CN115927115A - 光合固氮红细菌新物种及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了光合固氮红细菌新物种及其应用。本发明提供了光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.26164。该菌株能够产生5‑氨基乙酰丙酸(ALA)，并且和藻细胞共培养时，能够抑制藻生长。5‑ALA能够作为天然的除草剂杀虫剂和植物生长促进剂。因此本发明菌株S2205是制备微生物菌剂以用于改良作物生态环境、促进作物健康生长的优秀菌种资源。

Description

光合固氮红细菌新物种及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及光合固氮红细菌新物种及其应用。

背景技术

细菌域(Bacteria)-假单胞菌门(Pseudomonadota)-α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)-红细菌目(Rhodobacterales)-红细菌科(Rhodobacteraceae)的多数成员能够行光合作用，因此，常被称为光合细菌的一个重要类群。光合细菌在碳、氮、硫元素的固定和循环中担任重要角色，且自身具有能够产生参与机能代谢的生理活性物质的能力，在农牧产业、环境保护、食品医药及其他领域中光合细菌的研究、应用和市场化方面受到日益广泛关注而成为研究热点。比如，Kenji等[Kenji T,Sasaki K,Masanori W,etal.Removal of phosphorus from Oyster Farm mud sediment using a photosyn-thetic bacterium,Rhodobacter sphaeroides IL106.Journl of Bioscience andBioengineering，1999，88(4):410-415]利用球形红细菌IL106去除含高浓度磷的牡蛎养殖场泥沉积物，效果显著，4天可以将总磷从26.8mg/L降低至0.73mg/L。红细菌属是Imhoff等人(Imhoff J,Trüper H,Pfennig N.Rearrangement of the species and genera of thephototrophic“purple nonsulfur bacteria”[J].International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology,1984,34(3):340-343.)在1984年对红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)的部分物种进行重新分类时提议建立的。后于1994年、2014年、2019年又几经修订(Wang D,Liu H,Zheng S,Wang G.Paenirhodobacter enshiensisgen.nov.,sp.nov.,a non-photosynthetic bacterium isolated from soil,andemended descriptions of the genera Rhodobacter and Haematobacter.Int J SystEvol Microbiol 2014；64:551–558；Hiraishi A,Ueda Y.Intrageneric structure ofthe genus Rhodobacter:transfer of Rhodobacter sulfidophilus and relatedmarine species to the genus Rhodovulum gen.nov[J].International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology,1994,44(1):15-23；Suresh G,Lodha TD,Indu B,Sasikala C,Ramana CV.Taxogenomics resolves conflict in the genusRhodobacter:a two and half decades pending thought to reclassify the genusRhodobacter.Front Microbiol 2019；10:2480.)。目前，红细菌属共包含15个有效描述种(https://lpsn.dsmz.de/genus/Rhodobacter)，这些物种的模式菌株来源广泛，包括红树林生境的河口地带(Venkata Ramana V,Anil Kumar P,Srinivas TN,et al.Rhodobacteraestuarii sp.nov.,a phototrophic alphaproteobacterium isolated from anestuarine environment[J].Int J Syst Evol Microbiol,2009,59(Pt 5):1133-6.)、碱性褐塘(Gandham S,Lodha T,Chintalapati S,et al.Rhodobacter alkalitoleranssp.nov.,isolated from an alkaline brown pond[J].Arch Microbiol,2018,200(10):1487-1492.)、埤塘生态区(Sheu C,Li ZH,Sheu SY,etal.Tabrizicola oligotrophicasp.nov.and Rhodobacter tardus sp.nov.,two new species of bacteria belongingto the family Rhodobacteraceae[J].Int JSyst Evol Microbiol,2020,70(12):6266-6283.)、富营养化淡水湖(Suresh G,Sailaja B,Ashif A,et al.Description ofRhodobacter azollae sp.nov.and Rhodobacter lacus sp.nov[J].Int J Syst EvolMicrobiol,2017,67(9):3289-3295.)、热泉(Xian WD,Liu ZT,Li MM,et al.Rhodobacterflagellatus sp.nov.,a thermophilic bacterium isolated from a hot spring[J].Int J Syst Evol Microbiol,2020,70(3):1541-1546；Khan IU,Habib N,Xiao M,etal.Rhodobacter thermarum sp.nov.,a novel phototrophic bacterium isolated fromsediment of a hot spring[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2019,112(6):867-875.)、海洋沉积物(Venkata Ramana V,Sasikala C,Ramana Ch V.Rhodobacter maris sp.nov.,aphototrophic alphaproteobacterium isolated from a marine habitat of India[J].Int J Syst Evol Microbiol,2008,58(Pt 7):1719-22.)、泻湖沉积物(Subhash Y,LeeSS.Rhodobacter sediminis sp.nov.,isolated from lagoon sediments[J].Int J SystEvol Microbiol,2016,66(8):2965-2970.)、小溪泥浆(Raj PS,Ramaprasad EVV,VaseefS,et al.Rhodobacter viridis sp.nov.,a phototrophic bacterium isolated frommud of a stream[J].Int J Syst Evol Microbiol,2013,63(Pt 1):181-186.)、土壤(Arunasri K,Venkata Ramana V,

 C,et al.Rhodobacter megalophilussp.nov.,a phototroph from the Indian Himalayas possessing a wide temperaturerange for growth[J].Int J Syst Evol Microbiol,2008,58(Pt 8):1792-6.)中。另外，Kurahashi等(Kurahashi M,Yokota A.Apreliminary report of phylogeneticdiversity of bacterial strains isolated from marine creatures[J].J Gen ApplMicrobiol,2002,48(5):251-9.)还从多种海洋生物的肠道菌群中分离到了归属于红细菌属的菌株。红细菌属菌株细胞呈卵形或杆状，细胞大多具有单极鞭毛运动。过氧化氢酶和氧化酶阳性。光能异养型。细胞含有复杂的胞质内膜系统和天然类胡萝卜素生物合成系统，具有光自养和暗化学养(好氧/厌氧)的能力，能够有效同化多种有机物作为细胞生长的碳源。该属大多数菌株为需氧的嗜中温细菌。优势脂肪酸成分包括C_18:1ω7c，其中大多数菌株还含有脂肪酸成分C_10:0 3OH和C_18:0 3OH。磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰胆碱(PC)为该属菌株主要极性脂成分，Q-10为该属菌株含有的唯一的呼吸醌。基因组的DNA G+C含量为62.9-70.6％。

红细菌属模式种荚膜红细菌(R.capsulatus)的菌株可将大气中的氮气转化为氨来补充植物对氮元素的需求。由于这类细菌具有固氮作用，在水稻栽培中接种荚膜红细菌可有效提高植物氮素吸收、植株生长和产量(Maeda I.Potential of PhototrophicPurple Nonsulfur Bacteria to Fix Nitrogen in Rice Fields[J].Microorganisms,2021,10(1)；Elbadry M,Gamal-Eldin H,Elbanna K.Effects of Rhodobactercapsulatus inoculation in combination with graded levels of nitrogenfertilizer on growth and yield of rice in pots and lysimeter experiments[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,1999,15(3):393-395；Gamal-Eldin H,Elbanna K.Field evidence for the potential of Rhodobacter capsulatusas Biofertilizer for flooded rice[J].Curr Microbiol,2011,62(2):391-5.)。Min等(Min K,Park YS,Park GW,et al.Elevated conversion of CO(2)to versatile formateby a newly discovered formate dehydrogenase from Rhodobacter aestuarii[J].Bioresour Technol,2020,305(123155.)从河口红细菌(R.aestuarii)中发现了一种耐氧的CO₂还原酶，可用于催化二氧化碳至多功能甲酸盐，在减少二氧化碳排放方面的突出优势可用于构建一个可行的酶体系，能够将二氧化碳作为一种廉价、丰富和可再生资源生产多功能甲酸盐。另外，红细菌属菌株还常用于通过光发酵来生产环境友好型燃料氢气的过程中。这是一种厌氧过程，需要使用光作为能量来源和有机底物(如乳酸)作为碳源，以维持红细菌属菌株的生长，从而产生氢气。Turon等(Turon V,Ollivier S,Cwicklinski G,etal.H(2)production by photofermentation in an innovative plate-typephotobioreactor with meandering channels[J].Biotechnol Bioeng,2021,118(3):1342-1354.)研究发现，应用平板型光生物反应器，荚膜红细菌的最大产氢流速可达157.7±9.3mL H₂/L/h。红细菌属菌株也被发现具有降解致癌物质多环芳烃和苯等污染物的能力(Oberoi AS,Philip L,Bhallamudi SM.Biodegradation of Various AromaticCompounds by Enriched Bacterial Cultures:Part A-Monocyclic and PolycyclicAromatic Hydrocarbons[J].Appl Biochem Biotechnol,2015,176(7):1870-88.)。同时也能够降解土壤、泥沙和废水中的各种污染物。Ponsano等发现，荚膜红细菌可以处理家禽屠宰场废水中的脂肪(Ponsano EH,Paulino CZ,Pinto MF.Phototrophic growth ofRubrivivax gelatinosus in poultry slaughterhouse wastewater[J].BioresourTechnol,2008,99(9):3836-42.)；Wu等发现，用荚膜红细菌处理大豆蛋白废水中的蛋白质和淀粉(Wu P,Li J-z,Wang Y-l,et al.Promoting the growth of Rubrivivaxgelatinosus in sewage purification by the addition of magnesium ions[J].Biochemical engineering journal,2014,91(66-71.)。Kong等发现这类菌株可以使四氯苯酚脱氯和矿化(Kong F,Wang A,Ren HY,et al.Improved dechlorination andmineralization of 4-chlorophenol in a sequential biocathode-bioanodebioelectrochemical system with mixed photosynthetic bacteria[J].BioresourTechnol,2014,158(32-8.)，而Ouchane等在荚膜红细菌中发现了对除草剂terbutryn具有抗性表型的pufL基因(Ouchane S,Picaud M,Astier C.A new mutation in the pufLgene responsible for the terbutryn resistance phenotype in Rubrivivaxgelatinosus[J].FEBS Lett,1995,374(1):130-4.)。Wu等研究发现，添加荚膜红细菌的大豆加工废水可有效去除土壤中农药西维因的残留(Wu P,Li J-z,Wang Y-l,etal.Promoting the growth of Rubrivivax gelatinosus in sewage purification bythe addition of magnesium ions[J].Biochemical engineering journal,2014,91(66-71.)，此外，由于胞内营养物质(维生素B、辅酶Q10、色素、叶酸)，大豆加工废水中的荚膜红细菌还能改善土壤质量和肥力。上述信息均提示该属菌株对于环境污染具有较强的生物修复潜力。从荚膜红细菌(R.capsulatus)中提取的具有优良酶促性的5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS)，据此被评估并应用于5-氨基乙酰丙酸(ALA)的生产(Lou JW,Zhu L,Wu MB,etal.High-level soluble expression of the hemA gene from Rhodobacter capsulatusand comparative study of its enzymatic properties[J].J Zhejiang Univ Sci B,2014,15(5):491-9.)。5-氨基乙酰丙酸(ALA)是血红素、维生素B12、细胞色素和叶绿素四吡咯等化合物生物合成的常见前体，作为除草剂、杀虫剂和植物生长促进因子已在农业上得到了实际应用，而且还能使植物具有耐盐和耐低温的能力，在植物促生、抗逆、防病的作用中可起到关键作用。同时，这类物质也已应用于肿瘤诊断和癌症治疗等医疗领域(SasakiK,Watanabe M,Tanaka T,et al.Biosynthesis,biotechnological production andapplications of 5-aminolevulinic acid[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002,58(1):23-9.)。目前，许多不同的5-氨基乙酰丙酸合成酶编码基因已细菌属菌株中被克隆并在大肠杆菌菌株中表达，通过结合过表达和优化培养工艺，研究人员已将ALA产量提高到7.34g L^-1(Lin J,Fu W,Cen P.Characterization of 5-aminolevulinate synthase fromAgrobacterium radiobacter,screening new inhibitors for 5-aminolevulinatedehydratase from Escherichia coli and their potential use for high 5-aminolevulinate production[J].Bioresour Technol,2009,100(7):2293-7.)。因此，红细菌属菌株在工业、农业、食品医药等领域拥有良好的应用前景。深入挖掘红细菌属新资源意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供光合固氮红细菌新物种及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种光合固氮红细菌新物种。

本发明要求保护的光合固氮红细菌新物种，具体为光合固氮红细菌(Rhodobacterphotoazotoformans)S2205，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.26164。

所述光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205菌株S2205为革兰氏染色阴性细菌，嗜中温，兼性好氧。菌株在30℃下，NA培养基上培养48小时后，可形成湿润，光滑和淡黄色菌落。菌株的生长条件是20-37℃、0-3％NaCl和pH 6.0-8.0，最适生长条件是30℃、0-1％ NaCl、pH 7.0。该菌株的氧化酶和过氧化氢酶测试为阳性，七叶苷水解阳性；明胶液化实验阴性，不能水解淀粉和纤维素。

第二方面，本发明要求保护一种培养物。

本发明所要求保护的培养物为前文第一方面中所述光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205的培养物，是将前文第一方面中所述合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205在细菌培养基中培养得到的物质。

上述培养物中，所述物质包括所述杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203(菌体自身)和所述杀藻申氏杆菌(Shinella algicida)SD203的代谢物。

上述培养物中，所述细菌培养基可为固体培养基或液体培养基。

术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体培养基的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。

在本发明的具体实施方式中，所述细菌培养基具体为NA培养基。

第三方面，本发明要求保护一种代谢物。

本发明要求保护的代谢物为前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205的代谢物。

术语“代谢物”是指微生物新陈代谢过程中产生的初级代谢产物和/或次级代谢产物。初级代谢是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢的产物即为初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。次级代谢的产物即为次级代谢产物，大多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、毒素等类型。

第四方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明要求保护的菌剂含有前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205、前文第二方面中所述的培养物和/或前文第三方面中所述的代谢物。

其中，所述菌剂为抑制藻生长的菌剂和/或用于除草的菌剂和/或用于杀虫的菌剂和/或用于促进植物生长的菌剂。

上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。

上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

第五方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacterphotoazotoformans)S2205或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂在如下任一中的应用：

(A1)抑制藻生长；

(A2)制备用于抑制藻生长的产品；

(A3)治理水华；

(A4)制备用于治理水华的产品；

(A5)除草；

(A6)制备用于除草的产品；

(A7)杀虫；

(A8)制备用于杀虫的产品；

(A9)促进植物生长；

(A10)制备用于促进植物生长的产品；

(A11)生产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)；

(A12)制备用于生产5-氨基乙酰丙酸的产品；

(A13)改良作物生态环境；

(A14)制备用于改良作物生态环境的产品。

第六方面，本发明要求保护一种用于抑制藻生长的产品.

本发明要求保护的用于抑制藻生长的产品，其活性成分为前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。

第七方面，本发明要求保护一种用于治理水华的产品。

本发明要求保护的用于治理水华的产品，其活性成分为前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。

第八方面，本发明要求保护一种用于除草的产品。

本发明要求保护的用于除草的产品，其活性成分为前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。

第九方面，本发明要求保护一种用于杀虫的产品。

本发明要求保护的用于杀虫的产品，其活性成分为前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。

第十方面，本发明要求保护一种用于促进植物生长的产品。

本发明要求保护的用于促进植物生长的产品，其活性成分为前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。

第十一方面，本发明要求保护一种抑制藻生长的方法。

本发明要求保护的抑制藻生长的方法，可包括如下步骤：用前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂对待处理的藻样本进行处理。

第十二方面，本发明要求保护一种治理水华的方法。

本发明要求保护的治理水华的方法，可包括如下步骤：用前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂对待治理的水华水体进行处理。

第十三方面，本发明要求保护一种除草和/或杀虫和/或促进植物生长的方法。

本发明要求保护的除草和/或杀虫和/或促进植物生长的方法，可包括如下步骤：用前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂对待待处理的植物或其生长基质进行处理。

在上述各方面中，所述藻为蓝藻；所述水华为蓝藻水华。

进一步地，所述蓝藻为水华鱼腥藻。

在本发明的具体实施方式中，所述藻为水华鱼腥藻FACHB-245。

第十四方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205在制备前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂中的应用。

实验证明，本发明菌株S2205代表了红细菌属的一个新物种，命名为光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)。该菌株能够产生5-氨基乙酰丙酸(ALA)，并且和藻细胞共培养时，能够抑制藻生长。5-ALA能够作为天然的除草剂杀虫剂和植物生长促进剂。因此本发明菌株S2205是制备微生物菌剂以用于改良作物生态环境、促进作物健康生长的优秀菌种资源。

保藏说明

分类命名：光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)；

参椐的生物材料：S2205；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏机构简称：CGMCC；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2022年12月7日；

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.26164。

附图说明

图1为菌株S2205的极性脂成分检测结果。

图2为基于菌株S2205和相关菌株的16S rRNA基因序列构建系统发育树。系统发育树以Rhodospirillum rubrum ATCC 11170T(D30778)为外群。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、菌株S2205的分离筛选及鉴定

一、菌株S2205的分离

菌株S2205分离自云南大理洱海水样。分离培养基是BG-11，该培养基的成分见表1。菌种分离、纯化方法和操作流程参照Deng Y等文献描述的方法进行(Deng Y,Han X-F,Jiang Z-M,Yu L-Y,Li Y and Zhang Y-Q(2022)Characterization of threeStenotrophomonas strains isolated from different ecosystems and proposal ofStenotrophomonas mori sp.nov.And Stenotrophomonas lacuserhaiisp.nov..Front.Microbiol.13:1056762.doi:10.3389/fmicb.2022.1056762.)。获得的纯菌株以20％(v/v)甘油作为保护剂，进行液氮保藏和-80℃冷冻保藏。

本实验中，分离纯化得到菌株S2205。

表1、BG-11培养基成分及终浓度

二、菌株S2205的细胞形态观察和生理生化特征检测

以下实验基本上都在NA固体培养基(添加琼脂)或NA液体培养基(不添加琼脂)上以及BG-11培养基上开展，特殊情况，则另加说明。

NA培养基成分：蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g，蒸馏水溶解后定容至1000mL,pH7.0。

菌株S2205的生长温度检测范围为10-45℃，检测点11个(10、15、20、25、28、30、32、35、37、40和45℃)；生长盐浓度(NaCl)检测范围为0-8％(0-8g/100ml)的9个浓度梯度(0、1、2、3、4、5、6、7和8％)；生长pH检测范围为4-11之间的8个梯度(4、5、6、7、8、9、10、11)。菌株的生理生化功能使用检测试剂盒API 50CH、API ZYM，以及BiOLOG GEN III板及相应的操作方法进行检测。菌株的其他生理生化特征，包括革兰氏染色属性、氧需求、接触酶活性、氧化酶活性、明胶水解活性，淀粉水解活性和纤维素水解活性，主要参照《常见细菌系统鉴定手册》进行(东秀珠,蔡妙英.2001.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社)。

鉴定结果显示，菌株S2205为革兰氏染色阴性细菌，嗜中温，兼性好氧。菌株在30℃下，NA培养基上培养48小时后，可形成湿润，光滑和淡黄色菌落。菌株的生长条件是20-37℃、0-3％NaCl和pH 6.0-8.0，最适生长条件是30℃、0-1％ NaCl、pH 7.0。

菌株S2205的氧化酶和过氧化氢酶测试为阳性，七叶苷水解阳性；明胶液化实验阴性，不能水解淀粉和纤维素。菌株S2205和近缘菌Rhodobacter tardus CYK-10的表型方面区别性特征见表2。

表2、菌株S2205和最近缘菌Rhodobacter tardus CYK-10的区别性表型特征

注：表中，+表示为阳性，-表示为阴性，w表示弱阳性。

三、菌株S2205的细胞化学特征检测

通过GC气相色谱、HPLC液相色谱和TLC薄层色谱检测菌株S2205的脂肪酸、醌类型、极性脂等细胞化学组分(Sasser M.Identification of bacteria by gasghromatography of cellular fatty acids,MIDI Technical Note 101.Newark,DE:MIDIinc；1990.Minnikin DE,O’Donnell AG,Goodfellow M,Alderson G,Athalye M et al.Anintegrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones andpolar lipids.J Microbiol Methods 1984；2:233–241.)。菌株S2205的主要脂肪酸是C_18:1ω7c。如表3所示，菌株S2205的很多脂肪酸成分的含量也与红细菌属近源种不同(Sheu C,Li ZH,Sheu SY,Yang CC,Chen WM.Tabrizicola oligotrophica sp.nov.andRhodobacter tardus sp.nov.,two new species of bacteria belonging to thefamily Rhodobacteraceae.Int J Syst Evol Microbiol 2020；70:6266-6283.)。菌株S2205的唯一呼吸醌是Q10。在菌株S2205中，极性脂成分包括双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)，未知成分的磷脂(PL)及糖脂(GL)如图1所示。其中，优势脂肪酸、醌和主要的极性脂成分都确证菌株S2205是红细菌属的成员；同时，菌株S2205的脂肪酸组成的微量成分及其含量又可将菌株S2205和红细菌属的其他物种相区分开。

表3、菌株S2205的脂肪酸组成

脂肪酸(％)	S2205
		<![CDATA[anteiso-C<sub>14:0</sub>]]>	1.4
<![CDATA[C<sub>16:0</sub>]]>	9.8
		<![CDATA[C<sub>18:0</sub>]]>	3.9
<![CDATA[C<sub>10:0</sub>2OH]]>	1.4
		<![CDATA[C<sub>10:0</sub>3OH]]>	2.1
<![CDATA[C<sub>18:1</sub>2OH]]>	0.9
		<![CDATA[C<sub>18:0</sub>3OH]]>	5.7
<![CDATA[C<sub>16:1</sub>ω7c]]>	4.7
		<![CDATA[C<sub>18:1</sub>ω7c]]>	59.7
<![CDATA[11-MethylC<sub>18:1</sub>ω7c]]>	4.3

四、菌株S2205系统进化地位的确定

提取菌株S2205的基因组DNA进行测序，并将其中的16S rRNA基因序列(SEQIDNo.1)在国际权威细菌分类学分析数据库(http://www.ezbiocloud.net/)中进行在线比对(Kim OS,Cho YJ,Lee K,et al.2012,Introducing EzTaxon-e:a prokaryotic16S rRNAgene sequence database with phylotypes that represent uncultured species.IntJ Syst Evol Microbiol,62:716-721.)。结果显示本发明菌株S2205与红细菌科的菌种相似性最高。调取近缘菌株的16S rRNA基因与菌株S2205的16SrRNA基因构建系统进化树，在红细菌科的系统进化树中，菌株S2205聚类于红细菌属的进化分枝上，紧邻于Rhodobactertardus CYK-10(图2)；菌株S2205和Rhodobacter tardus种的典型菌株Rhodobactertardus CYK-10的16S rRNA基因相似性为95.2％，这一数值远低于区分原核微生物物种的界限值98.65％(Kim M,Oh HS,Park SC,Chun J.Towards a taxonomic coherencebetween average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity forspecies demarcation of prokaryotes.Int J Syst Evol Microbiol 2014；64:346–351.。由此判定，菌株菌株S2205是红细菌属内区别于已知物种的一个成员。

为进一步明确菌株的分类学地位，在EZbiocloud上比较并计算菌株S2205的全基因组序列与最近缘对照菌Rhodobacter tardus CYK-10的全基因组序列的平均核苷酸相似性(ANI值)(Yoon SH,Ha SM,Lim J,Kwon S,Chun J.A large-scale evaluation ofalgorithms to calculate average nucleotide identity.Antonie van Leeuwenhoek2017；110:1281–1286.)。全基因组序列比较分析显示，菌株S2205的全基因组序列与最近缘对照菌Rhodobacter tardus CYK-10的平均核苷酸相似性(ANI)是71.9％。该值均远低于95％这一区分原核微生物基因种的ANI阈值(Kim,M.,Oh,H.S.,Park,S.C.,and Chun,J.(2014).Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.64,346–351.)。该结果进一步支持菌株S2205代表了红细菌属内一个新物种的结论。根据菌株S2205的全基因组序列计算得出菌株S2205的基因组GC含量为65.6％。

综合菌株S2205在表型和基因型方面的分类学数据及其与近缘菌株的比较，我们判定菌株S2205代表了红细菌属的一个新物种。由于其含有光合细菌合成5-ALA的碳四途径的限速酶基因(参见后文“六、菌株S2205产5-氨基乙酰丙酸能力测试”)，因此将其命名为光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)。

光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)于2022年12月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.26164。

五、菌株S2205对水华鱼腥藻FACHB-245的抑制作用检测实验

在无菌条件下，在250mL的锥形瓶加入无菌BG-11培养液40mL。接种入水华鱼腥藻FACHB-245液。藻接种终浓度约为2.0×10⁵细胞·mL^-1。对照和处理各设3个重复。向处理组中加入1.0mL的S2205菌悬液，至其浓度为2.0×10⁵菌细胞·mL^-1。对照组中加入1.0mL的BG-11培养基，摇匀。在光照培养箱中30℃，(12h光照：12h无光照)培养，培养时间为5d。

菌株S2205对水华鱼腥藻FACHB-245生长抑制作用的实验结果统计如表4。由表4可知，菌藻共同培养时，菌株S2205明显抑制了水华鱼腥藻FACHB-245生物量的增长，对水华鱼腥藻FACHB-245的抑制率可达67.5％。由此判定，菌株S2205对水华鱼腥藻FACHB-245的生长抑制效果(袁峻峰,孟智芳,陈德辉,等.中性柠檬酸菌对几种常见藻类生长的他感作用[J].淡水渔业,1999,29(4):12-15.)。

表4、菌株S2205对水华鱼腥藻FACHB-245生长抑制的实验结果

注：1,2,3分别代表同样条件下的重复实验。降低率是指与对照样相比，处理样中细胞浓度的减少量占对照样的百分比。

六、菌株S2205产5-氨基乙酰丙酸能力测试

菌株S2205产5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)能力测试实验参照文献方法开展(孙勇,吴任,章力,等.高产5-氨基乙酰丙酸光合细菌株hemA基因的克隆与序列分析[J].暨南大学学报,2007,28(5):518-523.)。概括为：(1)菌株S2205使用Molisch培养基在光照培养箱中30℃，(12h光照：12h无光照)培养72h。其中，Molisch培养基成分：蛋白胨10g/L；甘油5g/L；MgSO₄ 0.5g/L；KH₂PO₄ O.5g/L；FeSO₄ 0.03g/L，去离子水补足至1L；pH 7.2。(2)无菌操作条件下，取5mL菌液，以5000rpm转速离心15min，取上清液2mL到另一试管中，加入2mL浓度为2mol/L的乙酸钠(pH 4.6)缓冲液和0.5mL乙酰丙酸,沸水浴加热15min，冷却至室温后，取2mL反应液与2mL Ehrlich’s试剂混合，稳定15min后，测定其在OD_553nm吸光值，根据标准曲线计算出菌株产生5-ALA的值。实验平行重复3次，取平均值。用蒸馏水作为空白对照。实验测得菌株S2205产5-ALA的产量大约为5.21mg/L。

其中，标准曲线的制作概述为：精确配制质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mg/L的5-ALA·HCl标准样品溶液(Sigma公司产品)。分别取2mL不同浓度的5-ALA·HCl标准样品溶液到另一管中，加入2mL浓度为2mol/L的乙酸钠缓冲液(pH4.6)和0.5mL乙酰丙酸，沸水浴加热15min后冷却至室温。取2mL上述反应液与2mL的Ehrlich’s试剂混合，稳定15min后，用比色皿在553nm下用分光光度计检测混合液的吸光值。并用蒸馏水作为空白对照。Ehrlich’s试剂的配制：在50mL量筒中，依次加入30mL冰醋酸，1g对-二甲氨基苯甲酸，8mL的70％高氯酸，溶解后用冰醋酸定容至50mL，盛放于棕色瓶中，保存于4℃备用。

光合细菌合成5-ALA的碳四途径的限速酶基因是5-ALA合成酶,该酶由hemA基因编码。我们在菌株S2205的基因组中检索到hemA基因(C8J29_RS06575)。

菌株S2205的基因性特征和表型特征相互确证：菌株具有较强的产5-ALA的能力。

5-ALA能够作为天然的除草剂杀虫剂和植物生长促进剂(Sasikalac,Ramamav,Raghuveerrp.5-Aminolevulinicacid:apotential herbicide/insecticidefrommicroorganisms[J].Biotechnol Prog,1994,10:451-459.)。因此本发明菌株是制备微生物菌剂以用于改良作物生态环境、促进作物健康生长的优秀菌种资源。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.26164。

2.权利要求1所述光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205的培养物，是将权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205在细菌培养基中培养得到的物质。

3.权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205的代谢物。

4.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205、权利要求2所述的培养物和/或权利要求3所述的代谢物。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为抑制藻生长的菌剂和/或用于除草的菌剂和/或用于杀虫的菌剂和/或用于促进植物生长的菌剂。

6.权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂在如下任一中的应用：

(A1)抑制藻生长；

(A2)制备用于抑制藻生长的产品；

(A3)治理水华；

(A4)制备用于治理水华的产品；

(A5)除草；

(A6)制备用于除草的产品；

(A7)杀虫；

(A8)制备用于杀虫的产品；

(A9)促进植物生长；

(A10)制备用于促进植物生长的产品；

(A11)生产5-氨基乙酰丙酸；

(A12)制备用于生产5-氨基乙酰丙酸的产品；

(A13)改良作物生态环境；

(A14)制备用于改良作物生态环境的产品。

7.一种用于抑制藻生长的产品，其活性成分为权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂；

或

一种用于治理水华的产品，其活性成分为权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂；

或

一种用于除草的产品，其活性成分为权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacterphotoazotoformans)S2205或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂；

或

一种用于杀虫的产品，其活性成分为权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacterphotoazotoformans)S2205或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂；

或

一种用于促进植物生长的产品，其活性成分为权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂。

8.一种抑制藻生长的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂对待处理的藻样本进行处理；

或

一种治理水华的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂对待治理的水华水体进行处理；

或

一种除草和/或杀虫和/或促进植物生长的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205或权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂对待待处理的植物或其生长基质进行处理。

9.根据权利要求5所述的菌剂或权利要求6所述的应用或权利要求7所述的产品或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述藻为蓝藻；所述水华为蓝藻水华；

进一步地，所述蓝藻为水华鱼腥藻。

10.权利要求1所述的光合固氮红细菌(Rhodobacter photoazotoformans)S2205在制备权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的代谢物或权利要求4或5所述的菌剂中的应用。

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