CN101948768A - 一株降解2-氯苯酚的光合细菌的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一株降解2-氯苯酚的光合细菌的制备方法，包括以下步骤：1、富集培养基的配制；2、光合细菌的富集培养；3、降解2-氯苯酚的光合细菌的强化驯化；4、分离可降解2-氯苯酚的光合细菌；5、光合细菌的扩大培养；6、筛选菌株；7、紫外诱变；8、菌种鉴定。本发明具有对氧存在条件敏感度较低和不会对环境造成二次污染的特点。
Description
技术领域
本发明属于环境生物工程领域，具体涉及一株可降解2-氯苯酚(o-chlorophenol，2-CP)的光合细菌(Rhodopseudomonas palustris)的制备方法。
背景技术
氯酚类有机物可由酚类化合物直接氯化或氯苯水解而来，是一类典型的难降解有机污染物。由于其具有广谱的抗、杀菌和杀虫功效而被广泛应用于染料、造纸、防腐剂、除草剂、杀菌剂等行业。此外，废物焚烧、纸浆用氯漂白、饮用水氯化消毒过程中也都有可能产生氯酚类副产物。同时，氯酚类有机物也是一类典型的有毒有害污染物，其中很多化合物被认为具有“三致”(致癌、致畸、致突变)效应和遗传毒性。近年来的研究表明，某些氯酚还是内分泌干扰物或是潜在的内分泌干扰物，当它们长期低剂量存在时，容易使人和生物的内分泌系统紊乱。Akane等依据急性毒性试验方法研究了各种氯酚对蚯蚓等土壤生物的影响，发现2-氯苯酚、3-氯苯酚、4-氯苯酚的半数致死浓度(48h-LC50)分别为2.3×10-5、1.9×10-5、和2.6×10-5mmol/cm2。因此，美国、日本以及我国等世界很多国家都将氯酚类有机物列入了优先污染物名单。如美国环保局(EPA)于1976年公布的129种优先污染物名单中，2-氯苯酚位列第24位，2，4-对氯苯酚位列第31位，五氯酚位列第64位。近年来，有关环境中氯酚类有机物去除方法的研究一直是学术界的研究热点和难点。对此类化合物的主要去除方法可分为物理法、化学法、物理化学法和生物降解法。其中，生物降解方法因其具有成本低、效率高、操作方法简单、降解副产物少，无二次污染等优点而成为消除氯酚类有机物最有前景的途径。
尽管自然界存在多种降解2-氯苯酚的微生物，然而利用这些微生物进行降解2-氯苯酚仍存在诸多问题没有解决，从而阻碍了生物降解技术在处理废水中的实际应用。存在的主要问题如下：
1、目前发现的降酚菌株大部分都是好氧微生物或厌氧微生物，对氧存在的敏感度都很高，尤其是厌氧微生物，在有氧存在的条件下几乎无法生长，从而使2-氯苯酚的降解效果得不到保证。
2、在降解过程中往往需要添加苯酚作为共代谢的诱导底物，苯酚本身也是一种有毒的有机化合物，其加入会对环境造成二次污染。
光合细菌(photosynthetic bacteria，PSB)是具有原始光能合成体系的原核生物的总称，它们不仅能在厌氧光照条件下以低级脂肪酸、多种二羧酸、醇类、糖类、芳香族化合物等低分子有机物作为光合作用的电子供体进行光能异养生长，而且能在黑暗有氧条件下以有机物为呼吸基质进行好氧异养生长。此外，光合细菌工艺设备简单、有机质负荷高、耗能少、菌体可综合利用、不造成二次污染。基于此，近年来国内外对光合细菌进行了较为广泛的研究，并对味精废水、炼焦废水、啤酒废水及其他多种工业废水作了成功的处理，然而采用光合细菌处理含氯酚废水的研究国内却尚未有报道。
因此，筛选能够降解2-氯苯酚并且对氧存在敏感度不高的光合细菌，提高其在含酚废水中的生存能力和降解速率，减少二次污染，是微生物降解技术迈向实用化的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一株降解2-氯苯酚的光合细菌的制备方法，该光合细菌具有以下特点：1、对氧存在条件敏感度较低；2、不会对环境造成二次污染。
本发明所提供的降解2-氯苯酚的光合细菌是一株命名为PSB-1D的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，16SrDNA序列为GenBank Accession No.HM068966。该菌是已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。该菌种的主要特征为：短杆状，稍弯，二分分裂，以极生鞭毛运动；革兰氏染色为阴性，接触酶试验、吲哚试验和硝酸盐还原试验均为阳性。
本发明所提出的一株可降解2-氯苯酚的光合细菌的制备方法包括：
1、富集培养基的配制：
将NH4Cl 0.5～2.5克，CH3COONa 0.5～5克，MgCl2 0.05～0.5克，CaCl2 0.05～0.5克，KH2PO4 0.2～1克，K2HPO4 0.2～1克，酵母膏0.05～2克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10％的NaOH和10％的HCl调节pH 5.0～10.0，搅拌均匀，即配得光合细菌的富集培养基。
2、光合细菌的富集培养：
将富集培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，然后取农药厂排污口下游水体浅层底泥样品2克置于250毫升无菌具塞细颈瓶中，添加含2-氯苯酚质量浓度为25毫克/升的灭菌后富集培养基100毫升。盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中，在光照度为1000～6000勒克斯，温度为15～40℃，厌氧条件下培养至出现红色，获得光合细菌富集培养菌悬液a。
3、降解2-氯苯酚的光合细菌的强化驯化：
从变至红色的富集培养菌悬液a中取5毫升，接入95毫升含2-氯苯酚质量浓度为75毫克/升的新鲜无菌富集培养基中，在光照度为1000～6000勒克斯，温度为15～40℃，厌氧条件下培养至红色，由此得到第一次强化驯化培养液b1。依次提高富集培养基中2-氯苯酚的质量浓度，按照上述方法连续培养5～8个周期，直至2-氯苯酚在富集培养基中的的质量浓度达到320毫克/升，此时得到n次强化驯化培养液bn。
4、分离可降解2-氯苯酚的光合细菌：
富集培养基中加入2～3％的琼脂，灭菌后倒入直径为9厘米的培养皿中，冷却后制得固体分离培养基平板。取1毫升n次强化驯化培养液bn滴到固体分离培养基平板上，用无菌三角刮刀涂布。在培养皿盖内侧放入0.2～1克焦性没食子酸和1～5毫升质量百分浓度为50％的过饱和Na2CO3溶液作为吸氧剂，将涂布后的固体分离培养基平板倒扣至盖内。用融化后的固体石蜡+液体石蜡按配比1∶1进行培养皿边缘密封。将密封后的培养皿倒置暗处2～5小时后拿出，再倒置于光照培养箱中，于光照度为1000～6000勒克斯，温度为15～40℃条件下光照厌氧培养。当厌氧培养5～7天后，平板上长出红紫色的小型菌落，挑取单个菌落重复划线分离多次，直至镜检观察细胞形态一致，此时认为获得纯菌。
5、光合细菌的扩大培养：
挑取上述固体分离培养基平板上的各红色单菌落，分别用含2-氯苯酚浓度为100毫克/升的富集培养基进行扩大培养。培养7天后，培养瓶中的菌液都变为红色，由此得到各菌体的扩大培养液d。
6、筛选菌株：
测定各个菌株的扩大培养液d中2-氯苯酚的质量浓度，选择2-氯苯酚质量浓度最低的扩大培养液中的菌株作为后续研究对象。菌株编号为1D。
7、紫外诱变：
培养70小时的编号为1D的菌株培养液以10000转/分钟的转速离心5分钟，倾去上清液，菌体打散后加入无菌生理盐水，离心后倾去上清液。离心菌体中加入无菌生理盐水，将其浓度调整至每毫升108个左右，由此制得菌悬液e。移取5毫升菌悬液e到直径9厘米的培养皿内，放入灭菌的搅拌转子。将培养皿置于磁力搅拌器上，18瓦紫外灯下垂直距离25厘米处照射10～100秒，由此得照射后菌悬液f。取0.5毫升紫外光照射后的菌悬液f涂布于固体分离培养基平板上进行厌氧光照培养，定期观察，7天后从固体平板中挑取出现较早、生长速率较快的单菌落，即得诱变菌株，编号为PSB-1D。
8、菌种鉴定：
对菌株PSB-1D的细胞形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定。测定结果表明，菌株PSB-1D属于为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。该菌株为已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。
本发明的优点是：1、本发明通过强化驯化和紫外诱变等手段筛选出具有较强耐受和降解2-氯苯酚的能力的沼泽红假单胞菌。沼泽红假单胞菌不仅能在厌氧光照条件下以丙酸钠作为光合作用的电子供体进行光能异养生长，而且能在黑暗有氧条件下以葡萄糖为呼吸基质进行好氧异养生长。因此，沼泽红假单胞菌既不像好氧微生物那样受污水中溶解氧浓度的限制，可以利用光能进行高效的能量代谢，既使是微弱的光照也能进行，它又不像严格厌氧的甲烷细菌等对氧存在高度敏感，它可以在有氧条件下分解有机物，通过氧化磷酸化取得能量。2、沼泽红假单胞菌降解2-氯苯酚过程中利用丙酸纳或葡萄糖作为共代谢基质，解决了以苯酚作为2-氯苯酚降解菌共代谢基质对环境造成的二次污染问题，故本发明提供的降解2-氯苯酚的光合细菌不会造成二次污染。
实施例：
实施例1：
一株可降解2-氯苯酚的光合细菌的制备方法包括：
1、富集培养基的配制：
将(NH4)2SO4 1.0克，CH3COONa 3.5克，Mg2SO4 0.1克，CaSO4 0.1克，KH2PO4 0.6克，K2HPO4 0.4克，酵母膏0.1克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10％的NaOH和10％的HCl调节pH 7.0，搅拌均匀，即配得光合细菌的富集培养基。
2、光合细菌的富集培养：
将富集培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌，然后取农药厂排污口下游水体浅层底泥样品2克置于250毫升无菌具塞细颈瓶中，添加含2-氯苯酚质量浓度为25毫克/升的灭菌后富集培养基100毫升。盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中，在光照度为3250勒克斯，温度为30℃，厌氧条件下培养至出现红色，获得光合细菌富集培养菌悬液a。
3、降解2-氯苯酚的光合细菌的强化驯化：
从变至红色的富集培养菌悬液a中取5毫升，接入95毫升含2-氯苯酚质量浓度为75毫克/升的新鲜无菌富集培养基中，在光照度为3430勒克斯，温度为30℃，厌氧条件下培养至红色，由此得到第一次强化驯化培养液b1。依次提高富集培养基中2-氯苯酚的质量浓度，分别为50，100，150，200，250，300，320毫克/升，按照上述方法连续培养7个周期，此时得到7次强化驯化培养液b7。
4、分离可降解2-氯苯酚的光合细菌：
富集培养基中加入2.5％的琼脂，灭菌后倒入直径为9厘米的培养皿中，冷却后制得固体分离培养基平板。取1毫升7次强化驯化培养液b7滴到固体分离培养基平板上，用无菌三角刮刀涂布。在培养皿盖内侧放入0.2克焦性没食子酸和2毫升质量百分浓度为50％的过饱和Na2CO3溶液作为吸氧剂，将涂布后的固体分离培养基平板倒扣至盖内。用融化后的固体石蜡+液体石蜡按配比1∶1进行培养皿边缘密封。将密封后的培养皿倒置暗处2小时后拿出，再倒置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中，于光照度为3430勒克斯，温度为30℃条件下光照厌氧培养。当厌氧培养7天后，平板上长出红紫色的小型菌落，挑取单个菌落重复划线分离多次，直至镜检观察细胞形态一致，此时认为获得纯菌。
5、光合细菌的扩大培养：
挑取上述固体分离培养基平板上的各红色单菌落，分别用含2-氯苯酚浓度为100毫克/升的富集培养基进行扩大培养。培养7天后，培养瓶中的菌液都变为红色，由此得到各菌体的扩大培养液d。
6、筛选菌株：
测定各个菌株的扩大培养液d中2-氯苯酚的质量浓度，选择2-氯苯酚质量浓度最低的扩大培养液中的菌株作为后续研究对象。菌株编号为1D。其中，采用日立(Hitachi)L-2000型高效液相色谱仪测定2-氯苯酚的分析条件为：C18反相柱(4.6mm×200mm)，柱温30℃；紫外检测器检测波长273nm；流动相为甲醇45％，高纯水55％；流速1.0mL/min；进样量25μL。采用Anke TGL-16GB高速离心机将PSB-1D培养液于10000r/min高速离心10min，取上清液经0.22μm微滤膜过滤后进行测定。
7、紫外诱变：
培养70小时的编号为1D的菌株培养液以10000转/分钟的转速离心5分钟，倾去上清液，菌体打散后加入无菌生理盐水，离心后倾去上清液。离心菌体中加入无菌生理盐水，将其浓度调整至每毫升108个左右，由此制得菌悬液e。移取5毫升菌悬液e到直径9厘米的培养皿内，放入灭菌的搅拌转子。将培养皿置于磁力搅拌器上，18瓦紫外灯下垂直距离25厘米处照射50秒，由此得照射后菌悬液f。取0.5毫升紫外光照射后的菌悬液f涂布于固体分离培养基平板上进行厌氧光照培养，定期观察，7天后从固体平板中挑取出现较早、生长速率较快的单菌落，即得诱变菌株，编号为PSB-1D。
8、菌种鉴定：
对菌株PSB-1D的细胞形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定。测定结果表明，菌株PSB-1D属于为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。该菌株为已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。2-氯苯酚对菌株PSB-1D的安全质量浓度为75mg/L，半致死浓度96LC50为426.6mg/L。
光照厌氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的制备方法：
分别将(NH4)2SO4 0.06克，CH3CH2COONa 3.0克，MgSO4 0.122克，CaSO4 0.155克，KH2PO4 0.6克，K2HPO4 0.4克，酵母膏0.5克加入到1000毫升蒸馏水中，调节pH 7.0，搅拌均匀，即配得光照厌氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基。
将光照厌氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌。取光合细菌PSB-1D置于250毫升无菌具塞细颈瓶中，添加灭菌后富集培养基100毫升(含2-氯苯酚质量浓度为50毫克/升)。盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中进行厌氧光照培养。其中，温度30℃、pH值为7.0、光照强度为4410勒克斯的条件下培养7d对2-氯苯酚的降解率为67.6％。
黑暗好氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的制备方法：
分别将(NH4)2SO4 0.6克，葡萄糖3.0克，MgSO4 0.258克，CaSO4 0.155克，KH2PO4 0.6克，K2HPO4 0.4克，酵母膏0.2克加入到1000毫升蒸馏水中，调节pH 7.0，搅拌均匀，即配得黑暗好氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基。
将黑暗好氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌。取光合细菌PSB-1D置于250毫升无菌锥形瓶中，添加灭菌后富集培养基100毫升(含2-氯苯酚质量浓度为50毫克/升)。用黑布将锥形瓶周围包好。将锥形瓶置于HZQ-C型空气浴震荡器中进行好氧黑暗培养。其中，菌株PSB-1D在温度为30℃、pH值为7.0、摇床转速为130转/分钟的条件下培养7d对2-氯苯酚的降解率为69.4％。
实施例2
一株可降解2-氯苯酚的光合细菌的制备方法包括：
1、富集培养基的配制：
将(NH4)2SO4 2.0克，CH3COONa 0.5克，Mg2SO4 0.3克，CaSO4 0.2克，KH2PO4 0.2克，K2HPO4 1克，酵母膏1克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10％的NaOH和10％的HCl调节pH 7.5，搅拌均匀，即配得光合细菌的富集培养基。
2、光合细菌的富集培养：
将富集培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌，然后取农药厂排污口下游水体浅层底泥样品2克置于250毫升无菌具塞细颈瓶中，添加含2-氯苯酚质量浓度为25毫克/升的灭菌后富集培养基100毫升。盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中，在光照度为4470勒克斯，温度为35℃，厌氧条件下培养至出现红色，获得光合细菌富集培养菌悬液a。
3、降解2-氯苯酚的光合细菌的强化驯化：
从变至红色的富集培养菌悬液a中取5毫升，接入95毫升含2-氯苯酚质量浓度为75毫克/升的新鲜无菌富集培养基中，在光照度为4470勒克斯，温度为35℃，厌氧条件下培养至红色，由此得到第一次强化驯化培养液b1。依次提高富集培养基中2-氯苯酚的质量浓度，分别为50，100，150，200，250，300，320毫克/升，按照上述方法连续培养7个周期，此时得到7次强化驯化培养液b7。
4、分离可降解2-氯苯酚的光合细菌：
富集培养基中加入2～3％的琼脂，灭菌后倒入直径为9厘米的培养皿中，冷却后制得固体分离培养基平板。取1毫升7次强化驯化培养液b7滴到固体分离培养基平板上，用无菌三角刮刀涂布。在培养皿盖内侧放入0.2克焦性没食子酸和2毫升质量百分浓度为50％的过饱和Na2CO3溶液作为吸氧剂，将涂布后的固体分离培养基平板倒扣至盖内。用融化后的固体石蜡+液体石蜡按配比1∶1进行培养皿边缘密封。将密封后的培养皿倒置暗处2小时后拿出，再倒置于光照培养箱中，于光照度为4470勒克斯，温度为35℃条件下光照厌氧培养。当厌氧培养7天后，平板上长出红紫色的小型菌落，挑取单个菌落重复划线分离多次，直至镜检观察细胞形态一致，此时认为获得纯菌。
5、光合细菌的扩大培养：
挑取上述固体分离培养基平板上的各红色单菌落，分别用含2-氯苯酚浓度为100毫克/升的富集培养基进行扩大培养。培养7天后，培养瓶中的菌液都变为红色，由此得到各菌体的扩大培养液d。
6、筛选菌株：
测定各个菌株的扩大培养液d中2-氯苯酚的质量浓度，选择2-氯苯酚质量浓度最低的扩大培养液中的菌株作为后续研究对象。菌株编号为1D。其中，采用日立(Hitachi)L-2000型高效液相色谱仪测定2-氯苯酚的分析条件为：C18反相柱(4.6mm×200mm)，柱温30℃；紫外检测器检测波长273nm；流动相为甲醇45％，高纯水55％；流速1.0mL/min；进样量25μL。采用Anke TGL-16GB高速离心机将PSB-1D培养液于10000r/min高速离心10min，取上清液经0.22μm微滤膜过滤后进行测定。
7、紫外诱变：
培养70小时的编号为1D的菌株培养液以10000转/分钟的转速离心5分钟，倾去上清液，菌体打散后加入无菌生理盐水，离心后倾去上清液。离心菌体中加入无菌生理盐水，将其浓度调整至每毫升108个左右，由此制得菌悬液e。移取5毫升菌悬液e到直径9厘米的培养皿内，放入灭菌的搅拌转子。将培养皿置于磁力搅拌器上，18瓦紫外灯下垂直距离25厘米处照射10～100秒，由此得照射后菌悬液f。取0.5毫升紫外光照射后的菌悬液f涂布于固体分离培养基平板上进行厌氧光照培养，定期观察，7天后从固体平板中挑取出现较早、生长速率较快的单菌落，即得诱变菌株，编号为PSB-1D。
8、菌种鉴定：
对菌株PSB-1D的细胞形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定。测定结果表明，菌株PSB-1D属于为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。该菌株为已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。2-氯苯酚对菌株PSB-1D的安全质量浓度为50mg/L，半致死浓度96LC50为345.2mg/L。
光照厌氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的制备方法：
分别将将(NH4)2SO4 0.2克，柠檬酸钠2.8克，MgSO4 0.122克，CaSO4 0.155克，KH2PO40.6克，K2HPO4 0.4克，酵母膏0.3克加入到1000毫升蒸馏水中，调节pH 7.0，搅拌均匀，即配得光照厌氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基。
将光照厌氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌。取光合细菌PSB-1D置于250毫升无菌具塞细颈瓶中，添加灭菌后富集培养基100毫升(含2-氯苯酚质量浓度为50毫克/升)。盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中进行厌氧光照培养。其中，温度25℃、pH值为8.0、光照强度为3850勒克斯的条件下培养7d对2-氯苯酚的降解率为57.2％。
黑暗好氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的制备方法：
分别将(NH4)2SO4 0.6克，CH3COONa 3.0克，MgSO4 0.258克，CaSO4 0.155克，KH2PO40.6克，K2HPO4 0.4克，酵母膏2.0克加入到1000毫升蒸馏水中，调节pH 7.0，搅拌均匀，即配得黑暗好氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基。
将黑暗好氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌。取光合细菌PSB-1D置于250毫升无菌锥形瓶中，添加灭菌后富集培养基100毫升(含2-氯苯酚质量浓度为50毫克/升)。用黑布将锥形瓶周围包好。将锥形瓶置于HZQ-C型空气浴震荡器中进行好氧黑暗培养。其中，菌株PSB-1D在温度为25℃、pH值为6.5、摇床转速为140转/分钟的的条件下培养7d对2-氯苯酚的降解率为61.9％。
实施例3
一株可降解2-氯苯酚的光合细菌的制备方法包括：
1、富集培养基的配制：
将(NH4)2SO4 1.8克，CH3COONa 2.3克，Mg2SO4 0.1克，CaSO4 0.1克，KH2PO4 0.05克，K2HPO4 0.05克，酵母膏0.5克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10％的NaOH和10％的HCl调节pH 8.0，搅拌均匀，即配得光合细菌的富集培养基。
2、光合细菌的富集培养：
将富集培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌，然后取农药厂排污口下游水体浅层底泥样品2克置于250毫升无菌具塞细颈瓶中，添加含2-氯苯酚质量浓度为25毫克/升的灭菌后富集培养基100毫升。盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中，在光照度为5520勒克斯，温度为25℃，厌氧条件下培养至出现红色，获得光合细菌富集培养菌悬液a。
3、降解2-氯苯酚的光合细菌的强化驯化：
从变至红色的富集培养菌悬液a中取5毫升，接入95毫升含2-氯苯酚质量浓度为75毫克/升的新鲜无菌富集培养基中，在光照度为5520勒克斯，温度为25℃，厌氧条件下培养至红色，由此得到第一次强化驯化培养液b1。依次提高富集培养基中2-氯苯酚的质量浓度，分别为50，100，125，175，225，275，320毫克/升，按照上述方法连续培养7个周期，此时得到7次强化驯化培养液b7。
4、分离可降解2-氯苯酚的光合细菌：
富集培养基中加入2.5％的琼脂，灭菌后倒入直径为9厘米的培养皿中，冷却后制得固体分离培养基平板。取1毫升7次强化驯化培养液b7滴到固体分离培养基平板上，用无菌三角刮刀涂布。在培养皿盖内侧放入0.2克焦性没食子酸和2毫升质量百分浓度为50％的过饱和Na2CO3溶液作为吸氧剂，将涂布后的固体分离培养基平板倒扣至盖内。用融化后的固体石蜡+液体石蜡按配比1∶1进行培养皿边缘密封。将密封后的培养皿倒置暗处2小时后拿出，再倒置于光照培养箱中，于光照度为5520勒克斯，温度为25℃条件下光照厌氧培养。当厌氧培养7天后，平板上长出红紫色的小型菌落，挑取单个菌落重复划线分离多次，直至镜检观察细胞形态一致，此时认为获得纯菌。
5、光合细菌的扩大培养：
挑取上述固体分离培养基平板上的各红色单菌落，分别用含2-氯苯酚浓度为100毫克/升的富集培养基进行扩大培养。培养7天后，培养瓶中的菌液都变为红色，由此得到各菌体的扩大培养液d。
6、筛选菌株：
测定各个菌株的扩大培养液d中2-氯苯酚的质量浓度，选择2-氯苯酚质量浓度最低的扩大培养液中的菌株作为后续研究对象。菌株编号为1D。其中，采用日立(Hitachi)L-2000型高效液相色谱仪测定2-氯苯酚的分析条件为：C18反相柱(4.6mm×200mm)，柱温30℃；紫外检测器检测波长273nm；流动相为甲醇45％，高纯水55％；流速1.0mL/min；进样量25μL。采用Anke TGL-16GB高速离心机将PSB-1D培养液于10000r/min高速离心10min，取上清液经0.22μm微滤膜过滤后进行测定。
7、紫外诱变：
培养70小时的编号为1D的菌株培养液以10000转/分钟的转速离心5分钟，倾去上清液，菌体打散后加入无菌生理盐水，离心后倾去上清液。离心菌体中加入无菌生理盐水，将其浓度调整至每毫升108个左右，由此制得菌悬液e。移取5毫升菌悬液e到直径9厘米的培养皿内，放入灭菌的搅拌转子。将培养皿置于磁力搅拌器上，18瓦紫外灯下垂直距离25厘米处照射10～100秒，由此得照射后菌悬液f。取0.5毫升紫外光照射后的菌悬液f涂布于固体分离培养基平板上进行厌氧光照培养，定期观察，7天后从固体平板中挑取出现较早、生长速率较快的单菌落，即得诱变菌株，编号为PSB-1D。
8、菌种鉴定：
对菌株PSB-1D的细胞形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定。测定结果表明，菌株PSB-1D属于为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。该菌株为已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。2-氯苯酚对菌株PSB-1D的安全质量浓度为125mg/L，半致死浓度96LC50为702.6mg/L。
光照厌氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的制备方法：
分别将(NH4)2SO4 0.4克，可溶性淀粉4.5克，MgSO4 0.122克，CaSO4 0.155克，KH2PO40.6克，K2HPO4 0.4克，酵母膏2.5克加入到1000毫升蒸馏水中，调节pH 8.0，搅拌均匀，即配得光照厌氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基。
将光照厌氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌。取光合细菌PSB-1D置于250毫升无菌具塞细颈瓶中，添加灭菌后富集培养基100毫升(含2-氯苯酚质量浓度为50毫克/升)。盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中进行厌氧光照培养。其中，温度35℃、pH值为9.0、光照强度为3390勒克斯的条件下培养7d对2-氯苯酚的降解率为57.2％。
黑暗好氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的制备方法：
分别将(NH4)2SO4 2.6克，CH3CH2COONa 2.9克，MgSO4 0.258克，CaSO4 0.155克，KH2PO40.6克，K2HPO4 0.4克，酵母膏1.2克加入到1000毫升蒸馏水中，调节pH 8.5，搅拌均匀，即配得黑暗好氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基。
将黑暗好氧条件下降解2-氯苯酚时菌株PSB-1D的培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌。取光合细菌PSB-1D置于250毫升无菌锥形瓶中，添加灭菌后富集培养基100毫升(含2-氯苯酚质量浓度为50毫克/升)。用黑布将锥形瓶周围包好。将锥形瓶置于HZQ-C型空气浴震荡器中进行好氧黑暗培养。其中，菌株PSB-1D温度25℃、pH值为8.0、摇床转速为140转/分钟的的条件下培养7d对2-氯苯酚的降解率为63.6％。
Claims (1)
1.一株降解2-氯苯酚的光合细菌的制备方法，其特征是：其制备方法包括以下步骤：
(1)、富集培养基的配制：将NH4Cl 0.5～2.5克，CH3COONa 0.5～5克，MgCl2 0.05～0.5克，CaCl2 0.05～0.5克，KH2PO4 0.2～1克，K2HPO4 0.2～1克，酵母膏0.05～2克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10％的NaOH和10％的HCl调节pH 5.0～10.0，搅拌均匀，即配得光合细菌的富集培养基；
(2)、光合细菌的富集培养：将富集培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，然后取农药厂排污口下游水体浅层底泥样品2克置于250毫升无菌具塞细颈瓶中，添加含2-氯苯酚质量浓度为25毫克/升的灭菌后富集培养基100毫升；盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX-300I-G型微电脑光照培养箱中，在光照度为1000～6000勒克斯，温度为15～40℃，厌氧条件下培养至出现红色，获得光合细菌富集培养菌悬液a；
(3)、降解2-氯苯酚的光合细菌的强化驯化：从变至红色的富集培养菌悬液a中取5毫升，接入95毫升含2-氯苯酚质量浓度为75毫克/升的新鲜无菌富集培养基中，在光照度为1000～6000勒克斯，温度为15～40℃，厌氧条件下培养至红色，由此得到第一次强化驯化培养液b1；依次提高富集培养基中2-氯苯酚的质量浓度，按照上述方法连续培养5～8个周期，直至2-氯苯酚在富集培养基中的的质量浓度达到320毫克/升，此时得到n次强化驯化培养液bn；
(4)、分离可降解2-氯苯酚的光合细菌：富集培养基中加入2～3％的琼脂，灭菌后倒入直径为9厘米的培养皿中，冷却后制得固体分离培养基平板，取1毫升n次强化驯化培养液bn滴到固体分离培养基平板上，用无菌三角刮刀涂布；在培养皿盖内侧放入0.2～1克焦性没食子酸和1～5毫升质量百分浓度为50％的过饱和Na2CO3溶液作为吸氧剂，将涂布后的固体分离培养基平板倒扣至盖内，用融化后的固体石蜡+液体石蜡按配比1∶1进行培养皿边缘密封，将密封后的培养皿倒置暗处2～5小时后拿出，再倒置于光照培养箱中，于光照度为1000～6000勒克斯，温度为15～40℃条件下光照厌氧培养；当厌氧培养5～7天后，平板上长出红紫色的小型菌落，挑取单个菌落重复划线分离多次，直至镜检观察细胞形态一致，此时认为获得纯菌；
(5)、光合细菌的扩大培养：挑取上述固体分离培养基平板上的各红色单菌落，分别用含2-氯苯酚浓度为100毫克/升的富集培养基进行扩大培养；培养7天后，培养瓶中的菌液都变为红色，由此得到各菌体的扩大培养液d；
(6)、筛选菌株：测定各个菌株的扩大培养液d中2-氯苯酚的质量浓度，选择2-氯苯酚质量浓度最低的扩大培养液中的菌株作为后续研究对象，菌株编号为1D；
(7)、紫外诱变：培养70小时的编号为1D的菌株培养液以10000转/分钟的转速离心5分钟，倾去上清液，菌体打散后加入无菌生理盐水，离心后倾去上清液；离心菌体中加入无菌生理盐水，将其浓度调整至每毫升108个左右，由此制得菌悬液e；移取5毫升菌悬液e到直径9厘米的培养皿内，放入灭菌的搅拌转子，将培养皿置于磁力搅拌器上，18瓦紫外灯下垂直距离25厘米处照射10～100秒，由此得照射后菌悬液f，取0.5毫升紫外光照射后的菌悬液f涂布于固体分离培养基平板上进行厌氧光照培养，定期观察，7天后从固体平板中挑取出现较早、生长速率较快的单菌落，即得诱变菌株，编号为PSB-1D；
(8)、菌种鉴定：对菌株PSB-1D的细胞形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定；测定结果表明，菌株PSB-1D属于为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。该菌株为已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。
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