CN104593296B - 造纸废水污灌苇田中典型细菌——纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的筛选及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株造纸废水污灌苇田中的兼性好氧典型耐碱细菌——纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1‑4的筛选及其应用。所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)WTXJ1‑4,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏日期2014年11月25日,保藏编号为CGMCC No.10053。本发明提供的菌株能耐受pH为7.0~8.6的碱度变化,并能表现出优良的CODCr和AOX降解活性和生长活性,在污灌苇田造纸废水的生物净化中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域,涉及一株造纸废水污灌苇田中的兼性好氧典型耐碱细菌的筛选及其应用。
背景技术
制浆造纸工业废水排放量巨大,仅次于化学工业和钢铁工业。制浆漂白工序产生的各种有机氯化物,包括氯酚类、氯烃类,氯苯类、氯愈创木酚和呋喃类等,此类化合物在废水当中统称可吸附有机卤素(Adsorbable Organic Halides,AOX)。由于AOX毒副作用的严重性,许多国家都对纸浆厂的AOX排放量制定了限值。
目前我国造纸工业废水排放量及COD(Chemical Oxygen Demand)排放量在我国各类工业排放量中所占比例大,造纸工业废水对水环境的污染最为严重,它不但是我国造纸工业污染防治的首要问题,也是全国工业废水进行达标处理的首要问题之一。我国造纸工业的水污染主要来自碱法(包括硫酸盐法)化学浆厂的废水,它包括蒸煮黑液和洗漂废水两部分。我国碱法纸浆产量约占化学制浆产量的90%,碱法制浆产生黑液的污染负荷约占该制浆造纸生产线产生废水总污染负荷的90%左右。
人工湿地在我国造纸废水处理中的应用越来越广泛。国内外学者对多种典型有机氯在人工湿地的去除规律进行了研究,一系列的研究成果表明,人工湿地系统对各种典型的有机氯污染物均有较好的处理效果。造纸废水的排入是芦苇湿地(苇田)生态处理系统污染的重要来源。造纸废水中有毒化学组分复杂,其主要特征是高碱度、高浓度木质素及其衍生物,很容易对苇田生物尤其是微生物的种类和数量带来较大的冲击。微生物群落是湿地生态系统的重要组成部分,对干扰敏感,能够迅速的反映生态系统过程的变化,受干扰系统中微生物多样性的变化模式可作为生态系统的敏感指标,在生态系统保护和恢复中具有重要意义。其中,数量占优势和/或种类上独特的典型微生物更能反映和代表某生态系统受不同废水污灌胁迫的生物响应特征。
座落于江苏省盐城市射阳县黄沙港镇境内的胜达集团江苏双灯纸业有限公司是中国造纸协会全国生活用纸专业委员会常委单位,是全国最大的非木材类生活用纸生产企业,拥有约3.4万亩的造纸废水芦苇湿地(苇田)生态处理系统。胜达集团江苏双灯纸业有限公司位于江苏省盐城市射阳县黄沙港镇境内,在非木材类生活用纸生产企业里规模是全国最大的,拥有约3.4万亩的造纸废水芦苇湿地(苇田)生态处理系统。该系统从2001年起已连续稳定运行12年,至2014年初响应国家生态保护号召,已停止污灌。该系统共有2个氧化塘P1–P2(P1,自2005年起已连续运行9年;P2,自2001年起连续运行9年后废弃使用,处于自然修复状态)、6个苇田F1~F6(F1:污灌12年后停止污灌1年,F2和F3:污灌10年后停止污灌1年;F4:连续污灌9年,F5:连续污灌8年,F6:连续污灌6年)和一个由3条污灌沟渠(D1–D3)和4条蓄排水沟渠(G1–G4)组成的污灌和排污水网。采用连续污灌与间歇污灌相结合的污灌方式和中间污灌扩散淹流实现不同苇田梯度污染生态处理效果。按芦苇生长周期一般每年5-6月份一次性污灌,至次年1-2月份芦苇收割期排水至该生态系统总沟渠,实现零排放。
研究污灌苇田生态系统受不同废水污灌胁迫的生物响应特征的前提是获得纯的典型优势菌株,这是本领域目前有待解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的是提供一株造纸废水污灌苇田中的典型并优势降解污灌苇田造纸废水的兼性好氧耐碱细菌及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一方面,本发明提供一株造纸废水污灌苇田中的典型的优势降解污灌苇田造纸废水的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusifornis)WTXJ1-4,其已于2014年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所),保藏编号为CGMCC No.10053。
所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4由胜达集团江苏双灯纸业有限公司海涂生态系统的苇田土壤中分离得到,具有如下生物学特征:菌落较小,圆形,光滑,隆起,边缘整齐,在培养基正、反面颜色均为乳白色。该菌细胞呈直杆状,直杆两端圆头,细胞大小约为1.4~2.8×0.5~0.8μm,长有数根鞭毛,端生Φ0.3~0.4μm短圆形芽孢。革兰氏阳性,V.P试验阳性,甲基红 试验阳性,吲哚试验阳性,能水解明胶,不能水解淀粉。
所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的16S rDNA序列(SEQ ID NO:1)如下:
SEQ ID NO:1
CGAGGCGTCACTCCATCTATATGCAAGTCGAGCGAACAGAAAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTACCCTATAGTTTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGAATAATCTCTTTTGCTTCATGGTGAAAGACTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCGCTATAGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTACAGTAGTAACTGGCTGTACCTTGACGGTACCTTATTAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGTTGACCACTGTAGAGATATAGTTTCCCCTTCGGGGGCAACGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGATACAAACGGTTGCCAACTCGCGAGAGGGAGCTAATCCGATAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAG TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGATAGATGATTGGGGGATGTATAGTTTT
实验证明,所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4能优势降解污灌苇田造纸废水中的CODCr和AOX。
因此,另一方面,本发明提供纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在降解污灌苇田造纸废水中的用途。
其中,所述降解污灌苇田造纸废水包括,将所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4直接接种于污灌苇田造纸废水中进行培养。
优选地,所述污灌苇田造纸废水的CODCr为5.0×102~3.0×103mg/L,优选为5.0×102~2.0×103mg/L,更优选为8.0×102~1.5×103mg/L,进一步优选1.0×103~1.2×103mg/L。
所述污灌苇田造纸废水的pH为7.0~8.6,优选为7.5~8.6,进一步优选8.0。
优选地,所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的接种量1.0×107~8.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水,优选为2.0×107~5.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水,更优选为3.0×107~4.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水。
在废水中培养菌株使其发挥作用时,本发明菌株的培养条件为30~37℃,120~160r/min;培养液的瓶装量为30~40%(V/V)。
又一方面,本发明提供一种降解污灌苇田造纸废水的方法,所述方法包括,将所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4接种于污灌苇田造纸废水中进行培养。
优选地,所述污灌苇田造纸废水的CODCr为5.0×102~3.0×103mg/L,优选为5.0×102~2.0×103mg/L,更优选为8.0×102~1.5×103mg/L,进一步优选1.0×103~1.2×103mg/L。所述污灌苇田造纸废水的pH为7.0~8.6,优选为7.5~8.6,进一步优选为8.0。
优选地,所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的接种量为1.0×107~8.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水,优选为2.0×107~5.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水,更优选为3.0×107~4.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水;培养条件为30~37℃,120~140r/min,培养液的瓶装 量为30~40%(V/V)。
再一方面,本发明提供所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在制备用于治理污灌苇田造纸废水的生物降解剂中的用途。
还一方面,本发明提供所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在构建降解污灌苇田造纸废水的工程菌中的用途。
本发明获得了一株能在污灌苇田造纸废水中生存并有良好CODCr和AOX降解能力的细菌。对于污灌苇田造纸废水(CODCr为3.0×103mg/L,AOX为11.7mg/L,氨氮含量为27.8mg/L,亚硝酸盐氮含量为0.003mg/L,硝酸盐氮含量为116.2mg/L,固体悬浮物含量为49.1mg/L,pH为8.6),实验证明,本发明提供的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4能在未经稀释以及1倍、2倍、3倍和4倍稀释的该废水中生长,并显著降低该废水的CODCr和AOX,由此证明该菌株可以耐受pH为7.0~8.6的碱度变化,并能表现出优良的CODCr和AOX降解活性和生长活性。并且对于该污灌苇田造纸废水的2倍稀释水,其中,纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在好氧条件下的CODCr和AOX降解率均为最高,分别为71.8%和62.8%;在厌氧条件下,CODCr和AOX降解率分别为67.4%和55%。这说明,在高碱度条件以及厌氧或好氧条件下,纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4均表现出了优良的CODCr和AOX降解活性。因此,作为优势降解污灌苇田造纸废水的兼性好氧耐碱细菌,纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在污灌苇田造纸废水的生物净化中具有良好的应用前景。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1为TEM电镜下纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的鞭毛(×23000)。
图2为TEM电镜下纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的芽孢(×18500)。
图3为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的系统发育树。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解,这些实施例仅用于说明本发明,其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等,如无特殊说明,均为市售购买产品。 其中,污灌苇田造纸废水和土(泥)样均采自胜达集团江苏双灯纸业有限公司。
实施例1 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的分离、纯化及鉴定
1.分离及纯化
试验土样采样:用专门的植物根系采样器(购自荷兰Eijkelkamp公司)采集苇田土壤。随机选取芦苇若干株,连根带土缓缓提出,剪切除去茎部,称重,在一个大的塑料袋中缓缓抖落根围土壤,至土壤重量剩下1/5,即为根际土壤,而其余的4/5即为本体土壤,用植物根系采样器采集本体土壤作为试验土样。土样封装于45ml无菌取样管中,置于4℃冰箱保存。
土样菌悬液制备:称取土样10g,放入装有玻璃珠的500mL锥形瓶中,向其中加入150ml双蒸水,振摇约2h,使土样与水充分混合,形成土样菌悬液。
典型微生物的分离纯化:采用涂布分离法进行计数和初步分离,适当稀释土样菌悬液,分别接种在牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和马丁氏培养基上进行好氧和厌氧培养。细菌于37℃培养24h,放线菌于28℃培养5~7d,真菌于28℃培养3~4d。挑选菌落数在50-250个的平板进行计数,选取数量多且在6个苇田F1~F6中分布广的菌落作为造纸废水污灌苇田中的典型微生物。采用划线分离法对初步分离的典型微生物单菌落逐个反复划线或涂布,最终获得菌落纯的好氧和厌氧的细菌、放线菌和真菌的典型菌株共157株。其中,命名为“WTXJ1-4”的一株细菌数量最多,在F1中达最大,为1.1×107个菌株/g土样;分布也较广,在造纸废水污灌年份较长的F1~F4中均有分布。因此,WTXJ1-4菌株为造纸废水污灌苇田中的一株能够适应该污灌造纸废水的典型细菌。
2.鉴定
对筛选出的WTXJ1-4菌株进行形态学观察(菌落形态和细胞形态、特殊构造),同时委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rDNA序列分析,测序结果见序列表中的SEQ ID NO:1。
形态学观察发现,菌株WTXJ1-4的菌落较小,圆形,光滑,隆起,边缘整齐,在培养基正、反面颜色均为乳白色。该菌细胞呈直杆状,直杆两端圆头,细胞大小约为1.4~2.8×0.5~0.8μm,长有数根鞭毛,端生Φ0.3~0.4μm短圆形芽孢,进一步的生理生化鉴定试验和结果包括,菌株的革兰氏阳性,V.P试验阳性,甲基红试验阳性,吲哚试验阳性,能水解明胶,不能水解淀粉。委托南京农业大学生命科学实验中心通过Tecnai-12透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察WTXJ1-4的细胞形态、鞭毛和芽孢,见图1和图2。
获得WTXJ1-4的16S rDNA序列,将其与Genbank中的基因序列进行同源性比较,发现其属于赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)属,然后通过建立系统发育树(图3),发现WTXJ1-4可能为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)。结合形态学观察(图1和图2)和生理生化试验结果,最终确定WTXJ1-4为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)。
3.兼氧性
将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4涂布于牛肉膏蛋白胨或LB营养琼脂培养基上,分别于28~30℃的生化好氧培养箱中和厌氧培养箱中培养1~2天,每天观察菌落和菌苔的生长情况。结果表明,纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在好氧和厌氧条件下均能正常生长,因此,确定纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4为兼氧菌。
实施例2纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在有氧和无氧条件下的耐碱性和污灌苇田造纸废水降解作用
取污灌苇田造纸废水,该废水的CODCr为3.0×103mg/L,AOX为11.7mg/L,氨氮含量为27.8mg/L,亚硝酸盐氮含量为0.003mg/L,硝酸盐氮含量为116.2mg/L,固体悬浮物含量为49.1mg/L,pH为8.6。
将该废水稀释1倍、2倍、3倍和4倍,得到1/2倍原水、1/3倍原水、1/4倍原水和1/5倍原水,与未经稀释的废水(1倍原水)作为培养液。将实施例1获得的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4用无菌水稀释成适当浓度的菌悬液,分别接种于100mL得到的不同稀释液以及未经稀释的废水中,使WTXJ1-4的接种量为3.25×107个菌株/ml培养液,然后分别于35℃水浴恒温振荡器培养4天,测定培养液中pH、CODCr、AOX、CODCr降解率(%)和AOX降解率(%)。所做培养分成有氧组和无氧组,其中有氧组为150r/min振荡培养,培养液的瓶装量为35%(V/V),无氧组为在培养液表面加约1cm的液体石蜡,其它条件与有氧组相同。
上述实验平行进行2组,分别为试1和试2,同时将不接种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的培养液作为空白,结果如表1所示。
表1Lysinibacillus fusiformis WTXJ1-4培养4天的试验结果
结果表明,纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在未经稀释与稀释1倍、2倍、3倍和4倍的污灌苇田造纸废水中均能正常生长,并分别保持36.3%~71.8%和38%~62.8%的较高CODCr降解率和AOX降解率。其中在经2倍稀释的该污灌苇田造纸废水培养液中,CODCr降解率和AOX降解率均最高。在好氧条件下,CODCr降解率达71.8%,AOX降解率达62.8%;在厌氧条件下,CODCr降解率达67.4%,AOX降解率达55%。这说明,在高碱度条件以及厌氧或好氧条件下,纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的确可以耐受pH为7.0~8.6的碱度变化,并表现出了优良的CODCr和AOX降解活性。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明,本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (28)
1.一株能够降解污灌苇田造纸废水的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)WTXJ1-4,其保藏编号为CGMCC No.10053。
2.根据权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在降解污灌苇田造纸废水中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述降解污灌苇田造纸废水包括,将所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4直接接种于污灌苇田造纸废水中进行培养。
4.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的CODCr为5.0×102~3.0×103mg/L。
5.根据权利要求4所述的用途,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的CODCr为5.0×102~2.0×103mg/L。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的CODCr为8.0×102~1.5×103mg/L。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的CODCr为1.0×103~1.2×103mg/L。
8.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的pH为7.0~8.6。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的pH为7.5~8.6。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的pH为8.0。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的用途,其特征在于,所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的接种量为1.0×107~8.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水。
12.根据权利要求11所述的用途,其特征在于,所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的接种量为2.0×107~5.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水。
13.根据权利要求12所述的用途,其特征在于,所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的接种量为3.0×107~4.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水。
14.根据权利要求3所述的用途,其特征在于,培养条件为30~37℃,120~160r/min;培养液的瓶装量为30~40%(V/V)。
15.一种降解污灌苇田造纸废水的方法,其特征在于,所述方法包括,将权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4接种于污灌苇田造纸废水中进行培养。
16.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的CODCr为5.0×102~3.0×103mg/L。
17.根据权利要求16所述的方法,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的CODCr为5.0×102~2.0×103mg/L。
18.根据权利要求17所述的方法,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的CODCr为8.0×102~1.5×103mg/L。
19.根据权利要求18所述的方法,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的CODCr为1.0×103~1.2×103mg/L。
20.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的pH为7.0~8.6。
21.根据权利要求20所述的方法,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的pH为7.5~8.6。
22.根据权利要求21所述的方法,其特征在于,所述污灌苇田造纸废水的pH为8.0。
23.根据权利要求15至22中任一项所述的方法,其特征在于,所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的接种量为1.0×107~8.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水。
24.根据权利要求23所述的方法,其特征在于,所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的接种量为2.0×107~5.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水。
25.根据权利要求24所述的方法,其特征在于,所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4的接种量为3.0×107~4.0×107个菌株/ml所述污灌苇田造纸废水。
26.根据权利要求15所述的方法,其特征在于,培养条件为30~37℃,120~160r/min;培养液的瓶装量为30~40%(V/V)。
27.权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在制备用于治理污灌苇田造纸废水的生物降解剂中的用途。
28.权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌WTXJ1-4在构建用于降解污灌苇田造纸废水的工程菌中的用途。
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