CN114350736A - 一种提高雨生红球藻培养物中虾青素双酯含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高雨生红球藻培养物中虾青素双酯含量的方法。在培养雨生红球藻的第一阶段在培养基中添加有机酸镁盐，以促进MEP途径以及叶绿体中的电子的传递，从而增强藻类细胞的积累；在培养的第二阶段，加入胍基多肽以及表面活性剂，一方面胍基多肽参与藻类细胞内脂肪酸的代谢，从而促进脂肪酸的大量积累，另一方面，在表面活性剂的作用下能够促进脂肪酶的催化作用，从而促进虾青素双酯的生成。通过上述工艺优化，极大地提高了虾青素双酯在总虾青素产物中的含量，有利于生产高稳定性和抗氧化活性的商业化虾青素。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及一种提高雨生红球藻培养物中虾青素双酯含量的方法。
背景技术
虾青素是一种具有极强抗氧化性的脂溶性类胡萝卜素，化学名为3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，外观呈现红色或橙黄色。虾青素的生理功能十分优越，例如：通过血脑屏障、保护大脑，清除自由基，保护皮肤和眼睛，防止心脑血管老化，保护神经系统健康，缓解运动疲劳等。并且虾青素本身的颜色鲜艳，可以使动物的羽毛和皮肤呈现健康漂亮的颜色。基于上述特性，虾青素在保健、医药、食品、化妆品、养殖等各个领域有着十分广泛的应用。
虾青素的化学结构如下式所示，以共轭双键形式的形式将4个异戊二烯单位联接起来，并且有两个由异戊二烯单位组成的六元环结构各连接在两端，共轭羟基和不饱和双键都能够淬灭氧自由基，使得虾青素有着很强的抗氧化功能，据研究其抗氧化活性为维生素E的550倍，是β-胡萝卜素的10倍。虾青素分子结构的两端有两个手性中心，两个手性碳原子都能以左旋(S)或右旋(R)的形式存在，形成了三种立体异构：3S,3’S、3S,3’R、3R,3’R。根据动物实验验证，其抗氧化活性3S,3’S＞3R,3’R＞3S,3’R。
目前，主流的虾青素的制备方法有化学合成、红法夫酵母发酵和雨生红球藻发酵等，其中化学法制备的是3S,3’S:3S,3’R:3R,3’R＝1:2:1的混合物，抗氧化活性最低；红法夫酵母发酵的虾青素95％以上是是3R,3’R，雨生红球藻合成的虾青素95％以上是活性最高的3S,3’S构型。基于抗氧化活性和安全性的考虑，目前国家规定，仅有雨生红球藻来源的虾青素能够用于人类食品和保健品，化学合成与酵母发酵的产物只能用于饲料当中。因此，开发雨生红球藻虾青素资源成为众多企业研究的重点。
然而虾青素的共轭双键结构也导致了虾青素的性质不稳定，光、热、氧化物等很容易破坏它的结构，从而失去抗氧化活性，而酯化保护的方法是一种保护抗氧化活性的策略。共轭双键末端各有一个羟基，能够与脂肪酸形成单酯或双酯，例如在雨生红球藻的虾青素产物中，65％以单酯形式存在，30％以双酯形式存在，游离态约占5％。由于虾青素双酯结构更加稳定，不易被氧化变性，因此提高雨生红球藻中虾青素双酯的含量有利于虾青素的保存。有研究表明，在鱼类吸收和色素沉积方面，虾青素酯和游离虾青素在生物利用方面差别很小。抗氧化方面，与游离虾青素相比，虾青素单酯的活性略低，双酯活性最低。但是服用虾青素酯之后，在消化道内可由脂肪酶以水解为单体(雨生红球藻源虾青素酯的消化吸收特性研究[J].中国食品学报,2019,019(004):125-132.)，不影响虾青素的吸收和功效发挥。并且虾青素酯的生物活性也越来越多的被研究，例如Rao等研究表明虾青素单酯和双酯可以避免皮肤癌的发生(Effective inhibition of skin cancer,tyrosinase,andantioxidative properties by astaxanthin and astaxanthin esters from the greenalga Haematococcus pluvialis.[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2013,61(16):3842-3851)，Kamath的实验结果表明虾青素酯对大鼠胃溃疡有缓解和治疗作用(Ulcer preventive and antioxidative properties of astaxanthin fromHaematococcus pluvialis[J].European Journal of Pharmacology,2008,590(1-3):387-395)。Kobayashi对亚油酸光敏氧化实验，表明虾青素酯的单线态氧淬灭能力要优于其他的类胡萝卜素(Singlet oxygen quenching ability of astaxanthin esters fromthe green algaHaematococcus pluvialis[J].Biotechnology Letters,1999,21(4):265-269.)。因此提升雨生红球藻发酵产物中虾青素双酯的含量，有利于保护其抗氧化活性，并且不影响服用后的消化和功能发挥，有利于产品的商业化推广。
雨生红球藻的生长和虾青素积累过程都受到自身及环境因素的影响，包括培养基中组分的浓度、光照质量及强度、温度、pH等。雨生红球藻的生长过程分为两个阶段：①在较为温和舒适培养条件下，使藻类细胞保持在快速生长游动的细胞阶段，以获得较高的生物量。②通过限制氮源、磷源及高光强等胁迫条件，诱导游动细胞为不动细胞，从而获得虾青素的积累。
综上，现有虾青素制备过程中存在虾青素不稳定、易被氧化等问题。需要采取合适的工艺手段提升虾青素的稳定性，促进雨生红球藻虾青素的商业化应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高雨生红球藻培养物中虾青素双酯含量的方法。该方法将基于提升虾青素发酵稳定性和活性，采用新颖高效的方法提高了雨生红球藻虾青素双酯的含量，通过上述工艺，可实现雨生红球藻虾青素的商业化生产。
一种提高雨生红球藻培养物中虾青素双酯含量的方法，所述方法在基础培养基中添加有机酸镁，在补料培养基中添加胍基多肽和表面活性剂。
上述方法中，在生长第一阶段在培养基中添加有机酸镁盐，以促进MEP途径以及叶绿体中的电子的传递，从而增强藻类细胞的积累。在生长第二阶段，加入胍基多肽衍生物以及表面活性剂，一方面胍基多肽衍生物两亲性的多肽链起到催化藻类细胞内脂肪酸的代谢的作用，从而促进脂肪酸的大量积累；另一方面，在表面活性剂的作用下能够促进脂肪酶的催化作用，从而促进虾青素双酯的生成。
本发明中，所述雨生红球藻培养分为游动细胞培养和胁迫培养两个阶段；优选地，所述游动细胞培养阶段的培养温度为15-25℃，光照强度50-500μmol/(m2·s)，每天光照时间为12-20小时，培养时间3-12天；优选地，所述胁迫培养阶段的培养温度为15-25℃，光照强度2000-5000μmol/(m2·s)，每天光照时间为16-24小时，培养时间8-20天。
本发明中，所述有机酸镁为柠檬酸镁、乳酸镁、羟基乙酸镁、苏糖酸镁、苹果酸镁中的一种或多种；优选地，所述有机酸镁在基础培养基中添加量200-1800mg/L。
本发明中，所述胍基多肽是由3-5个氨基酸组成的多肽，其中多肽链的端点分别称氨基端(N端)和羧基端(C端)，该多肽N端的氨基由胍基取代；优选地，所述胍基多肽结构如下式所示：
其中，n为0-2的整数；R1为亲水性基团，优选R1来自亲水性氨基酸丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)中的一种或多种；R3和R4为疏水性基团，优选R3和R4来自疏水性氨基酸如缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)中的一种或多种；优选R2来自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)中的一种或多种，当n为2时，R2的来源可以相同或不同；优选地，所述胍基多肽衍生物在补料培养基中的添加量为500-1500mg/L。
本发明中，所述表面活性剂为烷基糖苷、蔗糖酯、月桂酰谷氨酸钾、椰油酰氨基丙酸钠中的一种或多种；优选地，所述表面活性剂在补料培养基中的添加量为200-800mg/L。
本发明中，所述基础培养基的基础组分包含硝酸钾、磷酸二氢钾、二水合氯化钙、EDTA二钠、六水合氯化铁、氯化锌、硼酸、六水合氯化钴、五水合硫酸铜、六水合氯化锰、二水合钼酸钠中的一种或多种；优选地，所述基础培养基的各基础组分含量为：硝酸钾200-600mg/L，磷酸二氢钾10-70mg/L，二水合氯化钙50-200mg/L，EDTA二钠1.0-10mg/L，六水合氯化铁1.0-5.0mg/L，氯化锌0.0001-0.001mg/L，硼酸0.01-0.1mg/L，六水合氯化钴0.0001-0.001mg/L，五水合硫酸铜0.01-0.1mg/L，六水合氯化锰0.0001-0.001mg/L，二水合钼酸钠0.01-0.1mg/L。
本发明中，所述胍基多肽和表面活性剂采用流加补料的方式在胁迫培养阶段加入光生物反应器中；优选地，所述胍基多肽和表面活性剂的流加速率为0.5-5mL/h。
本发明中，所述方法获得的虾青素酯按照分子量折算成虾青素计算，总虾青素占藻体的湿重为3-10％；优选地，所述虾青素中游离虾青素占2％-20％，虾青素双酯占60％-70％，虾青素单酯占20％-28％，以虾青素总质量计。
在一种实施方案中，藻体加入萃取剂，利用超声细胞破碎仪进行破壁处理，再离心，收集萃取剂，再向藻体沉淀中加入萃取剂，重复上述萃取-破壁-离心-收集萃取剂步骤，直至萃取剂提取至藻渣呈现白色，将搜集到的萃取剂上清液合并，利用高效液相色谱-质谱联用的方法检测其中的游离虾青素以及虾青素酯的含量。其中，所述的萃取剂可选用丙酮、环己酮、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚等，每次添加质量为藻体湿重的3-10倍。
本发明的另一目的在于提供一种虾青素产品。
一种虾青素，采用上述的方法制备获得，所述虾青素中游离虾青素占2％-20％，虾青素双酯占60％-70％，虾青素单酯占20％-28％，以虾青素总质量计。
与现有技术相比较，本发明的积极效果在于：
(1)目前现有的雨生红球藻养殖方法中，虾青素含量平均为1.5％～3％，本发明实施例中的虾青素含量可提升至3％～10％，能够提升虾青素的产量，降低生产成本。
(2)现有的雨生红球藻虾青素双酯含量仅有30％左右的水平，本发明能够有效提升虾青素中虾青素双酯所占比例，达到60％～70％，将羟基以酯键的形式保护起来，极大降低虾青素在生产、保存过程中的氧化，使雨生红球藻虾青素更加稳定，有利于商业化推广。
具体实施方式
为了进一步说明本发明提供的提升虾青素酯含量的方法，下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。
雨生红球藻，藻株型号H3，购自上海光语生物科技有限公司；
胍基多肽衍生物，购自吉尔生化(上海)有限公司；
柠檬酸镁、乳酸镁、羟基乙酸镁、苏糖酸镁、苹果酸镁等，购自阿拉丁公司，规格为分析级；
烷基糖苷、蔗糖酯、月桂酰谷氨酸钾、椰油酰氨基丙酸钠，购自SIGMA公司，规格为分析级；
无机盐试剂均为市售分析纯。
分析测试方法：
虾青素及酯的液相色谱-质谱联用检测方法如下：检测仪器为安捷伦高效液相色谱质谱联用仪，配Phenomenx C18反相色谱柱5μm(4.6mm×250mm)。流动相A为水和甲醇的混合液(体积比为3:1)，流动相B为乙腈(100％)，流速0.5ml/min，洗脱程序如表1所示。采用紫外检测，检测波长为476nm。质谱仪以点喷雾电离作为离子源，点喷雾电离负离子模式，毛细管电压4000V，喷雾器气体流速和压力分别为5L/min和40psi，氮气气温为325℃，进样量10μL。对萃取液中的虾青素、虾青素单酯和双酯进行分离鉴定，并统计其含量。
表1梯度洗脱程序
实施例1
(1)雨生红球藻游动细胞的培养
雨生红球藻培养时所采用的培养基为MCM培养基，其配方如下：乳酸镁870mg/L，硝酸钾200mg/L，磷酸二氢钾34.6mg/L，二水合氯化钙73.8mg/L，EDTA二钠4.7mg/L，六水合氯化铁1.9mg/L，氯化锌0.0001mg/L，硼酸0.09mg/L，六水合氯化钴0.0008mg/L，五水合硫酸铜0.015mg/L，六水合氯化锰0.0006mg/L，二水合钼酸钠0.05mg/L。按照上述配方配置好培养基溶液3L后，在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃，接种雨生红球种子液，接种量为培养基体积的10％。加入内置光源的釜式光生物反应器，开始雨生红球藻游动细胞的培养，使藻体扩增。该阶段的培养温度为19℃，光照强度150μmol/(m2·s)，每天光照时间为17小时，培养时间3天。
(2)雨生红球藻胁迫产虾青素
雨生红球藻游动细胞培养期结束后，增大光照强度至3600μmol/(m2·s)，每天光照时间为24小时。并且向反应器内通入补料培养基，培养基中有两种组分，胍基多肽衍生物的结构为：胍基-C-R-V-P，添加量为500mg/L，月桂酰谷氨酸钾含量为450mg/L，上述补料培养基同样在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃以下后，采用流加方式通入光生物反应器中，流加速率为5.0mL/h。在该胁迫条件下进行虾青素的生成和累积。该阶段培养时间为19天。
(3)藻体的收集与虾青素酯含量的检测
在培养结束之后，取上述培养好的雨生红球藻培养液10mL，置于已经称好质量(质量记为M1)的15mL离心管中，记录藻液与离心管的质量之和M2，利用离心机在6000rpm下离心10min后，弃掉上层上清液，记录下层藻体与离心管的质量之和M3。则溶液中的藻体湿重为(M2-M3)/(M2-M1)。经过检测，藻体湿重为10％。
藻体加入丙酮作为萃取剂，利用超声细胞破碎仪对藻体进行破壁处理，再离心，收集萃取剂，再向藻体沉淀中加入萃取剂，重复上述萃取-破壁-离心-收集萃取剂步骤，每次的萃取剂添加量为藻体湿重的9.3倍。重复三次后萃取剂提取至藻渣呈现白色，将搜集到的萃取剂上清液合并，利用高效液相色谱-质谱联用的方法检测其中的游离虾青素以及虾青素酯的含量，其中虾青素酯按照分子量折算成虾青素计算，总虾青素占藻体的湿重为7％，其中游离虾青素占5.1％，虾青素双酯占80％，虾青素单酯占14.9％。
实施例2
(1)雨生红球藻游动细胞的培养
雨生红球藻培养时所采用的培养基为MCM培养基，其配方如下：苏糖酸镁200mg/L，硝酸钾500mg/L，磷酸二氢钾59mg/L，二水合氯化钙50mg/L，EDTA二钠10mg/L，六水合氯化铁5.0mg/L，氯化锌0.001mg/L，硼酸0.06mg/L，六水合氯化钴0.0007mg/L，五水合硫酸铜0.03mg/L，六水合氯化锰0.0009mg/L，二水合钼酸钠0.02mg/L。按照上述配方配置好培养基溶液3L后，在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃以下，接种雨生红球种子液，接种量为培养基体积的10％。加入内置光源的釜式光生物反应器，开始雨生红球藻游动细胞的培养，使藻体扩增。该阶段的培养温度为21℃，光照强度400μmol/(m2·s)，每天光照时间为16小时，培养时间6天。
(2)雨生红球藻胁迫产虾青素
雨生红球藻游动细胞培养期结束后，增大光照强度至4700μmol/(m2·s)，每天光照时间为18小时。并且向反应器内通入补料培养基，培养基中有两种组分，胍基多肽衍生物的结构为：胍基-S-I-L，添加量为500mg/L，蔗糖酯含量为500mg/L，上述补料培养基同样在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃以下后，采用流加方式通入光生物反应器中，流加速率为5.0mL/h。在该胁迫条件下进行虾青素的生成和累积。该阶段培养时间为8天。
(3)藻体的收集与虾青素酯含量的检测
在培养结束之后，取上述培养好的雨生红球藻培养液10mL，置于已经称好质量(质量记为M1)的15mL离心管中，记录藻液与离心管的质量之和M2，利用离心机在6000rpm下离心10min后，弃掉上层上清液，记录下层藻体与离心管的质量之和M3。则溶液中的藻体湿重为(M2-M3)/(M2-M1)。经过检测，藻体湿重约为7％。
藻体加入乙酸乙酯作为萃取剂，利用超声细胞破碎仪对藻体进行破壁处理，再离心，收集萃取剂，再向藻体沉淀中加入萃取剂，重复上述萃取-破壁-离心-收集萃取剂步骤，每次的萃取剂添加量为藻体湿重的10倍。重复三次后萃取剂提取至藻渣呈现白色，将搜集到的萃取剂上清液合并，利用高效液相色谱-质谱联用的方法检测其中的游离虾青素以及虾青素酯的含量，其中虾青素酯按照分子量折算成虾青素计算，总虾青素占藻体的湿重为5％，其中游离虾青素占7％，虾青素双酯占68.1％，虾青素单酯占24.8％。
实施例3
(1)雨生红球藻游动细胞的培养
雨生红球藻培养时所采用的培养基为MCM培养基，其配方如下：柠檬酸镁680mg/L，硝酸钾530mg/L，磷酸二氢钾70mg/L，二水合氯化钙90.9mg/L，EDTA二钠3.2mg/L，六水合氯化铁4.1mg/L，氯化锌0.0003mg/L，硼酸0.01mg/L，六水合氯化钴0.0001mg/L，五水合硫酸铜0.1mg/L，六水合氯化锰0.0001mg/L，二水合钼酸钠0.01mg/L。按照上述配方配置好培养基溶液3L后，在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃以下，接种雨生红球种子液，接种量为培养基体积的10％。加入内置光源的釜式光生物反应器，开始雨生红球藻游动细胞的培养，使藻体扩增。该阶段的培养温度为25℃，光照强度500μmol/(m2·s)，每天光照时间为12小时，培养时间10天。
(2)雨生红球藻胁迫产虾青素
雨生红球藻游动细胞培养期结束后，增大光照强度至2000μmol/(m2·s)，每天光照时间为21小时。并且向反应器内通入补料培养基，培养基中有两种组分，胍基多肽衍生物的结构为：胍基-Y-E-D-L-I，添加量为1500mg/L，烷基糖苷含量为750mg/L，上述补料培养基同样在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃以下后，采用流加方式通入光生物反应器中，流加速率为0.5mL/h。在该胁迫条件下进行虾青素的生成和累积。该阶段培养时间为20天。
(3)藻体的收集与虾青素酯含量的检测
在培养结束之后，取上述培养好的雨生红球藻培养液10mL，置于已经称好质量(质量记为M1)的15mL离心管中，记录藻液与离心管的质量之和M2，利用离心机在6000rpm下离心10min后，弃掉上层上清液，记录下层藻体与离心管的质量之和M3。则溶液中的藻体湿重为(M2-M3)/(M2-M1)。经过检测，藻体湿重约为15％。
藻体加入甲基叔丁基醚作为萃取剂，利用超声细胞破碎仪对藻体进行破壁处理，再离心，收集萃取剂，再向藻体沉淀中加入萃取剂，重复上述萃取-破壁-离心-收集萃取剂步骤，每次的萃取剂添加量为藻体湿重的4倍。重复三次萃取剂提取至藻渣呈现白色，将搜集到的萃取剂上清液合并，利用高效液相色谱-质谱联用的方法检测其中的游离虾青素以及虾青素酯的含量，其中虾青素酯按照分子量折算成虾青素计算，总虾青素占藻体的湿重为6％，其中游离虾青素占5.5％，虾青素双酯占75.1％，虾青素单酯占19.5％。
实施例4
(1)雨生红球藻游动细胞的培养
雨生红球藻培养时所采用的培养基为MCM培养基，其配方如下：苹果酸镁1800mg/L，硝酸钾350mg/L，磷酸二氢钾31.3mg/L，二水合氯化钙171.6mg/L，EDTA二钠8.0mg/L，六水合氯化铁3.7mg/L，氯化锌0.0002mg/L，硼酸0.05mg/L，六水合氯化钴0.0004mg/L，五水合硫酸铜0.08mg/L，六水合氯化锰0.0008mg/L，二水合钼酸钠0.07mg/L。按照上述配方配置好培养基溶液后3L，在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃以下，接种雨生红球种子液，接种量为培养基体积的10％。加入内置光源的釜式光生物反应器，开始雨生红球藻游动细胞的培养，使藻体扩增。该阶段的培养温度为21℃，光照强度225μmol/(m2·s)，每天光照时间为15小时，培养时间12天。
(2)雨生红球藻胁迫产虾青素
雨生红球藻游动细胞培养期结束后，增大光照强度至5000μmol/(m2·s)，每天光照时间为22小时。并且向反应器内通入补料培养基，培养基中有两种组分，胍基多肽衍生物的结构为：胍基-T-D-H-P-V，添加量为736mg/L，蔗糖酯含量为350mg/L，上述补料培养基同样在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃以下后，采用流加方式通入光生物反应器中，流加速率为4.3mL/h。在该胁迫条件下进行虾青素的生成和累积。该阶段培养时间为16天。
(3)藻体的收集与虾青素酯含量的检测
在培养结束之后，取上述培养好的雨生红球藻培养液10mL，置于已经称好质量(质量记为M1)的15mL离心管中，记录藻液与离心管的质量之和M2，利用离心机在6000rpm下离心10min后，弃掉上层上清液，记录下层藻体与离心管的质量之和M3。则溶液中的藻体湿重为(M2-M3)/(M2-M1)。经过检测，藻体湿重约为8％。
藻体加入丙酮作为萃取剂，利用超声细胞破碎仪对藻体进行破壁处理，再离心，收集萃取剂，再向藻体沉淀中加入萃取剂，重复上述萃取-破壁-离心-收集萃取剂步骤，每次的萃取剂添加量为藻体湿重的5.7倍。重复三次萃取剂提取至藻渣呈现白色，将搜集到的萃取剂上清液合并，利用高效液相色谱-质谱联用的方法检测其中的游离虾青素以及虾青素酯的含量，其中虾青素酯按照分子量折算成虾青素计算，总虾青素占藻体的湿重为3％，其中游离虾青素占2％，虾青素双酯占78％，虾青素单酯占20％。
实施例5
(1)雨生红球藻游动细胞的培养
雨生红球藻培养时所采用的培养基为MCM培养基，其配方如下：苏糖酸镁1200mg/L，硝酸钾600mg/L，磷酸二氢钾10mg/L，二水合氯化钙200mg/L，EDTA二钠1.0mg/L，六水合氯化铁1.0mg/L，氯化锌0.0009mg/L，硼酸0.1mg/L，六水合氯化钴0.001mg/L，五水合硫酸铜0.07mg/L，六水合氯化锰0.001mg/L，二水合钼酸钠0.1mg/L。按照上述配方配置好培养基溶液后3L，在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃以下，接种雨生红球种子液，接种量为培养基体积的10％。加入内置光源的釜式光生物反应器，开始雨生红球藻游动细胞的培养，使藻体扩增。该阶段的培养温度为15℃，光照强度50μmol/(m2·s)，每天光照时间为20小时，培养时间8天。
(2)雨生红球藻胁迫产虾青素
雨生红球藻游动细胞培养期结束后，增大光照强度至2500μmol/(m2·s)，每天光照时间为16小时。并且向反应器内通入补料培养基，培养基中有两种组分，胍基多肽衍生物的结构为：胍基-C-K-V-L，添加量为828mg/L，椰油酰氨基丙酸钠含量为200mg/L，上述补料培养基同样在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃以下后，采用流加方式通入光生物反应器中，流加速率为1.9mL/h。在该胁迫条件下进行虾青素的生成和累积。该阶段培养时间为14天。
(3)藻体的收集与虾青素酯含量的检测
在培养结束之后，取上述培养好的雨生红球藻培养液10mL，置于已经称好质量(质量记为M1)的15mL离心管中，记录藻液与离心管的质量之和M2，利用离心机在6000rpm下离心10min后，弃掉上层上清液，记录下层藻体与离心管的质量之和M3。则溶液中的藻体湿重为(M2-M3)/(M2-M1)。经过检测，藻体湿重约为5％。
藻体加入环己酮作为萃取剂，利用超声细胞破碎仪对藻体进行破壁处理，再离心，收集萃取剂，再向藻体沉淀中加入萃取剂，重复上述萃取-破壁-离心-收集萃取剂步骤，每次的萃取剂添加量为藻体湿重的3倍。重复三次萃取剂提取至藻渣呈现白色，将搜集到的萃取剂上清液合并，利用高效液相色谱-质谱联用的方法检测其中的游离虾青素以及虾青素酯的含量，其中虾青素酯按照分子量折算成虾青素计算，总虾青素占藻体的湿重为10％，其中游离虾青素占10％，虾青素双酯占60％，虾青素单酯占30％。
实施例6
(1)雨生红球藻游动细胞的培养
雨生红球藻培养时所采用的培养基为MCM培养基，其配方如下：羟基乙酸镁1500mg/L，硝酸钾430mg/L，磷酸二氢钾43.5mg/L，二水合氯化钙115.9mg/L，EDTA二钠3.7mg/L，六水合氯化铁4.3mg/L，氯化锌0.0005mg/L，硼酸0.08mg/L，六水合氯化钴0.0009mg/L，五水合硫酸铜0.01mg/L，六水合氯化锰0.0001mg/L，二水合钼酸钠0.08mg/L。按照上述配方配置好培养基溶液后3L，在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃以下，接种雨生红球种子液，接种量为培养基体积的10％。加入内置光源的釜式光生物反应器，开始雨生红球藻游动细胞的培养，使藻体扩增。该阶段的培养温度为16℃，光照强度380μmol/(m2·s)，每天光照时间为18小时，培养时间9天。
(2)雨生红球藻胁迫产虾青素
雨生红球藻游动细胞培养期结束后，增大光照强度至3500μmol/(m2·s)，每天光照时间为20小时。并且向反应器内通入补料培养基，培养基中有两种组分，胍基多肽衍生物的结构为：胍基-Y-H-I-P，添加量为1074mg/L，烷基糖苷含量为800mg/L，上述补料培养基同样在121℃下高温灭菌20min，放置降温至25℃以下后，采用流加方式通入光生物反应器中，流加速率为3.3mL/h。在该胁迫条件下进行虾青素的生成和累积。该阶段培养时间为15天。
(3)藻体的收集与虾青素酯含量的检测
在培养结束之后，取上述培养好的雨生红球藻培养液10mL，置于已经称好质量(质量记为M1)的15mL离心管中，记录藻液与离心管的质量之和M2，利用离心机在6000rpm下离心10min后，弃掉上层上清液，记录下层藻体与离心管的质量之和M3。则溶液中的藻体湿重为(M2-M3)/(M2-M1)。经过检测，藻体湿重约为12％。
藻体加入乙酸乙酯作为萃取剂，利用超声细胞破碎仪对藻体进行破壁处理，再离心，收集萃取剂，再向藻体沉淀中加入萃取剂，重复上述萃取-破壁-离心-收集萃取剂步骤，每次的萃取剂添加量为藻体湿重的7.4倍。重复三次萃取剂提取至藻渣呈现白色，将搜集到的萃取剂上清液合并，利用高效液相色谱-质谱联用的方法检测其中的游离虾青素以及虾青素酯的含量，其中虾青素酯按照分子量折算成虾青素计算，总虾青素占藻体的湿重为9％，其中游离虾青素占10％，虾青素双酯占80％，虾青素单酯占10％。
对比例1
按照实施例1方法，不同之处仅在于步骤(2)中，不加入胍基多肽衍生物，而加入异亮氨酸500mg，其它操作及参数均相同。
最终经过检测，步骤(3)中的总虾青素占藻体湿重为3％，其中游离虾青素占32％，虾青素双酯占23％，虾青素单酯占45％。
对比例2
按照实施例6方法，不同之处仅在于步骤(1)中，不加入羟基乙酸镁，而加入七水合硫酸镁，浓度为1500mg，其它操作及参数均相同。
最终经过检测，步骤(3)中的总虾青素占藻体湿重为4％，其中游离虾青素占27％，虾青素双酯占25％，虾青素单酯占48％。
对比例3
按照实施例2方法，不同之处仅在于步骤(2)中，不加入蔗糖酯表面活性剂，其它操作及参数均相同。
最终经过检测，步骤(3)中的总虾青素占藻体湿重为4％，其中游离虾青素占24％，虾青素双酯占11％，虾青素单酯占65％。
本领域技术人员可以理解，在本说明书的教导之下，可对本发明做出一些修改或调整。这些修改或调整也应当在本发明权利要求所限定的范围之内。
Claims (9)
1.一种提高雨生红球藻培养物中虾青素双酯含量的方法，其特征在于，所述方法在基础培养基中添加有机酸镁，在补料培养基中添加胍基多肽和表面活性剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述雨生红球藻培养分为游动细胞培养和胁迫培养两个阶段；
优选地，所述游动细胞培养阶段的培养温度为15-25℃，光照强度50-500μmol/(m2·s)，每天光照时间为12-20小时，培养时间3-12天；
优选地，所述胁迫培养阶段的培养温度为15-25℃，光照强度2000-5000μmol/(m2·s)，每天光照时间为16-24小时，培养时间8-20天。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述有机酸镁为柠檬酸镁、乳酸镁、羟基乙酸镁、苏糖酸镁、苹果酸镁中的一种或多种；
优选地，所述有机酸镁在基础培养基中添加量200-1800mg/L。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述胍基多肽是由3-5个氨基酸组成的多肽，其中多肽链的端点分别为氨基端(N端)和羧基端(C端)，该多肽N端的氨基由胍基取代；
优选地，所述胍基多肽结构如下式所示：
其中，n为0-2的整数；R1为亲水性基团，优选R1来自亲水性氨基酸丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、酪氨酸中的一种或多种；R3和R4为疏水性基团，优选R3和R4来自疏水性氨基酸如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸中的一种或多种；优选R2来自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的一种或多种，当n为2时，R2的来源可以相同或不同；
优选地，所述胍基多肽衍生物在补料培养基中的添加量为500-1500mg/L。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂为烷基糖苷、蔗糖酯、月桂酰谷氨酸钾、椰油酰氨基丙酸钠中的一种或多种；
优选地，所述表面活性剂在补料培养基中的添加量为200-800mg/L。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基础培养基的基础组分包含硝酸钾、磷酸二氢钾、二水合氯化钙、EDTA二钠、六水合氯化铁、氯化锌、硼酸、六水合氯化钴、五水合硫酸铜、六水合氯化锰、二水合钼酸钠中的一种或多种；
优选地，所述基础培养基的各基础组分含量为：硝酸钾200-600mg/L，磷酸二氢钾10-70mg/L，二水合氯化钙50-200mg/L，EDTA二钠1.0-10mg/L，六水合氯化铁1.0-5.0mg/L，氯化锌0.0001-0.001mg/L，硼酸0.01-0.1mg/L，六水合氯化钴0.0001-0.001mg/L，五水合硫酸铜0.01-0.1mg/L，六水合氯化锰0.0001-0.001mg/L，二水合钼酸钠0.01-0.1mg/L。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述胍基多肽和表面活性剂采用流加补料的方式在胁迫培养阶段加入光生物反应器中；
优选地，所述胍基多肽和表面活性剂的流加速率为0.5-5mL/h。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法获得的虾青素酯按照分子量折算成虾青素计算，总虾青素占藻体的湿重为3-10％；
优选地，所述虾青素中游离虾青素占2％-20％，虾青素双酯占60％-70％，虾青素单酯占20％-28％，以虾青素总质量计。
9.一种虾青素，采用权利要求1-8中任一项所述的方法制备获得，其特征在于，所述虾青素中游离虾青素占2％-20％，虾青素双酯占60％-70％，虾青素单酯占20％-28％，以虾青素总质量计。
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