JP6847389B2 - カロテノイドの大量生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を用いてカロテノイドを大量生産する方法、その方法で得られる藻体、及びその藻体を用いた抗酸化剤及び天然着色料に関する。

生物の生命活動において、呼吸によって体内に取り込まれた酸素の一部は、エネルギー代謝過程で酸化反応性の高い活性酸素に変化する。活性酸素は、日常的な生体活動の他、紫外線照射、喫煙、激しい運動等でも発生し、細胞を構成する脂質、タンパク質、及び核酸を酸化することが知られている。活性酸素は、適量であれば細菌やウイルス等の体外由来の異物に対する攻撃防御作用を有するが、過剰に発生すると老化、発癌、及び生活習慣病の原因となるなど、生体に対して有害な影響を及ぼす（非特許文献１）。

細胞内で発生した過剰な活性酸素から細胞を防御するために、生物は、自ら生合成した抗酸化酵素により活性酸素を分解し、消去している。抗酸化酵素には、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）、カタラーゼ、及びグルタチオンペルオキシダーゼが知られている（非特許文献２）。また、生物は、スカベンジャーと呼ばれる抗酸化物質を生合成して又は外界から摂取して、活性酸素から細胞を防御している。抗酸化物質は、自身が酸化されることによって活性酸素を消去する抗酸化作用を有する物質である。抗酸化物質には、ビタミンC、ビタミンE、尿酸、コエンザイムQ10、ポリフェノール、カロテノイド等が知られている（非特許文献３）。このうちカロテノイドは、他の抗酸化物質と比較して抗酸化作用が極めて高いことが近年の研究から明らかとなってきた（非特許文献４）。例えば、アスタキサンチン、リコペン等のカロテノイドには、細胞の増殖抑制効果や炎症反応抑制効果等の様々な疾患に対する予防効果や抗体産生促進作用があることが報告されている（非特許文献４）。

カロテノイドは、植物が紫外線照射によって発生する活性酸素から細胞を防御するために生産する抗酸化物質であり、自然界には600種以上が存在する。動物は、カロテノイドを生合成できないが、外界から摂取することで植物と同様の抗酸化作用を獲得することができる。例えば、エビやカニ等の甲殻類は、藻類由来のアスタキサンチンを摂食し、外皮に蓄積している。また、カロテノイドは、茶褐色、赤色、橙色、黄色、黄緑色等の特有の色彩を有する天然の色素成分で、食品素材の野菜や果実等にも含まれており、それらの色彩に寄与している。例えば、ニンジンやカボチャ等の緑黄色野菜に多く含まれる黄色色素のβ-カロテンやα-カロテン、トマトやスイカ等に含まれる赤色色素のリコペン、キャベツ等に含まれる黄色色素のルテイン、そして橙黄色色素のゼアキサンチン及びネオキサンチン等は、その好例である。以上のように、カロテノイドは、高い抗酸化作用と鮮やかな色彩を有し、また安全性が極めて高いという利点を有する。それ故、安全で効果的な抗酸化剤として、又はカラーバリエーションに富む天然着色料として、カロテノイドが近年注目されている。

カロテノイドは、一般に化学合成によって生産されている。例えば、現在生産されているβ-カロテンの85％以上は化学合成品である。しかし、その原材料は、化石燃料由来であり、化学触媒と試薬を多量に用いることから環境への影響や残留不純物による人体等の生体に対する安全面で不安が残る。また、合成工程では多量の熱源を必要とするため、エネルギー消費や製造コストが問題となる。

一方、カロテノイドの一部は、植物、酵母や微細藻類からの抽出によって生産されている。例えば、アスタキサンチンの製造には酵母のPhaffia rhodozymaや微細藻類のHaematococcus pluvialisが、またβ-カロテンの製造には微細藻類のDunaliella salina等が、使用され、実用化されている。このような生物由来のカロテノイドは、生体に対する安全性は高いが、P. rhodozymaは従属栄養生物であるため独立栄養生物と比較して培養コストが高いという問題がある。微細藻類は独立栄養生物ではあるが、H. pluvialisは増殖速度が遅く、培養日数が長期になる問題がある。また、D. salinaは屋外で培養できるが、日照、降雨、及び塩濃度等の環境的制約が多いことに加え、藻体が特有の臭気をもつことから、食品利用には適さないという問題がある。さらに、通常の培養条件下で培養された微細藻類の藻体内に蓄積されるカロテノイド量は、一般的に多くない。微細藻類の多くは、紫外線や栄養不足等の環境ストレスが付与されることによってはじめて特定のカロテノイドを大量に蓄積するようになる。それ故、微細藻類を用いたカロテノイドの生産方法において、効果的にカロテノイドを大量生産させるためには、生育に影響を与えず、かつ適切な環境ストレスを付与できる条件が重要となる。

吉川敏一, 谷川徹, 1999, 化学と生物, 37(7): PP.475-481. 藤田直, 2002, 薬学雑誌, 122 (3): 203-218. 江口裕伸 他, 2009, 生物試料分析, 32(4): 247-256 眞岡孝至, 2007, 食品・臨床栄養, 2: 3-14.

本発明は、培養が容易で増殖速度の速い微細藻類を用いて、カロテノイドを安定的に、かつ大量に生産する方法を開発し、提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、トレボウクシア藻綱に属する種又はヨコワミドロ目に属する種を強光下で特定の時間培養することによって、藻体の生育に影響を与えず、適切な環境ストレスを付与できることを見出した。また、この環境ストレスによってカロテノイド合成経路が活性化され、藻体内に特定のカロテノイドが大量に蓄積されることを見出した。本発明は当該新規知見に基づくものであって、以下を提供する。
（１）トレボウクシア藻綱（Trebouxiophyceae）又はヨコワミドロ目（Sphaeropleales）に属する種に500〜2500μmol photons/m²/sの光強度で光を150〜500時間照射して培養するストレス付与工程を含むカロテノイドの大量生産方法。
（２）前記ストレス付与工程後の培養液から藻体を回収する回収工程を含む、（１）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（３）前記回収工程後の藻体を乾燥させる乾燥工程を含む、（２）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（４）前記ストレス付与工程後又は乾燥工程後の藻体からカロテノイドを抽出する抽出工程を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載のカロテノイドの大量生産方法。
（５）前記抽出工程後の抽出液からカロテノイドを分離、精製する分離工程を含む、（４）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（６）光照射が連続照射である、（１）〜（５）のいずれかに記載のカロテノイドの大量生産方法。
（７）前記トレボウクシア藻綱に属する種がクロレラ目（Chlorellales）、カワノリ目（Prasiolales）又はワタナベア系統群（Watanabea-clade）に属する種である、（１）〜（６）のいずれかに記載のカロテノイドの大量生産方法。
（８）前記ヨコワミドロ目に属する種がイカダモ科（Scenedesmaceae）、ムリエラ属（Muriella）又はグラエシエラ属（Graesiella）に属する種である、（１）〜（６）のいずれかに記載のカロテノイドの大量生産方法。
（９）前記カロテノイドがルテイン及び／又はゼアキサンチンである、（７）又は（８）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（１０）前記カロテノイドがアスタキサンチン及び／又はその誘導体である、（８）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（１１）前記カロテノイドがアンテラキサンチン及び／又はその誘導体である、（７）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（１２）前記カロテノイドがネオキサンチン及び／又はその誘導体である、（７）に記載のカロテノイドの大量生産方法。
（１３）500〜2500μmol photons/m²/sの光強度で光を照射し、150〜500時間培養する工程を含む方法によって得られるトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。
（１４）前記工程後の培養液から培地を除去して藻体を回収する工程をさらに含む方法によって得られる、（１３）に記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。
（１５）前記工程で回収された藻体を乾燥させる工程をさらに含む方法によって得られる、（１４）に記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。
（１６）前記トレボウクシア藻綱に属する種がクロレラ目（Chlorellales）、カワノリ目（Prasiolales）又はワタナベア系統群に属する種である、（１３）〜（１５）のいずれかに記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。
（１７）前記ヨコワミドロ目に属する種がイカダモ科（Scenedesmaceae）、ムリエラ属（Muriella）又はグラエシエラ属（Graesiella）に属する種である、（１３）〜（１５）のいずれかに記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種。
（１８）（１３）〜（１７）のいずれかに記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種を含む天然着色料。
（１９）（１３）〜（１７）のいずれかに記載のトレボウクシア藻綱又はヨコワミドロ目に属する種を含む抗酸化剤。
（２０）（１８）に記載の天然着色料又は（１９）に記載の抗酸化剤を含む飲食品。
（２１）（１８）に記載の天然着色料又は（１９）に記載の抗酸化剤を含む化粧品。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2014-259462号の開示内容を包含する。

本発明のカロテノイドの大量生産方法によれば、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を用いてカロテノイドを大量蓄積した藻体を生産することによって、カロテノイドを安定的に、かつ大量に生産することが可能となる。

本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類によれば、大量のカロテノイドを蓄積した藻体を提供することができる。

本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、茶色〜黄緑色の天然着色料として利用することができる。

本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、高い抗酸化作用を有する抗酸化剤として利用することができる。

本発明の抗酸化剤又は天然着色料を飲食品に添加することで、色味と抗酸化作用を有する飲食品を提供することができる。

本発明のカロテノイドの大量生産方法の工程フローを示す図である。 各トレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類を強光ストレス付与下で培養した時の成長曲線を示す図である。 強光ストレスを付与したMuriella zofingiensisにおける植物色素の藻体内比率を示す図である。図中、Chlはクロロフィルを、UC1とUC2は未知のカロテノイド（Unknown Caroteniod）を、UCE1〜UCE4はいずれも未知のカロテノイドエステル（Unknown Caroteniod Ester）を示す。図中、0Dは培養0日目を、また14Dは培養14日目を意味する。 強光ストレスを付与したGraesiella emersoniiにおける植物色素の藻体内比率を示す図である。図中、Chlはクロロフィルを、UCE1とUCE2は未知のカロテノイドエステル（Unknown Caroteniod Ester）を示す。図中、0Dは培養0日目を、8Dは培養8日目を、そして14Dは培養14日目を意味する。 強光ストレスを付与したParachlorella kessleri NIES-2152における植物色素の藻体内比率を示す図である。図中、Chlはクロロフィルを、UCは未知のカロテノイド（Unknown Caroteniod）を示す。0Dは培養0日目を、また8Dは培養8日目を意味する。 強光ストレスを付与したDidymogenes anomalaにおける植物色素の藻体内比率を示す図である。図中、UCは未知のカロテノイド（Unknown Caroteniod）を示す。0Dは培養0日目を、また14Dは培養14日目を意味する。

１．カロテノイドの大量生産方法
１−１．概要
本発明の第１の態様は、カロテノイドの大量生産方法である。本発明は、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類に特定の環境ストレスを付与したときに細胞内にカロテノイドが大量に蓄積される現象に基づいた発明である。本発明によれば、通常培養条件下で培養したときよりも細胞あたりの植物色素に占めるカロテノイド量の比率が有意に高いトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を得ることができる。また、その藻体から大量のカロテノイドを得ることもできる。

１−２．定義
本明細書で頻用する以下の用語について定義する。

「植物色素」とは、植物細胞内に存在する主要な色素成分であり、クロロフィル、カロテノイド、フラボノイド、及びベタレインの4群に大別される。本明細書で対象となるトレボウクシア藻類は、前記4群のうちクロロフィル及びカロテノイドの2種を包含する。本明細書では、そのうちのカロテノイドを対象とする。

「カロテノイド」とは、化学式C₄₀H₅₆を基本骨格とし、左右対称に近い構造を有する水不溶性のテトラテルペンの総称である。植物色素の一つであり、植物、糸状菌、又は微生物によって生合成され、茶色、赤色、橙赤色、橙色、橙黄色、黄色、淡黄色（レモン色）、黄緑、又は萌葱色を呈する。カロテノイドは、分子中に酸素を含むカロテン類と、分子中に酸素を含まないキサントフィル類に大別されるが、本明細書のカロテノイドは、いずれも包含する。カロテノイドの具体例として、カロテンに属する、赤色色素のリコペン、黄色色素のα-カロテン、β-カロテン、γ-カロテン及びβ-クロプトキサンチン、またキサントフィルに属する、淡黄色色素のアンテラキサンチン、茶色色素（オリーブ色を含む）のフコキサンチン、赤色色素のカプサンチン、アスタキサンチン及びアスタキサンチン誘導体（カンタキサンチン等）、橙赤色色素のビオラキサンチン、橙黄色色素のゼアキサンチン、及び黄色色素のルテイン及びネオキサンチン等が挙げられる。本発明の対象として好ましいカロテノイドは、ルテイン、ゼアキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン及びアスタキサンチンである。

「トレボウクシア藻綱（Trebouxiophyceae）」とは、緑藻植物門（Chlorophyta）に属する一群であり、細胞内に葉緑体を有し、光合成によりα-1, 4グルカンを主成分とするデンプンを生合成することのできる藻類である。例えば、クロレラ目（Chlorellales）、ワタナベア系統群（Watanabea-clade）、トレボウクシア目（Trebouxiales）、ミクロタムニオン目（Microthamniales）及びカワノリ目(Prasiolales)を含む（仲田崇志, 2012, 渡邉信監修, 藻類ハンドブック, pp33-37, NTS Inc）。なお、本明細書では、トレボウクシア藻綱に属する藻類を総称して、しばしば「トレボウクシア藻類」と表記する。

「トレボウクシア藻綱に属する種」とは、分類学上、トレボウクシア藻綱に分類される種をいう。具体的には、前述のクロレラ目、ワタナベア系統群、トレボウクシア目、ミクロタムニオン目、及びカワノリ目に属する種が該当する。

「ヨコワミドロ目（Sphaeropleales）」とは、緑藻綱（Chlorophyceae）の属する一群であり、トレボウクシア藻類と同様に細胞内に葉緑体を有し、光合成によりα-1, 4グルカンを主成分とするデンプンを生合成することのできる藻類である。なお、本明細書では、ヨコワミドロ目に属する藻類を総称して、しばしば「ヨコワミドロ藻類」と表記する。

「ヨコワミドロ目に属する種」とは、分類学上、ヨコワミドロ目に分類される種をいう。具体的には、イカダモ科（Scenedesmaceae）に属する種、ムリエラ属（Muriella）に属する種（例えば、M. zofingiensis）又はグラエシエラ属（Graesiella）に属する種（例えば、G. emersonii）、が該当する。

トレボウクシア藻綱と緑藻綱は、分子系統学的に姉妹関係にある互いに近縁な生物群である（Lemieux, C., et al., 2014, BMC Evol. Biol., 14, 211）。

１−３．方法
本発明のカロテノイドの大量生産方法における工程フローを図１に示す。本発明の生産方法は、ストレス付与工程（S001）、回収工程（S002）、乾燥工程（S003）、抽出工程（S004）及び分離工程（S005）を含む。このうちストレス付与工程は必須工程であり、回収工程、乾燥工程、抽出工程及び分離工程は選択工程である。選択工程として、さらなる工程を含んでいてもよい。以下、本発明におけるストレス付与工程、回収工程、乾燥工程、抽出工程及び分離工程に関して、具体的に説明をする。

１−３−１．ストレス付与工程
「ストレス付与工程」（S001）は、培養中のトレボウクシア藻類又はヨコミワミドロ藻類に強光ストレスを付与する工程である。本工程は、ストレス付与によってトレボウクシア藻類又はヨコミワミドロ藻類のカロテノイド合成経路を活性化させ、藻体内に大量のカロテノイドを蓄積させることを目的とする。

本発明で使用するトレボウクシア藻類は、前記トレボウクシア藻類が該当する。いずれの目又は系統群に属する種であってもよいが、好ましくはクロレラ目、カワノリ目、又はワタナベア系統群に属する種である。クロレラ目に属する種には、クロレラ科（Chlorellaceae）に属する種が挙げられる。ここでいうクロレラ科は、クロレラ系統群（Chlorella-clade）、パラクロレラ系統群（Parachlorella-clade）及びプロトテカ系統群（Prototheca-clade）を包含する概念である（仲田崇志, 2012, 渡邉信監修, 藻類ハンドブック, pp33-37, NTS Inc）。クロレラ科に属する種には、例えば、クロレラ属（Chlorella）に属する種（例えば、C. mirabilis、C. minutissima、C. vulgaris、C. sorokiniana、C. viscose、C. variabilis等）、オーセノクロレラ属（Auxenochlorella）に属する種（例えば、A. protothecoides等）、パラクロレラ属（Parachlorella）に属する種（例えば、P. kessleri、P. beijerinckii等）、ディクロスター属（Dicloster）に属する種（例えば、D. acuatus等）、ミクラクチニウム属（Micractinium）に属する種（例えば、M. pusillum、M. belenophorum等）、ロボスファエロプシス属（Lobosphaeropsis）に属する種（例えば、L. lobophora等）、ディクチオスファエリウム属（Dictyosphaerium）に属する種（例えば、D. pulchellum等）、ディディモゲネス属（Didymogenes）に属する種、及びアクチナストルム属（Actinastrum）に属する種（例えば、A. hantzschii等）が挙げられる。

トレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類には、単細胞生物及び多細胞生物が存在するが、本明細書で使用する種はいずれであってもよい。好ましくは単細胞生物である。

トレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類は、いずれの種も本願発明の方法によりカロテノイドを大量生産し、それを藻体内に蓄積できるが、生産されるカロテノイドの種類は、藻類の種類によって異なる。トレボウクシア藻類のクロレラ目、カワノリ及びワタナベア系統群に属する藻類は、主としてルテイン及び／又はゼアキサンチンを蓄積する。このようなカロテノイドを蓄積する具体例としては、限定はしないが、Chlorella vulgaris等のクロレラ属に属する種、及びParachlorella kessleri等のパラクロレラ属に属する種が挙げられる。Didymogenes anomala等のディディモゲネス属に属する種は、ルテイン及び／又はゼアキサンチンに加え、ネオキサンチンも大量に生産し、蓄積し得る。また、トレボウクシア藻類のクロレラ目に属する藻類、特にクロレラ科に属する種は、アンテラキサンチンも蓄積し得る。アンテラキサンチン及びその誘導体を大量に蓄積する具体例としては、限定はしないが、Chlorella sorokiniana等のクロレラ属に属する種等が挙げられる。

一方、ヨコワミドロ藻類は、主としてアスタキサンチン及びその誘導体（例えば、カンタキサンチン等）を蓄積する。このようなカロテノイドを蓄積する具体例としては、限定はしないが、Muriella zofingiensis等のムリエラ属に属する種が挙げられる。また、Graesiella emersonii等のグラエシエラ属に属する種ではルテイン及び／又はゼアキサンチンの蓄積も見られる。特定のカロテノイドを生産する場合には、所望するカロテノイドを大量に生産するトレボウクシア藻類を適宜選択すればよい。例えば、カロテノイドの種類に応じた色彩を基準に選択してもよい。

本工程で使用するトレボウクシア藻類は、培養条件が一致又は近似する種であれば複数の種を一緒に培養してもよい。ここでいう培養条件とは、例えば、培地の組成、培地塩濃度、培養温度等が該当する。

本工程は、前述のように培養中のトレボウクシア藻類に対して行う。ストレス付与開始時における培養液中のトレボウクシア藻類の状態は、特に限定はしないが、後述するように本工程中も培養は継続することから、誘導期（lag phase）又は対数期（log phase）が好ましい。

本明細書において「強光ストレス」とは、環境ストレスの一つであって、外部刺激として強力な光を対象生物に作用させることをいう。具体的には、特定の光強度を有する光を特定時間トレボウクシア藻類に照射したときのストレスをいう。

本明細書において「光強度」とは、光量子束密度を意味する。光強度は、その単位時間の単位面積当たりの光子数、すなわち照射された面に含まれる全光子数を照射面積（m²）と照射時間（秒）を乗じた数値で除した値（mol photons/m²/s）で表す。この光強度の光子数は、実際の照射面における光を分光ユニットなどによって測定することで算出できる。

本明細書において「特定の光強度」とは、500〜2500μmol photons/m²/s、好ましくは550〜2300μmol photons/m²/s、より好ましくは600〜2000μmol photons/m²/sである。

照射する光は、450nm±15nm及び／又は580nm±15nmに波長スペクトルのピーク（極大波長）を有する光であればよい。例えば、380 nm〜800 nmの全可視光域を含む白色光、又は400〜500 nmの紫色光〜青色光及び／又は560 nm〜600 nmの黄色光が該当する。

本工程で使用する光源は、前記波長域の光を放射可能な光源であれば特に限定はしない。例えば、全可視光域を含む白色光を放射可能な蛍光灯、白色発光ダイオード（Light Emitting Diode：以下、本明細書では、しばしば「LED」と表記する）、高輝度放電（HID：High Intensity Discharge）ランプ等が挙げられる。また、400 nm〜500 nmの波長域内及び560 nm〜600 nmの波長域内に波長スペクトルのピークを有する白色LEDを利用するのが効果的である。

本明細書において「特定時間」とは、前記光強度でトレボウクシア藻類に十分な強光ストレスを付与できる時間をいう。具体的には、150〜500時間、好ましくは160〜400時間、より好ましくは168〜360時間、さらに好ましくは190〜340時間である。日にち換算すれば、7〜20日間や6〜14日間に相当する。一般に光強度が強ければ照射する時間は短くても十分な強光ストレスを付与することができる。例えば、1800〜2500μmol photons/m²/sの光強度であれば、150〜250時間又は150〜220時間の照射で足りる。一方、光強度が弱い場合には照射する時間は長い方が好ましい。例えば、500〜1000μmol photons/m²/sの光強度であれば、280〜500時間又は310〜500時間照射することが好ましい。

強光ストレスの付与は、総合時間で上記特定の光強度にて曝光できれば、連続照射であっても、また明暗期を有する明暗光であってもよい。明暗周期光の場合には、1日の明暗周期は特に限定はしないが、例えば、明期8時間：暗期16時間〜16hr:8hr時間の範囲でよい。あるいは、明期中に周期的に又は非周期的に、肉眼で認識できる暗期（例えば、1秒以上、好ましくは数秒以上の暗期）が挿入される明暗光であってもよい。好ましくは連続照射である。ここでいう連続照射とは、連続光の照射だけでなく、蛍光灯のように、極めて短時間に明暗期を繰り返すパルス光の照射も含む。

照射方法は、培養中のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類に十分に曝光される方法であれば特に限定はしない。例えば、透明な培養槽の周囲に光源を設置して培養槽全体に光を照射する方法、一方向又は複数の方向から透明な培養槽に光を照射しながら培養槽を回転させることで培養槽全体に光を行き渡す方法等が挙げられる。光の照射は、光源からの直接照射が好ましいが、培養液全体に光を行き届かせる目的等のために反射板等を介した間接照射であってもよい。間接照射の場合、照射した光が減衰する可能性があることから、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類への光強度が前述の範囲となるように、必要に応じて光源の光強度を高めることが好ましい。

強光ストレスの付与下であってもトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、生育及び増殖が可能であることから、ストレス付与中、培養は継続することが望ましい。

本工程における培養条件は、前記トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を培養可能な条件であれば、特に限定はしない。培養するトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の種に応じて、適宜最適の培養条件を設定すればよい。

例えば、本工程で用いる培地は、通常は基本生育培地で足りる。例えば、TAP培地が挙げられる。TAP培地の組成は、NH₄Cl 40mg, CaCl₂・2H₂O 5.1mg, MgSO₄・7H₂O 10mg, K₂HPO₄11.9mg, KH₂PO₄ 6.03mg, Hutner's trace elements 0.1mL, Acetic acid 0.1mL, Tris(hydroxymethyl) aminomethane 242mg, Distilled water 99.8mL（pH6.5〜6.8）とすればよい。ここで、Hutner's trace elementsは、Na₂EDTA・2H₂O 5g, ZnSO₄・7H₂O 2.2g, H₃BO₃ 1.14g, MnCl₂・4H₂O 506mg,FeSO₄・7H₂O 499mg, CoCl₂・6H₂O 161mg, CuSO₄・5H₂O 157mg, (NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O 110mg, Distilled water 100mLからなる。培養するトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、野生株が好ましいが、変異株であっても構わない。ただし、その場合、培地の組成をその変異株の生育に適合したものに調製する。例えば、変異株がシステイン要求性変異株等の栄養要求性変異株であった場合、TAP培地に500ng/mL〜100μg/mLのシステインを添加する等して、栄養要求性を満たす培地を調製する。

培養温度は、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類が生育可能な温度であればよい。通常は15〜35℃、好ましくは18〜30℃、より好ましくは20〜28℃、さらに好ましくは25±2℃の範囲内である。

培養は、屋内、又は屋外のいずれであってもよい。飼料用やカロテノイドの抽出用として用いる場合には、大量培養可能な屋外培養でよい。一方、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類やそのカロテノイドをヒト飲食品用、医薬品用、及び化粧品用として用いる場合には、屋内培養が好ましい。屋内培養は、光、湿度、温度等の気象条件や培地の供給、及び無菌状態等が管理された植物工場のような完全閉鎖空間内の人工環境下における培養か、屋内に設置された培養庫内での培養のいずれであってもよい。

本工程では、全期間を通して、又は定期的若しくは不定期に、必要に応じて培地を撹拌してもよい。撹拌手段は問わない。例えば、撹拌棒等の撹拌装置を用いてもよいし、培養槽を反転、回転、振動することで培地を撹拌してもよい。また、必要に応じて、培地のCO₂濃度が2〜5％となるようにCO₂を添加してもよい。

本工程期間中、必要に応じて培地を1回又は複数回交換してもよい。交換培地は、使用中の培地と同じものが好ましいが、ストレス付与の効果を妨げない範囲で他の培地に交換することもできる。培地の交換時期は、特に限定しないが、培養液中のトレボウクシア藻類が死滅期（death phase）に入る前、具体的には静止期（stationary phase）が好ましい。また、培地交換の際に、必要に応じて培養液を希釈してもよい。

１−３−２．回収工程
「回収工程」（S002）とは、前記ストレス付与工程（S001）後の培養液からトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の藻体を回収する工程である。本工程は、培養液から培地や粗雑物等を除去して、藻体をスラリーの状態で回収することを目的とする。

培養液から藻体を回収する方法は、当該分野で公知の常法を用いればよい。例えば、培養液を遠心又は濾過によって培地を除去する方法が挙げられる。具体的には、培養液を遠心機により適当な重力加速度（g）で適当な時間遠心した後に、上清を除去してスラリーを回収する方法や、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の藻体又は細胞サイズよりも小さい孔径を有するフィルターで濾過して培養液を除去し、フィルターに残ったスラリーを回収する方法が挙げられる。回収した藻体は、必要に応じて水又は培地と同程度の浸透圧を有するバッファ若しくは生理食塩水で1回以上洗浄してもよい。

本工程により、細胞内にカロテノイドを大量蓄積したトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類をスラリーとして得ることができる。

１−３−３．乾燥工程
「乾燥工程」（S003）とは、前記回収工程（S002）後の藻体を乾燥させる工程である。本工程は、回収工程で得られた藻体を軽量化して、運搬や取扱いを容易にすることを目的とする。

本工程の「乾燥」とは、回収工程で得られたスラリー中の水分及び／又はトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞中の水分を減ずることをいう。乾燥によるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の生死は問わない。

乾燥方法は、水分を減じることができれば特に限定はしない。例えば、送風装置等を用いて温風若しくは冷風を当てる通風乾燥法、加熱により水分蒸発させる無風乾燥法、スラリーを適当なバッファで懸濁した後、その懸濁液を気体中に噴霧して急速乾燥させる噴霧乾燥、凍結乾燥（フリーズドライ）法、密閉容器内で真空ポンプ等を用いて脱気する真空乾燥法、外気に晒して放置する自然乾燥法（天日干しを含む）、又はその組み合わせが挙げられる。実際の工程では、上記方法を応用した各種乾燥装置を用いて行えばよい。例えば、ドラムドライヤー、遠赤バンド乾燥機、連続式真空乾燥装置、スプレードライヤー、フリーズドライヤー等が挙げられる。

乾燥工程後の藻体は、固形状態、顆粒状態又は粉末状態のいずれであってもよい。運搬性を向上させるため、嵩を低減し収容率を向上させるため、等分量に分配可能にするため、又は後述の抽出工程においてカロテノイドの抽出効率を高めるためには顆粒状態又は粉末状態が好ましい。

乾燥藻体の固体サイズが大きい場合には、乾燥藻体を必要に応じて断片化してもよい。本明細書において「断片化」とは、切断及び／又は粉砕により、乾燥藻体を小片状、顆粒状又は粉末状にすることをいう。乾燥藻体の断片化は、当該分野で公知の方法又は装置を用いて達成することができる。例えば、コンバージミル、ラインミル、押出し造粒機、破砕造粒機、環式圧縮解砕造粒機等の公知の断片化装置又は造粒装置、あるいはロール粉砕機又は摩砕機を用いて行えばよい。なお、前述のスプレードライヤー等を使用した噴霧乾燥等によりトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を乾燥させた場合には、乾燥と同時に粉末化することができるので便利である。

本工程により、細胞内にカロテノイドを大量蓄積したトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の総重量を軽減化し、取り扱いが容易になる。また、保存性も高まる。

１−３−４．抽出工程
「抽出工程」（S004）とは、前記回収工程（S002）後、又は乾燥工程（S003）後のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の藻体又は細胞からカロテノイドを抽出する工程である。本工程の目的は、ストレス付与工程で藻体内に蓄積されたカロテノイドを抽出し、回収することである。

藻体からカロテノイドを抽出方法する方法は、植物細胞からカロテノイドを抽出する当該分野で公知のあらゆる方法を用いることができる。トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、クロレラ科藻類に代表されるように通常強固な細胞壁を有している。したがって、藻体からカロテノイドを効率的に抽出するには、回収したトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞を物理的方法及び／又は化学的方法で処理することが好ましい。

物理的方法としては、例えば、圧潰法、超音波法、又はその組み合わせによる抽出方法が挙げられる。

「圧潰法」とは、細胞に物理的圧力を付与して細胞壁を圧潰破砕し、細胞内の長鎖脂肪酸を抽出する方法である。圧潰法は、例えば、まず、回収した細胞をビーズミル又はグラインドミル等を用いて物理的にすり潰して破砕液を得る。具体的な条件や方法は、ミルの使用説明書等を参考にすればよい。その後、必要に応じて破砕液中のタンパク質を変性除去し、破砕溶液をそのまま又は有機溶媒等を加えて遠心した後、カロテノイドを含む有機溶媒相を回収する方法である。使用する有機溶媒は、低極性又は非極性の水非混和性媒体であればよく、n-ヘキサン若しくはn-ヘプタンのような炭素数6〜10の脂肪族若しくは脂環式炭化水素又はベンゼンのような炭素数6〜10の芳香族炭化水素が好ましく、ヘキサン又はn-ヘプタンがより好ましい。

「超音波法」とは、超音波によって細胞壁を破砕し、細胞内のカロテノイドを抽出する方法である。超音波法は、例えば、まず、回収した細胞を水又はバッファ等の適当な溶液に懸濁した後、超音波破砕装置（ソニケーター）を用いて適当な発振周波数と出力で細胞を破砕する。具体的な条件や方法は、超音波破砕装置の使用説明書等を参考にすればよい。その後、必要に応じて破砕液中のタンパク質を変性除去し、破砕溶液から前記圧潰による抽出方法と同様にカロテノイドを回収する方法が挙げられる。

化学的方法としては、例えば、酵素法が挙げられる。

「酵素法」とは、酵素によって細胞壁を溶解し、細胞内のカロテノイドを抽出する方法である。酵素方法では、例えば、Cellulase R-10、Hemicellulase、Lysozyme、α-Mannosidas、及びβ-Mannosidaseのカクテルを使用すればよい。酵素処理をする場合、まず、細胞を使用する酵素の存在下で処理する。その後、必要に応じて酵素処理溶液中のタンパク質を変性除去し、残った溶液から前記圧潰による抽出方法と同様にカロテノイドを回収する方法である。

本工程により、カロテノイドを細胞から分離し、有機溶媒中に溶解した抽出液として回収することができる。

１−３−５．分離工程
「分離工程」（S005）は、前記抽出工程（S004）で回収された抽出液からカロテノイドを分離し、精製する工程である。前記抽出工程で回収された抽出液には、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞から抽出されたカロテノイド以外の脂溶性物質が含まれている。本工程の目的は、その抽出液から目的とするカロテノイドを分離し、精製することである。

有機溶媒に溶解したカロテノイドの回収方法又は精製方法は当該分野で公知の方法を用いればよく、特に限定はしない。例えば、エステル化やアルカリ等によって鹸化し、分溜する方法が挙げられる。

また、HPLC等の分離装置を用いて特定のカロテノイドを分離してもよい。

１−４．効果
本発明の生産方法によれば、通常培養の同種トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類と比較して細胞内に大量のカロテノイドを蓄積した藻体を簡便な方法で得ることができる。

また、その藻体からカロテノイドを抽出することで、カロテノイドを安定的に供給することができる。

さらに、本発明の生産方法によれば、特定のカロテノイドの藻内比率を制御し、様々な色彩のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を調製することができる。

２．カロテノイドを細胞内に蓄積したトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類
２−１．概要
本発明の第２の態様はトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類である。本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、第１態様の生産方法によって得られるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類であって、強光ストレスを付与しない通常培養条件で培養した同種トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類と比較して細胞内に大量のカロテノイドを蓄積していることを特徴とする。本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、藻体のままで、生食できる他、後述する第３態様のように天然着色料や、飲食品への添加物として利用することができる。

２−２．構成
本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、第１態様のカロテノイドの大量生産方法において、図１に示すストレス付与工程（S001）、回収工程（S002）、及び乾燥工程（S003）のいずれかの工程後に得られる藻体で構成される。細胞の生死は問わない。

ストレス付与工程（S001）後の藻体で構成されるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、培養中のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類に対して、500〜2500μmol photons/m²/sの光強度で150〜500時間光を照射する強光ストレスを付与することによって得ることができる。強光ストレスの具体的な付与方法については第１態様で詳述したことから、本態様ではその説明を省略する。本工程後のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、培養液に混在した状態で得られる。

回収工程（S002）後の藻体で構成されるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、ストレス付与工程（S001）後の培養液から培地を除去し、藻体を回収することによって得ることができる。培養液から藻体を回収する具体的な方法については、第１態様で詳述したことから、本態様ではその説明を省略する。本工程後のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、スラリーの状態で得られる。この状態の藻体は、食品として、例えば、パン等に塗布するペーストとして生食することもできる。

乾燥工程（S003）後の藻体で構成されるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、回収工程（S002）後の藻体を乾燥させることによって得ることができる。藻体を乾燥させる具体的な方法については、第１態様で詳述したことから、本態様ではその説明を省略する。本工程後のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、固形状態（小片状態、顆粒状態又は粉末状態を含む）で得られる。

本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、第１態様の生産方法によって得られるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類である。これらの藻類は、強光ストレスを付与しない通常培養条件下で培養した同種藻類と比較して細胞内植物色素に占めるカロテノイド率が有意に高い。

ここでいう「通常培養条件」とは、トレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の生育及び増殖を目的として当該分野で一般的に使用される培養条件をいう。例えば、クロレラ科藻類であれば、培地は、基本培地であるTAP培地（組成は前述）等を用いて、20〜35℃の培養温度下で、20〜150μmol/m²/sの光強度の光を明期：暗期＝8時間：16時間〜16時間：8時間の範囲で培養する場合が挙げられる。

「細胞内植物色素に占めるカロテノイド率」とは、細胞あたりに含まれる全植物色素の量を100％としたときにカロテノイドの量が占める比率（％）をいう。植物色素の量は、質量又は容量等の絶対値であってもよいし、吸光度等の相対値に基づく換算値であってもよい。前述のようにトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、植物色素としてクロロフィルとカロテノイドのみを含むことから、ここでいうカロテノイド率とは、細胞あたりのクロロフィル量と全カロテノイド量の総和に対するカロテノイド量の割合に相当する。

また、ここでいう「有意」とは、統計学的に有意差があることをいう。「統計学的に有意差がある」とは、通常培養条件と、第１態様に記載した本発明の強光培養条件のそれぞれから得られたトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞内植物色素に占めるカロテノイド率を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。有意差があるか否かの判断基準は、例えば、統計学的検定において、得られた値の危険率（有意水準）が小さい場合、例えば、p値が0.05未満（p＜0.05：危険率5％未満）、0.01未満（p＜0.01：危険率1％未満）又は0.001未満（p＜0.001：危険率0.1％未満）の場合が挙げられる。「p（値）」とは、統計学的検定において仮定した統計量分布において、その仮定が偶然正しくなる確率を示す。p（値）が小さいほど、仮定が真に近いことを意味するため、両者間に有意に差があると判断できる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、多重比較検定法を用いることができる。

２−３．効果
本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、細胞内に大量のカロテノイドを蓄積している。

本発明のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、そのまま生食することもできる他、後述する天然着色料成分として、また抗酸化剤の有効成分として利用することができる。特に、藻体内に含まれるカロテノイドの種類や比率によって本発明の藻類の藻体は、茶色〜黄緑色の様々な色彩を呈することから、様々なカラーバリエーションを有する生食用藻体、抗酸化剤、又は天然着色料として利用することができる。

３．天然着色料
３−１．概要
本発明の第３の態様は、天然着色料である。本発明の天然着色料は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を色素成分とする。本発明によれば、カロテノイドを主成分とする人体に安全な色素を大量かつ安定的に提供することができる。

３−２．構成
「天然着色料」とは、自然物に由来する色素成分であって、飲食品、化粧品、医薬品等に添加して、その色調を調整するために使用される添加剤をいう。天然着色料の原料となる自然物には、植物、糸状菌、細菌、昆虫が知られている。本発明の天然着色料は、必須成分である色素成分、及び選択成分である溶媒及び／又は担体を含む。以下、各成分について具体的に説明をする。

（１）色素成分
本発明の天然着色料は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を色素成分とする。実質的な色素成分は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞内に大量に蓄積されたカロテノイドである。本発明の天然着色料の色幅は、茶色、赤色、橙赤色、橙色、橙黄色、黄色、淡黄色（レモン色）、黄緑、萌葱色、及びそれらの中間色に及ぶ。本発明の天然着色料の色彩は、第２態様におけるトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の細胞内に蓄積されたカロテノイドの種類、及び細胞内に占めるそのカロテノイドの種の量比に基づく。例えば、細胞内カロテノイドにおいてルテイン及び／又はゼアキサンチン、またはネオキサンチン又はアンテラキサンチンの比率が高いトレボウクシア藻類は、橙黄色〜黄色着色料となり得る。また、細胞内カロテノイドにおいてアスタキサンチン及び／又はその誘導体（カンタキサンチン等）の比率が高いヨコワミドロ藻類は赤色着色料となり得る。本発明の天然着色料は、顔料のように、異なる色を呈するカロテノイドを蓄積したトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を組み合わせて新たな色彩を調製してもよい。例えば、前述のルテイン等の比率が高い黄色用トレボウクシア藻類とアスタキサンチン等の比率が高い赤色用ヨコワミドロ藻類とを混合して橙色着色料を調製することもできる。

第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類には、ストレス付与工程（S001）後の藻体で構成されるもの、回収工程（S002）後の藻体で構成されるもの、及び乾燥工程（S003）後の藻体で構成されるものの3形態があるが、本発明の天然着色料は、いずれの藻体で構成されていてもよく、またいずれの場合も細胞の生死は問わない。また、2形態以上の藻体を組み合わせた構成であってもよい。例えば、回収工程後のスラリー状態の藻体と乾燥工程後の粉末状態の藻体を混合したものが挙げられる。軽量性、コンパクト性、及び保存性等の観点から、回収工程後及び／又は乾燥工程後の藻体で構成されるものが好ましく、乾燥工程後の藻体で構成されるものがより好ましい。乾燥工程後の藻体で構成される場合、容量又は重量計測の容易性、及び添加後の混合容易性等の観点から顆粒状態又は粉末状態が好ましい。

（２）溶媒
本発明の天然着色料は、必要に応じて薬学上又は食品衛生上許容可能な溶媒を含む。本明細書で「薬学上又は食品衛生上許容可能」とは、医薬品若しくは化粧品の製剤技術分野又は食品衛生分野において人体等の生体に無害であり、かつ本発明の天然着色料の色調、又は医薬品若しくは化粧品の薬理効果に支障を与えないことをいう。

薬学上又は食品衛生上許容可能な溶媒として、例えば、水若しくはそれ以外の薬学上又は食品衛生上許容し得る、水溶液、油又は有機溶剤が挙げられる。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。油としては、小麦胚芽油、杏子油、オリーブオイル、椿油、イブニングプリムローズオイル、アロエベラオイル、菜種油、パーム油、綿実油、大豆油、コーン油、紅花油、ゴマ油、亜麻仁油、ひまし油等の植物油が挙げられる。有機溶剤としては、エタノール等が挙げられる。

（３）担体
本発明の天然着色料は、必要に応じて薬学上又は食品衛生上許容可能な担体を含む。担体は、着色料としての取り扱いを容易にし、また剤形を維持する他、色素成分であるカロテノイドの変性を防ぎ、色調を維持することができる。担体には、例えば、賦形剤、結合剤、充填剤、乳化剤、pH調整剤、硬化調節剤、防腐剤、流動添加調節剤等が挙げられる。

賦形剤には、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖、金属塩、クエン酸、酒石酸、グリシン、ポリエチレングリコール、プルロニック、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。

結合剤には、例えば、植物デンプンを用いたデンプン糊、ペクチン、キサンタンガム、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、パラフィン、ポリビニルピロリドン又はそれらの組み合わせが挙げられる。

充填剤としては、ワセリン、前記糖及び／又はリン酸カルシウムが例として挙げられる。

乳化剤としては、界面活性剤（例えば、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、酢酸グリセリル、イソステアラミド、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル）が例として挙げられる。

pH調整剤には、アルカリ剤としての水酸化ナトリウムや水酸化カリウム、また酸剤としての、クエン酸、クエン酸ナトリウム、グリコール酸、アスコルビン酸等が挙げられる。

流動添加調節剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。

上記の他にも、必要であれば可溶化剤、希釈剤、分散剤、安定剤、保湿剤、保存剤等張化剤等を適宜含むこともできる。

本発明の天然着色料の剤形は、飲食品（飼料を含む）、化粧品、医薬品等への添加及び／又は混合に適した剤形にすればよく、特に限定はしない。顆粒剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、液剤、懸濁剤等は、対象物に添加しやすいことから剤形として好ましい。

本発明の天然着色料の使用方法は、特に限定はしないが、通常は着色すべき飲食品（飼料を含む）、化粧品、医薬品等の製造時に直接添加すればよい。飲食品（飼料を含む）、化粧品、医薬品等が固体であれば、着色すべき対象物の表面を被覆するように本発明の天然着色料を塗布してもよい。

３−３．効果
本発明の天然着色料は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類自体を色素成分とするが、その主成分は植物色素のカロテノイドである。カロテノイドの多くは野菜や果物等の一般食品となる植物にも含まれており、人体等の生体に対する危険性は無いか限りなく低い。したがって、本発明の天然着色料は、生体に対する安全性が極めて高く、飲食品、化粧品又は医薬品の着色料として有用である。

また、一般にカロテノイドは、動物細胞内では合成できないので魚介類や鳥類等には摂取した餌に含まれるカロテノイドを体内に蓄積し、発色又は色調を維持している種が多い。本発明の天然着色料は、前述のように主成分がカロテノイドであることから、養殖魚類用飼料及び愛玩動物用飼料（熱帯魚用飼料、鳥類用飼料等）に添加することで、飼料の着色のみならず、それを摂取した動物の色揚げ剤としても利用することができる。特に水産業界において養殖魚等の外観美や肉色は商品価値を左右する重要な因子であることから、本発明の天然着色料は安全性の高い色揚げ剤として有用性が高い。

さらに、本発明の抗酸化剤は、後述する第４態様の抗酸化剤と構成が実質的に同じであることから、飲食品、化粧品又は医薬品への着色と同時に、それらに抗酸化作用を付与することもできる。

４．抗酸化剤
４−１．概要
本発明の第４の態様は、抗酸化剤である。本発明の抗酸化剤は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を有効成分とする。本発明によれば、カロテノイドを主成分とする人体に安全な抗酸化剤を提供することができる。

４−２．構成
「抗酸化剤」（抗酸化物質又は酸化防止剤）とは、活性酸素（スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素等）を除去又は消去する物質である。具体的には、活性酸素を還元して安定な分子に変化させることで、活性酸素が関与する有害な反応を抑制することができる物質をいう。動植物によって生合成される抗酸化剤も多く、例えば、ビタミンC（アスコルビン酸）、ビタミンE（トコフェロール）、コエンザイムQ10、カロテノイド、フラボノイド等は、代表的な生物由来の抗酸化剤として知られている。

なお、本発明の抗酸化剤とは、上記一般定義のような単一物質のみで構成される狭義の抗酸化剤だけでなく、複数の抗酸化剤の混合物や、単一又は複数の抗酸化剤と担体等との混合物からなる、いわゆる抗酸化組成物を包含する広義の抗酸化剤を意味するものとする。

本発明の抗酸化剤は、必須成分である有効成分、及び選択成分である溶媒及び／又は担体を含む。以下、各成分について具体的に説明をする。

（１）有効成分
本発明の抗酸化剤は、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を有効成分として含む。第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類は、細胞内にカロテノイドを大量に蓄積している。前述のようにカロテノイドは、強い抗酸化力を有する抗酸化物質であることから、第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類に含まれるカロテノイドが本発明の抗酸化剤の実質的な有効成分となる。

本発明の抗酸化剤は、有効成分として、異なるカロテノイドを含む2種以上の第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類を含んでいてもよい。また、他の公知の抗酸化剤、例えば、ビタミンEやフラボノイド等を互いの抗酸化作用を阻害しない範囲で含むこともできる。

本発明の抗酸化剤に含まれる第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類の含有量（重量％）は、その抗酸化剤に包含される藻類の種類、その藻体に含まれるカロテノイドの種類、剤形、並びに後述する担体の種類によって異なる。有効成分である第２態様のトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類がその機能を発揮し得る量で、かつ生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く生じない量であれば特に限定はなく、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。一般にカロテノイドは、生体に対して無害又は有害性が極めて低いことから、大量摂取しても副作用は生じない。それ故、例えば、含有量100重量％に相当するトレボウクシア藻類又はヨコワミドロ藻類のみで構成されていてもよい。

（２）溶媒
本発明の抗酸化剤は、必要に応じて薬学上又は食品衛生上許容可能な溶媒を含む。本発明の抗酸化剤で使用され得る具体的な溶媒については、第３態様の天然着色料における溶媒と同じでよい。

（３）担体
本発明の抗酸化剤は、必要に応じて薬学上又は食品衛生上許容可能な担体を含む。本発明の抗酸化剤で使用され得る具体的な担体については、第３態様の天然着色料における担体と同じでよい。

本発明の抗酸化剤の剤形は、使用用途に合わせて適宜定めればよい。例えば、飲食品（飼料を含む）、化粧品等への添加剤として用いる場合には、添加混合に適した剤形にすればよい。例えば、顆粒剤、粉剤、ペースト剤、液剤、懸濁剤、ゲル剤等は、対象物に添加しやすいので好ましい。一方、医薬品又は特定保健用食品として用いる場合には、投与に適した剤形が好ましい。投与法は、経口投与と非経口投与に大別することができるので、それぞれの投与法に適した剤形にすればよい。本発明の抗酸化剤は、通常は経口投与剤として用いることが好ましいが、これに限定はされない。

経口投与に適した剤形としては、例えば、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤（内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤を含む）等が挙げられる。固形剤は、必要に応じて当該技術分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠にすることができる。

非経口投与は、全身投与及び局所投与に二分され、局所投与は組織内投与、経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分できることから、抗酸化剤もそれぞれの投与法に適した剤形にすればよい。例えば、経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。

上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、それぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。また本発明の抗酸化剤の製造方法については、当該技術分野の常法に従って製剤化すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載された方法を参照することができる。

４−３．効果
本発明の抗酸化剤は、生体に対する危険性が無いか限りなく低いことから、抗酸化作用と安全性が高い飲食品用、特定保健用食品、化粧品用、又は医薬品用の添加剤として利用することができる。

５．飲食品
５−１．概要
本発明の第５の態様は、飲食品である。本発明の飲食品は、第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤を含むことを特徴とする。本発明によれば、色味と抗酸化作用を有する飲食品を提供することができる。

５−２．構成
本発明の飲食品は、第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤を含む。前述のように第３態様の天然着色料及び第４態様の抗酸化剤は実質的にその構成が同一である。したがって、本発明の飲食品は、第３態様の天然着色料に基づく色を呈し、同時に第４態様の抗酸化剤による高い抗酸化作用を有する。

本明細書において「飲食品」とは、飲料、食品及び飼料を総称する用語である。

飲料は、例えば、水（精製水、ミネラルウォーター、海洋深層水を含む）、茶飲料（緑茶、ウーロン茶、紅茶を含む）、コーヒー、コーヒー飲料、乳（生乳、加工乳を含む）、乳飲料、乳酸菌飲料、ジュース、清涼飲料水（炭酸飲料、果汁飲料、粉末飲料、スポーツドリンクを含む）、ゼリー飲料、ココア飲料、醸造酒（ビール、日本酒、黄酒、ワイン、シードルを含む）、蒸留酒（ウイスキー、ブランデー、ウォッカ、ラム、テキーラ、焼酎、白酒、ジンを含む）、及び混成酒（リキュール、梅酒、ベルモットを含む）が該当する。 食品は、一般食品（特に加工食品）及び特定保健用食品を含む。加工食品には、例えば、パン類、米飯類、麺類、パスタ、マヨネーズ、ショートニング、カスタードクリーム、ドレッシング類、牛乳、ヨーグルト、スープ、味噌汁、豆腐、スプレッド類（バター、ジャム、ふりかけ、マーガリン等）、ソース類、醤油、油、又は菓子（例えば、クッキー類、チョコレート、キャンディ、ケーキ、アイスクリーム、チューインガム）等が該当する。

飼料は、例えば、養殖魚介類用飼料、家畜用飼料、鑑賞動物用飼料、又はペットフード等が含まれる。

本態様の飲食品は、製造過程で又は製造後に、第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤が添加される。本態様の飲食品の製造方法は、飲食品の製造過程で使用される他の食品素材、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、アミノ酸、各種油脂、種々の添加剤（例えば呈味成分、甘味料、有機酸等の酸味料、界面活性剤、pH調整剤、安定剤、酸化防止剤、色素、フレーバー）等を配合し、常法に従って製造すればよい。また、製造後の飲食品に第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤を添加することにより、本発明に係る食品を製造することもできる。

飲食品中における第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤の含有量は、飲食品形態や目的により異なる。ここでいう目的とは、着色目的（色揚げ目的を含む）、抗酸化作用付与の目的、及びその両方をいう。例えば、一例として製造過程で食品への着色を目的とする場合、食品衛生法に準拠した含有量が望まれる。例えば、食用赤色2号では1日当たり0.006mg、食用黄色4号では0.469mgを超えない範囲での添加が基準となるため、それを超えない量を添加すればよい。

６．化粧品
６−１．概要
本発明の第６の態様は、化粧品である。本発明の化粧品は、第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤を含むことを特徴とする。本発明によれば、色味と抗酸化作用を有する化粧品を提供することができる。

６−２．構成
本発明の飲食品は、第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤を含む。前述のように第３態様の天然着色料及び第４態様の抗酸化剤は実質的にその構成が同一である。したがって、本発明の飲食品は、第３態様の天然着色料に基づく色を呈し、同時に第４態様の抗酸化剤による高い抗酸化作用を有する。

化粧品の形態は、限定しない。乳液、化粧液、クリーム、ローション、エッセンス、パック及びシート、ファンデーション、おしろい、頬紅、口紅、アイシャドー、アイライナー、マスカラ、洗顔料、皮膚洗浄料、ゲル剤、ジェル剤、美肌剤、ボディシャンプー等の洗浄料、シャンプー、リンス等の毛髪化粧料、頭髪料、ヘアートリートメント、養毛剤、浴用剤、軟膏、医薬部外品、あぶら取り紙等のいずれであってもよい。

本発明の化粧料を調製する場合、第３態様の天然着色料及び第４態様の抗酸化剤を既存の化粧品に配合すればよい。例えば、化粧品の形態に応じて従来公知の賦形剤や香料、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、顔料等の粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、酸化防止剤、pH調節剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤等と共に適宜配合し、常法に従って製造すればよい。

化粧品における第３態様の天然着色料又は第４態様の抗酸化剤の配合量は、化粧品の形態や目的により異なる。ここでいう目的とは、着色目的、抗酸化作用付与の目的、及びその両方をいう。例えば、一例として製造過程で化粧品への着色を目的とする場合、食品衛生法に準拠した含有量が望まれる。例えば、食用赤色２号では1日当たり0.006mg、食用黄色４号では0.469mgを超えない範囲での添加が基準となるため、それを超えない量を添加すればよい。

＜実施例１：強光ストレス下におけるトレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類の生育及び増殖＞
（目的）
本発明の大量生産方法ではストレス付与工程でトレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類に対して強光下、長時間で培養を行う。通常の培養条件から逸脱した強光培養条件でのトレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類の生育及び増殖への影響を検証する。

（方法）
培養する藻類は、トレボウクシア藻綱に属するクロレラ属のC. mirabilis、C. vulgaris、C. sorokiniana及びC. viscose、パラクロレラ属のP. kessleri NIES-2152、P. kessleri PK2及びP. beijerinckii、ロボスファエロプシス属のL. lobophora、及びヨコワミドロ目に属するグラエシエラ属のG. emersonii、及びムリエラ属のM. zofingiensisを用いた。後述する培地に1.0×10⁶ cells/mLで播種した。

強光培養条件は、植物培養用蛍光灯Lv1（三菱電機オスラム）、CCFL照明ユニット（日本医科機器）及び強力LED電球（杭州遠方光電情報：中国）を組み合わせた光源から600 μmol photons/m²/sの光を、24時間連続照射で14日間照射した。93ｍLのチューブ（IWAKI）に80mLのTAP培地を入れ、チューブ内には20 mL/min/本で通気し、培地中のCO₂濃度を2〜5％とした。また、培養温度は25±2℃とした。

培養開始時、1日後、2日後、3日後、4日後、6日後、8日後、及び11日後に培養液の一部を採取して、コールターカウンターCDA-1000（Sysmex）を用いて細胞数をカウントし、1mLあたりの細胞数を算出した。

（結果）
図２に各トレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類を強光ストレス付与下で長時間培養した時の成長曲線を示す。いずれの種の成長曲線もシグモイド曲線となり、強光培養による成長の抑制は認められなかった。この結果から、強光培養条件であっても、トレボウクシア藻類及びヨコワミドロ藻類の生育及び増殖には影響がないことが明らかとなった。

＜実施例２：ヨコワミドロ藻類を用いたカロテノイドの生産（１）＞
（目的）
本発明のカロテノイド大量生産方法で処理したヨコワミドロ藻類におけるカロテノイド量を検証する。

（方法）
ヨコワミドロ藻類にはMuriella zofingiensisを用いた。強光培養条件は、実施例1の条件に準じた。培養初日、及び14日後の培養液2mLをそれぞれチューブに回収し、10000gで5分間の遠心により細胞を沈殿させた。上清を除去し、細胞ペレットを得た。これを−20℃で保存し、分析時に解凍して使用した。

分析は、まず、細胞ペレットに200μLのDMF（N,N-dimethylformamide）を加えて、タッピングにより細胞を懸濁した。続いて、10000gで5分間遠心した後、上清を回収した。DMF処理は、細胞内の色素が溶出して細胞が白色になるまで繰り返した。回収した上清をまとめて、200μLで取り分け、NaOH-メタノール溶液（0.1gNaOH in 100mLメタノール）溶液を9:1の割合で加え、4℃で12時間静置した。この処理によって、溶液中でエステル状態で存在するカロテノイドエステルを鹸化して、カロテノイドに戻した。NaOHが単体のカロテノイドを分解するのを防ぐため4℃の低温下で反応を行った。反応後の溶液を40μL採取し、HPLC（Waters2695 Separations Module、Waters 2475 Multi λ Fluorescence Detector）で分析した。測定波長は440nmで、Zapataの分析系（Zapata et al. 2000）を用いた。ピークの同定には市販の標準物質（ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、β-カロテン、及びリコペン）を用いた。

（結果）
図３に結果を示す。強光ストレス下培養初日におけるヨコワミドロ藻類の全植物色素に占めるカロテノイドの藻体内比率は、50％以下であった。一方、強光ストレスを付与し14日間培養した後の藻体中にはクロロフィルが存在せず（14D及び14D＋4℃）、そのほとんどがカロテノイドとなった。また、アスタキサンチンやアスタキサンチン誘導体の比率が顕著に増加し、強光ストレスによりヨコワミドロ藻類の藻体細胞内にアスタキサンチンやアスタキサンチン誘導体が大量に生産され、蓄積されることが明らかとなった。

＜実施例３：ヨコワミドロ藻類を用いたカロテノイドの生産（２）＞
（目的）
本発明のカロテノイド大量生産方法で処理した、実施例２とは異なるヨコワミドロ藻類におけるカロテノイド量を検証する。

（方法）
ヨコワミドロ藻類にはGraesiella emersoniiを用いた。強光培養条件は、実施例1の条件に準じた。14日間の強光培養条件は、実施例１の条件に準じた。また、8日間の強光培養条件として、強力LED電球（杭州遠方光電情報：中国）から2000 μmol photons/m²/sの光を、8日間連続照射した。

藻体から植物色素を抽出し、各色素を同定する方法は、実施例２に準じた。

（結果）
図４に結果を示す。実施例２で用いたMuriella zofingiensisと同様に、強光ストレス培養初日における全植物色素に占めるカロテノイドの藻体内比率は50％以下であった。強光ストレス下で8日間、及び14日間培養した後の藻体中の植物色素に占めるカロテノイドの比率は、いずれも90％以上となり（8D、14D）、また、ルテイン及びゼアキサンチン混合物の比率が増加した。この結果から、強光ストレスによりヨコワミドロ藻類にも細胞内にルテイン及びゼアキサンチンが大量に生産され、蓄積され得ることが確認された。

＜実施例４：トレボウクシア藻類を用いたカロテノイドの生産（１）＞
（目的）
本発明のカロテノイド大量生産方法で処理したトレボウクシア藻類におけるカロテノイド量を検証する。

（方法）
トレボウクシア藻類にはParachlorella kessleri NIES-2152を用いた。14日間の強光培養条件は、実施例１の条件に準じた。また、8日間の強光培養条件として、強力LED電球（杭州遠方光電情報：中国）から2000 μmol photons/m²/sの光を、8日間連続照射した。

藻体から植物色素を抽出し、各色素を同定する方法は、実施例２に準じた。

（結果）
図５に結果を示す。強光ストレス培養初日における全植物色素に占めるカロテノイドの藻体内比率は、50％以下であった。強光ストレス下で8日間、及び14日間培養した後の藻体中の植物色素に占めるカロテノイドの比率は90％以上となり（8D）、また、ルテイン及びゼアキサンチン混合物の比率が増加した。この結果から、強光ストレスによりトレボウクシア藻類の細胞内にルテイン及びゼアキサンチンが大量に生産され、蓄積されることが確認された。

また、表１に、実施例２〜４から算出された培養液1Lあたりの各カロテノイド量を示す。吸光度法によるカロテノイドの算出は、Wellburn, A.R.（J. Plant Physiol., 1994, 144, 307-313）に記載の方法に準じた。HPLC法及び吸光度法のいずれによる算出方法であってもカロテノイド量の傾向に大きな差は見られなかった。

＜実施例５：トレボウクシア藻類を用いたカロテノイドの生産（２）＞
（目的）
本発明のカロテノイド大量生産方法で処理したトレボウクシア藻類におけるカロテノイド量を検証する。

（方法）
トレボウクシア藻類にはChlorella sorokinianaを用いた。14日間の強光培養条件は、実施例１の条件に準じた。

藻体から植物色素を抽出し、各色素を同定する方法は、実施例２に準じた。より具体的には、カラムはWaters Symmetry C8 column (150 mm x 4.6 mm, 3.5 μm particle size, 100A pore size)を用い、溶媒A（メタノール：アセトニトリル：0.25Mピリジン水溶液 ＝ 50v：25v：25v）及び溶媒B（メタノール：アセトニトリル：アセトン ＝ 20v：60v：20v）を表２の条件で流速1 mL/minにてカラムに通した。抽出溶媒にはN,N-Dimethylformamide（DMF）又はメタノールを用いた。カラム投入量は30μLとした。

ピークの同定には市販の標準物質（ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、β-カロテン、ネオキサンチン及びアンテラキサンチン）を用いた。

（結果）
図６に結果を示す。強光ストレス培養初日における全植物色素に占めるカロテノイドの藻体内比率は、50％以下であった。強光ストレス下で14日間培養した後の藻体中の植物色素に占めるカロテノイドの比率は90％以上となり（14D）、また、アンテラキサンチンの比率が著しく増加した。この結果から、強光ストレスによりトレボウクシア藻類、特にChlorella sorokinianaの細胞内にはアンテラキサンチンが大量に生産され、蓄積されることが確認された。表３に、Chlorella sorokinianaの培養液1Lあたりにおける各カロテノイド量を示す。

表中「＊」は、実際の藻体内蓄積量が測定不能であったことを示す。これは、含まれるカロテノイドの中には測定のためにNaOH処理を要するものがあるが、NaOH処理はクロロフィルも分解してしまうため、同時には測定できないことによる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (5)

1. カロテノイドの大量生産方法であって、
   カワノリ目（Prasiolales）、ワタナベア系統群（Watanabea-clade）、ムリエラ属（Muriella）又はグラエシエラ属（Graesiella）に属する藻体に550〜2500μmol photons/m²/sの光強度で人工的な光を150〜500時間照射して培養するストレス付与工程を含み、
   前記カロテノイドがアスタキサンチン、アンテラキサンチン、ネオキサンチン、ゼアキサンチン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される1以上であり、
   前記光照射が連続照射、又は明期中に周期的に又は非周期的に数秒の暗期を含む明暗光照射である
   前記方法。
2. 前記ストレス付与工程後の培養液から藻体を回収する回収工程を含む、請求項１に記載のカロテノイドの大量生産方法。
3. 前記回収工程後の藻体を乾燥させる乾燥工程を含む、請求項２に記載のカロテノイドの大量生産方法。
4. 前記ストレス付与工程後又は乾燥工程後の藻体からカロテノイドを抽出する抽出工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカロテノイドの大量生産方法。
5. 前記抽出工程後の抽出液からカロテノイドを分離、精製する分離工程を含む、請求項４に記載のカロテノイドの大量生産方法。

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