CN104480050A - 从海参生长环境中分离光合细菌及微生态制剂的制备方法 - Google Patents

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孙学亮
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Abstract

本发明提供从海参生长环境中分离光合细菌的方法及微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)选取试样；(2)配置富集培养基；(3)光合细菌的富集培养；(4)固体分离培养基板；(5)光合细菌的分离；(6)菌种鉴定；(7)扩大培养；(8)制备微生态制剂。本发明得到深红红螺菌质量优良，调节养殖水体中化学因子，避免有害细菌和条件致病菌大量滋生，制成的微生态制剂大大改善水产养殖产品的水体环境。深红红螺菌在没有有机物的条件下，可利用光能，固定二氧化碳固定有机物；在有有机物的条件下，又可以利用有机物进行生长。深红红螺菌能将养鱼水中的残饵、排泄物等完全分解，具有改善水产养殖生态环境，降低氨氮、BOD的优点。

Description

从海参生长环境中分离光合细菌及微生态制剂的制备方法
技术领域
本发明属于细菌培养与分离技术领域，尤其是涉及一种从海参生长环境中分离光合细菌及微生态制剂的制备方法。
背景技术
由于全球人口的持续增长和社会经济的快速发展，人们对水生食物产品的需求也在增加，目前，水产养殖已成为世界上增长最快的食物生产行业。在集约化养殖水体中，水产动物放养密度高，投喂饵料量大，养殖水体中极易蓄积大量的残饵、动植物排泄物、死亡残体等含氮有机物，未经处理的养殖废水和工业、生活污水被排放或被雨水冲刷进入养殖水体，导致养殖水体中化学因子严重超标，有害细菌和条件致病菌大量滋生，鱼、虾等养殖动物的体质下降，因水体环境较小水面更为复杂，水质调节困难，用药成本高且困难，而光合细菌具有天然、无毒、无副作用、无污染、无残留、安全可靠等特点，光合细菌以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用。光合细菌在净化水质、促进鱼虾生长等方面显示出强有力的优势，环境效益十分显著。光合细菌是自然界中广泛存在的比较古老的细菌类群，分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处。经研究发现，海参生长环境非常适合光合细菌的生存，并且由此得到的光合细菌质量优良。本发明对海参生长环境中光合细菌进行分离并将其制成用于废水处理微生态制剂，大大改善了水产养殖产品的水体环境。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种从海参生长环境中分离光合细菌及微生态制剂的制备方法，该方法得到光合细菌质量优良，调节养殖水体中化学因子，避免有害细菌和条件致病菌大量滋生，制成的微生态制剂大大改善水产养殖产品的水体环境。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
从海参生长环境中分离光合细菌的方法，包括以下步骤是：
(1)选取海参生长水域的底泥作为试样，放入容器中；
(2)配置富集培养基：CH3COONa 1.0-3.0g，CH3CH2COONa 0.3-3g，(NH4)2SO40.3-3g，MgSO4·7H2O 0.5-2g，K2HPO40.7-3g，K2HPO40.2-1克，CaCl20.05g，MnSO40.0025-0.0050g，FeSO40.005-0.010g，乙醇2-5mL，酵母膏0.1-0.5g，谷氨酸1.0g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.5；
(3)光合细菌的富集培养：将富集培养基进行高压蒸汽灭菌，然后将海参生长水域的底泥的样品1g置于无菌具塞细颈瓶中，添加经过高压蒸汽灭菌后的富集培养基1L，盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中，在光照度为1000～6000lux，温度为15～30℃，无氧，至培养基内出现红色，即获得光合细菌富集培养菌悬液；
(4)固体分离培养基板：CH3COONa 3.0-5.0g，酵母膏3.0-6.0g，CaCl20.3-1.0g，MgSO4·7H2O 0.5-1.0g，调pH至7.4，加入琼脂20-22g，加水至1L；
(5)光合细菌的分离：将光合细菌富集培养菌悬液摇床振荡处理，然后光合细菌富集培养菌悬液滴到固体分离培养基板上，固体分离培养基板上涂布和划线，将涂布后的固体分离培养基平板倒扣至盖内，对培养皿边缘密封，将密封后的培养皿倒置暗处5-7小时后拿出，再倒置于光照培养箱中，于光照度为1000～6000lux，温度为15～30℃条件下光照厌氧培养；当厌氧培养7天后，平板上长出红色的小型菌落，挑取单个菌落重复划线分离多次，至得到细胞形态一致的菌株；
(6)菌种鉴定：对菌株的细胞形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定；该菌株属于深红红螺菌种；
(7)扩大培养：将步骤(6)得到的深红红螺菌进行摇瓶一级液体扩大培养：将菌体置于10L发酵罐，培养完成后，然后将扩大培养得到的菌体进行二级液体扩大培养，即菌体被放置于100L发酵罐培养，然后得到二级液体扩大培养的菌株。
所述高压蒸汽灭菌灭菌条件为：0.103MPa，150℃，30-40min。
步骤(7)中的10L发酵罐内培养基的组分为:CH3COONa 30.0-32.0g，(NH4)2SO410.0-13.0g，MgSO42.0-4.0g,NaCl 1.0-1.2g，KH2PO43.0-5.0g，K2HPO45.0-7.0g，CaCl20.5-1.0g，酵母膏1.0-2.0g，微量元素溶液1-2mL，蒸馏水10L。
步骤(7)中的100L发酵罐内培养基的组分与10L发酵罐内培养基的组分相同。
所述微量元素溶液包括以下重量组分：EDTA-2Na 2-3g，FeSO40.2-0.5g，MnCl2·4H2O0.1-0.5g，CoCl2·6H2O 0.1-0.3g，ZnCl20.1-0.3g，Na2MoO4·2H2O 0.02-0.05g，H3BO30.1-0.4g，蒸馏水1000mL。
从海参生长环境中分离光合细菌的微生态制剂的制备方法，利用尼龙滤布除去上述方法得到的二级液体扩大培养的菌株中大部分水分，收集菌体细胞，干燥、粉碎，制备成活的干菌粉，即得到光合细菌的微生态制剂。
本发明得到深红红螺菌产量高、质量优良，可以用于调节养殖水体中化学因子，避免有害细菌和条件致病菌大量滋生，制成的微生态制剂大大改善水产养殖产品的水体环境。深红红螺菌在没有有机物的条件下，可利用光能，固定二氧化碳固定有机物；在有有机物的条件下，又可以利用有机物进行生长。深红红螺菌能将养鱼水中的残饵、排泄物等完全分解，具有改善水产养殖生态环境，降低氨氮、BOD的优点。作为鱼、虾、蟹育苗开口饵料，可以增加营养，提高成活率。本发明得到的深红红螺菌既不像好氧微生物那样受污水中溶解氧浓度的限制，可以利用光能进行高效的能量代谢，既使是微弱的光照也能进行，同时也可以在有氧条件下分解有机物。菌种来自海参生长环境的生化系统中，自身具有多样性及较强的适应能力，其对废水中其他污染物也有较好的去除能力。
具体实施方式
实施例1
从海参生长环境中分离光合细菌的方法，包括以下步骤是：
(1)选取海参生长水域的底泥作为试样，放入容器中；
(2)配置富集培养基：CH3COONa 1.0g，CH3CH2COONa 0.3g，(NH4)2SO40.3g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO40.7g，K2HPO40.3克，CaCl20.05g，MnSO40.0025g，FeSO40.005-0.010g，乙醇2-5mL，酵母膏0.1-0.5g，谷氨酸1.0g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.5；
(3)光合细菌的富集培养：富集培养基在0.103MPa、150℃条件下高压蒸汽灭菌30-40min，然后将海参生长水域的底泥的样品1g置于无菌具塞细颈瓶中，添加经过高压蒸汽灭菌后的富集培养基1L，盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中，在光照度为1000～6000lux，温度为15～30℃，无氧，至培养基内出现红色，即获得光合细菌富集培养菌悬液；
(4)固体分离培养基板：CH3COONa 3.0g，酵母膏3.0g，CaCl20.3g，MgSO4·7H2O 0.5g，调pH至7.4，加入琼脂20g，加水至1L；
(5)光合细菌的分离：将光合细菌富集培养菌悬液摇床振荡处理，然后光合细菌富集培养菌悬液滴到固体分离培养基板上，固体分离培养基板上涂布和划线，将涂布后的固体分离培养基平板倒扣至盖内，对培养皿边缘密封，将密封后的培养皿倒置暗处5-7小时后拿出，再倒置于光照培养箱中，于光照度为1000～6000lux，温度为15～30℃条件下光照厌氧培养；当厌氧培养7天后，平板上长出红色的小型菌落，挑取单个菌落重复划线分离多次，至得到细胞形态一致的菌株；
(6)菌种鉴定：对菌株的细胞形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定；该菌株属于深红红螺菌种；
(7)将步骤(6)得到的深红红螺菌进行摇瓶一级液体扩大培养：将菌体置于10L发酵罐，培养完成后，然后将扩大培养得到的菌体进行二级液体扩大培养，即菌体被放置于100L发酵罐培养，然后得到二级液体扩大培养的菌株；
其中，10L发酵罐内培养基的组分为:CH3COONa 30.0g，(NH4)2SO410.0g，MgSO42.0g,NaCl 1.0g，KH2PO43.0g，K2HPO45.0g，CaCl20.5g，酵母膏1.0g，微量元素溶液1-2mL，蒸馏水10L。
步骤(7)中的100L发酵罐内培养基的组分与10L发酵罐内培养基的组分、含量均相同。
所述微量元素溶液包括以下重量组分：EDTA-2Na 2g，FeSO40.2g，MnCl2·4H2O 0.1g，CoCl2·6H2O 0.1g，ZnCl20.1g，Na2MoO4·2H2O 0.02g，H3BO30.1g，从海参生长环境中分离光合细菌的微生态制剂的制备方法，利用尼龙滤布除去上述方法得到的二级液体扩大培养的菌株中大部分水分，收集菌体细胞，干燥、粉碎，制备成活的干菌粉，即得到光合细菌的微生态制剂。
实施例2
从海参生长环境中分离光合细菌的方法，包括以下步骤是：
(1)选取海参生长水域的底泥作为试样，放入容器中；
(2)配置富集培养基：CH3COONa 2.0g，CH3CH2COONa 1.5g，(NH4)2SO41.5g，MgSO4·7H2O 1.2g，K2HPO41.2g，K2HPO40.7克，CaCl20.05g，MnSO40.0035g，FeSO40.007g，乙醇3mL，酵母膏0.3g，谷氨酸1.0g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.5。
(3)光合细菌的富集培养：将富集培养基在0.103MPa，150℃条件下进行高压蒸汽灭菌30-40min，然后将海参生长水域的底泥的样品1g置于无菌具塞细颈瓶中，添加经过高压蒸汽灭菌后的富集培养基1L，盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中，在光照度为1000～6000lux，温度为15～30℃，无氧，至培养基内出现红色，即获得光合细菌富集培养菌悬液；
(4)固体分离培养基板：CH3COONa 4.0g，酵母膏5.0g，CaCl20.7g，MgSO4·7H2O 0.7g，调pH至7.4，加入琼脂21g，加水至1L。
(5)光合细菌的分离：将光合细菌富集培养菌悬液摇床振荡处理，然后光合细菌富集培养菌悬液滴到固体分离培养基板上，固体分离培养基板上涂布和划线，将涂布后的固体分离培养基平板倒扣至盖内，对培养皿边缘密封，将密封后的培养皿倒置暗处5-7小时后拿出，再倒置于光照培养箱中，于光照度为1000～6000lux，温度为15～30℃条件下光照厌氧培养；当厌氧培养7天后，平板上长出红色的小型菌落，挑取单个菌落重复划线分离多次，至得到细胞形态一致的菌株；
(6)菌种鉴定：对菌株的细胞形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定；该菌株属于深红红螺菌种。
(7)将步骤(6)得到的深红红螺菌进行摇瓶一级液体扩大培养：将菌体置于10L发酵罐，培养完成后，然后将扩大培养得到的菌体进行二级液体扩大培养，即菌体被放置于100L发酵罐培养，然后得到二级液体扩大培养的菌株。
其中，10L发酵罐内培养基的组分为:CH3COONa 31.0g，(NH4)2SO412.0g，MgSO43.0g，NaCl 1.1g，KH2PO44.0g，K2HPO46.0g，CaCl20.7g，酵母膏1.5g，微量元素溶液1mL，蒸馏水10L。
步骤(7)中的100L发酵罐内培养基的组分与10L发酵罐内培养基的组分相同。
微量元素溶液包括以下重量组分：EDTA-2Na 2g，FeSO40.2g，MnCl2·4H2O 0.1g，CoCl2·6H2O 0.1g，ZnCl20.1g，Na2MoO4·2H2O 0.02g，H3BO30.1g。
从海参生长环境中分离光合细菌的微生态制剂的制备方法，利用尼龙滤布除去上述方法得到的二级液体扩大培养的菌株中大部分水分，收集菌体细胞，干燥、粉碎，制备成活的干菌粉，即得到光合细菌的微生态制剂。
实施例3
从海参生长环境中分离光合细菌的方法，包括以下步骤是：
(1)选取海参生长水域的底泥作为试样，放入容器中；
(2)配置富集培养基：CH3COONa 3.0g，CH3CH2COONa 3g，(NH4)2SO43g，MgSO4·7H2O 2g，K2HPO43g，K2HPO41克，CaCl20.05g，MnSO40.0050g，FeSO40.010g，乙醇2-5mL，酵母膏0.5g，谷氨酸1.0g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.5。
(3)光合细菌的富集培养：将富集培养基在0.103MPa，150℃条件下进行高压蒸汽灭菌30-40min，然后将海参生长水域的底泥的样品1g置于无菌具塞细颈瓶中，添加经过高压蒸汽灭菌后的富集培养基1L，盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中，在光照度为1000～6000lux，温度为15～30℃，无氧，至培养基内出现红色，即获得光合细菌富集培养菌悬液；
(4)固体分离培养基板：CH3COONa 5.0g，酵母膏6.0g，CaCl21.0g，MgSO4·7H2O1.0g，调pH至7.4，加入琼脂22g，加水至1L。
(5)光合细菌的分离：将光合细菌富集培养菌悬液摇床振荡处理，然后光合细菌富集培养菌悬液滴到固体分离培养基板上，固体分离培养基板上涂布和划线，将涂布后的固体分离培养基平板倒扣至盖内，对培养皿边缘密封，将密封后的培养皿倒置暗处5-7小时后拿出，再倒置于光照培养箱中，于光照度为1000～6000lux，温度为15～30℃条件下光照厌氧培养；当厌氧培养7天后，平板上长出红色的小型菌落，挑取单个菌落重复划线分离多次，至得到细胞形态一致的菌株；
(6)菌种鉴定：对菌株的细胞形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定；该菌株属于深红红螺菌种。
(7)将步骤(6)得到的深红红螺菌进行摇瓶一级液体扩大培养：将菌体置于10L发酵罐，培养完成后，然后将扩大培养得到的菌体进行二级液体扩大培养，即菌体被放置于100L发酵罐培养，然后得到二级液体扩大培养的菌株。
所述高压蒸汽灭菌灭菌条件为：0.103MPa，150℃，30-40min。
步骤(7)中的10L发酵罐内培养基的组分为:CH3COONa 32.0g，(NH4)2SO413.0g，MgSO44.0g，NaCl 1.2g，KH2PO45.0g，K2HPO47.0g，CaCl21.0g，酵母膏2.0g，微量元素溶液2mL，蒸馏水10L。
步骤(7)中的100L发酵罐内培养基的组分与10L发酵罐内培养基的组分相同。
所述微量元素溶液包括以下重量组分：EDTA-2Na 3g，FeSO40.5g，MnCl2·4H2O 0.5g，CoCl2·6H2O 0.3g，ZnCl20.3g，Na2MoO4·2H2O 0.05g，H3BO30.4g，蒸馏水1000mL。
从海参生长环境中分离光合细菌的微生态制剂的制备方法，利用尼龙滤布除去上述方法得到的二级液体扩大培养的菌株中大部分水分，收集菌体细胞，干燥、粉碎，制备成活的干菌粉，即得到光合细菌的微生态制剂。
以上对本发明的三个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (6)

1.从海参生长环境中分离光合细菌的方法，其特征在于：包括以下步骤是：
(1)选取海参生长水域的底泥作为试样，放入容器中；
(2)配置富集培养基：CH3COONa1.0-3.0g，CH3CH2COONa0.3-3g，(NH4)2SO40.3-3g，MgSO4·7H2O0.5-2g，K2HPO40.7-3g，K2HPO40.2-1克，CaCl20.05g，MnSO40.0025-0.0050g，FeSO40.005-0.010g，乙醇2-5mL，酵母膏0.1-0.5g，谷氨酸1.0g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.5；
(3)光合细菌的富集培养：将富集培养基进行高压蒸汽灭菌，然后将海参生长水域的底泥的样品1g置于无菌具塞细颈瓶中，添加经过高压蒸汽灭菌后的富集培养基1L，盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中，在光照度为1000～6000lux，温度为15～30℃，无氧，至培养基内出现红色，即获得光合细菌富集培养菌悬液；
(4)固体分离培养基板：CH3COONa3.0-5.0g，酵母膏3.0-6.0g，CaCl20.3-1.0g，MgSO4·7H2O0.5-1.0g，调pH至7.4，加入琼脂20-22g，加水至1L；
(5)光合细菌的分离：将光合细菌富集培养菌悬液摇床振荡处理，然后光合细菌富集培养菌悬液滴到固体分离培养基板上，固体分离培养基板上涂布和划线，将涂布后的固体分离培养基平板倒扣至盖内，对培养皿边缘密封，将密封后的培养皿倒置暗处5-7小时后拿出，再倒置于光照培养箱中，于光照度为1000～6000lux，温度为15～30℃条件下光照厌氧培养；当厌氧培养7天后，平板上长出红色的小型菌落，挑取单个菌落重复划线分离多次，至得到细胞形态一致的菌株；
(6)菌种鉴定：对菌株的细胞形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定；该菌株属于深红红螺菌种；
(7)扩大培养：将步骤(6)得到的深红红螺菌进行摇瓶一级液体扩大培养：将菌体置于10L发酵罐，培养完成后，然后将扩大培养得到的菌体进行二级液体扩大培养，即菌体被放置于100L发酵罐培养，然后得到二级液体扩大培养的菌株。
2.根据权利要求1所述的从海参生长环境中分离光合细菌的方法，其特征在于：所述高压蒸汽灭菌灭菌条件为：0.103MPa，150℃，30-40min。
3.根据权利要求1所述的从海参生长环境中分离光合细菌的方法，其特征在于：步骤(7)中的10L发酵罐内培养基的组分为:CH3COONa30.0-32.0g，(NH4)2SO410.0-13.0g，MgSO42.0-4.0g，NaCl1.0-1.2g，KH2PO43.0-5.0g，K2HPO45.0-7.0g，CaCl20.5-1.0g，酵母膏1.0-2.0g，微量元素溶液1-2mL，蒸馏水10L。
4.根据权利要求1所述的从海参生长环境中分离光合细菌的方法，其特征在于：步骤(7)中的100L发酵罐内培养基的组分与10L发酵罐内培养基的组分相同。
5.根据权利要求1所述的从海参生长环境中分离光合细菌的方法，其特征在于：所述微量元素溶液包括以下重量组分：EDTA-2Na2-3g，FeSO40.2-0.5g，MnCl2·4H2O0.1-0.5g，CoCl2·6H2O0.1-0.3g，ZnCl20.1-0.3g，Na2MoO4·2H2O0.02-0.05g，H3BO30.1-0.4g，蒸馏水1000mL。
6.制备如权利要求1所述的从海参生长环境中分离光合细菌的微生态制剂的方法，其特征在于：利用尼龙滤布除去上述方法得到的二级液体扩大培养的菌株中大部分水分，收集菌体细胞，干燥、粉碎，制备成活的干菌粉，即可得到光合细菌的微生态制剂。
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