ES2843634A1

ES2843634A1 - Metodo para producir biomasa de una microalga

Info

Publication number: ES2843634A1
Application number: ES202030030A
Authority: ES
Inventors: Hahnefeld Agustín Portillo; Quintana Antera Martel; Pinchetti Juan Luis Gomez
Original assignee: Universidad de las Palmas de Gran Canaria
Current assignee: Universidad de las Palmas de Gran Canaria
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2020-01-17
Publication date: 2021-07-19
Also published as: EP4092102A4; EP4092102A1; WO2021144491A1; US20230061001A1

Abstract

Método para producir biomasa de una microalga. La invención se refiere a un método para producir biomasa de una microalga, donde el método comprende cultivar la microalga en un efluente diluido en agua de mar, donde la microalga se selecciona del grupo que consiste en una cepa del género Anabaena, una cepa del género Dolichospermum, una cepa del género Chrysoreinhardia, una cepa del género Halochlorella, y combinaciones de las mismas. La invención también se refiere a un método para la remediación de un efluente, donde el método comprende cultivar una microalga de la invención en el efluente diluido en agua de mar.

Description

DESCRIPCIÓN

MÉTODO PARA PRODUCIR BIOMASA DE UNA MICROALGA

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al uso de efluentes provenientes del tratamiento de aguas residuales como fuente de nutrientes para el cultivo de microalgas.

ANTECEDENTES

La contaminación del agua es uno de los problemas más graves para nuestro planeta, lo que, unido a las limitaciones en la disponibilidad del agua en amplias zonas del planeta, puede resultaren un peligro para la salud de la población. Actualmente, en los países desarrollados todas las aguas residuales se tratan en plantas de tratamiento principales y, posteriormente, se permite su descarga en el mar o los ríos, después de una serie de complejos tratamientos de purificación. En un proceso de purificación de aguas residuales el lodo acumulado en una fase inicial de filtración se trata en digestores anaeróbicos, para reducir su volumen y toxicidad. Este proceso produce principalmente metano, lodos secos y agua de rechazo (efluente). El metano se reutiliza como fuente de energía en muchas plantas de tratamiento, el lodo seco generalmente se reutiliza como turba, pero la fracción de agua de rechazo (efluente) regresa a la planta de tratamiento para ser tratada. Este tipo de agua supone un gran problema, ya que este efluente presenta una carga contaminante muy significativa, con altas concentraciones de nitrato, amonio y fosfato, DBO y DQO, así como bacterias. La incorporación de este tipo de agua en el flujo de una planta de tratamiento de aguas residuales causa un problema severo ya que el efluente altera todos los parámetros químicos del agua tratada. Por este motivo, en algunas plantas de tratamiento se almacena hasta que se encuentran condiciones favorables para su purificación. La composición del efluente varía considerablemente de una región a otra y siempre es una función del origen del lodo que se trata. También es evidente su alta carga contaminante, altas concentraciones de amonio y bacterias, así como numerosos agentes infecciosos dañinos para la población, los animales y las plantas. Actualmente, la eliminación de sustancias contaminantes de esta agua es muy costosa y laboriosa. Sin embargo, esta agua de rechazo (efluente) se puede usar como fuente de nutrientes para el cultivo de microalgas, ya que contiene requerimientos nutricionales de algas en una proporción adecuada, además de una concentración bacteriana mucho menor ya que el efluente se obtiene típicamente en condiciones anaerobias. Además de ser útil en la purificación de estas aguas residuales, el uso de un efluente como fuente de nutrientes para el cultivo de microalgas conduce a la producción de biomasa con utilidad económica. Esta biomasa se puede usar como fuente para un fertilizante, un pesticida, un pienso, un pienso para peces, un biocombustible, un combustible para aviones, un biodiesel, un pigmento, un tensioactivo, un cosmético, un agente farmacéutico, un suplemento para la salud, o la fabricación de bioplástico. El uso del efluente del tratamiento de aguas residuales como fuente de nutrientes para la producción de biomasa de microalgas ha demostrado ser eficaz en muchos estudios recientes. Las microalgas eucariotas más frecuentemente utilizadas en el tratamiento de aguas residuales son del género Chlorella, Scenedesmus, Muriellopsis, Botryococcus y Nannochloropsis y también la cianobacteria Phormidium bohneri. Sin embargo, la concentración óptima de efluente que se puede utilizar como fuente de nutrientes en la producción de microalgas se tiene que estudiar individualmente en cada caso. Hay que tener en cuenta que la concentración de efluente varía ampliamente de una planta de tratamiento a otra. Por estos motivos, no en todos los casos la tasa de crecimiento y la robustez de los cultivos de microalgas son suficientes para ser eficientes en la purificación del agua.

Por lo tanto, la detección, bioprospección, identificación y caracterización de cepas sigue siendo uno de los objetivos fundamentales en este tipo de estudios, para buscar las tasas de producción más altas, la capacidad de eliminar nutrientes, la resistencia a los patógenos y las bacterias, y la optimización de la biomasa obtenida.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los inventores han encontrado que las cepas de microalgas eucariotas Chrysoreinhardia giraudii BEA_IDA_0071B y Halochlorella rubescens BEA_IDA_0072B, y las cepas de cianobacterias Anabaena sp BEA_IDA_0069B y Dolichospermum sp BEA_IDA_0070B presentan tasas significantes de producción de biomasa y de eliminación de contaminantes cuando se cultivan en un medio de cultivo preparado por dilución de un efluente procedente de la planta de tratamiento de Salto del Negro (Gran Canaria, España) en agua de mar al 0.5%, de tal manera que se consiguen, en el efluente diluido, concentraciones de N -nitrógeno total (amonio y nitrato) - de 106 mg/L y concentraciones de P - fósforo total (ortofosfato) - de 3.75 mg/L. Estas concentraciones resultan en un cociente N/P de 31.3.

Así, en un primer aspecto la invención se refiere a un método para producir biomasa de una microalga, donde el método comprende cultivar la microalga en un efluente diluido en agua de mar, donde la microalga se selecciona del grupo que consiste en una cepa de Anabaena, una cepa de Dolichospermum, una cepa de Chrysoreinhardia, una cepa de Halochlorella, y combinaciones de las mismas, donde el efluente diluido presenta, al inicio del cultivo:

- concentraciones de nitrógeno total (N) de 90±60 mg/L (es decir, en el rango 30-150 mg/L), preferiblemente en el rango 60-100 mg/L y más preferiblemente en el rango 70 90 mg/L;

- concentraciones de fósforo total (P) de 8±7 mg/L (es decir, en el rango 1-15 mg/L), preferiblemente en el rango 2-10 mg/L y más preferiblemente en el rango 3-6 mg/L; - siempre que el cociente N/P esté en el rango 5-40, preferiblemente en el rango 15-38 y más preferiblemente en el rango 25-35.

En un segundo aspecto la invención se refiere a un método para la biorremediación de un efluente, donde el método comprende cultivar una microalga en el efluente diluido en agua de mar, donde la microalga se selecciona del grupo que consiste en una cepa del género Anabaena, una cepa del género Dolichospermum, una cepa del género Chrysoreinhardia, una cepa del género Halochlorella, y combinaciones de las mismas, donde el efluente diluido presenta, al inicio del cultivo:

En un aspecto adicional la invención se refiere a un método para producir un extracto de biomasa de una microalga, donde el método comprende cultivar la microalga en un efluente diluido en agua de mar, donde la microalga se selecciona del grupo que consiste en una cepa del género Anabaena, una cepa del género Dolichospermum, una cepa del género Chrysoreinhardia, una cepa del género Halochlorella, y combinaciones de las mismas, donde el efluente diluido presenta, al inicio del cultivo:

- concentraciones de fósforo total (P) de 8±7 mg/L (es decir, en el rango 1-15 mg/L), preferiblemente en el rango 2-10 mg/L y más preferiblemente en el rango 3-6 mg/L; - siempre que el cociente N/P esté en el rango 5-40, preferiblemente en el rango 15-38 y más preferiblemente en el rango 25-35;

cosechar la biomasa de la microalga por filtración; someter a la biomasa de microalga a un método de ruptura celular, y obtener el extracto resultante de la ruptura celular.

En un último aspecto la invención se refiere a una biomasa de microalga obtenible mediante el método para producir biomasa de una microalga del primer aspecto de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Análisis de los componentes principales entre los parámetros principales (composición de nutrientes, cociente N/P, actividad bacteriana, salinidad, pH, conductividad, peso seco y CDOM) en medio f/2 y en los diferentes porcentajes de dilución del efluente. Figura 2. Producción (media ± DE) de las cepas cultivadas en medio limpio f/2 y en 0.5% de efluente.

Figura 3. Tasa de crecimiento bacteriano (ufc/mld) (media ± DE) para las diferentes cepas cultivadas en medio f/2 y en 0,5% de efluente.

Figura 4. CDOM (PPB) (media ± DE) para las diferentes cepas cultivadas en medio f/2 y en 0,5% de efluente.

Figura 5. Composición química de las cepas de microalgas probadas en medio limpio f/2 y en 0,5% de efluente. Los resultados se expresan como un porcentaje de la biomasa en peso seco.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Tal y como se ha explicado más arriba, los inventores han encontrado que las cepas de microalgas eucariotas Crysoreinhardia giraudii BEA_IDA_0071B y Halochlorella rubescens BEA_IDA_0072B, y las cepas de cianobacterias Anabaena sp BEA_IDA_0069B y Dolichospermum sp BEA_IDA_0070B presentan tasas eficaces de producción de biomasa y de eliminación de contaminantes cuando se cultivan en un medio de cultivo preparado por dilución de un efluente procedente de una planta de tratamiento en Gran Canaria en agua de mar al 0.5%, de tal manera que se consiguen, en el efluente diluido, concentraciones de N -nitrógeno total (amonio y nitrato) de 106 mg/L y concentraciones de P - fósforo total (ortofosfato) de 3.75 mg/L. Estas concentraciones resultan en un cociente N/P de 31.3.

Métodos de la invención

Así, en un primer aspecto la invención se refiere a un método para producir biomasa de una microalga, donde el método comprende cultivar la microalga en un efluente diluido en agua de mar, donde la microalga se selecciona del grupo que consiste en una cepa del género Anabaena, una cepa del género Dolichospermum, una cepa del género Chrysoreinhardia, una cepa del género Halochlorella, y combinaciones de las mismas, donde el efluente diluido presenta, al inicio del cultivo:

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para la biorremediación de un efluente, donde el método comprende cultivar una microalga en el efluente diluido en agua de mar, donde la microalga se selecciona del grupo que consiste en una cepa del género Anabaena, una cepa del género Dolichospermum, una cepa del género Chrysoreinhardia, una cepa del género Halochlorella, y combinaciones de las mismas, donde el efluente diluido presenta, al inicio del cultivo:

De manera general, se entiende por biomasa el material producido por el crecimiento y/o propagación de células, de microorganismos, plantas o animales. La biomasa puede contener células y/o contenido intracelular, así como material extracelular. El material extracelular incluye, pero no se limita a, compuestos secretados por una célula. En el contexto de la presente invención la biomasa es material producido por el crecimiento y/o propagación de una microalga.

De acuerdo con la presente invención, el término “microalga” se refiere de manera general a un microorganismo seleccionado de entre las microalgas eucariotas y las cianobacterias. Las microalgas eucariotas son especies unicelulares que existen individualmente, o en cadenas o grupos y que se encuentran típicamente en sistemas marinos y de agua dulce. Dependiendo de la especie, pueden tener un tamaño de entre unos pocos micrómetros (^m) hasta unos pocos cientos de micrómetros. Las microalgas eucariotas son capaces de realizar la fotosíntesis. Producen aproximadamente la mitad del oxígeno atmosférico y usan simultáneamente el dióxido de carbono del gas de efecto invernadero para crecer fotoautotróficamente. Las cianobacterias son un grupo de bacterias fotosintéticas, algunas de las cuales fijan nitrógeno, que viven en una amplia variedad de suelos húmedos y agua, ya sea libremente o en una relación simbiótica con plantas u hongos formadores de líquenes. Van desde unicelulares a filamentosos e incluyen especies coloniales. Las colonias pueden formar filamentos, láminas o incluso esferas huecas.

En los métodos de la presente invención, la microalga se selecciona del grupo que consiste en una cepa del género Anabaena, una cepa del género Dolichospermum, una cepa del género Chrysoreinhardia, una cepa del género Halochlorella, y combinaciones de las mismas. Anabaena es un género de cianobacterias del orden Nostocales, de la familia Nostocaceae. Dolichospermum es un género de cianobacterias de la familia Aphanizomenonaceae. Chrysoreinhardia es un género del orden Sarcinochrysidales y de la familia Chrysocystaceae. Halochlorella es un género de la familia Chlamydomonadales. En una realización particular de la invención la cepa del género Anabaena es una cepa de la especie Anabaena sp. En una realización particular de la invención la cepa del género Dolichospermum es una cepa de la especie Dolichospermum sp. En una realización particular de la invención la cepa del género Chrysoreinhardia es una cepa de la especie Chrysoreinhardia giraudii. En una realización particular de la invención la cepa del género Halochlorella es una cepa de la especie Halochlorella rubescens. En un modo preferido de realización, la cepa de la especie Anabaena sp es la cepa BEA_IDA_0069B. En un modo preferido de realización, la cepa de la especie Dolichospermum sp es la cepa BEA-IDA-0070B. En un modo preferido de realización, la cepa de la especie Chrysoreinhardia giraudii es la cepa BEA-IDA-0071B. En un modo preferido de realización, la cepa de la especie Halochlorella rubescens es la cepa BEA-IDA-0072B. Las cepas se han depositado en el Banco Español de Algas (Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Muelle de Taliarte, s/n, 35214 Telde, Gran Canaria, España) según los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los fines del procedimiento en materia de patentes con los números de depósito BEA IDA-0069B, BEA-IDA-0070B, BEA-IDA-0071B y BEA-IDA-0072B indicados respectivamente para cada cepa.

Los términos "cultivar una microalga" o "cultivo de microalgas" se refieren a un método o sistema para multiplicar las microalgas a través de la reproducción en un medio de cultivo predeterminado, incluso en condiciones controladas de laboratorio. El término "cultivo", y sus variantes, se refieren a fomentar intencionadamente el crecimiento (aumento en el tamaño celular, contenido celular y/o actividad celular) y/o la propagación (aumento en el número de células por mitosis) de una o más células por uso de las condiciones de cultivo previstas. La combinación de crecimiento y propagación puede denominarse proliferación. La una o más células pueden ser las de un microorganismo, como las microalgas. Los ejemplos de condiciones previstas incluyen el uso de un medio definido (con características conocidas como pH, fuerza iónica y fuente de carbono), temperatura especificada, tensión de oxígeno, niveles de dióxido de carbono y crecimiento en un biorreactor. Los cultivos de microalgas se pueden usar para multiplicar el organismo, para determinar el tipo de organismo o la abundancia del organismo en la muestra que se analiza. En medio de cultivo líquido, el término “cultivo de microalgas” generalmente se refiere al medio líquido completo y a los microorganismos en el medio líquido, independientemente del recipiente en el que reside el cultivo. Un medio líquido a menudo se denomina "medio" o "medio de cultivo". El término "inocular" se refiere a implantar o introducir microorganismos en un medio de cultivo. Inocular un cultivo de microorganismos en las condiciones de cultivo descritas a lo largo de la especificación se refiere a iniciar un cultivo de microorganismos en las condiciones de cultivo, como se usa comúnmente en la técnica del cultivo de microorganismos. Los microorganismos que se introducen en un medio de cultivo pueden denominarse semilla o inóculo. En un modo de realización particular de la presente invención, la inoculación de la microalga viva en el medio de cultivo se realiza, en términos de biomasa seca, con al menos 50 mg/L, preferiblemente con 50-90 mg/L de biomasa seca. En la presente invención, las microalgas se pueden cultivar como monocultivo, o como cocultivo. En un modo de realización el cultivo es un monocultivo. En otro modo de realización el cultivo es un cocultivo de dos, de tres o de las cuatro microalgas de la invención. El término "cocultivo" y sus variantes se refieren a la presencia de dos o más tipos de células (i.e., dos o más tipos de microalgas) en el mismo biorreactor. Las condiciones de cultivo pueden ser aquellas que fomentan el crecimiento y/o la propagación de los dos o más tipos de células o aquellas que facilitan el crecimiento y/o la proliferación de una, o un subconjunto, de las dos o más células mientras se mantiene el crecimiento celular para el resto.

El término "efluente” o "lixiviado” en el contexto de la presente invención se refiere a descargas de aguas o vertidos empleados en procesos industriales, urbanos o agrícolas. Así, la invención se puede poner en práctica con aguas residuales. Las aguas residuales son cualquier tipo de agua cuya calidad se vio afectada negativamente por influencia antropogénica. Las aguas residuales incluyen las aguas usadas, domésticas, urbanas y los residuos líquidos industriales o mineros eliminados, o las aguas que se mezclaron con las anteriores (aguas pluviales o naturales). En una realización particular de la invención, el efluente o lixiviado procede de un digestor anaeróbico de una planta de biometanización para el tratamiento de lodos de estaciones depuradoras, donde la carga contaminante presenta aproximadamente 4500 mg N-NH ⁴ +/L; aproximadamente 550 mg N-PO ⁴ 3"/L; aproximadamente 150 mg N-NO ³ -/L y aproximadamente 40000 ufc/mL.

En el contexto de la presente invención, el efluente se usa diluido en agua de mar. En un modo de realización particular, la dilución es del 50%, del 30%, del 20%, del 10%, del 5%, del 4%, del 3%, del 2%, del 1%, del 0.5%, del 0.4%, del 0.3%, del 0.2%, o del 0.1%. El efluente diluido presenta, al inicio del cultivo concentraciones de nitrógeno total (N) de 90±60 mg/L (es decir, en el rango 30-150 mg/L), preferiblemente en el rango 60-100 mg/L y más preferiblemente en el rango 70-90 mg/L; concentraciones de fósforo total (P) de 8±7 mg/L (es decir, en el rango 1-15 mg/L), preferiblemente en el rango 2-10 mg/L y más preferiblemente en el rango 3-6 mg/L. En la presente invención, el cociente N/P está en el rango 5-40, 10-39, 15-38, 16-37, 20-36, 25-35. En un modo particular de la invención, el cociente N/P está preferiblemente en el rango 15-38 y más preferiblemente en el rango 25-35. En un modo de realización particular, el medio de efluente diluido no necesita la adición de una cantidad externa de fósforo (i.e., fosfato) para corregir el cociente N/P. En un modo de realización, el medio de efluente diluido no necesita ningún aditivo externo.

En el contexto de la invención, el nitrógeno total (N) se refiere a la suma de la concentración de amonio (N-NH ⁴ +) y de la concentración de nitratos (N-NO ³ ') presentes en el efluente diluido, mientras que el fósforo total se refiere a la concentración de ortofosfato (N-PO ⁴ 3') presente en el efluente diluido. En el contexto de la invención, el cociente N/P se refiere a la ratio de la suma de la concentración de amonio y nitratos presentes en el efluente diluido dividido entre la concentración de ortofosfato presente en el efluente diluido. En un modo de realización preferido, la unidad de las concentraciones se expresa en mg/L. En un modo de realización particular, la concentración de amonio (N-NH ⁴ +) con respecto a la concentración de nitrógeno total (N) en el efluente diluido es de al menos el 50%, de al menos el 60%, de al menos el 70%, de al menos el 80%, de al menos el 90%, de al menos el 95%. En un modo de realización particular, la concentración de amonio (N-NH ⁴ +) con respecto a la concentración de nitrógeno total (N) en el efluente diluido es preferiblemente de al menos el 60% y más preferiblemente de al menos el 70%.

En el contexto de la presente invención, el término “biorremediación” se refiere a un proceso utilizado para tratar medios contaminados, en particular un efluente o agua residual, por medio de la alteración de las condiciones ambientales de tal manera que se estimula el crecimiento de microorganismos y se degradan los contaminantes diana. En la presente invención se describe el uso de las microalgas, como sistema biológico para el tratamiento de las aguas residuales o efluente debido a su capacidad de eliminar cantidades significativas de nitratos, fosfatos y materia orgánica. En muchos casos, la biorremediación es menos costosa y más sostenible que otras alternativas de remediación.

En un modo particular de realización, el método comprende además la etapa de cosechar la biomasa de la microalga por filtración. En modos particulares de realización, la filtración se realiza a través de una malla de 10 ^m, 20 ^m, 30 ^m, 40 ^m, 50 ^m, 60 ^m, 70 ^m, 80 ^m, 90 ^m, o 100 ^m. En un modo preferido de realización, la filtración se realiza a través de una malla de 50 ^m. En un modo de realización particular, la biomasa cosechada por el método de la invención se lava con una solución adecuada, por ejemplo con agua destilada o con agua MilliQ, y se seca o se liofiliza para su uso posterior.

Para inóculos de 50-90 mg/L de biomasa seca los métodos de la invención alcanzan rendimientos de producción de 5-200 mg/L d. En modos de realización particulares, el rendimiento de producción es de al menos 5 mg/L d, 10 mg/L d, 20 mg/L d, 30 mg/L d, 40 mg/L d, 50 mg/L d, 60 mg/L d, 70 mg/L d, 80 mg/L d, 90 mg/L d, 100 mg/L d, 110 mg/L d, 120 mg/L d, 130 mg/L d, 140 mg/L d, 150 mg/L d, 160 mg/L d, 170 mg/L d, 180 mg/L d, 190 mg/L d, 200 mg/L d. Para inóculos de 50-90 mg/L de biomasa seca los métodos de la invención alcanzan tasas de consumo de nutrientes de 4-30 mg/L d para nitrógeno total (N) y de 0.5-3.0 mg/L d para fósforo total (P). En modos de realización particulares, la tasa de consumo de nitrógeno total (N) es de al menos 4 mg/L d, 6 mg/L d, 8 mg/L d, 10 mg/L d, 12 mg/L d, 15 mg/L d, 20 mg/L d, 25 mg/L d, 30 mg/L d. En modos de realización particulares, la tasa de consumo de fósforo total es de al menos 0.5 mg/L d, 0.6 mg/L d, 0.7 mg/L d, 0.8 mg/L d, 0.9 mg/L d, 1.0 mg/L d, 1.2 mg/L d, 1.4 mg/L d, 1.6 mg/L d, 1.8 mg/L d, 2.0 mg/L d, 2.2 mg/L d, 2.4 mg/L d, 2.6 mg/L d, 2.8 mg/L d, 3.0 mg/L d.

En un modo particular de realización, el cultivo se realiza en condiciones ambientales de exterior. En un modo particular de realización, el cultivo se realiza en fotobiorreactores. En modos particulares de realización, el fotobiorreactor es de al menos 100 L, de al menos 200 L, de al menos 300 L, de al menos 400 L, de al menos 500 L, de al menos 600 L, de al menos 700 L, de al menos 800 L, de al menos 900 L, de al menos 1000 L. En algunos modos de realización, el biorreactor puede ser incluso mayor, de 120000 L o más, para aplicaciones industriales a gran escala. En un modo preferido de realización, el cultivo se realiza en fotobiorreactores en condiciones ambientales de exterior, preferiblemente en fotobiorreactores de al menos 400 L.

En un modo de realización particular, la irradiación fue de 0 emoles de fotones/m2 s (horario nocturno) a 3000 emoles de fotones/m2 s (horario diurno), con una media de 1500 emoles de fotones/m2 s. En un modo de realización particular, la irradiación en horario diurno puede alcanzar durante las horas de mayor luz los 3500 emoles de fotones/m2 s. Así, en modos de realización, el cultivo se realiza bajo una irradiación máxima de al menos 1000 emoles de fotones/m2 s, de al menos 1500 emoles de fotones/m2 s, de al menos 2000 emoles de fotones/m2 s, de al menos 2500 emoles de fotones/m2 s, de al menos 3000 emoles de fotones/m2 s, de al menos 3500 emoles de fotones/m2 s. En modos de realización, el cultivo se realiza bajo una irradiación media de al menos 1500 emoles de fotones/m2 s, de al menos 1750 emoles de fotones/m2 s, de al menos 2000 emoles de fotones/m2 s, de al menos 2250 emoles de fotones/m2 s. En un modo particular de realización, el cultivo se realiza bajo una irradiación media de al menos 1750 emoles de fotones/m2 s.

En modos particulares de realización, el modo de operación del biorreactor es discontinuo, semicontinuo o continuo. En el modo discontinuo (batch), el cultivo se realiza por lotes o tandas, sin alimentación (F); se coloca dentro del biorreactor la carga total de cada proceso (tanda o lote) de cultivo o fermentación y se deja que se lleve a cabo el proceso productivo o la fermentación por el tiempo que sea necesario; el cual se denomina tiempo de retención. En el modo semicontinuo (fed-batch), el cultivo se realiza por lotes alimentados, con alimentación de entrada (F1); se alimenta una línea de entrada o alimentación (F1) para que el sistema de cultivo tenga un producto (biomasa) con máximo de crecimiento (exponencial) y aumente la productividad. En el modo en continuo, el cultivo se realiza por quimiostato, se alimenta una línea de entrada F1 o alimentación y se drena una línea de salida F2 o lavado; de manera que los flujos o caudales de ambas líneas sean iguales y la producción sea continua. En un modo preferido de realización, el modo de operación del biorreactor es de cultivo en continuo.

El contenido de gas del biorreactor para cultivar las microalgas de la invención puede ser manipulado. Parte del volumen del biorreactor puede contener gas en lugar de líquido. Se pueden usar puertos de entrada de gas para bombear gases al biorreactor. Cualquier gas puede ser bombeado a un biorreactor, incluyendo aire, CO ² , gases nobles como el argón y otros. La tasa de entrada de gas en un biorreactor también se puede manipular. El aumento del flujo de gas en un biorreactor aumenta la turbidez de un cultivo de microalgas. La entrada de gas en un biorreactor se puede modular para generar cantidades óptimas de, por ejemplo CO ² , para el crecimiento máximo de la microalga. Así, en modos particulares de la invención, el cultivo se realiza bajo un aporte de CO ² por pulsos de un minuto cada hora durante las horas diurnas y/o aireación mediante bomba soplante. En modos particulares de la invención el aporte de CO2 es de 3% CO2/97% de aire, 99.75% de aire: 0.25% CO ² ; 99.5% de aire: 0.5% CO ² ; 99.0% de aire: 1.00% CO ² ; 98.5% de aire: 1.5% CO ² ; 98.0% de aire: 2.0% CO ² ; 97.0 % aire: 3.0% CO ² , 96.0% aire: 4.0% CO ² ; y 95.00% aire: 5.0% CO ² se puede infundir en un biorreactor o biorreactor. En un modo particular de realización, el cultivo se realiza bajo un aporte de CO ² por pulsos de un minuto cada hora durante las horas diurnas (98.5% de aire: 1.5% CO ² ) y/o aireación mediante bomba soplante.

En un modo particular de realización, el método de acuerdo con el primer aspecto de la invención comprende además producir un material procesado a partir de la biomasa de microalga. El material procesado se selecciona del grupo que consiste en un fertilizante, un pesticida, un pienso, un pienso para peces, un biocombustible, un combustible para aviones, un biodiesel, un pigmento, un tensioactivo, un cosmético, un agente farmacéutico, un suplemento para la salud, o bioplásticos. El material procesado se puede obtener mediante los pasos adecuados para recuperar o extraer el material a partir de la biomasa de microalga y para procesar el material.

Así, en un aspecto adicional la invención se refiere a un método para producir un extracto de biomasa de una microalga, donde el método comprende cultivar la microalga en un efluente diluido en agua de mar, donde la microalga se selecciona del grupo que consiste en una cepa del género Anabaena, una cepa del género Dolichospermum, una cepa del género Chrysoreinhardia, una cepa del género Halochlorella, y combinaciones de las mismas, donde el efluente diluido presenta, al inicio del cultivo:

Métodos de ruptura celular son generalmente conocidos por el experto en la materia (véanse EP2478089B1, o Jean-Maxime Rouxa, Hadrien Lamotte, Jean-Luc Achard, "An Overview of Microalgae Lipid Extraction in a Biorefinery Framework”, Energy Procedia 112 (2017) 680 -688). En una realización particular, el método de ruptura celular se selecciona del grupo que consiste en molino de bolas, homogeneización a alta velocidad, homogeneización a alta presión, ultrasonicación, microondas, campo eléctrico pulsante, métodos químicos, hidrólisis enzimática, y extracción en agua subcrítica.

Todos los términos y modos de realización descritos en cualquier otra parte del presente documento son igualmente aplicables a estos aspectos de la invención, métodos de la invención.

Biomasa de microalga

En modos de realización de la presente invención, el contenido de la biomasa es 40-60% (peso seco, DW) de carbohidratos, 13-40% (peso seco, DW) de proteína, y 2.7-20% (peso seco, DW) de lípidos. En un modo de realización, el contenido en proteína es 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 80%, 90%, o 100% mayor en medio 0.5% efluente que en medio f/2. En un modo de realización particular, el contenido en proteína es un 20% mayor en medio 0.5% efluente que en medio f/2 para la microalga eucariota Chrysoreinhardia giraudii BEA_IDA_0071B. En un modo de realización particular, el contenido en proteína es un 26% mayor en medio 0.5% efluente que en medio f/2 para la microalga eucariota Halochlorella rubescens BEA_IDA_0072B. En un modo de realización particular, el contenido en proteína es un 60% mayor en medio 0.5% efluente que en medio f/2 para la cianobacteria Anabaena sp BEA_IDA_0069B. En un modo de realización particular, el contenido en proteína es un 60% mayor en medio 0.5% efluente que en medio f/2 para la cianobacteria Dolichospermum sp BEA_IDA_0070B. En un modo de realización particular, el contenido en proteína es, de media, un 30% ±20 mayor en medio 0.5% efluente que en medio f/2.

La biomasa de una microalga de la presente invención cumple la legislación europea para productos alimenticios (Reglamento (CE) no 2073/2005 de la Comisión de 15 de noviembre de 2005 relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios) o para umbrales máximos de contaminantes en productos alimenticios (Reglamento (CE) N o 1881/2006 de la Comisión de 19 de diciembre de 2006 por el que se fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios), que determinan que el número de microorganismos aerobios a 30°C debe de estar por debajo de 50.000 cfu/gB y que la presencia de coliformes fecales debe ser indetectable en ensayos de microbiología. La biomasa de una microalga de la presente invención presenta un contenido en metales pesados que cumple con los estándares europeos sobre los contenidos máximos permitidos de metales pesados en algas marinas y productos derivados (Reglamento (CE) N o 1881/2006 de la Comisión de 19 de diciembre de 2006 por el que se fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios). Estas concentraciones máximas son <3 mg/kgB para Pb y Zn, <0.3 mg/kgB para Hg.

En un aspecto de la invención, la biomasa de la invención puede usarse para la preparación de un producto farmacéutico, nutracéutico, prebiótico, probiótico o de un alimento funcional. En particular, las microalgas de la presente invención son fuentes de PUFA (ácidos grasos poliinsaturados). En un aspecto adicional de la invención, la biomasa de la invención puede usarse para la preparación de pesticidas, piensos, piensos compuestos, piensos para peces y biofertilizantes. En otro aspecto de la invención, la biomasa de la invención puede usarse para la producción de biodiesel, biocombustible o combustible para aviones.

Todos los términos y modos de realización descritos en cualquier otra parte del presente documento son igualmente aplicables a este aspecto de la invención, la biomasa de la invención.

Cabe señalar que, tal como se usa en la especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un”, "una”, "el”, "la” incluyen sus referentes plurales "unos”, "unas”, "los”, "las” a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, el término "comprende" también incluye como un modo de realización particular que no estén presentes elementos o componentes adicionales, es decir, incluye como un modo de realización el término "consiste en".

EJEMPLOS

La invención se describirá por medio de los siguientes ejemplos que deben considerarse meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención.

1. Materiales y métodos

1.1 Cultivos de cepas y medios

Las cepas de microalgas probadas en este estudio se muestran en la Tabla 1. Esta tabla especifica dónde se aislaron las cepas, el tipo, la clase y su morfología (filamentosas o agregado no filamentoso). Las microalgas se obtuvieron del Banco Español de Algas (BEA) y pertenecen al grupo de especies seleccionadas por el proyecto SABANA (EU H2020, Grant #727874) con actividad de compuestos bioactivos y productividad significativa. Los inóculos de las cepas se cultivaron en modo semicontinuo (0.1 1/día) en las mismas condiciones de laboratorio: rango de irradiación de luz entre 220-280 ^mol/m2 s (L:O 12:12), suministro continuo de CO2 (1.5%), temperatura (25 ± 2 °C), pH (8.0 ± 0.3) y medio marino f/2 (Guillard R.R.L., “Culture of Phytoplankton for Feeding Marine Invertebrates”. En Smith W.L. y Chanley M.H. (Eds.), “Culture of Marine Invertebrate Animals”, 1975 Plenum Press, Nueva York, EE.UU.). La unidad 1/día indica que se cosecha y se renueva un 10% del volumen (i.e., 50 mL, 250 mL, 1L, 20L, 400L, etc.) al día.

1.2 Condiciones de cultivo

Los experimentos se realizaron al aire libre en reactores tubulares de lecho empacado (PBR) de 400L de volumen para la cepa BEA_IDA_0071B y 100L de volumen para el resto de cepas. Las unidades por triplicado se probaron usando el medio f/2 como medio limpio y control, y un conjunto adicional por triplicado usando efluente diluido como medio de cultivo nutricional. Estos PBR se inocularon con un tamaño de inóculo diferente (iPS) para cada cepa, que oscila entre 50 y 90 mg/L (PS, peso seco) (Tabla 5). Las columnas PBR de burbujas se mantuvieron al aire libre sin control de temperatura y luz y aireación constante con pulso de suministro de CO ² cada hora (1.5%). La irradiancia media fue de 1750 ^mol/m2 s y se midió cada hora en diferentes posiciones, utilizando un sensor de luz esférico (LICOR, EE.UU., SPQA 2770, mod. LI-4000). El rango medio de temperatura, pH, salinidad y conductividad para cada cepa probada se muestra en la Tabla 2. Estos parámetros se midieron con sensores portátiles CRISON Instruments (pH25 y CM25) previamente calibrados. Los PBR fueron operados en modo semi-continuo (con una tasa de diluciones de 0.2 1/día) y reemplazando diariamente este volumen con una nueva dilución de agua de mar filtrada y medio (f/2 para los controles y para el medio de 0.5% de efluente).

1.3 Monitoreo del cultivo

El 20% del volumen de cada PBR se cosechó diariamente, utilizando una malla de nylon Nitex TM de 50^m para cepas de agregados filamentosos y no filamentosos. La biomasa se lavó con agua estéril doblemente destilada, luego se congeló durante 24 horas a -18 °C y posteriormente se liofilizó en un liofilizador (Labconco, Freezone 6) durante al menos 48 horas y se pesó para determinar la biomasa en estado estacionario (g/L). El agua rechazada de la cosecha se recogió para la determinación del análisis (ver más abajo).

La producción (P) se calculó como la tasa de aumento diario de biomasa (g/Ld). La densidad óptica (DO) de los cultivos se calculó como las diferencias entre los valores verificados a longitudes de onda de 680 y 750 nm en un espectrofotómetro Beckman Coulter DV 730 UV contra una referencia de medio de agua de mar. Los parámetros fotosintéticos se probaron para determinar la fisiología de las cepas en diferentes medios. Se usó un fluorómetro de clorofila modulado por amplitud de pulso (AquaPen AP100, Photo-systems Instruments, República Checa) para controlar el estado fisiológico de los cultivos midiendo la fluorescencia de clorofila como F0 y el cociente Fv/Fm como medición de estrés de algas. También se realizó un análisis de la concentración de clorofila a (Chl a), filtrando 5 ml de volumen a través de filtros de fibra GF/F y extrayendo posteriormente clorofila de la lixiviación en acetona al 90% durante 24 horas en la oscuridad a 4 °C. La fluorescencia del extracto se midió en un fluorómetro Trilogy de Turner Designs complementado con un módulo de clorofila sin acidificación (Turner Designs # 7200-046) y calibrado previamente con clorofila pura (Sigma Chem Co.) (Welschmeyer, N.A., 1994).

La materia orgánica disuelta cromofórica (CDOM) se midió por fluorescencia in situ usando un fluorómetro Turner Design con un módulo ultravioleta (Turner Designs # 7200-069) calibrado con una concentración conocida de sulfato de quinina diluido en 0.05 molar de H ² SO ⁴ a diferentes niveles, para determinar la regresión lineal entre fluorescencia (RFU) y concentraciones de quinina (PPB). La eliminación de nutrientes se calculó como la cantidad de nitrógeno (amonio y nitrato) y fósforo eliminado por tiempo y volumen (mg Nutriente/Ld). El rendimiento de nutrientes se calculó como la eliminación de nutrientes por producción de biomasa (mg Nutriente/gB). La tasa de crecimiento bacteriano se calculó como el aumento en el número de microorganismos aeróbicos (como unidad formadora de colonias, ufc) por volumen y tiempo (ufc/mLd).

1.4 Métodos analíticos

1.4.1 Análisis de agua

Se tomó una muestra del agua rechazada de la cosecha y del volumen de agua reemplazado con el nuevo medio nutriente para diferentes análisis. Todos los procedimientos para analizar la composición de esta entrada y salida de agua del PBR siguieron los métodos estándar analíticos para agua y aguas residuales de APHA (2017) y también del Ministerio de Agricultura español (1982). La concentración de amonio se determinó por el método de Nessler en el que el potasio, el mercurio y el yodo reaccionan con el amonio para crear un compuesto de color amarillo-parduzco proporcional al amonio. El ortofosfato se midió por fotometría a través de la reacción azul de molibdeno. Los nitratos se determinaron por el método de reducción de cadmio. La concentración bacteriana se midió por el método horizontal para la enumeración de la colonia de microorganismos aeróbicos contados a 30 grados y 30 °C por la técnica de placa de vertido para microbiología de alimentos (métodos estándar ISO, 2018).

1.4.2 Análisis de efluente

Las titulaciones termométricas secuenciales cuantificaron carbonatos y bicarbonatos. El calcio, magnesio, potasio, sodio, boro, cobre, hierro, fósforo, manganeso y zinc se determinaron por espectrofotometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) y el mercurio por espectrometría atómica. La demanda química de oxígeno (DQO) se estableció por fotometría de reflujo cerrado y la demanda bioquímica de oxígeno (5 días-DBO) por el método manométrico.

1.4.3 Análisis de biomasa

Una vez que la biomasa se liofilizó, se realizaron análisis bioquímicos, microbiológicos y de metales pesados. El contenido bioquímico de la biomasa se estudió con el análisis de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos grasos. Los carbohidratos se determinaron utilizando el método fenol-sulfúrico. Los lípidos se extrajeron con cloroformo:metanol (2:1, v/v) con un contenido de BHT al 0,01%. Una vez extraídos, los lípidos se secaron y se determinaron gravimétricamente. Los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) se obtuvieron de los lípidos totales mediante transesterificación catalizada por ácido y se identificaron mediante cromatografía de gases. La proteína se cuantificó por el método Kjeldahl, que consiste en la digestión con ácido sulfúrico en presencia de un catalizador de cobre a 400 °C, seguido de una destilación y valoración del amoníaco liberado. El valor de proteína fue obtenido al multiplicar el valor de nitrógeno (N) x 6,25. El análisis microbiológico de la biomasa se estudió con el análisis de la presencia de microorganismos aeróbicos a 30 °C, E. coli fi-D-glucuronidasa, Listeria monocytogenes, coliformes fecales y Salmonella spp como cfu/gB, siguiendo los métodos estándar ISO para Productos alimenticios, microbiología y piensos (métodos estándar ISO, 2018). El contenido de biomasa de metales pesados (mercurio, arsénico, cadmio y plomo) se analizó para la cepa BEA_IDA_0071B como mg/kgB por espectrometría de absorción atómica y espectrometría de masa de plasma (ICP-MS).

1.5 Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron con XLSTAT Addinsoft 2019.1 para Microsoft Excel. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se realizaron estudios de varianza (ANOVA) para determinar la significación estadística de la variación de tamaño observada entre tratamientos. La prueba de Levene se evaluó para evaluar la homocedasticidad y los valores de p resultantes, y para resultados con diferencia significativa (valor de p<0.05), la prueba de Kruskal Wallis se realizó como análisis post-hoc. Para evaluar las diferencias entre los valores medios de los diferentes parámetros analizados para ambos medios analizados (medio limpio f/2 y efluente), se realizó la prueba t de Student con un nivel de confianza del 95% para las variables distribuidas normalmente y la prueba de pares emparejados de Wilcoxon para variables no distribuidas normalmente. Una prueba previa de Kolmogorov-Smirnov se realizó para analizar la distribución normal. La hipótesis nula estableció que las medias son iguales con un valor de p>0.05. El análisis de los componentes principales (PCA) se llevó a cabo para analizar la matriz de correlación de Pearson entre los principales parámetros analizados en medio f/2 y las diferentes diluciones de efluente analizadas.2

2. Resultados

2.1 Caracterización del efluente

El efluente utilizado en estos experimentos es el agua rechazada de los lodos de aguas residuales digeridos anaeróbicamente de la planta de biometanización de Salto del Negro (Gran Canaria, Islas Canarias, España). Esta planta concentra todo el material de lodo de las más de 40 plantas de tratamiento de la isla de Gran Canaria (Gobierno de las Islas Canarias, 2019) para este tratamiento anaeróbico. El rango de composición de este efluente (cationes, aniones, metales y otros parámetros) se muestra en la Tabla 3. Los principales compuestos en este efluente fueron bicarbonatos (17.531 mg/L), amonio (4.200 mg/L), cloruro (1.100 mg/L), potasio (604 mg/L), sodio (553 mg/L) y ortofosfato (525 mg/L). Las cantidades de metales (boro, cobre, hierro, manganeso, mercurio y zinc) fueron significativas y también necesarias para el crecimiento de algas. En relación con la actividad de microorganismos, la Tabla 3 muestra la DBO5 del efluente, con valores medios de 2.270 mg/L y valores de DQO de 6.745 mg/L, que resulta en un cociente DBO5/DQO de 0.33, lo que indica altas cantidades de materia orgánica biodegradable (relacionado con un alto valor de CDOM, 431 PPB) y agua altamente contaminada. Este hecho también se refleja en la alta concentración de microorganismos aeróbicos a 30 °C, 42.500 ufc/ml.

Estos resultados de la carga contaminada del efluente demuestran la dificultad de encontrar una tasa de dilución óptima para usarlo como medio nutriente para maximizar la producción de microalgas, igual que el medio marino f/2. En este sentido, el análisis de los parámetros principales de amonio, fosfato, nitrato, cociente N/P, concentración bacteriana, peso seco, CDOM y los parámetros físico-químicos (salinidad, pH y conductividad) se obtuvo para el agua de mar filtrada, para el medio f/2, para las diferentes diluciones de efluente en agua de mar (0.5%, 5%, 10%, 30% y 50%) y para el efluente sin diluir (Tabla 4). Todos los parámetros anteriores (excepto CDOM, nitrato, concentración bacteriana y cociente N/P) siguen un patrón similar de proporcionalidad lineal para todos los porcentajes de efluente diluidos en agua de mar (R2> 0.900, p> 0.05). La tabla anterior muestra la mayor similitud entre los parámetros analizados en medio limpio f/2 y 0.5% de efluente diluido (R2> 0.800, p> 0.100) que en el resto de diluciones de porcentaje de efluente (R2 <0.600, p <0.05). Este vínculo más estrecho entre los parámetros principales del medio limpio f/2 y el 0,5% del efluente puede verificarse mediante el análisis de componentes principales (PCA), donde ambos medios de nutrientes comparten el mismo cuadrante (Figura 1). La salinidad del efluente no diluido fue de 13 %o y la del agua de mar filtrada de 38 %. Mientras que la salinidad del 0,5% de efluente diluido fue de 36,8 %, similar a la del medio f/2. La conductividad del efluente diluido (0.5%) fue de 25.4 mS/cm, que no difiere del medio f/2. El pH en medio diluido al 0,5% y medio f/2 osciló entre 8.2 y 9, con un valor constante de 7,9 para agua de mar filtrada. La cantidad promedio de N (amonio y nitrato) en el medio f/2 fue de 85 mg/L y en 0.5% de efluente diluido 105 mg/L. El ortofosfato en medio f/2 fue de 6 mg/L y en el 0,5% de efluente, 3,75 mg/L. El cociente N/P para estos medios fue 14.7 para el medio de control y 31.3 para el efluente diluido. No hubo actividad bacteriana en el agua de mar filtrada, 518 ufc/ml en medio f/2 y 2,460 ufc/ml en 0,5% de efluente. El CDOM en el 0.5% del efluente también fue mayor que en el medio f/2, 73.2 PPB y 30.4 PPB respectivamente (Tabla 4).

2.2 Experimentos al aire libre

Todos los experimentos se realizaron por triplicado en medio de control (f/2) y 0.5% de efluente a escala piloto exterior en 100L PBR para las cepas BEA_IDA_0069B, BEA_IDA_0072B, BEA_IDA_0070B y en 400L para la cepa BEA_IDA_0071B. Todos los parámetros estudiados (P, F0, Fv/Fm, OD, Chl a, BG, CDOM, eliminación de nutrientes y rendimiento) (Tabla 5) y (temperatura, pH, salinidad y conductividad) (Tabla 2) fueron validados para cada medio con el análisis de varianza (ANOVA) (para variables normalmente distribuidas) y Kruskal-Wallis (para variables no distribuidas normalmente). No se mostraron diferencias significativas para todas las variables y tratamientos (p> 0.07) durante el período de incubación (15 días). La prueba t pareada no mostró diferencias significativas (p> 0.05) entre los parámetros anteriores analizados en el medio de control f/2 y 0.5% de efluente (Tabla 2), Relación Fv/Fm y CDOM de la cepa BEA_IDA_0071B, F0 y Chl a de la cepa BEA_IDA_0070B (p <0.05) (Tabla 5).

La producción fue mayor en 0.5% de efluente que en medio f/2 para todos los experimentos realizados para todas las cepas, excepto para las microalgas BEA_IDA_0071B cuyos valores de producción fueron similares, 0.073 y 0.075 g/Ld (Figura 2). La mayor cantidad de producción correspondió a las microalgas eucariotas BEA_IDA_0072B en 0.5% de efluente (0.131 g/Ld), y BEA_IDA_0071B. Se observó cómo los valores de producción más bajos estaban relacionados con los experimentos realizados para las cepas de cianobacterias BEA_IDA_0069B y BEA_IDA_0070B, por debajo de 0,05 g/L d en ambos medios (Tabla 5). El análisis de la prueba t de producción pareada entre medio f/2 y 0.5% de efluente no mostró diferencias significativas (p> 0.110).

El nivel de estrés de las microalgas durante todo el período de incubación se midió a través de la relación de fluorescencia Fv/Fm. La relación Fv/Fm más baja registrada para los experimentos realizados fue para las microalgas BEA_IDA_0071B cultivadas en un medio f/2, con un valor medio de 0.530, que contrasta con el valor de 0.610 en 0.5% de efluente (p <0.05) Este valor medio para el resto de los experimentos realizados fue de aproximadamente 0.700 y SD por debajo de 0.1 para ambos medios (p> 0.400) (Tabla 5). Este valor de relación máxima significaba cultivos de microalgas sin estrés. La fluorescencia in vivo se midió como F0 y mostró una correlación lineal positiva bastante significativa con la concentración de clorofila a (Chl a) (R = 0.990). Los valores más bajos (media ± DE) de fluorescencia (F0 y Chl a) se registraron para las cepas eucariotas BEA_IDA_0071B y BEA_IDA_0072B para ambos medios nutritivos realizados. Los valores más altos correspondieron a ambas cepas de cianobacterias. La densidad óptica (DO) mostró un nivel más alto para el 0,5% de los experimentos en efluente. Esta variable siguió un patrón de procedimiento similar al de F0, con una correlación significativa de Pearson (R = 0.855) (Tabla 5).

Se observó un crecimiento de microorganismos durante todo el período de incubación tanto en medio de control (f/2) como en 0,5% de efluente. También se debe tener en cuenta que incluso el crecimiento bacteriano fue mayor en cultivos medios f/2 que en 0,5% de efluente para las cepas BEA_IDA_0071B, BEA_IDA_0072B y BEA_IDA_0070B (Figura 3). La tasa de crecimiento bacteriano más baja se dio en las cianobacterias BEA_IDA_0069B en medio limpio (66 ufc/ml) y las cianobacterias BEA_IDA_0070B en 0,5% de efluente (100 ufc/ml). La cepa eucariota BEA_IDA_0072B mostró los valores más altos en la tasa de crecimiento bacteriano en medio f/2 (266 ufc/ml) y 0,5% de efluente (200 ufc/ml). No hubo diferencias significativas entre este parámetro probado en ambos medios (p> 0.200). El CDOM esperado fue mayor en 0.5% de efluente que en medio f/2 (Figura 4), con un valor medio de 76 PPB para todas las cepas excepto para las cianobacterias BEA_IDA_0070B, cuyo valor fue 90 PPB. Los valores de CDOM en el medio de control oscilaron entre 19 y 46 PPB. No hubo diferencias significativas para el análisis de prueba t emparejado entre la variable CDOM probada en ambos medios nutrientes (p> 0.05), excepto para las microalgas BEA_IDA_0071B (p <0.05) (Tabla 5).

No hubo diferencias significativas entre la eliminación de N, el rendimiento de N, la eliminación de P y el rendimiento de P para todos los experimentos realizados en medio limpio y efluente diluido (p> 0.08). Es de destacar el alto valor medio de rendimiento de N y eliminación de N para la cepa de microalgas BEA_IDA_0071B en ambos medios nutrientes: 78 mgN/gB y 23.8 mgN/L d en medio f/2, y 93 mgN/gB y 24.9 m g^Ld en 0.5% de efluente. Para el resto de las cepas, el rendimiento de N varió entre 20 y 55 mgN/gB y Nremoval entre 5 y 17 mgN/L d para ambos medios realizados. El rendimiento de P mostró un intervalo de variación más estrecho para todas las cepas y medios nutrientes utilizados, entre 2.3 y 5.4 mgP/gB, al igual que Premoval, entre 0.8 y 2 mgP/Ld (Tabla 5).

2.3 Análisis de la biomasa

2.3.1 Microbiología

El análisis microbiológico de la biomasa liofilizada para todas las cepas de microalgas analizadas en el método y diluido mostró que el estudio cumplía con la legislación en vigor para productos alimenticios. Esta biomasa presentaba valores superiores al umbral establecido por legislación para el número de microorganismos aeróbicos a 30°C (>50.000 ufc/gB) y bacterias coliformes fecales (Ausencia) (Tabla 6).

2.3.2 Metales pesados

Los resultados de las principales concentraciones de metales pesados (Cd, Pb, Hg y Ar) en la biomasa de la cepa de microalgas BEA_IDA_0071B cultivada en medio limpio y con un 0,5% de efluente, mostró por debajo de los límites establecidos en la legislación vigente para el control de los metales pesados en algas y subproductos (Tabla 7).

2.3.3 Composición bioquímica

No hubo diferencias significativas entre la composición bioquímica (carbohidratos, lípidos, proteínas y cenizas) para todas las cepas de microalgas probadas en medio limpio f/2 y 0,5% de efluente, mostrando un coeficiente de determinación significativo (R2>0,900, p>0,05). El contenido de carbohidratos fue ligeramente superior en el medio f/2 que en el efluente diluido y osciló entre el 40 y el 65% (peso seco, DW). La cepa de cianobacterias BEA_IDA_0070B mostró el mayor contenido de carbohidratos tanto en el medio f/2 como en el 0,5% del efluente (>60% DW). Para las cepas de eucariotas, el contenido medio de carbohidratos fue de aproximadamente 50% DW. El contenido de proteínas osciló entre 13 y 38% de DW, considerablemente más alto en el efluente que en el medio f/2 para las cepas BEA_IDA_0071B, BEA_IDA_0069B y BEA_IDA_0072B (con los valores más altos registrados, 30-38% de DW, y similar para la cepa BEA_IDA_0070B (con los valores más bajos registrados, 13-24% (DW)). El contenido en lípidos se relacionó entre los dos medios analizados y osciló entre el 2,7 y el 20,3% de DW. La cianobacteria BEA_IDA_0070B mostró los valores más bajos, <3% DW para ambos medios de nutrientes. El contenido de cenizas osciló entre 7 y 14% de DW, a excepción de la cepa de cianobacterias BEA_IDA_0070B, que mostró valores superiores al 18% de DW (Figura 5). Tampoco hubo diferencias significativas entre el perfil de ácidos grasos para todas las cepas probadas en medio limpio y efluente (p>0,800) (Tabla 8).

3. Discusión

3.1 Caracterización del efluente

La necesidad de nutrientes (nitrógeno y fósforo) en el cultivo de microalgas para obtener resultados óptimos de crecimiento conlleva un gran costo. Hoy en día, el medio nutriente f/2 es costoso, pero ampliamente utilizado en cultivos de microalgas marinas. Por lo tanto, el uso alternativo potencial de las aguas residuales como fuente de nutrientes para los cultivos de microalgas parece ser un gran desafío y está creciendo en fuerza, mientras se trabaja para reducir el impacto ambiental negativo. En el presente trabajo, hemos estudiado el uso de efluente diluido como fuente de nutrientes para las microalgas marinas (cianobacterias y eucariotas). Este efluente es el agua rechazada de los lodos de aguas residuales digeridos anaeróbicamente de una planta de biometanización en Gran Canaria (Islas Canarias, España). El lodo de más de 40 plantas de tratamiento en Gran Canaria se trata en esta instalación. Esta mezcla de lodo de aguas residuales de áreas urbanas, industriales y agrícolas genera una alta carga de contaminación. Este aspecto se refleja en el rango de composición del efluente, que muestra altas cantidades de materia orgánica biodegradable, microorganismos aeróbicos (42,500 ufc/ml), DBO5 (2,270 mg/L) y DQO (6,700 mg/l). Las concentraciones de amonio y fosfato estaban en concentraciones relativamente altas (4,200 mg/L y 525 mg/L respectivamente), que son contaminantes ambientales peligrosos con un potencial muy tóxico (Tabla 3). Estas concentraciones bastante altas superan el umbral de toxicidad para un crecimiento óptimo de algas. La composición del efluente utilizada en este estudio es diez veces mayor que la utilizada en otros trabajos de investigación en España. El porcentaje de dilución del efluente utilizado en este trabajo fue del 0,5%, muy por debajo de la dilución óptima del 20% utilizada por los autores anteriores. Los compuestos nutricionales y los parámetros fisicoquímicos de diferentes porcentajes de diluciones de efluente se correlacionaron con el medio f/2 (Tabla 4, Figura 1) como se muestra en los resultados. Por lo tanto, consideramos el 0.5% de efluente como un punto de partida para consolidar el efluente como un medio nutriente para la producción de microalgas y compararlo/ evaluarlo con el medio consolidado f/2. A la luz de los resultados, se demostró que la concentración de bacterias aeróbicas creció exponencialmente a lo largo del porcentaje de dilución de efluente (R2 = 0.980, p> 0.05), produciendo degradación del nitrógeno presente en el efluente. Este hecho implicó una degradación significativa de amoníaco a través de las diluciones en el agua de mar, debido al proceso de amonificación. Cuando se realizaron diluciones en el efluente, las bacterias aerobias presentes en el efluente (ambiente anaeróbico) encontraron un ambiente favorable para un crecimiento óptimo, al descomponer nitrógeno orgánico en amoníaco, que en este medio de agua de mar se convierte en amonio. Este nitrógeno orgánico del efluente, en condiciones anaeróbicas, permanece estable pero diluido en agua de mar precipita en amonio debido a la actividad bacteriana. Este amonio en condiciones aeróbicas estimula la oxidación del amonio en nitratos (proceso de nitrificación a través de la acción de las bacterias Nitrosomonas y Nitrobacter). Los resultados de amonio y fosfato mostraron un patrón de proporcionalidad lineal a través de las diferentes diluciones de efluente (R2> 0.900, p> 0.05), pero un patrón logarítmico sobre la concentración de nitrato (R2> 0.890, p <0.05), debido a este proceso de nitrificación. Este hecho es fundamental, las concentraciones de nitrógeno inorgánico (nitrato y amonio) en el efluente con respecto a las concentraciones de fosfato produjeron un cociente N/P de 31.3 para una dilución del 0.5% del efluente, un cociente N/P de 11.1 ±2.3 para una dilución de. 5% y un cociente de aproximadamente 6 para diluciones del efluente de entre 10 y 50% (Tabla 4).

En este sentido, el CDOM mostró, como se explica en los resultados, que no hay diferencia significativa con la concentración bacteriana y de nitrato (p> 0.05). La materia orgánica disuelta es un determinante importante del campo de luz subacuática en aguas naturales. El CDOM absorbe la luz tanto en la longitud de onda ultravioleta como en la visible, reduciendo la radiación para la fotosíntesis. La materia orgánica producida y liberada por el fitoplancton durante el crecimiento es producida por comunidades bacterianas heterotróficas que transforman la materia orgánica disuelta en biomasa y reciclan nutrientes inorgánicos. Este hecho podría explicar la relación directa entre CDOM y la concentración microbiana en el rango de dilución de efluente (Tabla 4), en la formación de CDOM por la transformación bacteriana. Como ocurrió con una concentración bacteriana que aumenta significativamente a través del porcentaje de efluente, CDOM mostró una evolución lineal, estrechamente relacionada con ese porcentaje de concentración (R2> 0.780, p> 0.05). Esta relación sugiere que el efluente diluido en agua de mar aumentó la actividad microbiana, lo que condujo a una mayor degradación de la materia orgánica del efluente. Este aspecto se refleja en el hecho de un aumento importante en CDOM, materia orgánica disuelta que sirve como sustrato para la remineralización microbiana heterotrófica de otros elementos. Los microbios utilizan enzimas extracelulares para catalizar un alto peso molecular de la materia orgánica en compuestos más pequeños que pueden transportarse a través de las membranas celulares de la bacteria. Existe un vínculo importante entre la producción de fluorescencia CDOM y el procesamiento microbiano de materia orgánica.

Se observó que esta dilución de efluente de 0.5% mantuvo niveles de nitrógeno y fósforo en una proporción aceptable para el crecimiento de algas (cociente N/P de 31.3), más alta que esta proporción obtenida por otros autores en todo el rango de porcentajes de dilución de efluente (13.5). Esta dilución de 0.5% de efluente elegida para realizar los experimentos de producción mostró un nivel aceptable de fósforo total (3.75 mg/L) y nitrógeno total (106 mg/L), sin la necesidad de agregar una cantidad adicional de P para corregir el cociente N/P, como se hizo en otros trabajos con efluente (Sepúlveda, C., Acién, F.G., Gómez, C., Jiménez-Ruiz, N., Riquelme, C., Molina-Grima, E., 2015. Utilization of centrate for the production of the marine microalgae Nannochloropsis gaditana. Algal Res. 9: 107-116; Romero-Villegas, G.I., Fiamengo, M., Acién-Fernández, F.G., Molina-Grima, E., 2018. Utilization of centrate for the outdoor production of marine microalgae at pilot-scale in flat-panel photobioreactors. Journal of Biotechnology 284: 102-114).

A partir de esta dilución, la concentración de amonio creció significativamente en todo el porcentaje de dilución de efluente, alcanzando niveles tóxicos (Tabla 4). La concentración de amonio para el 0.5% de efluente fue de 72 mg/L y superó con creces los valores límite de toxicidad de 1.8 mg/L para más de 200 especies de fitoplancton marino, 16.22 mg/L para Nannochlompsis sp, 9 mg/L para Spimdela polyrrhiza, 27 mg/L para Umglenopsis americana, Synura petersenii y Dinobryon cylindricum, 3.14 mg/L para Nephroselmis piriformes. Estudios previos sobre el efecto de las altas concentraciones de amonio en el crecimiento óptimo de las diferentes clases de microalgas han establecido los valores umbrales en 137 mg/L para Chlorophyceae, 45 mg/L para Cyanophyceae, 25 mg/L para Prymnesiophyceae, 6 mg/L para Diatomophyceae, 4.6 mg/L para Raphidophyceae y 1.8 mg/L para Dynoplyceae. En la misma revisión, el nivel tóxico para Chlorophyceae se estableció en 703 mg/L y 234 mg/L para Cyanophyceae. En este sentido, otros trabajos con Chlorella vulgaris establecieron un nivel de toxicidad de amonio de 360 mg/L. Todas estas referencias anteriores mostraron que el límite de amonio tóxico para el efluente utilizado estaba disponible hasta el 5% de la dilución del efluente, teniendo en cuenta que las cepas analizadas en el presente trabajo pertenecen a la clase de las Cyanophyceae (BEA_IDA_0069B y BEA_IDA_0070B), de las Chlorophyceae (BEA_IDA_0072B) y de las Pelagophyceae (BEA_IDA_0071B). La concentración de amonio puede aumentar sustancialmente hasta niveles tóxicos cuando el pH excede el valor de 9, produciendo una inhibición en el crecimiento de algas. En el presente trabajo, el pH permaneció constante y por debajo de este valor durante el período de cultivo (Tabla 2).

3.2 Experimentos al aire libre

Los resultados de la producción mostraron los mejores resultados para las operaciones realizadas en medio con efluente diluido al 0.5% que en medio limpio f/2 para todas las cepas analizadas (Figura 2, Tabla 5). Los valores más altos correspondieron a las cepas eucariotas BEA_IDA_0072B (131 mg/Ld) y BEA_IDA_0071B (89 mg/Ld). Se observa que estas tasas de producción son relativamente bajos en relación a los obtenidos por otros autores en medios con efluentes diluidos: 320 mg/ld para Nannochloropsis gaditana, 1130 mg/L d para Muriellopsis sp y 1020 mg/L d para Pseudokirchneriella subcapitata, 920 mg/L d para Chlorella sp, 900 mg/L d para Scenedesmus sp, Auxenochlorella protothecoides en aguas residuales, 200 mg/L d para Chlorella sorokiniana, pero más altos que los reportados por otros autores. Las diferencias en la producción se dan en función de la cepa, el medio de cultivo, las condiciones de operación establecidas, el inóculo de peso seco, el tipo de agua residual o el efluente y la tasa de dilución. Para el presente estudio se ha operado dentro de una tasa de dilución de 0.2 1/día cuando otros autores encontraron la mejor productividad entre 0.3 1/día y 0.6 1/día. Dados los mejores resultados obtenidos en productividad por los autores anteriores, podríamos aumentar la tasa de dilución a 0.6 1/día para mejorar el rendimiento de nuestros experimentos de producción.

La relación Fv/Fm se midió en todos los experimentos realizados, mostrando un valor medio de 0.680 y una SD baja (0.05) para todas las cepas y medios estudiados. Se estimó que esta proporción controlaba el nivel de estrés de los cultivos y mostraba cultivos sanos y sin estrés y perfectamente adecuados para las condiciones exteriores establecidas y los medios nutritivos. Se esperarían valores bajos de la relación Fv/Fm debido a las condiciones físicoquímicas del cultivo en condiciones exteriores y en medio efluente. Sin embargo, la diferencia (Fv) entre la fluorescencia máxima (Fm) y mínima (F0) mostró valores más altos relacionados con estas relaciones Fv/Fm significativamente altas. Cuanto mayor es el estrés de las microalgas, hay menos centros de reacción abiertos disponibles y Fv/Fm. Una relación Fv/Fm cercana al valor 0.800 puede ser considerada como óptima en términos fisiológicos, mostrando un aumento de los centros de reacción de PSII (fotosistema II) activos, lo que indica una situación sin estrés. Se acepta que estos valores se aclimatan fisiológicamente a las condiciones ambientales. La relación Fv/Fm se ha relacionado con el rendimiento cuántico máximo de la fotoquímica del PSII y una disminución en esta relación refleja el daño a PSII, sintomático de una acumulación desequilibrada de poder reductor, que a su vez promueve la síntesis de lípidos. Eso significa que una disminución drástica en el funcionamiento normal de la célula indujo la formación y acumulación de lípidos intracelulares. Los cambios en Fv/Fm proporcionan información esencial sobre los efectos de la fisiología de las microalgas debido a nutrientes, fase estacionaria, densidad, recolección, pH. Por todas estas razones, podemos asegurarnos de que nuestros experimentos se realizaron en condiciones óptimas para el período de incubación en ambos medios nutritivos probados.

También es importante estudiar el crecimiento bacteriano en la producción de microalgas utilizando efluente o aguas residuales como fuente de nutrientes, ya que las cargas bacterianas en el efluente podrían ser considerables (en este caso, 42.500 ufc/ml). También es relevante contrastar los resultados con los obtenidos con un medio limpio o control, en nuestro caso medio f/2. Nuestros resultados han demostrado que no hay una diferencia significativa entre la tasa de crecimiento bacteriano analizada en experimentos realizados en un medio limpio y 0.5% de efluente diluido (p> 0.200, Tabla 5). Las diferencias medias entre las tasas de crecimiento bacteriano medidas en ambos medios nutrientes para todas las microalgas analizadas fueron de apenas 60 ± 15 ufc/ml. Por lo tanto, es posible que no consideremos el crecimiento microbiano en estos cultivos con un 0,5% de efluente como factor limitante, que también muestra una relación positiva con la producción de algas (R = 0.700, p <0.05). Sin embargo, es razonable esperar interacciones entre algas y bacterias de las aguas residuales, algunos autores encontraron que el 50% del nitrógeno total en tales cultivos podría ser asimilado por microorganismos. Sería un error considerar que todos los nutrientes eliminados en estos cultivos con aguas residuales o efluentes como medio nutritivo se deben exclusivamente al crecimiento de algas. Es evidente que la bacteria Nitrosomonas disuelve un proceso de transformación de amonio disuelto en agua a nitrito, justo después de que la bacteria Nitrobacter oxida el nitrito convirtiéndolo en nitrato. También es importante tener en cuenta que, bajo el proceso de amonificación, la materia orgánica en descomposición se convierte en amoníaco gaseoso y luego en amonio. No hay muchos estudios que caractericen a este consorcio microbiano en el cultivo de aguas residuales o en el efluente. Las bacterias asociadas a los efluentes pueden interactuar directa o indirectamente con la cepa de microalgas a través del comensalismo, mutualismo y parasitismo.

Poco se sabe sobre las interacciones, y este hecho podría limitar nuestra capacidad de desarrollar una hipótesis coherente para ser probada en tales cultivos. Hay más preguntas que respuestas en las interacciones de algas bacterianas y no se ha explotado en tecnologías basadas en algas. Se necesita más investigación para encontrar las condiciones óptimas para la eliminación simultánea de amoníaco y nitrato de las microalgas y las bacterias.

Las microalgas pueden asimilar nitrógeno de una variedad de fuentes como amonio, nitrato y urea, prefiriendo asimilar amonio a glutamina y liberar el ion hidrógeno. Esta asimilación no requiere la reacción redox y consume menos energía que otras fuentes de nitrógeno inorgánico. En los experimentos realizados en el presente trabajo, el nitrógeno y el fósforo se eliminaron de manera eficiente para todas las microalgas analizadas. No se observaron diferencias significativas entre las eliminaciones de nutrientes analizadas en el medio de control f/2 y el 0,5% de efluente (p> 0,05). La eliminación de N mostró los valores más bajos para las cepas de cianobacterias, 5.8 m g^Ld para BEA_IDA_0070B y 10.1 m g^Ld para BEA_IDA_0069B para medio limpio f/2 y 6.9 mgN/L d y 11.2 mgN/L d para 0.5% de efluente (Tabla 5). Estos resultados son superiores a los 4 mgN/L d, obtenidos para Anabaena sp en humedales construidos, o 3.5 mgN/L d para Phormidium bohneri en el tratamiento de aguas. La eliminación de N para las cepas eucariotas mostró valores similares o más altos para estas cepas cultivadas en el medio efluente que en el medio de algas, con valores entre 12 y 25 mgN/Ld. Este rango de valores también estuvo en línea con los obtenidos para Scenedesmus sp. en efluente a una tasa de dilución de 0.2-0.6 1/día, Pseudokirchneriella subcapitata en efluente, Nannochloropsis gaditana a 0.31/día de tasa de dilución, Chlorella sp. en efluente y en estiércol de cerdo para algunos cultivos de microalgas. Nuestros resultados de eliminación de N parecen ser mayores que los obtenidos en aguas residuales para Scenedesmus sp. (8.8 mgN/L-d), pero inferiores a los obtenidos en el efluente para: Muriellopsis sp (47.5 mgN/LD), Nannochlompsis gaditana a una tasa de dilución de 0.2 1/día. La eliminación de P en los experimentos realizados en el presente trabajo osciló entre 0,8-2 mgp/Ld sin diferencias significativas entre los dos medios nutrientes probados (p> 0,05). Estos resultados estaban en concordancia con los obtenidos en medio de consorcio microbiano con Chlorella vulgaris (0.576 mgp/L d, en aguas residuales con Pseudokirchneriella subcapitata y Scenedesmus sp. Se pudo observar que estos valores fueron menores que los obtenidos en efluente con Scenedesmus sp, Nannochloropsis gaditana, con Murelliopsis sp y para algas de agua dulce cultivadas en aguas residuales. No hubo diferencias significativas entre los valores de rendimiento de N entre los experimentos realizados en ambos medios nutrientes (p> 0.05) con un valor de rango entre 20.1-93 mgN/gB. El valor más alto correspondió a la cepa eucariota BEA_IDA_0071B (Tabla 5). Estos datos estaban en línea con los obtenidos en efluente con Scenedesmus sp (23.3-37.6 mgN/gB), Nannochloropsis gaditana (50 mgN/gB), Murelliopsis sp (50 mgN/gB), Chlorella vulgaris (51 mgN/gB) y para algas verdes filamentosas en el tratamiento de aguas residuales. En relación con nuestros resultados de rendimiento de P, tampoco hubo diferencias significativas entre los medios de nutrientes utilizados (p> 0.05) con un valor de rango entre 2.2 y 5.4 mgp/gB, con el valor más alto correspondiente a las cianobacterias cultivadas BEA_IDA_0069B en medio limpio Estos resultados fueron similares a los obtenidos en efluentes a la misma tasa de dilución para Scenedesmus sp, a una tasa de dilución de 0.3 1/día para Nannochloropsis gaditana y en aguas residuales para Murelliopsis sp y superior a Murelliopsis sp en efluente (3.2 mgp/gB). Estos resultados obtenidos están en consonancia con otros obtenidos en diferentes trabajos de investigación como se muestra arriba. Una vez más, estos resultados muestran la efectividad del uso de microalgas como eliminación de nutrientes de los efluentes y las aguas residuales. También destacamos el rendimiento de N de la cepa eucariota BEA_IDA_0071B en un efluente con un valor de 93 mgN/gB. Este valor fue mucho mayor que los obtenidos por otros trabajos de investigación efluentes en el uso de efluentes o aguas residuales como medio nutriente para la producción de microalgas.

Se observa en nuestros resultados que el promedio de CDOM en los cultivos realizados en efluente diluido fue al menos dos veces mayor que en el medio de control f/2 (Figura 4). Este hecho confirma una mayor actividad microbiológica en el 0,5% del efluente, debido al papel en la formación de CDOM por la transformación bacteriana. Desafortunadamente, este es un aspecto crítico y no se ha estudiado ampliamente.

3.3 Cosecha

El costo para cosechar biomasa de microalgas podría ser una barrera para sus aplicaciones potenciales. Los métodos de centrifugación requieren energía intensiva y la floculación también es costosa y podría aumentar la salinidad de la biomasa cosechada. Sobre este tema, todas las cepas probadas en el presente trabajo fueron recolectadas filtrando biomasa a través de una malla de 50 ^m. Las cepas de cianobacterias BEA_IDA_0069B y BEA_IDA_0070B eran filamentosas y tienden a formar agregados, los eucariotas BEA_IDA_0071B y BEA_IDA_0072B forman agregados y todas estas cepas tienden a hundirse y formar una capa delgada de sedimentos cuando se interrumpió la aireación. Todo esto permite recoger la biomasa de manera eficiente, rápida y cómoda. Antes de proceder con la liofilización de la biomasa, se puede lavar exhaustivamente con agua destilada. Esta forma de recolección permite eliminar la materia sólida disuelta, las bacterias y los compuestos tóxicos de la biomasa y reducir considerablemente las impurezas. Este hecho representa una ventaja total con respecto a la mayoría de las microalgas cultivadas en otros estudios, donde las microalgas presentan una pequeña morfología celular por debajo de 5 ^m de diámetro, no se hunden y no forman agregados. Debido a estas características, estas microalgas en otros estudios deben cosecharse por centrifugación. Esta metodología y morfología de las microalgas en otros estudios no permiten un lavado de la biomasa.

3.4 Biomasa

3.4.1 Microbiología

Este estudio es el resultado de los resultados de microbiología de la biomasa liofilizada analizada para los experimentos realizados en medio limpio f/2 y efluente diluido. Toda la biomasa de las cepas recolectadas a través de la malla mostró el cumplimiento del análisis con la legislación europea vigente para productos alimenticios (reglamento CE, 2005) y con el umbral máximo de contaminación en los alimentos (reglamento CE, 2006) (Tabla 6). Estos resultados confirman la viabilidad, el potencial y los beneficios de estas cepas que presentan la ventaja de ser cosechadas por malla, como se describe en la sección anterior. Sin embargo, el agua rechazada del proceso tiene concentraciones de amonio, nitrato y fosfato, materia orgánica disuelta y microorganismos por debajo del umbral de los valores admisibles establecidos en la normativa española para la reutilización del agua tratada (Ministerio de Presidencia de España, 2007) como se explicó en los resultados y reflejado en las respectivas secciones anteriores. El proceso de biorremediación del agua de lixiviados utilizando microalgas para la eliminación de nutrientes es altamente efectivo.

3.4.2 Metales pesados

El contenido de metales pesados de la biomasa cosechada para la cepa de microalgas BEA_IDA_0071B cumple con los criterios de recomendaciones europeas sobre el contenido límite de metales pesados en algas marinas y subproductos (Reglamento CE, 2006). Esta concentración máxima se estableció en <3 mg/kgB para Pb y Zn, <0.3 mg/kgB para mercurio. El efluente mostró concentraciones de mercurio de 0.075 mg/L, y se diluyó en agua de mar al 5%. Esta concentración disminuyó a 0.075 ^g/L. Esta concentración podría considerarse no significativa. Por lo tanto, la concentración de mercurio en la biomasa analizada para ambos medios nutrientes probados mostró estar por debajo del valor umbral, <0.09 mg/kgB (Tabla 7). En este aspecto, se ha tenido en cuenta que la biomasa de esta cepa podría lavarse ya que era posible cosecharla a través de la malla.

3.4.3 Composición bioquímica

Los resultados revelaron que los carbohidratos eran la fracción de biomasa dominante para todas las cepas y que ambos medios nutritivos estaban en el rango del valor obtenido para la biomasa de microalgas cultivadas en PBR (> 43% DW) (Figura 5). Los valores de carbohidratos de las microalgas verdes BEA_IDA_0072B estaban en línea con los obtenidos para Chlorella sp, Scenedesmus sp en efluente a una tasa de dilución de 0.2 1/día y Nannochlompsis gaditana en medio efluente a una tasa de dilución de 0.3 1/día descritos por otros autores. Este valor fue ligeramente mayor en la cepa de algas doradas BEA_IDA_0071B (50% DW) que en la microalga dorada Prymnesium parvum (40% DW). El contenido de carbohidratos de las cianobacterias BEA_IDA_0070B y BEA_IDA_0069B fue más significativo (> 40% DW) que los valores registrados en otros estudios para Anabaena cylindrica (30% DW), pero similar a esos valores registrados por otros autores en Spirogyra sp. La concentración de lípidos en la mayoría de las especies se encuentra entre 2 y 19% DW (Figura 5). Estos valores a distancia se obtuvieron en Nannochloropsis gaditana en medio efluente por otros autores, pero más bajos que los reportados en Scendesmus obliquus en aguas residuales de cerdos (31% DW). La relación Fv/Fm durante el período de incubación realizado para todas las cepas y medios nutrientes (Tabla 5) no indujo la acumulación de contenido de lípidos como ocurrió bajo condiciones estresantes. Debe tenerse en cuenta que las diferencias en las concentraciones de lípidos son función de diferentes factores (medio y concentración de nutrientes, tasa de dilución, condiciones exteriores). Nuestros resultados mostraron que las proteínas eran los otros compuestos principales con concentraciones que variaban entre 13 y 40% DW, con valores más altos para la biomasa cultivada en 5% de efluente. Este rango de beneficio fue similar para varias cepas de microalgas cultivadas en PBR por otros autores con valores >45% DW para Chlorella sp y Tetraselmis chuii y el obtenido para Nannochloropsis gaditana, Chlorella vulgaris y Chlorella sp, pero superiores a las de Scenedesmus sp cultivadas en medio efluente. La microalga Prymnesium parvum mostró un contenido proteico similar a la cepa BEA_IDA_0071B ensayada en ambos medios nutrientes en este trabajo.

El rango de contenido de cenizas registrado (7-20% DW) (Figura 5) es consistente para microalgas marinas con bajo contenido de cenizas (<10% DW) para la microalga eucariota BEA_IDA_0071B y niveles moderados de cenizas (10-20% DW) para la cepa de microalgas BEA_IDA_0072B. Este valor de rango está relacionado con el mayor contenido de cenizas registrado para diferentes microalgas verdes y doradas, así como para las cianobacterias. Las cepas de microalgas probadas en este trabajo mostraron una composición bioquímica diferente, con un predominio del contenido de carbohidratos, seguido de proteínas y, en menor grado, de lípidos y cenizas. La mejor fuente de contenido de carbohidratos parecía estar en microalgas cultivadas en un medio limpio, y por el contrario, las microalgas cultivadas en efluente diluido mostraron un alto contenido de proteínas. El contenido de lípidos es transparente para los medios nutrientes utilizados. Los datos del perfil de ácidos grasos se muestran en la Tabla 8. Actualmente, su interés está principalmente en la producción de PFA, como el ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5) y el ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6). En este sentido, la cepa BEA_IDA_0071B mostró los valores más altos de EPA (20:5) y más significativos que los obtenidos por otros autores para microalgas de la clase Pelagophyceae, clase Chlorophyceae y Tetrasemis sp. El contenido de DHA (22:6) fue mayor en las cepas de cianobacterias y el eucariota BEA_IDA_0072B. Estos valores parecían ser más altos en el medio efluente que en el medio de control, y también más altos que los obtenidos para las cepas de cianobacterias por otros autores. El ácido alfa-linolénico (ALA, 18:3) mostró los valores más bajos para las microalgas BEA_IDA_0071B, oscilando entre 13% y 19.3% para el resto de las cepas analizadas. Estos datos fueron más altos que los obtenidos por otros autores (<13%) para Scenedesmus sp cultivados semi-continuamente en aguas residuales no tratadas a diferentes tasas de dilución, pero más bajos que los obtenidos para la misma especie por otros autores (39,3%). El ácido oleico (18:1) fue mayor para la cepa de microalgas BEA_IDA_0072B, con un rango entre 25% y 29%, mostrando valores más altos que para Chlorella sp y para Scenedesmus sp. Los datos del ácido palmítico (16:0) mostraron un valor similar al obtenido para diferentes especies y estudios de microalgas.

Todas las cepas probadas mostraron una relación de% PUFA sobre% SFA mayor que 1, excepto las cianobacterias BEA_IDA_0070B en medio f/2. Además, en las cepas de cianobacterias y las microalgas BEA_IDA_0072B, la mayoría de estos PUFA son PUFA n-3, con una relación n-3/n-6 superior a 1. Estas cepas mostraron buenas fuentes con niveles de DHA entre 1% y 2% (Tabla 8). Estos resultados están lejos de los niveles adecuados de DHA reportados por otros autores para Rhodomonas sp (4.6%) e Isochrysis galbana (12.7%).

Los resultados anteriores abordan el potencial de las microalgas probadas en el presente trabajo como fuentes de PUFA y pueden aplicarse como fuentes de alimentos funcionales, nutracéuticos y farmacéuticos. El contenido relativamente alto de % SFA y % MUFA (> 60%) para todas las cepas excepto las microalgas BEA_IDA_0071B (<40%) ofrece la posibilidad de lograr la producción de biodiesel con una estabilidad oxidativa superior.

4. Conclusiones

El uso de 0,5% de efluente diluido en agua de mar puede lograr tasas de producción significativas a una tasa de dilución de 0.21/día, y la producción podría mejorarse aumentando esta tasa de dilución a 0.61/día. Este aspecto debe estudiarse con considerable profundidad.

La cepa BEA_IDA_0071B mostró la eliminación máxima de N (24.9 mgN/Ld) y el rendimiento de N (93 mgN/gB). La eliminación de P varió entre 0,8 y 2 mgP/Ld y el rendimiento de P entre 2,2 y 4,8 mgP/gB. Los experimentos realizados no mostraron diferencias significativas en el crecimiento bacteriano en ambos medios nutrientes a lo largo del período de incubación, a pesar de la mayor actividad microbiológica en el medio efluente como se muestra en los resultados de CDOM.

El análisis microbiológico de la biomasa confirma la viabilidad, el potencial y los beneficios de las cepas cosechadas a través de una malla y lavadas con agua destilada porque estos resultados mostraron el cumplimiento de la legislación vigente para productos alimenticios. El análisis bioquímico demostró que los carbohidratos eran la fracción dominante 40-60% DW, seguidos por las proteínas 13-40% DW, luego los lípidos 2.7-20% DW para todas las cepas y medios nutritivos. BEA_IDA_0070B mostró el contenido máximo de carbohidratos (64% DW), BEA_IDA_0072B el contenido máximo de proteínas (38% DW). Siguiendo lo anterior, cada una de las cepas marinas estudiadas en este trabajo ofrece un enorme potencial para el tratamiento de aguas residuales, fácil recolección, control de crecimiento bacteriano y biomasa limpia con una amplia gama de posibilidades (pesticidas, alimentos acuícolas, piensos compuestos, biofertilizantes, biodiesel, nutracéuticos y farmacéuticos).

El uso del efluente como fuente alternativa de nutrientes para los cultivos de microalgas parece ser atractivo al tiempo que reduce el grave y peligroso problema del impacto ambiental debido al tratamiento y las descargas. Estos resultados preliminares respaldan la posibilidad de producir valiosa biomasa de microalgas que depura las aguas residuales o el efluente, previene el crecimiento de bacterias y proporciona un suministro de agua.

O

Tabla 8: Resultados de los perfiles de ácidos grasos para las diferentes cepas estudiadas en el medio de control f/2 y en el medio 0.5% de efluente. No hubo diferencias significativas entre los medios nutrientes (p> 0.800).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir biomasa de una microalga, donde el método comprende: cultivar la microalga en un efluente diluido en agua de mar,

donde la microalga se selecciona del grupo que consiste en una cepa del género Anabaena, una cepa del género Dolichospermum, una cepa del género Chrysoreinhardia, una cepa del género Halochlorella, y combinaciones de las mismas, donde el efluente diluido presenta, al inicio del cultivo:

- concentraciones de nitrógeno total (N) de 90±60 mg/L (es decir, en el rango 30 150 mg/L), preferiblemente en el rango 60-100 mg/L y más preferiblemente en el rango 70-90 mg/L;

- concentraciones de fósforo total (P) de 8±7 mg/L (es decir, en el rango 1-15 mg/L), preferiblemente en el rango 2-10 mg/L y más preferiblemente en el rango 3-6 mg/L;

- siempre que el cociente N/P esté en el rango 5-40, preferiblemente en el rango 15-38 y más preferiblemente en el rango 25-35.

2. Un método para la biorremediación de un efluente, donde el método comprende: cultivar una microalga en el efluente diluido en agua de mar,

3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la cepa del género Anabaena es una cepa de la especie Anabaena sp, donde la cepa del género Dolichospermum es una cepa de la especie Dolichospermum sp, donde la cepa del género Chrysoreinhardia es una cepa de la especie Chrysoreinhardia giraudii, y donde la cepa del género Halochlorella es una cepa de la especie Halochlorella rubescens.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde la cepa de la especie Anabaena sp. es BEA_IDA_0069B, donde la cepa de la especie Dolichospermum sp. es BEA_IDA_0070B, donde la cepa de la especie Chrysoreinhardia giraudii es BEA_IDA_0071B, y donde la cepa de la especie Halochlorella rubescens es BEA_IDA_0072B.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la concentración de amonio (N-NH ⁴ +) con respecto a la concentración de nitrógeno total (N) en el efluente diluido es de al menos el 50%, preferiblemente de al menos el 60% y más preferiblemente de al menos el 70%.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la inoculación de la microalga en el medio de cultivo se realiza con al menos 50 mg/L de biomasa seca, preferiblemente con 50-90 mg/L de biomasa seca.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el método comprende además la etapa de cosechar la biomasa de la microalga por filtración.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, donde la filtración se realiza a través de una malla de 50 ^m.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el cultivo se realiza en fotobiorreactores en condiciones ambientales de exterior, preferiblemente en fotobiorreactores de al menos 400 L.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el cultivo se realiza bajo una irradiación media de al menos 1750 emoles de fotones/m2 s.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el cultivo se realiza bajo un aporte de CO ² por pulsos de un minuto cada hora durante las horas diurnas (98.5% de aire: 1.5% CO ² ) y/o aireación mediante bomba soplante.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-10, que comprende además producir un material procesado a partir de la biomasa de microalga.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde el material procesado se selecciona del grupo que consiste en un fertilizante, un pesticida, un pienso, un pienso para peces, un biocombustible, un combustible para aviones, un biodiesel, un pigmento, un tensioactivo, un cosmético, un agente farmacéutico, un suplemento para la salud, o bioplásticos

14. Un método para producir un extracto de biomasa de una microalga, donde el método comprende:

i) cultivar la microalga en un efluente diluido en agua de mar,

- siempre que el cociente N/P esté en el rango 5-40, preferiblemente en el rango 15-38 y más preferiblemente en el rango 25-35;

ii) cosechar la biomasa de la microalga por filtración;

iii) someter a la biomasa de microalga a un método de ruptura celular; y

iv) obtener el extracto resultante de la ruptura celular.

15. El método de la reivindicación 13, donde el método de ruptura celular se selecciona del grupo que consiste en molino de bolas, homogeneización a alta velocidad, homogeneización a alta presión, ultrasonicación, microondas, campo eléctrico pulsante, métodos químicos, hidrólisis enzimática, y extracción en agua subcrítica.

16. Una biomasa de microalga obtenible mediante el método de acuerdo con una cualquier de las reivindicaciones 1 o 3-10.