CN117604060A - 一种基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素及其制备方法 - Google Patents
一种基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素及其制备方法，属于虾青素制备技术领域。所述制备方法包括以下步骤：S1、固定化的胆固醇酯酶的制备；S2、在酯化态虾青素料液中，分别加入有机溶剂和缓冲液，摇匀，放置一段时间后加入所述固定化的胆固醇酯酶，恒温振荡水解，得到酶解液；S3、将所述酶解液静置，待固定化胆固醇酯酶沉降完全后分离沉淀得到反应产物，回收固定化胆固醇酯酶，将反应产物在低温下离心去除杂质沉淀，然后萃取，即得到游离虾青素。本发明使用固定化酶技术制备固定化胆固醇酯酶，用于游离虾青素的提取，能够提高酶的稳定性，减少提取过程中虾青素的损失。
Description
技术领域
本申请属于虾青素制备技术领域，具体涉及一种基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素、制备方法及其应用。
背景技术
虾青素作为强抗氧化剂，受到广泛关注，具有广阔的应用和发展前景。南极磷虾是目前世界上仅剩的资源非常丰富但开发利用程度不高的单种可捕生物资源，其储量约6～10亿吨，富含优质的磷脂型Omega3多不饱和脂肪酸、蛋白质、虾青素等多种生物活性物质，是虾青素的良好来源。南极磷虾中的虾青素，大部分是以酯化态的形式存在，据研究报道，游离态的虾青素具有更高的生物利用率，而且目前的虾青素检测方法是以游离态的虾青素为标准，因此游离态的虾青素水解更具市场应用前景。水解酯化态虾青素的方法目前主要有皂化法和酶解法。皂化法会引起虾青素的异构化，且反应时间长，不利于虾青素的保存。酶解法反应较快，但需要加热到酶的最适温度，也会造成虾青素的损失。目前的研究通过对酶解法的优化，已经可以将反应温度控制在常温，并筛选了最佳的反应条件，使南极磷虾的游离虾青素回收率可达到95.24%。尽管酶解法可以有效地提取游离虾青素，但酶在使用后回收困难，无法重复利用，增加了酶解法的成本。
固定化酶是将酶固定在载体上，可以提高酶的稳定性，也可以对酶进行回收重复利用，同时又可以降低游离虾青素的制备成本。因此，使用固定化酶技术制备酶反应器是一个行之有效的方法。目前的固定化酶方法多种多样，主要有物理的吸附、包埋及化学的交联、共价结合等。吸附法对酶活的影响较小，但吸附不牢，酶在使用过程中损失较多。包埋法则不利于酶和底物的充分接触。交联和共价结合法又因为化学反应的存在对酶活的影响较大。将多种方法结合起来可以提高固定化酶的性能表现。现在对脂肪酶的固定化技术已经有较多研究，但对分解虾青素酯的固定化酶研究鲜有报道，本发明可为该领域的研究和应用提供基础。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素及其制备方法，本发明使用固定化酶技术制备固定化胆固醇酯酶，用于游离虾青素的提取，能够提高酶的稳定性和重复利用率，降低了游离虾青素的提取成本及减少提取过程中虾青素的损失。
本发明一方面提供了一种基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将硅藻土加入胆固醇酯酶溶液中，充分搅拌后离心回收硅藻土，再加入到EGDE溶液中，交联后离心收集沉淀，然后使用去离子水洗涤，即得到固定化的胆固醇酯酶；
S2、在酯化态虾青素料液中，分别加入有机溶剂和缓冲液，摇匀，放置一段时间后加入所述固定化的胆固醇酯酶，恒温振荡水解，得到酶解液；
S3、将所述酶解液静置，待固定化胆固醇酯酶沉降完全后分离沉淀得到反应产物，回收固定化胆固醇酯酶，将反应产物在低温下离心去除杂质沉淀，即得到游离虾青素。
可选地，所述步骤S1中所述硅藻土在溶液中的浓度为0.5-1g/ml，所述胆固醇酯酶溶液的浓度为10-20mg/ml，所述EGDE溶液的EGDE含量为0.01-0.03%。
可选地，所述步骤S2中所述有机溶剂为丙酮，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
可选地，所述步骤S2中所述丙酮的添加量为酯化态虾青素料液体积的1-3倍；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0-7.5，添加量为酯化态虾青素料液体积的1-3倍。
可选地，所述步骤S2中加入所述固定化的胆固醇酯酶后的反应体系中的酯化态虾青素浓度为0.5-2 μg/ml，酶浓度为2-8U/ml。
可选地，所述步骤S3中离心条件为：在温度3-5℃、转速5000-8000rpm条件下离心4-8min。
可选地，所述步骤S3中在反应产物离心后得到的上清液中加入正己烷，涡旋振荡，静置分层，然后将上层正己烷层取出待用，下层溶液再加入正己烷重复提取2-3次，合并正己烷相，减压浓缩，回收有机溶剂，即得到游离虾青素。
可选地，所述步骤S3中所述正己烷的添加量为上清液体积的0.5-2倍。
本发明另一方面提供了一种基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素，所述游离虾青素采用如上述的制备方法制得。
本发明又一方面提供了一种如上述的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素在制备功能性食品、保健品、化妆品中的应用。
本申请的有益效果包括但不限于：
1、本发明提供的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法中，使用固定化酶技术制备固定化胆固醇酯酶，用于游离虾青素的提取，提高了胆固醇酯酶的稳定性，使胆固醇酯酶可以回收重复利用，降低了游离虾青素的提取成本，且可以减小提取过程中虾青素的损失；
2、本发明提供的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法中，硅藻土是一种具有天然的微纳米多孔结构的矿物，作为固定化酶的载体，与常用的介孔硅相比不需要复杂的制备工艺，具有吸附效果好，成本低廉的优点；
3、本发明提供的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法中，使用复合方法制备固定化酶，其中，吸附法有利于减少固定化过程中酶活的损失，交联法有利于固定化酶的稳定，增加酶的可重复利用性；
4、本发明提供的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法中，胆固醇酯酶进行交联，与其它酶相比，具有反应温度低、反应速率高的优点；
5、本发明提供的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法，采用酶解法水解酯化态虾青素，与皂化法相比反应速率高，对产物的保护较好，不易使虾青素异构化；
6、本发明提供的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法，使用正己烷-丙酮体系对产物游离虾青素进行分离，该体系对游离虾青素具有更强的分离效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法流程图；
图2为本申请各实施例和对比例游离虾青素的回收率示意图；
图3为本申请各实施例和对比例固定化胆固醇酯酶的酶活示意图；
图4为本申请各实施例和对比例固定化酶的酸碱稳定性示意图；
图5为本申请各实施例和对比例固定化酶的热稳定性。
具体实施方式
为了更清楚地阐释本发明的整体构思，下面以示例的方式进行详细说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”“一些实施例”“示例”“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
在下文中，将结合示例性实施例来详细说明本发明的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素及其制备方法。图1为本申请基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法流程图。
如图1所示，在本发明的一个示例性实施例中，基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法可通过以下步骤来实现：
S1、固定化胆固醇酯酶的制备：将浓度为0.5-1 g/ml硅藻土加入浓度为10-20 mg/ml胆固醇酯酶溶液中，搅拌30-40min后离心回收硅藻土，再加入到EGDE含量为0.01-0.03%的EGDE溶液中，交联30-40min后离心收集沉淀，优选地，交联时间为30min。然后使用去离子水洗涤3-4次终止交联，去除残余的EGDE和表面水分，即得到固定化的胆固醇酯酶。
固定化酶的催化效率并不会随着浓度的升高一直升高，在本申请浓度之下以硅藻土为载体制备固定化胆固醇酯酶，既能够提升了胆固醇酯酶的稳定性，保证固定化酶的催化效率，并且胆固醇酯酶可以重复利用，又可以节省成本。同时，使用EGDE进行交联，若交联时间过长则会使酶交联过度，损失活性，若交联时间太短则使反应不够充分。本申请的交联时间能够提高了固定化酶的稳定性。
S2、酯化态虾青素的酶解：在酯化态虾青素料液中，分别加入丙酮和pH值为7.0-7.5的Tris-HCl缓冲液，摇匀，在25℃恒温条件下放置30 min，然后加入上述固定化的胆固醇酯酶，此时反应体系中的酯化态虾青素浓度为0.5-2 μg/ml，酶浓度为2-8 U/ml，在恒温条件下振荡水解，水解条件为25℃恒温振荡90min。得到酶解液。
其中，丙酮的添加量为酯化态虾青素料液体积的1-3倍，优选地，丙酮的添加量为酯化态虾青素料液体积的2倍。Tris-HCl缓冲液的添加量为酯化态虾青素料液体积的1-3倍，优选地，Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0；Tris-HCl缓冲液的添加量为酯化态虾青素料液体积的2倍。
胆固醇酯酶具有反应温度低、反应速率高等优点。选取胆固醇酯酶为酯化态虾青素的水解酶，能够缩短酶解的反应时间，降低反应温度，有利于虾青素的保存。因为酶的反应是在溶液中进行，使用丙酮和Tris-HCl缓冲液是为了溶解酯化态虾青素料液，同时为酶的反应提供合适的条件。胆固醇酯酶的最适ph为7.0，在此条件下具有最大酶促反应速率。
S3、游离虾青素的分离提取：将酶解液静置，待固定化胆固醇酯酶沉降完全后分离沉淀得到反应产物，回收固定化胆固醇酯酶，将反应产物在温度3-5℃、转速5000-8000rpm条件下离心4-8min，去除杂质沉淀得到上清液，优选地，将反应产物在温度4℃、转速5000-8000rpm条件下离心5min。向得到的上清液中加入正己烷，涡旋振荡1-3min，静置分层，然后将上层正己烷层取出待用，下层溶液再加入正己烷重复提取2-3次，合并正己烷相，减压浓缩，回收有机溶剂，即得到游离虾青素。其中，正己烷的添加量为上清液体积的0.5-2倍。
通过沉降回收固定化酶并不能回收完全，因此需要通过离心进一步去除不溶的杂质。低温离心则能够防止虾青素被破坏。正己烷的沸点较高，不易挥发，对环境的影响较小。因此，正己烷-丙酮体系对产物游离虾青素具有更强的分离效果。
实施例1
本实施例采用上述制备方法制备了一种游离虾青素，具体步骤如下：
1、将浓度为1g/ml硅藻土加入20mg/ml的胆固醇酯酶溶液中，搅拌30min使胆固醇酯酶被硅藻土充分吸附。
2、离心回收硅藻土，加入到0.02%的EGDE溶液中，交联30min后离心收集沉淀，使用去离子水洗涤3次终止交联，即得到固定化的胆固醇酯酶。
3、在酯化态虾青素料液中，分别加入2倍体积的丙酮和pH为7.0的Tris-HCl缓冲液，摇匀，25℃恒温放置30min，加入固定化的胆固醇酯酶，使反应体系的酯化态虾青素浓度为1μg/ml，酶浓度为4U/ml，25℃恒温振荡水解90min得到酶解液。
4、将酶解液静置，待固定化胆固醇酯酶沉降完全后分离沉淀得到反应产物，回收固定化胆固醇酯酶。
5、将上述反应产物在4℃、8000rpm条件下离心5min去除杂质沉淀得到上清液，向上清液中加入等体积的正己烷，涡旋振荡1min，静置分层，将上层正己烷层取出待用，下层溶液再加入正己烷重复提取2次，合并正己烷相。
6、减压浓缩，回收有机溶剂，所得产物即为游离虾青素。
实施例2
本实施例采用上述制备方法制备了另一种游离虾青素，具体步骤如下：
1、将浓度为1g/ml硅藻土加入10mg/ml的胆固醇酯酶溶液中，搅拌30min使胆固醇酯酶被硅藻土充分吸附。
2、离心回收硅藻土，加入到0.02%的EGDE溶液中，交联30min后离心收集沉淀，使用去离子水洗涤3次终止交联，即得到固定化的胆固醇酯酶。
3、在酯化态虾青素料液中，分别加入2倍体积的丙酮和pH为7.0的Tris-HCl缓冲液，摇匀，25℃恒温放置30min，加入固定化的胆固醇酯酶，使反应体系的酯化态虾青素浓度为1μg/ml，酶浓度为2U/ml，25℃恒温振荡水解90min得到酶解液。
4、将酶解液静置，待固定化胆固醇酯酶沉降完全后分离沉淀得到反应产物，回收固定化胆固醇酯酶。
5、将上述反应产物在4℃、8000rpm条件下离心5min去除杂质沉淀得到上清液，向上清液中加入0.5倍体积的正己烷，涡旋振荡1min，静置分层，将上层正己烷层取出待用，下层溶液再加入正己烷重复提取2次，合并正己烷相。
6、减压浓缩，回收有机溶剂，所得产物即为游离虾青素。
实施例3
本实施例采用上述制备方法制备了另一种游离虾青素，具体步骤如下：
1、将浓度为0.5g/ml硅藻土加入20mg/ml的胆固醇酯酶溶液中，搅拌30min使胆固醇酯酶被硅藻土充分吸附。
2、离心回收硅藻土，加入到0.02%的EGDE溶液中，交联30min后离心收集沉淀，使用去离子水洗涤3次终止交联，即得到固定化的胆固醇酯酶。
3、在酯化态虾青素料液中，分别加入2倍体积的丙酮和pH为7.0的Tris-HCl缓冲液，摇匀，25℃恒温放置30min，加入固定化的胆固醇酯酶，使反应体系的酯化态虾青素浓度为2μg/ml，酶浓度为2U/ml，25℃恒温振荡水解90min得到酶解液。
4、将酶解液静置，待固定化胆固醇酯酶沉降完全后分离沉淀得到反应产物，回收固定化胆固醇酯酶。
5、将上述反应产物在4℃、8000rpm条件下离心5min去除杂质沉淀得到上清液，向上清液中加入2倍体积的正己烷，涡旋振荡1min，静置分层，将上层正己烷层取出待用，下层溶液再加入正己烷重复提取2次，合并正己烷相。
6、减压浓缩，回收有机溶剂，所得产物即为游离虾青素。
实施例4
本实施例采用上述制备方法制备了另一种游离虾青素，具体步骤如下：
1、将浓度为1g/ml硅藻土加入20mg/ml的胆固醇酯酶溶液中，搅拌30min使胆固醇酯酶被硅藻土充分吸附。
2、离心回收硅藻土，加入到0.01%的EGDE溶液中，交联30min后离心收集沉淀，使用去离子水洗涤3次终止交联，即得到固定化的胆固醇酯酶。
3、在酯化态虾青素料液中，分别加入2倍体积的丙酮和pH为7.0的Tris-HCl缓冲液，摇匀，25℃恒温放置30min，加入固定化的胆固醇酯酶，使反应体系的酯化态虾青素浓度为1μg/ml，酶浓度为4U/ml，25℃恒温振荡水解90min得到酶解液。
4、将酶解液静置，待固定化胆固醇酯酶沉降完全后分离沉淀得到反应产物，回收固定化胆固醇酯酶。
5、将上述反应产物在4℃、8000rpm条件下离心5min去除杂质沉淀得到上清液，向上清液中加入2倍体积的正己烷，涡旋振荡1min，静置分层，将上层正己烷层取出待用，下层溶液再加入正己烷重复提取2次，合并正己烷相。
6、减压浓缩，回收有机溶剂，所得产物即为游离虾青素。
对比例1
本对比例采用与实施例1相同的制备方法制备了一种对比游离虾青素，与实施例1不同的是：步骤1中胆固醇酯酶溶液的浓度为5 mg/ml。
对比例2
本对比例采用与实施例1相同的制备方法制备了另一种游离虾青素，与实施例1不同的是：步骤1中用介孔硅代替硅藻土。
对比例3
本对比例采用与实施例1相同的制备方法制备了另一种游离虾青素，与实施例1不同的是：步骤1中用戊二醛溶液代替EGDE溶液。
对比例4
本对比例采用与实施例1相同的制备方法制备了另一种游离虾青素，与实施例1不同的是：步骤3中用石油醚代替正己烷进行萃取。
对比例5
本对比例采用与实施例1相同的制备方法制备了另一种游离虾青素，与实施例1不同的是：步骤1中用脂肪酶溶液代替胆固醇酯酶溶液。
测试一、游离虾青素回收率的测试
具体的测试步骤为：虾青素的测定方法参考SC/T3053—2019，使用高效液相色谱法进行测定，游离虾青素的制备采用本发明的方法。分别测定各实施例及对比例制备的游离虾青素含量，代入公式计算游离虾青素回收率。得到的测试结果如表1和图2所示。
表1
由表1和图2所示，对各实施例及对比例的游离虾青素回收率进行了测定，以比较各实施例及对比例制备游离虾青素的效果（****p<0.0001，n=3)。各实施例的游离虾青素回收率均在95%以上，其中实施例1的游离虾青素回收率最高，达到了98.65%，说明本发明可以充分酶解酯化态虾青素并回收产物。各对比例的游离虾青素回收率均较实施例低，因为对比例2将硅藻土替换为介孔硅，由于介孔硅的吸附能力较硅藻土低，吸附的胆固醇酯酶更少；对比例3将EGDE替换为戊二醛，戊二醛更容易因交联过度引起酶的失活；对比例4将正己烷替换为石油醚，石油醚虽然与正己烷的提取效果相近，但安全性和污染性较差，产物回收后含有少量杂质。对比例5的回收率最低，因为将胆固醇酯酶替换为了脂肪酶，在此制备条件下，脂肪酶的活性受到抑制，不能有效催化虾青素酯的水解。此外，还测试了高EGDE浓度、低固定化酶浓度、低正己烷添加体积对虾青素回收率的影响，EGDE浓度过高会引起酶的失活，固定化酶的添加量低会水解不完全，正己烷添加量太少不利于产物的分离，因此这三项必须在合适的范围内才能起到相应的作用。
测试二：固定化胆固醇酯酶酶活的测定
胆固醇酯酶酶活指在一定的温度和pH条件下1min水解胆固醇酯产生1μmol游离胆固醇的酶量为一个酶活单位(U)。对实施例1-4和对比例1-3固定化胆固醇酯酶酶活具体的测试步骤如下：
1、底物乳液的制备：取30ml的4%聚乙烯醇溶液，加入10g胆固醇硬脂酸酯，摇匀后用超声破碎仪分散10min。
2、铜盐显色剂的配制：称取5g无水醋酸铜，加去离子水溶解并定容到100ml，然后用吡啶调pH至6.1。
3、标准曲线的制作：分别配置浓度为0、7.5、15、22.5、30、37.5μmol/ml的硬脂酸异辛烷溶液，然后取5ml置于不同编号的试管中，加入铜盐显色剂溶液，涡旋振荡器振荡90s，室温静置至上层溶液澄清，取上层澄清液在714nm波长条件下测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，硬脂酸浓度为横坐标，得到硬脂酸铜标准曲线。
4、依次在试管中加入1.0ml底物，1.5ml磷酸盐缓冲液(pH=8.0)，于25℃恒温水浴5min后分别迅速加入各实施例和对比例的50mg固定化胆固醇酯酶溶液，置于摇床中反应15min，反应条件为25℃，200r/min。反应15min后迅速加入6mol/L的盐酸溶液0.5ml，95%的乙醇3ml终止反应，混合均匀后加入1.5ml异辛烷溶液，涡旋振荡器振荡90s，60℃水浴中静置10min，然后常温水浴中冷却5min。移取0.5ml上层异辛烷溶液，加入异辛烷2ml，铜盐显色剂0.5ml，于涡旋振荡器振荡90s，然后室温静置直到上层溶液澄清。分别取上层澄清溶液100μL在714nm波长条件下测定吸光度。测试结果如图3所示。
对各实施例及对比例酶活测定的结果如图3所示，实施例1表现出了最高的酶活（***p<0.001，****p<0.0001，n=3)。实施例2的酶活较实施例1低，因为在固定化胆固醇酯酶的制备过程中，酶的浓度较低。实施例3和实施例4的结果比较接近，实施例3的硅藻土浓度降低并没有引起酶活的改变，说明在该浓度下硅藻土对酶的吸附量接近饱和。而实施例4的EGDE浓度降低，使酶的交联程度降低，有少量吸附的酶在制备过程中损失，使其酶活略低于实施例1。对比例1在制备过程中使用的酶浓度低于本发明的申请范围，所以其酶活明显降低。对比例2将硅藻土替换为介孔硅，由于介孔硅的吸附能力较低，固定化酶的酶活不如以硅藻土为载体；对比例3将EGDE替换为戊二醛，一部分酶因为交联过度失去了活性。
测试三、固定化胆固醇酯酶机械稳定性测试
将各实施例和对比例制备的固定化胆固醇酯酶分别在25℃、pH8.0的条件下连续不间断反应7次，测定每次的酶活，以第一次反应测得的酶活为100%。以相对酶活比较各实施例制备的固定化胆固醇酯酶的稳定性。
相对酶活：指在同一组实验中，设定酶活力最高的一组为100%，其余组的酶活力与之相比，用百分数表示结果。对各实施例及对比例的固定化胆固醇酯酶在连续反应7次后的残余相对酶活进行了测定，得到的测试结果如表2所示。
表2
由表2可知，实施例1表现出最高的稳定性。实施例2、实施例3和对比例1在连续7次反应后的残余相对酶活比较接近，说明EGDE可以通过交联提高固定化胆固醇酯酶的稳定性，减少重复使用过程中的损失。实施例4相对酶活较低，说明EGDE浓度降低会降低固定化胆固醇酯酶的稳定性。对比例2的酶活损失最大，介孔硅对胆固醇酯酶的吸附不够牢靠，硅藻土具有多级孔洞结构，可以更有效地吸附胆固醇酯酶。而对比例3使用戊二醛进行交联，在重复利用的过程中因物理作用损失的酶要稍多一点。
测试四、固定化胆固醇酯酶酸碱稳定性测试
具体的测试步骤为：取适量各实施例及对比例制备的固定化胆固醇酯酶和未固定的游离胆固醇酯酶，分别放置在pH为4、5、6、7、8、9、10的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，室温处理6h，然后在25℃、pH8.0的条件下测定相对酶活，以各组中未处理的酶的酶活为100%。游离酶直接用不同pH的Tris-HCl缓冲液溶解，浓度为1mg/ml，室温处理6h后，10000rpm离心12min获取处理后的游离酶，在相同条件下测定相对酶活。以游离酶为对照，比较各组制备的固定化酶的酸碱稳定性。得到的测试结果如图4所示。
由图4可知，对各实施例和对比例的固定化胆固醇酯酶在不同pH下处理6小时的相对酶活进行了比较，固定化后的胆固醇酯酶表现出了更高的稳定性。胆固醇酯酶在pH为7-8的环境中活性保存较好，当保存环境的pH超出这个范围，游离酶的相对酶活迅速下降，而固定化后的酶仍能保持80%以上的活性。对比例2表现出了最低的pH稳定性，因为介孔硅的吸附能力较低，且大多吸附在颗粒表面，更容易受到环境的影响。所以，通过本发明的方法制备固定化胆固醇酯酶可以明显提高胆固醇酯酶的耐酸碱性，更有利于酶的保存。
测试五、固定化胆固醇酯酶热稳定性测试
具体的测试步骤为：取适量各实施例及对比例制备的固定化胆固醇酯酶和未固定的游离胆固醇酯酶，加入到pH为8.0的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，分别在40-80 ℃的温度下处理6h，然后在25℃、pH为8.0的条件下测定相对酶活，以各组中在4℃条件下处理的酶的酶活为100%。游离酶直接用pH为8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，浓度为1mg/ml，在40-80℃的温度下处理6h后，10000rpm离心12min获取处理后的游离酶，在相同条件下测定相对酶活。以游离酶为对照，比较各组制备的固定化酶的热稳定性。得到的测试结果如图5所示。
如图5所示，对各实施例和对比例制备的固定化胆固醇酯酶在不同温度下处理6小时后的相对酶活进行了比较，固定化后的胆固醇酯酶表现出了更高的稳定性。随着保存温度的升高，胆固醇酯酶逐渐失去活性，游离酶在75℃时已完全失活，而固定化后的酶在75℃时仍保留50%左右的酶活。其中，实施例1的稳定性最好，而对比例2的稳定性最差，说明介孔硅吸附胆固醇酯酶后，不能有效的防止胆固醇酯酶受到环境的影响。通过比较其它各组数据，对比例1的热稳定性相对较低，因为在制备固定化酶时酶的添加量太少，使得温度对酶的影响较为明显；而实施例4因为EGDE的浓度较低，交联程度相对较低，与实施例1相比热稳定性略低；对比例3使用戊二醛代替EGDE，也并没有表现出更好的热稳定性。所以，通过本发明的方法制备固定化胆固醇酯酶可以明显提高胆固醇酯酶的耐热性，减少环境温度对酶的影响。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将硅藻土加入胆固醇酯酶溶液中，充分搅拌后离心回收硅藻土，再加入到EGDE溶液中，交联后离心收集沉淀，然后使用去离子水洗涤，即得到固定化的胆固醇酯酶；
S2、在酯化态虾青素料液中，分别加入有机溶剂和缓冲液，摇匀，放置一段时间后加入所述固定化的胆固醇酯酶，恒温振荡水解，得到酶解液；
S3、将所述酶解液静置，待固定化胆固醇酯酶沉降完全后分离沉淀得到反应产物，回收固定化胆固醇酯酶，将反应产物在低温下离心去除杂质沉淀，然后萃取，即得到游离虾青素。
2.根据权利要求1所述的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中所述硅藻土在溶液中的浓度为0.5-1g/ml，所述胆固醇酯酶溶液的浓度为10-20mg/ml，所述EGDE溶液的EGDE含量为0.01-0.03%。
3.根据权利要求1所述的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中所述有机溶剂为丙酮，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
4.根据权利要求3所述的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中所述丙酮的添加量为酯化态虾青素料液体积的1-3倍；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0-7.5，添加量为酯化态虾青素料液体积的1-3倍。
5.根据权利要求1所述的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中加入所述固定化的胆固醇酯酶后的反应体系中的酯化态虾青素浓度为0.5-2μg/ml，酶浓度为2-8U/ml。
6.根据权利要求1所述的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中离心条件为：在温度3-5℃、转速5000-8000rpm条件下离心4-8min。
7.根据权利要求6所述的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中萃取步骤为：在反应产物离心后得到的上清液中加入正己烷，涡旋振荡，静置分层，然后将上层正己烷层取出待用，下层溶液再加入正己烷重复提取2-3次，合并正己烷相，减压浓缩，回收有机溶剂，即得到游离虾青素。
8.根据权利要求7所述的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中所述正己烷的添加量为上清液体积的0.5-2倍。
9.一种基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素，其特征在于，所述游离虾青素采用如权利要求1~8任意一项所述的制备方法制得。
10.一种如权利要求9所述的基于固定化胆固醇酯酶的游离虾青素在制备功能性食品、保健品、化妆品中的应用。
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