRSF-NAMPT HS+pnuC BM及びpCDF-pgi→prs+niaP BCとpACYC-prs→pgiを、ヒートショック法によりBL21(DE3)株に導入し、BL21/pRSF-NAMPT HS+pnuC BM/pCDF-pgi→prs+niaP BC/pACYC-prs→pgi株を得た。
・実施例1(BL21/pRSF-NAMPT CP株を用いたNMN生産):
BL21/pRSF-NAMPT CP株を、5mLのLB培地が入った試験管に植菌し、37℃、200rpmで12時間培養した。培養液を200mLのLB培地が入った500mL三角フラスコにOD600が0.03となるように加え、37℃、200rpmで培養し、OD600が0.4となった時点で、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(ナカライテスク(株)製)を終濃度0.1mMとなるように添加し、25℃、200rpmで16時間培養した。その後、培養液を50mLコニカル管に移し、3000gで5分間遠心分離し、菌体を回収した。さらに、1×PBSを加えて洗浄を行い、3000gで5分間遠心分離し、菌体を回収した。この操作を2回実施した。回収した菌体をOD600が10となるようにLB培地で懸濁し、100mL三角フラスコに10mLとなるように加え、そこにニコチンアミドを1g/L、D-グルコースを0.4g/L、リン酸バッファー(pH6.2)を0.005mol/Lとなるように仕込み、30℃、200rpmで反応した。2時間後に反応液を採取し、-30℃で凍結した後に溶解させ、12000rpmで3分間遠心分離して上清を回収した。この回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は0.03g/Lであった。
BL21/pRSF-NAMPT CP株をBL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi株に変更した以外は実施例1と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は0.18g/Lであった。
BL21/pRSF-NAMPT CP株をBL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-pgi→prs株に変更した以外は実施例1と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は0.22g/Lであった。
BL21/pRSF-NAMPT CP株をBL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-niaP BC株に変更した以外は実施例1と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は0.21g/Lであった。
BL21/pRSF-NAMPT CP株をBL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-niaX SPT株に変更した以外は実施例1と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は0.23g/Lであった。
BL21/pRSF-NAMPT CP株をBL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-pnuC BM株に変更した以外は実施例1と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は0.36g/Lであった。
ニコチンアミドを1g/Lから2g/L、D-グルコースを0.4g/Lから1.0g/L、リン酸バッファー(pH6.2)を0.005mol/Lから0.01mol/Lに変更した以外は実施例2と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は0.20g/Lであった。
BL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi株をBL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-niaP BC株に変更した以外は実施例7と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は0.31g/Lであった。
BL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi株をBL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-niaX SPT株株に変更した以外は実施例7と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は0.33g/Lであった。
回収した菌体をOD600が10となるようにLB培地の代わりにM9培地で懸濁した以外は実施例6と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は0.12g/Lであった。
BL21/pRSF-NAMPT CP株をBL21(DE3)株に変更した以外は実施例1と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は定量限界以下であった。
BL21/pRSF-NAMPT CP株をBL21/pRSF-NAMPT HS株に変更した以外は実施例1と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は定量限界以下であった。
・実施例11(BL21/pRSF-NAMPT CP+pnuC BM/pCDF-pgi→prs+niaP BC/pACYC-prs→pgi株を用いたNMN生産):
BL21/pRSF-NAMPT CP株をBL21/pRSF-NAMPT CP+pnuC BM/pCDF-pgi→prs+niaP BC/pACYC-prs→pgi株に変更した以外は実施例1と同様に菌体を回収した。回収した菌体をOD600が40となるようにM9培地で懸濁し、100mL三角フラスコに10mLとなるように加え、そこにニコチンアミドを7g/L、D-グルコースを21g/L、リン酸バッファー(pH6.2)を0.05mol/Lとなるように仕込み、30℃、200rpmで反応した。8時間後に反応液を採取し、-30℃で凍結した後に溶解させ、12000rpmで3分間遠心分離して上清を回収した。この回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は6.52g/Lであった。
BL21/pRSF-NAMPT CP+pnuC BM/pCDF-pgi→prs+niaP BC/pACYC-prs→pgi株をBL21/pRSF-NAMPT HS+pnuC BM/pCDF-pgi→prs+niaP BC/pACYC-prs→pgi株に変更した以外は実施例11と同様に反応を行い、回収した液体をHPLCにて分析したところ、NMN量は0.04g/Lであった。
前処理されたNMN含有LB培地500mLを400rpmで撹拌しながら2時間かけてNF膜ろ過(SYNDER社製、NF-S)し、50mLまで膜濃縮を行った。得られた濃縮液を、終夜凍結乾燥行うことで、NMN含有粗体6.3gを得た。得られた粗体を15mLのmiliQ水に溶解し、0.22μmのフィルター濾過後HPLC分取を行うことで、NMN含有フラクションを得た(純度:64.56%)。NMN含有フラクションを再度凍結乾燥後、HPLC分取を行い、得られた高含有NMNフラクションを1N HClを用いてpH=3に調整し凍結乾燥してNMNを得た(純度:>99%)。
MS(ESI) :m/z 335[M+H]+ 1H-NMR (D2O) δ: 9.49 (1H, s), 9.30 (1H, d, J = 6.4 Hz), 9.00 (1H, d, J = 7.8 Hz) 8.31 (1H, dd, J = 7.8, 6.4), 6.32 (1H, d, J = 5.0 Hz), 4.79-4.65 (1H, m), 4.59 (1H, t, J = 5.0 Hz), 4.47-4.45 (1H, m)4.34-4.30 (1H, m), 4.18-4.13 (1H, m).
装置: Agilent Infinity 1200分取HPLC
溶媒: A = 100%H2O + 0.1%CH3COOH
B = 95%MeCN/5%H2O + 0.1%CH3COOH
カラム: zic-HILIC、21.2mmI.D.×150mm、5μm、2本連結
ガードカラム:InertSustain Amide、7.6mmI.D.×30mm
カラム温度: RT℃
流速: 22.0mL/分
検出波長: 260、200nm(PDA)(260nmでUVトリガー分取)
グラジエント条件: 時間(分) Bsolv.(%)
0.00 84.00
50.0 84.00
50.1 45.00
58.0 45.00
58.1 84.00
65.0 STOP
フラクションボリューム:8.0mL
装置: 島津IT-TOF/MS
溶媒: A = 100%H2O + 0.1%CH3COOH
B = 95%MeCN/5%H2O + 0.1%CH3COOH
カラム: zic-HILIC、4.6mmI.D.×150mm、5.0μm
カラム温度:25℃
流速: 1.2mL/分
検出波長: 200、260nm(PDA)
グラジエント条件: 時間(分) Bsolv.(%)
0.00 90.00
4.00 90.00
21.0 50.00
25.0 50.00
25.1 90.00
30.0 STOP
ネプライザガス流量:1.5mL/分
CDL温度: 200℃
ヒートブロック温度:200℃
検出器電圧: 1.65kV
MS検出範囲: Event1 MS 100~600
Event2 MS/MS 70~500
・NAMPT変換効率の評価:
BL21/pRSF-NAMPT CP株を5mLのLB培地が入った試験管に植菌して37℃、200rpmで12時間培養した後、培養液を200mLのLB培地が入った500mL三角フラスコにOD600が0.03となるように植菌して37℃、200rpmで培養し、OD600が0.4となった時点で、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドを終濃度0.1mMとなるように添加し、25℃、200rpmで16時間培養を行った。培養液30mLを50mLコニカル管に移し、3000gで5分間遠心分離し、菌体を回収した。さらに、1×PBSを加えて洗浄を行い、3000gで5分間遠心分離し、菌体を回収した。この操作を2回実施した。回収菌体をCell Lysis Buffer(MBL社製)15mLで懸濁し、一般に推奨される方法でLysateを調製した。プロテインアッセイブラッドフォード試薬(和光純薬(株)製)を用いてLysateのOD595を測定し、OD595が0.1となるようにLysate液を水で希釈した。この希釈液をNAMPT溶液として、CycLexR NAMPT Colorimetric Assay Kit Ver.2(MBL社製)のOne-Step Assay Methodに準拠してNAMPT変換効率を測定した。測定には、SpectraMaxR iD3マルチモードマイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス社製)を用いた。結果、NAMPT変換効率は230であった。
BL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-niaP BC株を5mLのLB培地が入った試験管に植菌して37℃、200rpmで12時間培養した後、培養液を200mLのLB培地が入った500mL三角フラスコにOD600が0.03となるように植菌して37℃、200rpmで培養し、OD600が0.4となった時点で、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドを終濃度0.1mMとなるように添加し、25℃、200rpmで16時間培養を行った。その後、培養液を50mLコニカル管に移し、3000gで5分間遠心分離し、菌体を回収した。さらに、1×PBSを加えて洗浄を行い、3000gで5分間遠心分離し、菌体を回収した。この操作を2回実施した。回収した菌体をOD600が10となるようにLB培地で懸濁し、100mL三角フラスコに10mLとなるように加え、そこにニコチンアミドを1g/L、D-グルコースを0.4g/L、リン酸バッファー(pH6.2)を0.005mol/Lとなるように仕込み、30℃、200rpmで反応した。反応1時間後と2時間後に反応液を採取し、-30℃で凍結した後に溶解させ、12000rpmで3分間遠心分離して上清を回収した。これら回収した液体をHPLCにて分析し、NMN量を定量した。結果、niaPのニコチンアミド取り込み効率は81%であった。
BL21/pRSF-NAMPT CP/pCDF-prs→pgi/pACYC-pnuC BM株を5mLのLB培地が入った試験管に植菌して37℃、200rpmで12時間培養した後、培養液を200mLのLB培地が入った500mL三角フラスコにOD600が0.03となるように植菌して37℃、200rpmで培養し、OD600が0.4となった時点で、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドを終濃度0.1mMとなるように添加し、25℃、200rpmで16時間培養を行った。その後、培養液を50mLコニカル管に移し、3000gで5分間遠心分離し、菌体を回収した。さらに、1×PBSを加えて洗浄を行い、3000gで5分間遠心分離し、菌体を回収した。この操作を2回実施した。回収した菌体をOD600が10となるようにLB培地で懸濁し、100mL三角フラスコに10mLとなるように加え、そこにニコチンアミドを1g/L、D-グルコースを0.4g/L、リン酸バッファー(pH6.2)を0.005mol/Lとなるように仕込み、30℃、200rpmで反応した。反応2時間後に反応液を採取し、1つは-30℃で凍結した後に溶解させ、12000rpmで3分間遠心分離して上清を回収した。もう1つは凍結処理せず、12000rpmで3分間遠心分離して上清を回収した。これら回収した液体をHPLCにて分析し、NMN量を定量した。結果、pnuCのニコチンアミドモノヌクレオチド排出効率は81%であった。
実施例11で得られた反応8時間後のNMNを含む反応液に、アデノシン三リン酸(ATP)、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ1(NMNAT1)(CycLexR NAMPT Colorimetric Assay Kit Ver.2(MBL社製)のATP及びNMNAT1を使用)を加えて、30℃で反応させたところ、NAD+の生成が確認された。さらに、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)とエタノール(CycLexR NAMPT Colorimetric Assay Kit Ver.2(MBL社製)のADH及びエタノールを使用)を加えて、30℃で反応させたところ、NADHの生成が確認された。
遠心分離で菌体除去したNMN含有LB培地を活性炭処理し、その後、活性炭を分離除去した処理液を得た。その処理液から高分子量の不純物を除去するためにNF膜ろ過を行い、さらに不純物を除去するため、ろ液をイオン交換樹脂にて処理した。次に、処理液をNF膜を用いて濃縮し、さらにその濃縮液を遠心濃縮することでNMN含有濃縮液を得た。最終的に、NMN含有濃縮液に5mol/Lの塩酸水を添加してpH=3~4に調整した後、エタノールを適量添加し再結晶操作を行った。析出した固体を回収し、NMNの結晶を高純度で得た(HPLC純度>95%)。
Claims (13)
- ニコチンアミド誘導体を産生するための微生物であって、
前記微生物が、ニコチンアミド及び5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸からニコチンアミドモノヌクレオチドを生成するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)を発現する、及び/又は、前記NAMPTのアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記NAMPTが、配列番号3又は配列番号6に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するポリペプチドからなる、組換え微生物。 - 前記微生物が更に、ニコチン酸及び/又はニコチンアミドの細胞内取り込みを促進するナイアシン輸送体を発現する、及び/又は、前記ナイアシン輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記ナイアシン輸送体が、配列番号9又は配列番号12に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するポリペプチドからなる、請求項1に記載の組換え微生物。 - 前記微生物が更に、ニコチンアミド誘導体の細胞外排出を促進するニコチンアミド誘導体輸送体を発現する、及び/又は、前記ニコチンアミド誘導体輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより形質転換されてなるとともに、
前記ニコチンアミド誘導体輸送体が、配列番号15に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するポリペプチドからなる、請求項1又は2に記載の組換え微生物。 - 前記微生物が更に、グルコース-6-リン酸から5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸を合成する経路を促進する1又は2以上の酵素を更に発現する、及び/又は、前記1又は2以上の酵素のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターにより更に形質転換されてなる、請求項1~3の何れか一項に記載の組換え微生物。
- 前記1又は2以上の酵素が、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、及びホスホリボシルピロリン酸シンターゼからなる群より選択される1又は2以上の酵素である、請求項4に記載の組換え微生物。
- 前記ホスホグルコースイソメラーゼが、配列番号18に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するポリペプチドであり、
前記グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼが、配列番号21に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するポリペプチドであり、
前記6-ホスホグルコノラクトナーゼが、配列番号24に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するポリペプチドであり、
前記6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼが、配列番号27に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するポリペプチドであり、
前記リボース-5-リン酸イソメラーゼが、配列番号30又は33に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するポリペプチドであり、
前記ホスホリボシルピロリン酸シンターゼが、配列番号36に示すアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項5に記載の組換え微生物。 - 前記ニコチンアミド誘導体が、ニコチンアミドモノヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドリボシド、ニコチン酸モノヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、及び、ニコチン酸アデニンジヌクレオチドからなる群より選択される、請求項1~6の何れか一項に記載の組換え微生物。
- 組換え微生物が大腸菌又は酵母である、請求項1~7の何れか一項に記載の組換え微生物。
- ニコチンアミド誘導体を産生するための方法であって、請求項1~8の何れか一項に記載の組換え微生物にニコチンアミドを供給し、前記微生物により生成されたニコチンアミド誘導体を回収することを含む方法。
- 回収されたニコチンアミド誘導体を精製することを更に含む請求項9に記載の方法。
- ニコチンアミド及び5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸からニコチンアミドモノヌクレオチドを生成するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、
前記核酸が、配列番号2又は配列番号5に記載の塩基配列と99%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。 - ニコチン酸及び/又はニコチンアミドの細胞内取り込みを促進するナイアシン輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、
前記核酸が、配列番号8又は配列番号11に記載の塩基配列と99%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。 - ニコチンアミド誘導体の細胞外排出を促進するニコチンアミド誘導体輸送体のアミノ酸配列をコードする核酸を担持するベクターであって、
前記核酸が、配列番号14に記載の塩基配列と99%以上の配列同一性を有する塩基配列を含むベクター。
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