CN106591180B - 复合微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用，属于废气生物净化技术领域。复合微生物菌剂制备方法包括：将氯苯降解专性菌和混合菌种按质量比0.5‑1:1混合后得复合菌种，接种、发酵复合菌种至发酵液的活菌数为1.0×1010‑1.0×1011cfu/mL；将发酵液与固体载体材料按质量百分比1:1‑10混合得复合微生物菌剂，混合菌种驯化自石化厂污水处理站曝气池内的活性污泥。氯苯降解专性菌为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，其生物保藏编号为：CGMCC No.10053。该制备方法简单、易操作，经此方法得到的复合微生物菌剂可直接用于废气生物处理系统的启动，对氯苯废气降解效果好且易保存、携带方便。

Description

复合微生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及废气生物净化技术领域，且特别涉及一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
据报道，每年约有150万吨的氯苯类有机化合物释放到大气中。美国环保局(EPA)公布的129种优先控制污染物名单中，氯苯类有机化合物占一半以上。我国也将氯苯列为重点污染物的黑名单之中。大部分氯苯类有机化合物是有毒性的，另有一部分被认为具有致癌、致畸、致突变的三致效应。致癌的氯苯类化合物并没有安全阈值剂量，这样说来，一旦暴露其中，不管多小的剂量，都预示着会产生一定的风险。根据国际科学学院的报道，氯苯类有机化合物的释放还会提高大气中红外线的吸收和发射。而一旦地球上的热量散失变得迟钝，地球的温度以及气候就会相应的受到影响。因此，研发氯苯废气的污染控制技术显得十分重要和迫切。目前，生物降解技术是净化这类物质的有效方法之一。
现阶段，实际应用的废气生物降解系统多直接采用活性污泥为接种微生物启动反应器。活性污泥接种前一般要经过较长时间的驯化，培养出具有较高降解目标污染物的能力后，再进行生物处理系统接种。通常存在微生物驯化周期长、技术要求高、废气生物处理系统启动时间长、启动期去除效率低、运行不稳定等缺点，特别是在针对难溶难降解废气的生物净化过程中，此类问题尤为突出。此外，污泥活性不易保存，携带、运输不便。
废气生物降解系统中，能否接种降解能力强、活性高的微生物是废气生物处理系统迅速完成启动，并成功运行的关键。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂可直接应用于处理废气，对氯苯废气降解效果好且易保存、携带方便。
本发明的第二目的在于提供一种上述复合微生物菌剂的制备方法，此制备方法简单，易操作。
本发明的第三目的在于提供上述复合微生物菌剂在降解氯苯废气中的应用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种复合微生物菌剂，其包括固体载体，还包括氯苯降解专性菌和混合菌种，氯苯降解专性菌与混合菌种的质量比为0.5-1:1，混合菌种驯化自石化厂污水处理站曝气池内的活性污泥。该复合微生物菌剂可应用于降解氯苯废气领域。氯苯降解专性菌的生物保藏编号为：CGMCC No.10053，该专性菌于2014年11月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所。
本发明还提出一种复合微生物菌剂的制备方法，其包括以下步骤：
将氯苯降解专性菌和混合菌种按质量比0.5-1:1混合后得复合菌种，接种、发酵复合菌种至发酵液的活菌数为1.0×1010-1.0×1011cfu/mL；将发酵液与固体载体材料按质量百分比1:1-10混合得复合微生物菌剂，混合菌种驯化自石化厂污水处理站曝气池内的活性污泥。
本发明实施例的复合微生物菌剂及其制备方法和应用的有益效果是：通过将氯苯降解专性菌和混合菌种混合，丰富了复合菌剂所包含的有效菌种；专性菌和混合菌以质量比0.5-1:1混合，使混合后的复合菌种对氯苯的降解效果达到最佳；复合菌种发酵后的发酵液中活菌数为1.0×1010-1.0×1011cfu/mL，保证了活菌的数量，不仅提高了降解率还缩短了降解所需的时间；将发酵液与固体载体材料按质量百分比1:1-10混合，可以便于使用并利于该产品的长期贮存。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的生物保藏信息及存活证明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的复合微生物菌剂及其制备方法和应用进行具体说明。
本发明实施例提供的用于降解氯苯废气的复合微生物菌剂，以Lysinibacillu属的氯苯降解专性菌和具有氯苯高降解活性的混合菌种混合发酵后，将所得的发酵液再与固体载体材料混合而得。
其中，本发明实施例中的Lysinibacillu属的氯苯降解专性菌分离自长期运行处理氯苯废气的生物滴滤塔，具体的，该氯苯降解专性菌筛选于附着在生物滴滤塔填料表面的生物膜。经鉴定，本发明实施例中氯苯降解专性菌属于Lysinibacillus属，其分类命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)，并于2014年11月25日在位于北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.10053。本实施例所用的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的生物保藏信息以及存活证明请参见图1。该纺锤形赖氨酸芽孢杆菌具有如下生物学特性：菌落较小，圆形，光滑，隆起，边缘整齐。其菌细胞呈直杆状，直杆两端圆头，细胞大小约为1.4-2.8×0.5-0.8μm，长有数根鞭毛，端生Φ0.3～0.4μm短圆形芽孢。革兰氏阳性，V.P试验阳性，甲基红试验阳性，吲哚试验阳性，能水解明胶，不能水解淀粉。
该纺锤形赖氨酸芽孢杆菌具体筛选过程如下：
为了提高筛选效率，筛选例如可以包括初筛和复筛。其中初筛通常是从大量的菌落中随机挑取部分菌落进行试验并通过检测得到一些较优菌株，删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产形状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不至于漏网，该筛选类型主要以量为主，精确性为次；复筛则是将初筛得到的较优菌株再进行多次试验，验证其效价和传代稳定性，从而从中得到一两个或少数几个最优的菌株，该筛选类型主要以质为主。本发明实施例中的初筛例如可优选采用快速耗时短的无菌滤纸片平板法，该方法通常是将饱浸含有某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化，进而可以通过指示剂变色圈与菌落直径之比了解菌株的相对产量性状。具体的，本发明实施例中优选取1mL稀释后的富集培养液涂布于无机盐培养基上于30-45℃条件下培养1-5d，将长出的菌落逐一挑入事先装有约100-200μL无机盐培养基的96孔平板上，培养0.5-3d后，用4-8mm无菌滤纸片吸收培养液后贴于鉴别培养基上，每皿均匀地贴3-7个，于30-45℃条件下培养0.5-3d，向滤纸片上滴加0.5-1.5mol/L的AgNO3溶液，根据滤纸片周围生长圈和显色圈大小，判断菌株的降解能力，挑取3-5株降解能力较大者作为初筛菌。其中，无机盐培养基例如可以包括质量比为3-5:1-3:1.5-3:0.1-0.3:0.03-0.08:0.005-0.015:0.01-0.05的K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O。此外，向该培养基中加入作为唯一碳源和能源的氯苯以使该培养基中的碳、氮、磷的质量比为90-110:3-7:1。富集培养基优选分别在多个1L的无机盐培养基中加入不同质量的氯苯，分别为250mg、500mg、1000mg、1500mg、2000mg，经阶梯型的富集筛选，可以筛选出耐性不等的菌株，使耐性不高但有潜在使用前景的菌株不至于被遗漏。鉴别培养基优选是在1L无机盐培养基中添加1500-2500mg氯苯和10-20g琼脂，该培养基通过在无机盐培养基中加入特殊的化学物质氯苯后再加入指示剂AgNO3溶液，因不同菌种对氯苯的分解能力不同，从而可以根据生长圈和显色圈的不同鉴别和区分目标菌和杂菌。
然后，将初筛后所得的初筛菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于25-37℃的生化培养箱中培养活化24-36h，活化时间可通过观察微生物的生长情况确定，必要时可进行多次活化。将活化后的菌落制成菌悬液，具体的，可以是在紫外超净工作台下将少量无机盐培养基倒入培养皿中，优选的达到培养皿一半即可；然后采用涂布法将牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落接种于无机盐培养基中，并加入适量的氯苯作为菌株唯一的碳源和能源；较佳的，于25-37℃条件下以100-200r/min的转速在空气浴恒温振荡器中振荡3-5d，得到氯苯降解菌悬液。用平板菌落计数法计数后例如可以以体积比1:5-15将菌悬液接种于100-500mL发酵培养基中，于30-45℃的条件下水浴恒温振荡器发酵培养3-5d。该发酵培养基可以是在1L的无机盐培养基中添加1000-2000mg氯苯。以不含菌悬液的发酵培养基为空白对照，测定发酵培养基中氯苯含量，选单位细胞对氯苯降解率最高的菌株作为复筛菌也即纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，优选的，置于-60--80℃的条件下超低温保存。经测定，本发明实施例所筛选出的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的活菌的数量为108-109cfu/mL。
此外，本发明实施例中混合菌种是以含有氯苯的污泥培养基驯化取自石化厂污水处理站曝气池内的活性污泥所得，该石化厂污水处理站例如可以是盐城德利化工有限公司的污水处理厂。其驯化培养通过以下方式进行：
将取自石化厂污水处理站曝气池内的活性污泥置于容器中进行曝气，向容器中添加氯苯乳化液至容器内液体驯化污泥中的氯苯质量浓度优选为1500-2000mg/L；此外，向容器内添加葡萄糖和氮磷无机营养液，使得容器内作为共代谢基质的葡萄糖与氯苯乳化液的质量浓度比优选为1:300-400，并使容器内液体中碳、氮、磷的质量比为90-110:3-7:1。待容器内氯苯去除率达90％以上，驯化结束；将驯化后的活性污泥置于污泥培养基中培养得到具有氯苯高降解活性的混合菌种。其中，污泥培养基例如可以包括质量比为3-5:1-3:1.5-3:0.1-0.3:0.03-0.08:0.005-0.015:0.01-0.05的K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O。此外，还可以向该培养基中加入作为唯一碳源和能源的氯苯以使该培养基中的碳、氮、磷的质量比为90-110:3-7:1，调节其pH至6.8-7.0。经测定，本发明实施例所筛选出的混合菌种的活菌数量为108-109cfu/mL。
将以上纺锤形赖氨酸芽孢杆菌和混合菌种按质量比0.5-1:1混合，得复合菌种。将该复合菌种接种于发酵装置如发酵罐中发酵。发酵例如可以包括以下步骤：于发酵装置中加入占其总体积50-70％的培养基。
该培养基例如可以包括质量比为8-12:3-7:3-7:3-7:3-7:3-5:1-3:1.5-3:0.1-0.3:0.03-0.08:0.005-0.015:0.01-0.05的葡萄糖、淀粉、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，调节其pH为6.8-7.0。将复合菌种按体积比0.5-1:100接种于培养基中，以与发酵液体积比为0.8-1:1-1.5通入空气，以150-200rpm转速进行搅拌发酵。作为优选的，发酵过程中发酵温度控制为34-36℃，发酵压力控制在0.03-0.05MPa，在此参数范围内，发酵效果最佳。本发酵过程以纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的菌数不低于总菌数的50％且发酵液的活菌数在1.0×1010-1.0×1011cfu/mL之间作为发酵终点。
然后，将复合菌种的发酵液与固体载体材料按质量百分比1:1-10混合得复合微生物菌剂，该固体载体材料例如可以包括质量比为10-15:65-85:10-25:5-10的葡萄糖、麦麸、木屑和生物活性碳，为了使固体载体材料与复合微生物菌剂能充分混合，该固体载体材料的平均粒度优选为小于60目。
为了便于携带和使用，可将复合微生物采用低温抽湿后再于无菌条件下风干至其水分含量为25-35％，且松散不易结块。进一步的，可以对该复合微生物菌剂进行粉碎和分装，粉碎粒度例如可以小于60目，为了保证菌种存活率，包装物优选为透气性好的包装材料。
为了保证该复合微生物菌剂对氯苯废气具有较好的降解效果，本发明实施例中所制备出的复合微生物菌剂的含菌量优选为大于等于1.0×1010cfu/g。此外，经验证，本发明实施例中所制备出的复合微生物菌剂在室温(25-40℃)保存3个月后每克微生物菌剂中活菌总数不少于1.0×109cfu/g，说明本发明实施例所提供的制备方法简单并高效可行。
上述制备得到的复合微生物菌剂可以用于氯苯废气的降解，其中氯苯废气例如可以是一氯苯、间二氯苯、对二氯苯、1,2,4-三氯苯和六氯苯等，复合微生物菌剂可以将氯苯废气降解为二氧化碳、水、无机盐和生物质等无害或少污染的物质。
本发明实施例所制得的复合微生物菌剂的使用方法例如可以为：打开包装将菌剂加入培菌装置中进行扩增培养，将培养好的复合微生物菌剂加入废气生物处理系统的喷淋液槽，通过喷淋系统循环淋洒于生物填料上，即可完成废气生物处理装置快速启动。因此，本发明实施例中的复合微生物菌剂可直接应用于废气生物处理系统的启动且使用方便。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
向5个1L的无机盐培养基中分别加入250mg、500mg、1000mg、1500mg、2000mg的氯苯作为富集培养基，其中无机盐培养基包括质量比为3:1:1.5:0.1:0.03:0.005:0.01的K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，并向其中加入氯苯使该培养基中碳、氮、磷的质量比为90:3:1；分别取1mL上述富集培养基中的富集培养液涂布于无机盐培养基中并加入分离自生物滴滤塔填料表面的生物膜的菌株，于30℃条件下培养1d，将长出的菌落挑入装有100μL无机盐培养基的96孔平板上，培养0.5d后，用4mm的无菌滤纸片吸收培养液后贴于鉴别培养基上，该鉴别培养基是通过在1L无机盐培养基中添加1500mg氯苯和10g琼脂形成，每皿贴3个，于30℃条件下培养0.5d，向滤纸片上滴加0.5mol/L的AgNO3溶液，挑选3株降解氯苯能力较强的菌为初筛菌。将初筛菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于25℃的生化培养箱中培养活化24h，在紫外超净工作台下倒入体积为培养皿一半的无机盐培养基，采用涂布法将牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落接种于无机盐培养基中，加入适量的氯苯于25℃条件下以100r/min的转速在空气浴恒温振荡器中振荡3d，得到氯苯降解菌悬液。以体积比1:5将菌悬液接种于100mL发酵培养基中，于30℃的条件下水浴恒温振荡器发酵培养3d，该发酵培养基是在1L的无机盐培养基中添加1000mg氯苯形成。选择单位细胞对氯苯降解率最高的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌作为复筛菌并置于-60℃的条件下超低温保存，该复筛菌的活菌的数量为108cfu/mL。
将取自石化厂污水处理站曝气池内的活性污泥置于容器中进行曝气，向容器中添加氯苯乳化液至容器内液体驯化污泥中的氯苯质量浓度为1500mg/L；向容器内添加葡萄糖和氮磷无机营养液，使容器内的葡萄糖与氯苯乳化液的质量浓度比为1:300，容器内液体中碳、氮、磷的质量比为90:3:1。待容器内氯苯去除率达95％，驯化结束；将驯化后的活性污泥置于污泥培养基中培养得到混合菌种。其中，污泥培养基包括质量比为3:1:1.5:0.1:0.03:0.005:0.01的K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，该培养基中还加入氯苯以使该培养基中的碳、氮、磷的质量比为90:3:1，调节其pH至6.8，该混合菌种的活菌数量为108cfu/mL。
将以上纺锤形赖氨酸芽孢杆菌和混合菌种按质量比0.5:1混合，得复合菌种。将该复合菌种接种于发酵罐中并在发酵温度为34℃，罐压为0.03MPa的条件下发酵。其中，培养基加入量为发酵罐总体积的50％，培养基包括质量比为8:3:3:3:3:3:1:1.5:0.1:0.03:0.005:0.01的葡萄糖、淀粉、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，调节其pH为6.8。将复合菌种按体积比0.5:100接种于培养基中，以与发酵液体积比为0.8:1通入空气，以150rpm转速进行搅拌发酵。以纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的菌数为总菌数的50％且发酵液的活菌数为1.5×1010作为发酵终点。
将复合菌种的发酵液与平均粒度为50目且包括质量比为10:65:10:5的葡萄糖、麦麸、木屑和生物活性碳的固体载体材料按质量百分比1:1混合得复合微生物菌剂，本菌剂含菌量为1.0×1010cfu/g，且25℃条件下保存3个月后活菌总数为1.0×1010cfu/g。将此菌剂采用低温抽湿后再于无菌条件下风干至其水分含量为25％，并将其粉碎至粒度为50目后分装。
实施例2
向5个1L的无机盐培养基中分别加入250mg、500mg、1000mg、1500mg、2000mg的氯苯作为富集培养基，其中无机盐培养基包括质量比为5:3:3:0.3:0.08:0.015:0.05的K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，并向其中加入氯苯使该培养基中碳、氮、磷的质量比为110:7:1；分别取1mL上述富集培养基中的富集培养液涂布于无机盐培养基中并加入分离自生物滴滤塔填料表面的生物膜的菌株，于45℃条件下培养5d，将长出的菌落挑入装有200μL无机盐培养基的96孔平板上，培养3d后，用8mm的无菌滤纸片吸收培养液后贴于鉴别培养基上，该鉴别培养基是通过在1L无机盐培养基中添加2500mg氯苯和20g琼脂形成，每皿贴7个，于45℃条件下培养3d，向滤纸片上滴加1.5mol/L的AgNO3溶液，挑选5株降解氯苯能力较强的菌为初筛菌。将初筛菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃的生化培养箱中培养活化36h，在紫外超净工作台下倒入体积为培养皿一半的无机盐培养基，采用涂布法将牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落接种于无机盐培养基中，加入适量的氯苯于37℃条件下以200r/min的转速在空气浴恒温振荡器中振荡5d，得到氯苯降解菌悬液。以体积比1:15将菌悬液接种于500mL发酵培养基中，于45℃的条件下水浴恒温振荡器发酵培养5d，该发酵培养基是在1L的无机盐培养基中添加2000mg氯苯形成。选择单位细胞对氯苯降解率最高的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌作为复筛菌并置于-80℃的条件下超低温保存，该复筛菌的活菌的数量为109cfu/mL。
将取自石化厂污水处理站曝气池内的活性污泥置于容器中进行曝气，向容器中添加氯苯乳化液至容器内液体驯化污泥中的氯苯质量浓度为2000mg/L；向容器内添加葡萄糖和氮磷无机营养液，使容器内的葡萄糖与氯苯乳化液的质量浓度比为1:400，容器内液体中碳、氮、磷的质量比为110:7:1。待容器内氯苯去除率达98％，驯化结束；将驯化后的活性污泥置于污泥培养基中培养得到混合菌种。其中，污泥培养基包括质量比为5:3:3:0.3:0.08:0.015:0.05的K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，该培养基中还加入氯苯以使该培养基中的碳、氮、磷的质量比为110:7:1，调节其pH至7.0，该混合菌种的活菌数量为109cfu/mL。
将以上纺锤形赖氨酸芽孢杆菌和混合菌种按质量比1:1混合，得复合菌种。将该复合菌种接种于发酵罐中并在发酵温度为36℃，罐压为0.05MPa的条件下发酵。其中，培养基加入量为发酵罐总体积的70％，培养基包括质量比为12:7:7:7:7:5:3:3:0.3:0.08:0.015:0.05的葡萄糖、淀粉、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，调节其pH为7。将复合菌种按体积比1:100接种于培养基中，以与发酵液体积比为1:1.5通入空气，以200rpm转速进行搅拌发酵。以纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的菌数为总菌数的80％且发酵液的活菌数为5×1010作为发酵终点。
将复合菌种的发酵液与平均粒度为40目且包括质量比为15:85:25:10的葡萄糖、麦麸、木屑和生物活性碳的固体载体材料按质量百分比1:10混合得复合微生物菌剂，本菌剂含菌量为5.0×1010cfu/g，且40℃条件下保存3个月后活菌总数为1.0×109cfu/g。将此菌剂采用低温抽湿后再于无菌条件下风干至其水分含量为35％，并将其粉碎至粒度为40目后分装。
实施例3
向5个1L的无机盐培养基中分别加入250mg、500mg、1000mg、1500mg、2000mg的氯苯作为富集培养基，其中无机盐培养基包括质量比为4:2:2.2:0.2:0.05:0.01:0.03的K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，并向其中加入氯苯使该培养基中碳、氮、磷的质量比为100:5:1；分别取1mL上述富集培养基中的富集培养液涂布于无机盐培养基中并加入分离自生物滴滤塔填料表面的生物膜的菌株，于37℃条件下培养3d，将长出的菌落挑入装有150μL无机盐培养基的96孔平板上，培养1.7d后，用6mm的无菌滤纸片吸收培养液后贴于鉴别培养基上，该鉴别培养基是通过在1L无机盐培养基中添加2000mg氯苯和15g琼脂形成，每皿贴5个，于37℃条件下培养1.7d，向滤纸片上滴加1mol/L的AgNO3溶液，挑选4株降解氯苯能力较强的菌为初筛菌。将初筛菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于31℃的生化培养箱中培养活化30h，在紫外超净工作台下倒入体积为培养皿一半的无机盐培养基，采用涂布法将牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落接种于无机盐培养基中，加入适量的氯苯于31℃条件下以150r/min的转速在空气浴恒温振荡器中振荡4d，得到氯苯降解菌悬液。以体积比1:10将菌悬液接种于300mL发酵培养基中，于37℃的条件下水浴恒温振荡器发酵培养4d，该发酵培养基是在1L的无机盐培养基中添加1500mg氯苯形成。选择单位细胞对氯苯降解率最高的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌作为复筛菌并置于-70℃的条件下超低温保存，该复筛菌的活菌的数量为5.5×108cfu/mL。
将取自石化厂污水处理站曝气池内的活性污泥置于容器中进行曝气，向容器中添加氯苯乳化液至容器内液体驯化污泥中的氯苯质量浓度为2200mg/L；向容器内添加葡萄糖和氮磷无机营养液，使容器内的葡萄糖与氯苯乳化液的质量浓度比为1:350，容器内液体中碳、氮、磷的质量比为100:5:1。待容器内氯苯去除率达93％，驯化结束；将驯化后的活性污泥置于污泥培养基中培养得到混合菌种。其中，污泥培养基包括质量比为4:2:2.2:0.2:0.05:0.01:0.03的K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，该培养基中还加入氯苯以使该培养基中的碳、氮、磷的质量比为100:5:1，调节其pH至6.9，该混合菌种的活菌数量为5.5×108cfu/mL。
将以上纺锤形赖氨酸芽孢杆菌和混合菌种按质量比0.8:1混合，得复合菌种。将该复合菌种接种于发酵罐中并在发酵温度为35℃，罐压为0.04MPa的条件下发酵。其中，培养基加入量为发酵罐总体积的60％，培养基包括质量比为10:5:5:5:5:4:2:2.2:0.2:0.05:0.01:0.03的葡萄糖、淀粉、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，调节其pH为6.9。将复合菌种按体积比0.8:100接种于培养基中，以与发酵液体积比为0.9:1.3通入空气，以180rpm转速进行搅拌发酵。以纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的菌数为总菌数的60％且发酵液的活菌数为8×1010作为发酵终点。
将复合菌种的发酵液与平均粒度为30目且包括质量比为13:75:17:8的葡萄糖、麦麸、木屑和生物活性碳的固体载体材料按质量百分比1:5混合得复合微生物菌剂，本菌剂含菌量为1×1011cfu/g，且33℃条件下保存3个月后活菌总数为1.0×1011cfu/g。将此菌剂采用低温抽湿后再于无菌条件下风干至其水分含量为30％，并将其粉碎至粒度为30目后分装。
实施例4
向5个1L的无机盐培养基中分别加入250mg、500mg、1000mg、1500mg、2000mg的氯苯作为富集培养基，其中无机盐培养基包括质量比为4.35:1.7:2.1:0.2:0.05:0.01:0.03的K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，并向其中加入氯苯使该培养基中碳、氮、磷的质量比为100:5:1；分别取1mL上述富集培养基中的富集培养液涂布于无机盐培养基中并加入分离自生物滴滤塔填料表面的生物膜的菌株，于37℃条件下培养2d，将长出的菌落挑入装有130μL无机盐培养基的96孔平板上，培养1d后，用6mm的无菌滤纸片吸收培养液后贴于鉴别培养基上，该鉴别培养基是通过在1L无机盐培养基中添加2000mg氯苯和15g琼脂形成，每皿贴5个，于37℃条件下培养2d，向滤纸片上滴加1mol/L的AgNO3溶液，挑选4株降解氯苯能力较强的菌为初筛菌。将初筛菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于30℃的生化培养箱中培养活化30h，在紫外超净工作台下倒入体积为培养皿一半的无机盐培养基，采用涂布法将牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落接种于无机盐培养基中，加入适量的氯苯于30℃条件下以150r/min的转速在空气浴恒温振荡器中振荡4d，得到氯苯降解菌悬液。以体积比1:10将菌悬液接种于250mL发酵培养基中，于37℃的条件下水浴恒温振荡器发酵培养4d，该发酵培养基是在1L的无机盐培养基中添加1500mg氯苯形成。选择单位细胞对氯苯降解率最高的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌作为复筛菌并置于-70℃的条件下超低温保存，该复筛菌的活菌的数量为5.5×108cfu/mL。
将取自石化厂污水处理站曝气池内的活性污泥置于容器中进行曝气，向容器中添加氯苯乳化液至容器内液体驯化污泥中的氯苯质量浓度为1800mg/L；向容器内添加葡萄糖和氮磷无机营养液，使容器内的葡萄糖与氯苯乳化液的质量浓度比为1:350，容器内液体中碳、氮、磷的质量比为100:5:1。待容器内氯苯去除率达98％，驯化结束；将驯化后的活性污泥置于污泥培养基中培养得到混合菌种。其中，污泥培养基包括质量比为4.35:1.7:2.1:0.2:0.05:0.01:0.03的K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，该培养基中还加入氯苯以使该培养基中的碳、氮、磷的质量比为100:5:1，调节其pH至6.9，该混合菌种的活菌数量为5.5×108cfu/mL。
将以上纺锤形赖氨酸芽孢杆菌和混合菌种按质量比0.8:1混合，得复合菌种。将该复合菌种接种于发酵罐中并在发酵温度为35℃，罐压为0.04MPa的条件下发酵。其中，培养基加入量为发酵罐总体积的60％，培养基包括质量比为10:5:5:5:5:4.35:1.7:2.1:0.2:0.05:0.01:0.03的葡萄糖、淀粉、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O，调节其pH为6.9。将复合菌种按体积比0.8:100接种于培养基中，以与发酵液体积比为0.9:1.3通入空气，以180rpm转速进行搅拌发酵。以纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的菌数为总菌数的80％且发酵液的活菌数为8×1010作为发酵终点。
将复合菌种的发酵液与平均粒度为50目且包括质量比为13:75:17:8的葡萄糖、麦麸、木屑和生物活性碳的固体载体材料按质量百分比1:1混合得复合微生物菌剂，本菌剂含菌量为1×1012cfu/g，且33℃条件下保存3个月后活菌总数为1.0×1011cfu/g。将此菌剂采用低温抽湿后再于无菌条件下风干至其水分含量为30％，并将其粉碎至粒度为50目后分装。
重复实施上述实施例1-4，制得足够多的降解氯苯废气的复合微生物菌剂，并以按上述各实施例所得的降解氯苯废气的复合微生物菌剂分别作为试验组1-4，以现有降解氯苯废气的复合微生物菌剂中的降解“三苯”VOCs废气的复合微生物菌剂为对照组，分别接种于5个相同的氯苯废气生物处理装置中并向装置中通入相同浓度的氯苯，考察反应器的启动时间及不同时间阶段反应器中氯苯的清除率，结果如表1所示：
表1反应器启动过程净化效果比较
由表1可以看出，同样的条件下，本发明实施例所制备出的降解氯苯废气的复合微生物菌剂较现有降解氯苯废气的复合微生物菌剂启动反应器的时间更短，且在同等时间阶段内对氯苯的清除率均更高，说明本发明实施例制备出的复合微生物菌剂对氯苯降解效果好。对比实施例1-4，可看出实施例4制备出的复合微生物菌剂性能更好，其原因在于本发明实施例中在制备过程中菌种筛选、培养及发酵过程中的培养基配方的配比更满足该菌种的需要且设置的培养和发酵参数适中。
综上所述，本发明实施例的降解氯苯废气的复合微生物菌剂所包含的菌种丰富、菌种数量高，降解氯苯废气效果好；该菌剂的制备方法简单、使用方便、适用范围广、成本低廉，产品贮存时间长，适合于工业化生产。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种复合微生物菌剂，包括固体载体，其特征在于，还包括氯苯降解专性菌和混合菌种，所述氯苯降解专性菌与所述混合菌种的质量比为0.5-1:1，所述混合菌种驯化自石化厂污水处理站曝气池内的活性污泥；
所述氯苯降解专性菌为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)，所述氯苯降解专性菌的生物保藏编号为：CGMCC No.10053；
驯化包括以下步骤：将取自石化厂污水处理站曝气池内的所述活性污泥置于容器中进行曝气；向所述容器中添加氯苯乳化液至所述活性污泥中的氯苯质量浓度为1500-2000mg/L；向所述容器内加入葡萄糖和氮磷无机营养液至所述容器内液体中碳、氮、磷的质量比为90-110:3-7:1，待所述容器内氯苯去除率达90％以上，驯化结束。
2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂的含菌量大于等于1.0×1010cfu/g。
3.如权利要求1-2任一项所述的复合微生物菌剂在降解氯苯废气中的应用。
4.一种复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将氯苯降解专性菌和混合菌种按质量比0.5-1:1混合后得复合菌种，接种、发酵所述复合菌种至发酵液的活菌数为1.0×1010-1.0×1011cfu/mL；将所述发酵液与固体载体材料按质量百分比1:1-10混合得复合微生物菌剂，所述混合菌种驯化自石化厂污水处理站曝气池内的活性污泥；
所述氯苯降解专性菌为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)，所述氯苯降解专性菌的生物保藏编号为：CGMCC No.10053；
驯化包括以下步骤：将取自石化厂污水处理站曝气池内的所述活性污泥置于容器中进行曝气；向所述容器中添加氯苯乳化液至所述活性污泥中的氯苯质量浓度为1500-2000mg/L；向所述容器内加入葡萄糖和氮磷无机营养液至所述容器内液体中碳、氮、磷的质量比为90-110:3-7:1，待所述容器内氯苯去除率达90％以上，驯化结束。
5.根据权利要求4所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，发酵所述复合菌种包括以下步骤：于发酵装置中加入占其体积50-70％的培养基，将所述复合菌种按体积比0.5-1:100接种于所述培养基中，并向所述发酵装置中通入与所述发酵液的体积比为0.8-1:1-1.5的空气，搅拌发酵。
6.根据权利要求5所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述培养基包括质量比为8-12:3-7:3-7:3-7:3-7:3-5:1-3:1.5-3:0.1-0.3:0.03-0.08:0.005-0.015:0.01-0.05的葡萄糖、淀粉、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、K2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、MgSO4、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2·2H2O。
7.根据权利要求4所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述固体载体材料包括质量比为10-15:65-85:10-25:5-10的葡萄糖、麦麸、木屑和生物活性碳。
8.根据权利要求4所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述固体载体材料的平均粒度小于60目。
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