TW202039825A - 一種新穎紫硫菌株及其改善水質的用途 - Google Patents

Abstract

一種新穎紫硫菌株Marichromatium purpuratum RuA2，該紫硫菌株係分離自台灣西南海岸海水魚養殖廠底泥，其是在有氧環境下分離純化，並於厭氧環境下培養在含魚類蛋白質的培養基中，Marichromatium purpuratum RuA2可用於改善水產養殖環境水質，包含降低碳、氮、硫含量、增加微生物菌群豐富性、減少抗生素抗性基因或抗生素抗性微生物。

Description

一種新穎紫硫菌株、富集培養方法及其用途

本發明係關於一種新穎紫硫菌株，具廣鹽度對氧氣耐受性高，以低成本快速富集培養方法，有效改良水產養殖池的水質。

水產養殖是全球成長最快的蛋白質生產行業之一，預估到2030年，水產養殖行業可能佔了人類總消費的62%。

對水產養殖業來說，疾病與不良的環境是影響產量最大的因素，許多主要漁業國家的內陸水域捕撈量減少，且在生物學上有三分之一的魚類資源處於無法維持，這可能是因為內陸水域受到汙染、環境惡化及過度捕撈造成的影響。

自從盤尼西林的發現，人類克服細菌感染最常見的作法就是使用抗生素，但由於抗生素的濫用，抗生素耐藥性的快速增長引起大眾的關注，抗生素抗性基因與抗生素耐藥性有關，因為通過不同種類微生物之間的水平轉移導致抗生素抗性基因的高盛行率，不論在城市、農村地區或天然水系統(包括地下含水層)都可以發現抗生素抗性基因的蔓延，細菌一旦獲得抗性基因即使選擇壓力消失仍會在環境中存在至少5至10年。

磺胺類藥物(Sulfonamides，SMX)是一種人工合成的抗菌藥物，SMX可競爭性抑制對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)轉化為二氫丙酸(dihydropteroate)，二氫丙酸是細菌合成嘌呤和DNA的必要中間物質，因 此SMX在臨床上被廣泛使用。在水產養殖行業，SMX是用於治療細菌與原生動物感染最常使用的藥物之一，因此造成水產養殖設施SMX耐藥性盛行率提高。過去沒有研究提告光合紫硫菌可以用於改善SMX抗性基因。

水產養殖池中通常因為代謝廢物累積、未利用的飼料分解、生物材料的腐爛等原因導致水質惡化，通常會使用益生菌(如光合細菌)增加水產養殖產品的疾病抵抗力、飼養效率及水質改善，光合細菌在元素循環中扮演重要角色，通常添加光合細菌可以消除有機物質、其他有害物質、改善水質，光合細菌包含綠菌門(Chlorobi)、藍菌門(Cyanobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)，其中常見的紫硫菌與紫非硫菌屬於變形菌門，Marichromatium屬是變形菌門中一個次要的系統發育群，包含M.purpuratum、M.gracile、M.indicum、M.bheemlicum、M.fluminis，第一株M.purpuratum--BN5500是由亞得里亞海岸分離出，與其它M.purpuratum都具有厭氧、行光合作用等特性。

由於紫硫菌的厭氧特性，在操作與培養時都需要絕對厭氧，更增加操作與應用上的困難度。

因此，如何篩選出一株對氧氣耐受性較高的紫硫菌，可以有效改良水產養殖池的水質，即成為本發明在此欲解決的一重要課題。

本發明的目的即在於提供一種新穎紫硫菌株，該菌株為Marichromatium purpuratum RuA2，其係寄存於食品工業發展研究所。

為達前述發明目的，該紫硫菌株係分離自台灣西南海岸海水魚養殖廠底泥。

為達前述發明目的，該海水養殖廠係虱目魚養殖廠。

本發明的另一目的即在於提供一種如前述之紫硫菌株之篩選方法，其包含下列步驟：步驟一：取一水產養殖池的池水或沉積物，製作Winogradsky Columns，裝入含3-4% NaCl培養液的培養瓶中，在瓶口未密閉下，厭氧培養於30℃之培養箱2週-10週，直到該培養液呈紫紅色；步驟二：移入含2-4%含魚類蛋白質的NaCl培養液，培養於厭氧條件，其中該魚類蛋白質包含魚溶漿、魚肉湯、魚漿；步驟三：在有氧條件下於固態培養基分離純化，厭氧條件下培養；步驟四：重複該步驟二與該步驟三直到純化出分離株。

為達前述發明目的，其中該NaCl培養液包含天然海水或人工海水。

本發明的另一目的即在於提供一種新穎紫硫菌株Marichromatium purpuratum RuA2的富集培養方法，該紫硫菌株加入含魚溶漿海水培養基的透明容器中，該透明容器以海水培養基裝滿不留空氣，照光厭氧培養10-14天後，待菌體出現沉澱現象後即可使用；其中該海水培養基包含人工海水或天然海水；其中該魚溶漿濃度為8-10g/L。

本發明的另一目的即在於提供一種改善水質的方法，該方法包括添加有效量之新穎紫硫菌株Marichromatium purpuratum RuA2於水產養殖區域中。

為達前述發明目的，該改善水質是降低水中碳、氮或硫含量。

為達前述發明目的，該改善水質是增加微生物菌群豐富性。

為達前述發明目的，該改善水質是減少抗生素抗性基因或抗生素抗性微生物。

綜上所述，與現有技術相較。本發明篩選出的新穎菌株RuA2具有以下優點：1)除了培養外，菌株接種操作過程不需要在厭氧箱，富集培養基也不需要加入脫氧劑，與其他紫硫菌需要完全厭氧操作比較起來，RuA2培養手段相對容易；2)具廣鹽度，可以應用在鹽度0.5~6%的海水魚養殖池環境；3)利用便宜的魚溶漿或於魚肉湯等含蛋白質原料即可以快速富集培養，成本低廉；4)RuA2補充可以改善水質：降低水產養殖中的有機物蓄積(例如TOC)、含氮廢物(例如硝酸鹽)和硫(例如硫化氫)、降低SMX抗藥性基因並增加水中微生物多樣性。

圖1A是RuA2篩選步驟。

圖1B是RuA2分離和純化步驟示意圖。

圖1C是光學顯微鏡下RuA2菌體外型。

圖2是RuA2添加後對水樣中RuA2菌量偵測的PCR結果。

圖3A是RuA2添加後對水樣中sul1基因、nosZ基因影響的PCR結果。

圖3B是RuA2添加後對水樣中硝酸鹽濃度、nosZ基因的影響。

圖4A是RuA2添加後對水樣中微生物菌群相似性分析。

圖4B是RuA2添加後對水樣中微生物菌群組成的影響。

圖5是RuA2添加後對水樣中微生物菌群組成的影響。

圖6A是RuA2添加後對水樣中微生物菌群組成影響的文氏圖。

圖6B是RuA2添加後對水樣中前35個已知菌屬的微生物菌群組成影響。

圖6C是RuA2添加後對RuA2補充組獨有菌屬的微生物菌群組成影響。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

本發明所涉及到的術語定義

除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所瞭解相同的含義。在本發明的實踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現在描述較佳的方法、裝置和材料。

術語"厭氧微生物"或"厭氧菌"是指對氧敏感並且在氧的存在下將不會生長的微生物。厭氧微生物或厭氧菌是不需要氧來生長的任何生物體，厭氧微生物包括專性厭氧菌和兼性厭氧菌兩者，專性厭氧菌是在暴露于大氣水準的氧時將死亡的那些微生物。兼性厭氧菌是在氧存在的情況下能進行有氧呼吸，但是在氧不存在的情況下能夠切換到發酵或無氧呼 吸的生物體。

術語"富集"是指通過以下方式選擇性地富集特定微生物的生長的培養方法：提供具有有利於該特定微生物的生長的特定的和已知屬性的介質和條件，富集培養的環境將積極地影響所選微生物的生長，和/或消極地影響其它微生物的生長。

術語“PCR”意指聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR。PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個週期，迴圈進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。

術語“引子”意指一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA複製的起始點，除非特定限制，否則所述術語涵蓋自然中生物的DNA複製和聚合酶連鎖反應(PCR)中人工合成的引子(通常為DNA引子)。之所以需要引子是因為在DNA合成中DNA聚合酶僅僅可以把新的核苷酸加到已有的DNA鏈上。除非特定限制，否則上游引子為在DNA複製時，作為DNA範本3'端的複製起始點的引子，下游引子為在DNA複製時，作為DNA範本5'端的複製起始點的引子。

術語“瓊脂糖凝膠電泳”意`指一種用瓊脂或瓊脂糖作支援介質的電泳方法，借助瓊脂糖凝膠的分子篩作用，多核苷酸片段因其分子量或分子形狀不同，電泳移動速度有差異而分離，是基因操作中常用的重要方法。

術語「分離株」是純的微生物體外培養物，以通過其體外培養從異質的微生物野生群落得到。

術語"抗生素抗性基因"指具有對抗生素抗性的基因，並且包括該基因的細胞即使在用相應抗生素處理的環境下可存活。

下面對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

篩選菌株

如圖1A所示，篩選RuA2菌株方法如下，S01：水產養殖池的池水或沉積物加入含NaCl培養液，製作Winogradsky Columns，厭氧培養至紫紅色；S02：加入含魚類蛋白質的NaCl培養液，厭氧培養，其中魚類蛋白質包含魚溶漿、魚肉湯、魚漿，NaCl培養液的適合鹽度為0.5%~6%，NaCl培養液的較佳鹽度為2%~4%，NaCl培養液包含天然海水或人工海水；S03：在含氧環境中於固態培養基分離純化，厭氧條件下培養；S04：重複S02、S03步驟得到純化RuA2分離株。

下面為實際取得菌株方法，但取得菌株方法不應以下述實施內容為限。

收集台南七股魚池的水下10-20釐米的沉積土壤約400公克，加入0.5% MgSO₄(W/W)、0.5% CaCO₃(W/W)、1% cellulose source(W/W)、和0.5g煮熟的蛋黃，土壤混和均勻放入1.25公升的透明無色保特瓶中，再加入少量4%人工海水(購自TAAM公司)攪拌以除去土壤混和液中的空氣。繼續加入4%人工海水至離透明塑膠瓶瓶口約3釐米的地方，用塑料薄膜覆蓋瓶口，並以橡皮筋固定(如圖1B-a)，製作Winogradsky Columns，放置於植物生長培養箱4週~8週，培養溫度是30℃，光照條件是1500~2500Ix；在土 壤混和液變成紫紅色後，吸取紫紅色的土壤混和液放入35毫升含魚肉湯(5g/L)的試管中(如圖1B-b)，魚肉湯是將魚肉以4%人工海水煮熟後均質而得；以平板分離菌株，平板填充以4% NaCl配置的牛肉洋菜膠(5g/L)，密封於厭氧袋中培養(如圖1B-c)，篩選出紫紅色分離株RuA2(如圖1B-d)，RuA2寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存日期108年4月12日；RuA2菌株的16S rDNA和16S-23S rDNA基因間隔區(IGS)序列保藏在GenBank中(登錄號KY883369)。前述步驟除了培養須維持厭氧環境外，菌株分離、繼代等操作均不需要在厭氧環境進行。

富集培養

RuA2以含魚類蛋白質培養基可進行富集培養(圖1B-e~圖1B-g)，增量RuA2，其中含魚類蛋白質培養基包含配置於人工海水中的均質煮沸魚肉湯(適合濃度是8-12g/L)或魚溶漿(適合濃度是8-12%)，其中均質煮沸魚肉湯的最佳濃度是10g/L、魚溶漿的最佳濃度是8-10%，培養於透明容器中，該透明容器以海水培養基裝滿不留空氣，照光厭氧培養10-14天後，待菌體出現沉澱現象後即可使用；目前台灣所生產的魚溶漿以魚內臟為主，採用消化法製成：磨碎的內臟加入適當的酸進行消化，不停地攪拌保持45-60℃，加熱80℃停止自加消化，分離魚油與未消化之固型物，濃縮集得魚溶漿；魚溶漿價格低廉通常用於動物飼料，蛋白質含量高。RuA2種菌保存是室溫光照無氧靜置，培養液養分用盡，菌株會自然沉澱，在室溫有光照環境約可以保存一年，沉澱物黃化或白化就是種菌死亡；欲活化RuA2種菌是以魚溶漿培養液對半稀釋種菌保存液，待菌株重新生長呈紫紅色後(此時間可能超過2~3週)，再取1/4~1/2體積的新鮮菌液加入新的塑膠寶特瓶 中，加滿魚溶漿培養液，光照厭氧培養2週後含菌培養液每毫升菌數可以達10⁸以上，實務上海水魚養殖場水量每公噸加入1公升的含菌培養液。

水樣收集

實驗模型水箱為1米×1米×1米的塑料水箱，於台南七股的虱目魚海水養殖池取得沉積物，放置於該實驗模型水箱中，沉積物深度約0.1米，水填充到實驗模型水箱的水箱口邊緣下方0.1米處，該實驗模型水箱充氣並放置7天使其平衡，並收集水樣(定義為第-1週)。在平衡7天後，從該實驗模型水箱取出水樣(定義為第0週)，然後加入M.purpuratum RuA2(簡稱RuA2，每公升水樣加入菌數5×10⁵)，加入RuA2後的第1、2、3和4週收集水樣，在第1、2、3週取樣後以前述相同方法補充RuA2。水樣用無菌瓶收集，無菌瓶先以取樣點的水預洗三次，將樣品在黑暗中儲存並保持在4℃，然後送到實驗室進行後續分析，沉積物的結構類別由國立中興大學土壤調查和測試中心進行分析，其中含有0.863%有機物質的沙質貸款(57.5%砂、36.2%淤泥、6.1%粘土)。經PCR確認，如圖2所示，RuA2補充後第1週即可觀察到RuA2，第4週數量增加，而對造組沒有觀察到RuA2。

水質分析

水樣通過0.45μm尼龍濾膜過濾，以O.I.Analytical Aurora Model進行總有機碳(total organic carbon，TOC)分析；以紅外線偵測儀分析CO₂濃度分析無機碳、以酸化和氧化分析有機碳，以計算總無機碳與總碳量；以Merck spectroquant Nova 60試劑盒偵測水樣中的總氮(Total nitrogen，T-N)、NH⁴⁺-N、NO₃ ^2--N含量。

微生物DNA

水樣在4℃離心以收集微生物，並重新懸浮於Tris-EDTA緩衝液(pH 8.0)中，加入溶菌酶(lysozyme，20mg/mL)後，將懸浮液冷凍-解凍三次，置於37℃下1-2小時，加入含蛋白酶K(proteinase K，20mg/mL)、SDS(10%)的液體置於45℃隔夜(約16~20小時)，將樣品與DNAzol溶液混合、離心，上清液用乙醇沉澱得微生物DNA，以75%乙醇洗滌並重懸於無菌去離子水中。使用NanoDrop分光光度計測定製備的DNA濃度，並儲存在-30℃。

聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction，PCR)

以PCR偵測確定RuA2、SMX抗性基因sul1、氧化亞氮還原酶基因nosZ的存在，將固定量DNA以標靶基因專一性引子增幅，以凝膠電泳分離，利用軟體分析每個橫紋的強度並以16S rDNA的強度標準化，PCR使用引子如表1。

微生物群落結構分析

以PCR引子Sequence ID No：8、Sequence ID No：9增幅細菌 16S rRNA變化區域V3~V4並以Miseq Illumina(Genomics BioSci &Tech.Co.,Ltd.)分析。

RuA2分離株的特性

光合紫硫菌M.purpuratum RuA2(簡稱RuA2)的分離方法如圖1B所示，由圖1B-e、圖1B-g可以看到菌株RuA2的懸浮液顯示出紫紅色，也就是M.purpuratum的特徵之一，圖1C可以看到菌株RuA2呈桿狀，長度為2-4μm，菌體內有1~3個元素硫(如箭頭所指的小球狀)，可以知道RuA2具有硫利用率，可以使用培養基中的硫代硫酸鈉，可以去除硫化氫，轉換成硫顆粒而將硫累積於菌體體內；RuA2分離株可以在0.5%至6%的鹽濃度下生長，最佳生長鹽濃度為2%至6%，並且對氧的耐受性比多數不產氧光合細菌(Anoxygenic Phototrophic Bacteria)更好；在4℃下一個月沒有顯著影響之後培養的增殖能力，由16S rDNA和16S-23S核醣體RNA基因間隔序列與M.purpuratum 984(GenBank登錄號CP007031)的公開基因組序列具有99.6%的同一性，親緣演化關係(phylogenetic relationships)上RuA2的16S rDNA序列構建與M.purpuratum V2和DSM 1591群集，bootstrap value為每1000次重複93%。

水質改善

水質參數如表2所示，對照組和RuA2補充組在5個星期實驗期間水樣的鹽度分別為32.05±1.06ppt和30.98±0.88ppt，水溫為23.0±2.3℃，水溫變化幅度小被認為是亞熱帶水域的典型表現。

有機物蓄積和含氮廢物長久以來是水產養殖中的嚴重問題。

TOC：在第1週，RuA2補充組顯著去除32%TOC，對照中的TOC去除了 3.8%；在第4週，對照組的剩餘TOC為第0週時的79%，RuA2補充組的剩餘TOC僅有第0週的49%；28天實驗期間(第0週到第4週)，RuA2補充組的TOC去除率為0.508，是對照組的2.44倍；在為期4週的實驗其間，RuA2補充組的硝酸鹽去除率比對照組高5.94倍；由上述實驗結果發現，RuA2補充可以明顯降低水中TOC含量，也就是降低水中有機物的蓄積，進一步來說可以平衡水中浮游植物的產生、防止氧氣耗盡、水中有機碳的積累。

硝酸鹽(Nitrate)濃度：RuA2補充組的硝酸鹽濃度，在第1週保持恆定，在第2周達到最高值，是第1週的1.91倍，然後在第4週降至0.24倍；對照組的硝酸鹽濃度，第0週起迅速上升，至第2週是4.6倍達到峰值，然後在第4週下降至0.87倍；在2組的水樣中都沒有大量的氨(ammonium)積累。由上述實驗結果發現，RuA2補充可以明顯降低水中硝酸鹽濃度，也就是降低水中含氮廢物，進一步來說可以減少飼養水中對仔魚有害的氨、亞硝酸鹽(nitrite)和硝酸鹽，並減少因硝酸鹽滲入地下水造成的地下水系統與土質的污染。

硝酸鹽去除基因：硝酸鹽去除是脫氮和氧化亞氮還原酶的最後一步，氧化亞氮(Nitrous oxide)還原酶是在完全脫氮過程中發生的氧化亞氮還原中的一種特定酶，可將硝酸鹽轉化為氣態氮，氧化亞氮還原酶因為脫氮的特色被習之技術者用做遺傳標記，為了確定微生物群落中氧化亞氮還原酶的豐富度與本發明中觀察到的硝酸鹽去除效率是否相關，使用特異性引物以PCR確定氧化亞氮還原酶nosZ基因的存在(圖3A)，圖3B結果顯示，在第4週，RuA2補充組的nosZ基因量較對照組多，RuA2補充組中nosZ的相對豐富度是對照組的7.95倍；通過Pearson分析，RuA2補充組nosZ的增加量與水樣中的硝酸鹽濃度呈中度負相關(Pearson’s r=-0.152，圖3B)，這表示RuA2 補充組硝酸鹽去除能力的提高(表1)與微生物群落中nosZ的盛行率有關。

M.purpuratum是厭氧菌，需要嚴格的厭氧操作，但本新穎RuA2菌株對氧的耐受性較好，即使在有氧氣的狀態下操作，也能順利增值培養，且具有大範圍的鹽耐受性，，即使在夏天的暴雨或颱風時期，也可以順利操作有效降低水產養殖中的有機物蓄積和含氮廢物，解決長久以來的困擾。

M.purpuratum RuA2(Mp)was added weekly for 4 weeks starting at week 0 after sampling.

抗性偵測

偵測SMX抗性基因：如圖3A所示在wk-1的海水可以檢測到sul1的存在，這表明sul1在台灣沿海水域的西南部廣泛分佈，隨著每週補充RuA2菌株，sul1的存在逐漸下降，RuA2補充組在第4週幾乎檢測不到sul1基因；對照組的sul1基因有起伏變化，在第3週和第4週期間sul1基因增加，似乎有緩慢積累的現象；由上述實驗結果發現，RuA2補充組可以有效降低SMX抗性基因sul1，抗性細菌以及抗性基因是一種新興的環境污染物，尤其 抗性基因可經由水平基因轉移更增加了公共衛生的風險，sul1廣泛分佈於淡水和海水中，因此藉由RuA2補充有效降低SMX抗性基因sul1，可以廣泛用於淡水與海水的水質改善中。

微生物群聚結構

經由對16S rRNA的細菌變量V3-V4區域進行了高通量序列分析，圖4結果顯示微生物群落的豐度和多樣性，從RuA2補充組、對照組各5個時間點的10個樣品中獲得的總共1,162,894個序列，範圍從83,192到133,619，和22個細菌門具有

97%的序列相似性；在第0週，對照組和RuA2補充組的Shannon指數表示群落多樣性為4.6；在第4週，RuA2補充組的Shannon指數增加到5.3，而對照週期仍維持在4.6；進一步使用主成分分析評估樣本之間的相似性和差異，並確定樣本是否可以分組，圖4A結果顯示在補充菌株RuA2之前(第0週)和之後一週(第1週)，對照水樣品和補充RuA2的水樣品具高度相似；在第2週~第4週，對照樣品之間是相對相似，但RuA2補充與對照組不一樣；10個實驗樣品中前30個分類的heat-map，如圖4B所示，也證明補充RuA2改變了微生物群落結構；這10個實驗樣品鑑定出22個門(phyla)，其中主要的5個門相同，是：變形菌門、藍菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮黴菌門(Planctomycetes)、和放線菌門(Actinobacteria)，包含95%至99%的微生物群落豐富度，其中：擬桿菌門的豐富度：RuA2補充組由第0週的24.6%到第4週增加為34.3%；對照組由第0週的20.4%到第4週降低為8.2%。

放線菌門的豐富度：RuA2補充組由第0週的5.3%到第4週增加為15.1%；對照組則是在2.7~19.6的範圍內起伏變動。

藍菌門的豐富度：RuA2補充組由第0週的6.5%到第4週降低為2.6%；對照組由第0週的19.4%到第4週顯著增加為33.1%。

由上述實驗結果發現，補充RuA2可以增加微生物群落多樣性，可以降低藍菌門豐富度，藍菌門大量生長會釋放有毒物質影響水質，補充RuA2可以增加擬桿菌門、放線菌門的豐富度，由於放線菌門對有機物的利用率低，因此利用補充RuA2降低水中有機物的蓄積更適合放線菌門微生物生長。

圖6A顯示對照組和RuA2補充組在第0週、第4週的菌屬有56%重疊；在RuA2補充前(第-1週)對照組和RuA2補充組共有145個菌屬，站微生物群落的84%；在第4週，對照組和RuA2補充組仍有87%菌屬相同；圖6B顯示，在10個水樣中前35個已知菌屬相同，在第0週與第1週主要菌屬為Marivita。在第4週，對照組中最多的是Synechococcus和Erythrobacter屬，分別佔微生物組成的29.6%和2.0%；與對照組不同，RuA2補充組的微生物群落組成隨著均勻度的增加變得更加多樣化，其中較多的前四個屬為Marivita、Yonghaparkia、Fluviicola、Hyunsoonleella分別佔樣品中7.9%、6.7%、6.2%、3.8%的細菌群落豐度；RuA2補充組第4週水樣中有14個與對照組不同的菌屬(圖6A、圖6C)，這些菌屬相對豐富度較低(0.053%)，可能與第4週為微生物群落的多樣性有關，而不會嚴重影響群落結構，以Mann-Whitney U分析第4週對照組和RuA2補充組之間沒有顯著差異(p>0.05)；RuA2補充組影響了7個共有屬的相對豐度，如表3所示，在菌株RuA2補充量為0.04倍、0.09倍、和0.14倍，Verrucomicrobium、Planctomyces和Synechococcus三個菌屬的相對豐度分別降低，可能由於Verrucomicrobia的發生與硝酸鹽和營養物質有關，且Verrucomicrobia受藍藻生物量的影響，圖5 的結果還顯示補充RuA2使藍細菌和Verrucomicrobia的豐富度降低，又可能與補充RuA2使TOC和硝酸鹽濃度降低相關。表2結果顯示RuA2補充組中Fluviicola、Hyunsoonleella、Sediminicola和Yonghaparkia四個菌屬的相對豐富度分別增加到91.5倍、59倍、34.2倍和12倍。

水產養殖使用效果

本新穎RuA2菌株，經過富集培養後，將紫紅色的含菌培養液加入虱目魚養殖池中，含菌培養液每毫升菌數可以達10⁸以上，養殖場水量每公噸加入1公升培養菌液，養殖池的池水中有機物、氨(NH₃)、氮(N₂)、硫化氫(H₂S)等有害物質以及魚類產生的糞便和殘餌較少。前述虱目魚養殖池為海水養殖池，其中NaCl含量約1.5%-4%。

綜上所述，與現有技術相較，本發明篩選出的新穎菌株Rua2具有以下優點：1)除了培養外的菌株操作過程不需要厭氧，與其他M.purpuratum需要完全厭氧操作比較起來，RuA2培養手段相對容易；2)利用便宜的魚溶漿或於魚肉湯等含蛋白質原料即可以大量培養，成本低廉；3)改善水質：降低水產養殖中的有機物蓄積、含氮廢物和硫、降低SMX 抗藥性基因、增加水中微生物多樣性。

上列詳細說明係針對本發明之可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。

上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

紫硫菌(Marichromatium purpuratum)RuA2寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存日期108年4月12日(寄存編號後補)

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

<110> 東吳大學

<120> 一種新穎紫硫菌株、篩選方法、培養方法及其用途

<130> PA20190202

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<170> PatentIn version 3.2

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<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<220>

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 8

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 9

Claims (10)

1. 一種新穎紫硫菌株，該菌株為Marichromatium purpuratum RuA2，其係寄存於食品工業發展研究所。
2. 如申請專利範圍第1項之紫硫菌株，該紫硫菌株係分離自台灣西南海岸海水魚養殖廠底泥。
3. 如申請專利範圍第2項之紫硫菌株，該海水魚養殖廠係虱目魚養殖廠。
4. 一種如申請專利範圍第1項所述之紫硫菌株之篩選方法，其包含下列步驟：步驟一：取一水產養殖池的池水或沉積物，製作Winogradsky Columns，裝入含2%~4% NaCl培養液的培養瓶中，在瓶口未密閉下，厭氧培養於30℃之培養箱2週-10週，直到該培養液呈紫紅色；步驟二：移入含2%~4%魚類蛋白質的NaCl培養液中，培養於厭氧條件，其中該魚類蛋白質包含魚溶漿、魚肉湯或魚漿；步驟三：在有氧條件下於固態培養基分離純化，厭氧條件下培養；步驟四：重複該步驟二與該步驟三直到純化出紫硫菌分離株。
5. 如申請專利範圍第4項之篩選方法，其中該NaCl培養液包含天然海水或人工海水取代。
6. 一種新穎紫硫菌株Marichromatium purpuratum RuA2的富集培養方法，該紫硫菌株加入含魚溶漿海水培養基的透明容器中，該透明容器以海水培養基裝滿不留空氣，照光厭氧培養10-14天後，待菌體出現沉澱現象後即可使用；其中該海水培養基包含人工海水或天然海水；其中該魚溶漿濃度為8-10g/L。
7. 一種改善水質的方法，該方法包括添加有效量之新穎紫硫菌株Marichromatium purpuratum RuA2於水產養殖區域中。
8. 如申請專利範圍第7項之方法，該改善水質是降低水中碳、氮或硫含量。
9. 如申請專利範圍第7項之方法，該改善水質是增加微生物菌群豐富性。
10. 如申請專利範圍第7項之方法，該改善水質是減少抗生素抗性基因或抗生素抗性微生物。

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