WO2012168662A1 - Procede d'enrichissement en epa de microalgues du genre monodus, cultivees en mode mixotrophe - Google Patents

Procede d'enrichissement en epa de microalgues du genre monodus, cultivees en mode mixotrophe Download PDF

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WO2012168662A1
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monodus
genus
microalgae
culture
microalga
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Pierre Calleja
Khadidja Romari
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Fermentalg
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the invention relates to a new microalgae strain belonging to the genus Monodus, particularly adapted to the production of fatty acids in the mixotrophic culture mode.
  • This new strain of Monodus is useful for producing ⁇ (Eicosapentaenoic acid) in mixotrophic mode, especially in the presence of a discontinuous supply of light in the form of flashes.
  • microalgae are photosynthetic microorganisms of autotrophic nature, that is to say having the ability to grow autonomously by photosynthesis.
  • microalgae species found in freshwater or oceans are strictly autotrophic, that is, they can only grow by photosynthesis. For these, the presence in their medium of carbon substrates or organic material is not favorable to them and even tends to inhibit their growth.
  • heterotrophic are able to develop in the total absence of light, by fermentation, that is to say by exploiting the organic matter.
  • microalgae species for which photosynthesis remains essential for their development, are able to take advantage of photosynthesis and the organic matter present. in their midst. These intermediate species, called mixotrophs, can be grown both in the presence of light and organic matter.
  • Microalgae are currently the subject of many industrial projects because some species are able to accumulate or secrete significant amounts of lipids, including polyunsaturated fatty acids.
  • microalgae offer several advantages over fish oils: they are cultivable in vitro under controlled conditions, which allows the production of a biomass of relatively constant biochemical composition, and, on the other hand, unlike fish oils, they do not have an unpleasant smell and their lipids contain little or no cholesterol.
  • the lipids produced by microalgae have a simpler fatty acid profile than that of fish oils, which limits the separation steps of the fatty acids of interest.
  • the taxonomic classification of eukaryotic algae contains 14 phyla. There are important variations among the different species of the different classes composing these phylums with regard to the content of microalgae in polyunsaturated fatty acids. In addition, the relative proportions of EPA and DHA in the lipid profiles vary according to the species and the culture conditions.
  • the main microalgae of interest, producers of EPA and DHA are marine species. However, among the hundreds of thousands of marine microalgae species, only a small number have a high content of both of these fatty acids at the same time and sufficient capacity to be cultured in vitro.
  • the species of interest are mainly Bacillariophytes (or diatoms) derived from marine phytoplankton. They are generally characterized by an active production of EPA, but often by relatively low levels of DHA.
  • freshwater microalgae do not usually contain EPA or DHA.
  • the only freshwater microalgae capable of producing them seem to be part of the Pleurochloridaceae family, particularly in species of the genus Monodus [Pencreac'h et al. (2004) Marine microalgae: alternative source of EPA and DHA, Lipids, 11 (2): 118-222].
  • JP9252764 and JP60087798 thus describe strains of Monodus subterraneus grown in the autotroph which can accumulate an amount of EPA up to 3.8% of their dry weight. These strains were cultured under laboratory conditions, ie in inorganic culture media, in flasks or bioreactors of low volumetric capacity with a continuous light supply.
  • An alternative to autotrophic culture would be to practice cultures in heterotrophic mode, that is to say in the absence of light with a supply of energy in the form of carbon substrates, or, in mixotrophic mode, that is to say with a light input of less intensity and in the presence of a supply of organic substrate.
  • the cultivation and selection process consisted more particularly in cultivating microalgae under mixotrophic conditions, in the presence of discontinuous illumination, especially in the form of flashes.
  • the subject of the present invention is therefore a process for enriching microalgae of the Monodus genus with polyunsaturated fatty acids, more particularly with EPA, characterized in that it comprises the cultivation of a microalga of the Monodus genus in mixotrophic mode.
  • the mixotrophic culture of this microalga is preferably carried out in the presence of at least 5 mM, preferably at least 10 mM, more preferably at least 20 mM, and even more preferably more than 50 mM of a carbon substrate.
  • Those skilled in the art know how to determine the maximum concentrations of the carbon substrate to be used.
  • the cultivation mixotrophy mode of this microalga can be carried out in the presence of 10-200mM, preferably between 20 and 50mM of carbon substrate.
  • the supply of the substrate is ensured continuously during the culture, to allow the cells to accumulate a high concentration of lipids. Additional substrate is added to the culture medium during the culture process to maintain a constant concentration of the carbonaceous substrate in the culture medium.
  • the concentrations of the carbon substrate to be added to the culture can be determined to maintain a constant concentration of the carbon substrate in the culture medium.
  • the culture can be carried out with cumulative concentrations of carbon substrate of 5 mM to 1 M, preferably from 50 mM to 800 mM, more preferably from 70 mM to 600 mM, and still more preferably from 100 mM to 500 mM. mM.
  • the carbonaceous substrate preferably comprises, in pure form or as a mixture of glucose, cellulose, lactate, starch, lactose, sucrose, acetate and / or glycerol derivatives.
  • a particularly preferred carbon substrate is sodium acetate.
  • the carbon substrate contained in the culture medium may consist of complex molecules or a mixture of substrates.
  • Products resulting from the biotransformation of starch, for example from corn, wheat or potato, in particular starch hydrolysates, which consist of small molecules, constitute, for example, substrates carbonates adapted to the mixotrophic culture of microalgae according to the invention.
  • This method is more particularly intended for the implementation of new microalgae strains of the genus Monodus (Phylum: Xanthophyceae, Order: Mischococcales, Family: Pleurochloridaceae) [ITIS Catalog of Life, 2010] selected for their mixotrophic nature, especially for their capacity to be cultivated with a light input greater than 10 ⁇ l, in a mineral medium, for example BG11 medium [Allen, MM & Stanier, RY 1968. Growth and division of some unicellular blue-green algae. J. Gen. Microbiol. 51: 199-202] in which a carbon substrate is added.
  • the carbonaceous substrate comprises glycerol in a concentration equivalent to or greater than 5 mM.
  • a representative strain of the Monodus strains according to the invention is the strain FCC 757 isolated by the applicant and deposited at the CCAP, on May 27, 2011, under the number CCAP 848/3. Such strains are capable of producing significant amounts of EPA when grown in a mixotrophic mode.
  • CCAP strain 848/3 belongs to the species Monodus subterraneus. Nevertheless, given its affiliation with other species of Monodus, the invention relates to any species of microalga of the genus Monodus having a mixotrophic character, as described in the present application.
  • the isolated Monodus strains according to the invention are the first described to be capable of producing, in a mixotrophic condition, significant amounts of EPA that may represent more than 10% of the total lipids contained in the microalgae.
  • the biomass obtained is also generally from 10 to 50%, more often from 20 to 40%, higher than that of the same culture carried out in autotrophic mode.
  • the subject of the invention is thus a process for cultivating microalgae of the Monodus genus in mixotrophic mode, in particular with a view to producing polyunsaturated fatty acids, such as ⁇ .
  • This culture method proves particularly advantageous when the microalgae are cultivated in the presence of a variable or discontinuous light input, that is to say when the flow of light brought to the algae in culture is variable or discontinuous over time.
  • a variable or discontinuous illumination of crops especially in the implementation of a mixotrophic culture, had a favorable impact on the development of algae and allowed to increase the productivity of these, in particular as regards their production of lipids.
  • the inventor believes that a discontinuous or variable light supply to microalgae has the effect of causing a "stress" favorable to lipid synthesis. Part of this may be explained by the fact that, in nature, microalgae tend to accumulate lipid reserves to withstand the stresses of their environment.
  • the periods of darkness may occupy more than a quarter of the time, preferably half or more of the time, during which the algae are grown.
  • the illumination is discontinuous and more preferably in the form of flashes, that is to say over periods of short duration.
  • the successive phases of illumination are then generally between 5 seconds and 10 minutes, preferably between 10 seconds and 2 minutes, more preferably between 20 seconds and 1 minute.
  • the illumination may be variable, which means that the illumination is not interrupted by dark phases, and that the light intensity varies over time.
  • This light variation can be periodic, cyclic or even random.
  • the illumination can vary continuously, that is to say that the light intensity is not constant and varies continuously over time (dpmol (photons) / dt ⁇ 0).
  • the invention aims, in particular, a microalgae culture method of the genus Monodus, characterized in that said algae are cultivated in the dark with a discontinuous or variable light input over time, whose intensity in micromoles of photons vary by an amplitude equal to or greater than 10 pmol. m '2 , s "1 at several times per hour, preferably equal to or greater than 50 pmol.m “ 2 . s "1 , more preferably equal to or greater than 100 pmol, m " 2 , s "1.
  • the amplitude of this variation of light intensity is generally greater than 10 pmol. m “2 , s “ 1 , preferably greater than or equal to 20 pmol. m “2, s “ 1 , more preferably greater than or equal to 50 ⁇ . m “2 , s " 1 .
  • the light intensity reaches, each hour, preferably several times in the hour, a high and low value, whose difference is equal to or greater than that indicated above.
  • said luminous intensity successively reaches the values 50 ⁇ . m “2 , s “ 1 and 100 pmol. m “2 , s " 1 every hour, more preferably the values 0 and 50 pmol. m “2 , s “ 1 , more preferably still 0 and 100 pmol. m “2 , s " 1 .
  • the contribution of light in the cultures can be obtained by lamps distributed around the external wall of the fermenters.
  • a clock triggers these lamps for defined lighting times.
  • Fermentors are preferably located in an enclosure away from daylight, which can control the ambient temperature.
  • the culture method according to the invention thus makes it possible to select Monodus strains of a mixotrophic nature, similar to that isolated by the applicant and deposited at the CCAP and having a high yield of polyunsaturated fatty acids.
  • This method is characterized in that it comprises one or more of the following steps: - The cultivation of different strains of the genus Monodus in the dark with discontinuous or variable light input over time, the intensity of which in micromoles of photons preferably varies by an amplitude equal to or greater than 50 pmol. m “2 , s " 1 at least once an hour;
  • strains of Monodus can be cultured, in parallel, on microplates in the same enclosure with precise monitoring of the conditions and evolution of the different cultures. It is thus easy to know the response of the various strains to the discontinuous illumination and, where appropriate, the addition of one or more carbon substrates in the culture medium. Strains that respond favorably to discontinuous illumination and carbon substrates, generally offer a better yield for lipid production in terms of quality (polyunsaturated fatty acids more abundant in the lipid profile) and quantitative (lipids contain a higher proportion EPA).
  • the microalgae can be selected in a fermenter from a pool of diversified microalgae, the preferred variants of which are to be selected by the selection method according to the invention, combining discontinuous or variable light with mixotrophic culture conditions.
  • the culture is practiced by maintaining the microalgae in cultures over many generations, then an isolation of the components that have become the majority in the culture medium is carried out at the end of the culture.
  • the culture process according to the invention is characterized more particularly in that the culture of the strains is carried out over several generations, preferably in the mixotrophic mode, and in that the cells loaded with lipids are harvested.
  • the object of the invention is therefore also the production of lipids, in particular of fatty acids, via the cultivation of microalgae of the Monodus genus of a mixotrophic nature, preferably cultivated or selected according to the processes referred to above, then the recovery of the microalgae thus cultivated for to extract the lipid content, in particular ⁇ .
  • the invention also relates to the microalgae of the Monodus genus enriched in polyunsaturated fatty acids that can be obtained according to the method of the invention as previously described.
  • the total lipids of such microalgae generally comprise more than 30%, often more than 40% and sometimes even more than 50% EPA by dry weight.
  • the cultures are made in fermentors (bioreactors) of 2L useful with dedicated automata and supervision by computer station.
  • the system is regulated in pH via addition of base (1N sodium hydroxide solution) and / or acid (1N sulfuric acid solution).
  • the culture temperature is set at 23 ° C.
  • Stirring is carried out by means of 3 stirring wheels placed on the shaft according to the Rushton configuration (three-blade propellers with downward pumping).
  • the bioreactor is equipped with an external lighting system surrounding the transparent tank. The intensity as well as the light cycles are controlled by a dedicated automaton supervised by a computer station.
  • the reactors are inoculated with a pretreatment performed on a shaking table (140 rpm) in a thermostatically controlled enclosure (22 ° C.) and continuously lit at 100 ⁇ m-2 s-1.
  • Pre-cultures and cultures in bioreactors are carried out in BG11 medium supplemented with 10 mM NaHCO 3 .
  • the organic carbon used for the bioreactor mixotrophic culture is sodium acetate at concentrations between 20 mM and 50 mM.
  • the organic carbon substrate is added to the culture medium in "fed-batch" mode.
  • the total biomass concentration is monitored by measuring the dry mass (GFC filter filtration, Whatman, then drying in a vacuum oven, 65 ° C and -0.8 bar, for 24 hours minimum before weighing).

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Abstract

L'invention se rapporte à de nouvelles souches de microalgues appartenant au genre Monodus permettant une production optimale d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA, en mode mixotrophe, ainsi qu'à un procédé de sélection et de culture de telles souches, utilisant un apport de lumière discontinu sous forme de flashs.

Description

PROCEDE D'ENRICHISSEMENT EN EPA DE MICROALGUES DU GENRE MONODUS. CULTIVEES EN MODE MIXOTROPHE
L'invention se rapporte à une nouvelle souche de microalgue appartenant au genre Monodus, particulièrement adaptée à la production d'acides gras en mode de culture mixotrophe.
Cette nouvelle souche de Monodus est utile pour produire de ΙΈΡΑ (acide éicosapentaénoïque) en mode mixotrophe, notamment en présence d'un apport discontinu de lumière sous forme de flashs.
Préambule
Il est rappelé que les microalgues sont des microorganismes photosynthétiques à caractère autotrophe, c'est-à-dire ayant l'aptitude de croître de manière autonome par photosynthèse.
Les microalgues se développent aussi bien dans les milieux aquatiques marins, qu'en eaux douces ou saumâtres, ainsi que dans divers habitats terrestres.
La plupart des espèces de microalgues rencontrées dans l'eau douce ou les océans sont strictement autotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent croître que par photosynthèse. Pour celles-ci, la présence dans leur milieu de substrats carbonés ou de matière organique ne leur est pas favorable et tend même à inhiber leur croissance.
Cependant, un certain nombre d'espèces de microalgues, de familles et d'origines très diverses, s'avèrent ne pas être strictement autotrophes. C'est ainsi que certaines d'entre-elles, dites hétérotrophes, sont capables de se développer en l'absence totale de lumière, par fermentation, c'est-à- dire en exploitant la matière organique.
D'autres espèces de microalgues, pour lesquelles la photosynthèse reste indispensable à leur développement, sont capables à la fois de tirer parti de la photosynthèse et de la matière organique présente dans leur milieu. Ces espèces intermédiaires, dites mixotrophes, peuvent être cultivées à la fois en présence de lumière et de matière organique.
Cette particularité des algues dites « mixotrophes » semble être liée à leur métabolisme, qui leur permet d'opérer simultanément photosynthèse et fermentation. Les deux types de métabolisme co-existent avec un effet global positif sur la croissance des algues [Yang C. et al. (2000) Biochemical Engineering Journal 6 :87-102].
A l'heure actuelle, la classification des algues se fonde encore largement sur des critères morphologiques et sur la nature des pigments photosynthétiques que contiennent leurs cellules. De ce fait, elle est peu indicative du caractère autotrophe, hétérotrophe ou mixotrophe des espèces d'algues, alors que celles-ci recouvrent une très grande diversité d'espèces et de formes [Dubinsky et al. 2010, Hydrobiologia, 639:153-171].
Les microalgues font l'objet actuellement de nombreux projets industriels car certaines espèces sont capables d'accumuler ou de sécréter des quantités importantes de lipides, notamment d'acides gras polyinsaturés.
Parmi ces acides gras polyinsaturés, certains hautement insaturés de la série des omégas 3 (AGHI ou PUFA-u>3), en particulier l'acide éicosapentaénoïque (EPA, C20:5 ω3) et l'acide docosahexaénoïque (DHA, C22:6 ω3) ont une importance nutritionnelle reconnue et présentent de fortes potentialités en terme d'applications thérapeutiques [Horrocks L.A. et al. (2000) Health Benefits of DHA. Pharmacol. Res. 40: 211-225].
Les huiles de poissons, issues de l'industrie de la pêche, sont actuellement la principale source commerciale de ce type d'acides gras. Toutefois, alors que ces huiles trouvent de nouvelles applications (complément alimentaire en aquaculture, intégration dans les margarines), les ressources halieutiques marines se raréfient du fait d'une activité de pêche intensive.
De nouvelles sources d'EPA et de DHA doivent donc être recherchées afin de répondre, dans le futur, à la demande croissante du marché pour ce type d'acides gras polyinsaturés. Outre leur capacité à synthétiser les acides gras de novo, les microalgues offrent plusieurs avantages par rapport aux huiles de poisson : elles sont cultivables in vitro dans des conditions contrôlées, ce qui permet la production d'une biomasse de composition biochimique relativement constante, et, d'autre part, contrairement aux huiles de poissons, elles ne présentent pas d'odeur désagréable et leurs lipides ne contiennent pas ou peu de cholestérol.
Enfin, les lipides produits par les microalgues ont un profil d'acides gras plus simple que celui des huiles de poissons, ce qui limite les étapes de séparation des acides gras d'intérêt.
La classification taxonomique des algues eucaryotes contient 14 phylums. Il existe des variations importantes parmi les différentes espèces des différentes classes composant ces phylums en ce qui concerne la teneur des microalgues en acides gras polyinsaturés. Par ailleurs, les proportions relatives d'EPA et de DHA dans les profils lipidiques, varient selon l'espèce et les conditions de culture.
Les principales microalgues d'intérêt, productrices d'EPA et de DHA sont des espèces marines. Cependant, parmi les centaines de milliers d'espèces de microalgues marines, seul un faible nombre présentent une teneur élevée de ces deux acides gras à la fois et une capacité suffisante à être cultivée in vitro. Les espèces d'intérêt sont principalement des Bacillariophytes (ou diatomées) issues du phytoplancton marin. Elles se caractérisent généralement par une production active d'EPA, mais souvent par des teneurs assez faibles en DHA.
Bien que riches en acide α-linolénique (C18:3 UJ3), les microalgues d'eau douce ne contiennent généralement pas d'EPA, ni de DHA. Les seules microalgues d'eau douce capables d'en produire semblent à ce jour faire partie de la famille des Pleurochloridaceae, notamment chez les espèces du genre Monodus [Pencreac'h et al. (2004) Les microalgues marines : source alternative d'EPA et de DHA, Lipides, 11(2) :118-222].
Les demandes de brevet japonais JP9252764 et JP60087798 décrivent ainsi des souches de Monodus subterraneus cultivées en mode autotrophe pouvant accumuler une quantité d'EPA allant jusqu'à 3,8 % de leurs poids sec. Ces souches ont été cultivées en conditions de laboratoire, c'est-à-dire dans des milieux de culture inorganiques, en flacons ou en bioréacteurs de faible capacité volumétrique avec un apport lumineux continu.
Dans la perspective d'une exploitation industrielle, un tel mode de culture s'avère inadapté. En effet, pour être rentable, la production de biomasse doit pouvoir être réalisée dans des photo-bioréacteurs fermés de grande dimension. Or, un tel mode de culture est difficile à réaliser en mode autotrophe, car lorsque la densité des cellules augmente dans le milieu de culture, les cellules ont de plus en plus de difficulté à capter la lumière provenant de l'extérieur du réacteur. Il est alors nécessaire de brasser activement le milieu de culture, ce qui nécessite une importante dépense énergétique.
Une alternative à la culture en mode autotrophe serait de pratiquer les cultures en mode hétérotrophe, c'est-à-dire en l'absence de lumière avec un apport d'énergie sous forme de substrats carbonés, ou bien, en mode mixotrophe, c'est-à-dire avec un apport de lumière de moindre intensité et en présence d'un apport de substrat organique.
Cependant, les souches de Monodus existantes, ainsi que les procédés de culture s'y rapportant, sont très peu adaptés aux cultures en mode mixotrophe, et encore moins hétérotrophe, de ce genre de microalgues.
Ainsi, c'est au terme de nombreuses expérimentations dans des conditions de lumière inhabituelles et par l'adjonction de différents substrats que le demandeur est parvenu à isoler des souches de microalgue du genre Monodus, cultivables en mode mixotrophe, permettant, dans les conditions de la présente invention, une production optimale d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA.
Une souche (FCC 757) représentative des nouvelles souches de Monodus ainsi isolées et sélectionnées, a été déposée auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa, Scottish Association for Marine Science, Dunstaffnage Marine Laboratory, Oban, Argyll PA371QA, Ecosse, Royaume-Uni) selon les dispositions du Traité de Budapest, le 27 mai 2011 sous le numéro d'accession CCAP 843/3.
Le procédé de culture et de sélection a consisté plus particulièrement à cultiver les microalgues en conditions de mixotrophie, en présence d'un éclairement discontinu, notamment sous forme de flashs.
L'alternance rapprochée de phases éclairées et de phases obscures, perçue généralement comme stressante pour les microalgues, a permis, de façon surprenante, d'obtenir des souches de Monodus une production élevée d'acides gras polyinsaturés. Cette mise en œuvre des souches selon l'invention ouvre la perspective d'une production industrielle d'acides gras polyinsaturés, en particulier d'EPA, dans des fermenteurs bénéficiant d'un apport lumineux réduit, et devrait donc permettre de réaliser des économies d'énergie par rapport aux modes de culture autotrophes.
Les différents aspects et avantages de l'invention sont détaillés ci- après.
Description détaillée
La présente invention a donc pour objet un procédé d'enrichissement de microalgues du genre Monodus en acides gras polyinsaturés, plus particulièrement en EPA, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une microalgue du genre Monodus en mode mixotrophe.
La culture en mode mixotrophe de cette microalgue s'effectue préférentiellement en présence d'au moins 5 mM, de préférence au moins 10 mM, plus préférentiellement au moins 20 mM, et encore plus préférentiellement plus de 50 mM d'un substrat carboné. L'homme du métier sait déterminer les concentrations maximales du substrat carboné à utiliser. Généralement la culture en mode mixotrophie de cette microalgue peut s'effectuer en présence de 10-200mM, de préférence entre 20 et 50mM de substrat carboné. L'apport du substrat est assuré continuellement pendant la culture, afin de permettre aux cellules d'accumuler une concentration importante de lipides. Du substrat additionnel est ajouté au milieu de culture pendant le procédé de culture pour maintenir une concentration constante du substrat carboné dans le milieu de culture. L'homme du métier sait déterminer les concentrations du substrat carboné à ajouter à la culture pour maintenir une concentration constante du substrat carboné dans le milieu de culture. Généralement, la culture peut s'effectuer ainsi avec des concentrations cumulatives de substrat carboné de 5 mM à 1 M, de préférence de 50 mM à 800 mM, plus préférentiellement de 70 mM à 600 mM, et encore plus préférentiellement de 100 mM à 500 mM.
Le substrat carboné comprend préférentiellement, sous forme pure ou en mélange du glucose, des dérivés de cellulose, de lactate, de l'amidon, du lactose, du saccharose, de l'acétate et/ou du glycérol. Un substrat carboné particulièrement préféré est l'acétate de sodium.
Le substrat carboné contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés adaptés à la culture en mixotrophie des microalgues selon l'invention.
Ce procédé est plus particulièrement destiné à la mise en œuvre de nouvelles souches de microalgues du genre Monodus (Phylum: Xanthophycées, Ordre: Mischococcales, Famille: Pleurochloridaceae) [ITIS Catalogue of Life, 2010] sélectionnées pour leur caractère mixotrophe, notamment pour leur capacité à être cultivées avec un apport lumineux supérieur à 10 μΕ, dans un milieu minéral, par exemple le milieu BG11 [Allen, M. M. & Stanier, R.Y. 1968. Growth and division of some unicellular blue-green algae. J. Gen. Microbiol. 51 : 199-202] dans lequel est ajouté un substrat carboné. De préférence, le substrat carboné comprend du glycérol, dans une concentration équivalente ou supérieure à 5 mM. Ces nouvelles souches de Monodus peuvent être isolées et sélectionnées selon le procédé de sélection et de culture selon l'invention décrit plus loin.
Une souche représentative des souches de Monodus selon l'invention est la souche FCC 757 isolée par le demandeur et déposée à la CCAP, le 27 mai 2011 , sous le numéro CCAP 848/3. De telles souches sont capables de produire des quantités significatives d'EPA quand elles sont cultivées en mode mixotrophe.
Selon les analyses taxonomiques en cours, la souche CCAP 848/3 appartiendrait à l'espèce Monodus subterraneus. Néanmoins, compte tenu de sa filiation avec d'autres espèces de Monodus, l'invention porte sur toute espèce de microalgue du genre Monodus ayant un caractère mixotrophe, telle que décrite dans la présente demande.
A la connaissance du demandeur, les souches de Monodus isolées selon l'invention sont les premières décrites comme pouvant produire, en condition de mixotrophie, des quantités significatives d'EPA pouvant représenter plus de 10 % des lipides totaux contenus dans les microalgues.
La biomasse obtenue est par ailleurs généralement de 10 à 50 %, plus souvent de 20 à 40 %, supérieure à celle de la même culture effectuée en mode autotrophe.
L'invention a ainsi pour objet un procédé de culture de microalgues du genre Monodus en mode mixotrophe, notamment en vue de produire des acides gras polyinsaturés, tels que ΙΈΡΑ.
Ce procédé de culture s'avère particulièrement avantageux lorsqu'on cultive les microalgues en présence d'un apport lumineux variable ou discontinu, autrement dit lorsque le flux de lumière apporté aux algues en culture est variable ou discontinu au cours du temps.
Contrairement aux idées reçues, il est apparu qu'un éclairement variable ou discontinu des cultures, en particulier dans la mise en œuvre d'une culture en mode mixotrophe, avait un impact favorable sur le développement des algues et permettait d'accroître la productivité de celles-ci, notamment en ce qui concerne leur production de lipides. Sans être lié par la théorie, l'inventeur estime qu'un apport discontinu ou variable de lumière aux microalgues a pour effet de provoquer un « stress » favorable à la synthèse des lipides. Ce phénomène pourrait s'expliquer en partie, par le fait que, dans la nature, les microalgues ont tendance à accumuler des réserves lipidiques pour résister aux contraintes de leur environnement.
Par éclairement discontinu, il faut entendre un éclairement ponctué par des périodes d'obscurité. Les périodes d'obscurité peuvent occuper plus d'un quart du temps, de préférence la moitié du temps ou plus, durant lequel les algues sont cultivées.
Selon un aspect préféré de l'invention, l'éclairement est discontinu et plus préférentiellement sous forme de flashs, c'est-à-dire sur des périodes de courtes durées. Les phases successives d'éclairement sont alors généralement comprises entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
Selon un autre mode de l'invention, l'éclairement peut être variable, ce qui signifie que l'éclairement n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, et que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de lumière peut être périodique, cyclique, voire aléatoire.
Selon l'invention, l'éclairement peut varier de manière continue, c'est- à-dire que l'intensité lumineuse n'est pas constante et varie en permanence au cours du temps (dpmol(photons)/dt≠ 0).
Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairement continues et discontinues.
L'invention vise, en particulier, un procédé de culture de microalgues du genre Monodus, caractérisé en ce que lesdites algues sont cultivées dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude égale ou supérieure à 10 pmol. m'2, s"1 à raison de plusieurs fois par heure, de préférence égale ou supérieure à 50 pmol.m"2. s"1, plus préférentiellement égale ou supérieure à 100 pmol. m"2, s"1. Le point commun de ces différents modes d'éclairement, discontinu ou variable, réside dans le fait que, selon l'invention, l'intensité lumineuse apportée aux algues en culture, exprimée en micromoles de photons par seconde par mètre carré (μιτιοΙ. m"2, s"1), varie au moins une fois dans une même heure. L'amplitude de cette variation d'intensité de lumière est généralement supérieure à 10 pmol. m"2, s"1, préférentiellement supérieure ou égale à 20 pmol. m"2. s"1, plus préférentiellement supérieure ou égale à 50 μητιοΙ. m"2, s"1. Autrement dit, l'intensité lumineuse atteint, chaque heure, de préférence plusieurs fois dans l'heure, une valeur haute et basse, dont la différence est égale ou supérieure à celle indiquée ci-dessus. De préférence, ladite intensité lumineuse atteint successivement les valeurs 50 μηηοΙ. m"2, s"1 et 100 pmol. m"2, s"1 à chaque heure, plus préférentiellement les valeurs 0 et 50 pmol. m"2, s"1, plus préférentiellement encore les valeurs 0 et 100 pmol. m"2, s"1.
Il est rappelé que 1 pmol. m"2, s"1 correspond à 1 μΕ m"2, s"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature.
L'apport de lumière dans les cultures peut être obtenu par des lampes réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces lampes pour des temps d'éclairement définis. Les fermenteurs se situent préférentiellement dans une enceinte à l'abri de la lumière du jour, dont on peut contrôler la température ambiante.
Ainsi qu'a pu le constater le déposant, le fait que les souches ainsi sélectionnées présentent de bonnes aptitudes à croître en mode mixotrophe, en présence d'une lumière discontinue, prédispose lesdites souches à une production plus élevée d'acides gras polyinsaturés, notamment d'EPA.
Le procédé de culture selon l'invention permet ainsi de sélectionner des souches de Monodus à caractère mixotrophe, similaires à celle isolée par le demandeur et déposée à la CCAP et ayant un haut rendement en acides gras polyinsaturés.
Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs des étapes suivantes : - la culture de différentes souches du genre Monodus dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie préférentiellement d'une amplitude égale ou supérieure à 50 pmol. m"2, s"1 à raison d'au moins une fois par heure;
- le maintien de ladite culture sur plusieurs générations;
- l'isolement de la ou des souches dont le nombre de cellules s'est accru le plus au cours desdites générations.
Pour réaliser le criblage des souches, différentes souches de Monodus peuvent être cultivées, en parallèle, sur des microplaques dans une même enceinte avec un suivi précis des conditions et de l'évolution des différentes cultures. Il est ainsi aisé de connaître la réponse des différentes souches à l'éclairement discontinu et, le cas échéant, à l'adjonction d'un ou plusieurs substrats carbonés dans le milieu de culture. Les souches qui répondent favorablement à l'éclairement discontinu et aux substrats carbonés, offrent généralement un meilleur rendement pour la production de lipides sur le plan qualitatif (acides gras polyinsaturés plus abondants dans le profil lipidique) et quantitatif (les lipides contiennent une proportion plus élevée d'EPA).
Les microalgues peuvent être sélectionnées dans un fermenteur à partir d'un pool de microalgues diversifié et dont on cherche à sélectionner les variants avantagés par le mode de sélection selon l'invention alliant lumière discontinue ou variable avec des conditions de culture mixotrophes. Dans ce cas, la culture est pratiquée en maintenant les microalgues en cultures sur de nombreuses générations, puis un isolement des composantes devenues majoritaires dans le milieu de culture est effectué au terme de la culture.
Le procédé de culture selon l'invention se caractérise plus particulièrement en ce que la culture des souches s'effectue sur plusieurs générations, de préférence en mode mixotrophe, et en ce qu'on récolte les cellules chargées en lipides. L'invention a donc également pour but la production de lipides, notamment d'acides gras, via la culture de microalgues du genre Monodus à caractère mixotrophe, de préférence cultivées ou sélectionnées selon les procédés visés précédemment, puis la récupération des microalgues ainsi cultivées pour en extraire le contenu lipidique, en particulier ΙΈΡΑ.
Les méthodes d'extraction sélective de ΙΈΡΑ et du DHA sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J.Biochem. Physiol 37:911-917].
L'invention porte également sur les microalgues du genre Monodus enrichies en acides gras polyinsaturés, susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention tel que précédemment décrit. Les lipides totaux de telles microalgues comprennent généralement plus de 30 %, souvent plus de 40 % et parfois même plus de 50 % d'EPA en poids sec.
Exemple
Culture des souches de Monodus en bioréacteur
Les cultures sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 2L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le système est régulé en pH via l'ajout de base (solution d'hydroxyde de sodium à 1 N) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique à 1 N). La température de culture est fixée à 23°C. L'agitation est réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation placés sur l'arbre selon la configuration de Rushton (hélices tripales à pompage descendant). La vitesse d'agitation et le débit d'aération sont régulés au minimum = 100 rpm et au maximum = 250 rpm et Qmini =0,5 vvm / Qmaxi = 2 vvm respectivement. Le bioréacteur est équipé d'un système luminaire externe entourant la cuve transparente. L'intensité, ainsi que les cycles de lumière sont contrôlés par un automate dédié et supervisé par station informatique.
Les réacteurs sont inoculés avec une pré-culture réalisée sur table d'agitation (140 rpm) en enceinte thermostatée (22°C) et éclairée en continue à 100 μΕ m-2 s-1. Pré-cultures et cultures en bioréacteurs sont réalisées dans le milieu BG11 supplémenté avec 10mM en NaHCO3. Le carbone organique utilisé pour la culture en mixotrophie en bioréacteur est l'acétate de sodium à des concentrations entre 20 mM et 50 mM. Le substrat organique carboné est rajouté au milieu de culture en mode « fed-batch ».
Suivi des cultures
La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GFC, Whatman, puis séchage à l'étuve sous vide, 65°C et -0,8 bar, pendant 24h minimum avant pesée).
Concernant la quantification des lipides totaux, 107 cellules/mL ont été extraites. Les méthodes d'extraction des lipides sont connues de l'homme du métier et sont, par exemple, décrites par Bligh, E.G. et Dyer, W.J. [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J.Biochem. Physiol 37:911-917].
Lumière en flash
L'apport de la lumière dans les cultures en bioréacteur a été obtenu par des lampes LED réparties autour de la paroi externe des fermenteurs. Une horloge déclenche ces LED pour des temps d'éclairement ou des puises entre 10 et 100 uE. L'intensité lumineuse du système flash utilisé en mixotrophie est égale à celle utilisée en autotrophie (témoin).
Souche Monodus Mixotrophie Mixotrophie
Subterraneus en flash
Biomasse (% par rapport + 250% + 300%
à l'autotrophie)
Lipides totaux +20% +35%
(% par rapport
à l'autotrophie)
EPA (% par rapport +10% +40%
à l'autotrophie)

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'enrichissement en EPA (acide éicosapentaénoïque) d'une microalgue du genre Monodus, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une microalgue du genre Monodus en mode mixotrophe.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la culture en mode mixotrophe de ladite microalgue du genre Monodus s'effectue en présence d'un substrat carboné comprenant au moins 5 mM, de préférence au moins 10 mM, et plus préférentiellement au moins 20 mM de glucose, de cellulose, d'amidon, de lactose, de saccharose, d'acétate et/ou de glycérol.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit substrat carboné présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM de glycérol.
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit substrat carboné présent dans le milieu de culture comprend au moins 5 mM d'acétate de sodium, de préférence, au moins 20 mM d'acétate de sodium.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de récupération des microalgues ainsi cultivées.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la culture d'une ou plusieurs souches du genre Monodus dans l'obscurité avec un apport de lumière discontinu ou variable au cours du temps, dont l'intensité en micromoles de photons varie d'une amplitude de plus de 50 pmol. m"2, s"1 , à raison d'au moins une fois par heure; - le maintien de ladite culture sur plusieurs générations en présence d'un substrat carboné dans le milieu de culture;
- la récolte des cellules de Monodus ainsi obtenues.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'apport de lumière s'effectue sous forme de flashs.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le flashage consiste en des phases successives d'éclairement d'une durée comprise entre 5 secondes et 10 minutes, de préférence entre 10 secondes et 2 minutes, plus préférentiellement entre 20 secondes et 1 minute.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite microalgue du genre Monodus correspond à la souche FC 757, déposée le 27 mai 2011 auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 848/3.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on récupère lesdites microalgues ainsi cultivées pour extraire ΙΈΡΑ (acide éicosapentaénoïque) de leur contenu lipidique.
11. Microalgue du genre Monodus, caractérisée en ce que ses lipides totaux comprennent plus de 40 %, de préférence plus de 50 % d'EPA en poids sec.
12. Microalgue caractérisée en ce qu'elle consiste en une souche isolée du genre Monodus correspondant à la souche FC 757, déposée le 27 mai 2011 auprès de la CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa), sous le numéro CCAP 848/3.
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