JP2009082064A - 組換えプラスミド、形質転換体及び２ｈ−ピラン−２−オン−４，６−ジカルボン酸の製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】糖類から多段階の酵素反応を介して、ＰＤＣを工業的スケールで発酵生産する方法を提供する。
【解決手段】特定の配列で示されるデヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、特定の配列で示されるプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び/又は特定の配列で示される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド；特定の配列で示されるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子、特定の配列で示される4-ヒドロキシ安息香酸 3-水酸化酵素遺伝子、特定の配列で示されるプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び/又は特定の配列で示される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド；該組換えプラスミドを含む形質転換体；並びに、２Ｈ−ピラン−２−オン−４，６−ジカルボン酸の製造法。
【選択図】なし
【解決手段】特定の配列で示されるデヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、特定の配列で示されるプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び/又は特定の配列で示される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド；特定の配列で示されるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子、特定の配列で示される4-ヒドロキシ安息香酸 3-水酸化酵素遺伝子、特定の配列で示されるプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び/又は特定の配列で示される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド；該組換えプラスミドを含む形質転換体；並びに、２Ｈ−ピラン−２−オン−４，６−ジカルボン酸の製造法。
【選択図】なし
Description
本発明は、糖類から、2H-ピラン-2-オン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産するための多段反応プロセスを構成する酵素をコードする遺伝子を含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを導入した形質転換体、及びそれを用いる2H-ピラン-2-オン-4,6-ジカルボン酸の工業的製造法に関する。
植物主要成分であるリグニンは、芳香族高分子化合物として植物細胞壁に普遍的に含まれているバイオマス資源であるが、リグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分は、多様な化学構造を有する成分で構成されていることや複雑な高分子構造を持つために、有効な利用技術が開発されていない。そのため製紙工程で大量に生成するリグニンは有効利用されることなく、重油の代替え品として燃焼されている。
一方、本発明者らは、リグニン等の植物芳香族成分が、加水分解や酸化分解、可溶媒分解などの化学的分解法、超臨界水や超臨界有機溶媒による物理化学的分解法などにより、バニリン、シリンガアルデヒド等を含む低分子混合物に変換され、更に、これらの化合物が、機能性プラスチック原料や化学製品の原料となり得る単一の中間物質2-ピロン-4,6-ジカルボン酸（以下、「ＰＤＣ」と称する）に変換されることを見出している。また、本発明者らは、ＰＤＣを発酵生産するための多段反応プロセスを構成する４種類の酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体を用いて、バニリン、シリンガアルデヒド等からＰＤＣを製造する方法を報告している（特許文献１参照）。
近年、バイオマス資源由来の糖類から、バイオプロセスによる化学原料・燃料を製造する技術が注目されている。よって、糖類からのＰＤＣ生産が可能になれば、バイオマスの利用の幅を広げる一助となる。そこで、本発明者らは、シキミ酸経路を経由するグルコースからのＰＤＣの生産系を考案し、コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子、4-ヒドロキシ安息香酸 3-水酸化酵素遺伝子、プロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子をこの順に連結したコンストラクトを含む組換えプラスミドを作製し、これを大腸菌に導入してＰＤＣを製造したことを報告している（非特許文献１参照）。しかしながら、その収量は非常に低く、グルコース含量 2 g/Lの液体培地から、3 mg/L程度であった。
従って、本発明は、糖類から多段階の酵素反応を介して、ＰＤＣを工業的スケールで発酵生産する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、斯かる現状に鑑み鋭意検討した結果、デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、プロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を組み合わせることにより、又はコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子、4-ヒドロキシ安息香酸 3-水酸化酵素遺伝子、プロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子を組み合わせることにより、シキミ酸経路又はシキミ酸経路の一部を経由して、ＰＤＣを効率良く製造できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、（１）本発明は、配列番号１で示されるデヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、配列番号３及び５で示されるプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び/又は配列番号７で示される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを提供する。
（２）本発明はまた、配列番号９で示されるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子、配列番号11で示される4-ヒドロキシ安息香酸 3-水酸化酵素遺伝子、配列番号３及び５で示されるプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び/又は配列番号７で示される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを提供する。
（３）本発明はまた、配列番号13で示されるデヒドロキナ酸合成酵素遺伝子、及び/又は芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害機能を解除した、配列番号15で示されるデオキシ-D-アラビノ-へプツロソン酸-7-リン酸合成酵素アイソザイム遺伝子を更に含む、（１）又は（２）記載の組換えプラスミドを提供する。
（４）本発明はまた、（１）〜（３）のいずれか１記載の組換えプラスミドが導入されてなる形質転換体を提供する。
（５）本発明はまた、（１）〜（３）のいずれか１項記載の組換えプラスミドが大腸菌に導入されてなる形質転換体を提供する。
（６）本発明はまた、前記大腸菌が、XL1-Blue株である、（５）記載の形質転換体を提供する。
（７）本発明はまた、（４）〜（６）のいずれか１記載の形質転換体を糖類の存在下に培養し、培養物からＰＤＣを採取することを特徴とする、ＰＤＣの製造法を提供する。
（８）本発明は更に、前記糖類が、グルコースである、（７）記載の製造法を提供する。
（２）本発明はまた、配列番号９で示されるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子、配列番号11で示される4-ヒドロキシ安息香酸 3-水酸化酵素遺伝子、配列番号３及び５で示されるプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び/又は配列番号７で示される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを提供する。
（３）本発明はまた、配列番号13で示されるデヒドロキナ酸合成酵素遺伝子、及び/又は芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害機能を解除した、配列番号15で示されるデオキシ-D-アラビノ-へプツロソン酸-7-リン酸合成酵素アイソザイム遺伝子を更に含む、（１）又は（２）記載の組換えプラスミドを提供する。
（４）本発明はまた、（１）〜（３）のいずれか１記載の組換えプラスミドが導入されてなる形質転換体を提供する。
（５）本発明はまた、（１）〜（３）のいずれか１項記載の組換えプラスミドが大腸菌に導入されてなる形質転換体を提供する。
（６）本発明はまた、前記大腸菌が、XL1-Blue株である、（５）記載の形質転換体を提供する。
（７）本発明はまた、（４）〜（６）のいずれか１記載の形質転換体を糖類の存在下に培養し、培養物からＰＤＣを採取することを特徴とする、ＰＤＣの製造法を提供する。
（８）本発明は更に、前記糖類が、グルコースである、（７）記載の製造法を提供する。
本発明によれば、バイオマス資源の一つである糖類から、ＰＤＣを収率良くかつ安価に製造することができる。
「シキミ酸経路」は、芳香族アミノ酸の生合成経路として知られている。シキミ酸経路は、解糖系のホスホエノールピルビン酸（PEP）とペントースリン酸回路のエリトロース-4-リン酸（E4P）との縮合により始まり、デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸、3-デヒドロキナ酸、3-デヒドロシキミ酸、シキミ酸、シキミ酸-3-リン酸、5-エノールピルビン酸シキミ酸-3-リン酸へと順次変換され、更にコリスミ酸に変換される。コリスミ酸から各アミノ酸への反応に分岐するので、一般的には、コリスミ酸までをシキミ酸経路と定義している（図１中、細い実線で示した経路）。
本発明の製造法の１つは、シキミ酸経路の最終代謝物であるコリスミ酸に、コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子（ubiC遺伝子）、4-ヒドロキシ安息香酸 3-水酸化酵素遺伝子（pobA遺伝子）、プロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子（LigAB遺伝子）、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子（LigC遺伝子）でそれぞれコードされる酵素を作用させる多段階代謝プロセスを同調的に進行させて、糖類をＰＤＣにまで変換する方法である（図１中、点線で示した経路）。
また、本発明の製造法の他の１つは、デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子（qutC遺伝子）、LigAB遺伝子、及びLigC遺伝子でそれぞれコードされる酵素を作用させる多段階代謝プロセスを同調的に進行させて、糖類をＰＤＣにまで変換する方法である（図１中、波線で示した経路）。
本明細書の組換えプラスミドは、コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子（ubicC遺伝子）、4-ヒドロキシ安息香酸 3-水酸化酵素遺伝子（pobA遺伝子）、プロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子（LigAB遺伝子）、及び/又は4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子（LigC遺伝子）を含む組換えプラスミド、あるいはデヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子（qutC遺伝子）、LigAB遺伝子、及び/又はLigC遺伝子を含む組換えプラスミドである。ここで、「及び/又は」とは、特定の遺伝子群が全て同一のプラスミド内に含まれていてもよく、又は当該遺伝子群が２グループ以上に分かれて、それぞれ別個のプラスミドに含まれていてもよい、ことを意味する。
本発明の組換えプラスミドは、デヒドロキナ酸合成酵素の触媒活性を増強させるために、デヒドロキナ酸合成酵素遺伝子（aroB遺伝子）を更に含んでもよい（図１中、太い実線で示した経路）。
上記遺伝子の全ゲノム配列は、qutC遺伝子についてはDDBJ accession number M77665に、ubiC遺伝子についてはDDBJ accession number X66619に、aroB遺伝子についてはDDBJ accession number X03867に記載されている。
また、デオキシ-D-アラビノ-へプツロソン酸-7-リン酸合成酵素アイソザイム遺伝子（aroFfbr遺伝子）をaroB遺伝子と共に又は単独で、本発明の組換えプラスミドに更に含んでもよい（図１中、太い実線で示した経路）。aroFfbr遺伝子は、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害機能を解除したaroF遺伝子であり、芳香族アミノ酸の生合成経路に入る炭素の流れを減少させ得ることが知られている（FEMS Microbiology Letter 202 (2001), pp.145-148）。aroFfbr遺伝子は、aroF遺伝子の全ゲノム配列（DDBJ accession number K01989）の、24番目の塩基及び1004〜1019番目の塩基配列を変異させた遺伝子である（FEMS Microbiology Letter 202 (2001), pp.145-148）。
qutC遺伝子、ubiC遺伝子、aroB遺伝子、及びaroFfbr遺伝子の各遺伝子の取得方法は特に限定されないが、例えば、データベースに記載のこれらの遺伝子配列の情報に基づいて適当なプラマーやプローブを設計し、菌株のｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより行うことができる。
また、これらの遺伝子をＰＣＲ法により取得することもできる。菌株の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、当該遺伝子の塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行えばよい。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、94℃で30秒間（変性）、55℃で30秒〜１分間（アニーリング）、72℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば30サイクル行った後、72℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、適切なベクター中にクローニングすることができる。
また、これらの遺伝子をＰＣＲ法により取得することもできる。菌株の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、当該遺伝子の塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行えばよい。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、94℃で30秒間（変性）、55℃で30秒〜１分間（アニーリング）、72℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば30サイクル行った後、72℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、適切なベクター中にクローニングすることができる。
上記のようにして取得した、qutC遺伝子の読み取り枠の塩基配列を配列番号１にそのアミノ酸配列を配列番号２に、ubiC遺伝子の読み取り枠の塩基配列を配列番号９にそのアミノ酸配列を配列番号10に、aroB遺伝子の読み取り枠の塩基配列を配列番号13にそのアミノ酸配列を配列番号14に、aroFfbr遺伝子の全塩基配列を配列番号15にそのアミノ酸配列を配列番号16に示す。
pobA遺伝子は、特願2006-218524号明細書に記載のシュードモナス・プチダ（Pseudomonas. putida）KT2440株から上述のようにして取得することができる。pobA遺伝子の読み取り枠を配列番号11に、そのアミノ酸配列を配列番号12に示す。
LigA遺伝子及びLigB遺伝子は、それぞれ、特開2005-278549号公報に記載の配列番号14、16で示されるＤＮＡ断片（本明細書では、その塩基配列をそれぞれ配列番号３、５に、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号４、６に示す）を使用し、LigC遺伝子は、同公報の配列番号18で示されるＤＮＡ断片（本明細書では、その塩基配列を配列番号７に、アミノ酸配列を配列番号８に示す）を使用する。
本明細書では、前記の各遺伝子の読み取り枠の塩基配列を含むＤＮＡ断片、及び上記のLigABC遺伝子のＤＮＡ断片を「遺伝子断片」と称する。
本発明の組み換えプラスミドは、発現用ベクターを適当な制限酵素で切断し、適当なプロモーター配列の下流に上記の遺伝子断片を結合させることにより得られる。発現用ベクターとしては、調節可能なプロモーター、ＳＤ配列、ターミネーター等を有する、大腸菌を宿主とするpUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pKT230MC、pT7Blue、ブルースクリプト等が好ましく使用できる。これら以外にも、バチルス（Bacillus）属等の原核細胞、又は酵母、動物細胞等の真核細胞中での発現用に用いられる通常の発現用ベクターを用いることができる。結合の方法としては、例えば、ＤＮＡリガーゼによって結合させる方法が挙げられる。
得られた組換えプラスミドを用いて宿主生物を形質転換するには、塩化カルシウム法、プロトプラスト法、塩化ルビジウム法、リポフェクション法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、DEAE-デキストラン法等の公知の方法を用いればよい。
形質転換体の選択は、用いたプラスミドの選択マーカー、例えば形質転換体のＤＮＡ組換えにより獲得する薬剤耐性を指標にすることができる。薬剤耐性マーカーとしては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が挙げられる。これらの形質転換体の中から目的の組換えプラスミドを含有する形質転換体の選択は、例えば遺伝子の部分的なＤＮＡ断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により行うのが好ましい。プローブの標識としては、例えば放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素等を用いることができる。
得られた形質転換体は、糖類の他、窒素源、金属塩、ミネラル、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。培地のpHは、形質転換体が生育し得る範囲のpHであればよく、pH ６〜８程度に調整するのが好適である。培養は、好気的条件下で、15〜40℃、好ましくは28〜37℃で２〜７日間振盪又は通気攪拌培養すればよい。
本発明で使用される糖類は、グルコース、キシロース、アラビノース、グリセロール、ショ糖やデンプンの加水分解物、又はこれらの２以上の組み合わせが挙げられる。好ましくは、グルコースである。
培養液からのＰＤＣの採取は、通常の有機化合物の単離、精製法を用いればよい。例えば、培地を遠心分離することにより菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に酸（pH １〜４程度）を加えて、適当な溶媒で抽出すればよい。酸としては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸等が挙げられる。溶媒としては、酢酸エチル、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、ヘキサン、ヘプタン、トルエン、ベンゼン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、クロロホルム及びジクロロメタンが挙げられる。
本発明の製造法によって得られるＰＤＣは、プラスチック材料、化学製品材料等の成形体を作製するための、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン等の原料として有用である。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１ 組換えプラスミドの作製
（１）遺伝子断片の増幅
配列番号13で示されるaroB遺伝子断片、配列番号15で示されるaroFfbr遺伝子断片、配列番号１で示されるqutC遺伝子断片、配列番号９で示されるubiC遺伝子断片、及び配列番号11で示されるpobA遺伝子断片を、それぞれ、以下のプライマー配列を用いて増幅した。
aroB遺伝子断片：
5'-TCTCTAGAAGATCTTCGGGAGGGAATTATGGAGAGGATTGTC-3'（配列番号17）；
3'-CGCCATTGCCGATTGTCAATCAGCGTAAGATATCTCTAGAGC-5'（配列番号18）
aroFfbr遺伝子断片：
5'-TTAAGCTTGGATCCGGGAGGGAATCATGCAAAAAGACGCGCTGAATAAAGTACATATTAC-3'（配列番号19）；
3'-GAAATTCATCAGGATCTGAACGGGCAGCTGCCGCGCGCTTTTCGCTAAGAATTCAAGCTTAA-5'（配列番号20）
qutC遺伝子断片：
5'-CAGCTAGCACATATGGGGAGGGAAAAATGCCCGCAAACCTCAAAATC-3'（配列番号21）；
3'-GTTGAGGTGCCAGCACGTAACTGTGAATGTTAGGGTACCGCTAGCAA-5'（配列番号22）
ubiC遺伝子断片：
5'-GGGAGGGAACAATGTCACACCCCGCGTTAAC-3'（配列番号23）；
3'-TGTTTTTACCGGCGTCACCGTTGTACTAA-5’（配列番号24）
pobA遺伝子断片：
5'-ATCAAGCTTAGGGAGGGAACAATGAAAACTCAGGTTGCAATTA-3'（配列番号25）；
3'-GTTCGAGGAAGTTGCCTGACCTGCCATTGGCTAGCTCT-5'（配列番号26）
（１）遺伝子断片の増幅
配列番号13で示されるaroB遺伝子断片、配列番号15で示されるaroFfbr遺伝子断片、配列番号１で示されるqutC遺伝子断片、配列番号９で示されるubiC遺伝子断片、及び配列番号11で示されるpobA遺伝子断片を、それぞれ、以下のプライマー配列を用いて増幅した。
aroB遺伝子断片：
5'-TCTCTAGAAGATCTTCGGGAGGGAATTATGGAGAGGATTGTC-3'（配列番号17）；
3'-CGCCATTGCCGATTGTCAATCAGCGTAAGATATCTCTAGAGC-5'（配列番号18）
aroFfbr遺伝子断片：
5'-TTAAGCTTGGATCCGGGAGGGAATCATGCAAAAAGACGCGCTGAATAAAGTACATATTAC-3'（配列番号19）；
3'-GAAATTCATCAGGATCTGAACGGGCAGCTGCCGCGCGCTTTTCGCTAAGAATTCAAGCTTAA-5'（配列番号20）
qutC遺伝子断片：
5'-CAGCTAGCACATATGGGGAGGGAAAAATGCCCGCAAACCTCAAAATC-3'（配列番号21）；
3'-GTTGAGGTGCCAGCACGTAACTGTGAATGTTAGGGTACCGCTAGCAA-5'（配列番号22）
ubiC遺伝子断片：
5'-GGGAGGGAACAATGTCACACCCCGCGTTAAC-3'（配列番号23）；
3'-TGTTTTTACCGGCGTCACCGTTGTACTAA-5’（配列番号24）
pobA遺伝子断片：
5'-ATCAAGCTTAGGGAGGGAACAATGAAAACTCAGGTTGCAATTA-3'（配列番号25）；
3'-GTTCGAGGAAGTTGCCTGACCTGCCATTGGCTAGCTCT-5'（配列番号26）
（２）組換えプラスミドの作製
１．組換えプラスミドpACaroB、pCDFDuet-qutC、及びpCDqaroFfbrの作製
前記（１）で増幅した遺伝子断片を、pT7Blueベクター（Novagen）に挿入し、組換えプラスミドpT7Blue-aroB、pT7Blue-aroFfbr、pT7Blue-qutCを作製した（各々図２、３、４）。
pT7Blue-aroB及びpACYCDuet-1（Novagen）を制限酵素のBgl II、EcoRＶで処理し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pACYCDuet-1にaroBを連結し、組換プラスミドpACaroBを作製した（図５）。
次いで、pT7Blue-qutC及びpCDFDuet-1（Novagen）を制限酵素のNdeＩ、KpnＩで処理し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pCDFDuetにqutCを連結し、pCDFDuet-qutC（図６）を作製した。
その後、pT7Blue-aroFfbr及びpCDFDuet-qutCを制限酵素のBamHＩ、EcoRＩで処理し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pCDFDuet-qutCにaroFfbrを連結し、pCDqaroFfbr（図７）を作製した。
１．組換えプラスミドpACaroB、pCDFDuet-qutC、及びpCDqaroFfbrの作製
前記（１）で増幅した遺伝子断片を、pT7Blueベクター（Novagen）に挿入し、組換えプラスミドpT7Blue-aroB、pT7Blue-aroFfbr、pT7Blue-qutCを作製した（各々図２、３、４）。
pT7Blue-aroB及びpACYCDuet-1（Novagen）を制限酵素のBgl II、EcoRＶで処理し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pACYCDuet-1にaroBを連結し、組換プラスミドpACaroBを作製した（図５）。
次いで、pT7Blue-qutC及びpCDFDuet-1（Novagen）を制限酵素のNdeＩ、KpnＩで処理し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pCDFDuetにqutCを連結し、pCDFDuet-qutC（図６）を作製した。
その後、pT7Blue-aroFfbr及びpCDFDuet-qutCを制限酵素のBamHＩ、EcoRＩで処理し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pCDFDuet-qutCにaroFfbrを連結し、pCDqaroFfbr（図７）を作製した。
２．aroB及びaroFfbrの機能の確認
（２−１）aroB相補実験
E.coli JD25083（aroB欠損株）にpACaroBを導入することにより、aroB相補実験を行った。培地として、LB培地、及びDM培地（組成：K2HPO4 7 g/L、KH2PO4 3 g/L、(NH4)2SO4 1 g/L、MgSO4・7H2O、グルコース 2 g/L、及びチアミンHCl 30 mg/L）の２種類を用いた。結果を図８に示す。図８の左側がDMプレートであり、右側がLBプレートである。「H」は、E.coli XL-1を、「I」は、E.coli JD25083（aroB欠損株）を、「J」は、E.coli JD25083/pACaroB（aroB相補株）を示す。
図８から明らかなように、E.coli JD25083（aroB欠損株）はLBプレート上では増殖したが、DMプレート上では増殖しなかった。一方、pACaroBを導入したE.coli JD25083/pACaroB（aroB相補株）は、LBプレート及びDMプレートのいずれにおいても増殖した（図８）。このことから、作製したプラスミドのaroBは機能していることが示された。
（２−１）aroB相補実験
E.coli JD25083（aroB欠損株）にpACaroBを導入することにより、aroB相補実験を行った。培地として、LB培地、及びDM培地（組成：K2HPO4 7 g/L、KH2PO4 3 g/L、(NH4)2SO4 1 g/L、MgSO4・7H2O、グルコース 2 g/L、及びチアミンHCl 30 mg/L）の２種類を用いた。結果を図８に示す。図８の左側がDMプレートであり、右側がLBプレートである。「H」は、E.coli XL-1を、「I」は、E.coli JD25083（aroB欠損株）を、「J」は、E.coli JD25083/pACaroB（aroB相補株）を示す。
図８から明らかなように、E.coli JD25083（aroB欠損株）はLBプレート上では増殖したが、DMプレート上では増殖しなかった。一方、pACaroBを導入したE.coli JD25083/pACaroB（aroB相補株）は、LBプレート及びDMプレートのいずれにおいても増殖した（図８）。このことから、作製したプラスミドのaroBは機能していることが示された。
（２−２）aroF相補実験
E.coli JD23491（aroF欠損株）にpT7Blue-aroFfbr を導入することにより、aroF相補実験を行った。培地として、LB培地及びDM培地の２種類を用いた。LBプレート及びDMプレートのいずれにおいても、E.coli JD23491（aroF欠損株）及びE.coli JD23491/aroFfbr(aroFfbr相補株）の増殖が確認された。これは、大腸菌にAroFのアイソザイムとしてAroG、AroHが存在するためであると考えられる。
E.coli JD23491（aroF欠損株）にpT7Blue-aroFfbr を導入することにより、aroF相補実験を行った。培地として、LB培地及びDM培地の２種類を用いた。LBプレート及びDMプレートのいずれにおいても、E.coli JD23491（aroF欠損株）及びE.coli JD23491/aroFfbr(aroFfbr相補株）の増殖が確認された。これは、大腸菌にAroFのアイソザイムとしてAroG、AroHが存在するためであると考えられる。
E.coli JD23491（aroF欠損株）の増殖能とE.coli JD23491/aroFfbr（aroFfbr相補株）の増殖能との差を計るため、LB培地及びDM培地を用い培養実験を行った。図９（ａ）は、LB培地でのaroF相補試験の結果を、図９ｂは、DM培地でのaroF相補試験の結果を示す。図９（ａ）、９（ｂ）中、−白菱形−は、E.coli JD23491/aroFfbr（aroFfbr相補株）を、−白四角−は、E.coli JD23491（aroF欠損株）を、−白三角−は、野生型株を示す。
相補試験の結果、LB培地では、E.coli JD23491（aroF欠損株）の増殖能とE.coli JD23491/aroFfbr（aroFfbr相補株）の増殖能とに差は見られなかった（図９（ａ））。一方、DM培地では、E.coli JD23491（aroF欠損株）に比べて、E.coli JD23491/aroFfbr（aroFfbr相補株）の増殖が速かった（図９（ｂ））また、E.coli JD23491（aroF欠損株）では増殖が遅くなるものの、24時間後には、aroFfbrの増殖能は、相補株、野生型株と同程度になった（図９（ｂ））。
この相補実験において欠損株の増殖能と相補株の増殖能とに差が見られたことから、作製したプラスミドのaroFfbrが機能していることが示された。
相補試験の結果、LB培地では、E.coli JD23491（aroF欠損株）の増殖能とE.coli JD23491/aroFfbr（aroFfbr相補株）の増殖能とに差は見られなかった（図９（ａ））。一方、DM培地では、E.coli JD23491（aroF欠損株）に比べて、E.coli JD23491/aroFfbr（aroFfbr相補株）の増殖が速かった（図９（ｂ））また、E.coli JD23491（aroF欠損株）では増殖が遅くなるものの、24時間後には、aroFfbrの増殖能は、相補株、野生型株と同程度になった（図９（ｂ））。
この相補実験において欠損株の増殖能と相補株の増殖能とに差が見られたことから、作製したプラスミドのaroFfbrが機能していることが示された。
３．組換えプラスミドpCDFDuet-ubiC-pobA、及びpACaroBaroFfbrの作製
前記（１）で増幅した遺伝子断片をpT7Blueベクター（Novagen）へ挿入し、組換えプラスミドpT7Blue-ubiC及びpT7Blue-pobAを作製した（各々、図１１、１２）。
pT7Blue-ubiC及びpCDFDuet-1（Novagen）を制限酵素のEcoRＩ、Hind IIIで処理し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pCDFDuetにubiCを連結し、pCDFDuet-ubiC（図１３）を作製した。
次いで、pT7Blue-pobAを制限酵素のHind III、NheＩで、pCDFDuet-ubiCを制限酵素のEcoRＶで処理し、末端を平滑化し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pCDFDuet-ubiCにpobAを連結し、pCDFDuet-ubiC-pobA（図１４）を作製した。
pACaroB及びpT7Blue-aroFfbrを制限酵素のBamHＩ、EcoRＩで処理し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pACaroB aroFfbrを作製した（図１５）。
前記（１）で増幅した遺伝子断片をpT7Blueベクター（Novagen）へ挿入し、組換えプラスミドpT7Blue-ubiC及びpT7Blue-pobAを作製した（各々、図１１、１２）。
pT7Blue-ubiC及びpCDFDuet-1（Novagen）を制限酵素のEcoRＩ、Hind IIIで処理し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pCDFDuetにubiCを連結し、pCDFDuet-ubiC（図１３）を作製した。
次いで、pT7Blue-pobAを制限酵素のHind III、NheＩで、pCDFDuet-ubiCを制限酵素のEcoRＶで処理し、末端を平滑化し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pCDFDuet-ubiCにpobAを連結し、pCDFDuet-ubiC-pobA（図１４）を作製した。
pACaroB及びpT7Blue-aroFfbrを制限酵素のBamHＩ、EcoRＩで処理し、T4DNAリガーゼを用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行い、pACaroB aroFfbrを作製した（図１５）。
４．組換えプラスミドpULABC
特許文献１に記載の方法に準じて作製した。
特許文献１に記載の方法に準じて作製した。
実施例２ 組換えプラスミドpCDFDuet-qutC及びpULABCを導入した形質転換体からのＰＤＣの生産
（１）組換えプラスミドpCDFDuet-qutC及びpULABCを大腸菌XL1-Blue株（STRATEGENE, CA, USA）に形質転換し、25 mg/Lのアンピシリン及びストレプトマイシンを含むLBプレートに展開し37℃で12時間培養し、qutC遺伝子及びLigABC遺伝子を保有する形質転換株を得た。本菌を「XL-1/qutC LigABC株」と名付けた。
（２）XL-1/qutC LigABC株を、10 mlのLB液体培地（25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシンを含む）に接種し37℃で16時間培養し、前培養菌体懸濁液とした。200 mL液体培地（グルコース含量2 g/L）を坂口フラスコを用いて調製し、そこに培養したXL-1/qutC LigABC株の前培養菌体懸濁液全量を混合し、37℃、125 rpm/分の通気攪拌下、60時間培養した。その結果を図１０（ａ）に示す。
（３）培養終了後、坂口フラスコの培地から遠心分離（6000 rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えpH 3.5に調整し、低温で保存した。培養液の分析は、TLC、及びHPLC（分析条件 移動相：アセトニトリル/水＝2.5/7.5、酢酸1％；カラム：ODC-1251-SS（センシュー科学）；流速：0.5 mL/分；測定波長：294 nm）により行った。以下の実施例におけるHPLC分析は、本実施例の分析条件と同一の条件下で行った。
（４）分析の結果、XL-1/qutC LigABC株からＰＤＣが生産されたことが確認された。
（１）組換えプラスミドpCDFDuet-qutC及びpULABCを大腸菌XL1-Blue株（STRATEGENE, CA, USA）に形質転換し、25 mg/Lのアンピシリン及びストレプトマイシンを含むLBプレートに展開し37℃で12時間培養し、qutC遺伝子及びLigABC遺伝子を保有する形質転換株を得た。本菌を「XL-1/qutC LigABC株」と名付けた。
（２）XL-1/qutC LigABC株を、10 mlのLB液体培地（25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシンを含む）に接種し37℃で16時間培養し、前培養菌体懸濁液とした。200 mL液体培地（グルコース含量2 g/L）を坂口フラスコを用いて調製し、そこに培養したXL-1/qutC LigABC株の前培養菌体懸濁液全量を混合し、37℃、125 rpm/分の通気攪拌下、60時間培養した。その結果を図１０（ａ）に示す。
（３）培養終了後、坂口フラスコの培地から遠心分離（6000 rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えpH 3.5に調整し、低温で保存した。培養液の分析は、TLC、及びHPLC（分析条件 移動相：アセトニトリル/水＝2.5/7.5、酢酸1％；カラム：ODC-1251-SS（センシュー科学）；流速：0.5 mL/分；測定波長：294 nm）により行った。以下の実施例におけるHPLC分析は、本実施例の分析条件と同一の条件下で行った。
（４）分析の結果、XL-1/qutC LigABC株からＰＤＣが生産されたことが確認された。
実施例３ 組換えプラスミドpACaroB、pCDqaroFfbr及びpULABCを導入した形質転換体からのＰＤＣの生産
（１）組換えプラスミドpACaroB、pCDqaroFfbr及びpULABCを大腸菌XL-1株（STRATEGENE, CA, USA）に形質転換し、25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシン及びクロラムフェニコールを含むLBプレートに展開し37℃で12時間培養し、qutC遺伝子、aroB遺伝子、aroFfbr遺伝子LigABC遺伝子を保有する形質転換株を得た。本菌を「XL-1/qutC aroB aroFfbr LigABC株」と名付けた。
（２）XL-1/qutC aroB aroFfbr LigABC株を、10 mlのLB液体培地（25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシン及びクロラムフェニコールを含む）に接種し、37℃で16時間培養し、前培養菌体懸濁液とした。200 mLのLB液体培地（グルコース含量2 g/L）を坂口フラスコを用いて調製し、そこに培養したXL-1/qutC aroB aroFfbr LigABC株の前培養菌体懸濁液全量を混合し、37℃、125 rpm/分の通気攪拌下、60時間培養した。その結果を図１０（ｂ）に示す。
（３）培養終了後、坂口フラスコの培地から遠心分離（6000 rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えpH 3.5にし、低温で保存した。培養液の分析はHPLCを用いて行った。
（４）分析の結果、XL-1/qutC aroB aroFfbr LigABC株において、2 g/Lのグルコースから、ＰＤＣが約36 mg/L濃度で生産されたことが確認された。すなわち、aroB遺伝子及び aroFfbr遺伝子が更に導入された組換え大腸菌は、非特許文献１に記載の組換え大腸菌よりもＰＤＣを効率良く生産できることが明らかとなった。
（１）組換えプラスミドpACaroB、pCDqaroFfbr及びpULABCを大腸菌XL-1株（STRATEGENE, CA, USA）に形質転換し、25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシン及びクロラムフェニコールを含むLBプレートに展開し37℃で12時間培養し、qutC遺伝子、aroB遺伝子、aroFfbr遺伝子LigABC遺伝子を保有する形質転換株を得た。本菌を「XL-1/qutC aroB aroFfbr LigABC株」と名付けた。
（２）XL-1/qutC aroB aroFfbr LigABC株を、10 mlのLB液体培地（25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシン及びクロラムフェニコールを含む）に接種し、37℃で16時間培養し、前培養菌体懸濁液とした。200 mLのLB液体培地（グルコース含量2 g/L）を坂口フラスコを用いて調製し、そこに培養したXL-1/qutC aroB aroFfbr LigABC株の前培養菌体懸濁液全量を混合し、37℃、125 rpm/分の通気攪拌下、60時間培養した。その結果を図１０（ｂ）に示す。
（３）培養終了後、坂口フラスコの培地から遠心分離（6000 rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えpH 3.5にし、低温で保存した。培養液の分析はHPLCを用いて行った。
（４）分析の結果、XL-1/qutC aroB aroFfbr LigABC株において、2 g/Lのグルコースから、ＰＤＣが約36 mg/L濃度で生産されたことが確認された。すなわち、aroB遺伝子及び aroFfbr遺伝子が更に導入された組換え大腸菌は、非特許文献１に記載の組換え大腸菌よりもＰＤＣを効率良く生産できることが明らかとなった。
実施例４ 組換えプラスミドpCDFDuet-ubiC-pobA及びpULABCを導入した形質転換体からのＰＤＣの生産
（１）組換えプラスミドpCDFDuet-ubiC-pobA、pULABCを大腸菌XL-1株（STRATEGENE, CA, USA）に形質転換し、25 mg/Lのアンピシリン及びストレプトマイシンを含むLBプレートに展開し37℃で12時間培養し、ubiC遺伝子、pobA遺伝子及びLigABC遺伝子を保持する形質転換株を得た。本菌を「XL-1/ubiC pobA LigABC株」と名付けた。
（２）XL-1/ubiC pobA LigABC株を、10 mlのLB液体培地（25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシンを含む）に接種し、37℃で16時間培養し、前培養菌体懸濁液とした。200 mLのDM液体培地（グルコース含量2 g/L）を坂口フラスコを用いて調製し、そこに培養したXL-1/ubiC pobA LigABC株の前培養菌体懸濁液全量を混合し、37℃、125 rpm/分の通気攪拌下、60時間培養した。
（３）培養終了後、坂口フラスコの培地から遠心分離（6000 rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えpH 3.5に調整し、低温で保存した。培養液の分析は、TCL及びHPLCを用いて行った。
（４）分析の結果、XL-1/ubiC pobA LigABC株において、2 g/Lのグルコースから、ＰＤＣが約33.7 mg/Lの濃度で生産されたことが確認された。
（１）組換えプラスミドpCDFDuet-ubiC-pobA、pULABCを大腸菌XL-1株（STRATEGENE, CA, USA）に形質転換し、25 mg/Lのアンピシリン及びストレプトマイシンを含むLBプレートに展開し37℃で12時間培養し、ubiC遺伝子、pobA遺伝子及びLigABC遺伝子を保持する形質転換株を得た。本菌を「XL-1/ubiC pobA LigABC株」と名付けた。
（２）XL-1/ubiC pobA LigABC株を、10 mlのLB液体培地（25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシンを含む）に接種し、37℃で16時間培養し、前培養菌体懸濁液とした。200 mLのDM液体培地（グルコース含量2 g/L）を坂口フラスコを用いて調製し、そこに培養したXL-1/ubiC pobA LigABC株の前培養菌体懸濁液全量を混合し、37℃、125 rpm/分の通気攪拌下、60時間培養した。
（３）培養終了後、坂口フラスコの培地から遠心分離（6000 rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えpH 3.5に調整し、低温で保存した。培養液の分析は、TCL及びHPLCを用いて行った。
（４）分析の結果、XL-1/ubiC pobA LigABC株において、2 g/Lのグルコースから、ＰＤＣが約33.7 mg/Lの濃度で生産されたことが確認された。
実施例５ 組換えプラスミドpACaroBaroFfbr、pCDFDuet-ubiC-pobA、及びpULABCを導入した形質転換体からのＰＤＣの生産
（１）組換えプラスミドpACaroBaroFfbr、pCDFDuet-ubiC-pob及びpULABCを大腸菌XL1-Blue株（STRATEGENE, CA, USA）に導入し、25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシン及びクロラムフェニコールを含むLBプレートに展開し、37℃で12時間培養し、ubiC遺伝子、pobA遺伝子、aroB遺伝子、aroFfbr遺伝子及びLigABC遺伝子を保有する形質転換株を得た。本菌を「XL-1/ubiC pobA aroB aroFfbr LigABC株」と名付けた。
（２）XL-1/ubiC pobA aroB aroFfbr LigABC株を、10 mlのLB液体培地（25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシン及びクロラムフェニコールを含む）に接種し、37℃で16時間培養し、前培養菌体懸濁液とした。200 mLのLB液体培地（グルコース含量2 g/L）を坂口フラスコを用いて調製し、そこに培養したXL-1/ubiC pobA aroB aroFfbr LigABC株の前培養菌体懸濁液全量を混合し、37℃、125 rpm/分の通気攪拌下、60時間培養した。
（３）培養終了後、坂口フラスコの培地から遠心分離（6000 rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えpH 3.5に調整し、低温で保存した。培養液の分析はHPLCを用いて行った。
（４）分析の結果、XL-1/ubiC pobA aroB aroFfbr LigABC株において、ＰＤＣが生産されたことが確認された。
（１）組換えプラスミドpACaroBaroFfbr、pCDFDuet-ubiC-pob及びpULABCを大腸菌XL1-Blue株（STRATEGENE, CA, USA）に導入し、25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシン及びクロラムフェニコールを含むLBプレートに展開し、37℃で12時間培養し、ubiC遺伝子、pobA遺伝子、aroB遺伝子、aroFfbr遺伝子及びLigABC遺伝子を保有する形質転換株を得た。本菌を「XL-1/ubiC pobA aroB aroFfbr LigABC株」と名付けた。
（２）XL-1/ubiC pobA aroB aroFfbr LigABC株を、10 mlのLB液体培地（25 mg/Lのアンピシリン、ストレプトマイシン及びクロラムフェニコールを含む）に接種し、37℃で16時間培養し、前培養菌体懸濁液とした。200 mLのLB液体培地（グルコース含量2 g/L）を坂口フラスコを用いて調製し、そこに培養したXL-1/ubiC pobA aroB aroFfbr LigABC株の前培養菌体懸濁液全量を混合し、37℃、125 rpm/分の通気攪拌下、60時間培養した。
（３）培養終了後、坂口フラスコの培地から遠心分離（6000 rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えpH 3.5に調整し、低温で保存した。培養液の分析はHPLCを用いて行った。
（４）分析の結果、XL-1/ubiC pobA aroB aroFfbr LigABC株において、ＰＤＣが生産されたことが確認された。
Claims (8)
- 配列番号１で示されるデヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、配列番号３及び５で示されるプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び/又は配列番号７で示される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド。
- 配列番号９で示されるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子、配列番号11で示される4-ヒドロキシ安息香酸 3-水酸化酵素遺伝子、配列番号３及び５で示されるプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子、及び/又は配列番号７で示される4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド。
- 配列番号13で示されるデヒドロキナ酸合成酵素遺伝子、及び/又は配列番号15で示される、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害機能を解除したデオキシ-D-アラビノ-へプツロソン酸-7-リン酸合成酵素アイソザイム遺伝子を更に含む、請求項１又は２記載の組換えプラスミド。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の組換えプラスミドが導入されてなる形質転換体。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載の組換えプラスミドが大腸菌に導入されてなる形質転換体。
- 前記大腸菌が、XL1-Blue株である、請求項５記載の形質転換体。
- 請求項４〜６のいずれか１項記載の形質転換体を糖類の存在下に培養し、培養物から2H-ピラン-2-オン-4,6-ジカルボン酸を採取することを特徴とする、2H-ピラン-2-オン-4,6-ジカルボン酸の製造法。
- 前記糖類が、グルコースである、請求項７記載の製造法。
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