JP6570514B2 - 炭素源から発酵法によりアニリン誘導体を製造する方法 - Google Patents
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Description
また、以下の非特許文献3には、図1に示すように、コリスミ酸が、PapA(4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸シンターゼ)により4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸(ADC)に変換され、ADCが、PapB(4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸ムターゼ)により4-アミノ-4-デオキシプレフェネート(ADP)に変換され、ADPが、PapC(4-アミノ-4-デオキシプレフェネート脱水素酵素)により4-アミノフェニルピルビン酸に変換されることが開示されている。
また、4-アミノフェニルピルビン酸は、微生物の内因性酵素の働きによって4-アミノフェニルアラニン(4APhe)に変換されると考えられている。
このような低い生産量は、4-アミノフェニルアラニン(4APhe)、4-アミノケイ皮酸(4ACA)、2-(4-アミノフェニル)アルデヒド、4-アミノフェニル酢酸、及び4-アミノフェネチルエタノール(4APE)を含むアニリン誘導体をグルコース等の炭素源から発酵法により工業的に大量に製造しようとする際の障害であった(図1参照)。
かかる従来技術の現状に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、グルコースの如き炭素源から発酵法により4-アミノフェニルアラニン(4APhe)、4-アミノケイ皮酸(4ACA)、2-(4-アミノフェニル)アルデヒド、4-アミノフェニル酢酸、及び4-アミノフェネチルエタノール(4APE)を含むアニリン誘導体を工業的に大量に得ることが可能な製造方法を提供することである。
[1]以下の工程:
コリスミ酸から4-アミノフェニルピルビン酸を生合成する機能を有する微生物において、少なくとも3つの外来遺伝子を導入することによって、所定培養条件下、1.8g/L以上の4-アミノフェニルアラニン(4APhe)を生産することができる微生物を作製し;そして該微生物の生育及び/又は維持に適した条件下、該微生物を炭素源と接触させて、4-アミノフェニルアラニン(4APhe)、4-アミノケイ皮酸(4ACA)、2-(4-アミノフェニル)アルデヒド、4-アミノフェニル酢酸、及び4-アミノフェネチルエタノール(4APE)からなる群から選ばれる少なくとも1つのアニリン誘導体を製造する;
を含む、前記アニリン誘導体の製造方法。
別段の定めなき限り、本明細書で使用されるすべての技術的又は科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は等価な方法又は物質を、開示される方法又は組成物の実施において使用することができるが、例示的な方法、装置、物質等を本明細書に記載する。
本実施形態においては、コリスミ酸から4-アミノフェニルピルビン酸を生合成する機能を有する微生物であればいずれでも構わないが、大腸菌、バチルス属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属又はザイモモナス属の細菌、及びサッカロミケス(Saccharomyces)属又はシゾサッカロミケス(Schizosaccharomyces)属の酵母から成る群から選ばれるものが好ましく、迅速な生育能力や発酵管理の容易さの観点から、大腸菌が特に好ましい。
コリスミ酸から4-アミノフェニルピルビン酸を生合成する機能を有する微生物において、少なくとも3つの外来遺伝子を導入することによって、所定培養条件下、1.8g/L以上の4-アミノフェニルアラニン(4APhe)を生産することができる微生物を作製し;そして
該微生物の生育及び/又は維持に適した条件下、該微生物を炭素源と接触させて、4-アミノフェニルアラニン(4APhe)、4-アミノケイ皮酸(4ACA)、2-(4-アミノフェニル)アルデヒド、4-アミノフェニル酢酸、及び4-アミノフェネチルエタノール(4APE)からなる群から選ばれる少なくとも1つのアニリン誘導体を製造する;
を含む、前記アニリン誘導体の製造方法である。
但し、本発明においては、前記少なくとも3つの外来遺伝子がコードするアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号8、10、6に示すアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、PapA、PapB、及びPapC酵素活性を有する蛋白質が包含され、かかる配列同一性は、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%であることができる。
ここで、「配列同一性」とは、ポリペプチド配列(若しくはアミノ酸配列)又はポリヌクレオチド配列(若しくは塩基配列)における2本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同士又は各塩基同士の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量(数)を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。同一性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は数多く知られており、「配列同一性」なる用語は、当業者には周知である。
変異DNAは、例えば、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により調製することができる。具体的には、配列番号8、10、6に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるDNAに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらDNAに変異を導入することにより、変異DNAを取得することができる。ここで、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Sambrook,J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異DNAを適切な発現系を用いて発現させることにより、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質を得ることができる。
本明細書において、「ストリンジェント(stringent)条件」とは、ポリヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒(例えば、ホルムアミド)、温度、その他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシーは増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。従って、「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の同一性の程度が、例えば、全体の平均で約90%以上であるような、高い同一性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、「ストリンジェント条件」とは、約45℃にて6.0×SSCでハイブリダイゼーションを行った後に、50℃で2.0×SSCで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば、低ストリンジェントとしての約2.0×SSC、50℃から、高ストリンジェンシトとしての約0.1×SSC、50℃まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェント条件の室温、約22℃から、高ストリンジェント条件の約65℃まで増大させることができる。ハイブリダイゼーションは、当業界で公知の方法やそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
コリスミ酸から4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸(ADC)の生合成は、K.S. Anderson et al., JACS 113 (1991) 3198-3200から公知である。Parsons et al., Biochem 42(2003) 5684-5693の第5690頁には、それにとってADCが明らかに不満足な基質であるフェナジン生合成PhzDタンパク質の影響下でADCが辛うじて加水分解されるにすぎないと記載されている。また、ADC合成は自然界でコリスミ酸からのフォレート(folate)合成での第1工程であるので、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼ酵素は自然界で豊富に入手可能である。それらはすべてのフォレート原栄養株有機体中に、例えば、バクテリア、酵母、植物、及び低級真核生物中に存在すると推測される。アミノデオキシコリスミ酸シンターゼ酵素は、p-アミノベンゾエート合成にも関与していることが知られている。
本発明においては、コリスミ酸から4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸(ADC)への変換活性が確認されていなかったpapA様遺伝子(PfpapA)を用いた。
本発明においては、4-アミノ-4-デオキシコリスミ酸(ADC)から4-アミノ-4-デオキシプレフェネート(ADP)への変換活性が確認されていなかったpapB様遺伝子(PfpapB)を用いた。
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(Pal)は、フェニルアラニンをケイ皮酸に変換する活性を有する酵素であり、これまでにアラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)のPal4遺伝子(野生型、及び変異型のF126E、F126D)、又はロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis)由来のPAL遺伝子(RgPal)を発現させた大腸菌を用いて休止菌体反応を行い、4APheを4ACAに変換することに成功している。
本発明においては、4-アミノフェニルアラニン(4APhe)から4-アミノケイ皮酸(4ACA)への変換においてRgPalを使用した。
本発明においては、4-アミノフェニルピルビン酸から2-(4-アミノフェニル)アルデヒドへの変換において、フェニルピルビン酸をフェニルアセトアルデヒドに変換するフェニルピルビン酸脱炭酸酵素であることが明らかとなっている酵母のAro10を用いた。
本発明においては、2-(4-アミノフェニル)アルデヒドから4-ミノフェネチルエタノール(4APE)への変換において、宿主微生物の内因性酵素を使用した。
また、大腸菌のPheAはフェニルアラニン合成系の酵素であり、コリスミ酸(chorismate)をフェニルピルビン酸(phenylpyruvate)に変換する活性を有する。コリスミ酸はPapAの基質でもあることから、pheA遺伝子を破壊することでPapAの基質であるコリスミ酸の宿主細胞内濃度が上昇すると予想される。そこで、以下の実施例において、pheA遺伝子を破壊した。
[発酵培地の組成]
発酵培地の組成を図2に示す。発酵には、以下の培養条件を使用し、これを本明細書における「所定培養条件」とした。
(前培養)
4 ml の液体以下のLB培地を試験管に加え、これに大腸菌のグリセロールストックを100μl添加し、37oC、120 rpm で6時間培養した。
(培地組成(/L))
LB培地組成を以下の表1に示す。オートクレーブを用いて121℃、15分間滅菌した培地を使用した。
50 ml の試験管に5 mlの前記発酵培地を加え、これに前培養液を500μl添加し37oC、120 rpm で12 時間培養した。その後、IPTGを終濃度0.1 mMとなるよう添加し、さらに12 時間培養した。フラスコを用いた培養は、500 ml の羽根つきフラスコに、終濃度10 g/l となるようグルコースを添加した100 ml の前記発酵培地を加え、これに前培養液を500μl 添加し30oCで培養した。尚、発現用宿主として大腸菌NST37(DE3)[ATCC 31882、米国特許第4,681,852号、遺伝子型aroG, aroF, pheA, tyrR, tyrA, trpE]又はその誘導体を使用した際には、培地にチロシン及びトリプトファンを0.05 g/l となるように添加した。IPTGによる発現誘導後、培養12時間ごとに5 g/l となるようグルコースを添加した。培養36時間後に評価対象化合物である4APheの生産量を調べた。
(pheA遺伝子破壊株の作製)
Baba, T. et al. Mol. Syst. Biol. 2, 2006.0008 (2006)に報告された手順に従って、pheA遺伝子のORFの外側50bpと相同な配列及びFRT配列を含むプライマーセット(配列番号4:5'-gtgaaaacagtacgggtactgtactaaagtcacttaaggaaacaaacatggaagttcctattctctagaaagtataggaacttctggacagcaagcgaaccggaattgc-3';及び配列番号3:5'-gatgattcacatcatccggcaccttttcatcaggttggatcaacaggcacgaagttcctatactttctagagagaataggaacttctcagaagaactcgtcaagaaggcg -3')を用いて、pZE21MCS(Lutz and Bujard, Nucl. Acids Res. (1997) 25 (6): 1203-1210)を鋳型としてカナマイシン耐性遺伝子を増幅した。得られた遺伝子断片を破壊用カセットとした。NST37株[ATCC 31882、米国特許第4,681,852号、遺伝子型aroG, aroF, pheA, tyrR, tyrA, trpE]のゲノム上のpheA遺伝子を含む領域をRed(登録商標)/ET(登録商標)Recombinationにより破壊用カセットに置き換えることでpheA遺伝子破壊株を取得した。遺伝子破壊株のゲノム上のカナマイシン耐性遺伝子はFLP-FRT recombination system により取り除いた。得られたpheA遺伝子破壊株をNST37(DE3)/ΔpheA株と命名した。また、この株はフェニルアラニンを含まないM9培地では生育できなかった。
GeneScript社の人工遺伝子合成サービスを利用し、末端にEcoRIとHindIII切断部位を有するaroG4遺伝子を含むDNA断片(配列番号1、APPL. ENVIRON. MICROBIOL, 63, 761-762(1997))を合成した。これをT4 DNA Polymeraseを用いて平滑化した後、予めEcoRVで切断したクロラムフェニコール耐性遺伝子を有するpACYC184(ニッポン・ジーン社)に連結した。得られたプラスミドをpACYC-aroG4とした。これをNST37(DE3)/ΔpheAに導入し、NST37(DE3)/ΔpheA/pACYC-aroG4株を作製した。
ゲノムデータベースを用いてストレプトマイセス・ベネズエラエ(Streptomyces venezuelae)のPapABCと相同性を示すタンパク質をコードする遺伝子を探索したところ、大腸菌と同じプロテオバクテリア門に属するシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescence)SBW25株(De Leij F et al.(1995) Appl Environ Microbiol 61:3443-3453)のPFLU1770、PFLU1771、PFLU1772がそれぞれ34% (PapC)、44% (PapA)、28% (PapB)の相同性を示した。そこで、これらの遺伝子を発現させた組み換え大腸菌を作製し、4APheの生産量を調べることとした。
GeneScript社の人工遺伝子合成サービスを利用し、大腸菌と同じプロテオバクテリア門に属するシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescence)SBW25株のPFLU1770遺伝子(配列番号5、PfPapC遺伝子)、PFLU1771遺伝子(配列番号7、PfPapA遺伝子)、及びPFLU1772遺伝子(配列番号9、PfPapB遺伝子)を合成した。その際、各遺伝子の塩基配列のコドンを大腸菌での発現用に最適化した。pUC57(Genescript社)に連結された各遺伝子を、各種制限酵素を用いて切り出し、pETduet-1(Novagen社)、pRSFduet-1(Novagen社)又はpCDFduet-1(Novagen社)に連結することで、pET-PFLU1771、pRSF-PFLU1771、pCDF-PFLU1771、pET-PFLU1770_1772、pRSF-PFLU1770_1772、及びpCDF-PFLU1770_1772を構築した。すなわち、PFLU1771(PfpapA)を人工遺伝子合成し、pETduet-1に導入してpET-PFLU1771を作製した。また、PFLU1770(PfpapC)とPFLU1772(PfpapB)を人工遺伝子合成し、pCDFduet-1に挿入してpCDF-PFLU1770_1772を作製した。
以下の3つのプラスミドを作製した。この際、PCRの鋳型としては、ストレプトマイセス・ベネズエラエ(Streptomyces venezuelae)(ATCC寄託番号10712)及びストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス(Streptomyces pristinaespiralis)(ATCC寄託番号25486)の全DNAを用いた。
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)S288C(ATCC 204508)のゲノムを鋳型として、以下のプライマー対(配列番号21:5’-gagccatggcacctgttacaattga-3’と配列番号22:5’-gacggatcctattttttatttcttttaaagtgc -3’)を用いてPCRによりAro10の遺伝子(配列番号23)を増幅した。これを制限酵素NcoIとBamHIを用いて消化し、同じ酵素で処理したpRSF-duet1に連結してpRSF-aro10を得た。
以下のプライマー対(配列番号25:5’-gacggatccgatggccccctccgtcgactc-3’と配列番号26:5’-gctgaattcttatgccatcatcttgacgag-3’)を用いてPCRにより用いて酵母ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis)由来のPAL遺伝子(配列番号27)(RgPAL遺伝子)を含むDNA断片を増幅した。これを制限酵素BamHIとEcoRIを用いて消化し、同じ酵素で処理したpET-PFLU1771に連結してpET-PFLU1771_Rgpalを得た。
以下のプライマー対(配列番号25と配列番号26)を用いてPCRによりRgPAL遺伝子を含むDNA断片を増幅した。これを制限酵素BamHIとEcoRIを用いて消化し、同じ酵素で処理したpRSFduet-1に連結してpRSF-Rgpalを得た。
4APhe生産用培地を500 ml 含む、1.0 L 容ジャーファーメンター (BMJ-1:Biotto) に、LB培地で培養した前培養液を1/10 量接種した。空気を0.6 L/min で通気し、撹拌速度は500 r.p.m に設定した。O. D.が0.4-0.5に達した時点で終濃度0.1 mMとなるようIPTGを添加した。フィード制御システムBF510 (エイブル・バイオット社)を用いグルコーススタットでの培養を行った。この際、1時間ごとにグルコース濃度を測定し、測定値が1.5 g/l を下回わると培養槽にグルコースが1 g、塩化アンモニウムが0.2 g 添加されるようにBF510を設定した。
細胞濃度は、分光光度計 (UVmini-1240) を用いて600 nm で測定した。グルコース濃度の測定はグルコーステストキット (Wako) を用いて、比色定量により行った。培地中の4APheの濃度測定には、HPLC (1200 infinity series: Hewlett Packerd)を用い、210、254及び280 nm の波長の吸光度を指標に測定した。
前記pET-PFLU1771と前記pCDF-PFLU1770_1772を、大腸菌NST37(DE3)/ΔpheA/pACYC-aroG4に導入してPFABCΔAro株を得た。IPTG濃度を0.1 mMとして各株を上述の「所定培養条件」の下で培養し、培養36時間後の4APheの生産量を調べた。その結果、PFABCΔAro株は1.8 g/Lの4APheを生産した。
実施例1と同様の手法で、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス(Streptomyces pristinaespiralis)のpapABC(pET-spPapAとpRSF-spPapBC)を用いた場合には、0.2 g/Lの4APheが得られた。また、ストレプトマイセス・ベネズエラエ(Streptomyces venezuelae)のpapA(pET-svpapA)とストレプトマイセス・プリスチナエスピラリスのpapBC(pRSF-sppapBC)を用いた場合に、0.9 g/Lの4APheが得ることはできたが、実施例1の結果に及ばなかった。
上述の[ジャーファーメンターを用いた培養]に示した方法を用いて、PFABCΔAro株を用いて培養を行ったところ、図3に示すように、最大4.0 g/L の4APhe (対糖収率:15%)を生産することに成功した。生産量が変化しなくなる培養44時間での対糖収率は13%であった。
前記pET-PFLU1771_Rgpal、前記pCDF-PFLU1770_1772、前記pRSF-Rgpalの3つのプラスミドを大腸菌NST37(DE3)/ΔpheA/pACYC-aroG4に導入した。得られた株を、ジャーファーメンターを用いて培養したところ、3 mg/Lの4ACAが生産されていた。
これに反し、実施例3と同一培養条件下で、従来のpap系遺伝子を用いた場合、4ACAを生産することはできなかった。
酵母のAro10を用いて4APEを発酵生産させることを試みた。pRSF-aro10をPFABCΔAroに導入して得られた株を培養した。この際、IPTG濃度0.1 mM又は0.3 mMのいずれにおいても、培養24時間後に4APEの蓄積が確認された。
Claims (8)
- 以下の工程:
コリスミ酸から4-アミノフェニルピルビン酸を生合成する機能を有する微生物に、少なくとも3つの外来遺伝子を導入することによって、所定培養条件下、1.8g/L以上の4-アミノフェニルアラニン(4APhe)を生産することができる微生物を作製し;そして
該微生物の生育及び/又は維持に適した条件下、該微生物を炭素源と接触させて、4-アミノフェニルアラニン(4APhe)、4-アミノケイ皮酸(4ACA)、2-(4-アミノフェニル)アルデヒド、4-アミノフェニル酢酸、及び4-アミノフェネチルエタノール(4APE)からなる群から選ばれる少なくとも1つのアニリン誘導体を製造する;
を含む、前記アニリン誘導体の製造方法であって、前記少なくとも3つの外来遺伝子は、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescence)由来のpapA、papB、及びpapCである、方法。 - 前記papA、papB、及びpapCは、それぞれ、配列番号7、9、5で示す塩基配列からなる、請求項1に記載の方法。
- 前記微生物を作製する工程において、さらに、フェニルアラニン合成酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子を破壊する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記破壊された遺伝子は、pheAである、請求項3に記載の方法。
- 前記微生物を作製する工程において、aroG、aro10及びpalから成る群から選ばれる少なくとも1つの外来遺伝子をさらに導入する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物は、大腸菌、バチルス属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属又はザイモモナス属の細菌、及びサッカロミケス(Saccharomyces)属又はシゾサッカロミケス(Schizosaccharomyces)属の酵母から成る群から選ばれる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物は大腸菌である、請求項6に記載の方法。
- 前記炭素源は、D-グルコース、スクロース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖蜜、トウモロコシ分解液、及びセルロース分解液からなる群から選ばれる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
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