KR100269709B1 - 2-아세틸아미노-4-O-(2-아미노-2-데옥시-β-D-글루코피라노실)-2-데옥시-D- 글루코스 및 그 염의 제조방법 - Google Patents
2-아세틸아미노-4-O-(2-아미노-2-데옥시-β-D-글루코피라노실)-2-데옥시-D- 글루코스 및 그 염의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
키틴의 분해물 또는 시약으로서 용이하게 이용할 수 있는 디 - N - 아세틸 - D - 키토비오스로부터 효율 좋게 2 - 아세틸아미노 - 4 -- (2 - 아미노 - 2 - 데옥시 - β - D - 글루코피리노실) - 2 - 데옥시 - D - 글루코스를 제조할 수 있는 방법을 제공한다.
디 -- 아세틸키토비오스에 미생물유래의 탈아세틸화 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는 하기의 식(1)으로 표시되는 2 - 아세틸아미노 - 4 -- (2 - 아미노 - 2 - 데옥시 - β - D - 글루코피라노실) - 2 - 데옥시 - D - 글루고스 또는 그 산 첨가염의 제조방법.
본 물질과 그 염은 효소의 활성측정용 기질로서 유용하고, 식품의 소재, 당사슬 공학분야에 있어서의 합성원료로서 활용할 수가 있다.
Description
본 발명은, 2 - 아세틸아미노 - 4 -- (2 - 아미노 - 2 - 데옥시 - β - D - 글루코피라노실) - 2 - 데옥시 - D - 글루코스 및 그 염의 제조방빕에 관한 것이다.
본 화합물은 천연물질인 키틴의 부분 기수분해물로 얻어지기 때문에, 키틴관련화합물 분해효소의 활성을 측정하는 기질로서 사용되는 것 이외에 식품소재, 당사슬 공학분야에서의 합성원료로서 활용할 수 있다.
키토산을 기수분해한 키토산 올리고당류가, 건강 식품시장을 중심으로 식품소재로서 널리 사용되고 있는 바, 일반적으로 원료로 되는 키토산은 일부의 당잔기(Sugar residues)에- 아세틸기기 잔존하고 있으며, 올리고 당류에도 D - 글루코사민잔기이외에- 아세틸 - D - 글루코사민잔기가 혼합되어 있다.
이와 같은 부분 탈아세틸화 키틴 올리고당은 엘리시터(elicitor)활성이나 항부식활성을 구비하고 있다는 것이 보고되고 있으며, 동일한 중합도(degree of Polmerization)의 키틴 올리고당이나 키토산 올리고당과 비교하여 우수한 활성을 나타내는 예를 볼 수 있다.
그러나, 부분 탈아세틸화 키틴 올리고당이라고 불리우는 것은 일반적으로 복수의 화합물의 혼합체로서 구성되어 있기 때문에, 구조가 아직 정의(Clarifying)되어 있지는 않다.
그렇기 때문에, 키틴올리고당, 부분 탈아세틸화 키틴 올리고당, 또는 키토산올리고당이 갖는 여러 가지 생리활성의 발현기구를 해명하는데 있어서, 구조가 정의된 부분 탈아세틸화 키틴 올리고당을 제공한다는 것은 극히 그 의의가 깊다 할 것이다.
또, 구조가 정의된 부분 탈아세틸화 커틴 올리고당의 최소단위인 2 - 아세틸아미노 - 4 -- (2 - 아미노 - 2 - 데옥시 - β - D - 글루코피라노실) - 2 - 데옥시 - D - 글루코스는, 부분 탈아세틸화 고분자키틴을 키티나제에 의해서 분해하여 제조할 수 있다는 보고가 있는는, (Mitsutomi, M. et al, Agric Biol. Chem, 54(4), 871-877, (1990) 참조)이 보고된 방법은 동시에, 구조가 극히 유사한 헤테로올리고당이 부산물(side product)로 되기 때문에, 그 분리와 정제가 극히 곤란하다. 이와 같은 이유 때문에, 본 화합물을 분리하여 당질소재로서 여러 분야에 활용하려는 시도는 현재까지 없었다.
제1도는 본 발명의 화합물의 질량 스펙트럼.
제2도는 본 발명의 화합물의1H-NMR 스펙트럼.
제3도는 디 -- 아세틸키토비오스를 기질(基質)로하여, 본 발명의 화합물을 조제하는 공정을 고속액체 크로마토그래피로 분석한 크로마토그램을 나타내며, (1)은 반응개시직후의 (0분), (2)는 반응개시 15분 후의, (3)은 반응개시 30분 후의, (4)는 반응개시 60분 후의 예정된 시간 간격을 두고 각각의 시료를 분석한 것이다.
즉, 본 발명은, 디 -- 아세틸기토비오스에 미생물유래의 탈아세틸화 효소를 작용시키는 것은 특징으로 하는 하기의 식(1)으로 나타내는 2 - 아세틸아미노 - 4 -- (2 - 아미노 - 2 - 데옥시 - β - D - 글루코피리노실) - 2 - 데옥시 - D - 글루코스 또는 그 산 첨가염의 제조방법이다.
또, 2 - 아세털아미노 - 4 -- (2 - 아미노 - 2 - 데옥시 - β - D - 글루코피라노실) - 2 - 데옥시 - D - 글루코스의 염으로서는 산 첨가염 (식중, HX로 표시됨)이 있으며, 예를 들면 염산염, 아세트산염 등이 있다. 이것을 하기의 식(2)으로 나타낸다.
[발명의 실시형태]
이하에 본 발명의 2 - 아세틸아미노 - 4 -- (2 - 아미노 - 2 - 데옥시 - β - D - 글루코피라노실) - 2 - 데옥시 - D - 글루코스 및 그 염의 제조방법에 관해서 설명한다.
또, 미생물유래의 탈아세틸화 효소로서는, 디 -- 아세틸키토비오스의 비환원말단에 위치하는- 아세틸 - D - 글루코사민잔기에 존재하는- 아세틸기를 우선적으로 달리하는 활성을 갖는 것이 필요한 바, 예를 들면, 불완전균 유래의 키틴 털아세틸화 효소 구체적으로는 Colletotrichum·lindemuthianum ATCC 56676주 유래의 키틴 탈아세칠화 효소(Biosci. Biotech Biochem., 60(10), 1598-1603. 1996)가 있다.
이 효소는, 예를 들면 다음과 같은 방법으로 얻을 수 있다. 상기의 불완전균의 포자를 액체배지에서 배양한 후, 배양물에서 활성부분(active fraction)을 회수한다. 이것을 크루드 효소액으로 사용하는 것외에, 통상적 방법으로 정제하여 정제효소로 할 수 있다. (일본국 특개평 8-289785호 공보참조).
이 효소를 원료화합물인 디 -- 아세틸키토비오스에 작용시켜서, 디 -- 아세틸기토비오스이 비환원말단의- 아세틸글루코사민잔기의 아세틸기만을 달리하여, 글루코사민잔기로 변환시켜 본 발명의 목적물인 2 - 아세틸아미노 - 4 -- (2 - 아미노 - 2 - 데옥시 - β - D - 글루코피라노실) - 2 - 데옥시 - D - 글루코스를 제조할 수 있다.
구체적으로, 디 -- 아세틸키토비오스를 테트리붕산 니트륨·염산완충액(pH8.5)에 용해시켜, 그 기질의 농도를 0.1∼0.5%, 바람직하게는 0.2%정도의 용액으로 만든다. 이 용액에 미생물유래의 키틴탈아세틸화 효소를 0.01 ∼ 0.3 단위(unit), 바림직히게는 0.05 단위정도를 가한 후, 30 ∼ 60℃, 바람직하게는 45℃에서 1 ∼ 6시간, 바람직하게는 2 ∼ 4시간 반응시킨다.
그 다음, 반응생성물을 양이온교환수지에 흡착시킴으로써 미반응의 원료물질을 제거하고, 0.1 N염산을 흘러서 목적물을 용출시킨다. 이때 사용하는 양이온 교환수지로서는 앰버리이트 CG-120(Amberlite CG-120) 등이 바람직하다.
희망에 따라서, 여기에 염산, 초산(아세트산) 등 적당한 산을 가하여 염이 형성된 화합물을 조제할 수 있다.
상기의 방법으로 얻어진 본 물질의 주요한 이용방법으로서는, 효소활성측정용기질, 식품소재, 당사슬 공학분야에서의 합성원료 등이 고려될 수 있다.
이와 같이하여, 얻어진 물질의 구조분석을 질량분식, 핵자기공명분석으로 하여, 도 1은 이 화합물의 질량스펙트럼이며, 도 2는1H-NMR스펙트럼이다.
[실시예]
다음에 본 발명을 실시예에 의해서 더욱 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이들 실시예로 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
(1) 탈아세틸화 효소의 정제
불완전균 Colletotrichum lindemuthianum ATCC 56676주를 0.28% 글루코스, 0.123% 항산마그네슘(7수화물), 0.2% 프로테오스펩톤, 0.272% 인산이수소칼륨 및 2.0% 한천(agar)을 함유하는 배지에 접종하여 25℃로 어두운 곳에서 7일간 정적 배양하여 흑색의 균체를 유도하였다.
그 다음에, 상기의 균체를 1%의 맥아추출물, 0.4% 효모추출물, 0.4% 포도당을 함유하는 200ml의 베지(pH5.8)가 들어있는 500ml들이 삼각플라스크에 접종하여 22℃로 어두운 곳에서 1분간 100회전의 조건으로 진동배양(Shaking Culture)을 하였다. 8일째부터 효소활성을 나타내는 것이 배양액 중에 분비되고, 18일째까지 그 활성이 증가하였다. 18일을 경과한 시점에서 배양을 종료하고, 균체배양액을 나이론 필터로 여과한 후, 유리섬유를 통과시켜 미립자를 제거하여 배양 여과액을 회수하였다.
이 배양 여과액에 4℃ 조건으로 80%포화가 되도록 황산암모늄을 가하여 하룻밤 방치한 후, 원심분리에 의해서 침전물을 회수하였다. 이 침전물을 소량의 50mM 테트라붕산 나트륨·염산완충액(pH9.5)에 용해시켜 이 완충액 중에서 투석을 하였다. 투석후의 크루드 효소액을 소수성 크로마토그래피 및 음이온 크로미트그래피를 사용하여 분획, 정제하고, SDS겔 전기영동으로 단일의 밴드를 나타내는 키틴 탈아세틸화 효소를 얻었다(일본국 특개평8-289785호 공보참조).
디 -- 아세틸키토비오스 (일본국, 생회학공업(주)제) 0.4mg을 0.2ml의 20mM 테트라붕산나트름·염산완충액(pH8.5)에 용해하여, 여기에 상기(1)에서 얻은 불완전균 Colletotrichum lindemuthianum 유래의 정제키틴 탈아세틸화 효소를 0.05단위 가하여 45℃에서 3시간 동안 반응시켰다.
이것을, Callbopak PA1컬럼(DIONEX사제)을 사용한 이온 크로마토그래피에 의해서 분석한 결과, 도 3, 도 4에 나타내는 바와 같이 반응 생성물은 한 종류이며, 이 피이크는 기질인 디 -- 아세틸키토비오스의 감소에 수반하여 반응초기부터 증가하고, 다른 회합물 유래의 피이크는 거의 존재하지 않았다. 그래서, 반응개시 3시간 후에는 원료 물질인 디 -- 아세틸키토비오스 유래의 피이크는 검출기에 의해서 정량되지 않게 되었다.
이와 같이, 기질이 신속하게 감소하여 단일의 피이크를 주는 화합물로 전환되어 있는 것을 알게된다.
이어서, 이것을 양이온교환수지 앰버라이트 CG-120(오르가노(주)사 제품)을 사용하여 정제하고 전기투석법으로 탈염을 하였다. 이것을 질량분석계(JEOL사제)에 의해서 분석한 결과 [M + H+] = 383의 시그널이 검출되어 본 물질의 분자량은 382인것으로 추정되었다.
그리고, 이것을1N-NMR에 의해서 분석한 결과, 본 물질의 구조는 2 - 아세틸아미노 - 4 -- (2 - 아미노 - 2 - 데옥시 - β - D - 글루코피라노실) - 2 - 데옥시 - D - 글루코스인 것으로 결정되었다.
[실시예 2]
디 -- 아세틸키토비오스 20mg을 10ml의 20mM 테트라붕산 나트륨·염산완충액(pH8.5)에 용해시켜 여기에 1.5ml의 팽창수지, Q - 세라로스 FF (피미시어사제품)를 현탁시킨 후, 이 현탁액에, 상기 실시예 1의 (1)에서 징제한 키틴 탈아세틸화 효소를 1.5단위 가하여 45℃에서 16시간 반응시켰다.
반응 후, 상기 Q - 세파로스수지를 사연적으로 침강시킨 후, 투명한 상청액을 회수하여 그 일부를 Carbopak PA1 컬럼(DIONEX 사제)을 사용한 이온 크로마토그래피로 분석하였다.
그 결과, 2 - 아세틸아미노 - 4 -- (2 - 아미노 - 2 - 데옥시 - β - D - 글루코피라노실) - 2 - 데옥시 - D - 글루코스의 피이크만이 검출되고, 원료물질인 디 -- 아세틸키토비오스 유래의 피이크는 존재하지 않았다.
[실시예 3]
실시예 1에서 조제된 2 - 아세틸아미노 - 4 -- (2 - 아미노 - 2 - 데옥시 β - D - 글루코피라노실) - 2 - 데옥시 - D - 글루코스를 효소활성측정용기질로서 사용하여, 엑소형 키틴분해 효소활성을 구비한 β -- 아세틸헥소사미니다제(penicillium oxalicum 유래, 상기 생회학공업(주)제) 0.007단위를 50mM 구연산나트륨완충액 (pH4.5)중에서 37℃로 한 시간 작용시켰으나 기질의 분해는 일어나지 않았다.
Claims (3)
- 제1항에 있어서, 상기 탈아세틸화효소는 디-N-아세틸-D-키토비오스의 비환원말단에 위치하는 N-아세틸-D-글루코사민잔기에 존재하는 N-아세틸기를 우선적으로 탈리(脫離)하는 활성을 가진 탈아세틸화효소인 것을 특징으로하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 탈아세틸화효소는 Colletotrichum lindemuthianum ATC 56676 유래의 키틴 탈아세틸화효소인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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