JP2021500027A - 嫌気性無細胞システムおよび環境、ならびにこれらを作製および使用するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮出願第62/574,570号(2017年10月19日出願)および同第62/576,157号(2017年10月24日出願)に基づく優先権および利益を主張し、これら仮出願はともに、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
本発明は、米国陸軍研究事務所によって与えられたW911NF−17P−0059の下での政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
分野
本開示は、無細胞組成物およびその使用、特に、嫌気性環境におけるタンパク質および分子の生成におけるものに関する。
産業上のおよび治療上の用途のある多くのタンパク質は、酸素が乏しい環境中の生物から単離される。生物は、海底熱水噴出孔(deep sea vents)、油井およびガス井、高塩分環境、および嫌気性環境において生活しているものを含み得る。努力および進歩にも拘わらず、単離を行う現行のアプローチはしばしば面倒で、コストがかかりかつ困難である。
従って、嫌気性条件を達成し得る改善された無細胞システム(例えば、本明細書で開示される無細胞システム)が必要である。
改善されたインビトロの嫌気性無細胞システムおよび環境ならびにその使用が、本明細書で開示される。
嫌気性の無細胞転写および翻訳システム(嫌気性のインビトロ転写および翻訳システムともいわれる)の組成物および製剤、ならびに使用法が本明細書で開示される。一実施形態において、本明細書で記載される嫌気性の無細胞転写および翻訳システムは、以下を含む:1またはこれより多くの生物に由来する抽出物;テンプレート核酸;および1またはこれより多くのO2、O−、またはH2O2スカベンジャー(本明細書でスカベンジャーともいわれる)。それらはまた、ホスフェート電位または酸化還元電位を提供するためのエネルギーリサイクルシステムを含み得る。一実施形態において、本明細書で記載される嫌気性の無細胞転写および翻訳システムは、以下を含む:転写および/または翻訳に必要な、補因子、酵素、および他の試薬の第1のセット;エネルギーリサイクルに必要な、補因子、酵素、および他の試薬の第2のセット;目的の遺伝子または遺伝子の一部を含むテンプレート核酸;ならびに1またはこれより多くのO2、O−、またはH2O2スカベンジャー。
便宜上、本明細書、実施例、および添付の請求項において使用されるある種の用語は、ここにまとめられる。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
そのインビトロ転写および翻訳システムは、細胞の状況外で転写および翻訳を行い得るシステムである。いくつかの実施形態において、このシステムは、「無細胞システム(cell−free system)」、「無細胞転写および翻訳(cell−free transcription and translation)」、「TX−TL」、「TXTL」、「TX/TL」、「抽出物システム(extract system)」、「インビトロシステム(in vitro system)、「ITT」、または「人工細胞(artificial cell)」ともいわれる。例示的なインビトロ転写および翻訳システムとしては、宿主から作製された精製または部分的に精製されたタンパク質システム、宿主から作製されていない精製または部分的に精製されたタンパク質システム、および「抽出物(extract)」として形成される宿主系統から作製されたタンパク質システムが挙げられる。一実施形態において、抽出物としては、細胞全体の抽出物、核抽出物、細胞質抽出物、これらの組み合わせなどが挙げられる。細胞全体の抽出物は、本明細書で溶解物ともいわれる。本明細書で記載される溶解物、および溶解物システムは、抽出物の非限定的な例であることが意図される;溶解物が本明細書で記載される場合、他の抽出物、または抽出物およびタンパク質の組み合わせが使用され得ることは、企図される。
無細胞システムにおける嫌気性環境を維持するために、O2、O−、もしくはH2O2スカベンジャーは、生体変換によって、または結合および/もしくは隔離からのいずれかで、その無細胞システムから酸素、酸素ラジカル、および/または過酸化水素を除去し得る。これは、宿主生物が嫌気性でなくても、または物理的条件が無酸素性でなくても、その無細胞システムが嫌気的にふるまうことを可能にする。一実施形態において、嫌気性のインビトロ転写および翻訳のための組成物は、1またはこれより多くのO2、O−、またはH2O2スカベンジャーを含み得る。一局面において、その1またはこれより多くのO2、O−、またはH2O2スカベンジャーは、O2、O−、もしくはH2O2の1またはこれより多くの結合剤、O2、O−、もしくはH2O2を別の分子に生化学的に変換する1もしくはこれより多くの生化学的変換因子、またはこれらの組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態において、その1またはこれより多くのスカベンジャーは、O2、O−、もしくはH2O2を結合および/または隔離する酵素、タンパク質、またはタンパク質様模倣物を含み得る。一実施形態において、O2、O−、もしくはH2O2の結合および/または隔離は、可逆的であっても不可逆的であってもよい。O2、O−、またはH2O2スカベンジャーである企図される酵素およびタンパク質の例としては、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン、ミオグロビン、ポルフィリン、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ルビスコ、およびこれらの模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素およびタンパク質は、天然に存在してもよいし(その環境から単離される)、操作された改変体であってもよいし、その天然に存在する改変体を模倣するように合成して生成されてもよい。いくつかの実施形態において、その酵素、タンパク質、またはタンパク質様模倣物は、酸素を結合する公知の実体のホモログまたは改変体である。
いくつかの実施形態において、その1またはこれより多くのスカベンジャーは、O2、O−、またはH2O2を別の分子へと生化学的に変換し得る。一実施形態において、その変換は、不可逆的であり得る。例示的なスカベンジャーであるシトクロムオキシダーゼは、電子を分子酸素へと転移させて、2分子の水を生成する。別の例示的なスカベンジャーであるグルコースオキシダーゼは、グルコースを酸化して、D−グルコノ−1,5−ラクトンおよび過酸化水素を形成する。別の例示的なスカベンジャーであるモノオキシゲナーゼは、2分子の酸素を還元して、1個のヒドロキシル基および1分子の水を形成する。別の例示的なスカベンジャーであるカタラーゼは、2分子の過酸化水素の分解を触媒して、2分子の水および1分子の酸素を形成する。
いくつかの例示的な非限定的実施形態において、そのスカベンジャーシステムの構成要素は、酸素、酸素ラジカル、および/または過酸化水素に結合またはキレート化し、これらを、溶液中の他の構成要素と相互作用することから効果的に隔離する。一実施形態において、その結合は、可逆的であり得る。天然に酸素に結合する分子の例は、ヘモグロビンであり、これは、脊椎動物および無脊椎動物において酸素を運ぶために使用される。ヘモグロビン内には、ポルフィリン複素環式環の中に保持された鉄を含むヘム基が存在し、このヘム基は、配位結合(coordinate covalent bond)において酸素に可逆的に結合し得る。一実施形態において、無細胞システムでは、ヘモグロビンは、その無細胞システムに過剰に添加されて、その無細胞システムにおける酸素濃度を低減し得る。いくつかの実施形態において、例示的なスカベンジャーは、酸素キャリアタンパク質であり得、ヘモグロビン、ヘムエリスリン、またはヘモシアニンとして公知である。他の実施形態において、そのスカベンジャーは、合成であってもよいし、操作されていてもよい。いくつかの実施形態において、そのスカベンジャーは、ヘム基を含み得る。
さらなる実施形態は、無細胞の酸素除去された酵素システムに関する。その無細胞の酸素除去された酵素システムは、本明細書で記載される1またはこれより多くのスカベンジャーを含む。
インビボでは、嫌気性生物におけるTXTLは、その細胞が低酸化還元電位において、すなわち、低酸化条件において維持する細胞質において作動する。嫌気性生物は、非呼吸代謝の作動を維持するために進化したO2感受性酵素活性(例えば、ヒドロゲナーゼ)、ラジカル支援酵素触媒、窒素固定(diazotrophy)などを有する。
・ 嫌気性細菌宿主(例えば、Clostridium sp.)から調製した処理された溶解物(厳密に嫌気性条件下で培養したClostridium、N2雰囲気下の密閉フード中で標準的技術を使用して調製された溶解物、N2雰囲気下の384ウェルマイクロタイタープレートへと25mL アリコートでアドレス指定された溶解物)または好気性条件もしくは嫌気性条件下で標準的細菌宿主から調製した溶解物。
・ 転写および翻訳のための標準的添加物。
・ 発現のための還元、低O2環境を維持するための添加物: 比>100:1において低酸化還元電位溶解物を維持するNAD(P)H/NAD(P)+バランスシステム(poising system)、酸化還元リサイクルのためのNAD(P)H再生トランスヒドロゲナーゼ、O2スカベンジャー: ヘモグロビン、オキシダーゼまたはオキシゲナーゼ酵素、反応性酸素スカベンジャー: カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、宿主生物代謝経路に特異的なATP再生の基質。
嫌気性条件をシミュレートするために、酵素成熟および脱酸素に寄与する種々の添加剤を、その反応に添加した。1つのサンプルシステムは、図3に示される、グルコース、グルコースオキシダーゼ、およびカタラーゼから構成される脱酸素システムであり、ここで2モルの酸素が消費されるごとに1モルの酸素が生成され、カタラーゼは、毒性の中間体である過酸化水素をリサイクルし得る。D−グルコノ−1,5−ラクトンの生成は、無細胞システムに対して比較的不活性である。各反応は不可逆的であるので、その反応は、酸素除去に向かってシフトする。その添加およびこのサンプルシステムにおけるその後のグルコースフラックスは、得られる反応においてpH変化を引き起こし得、これは、その無細胞システムにおいて緩衝化能力を提供するために重要になる。
無細胞システムは、脱酸素溶液を使用して酸素除去されたが、そのシステムはまた、転写および翻訳の活性を通じて機能的タンパク質を生成する能力がなければならない。これは、その無細胞システムの特性を調整することを要求し得る。例えば、種々のエネルギー再生溶液が、その嫌気性反応条件を補完する無細胞システムにおいて使用され得る。グルタメートシステムを利用するエネルギー再生は、酸化的リン酸化を使用し、これは、酸素依存性である。しかし、クレアチニンリン酸/クレアチニンキナーゼ(CP/CK)を利用するエネルギー再生は、基質レベルのリン酸化を使用し、これは、酸素非依存性である。
本開示は、とりわけ、無細胞システムおよびその使用を提供する。本開示の具体的実施形態が考察されてきたが、上記の明細書は、例証であって限定ではない。本開示の多くのバリエーションは、本明細書を検討すれば、当業者に明らかになる。本開示の全範囲は、請求項を参照することによって、それらの均等物の全範囲とともに、および本明細書によって、このようなバリエーションとともに決定されるべきである。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および配列データベースエントリーは、各個々の刊行物または特許が、参考として援用されることを具体的かつ個々に示されるかのように、それらの全体において参考として援用される。
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Claims (20)
- 無細胞組成物であって、該組成物は、
1もしくはこれより多くの生物に由来する抽出物;
1もしくはこれより多くの目的のタンパク質であって、ここで該1もしくはこれより多くのタンパク質は、該抽出物に対して外因性の1もしくはこれより多くの核酸から、および/または該1もしくはこれより多くの生物によって発現され、好ましくは該1もしくはこれより多くのタンパク質は、基質と反応して、生成物を生成する、1もしくはこれより多くの目的のタンパク質;ならびに
1もしくはこれより多くのO2、O−、またはH2O2スカベンジャー、
を含む組成物。 - 前記組成物は、前記1もしくはこれより多くの核酸をさらに含み、該1もしくはこれより多くの核酸からの前記1もしくはこれより多くのタンパク質のインビトロ転写および翻訳のためのものであり、好ましくは該1もしくはこれより多くの核酸は、極限環境生物または嫌気性生物に由来する遺伝子またはそのフラグメントを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記1またはこれより多くの生物は、前記1またはこれより多くのタンパク質を発現するように遺伝子操作される、請求項1に記載の組成物。
- インビトロ転写および翻訳のための組成物であって、該組成物は、
転写および/または翻訳に必要な、補因子、酵素、および他の試薬の第1のセット;
エネルギーリサイクルに必要な、補因子、酵素、および他の試薬の第2のセット;
1またはこれより多くの目的のタンパク質をコードする1またはこれより多くの核酸;ならびに
1またはこれより多くのO2、O−、またはH2O2スカベンジャー、
を含む組成物。 - タンパク質、酵素、および他の試薬の前記第1のセットは、1もしくはこれより多くの生物に由来する抽出物によって、および/または完全にもしくは部分的に精製された供給源から、全体的にまたは部分的に提供される、請求項4に記載の組成物。
- タンパク質、酵素、および他の試薬の前記第2のセットは、1もしくはこれより多くの生物に由来する抽出物によって、および/または完全にもしくは部分的に精製された供給源から、全体的にまたは部分的に提供される、請求項4に記載の組成物。
- 前記組成物は、酸素除去されているかまたは嫌気性である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1またはこれより多くの生物は、細菌、古細菌、植物、および動物から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1またはこれより多くの生物は、極限環境生物およびClostridiumから選択される、請求項8に記載の組成物。
- 前記1またはこれより多くのO2、O−、またはH2O2スカベンジャーは、O2、O−、もしくはH2O2に結合する、および/またはO2、O−、もしくはH2O2を別の分子に生化学的に変換する(例えば、還元するもしくは酸化する)、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1またはこれより多くのO2、O−、またはH2O2スカベンジャーは、ヘム基を含み、好ましくは、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン、ミオグロビン、ポルフィリン、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ルビスコ、およびこれらのホモログまたは改変体からなる群より選択される、請求項10に記載の組成物。
- 前記1またはこれより多くのO2、O−、またはH2O2スカベンジャーは、前記ヘム基によって結合される遷移金属をさらに含む、請求項11に記載の組成物。
- 前記1またはこれより多くのO2、O−、またはH2O2スカベンジャーは、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、プロトカテク酸 3,4−ジオキシゲナーゼおよびカタラーゼからなる群より選択される、請求項11に記載の組成物。
- 外因性エネルギーリサイクルシステムをさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記外因性エネルギーリサイクルシステムは、酸化還元電位を提供するための構成要素、ホスフェート電位を提供するための構成要素、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1またはこれより多くの構成要素を含む、請求項14に記載の組成物。
- 1またはこれより多くの添加剤、好ましくは、転写および/または翻訳に必要な、1またはこれより多くの補因子、酵素、および他の試薬から選択される1またはこれより多くの添加剤をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記抽出物は、細胞全体の抽出物、核抽出物、細胞質抽出物、およびこれらの組み合わせのうちの1またはこれより多くを含み、好ましくは、該抽出物は、細胞全体の溶解物を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- タンパク質合成のための方法であって、該方法は、
(a)請求項1〜17のいずれか1項に記載の組成物を提供する工程;および
(b)1もしくはこれより多くのタンパク質を該組成物から単離する工程、
を包含する方法。 - 前記1もしくはこれより多くのタンパク質を、前記組成物中で、前記1もしくはこれより多くの核酸からインビトロで発現させる工程をさらに包含する、請求項18に記載の方法。
- 生成物のインビトロ調製のための方法であって、該方法は、
(a)請求項1〜17のいずれか1項に記載の組成物を提供する工程;
(b)生成物を生成するために、1もしくはこれより多くのタンパク質を基質と反応させる工程;および
(c)必要に応じて、該生成物を該組成物から単離する工程、
を包含する方法。
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