CN1071836A

CN1071836A - 治疗肿瘤病的药品及其制备方法

Info

Publication number: CN1071836A
Application number: CN92110624A
Authority: CN
Inventors: G·索默亚
Original assignee: DH Human Health Foundation
Current assignee: DH Human Health Foundation
Priority date: 1991-10-31
Filing date: 1992-09-28
Publication date: 1993-05-12
Anticipated expiration: 2007-09-28
Also published as: CA2122612A1; ES2077530A1; DE4232465B4; SE9401406D0; NL9220026A; WO1993008794A1; DK170832B1; ITMI922233A1; LU88175A1; HU913437D0; FR2683148A1; NO941590L; SE513624C2; NO941590D0; NL194664C; ES2077530B1; IT1255390B; AT402692B; CH685282A5; DE4232465A1

Abstract

本发明涉及治疗肿瘤病的产品，该产品包括作为活性剂的适于人消费的氘含量为0.1到110ppm的水和/或水溶液，必要时还有载体和助剂。该产品为药品或药用溶液形式。本发明还涉及制备这些产品的方法。

Description

本发明涉及治疗肿瘤病的药品及其制备方法。

当今，有大量的医治恶性肿瘤的方法（外科手术，照射疗法，内分泌疗法，服用抗肿瘤药）。在最近十年，所有这些方法及在诊断学方面的最新成就都取得了巨大进步，尽管如此，治疗方法仍有许多缺点。

问题的主要原因在于不清楚细胞增殖的分子机理，因而借可获得的方法对病程的干预相当困难。因而治疗方法或至少是延缓病情的发展常常包括切除器官的某些部分，或使用抗肿瘤药物等。以消除造血过程中的障碍。

对该问题的合适的答案只能期盼对在引发细胞增殖中起关键作用的（亚）分子过程的充分认识。

借分子生物学的发展，生物科学正面临认识决定性的控制过程，借此有可能使患肿瘤疾病的病人恢复健康。

考虑分子生物学的最新成果，可以得出如下结论：真核细胞对激活增殖的刺激物的普通甲期反应是由于细胞外的Na⁺经浆膜交换细胞内的H⁺而使细胞内的PH升高〔见P.N.A.S.79，7778-7782（1982）〕。Na⁺/H⁺交换系统的激活是引发细胞生长所必不可少的，这一结论得到大量实验结果的支持。

已发现消除Na⁺/H⁺交换系统的特异性突变将会妨碍细胞在中性和酸性PH下生长〔见P.N.A.S.81 4833-4837（1984）〕。

最新证据表明了生长因子活化了Na⁺/H⁺交换系统，这就意味着Na⁺/H⁺交换可起跨膜信号转换器作用〔见Nature 304，645-648（1983）〕。

活化后的Na⁺/H⁺交换系统与细胞系的肿瘤特性之间的关系也得到了证明。在将转化的细胞系与未致肿瘤亲代系比较后，发现PH将升高〔见P.N.A.S.84，2766-2770（1987）〕。由于注射由Ha-ras编码的蛋白质或V-mos和Ha-ras致癌基因在细胞内的表达，通过活化Na⁺/H⁺交换系统而升高了细胞的PH值，所以致癌基因的表达和升高的细胞内PH之间牢固的关联作用已被发现〔见Mol.cell.Boil.7 1984-1988（1987）;Gene 54，147-153（1987）〕。

通过活化另一种与细胞膜结合的氢离子转运系统发现了类似的变化。在该情况下，ATP酶基因从酵母中分离并用于转化小鼠和猴子的细胞系。该基因被表达且通过连续逐出质子ATP酶引起了细胞质的持续的碱化。该实验真正令人惊奇的结果是由酵母的ATP酶基因转化的细胞获得了致肿瘤特性〔见NATURE 334，438-440（1980）〕

这一最新实验证明了诱导细胞增殖不仅与Na⁺/H⁺交换系统的活化作用有关，而且与通常用作细胞增殖信号的其它逐出质子系统有关。

对上述现象可以简单解释为由于升高了细胞内PH值而引发了细胞的增殖。然而这种解释与实验不一致，在实验中人为地提高细胞质中PH并没有提高细胞增殖活性〔见J.Exp.Boil.124，359-373（1986）〕。

上述的分子过程可通过研究氢和氘在控制上述过程中可能的作用来解释。

在自然界，氢与氘之比为约6000：1。由于质量相差100%，两种同位素在化学反应中显示不同的性能。通常可接受的看法是由于同位素效应，参予化学反应的D键可在较低速度下断裂，因此它们需要增加活化能（见Simonyi miklos and Fitos Ilona：Hydrogen Istope Eflect in the chemical Reactions，A Kenia Ujabb eredmenyei（在匈牙利），（Recent Result in chemistry）46，8-129（1980）〕。在酶促反应中，对于质量数较小的氢同位素可类似地测得其反应速度要高4到5倍（见Biochem.pharmacol，30，3089-3094（1981）〕。

氘在生物系统中的作用也作了全面研究，〔见Katz，J.J.and Crespi，H.L.：Isotope Eflects in Biological System（eds.collins，C.J.and Bowman，NS.）A.C.S.Monograph167，Wan Nostrand Reinhold，New York，1971，286-363〕。这些实验的共同特点是研究氘作用通常使用高（1-100%）D₂O浓度。

普通可接受的观点是氘有抑制细菌、酵母和植物繁殖和生长的作用。哺乳动物能耐受的D₂O浓度最高为35%，更高的D₂O浓度对它们将是致命的。

在这些实验中，所用氘浓度是自然浓度（这一浓度常被忽略）的100到10000倍。

对在沉淀物中氢同位素的世界范围的调查表明D含量主要与取样部位有关，范围在120-160ppm。在氢同位素之间有差异的植物及类似的海藻类能富集氢（见Schiegl，W.E.and Vogel，J.C.，Earth and Planet，Sci.Letter 7，307-313（1970）;Ziegler，H.et al.，Planta 128，85-92（1976）〕。作为这些过程的结果，氘浓度例如在食植物生物中显示较窄的变化范围，这一范围与生物种及所消费的植物量有关。对于人类，地域（栽有所消费的植物）是一个决定性因素。根据测量，在热带雨水中的氘含量在155-160ppm范围内，而在温带地区该值仅为120-150。在植物中氘含量差异也是可观的，变化高达10-20%。

虽然上述现象被观察到了，但专家们并未把重点放在生物系统的氘含量上。

本发明的目的在于开发适于预防癌症或抑制肿瘤生长的药品并以这样的方法治疗癌症。

本发明的基础是认识到在生物系统中低氘含量（120-160ppm）对于维持细胞增殖正常速率是必需的且氘不足将会增加细胞周期的长度。亦即认识到氘是亚分子调节系统一个成分且暂时提高D浓度的方法将会引发细胞增殖。

本发明进一步的基础是认识到通过服用含氘量小于自然界水中的氘含量的水和/或水溶液（例如用贫氘水稀释的汁），作为交换过程的结果，能够降低人体中的氘量并以这样的方法致瘤细胞的增殖可以停止或癌肿瘤的发展可防止。

因此，本发明涉及治疗肿瘤病的产品，它包括氘含量为0.1到110ppm的水和/或适于人消费的氘含量为0.1到110ppm的水溶液作为活性剂，必要时可有载体和/或助剂。

本发明的产品最好是氘含量为0.1到110ppm的药品，如生理盐溶液，或药用溶液如，果味糖桨、软饮料或低醇含量或无醇的啤酒。

本发明还涉及治疗肿瘤病的产品的制备方法，该方法包括下列步骤：经电解和/或蒸馏制备作为活性剂的氘含量为0.1到110ppm的水和/或水溶液，然后将这样制备的氘含量为0.1到110ppm的水和/或水溶液，必要时可有载体和助剂转变成药品或药用溶液。

按照实施本发明方法优选的方法，将生理盐溶液制备成氘含量为0.1到110ppm的药品。

按照实施本发明方法的另一个优选方法，将果味糖糖桨、软饮料、或无醇或低醇啤酒制备成氘含量为0.1到110ppm的药用溶液。

本发明的产品最好配制成氘含量为0.1到110ppm的注射液、灌输液、糖桨、汁或含水软膏。

本发明的产品适于治疗肿瘤病。治疗应用的基础在于通过使用氘含量为0.1到110ppm的贫氘溶液，使得生物体的氘含量也降低。作为这一过程的结果，肿瘤细胞的生长速率变慢，然后这些细胞坏死，而健康的细胞仍能耐受降低的氘浓度。

本发明方法对治疗肿瘤疾病的适用性已通过使用贫氘水进行体外和体内试验得到证实。这些试验结果见图1和2及表1到4。

在图1中，表示在由降低氘含量（30ppm）或正常氘含量（150ppm）水制成的营养液中G₁相中同步化后，小鼠成纤维细胞L₉₂₉的生长。

图2表示小鼠成纤维细胞L₉₂₉经在含氘量30到5000ppm（a：30;b：150;c：300;d，600;e：1250;f：5000ppmD）的营养液介质中培养后的相对量。

当按实施例1电解水获得的氢燃烧成水时，可制备氘含量为30-40ppm的水。含氘量高于自然水的水通过加99.78%（质量）的D₂O到正常水中来制备。适于体外维持不同动物细胞系的培养基是由在1升水中溶解10g工业制得的氨基酸、维生素、盐和碱的脱水混合物〔Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（D′MEM），代号：07-01600;Sigma，St.Louis，USA〕制成的有不同氘含量的水制得的。将110ml牛血清加到所制得的溶液中。所得的液体培养基含有维持细胞所需的所有化合物。

小鼠成纤维细胞L₉₂₉的生长首先在体外条件下，于含不同氘量（30-5000ppm）的营养介质中进行研究。通过这些实验，约400个细胞的分裂相继进行。该实验证明在由贫氘水制成的介质中细胞的生长速度降低了15-20%。

然后研究营养介质中氘浓度是否影响同步化后细胞从所谓的G₁相进入到S-相所必需的时间（图1）。从图1中可看出，同步化后细胞生长的开始晚了6-8小时且在由贫氘（30ppm）水制备的营养介质中的生长速度低于在正常氘值（150ppm）水中的速度。

近几年用于测定细胞数的通常可接受的方法是通过将细胞与能被细胞还原的化合物-2，3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-5-〔（苯基氨基）羰基〕-2H-四唑翁-氢氧化物（XTT）一起温育来进行的。该化合物的还原态表明在450nm处有最大吸收，因而它的量可用光度法测量;这样相对细胞数可由光密度（OD）值计算（Cancer Rearch 48，4827-4833（1988）〕。借助该方法，低于（30ppm）和高于（300-5000ppm）自然值的氘浓度对细胞增殖的作用也被研究（图2）。通过这些实验证实了在由贫氘水制成的营养介质中生长速率降低了。按照这些实验，高于自然值2到4倍的氘浓度对细胞增殖有促进作用（进一步增加氘浓度（1250和5000ppm）来自同位素作用的抑制将占主导地位）。再用4种不同细胞系重复试验，得到类似结果。

在第一个体内实验中，研究了降低小鼠饮水中氘含量如何影响肿瘤生长。人乳腺肿瘤MDA-MB-231和MCF-7被移植到两组各14只CBA/ca小鼠中。对比组消费正常水，而从移植后那天起，治疗组被供应按本发明制备的贫氘水。结果汇总在表1中。

表1

贫氘水对小鼠乳腺肿瘤生长的作用

细胞系 MDA-MB-231 MCF-7

天对比组治疗组对比组治疗组

20 5/5 9/9 6/6 8/8

50 5/5 5/9 6/6 5/8

65 1/1 4/8 2/2 4/7

71 0/0 3/8 1/2 2/7

80 0/0 2/7 0/1 0/5

87 0/0 1/6 0/1 0/5

在治疗和对比组中的数字相应于肿瘤动物数/所有动物数。

表1的结果表明，在两个对比组（5+6）中的11个患肿瘤动物仅有1个动物经受了肿瘤的自发性退化，其余的分别在移植后第71和81天后死亡。相反，在两个治疗组中，17个患肿瘤动物（9+8）中10个动物（59%）的肿瘤生长后、退化并消失，且其中一个动物（未在表1中示出），较在对比组中最后死的动物多活30天。这些动物饮含30ppm氘的水3周，然后饮含110-120ppm氘的水至实验结束。

进行另一个实验，将人的前列腺肿瘤细胞PC-3移植到44只CBA/Ca型小鼠中。治疗在移植后第32天开始，给动物饮含氘94±5ppm的水。这时，在对比组和治疗组中肿瘤平均直径分别为10.4和10.2mm。（考虑体重/肿瘤质量比，在实验的这一阶段治疗小鼠相当于对体重70kg肿瘤为3.5kg的人开始治疗），这样，治疗是在肿瘤相当晚期时开始的，这就是治疗为什么不像在第一个实验中那样有效的原因。表2中的数字代表患肿瘤动物数/所有动物数和在治疗过程中肿瘤平均大小的变化。

表2

贫氘水对小鼠PC-3前列腺肿瘤的作用

患肿瘤动物数/所有动物数肿瘤平均直径

天对比值治疗组对比组治疗组

32 22/22 22/22 10.4 10.2

39 17/17 19/20 14.6 11.1

46 13/13 17/19 22.4 17.5

53 9/9 11/14 21.7 15.0

60 6/7 10/13 23.8 15.0

67 3/4 10/13 16.7 18.0

74 3/4 7/10 24.0 18.1

81 3/4 5/8 28.6 18.0

88 2/3 5/8 37.0 16.6

表2的结果表明，在对比组中22个动物仅有3个（22%）在肿瘤细胞移植后第87天存活，而在治疗组中22个动物中有8个（36%）在第88天仍活着。这时在对比组和治疗组中仍存活的动物分别为2个（9%）和5个（23%）。在治疗组的3个动物中，肿瘤退化可观察到。治疗组和对比组之间的重大差别也可由肿瘤平均直径的数据来证实。

根据表2的数据，可将累积死亡数总结在表3中。

表3

PC-3前列腺肿瘤累积死亡数

天对比组治疗组

32 0 0

39 5 2

46 9 3

53 13 8

60 15 9

67 18 9

74 18 12

81 18 14

88 19 14

表3中的结果表明在试验的所有阶段治疗组死亡的动物数小于对比组的。值得强调的是列移植后第67天治疗组仅有9个动物死亡;而对比组死亡的动物数是其2倍（18个）下列事实显示出：这一差别的重要性在小鼠中肿瘤一星期的发展期相当于人类的200-300天的发展期。表3中的这些数据表明人的存活期可增加几年，即使是在疾病的晚期开始治疗。

在第三个实验中，将肿瘤HT-29结肠细胞移植到小鼠中。治疗是在移植后第24天通过给这些支物饮含氘94±5ppm的水而开始的。肿瘤平均直径见表4。对比组有13个动物，治疗组有16个动物。从表4得知在90天的治疗过程中治疗组的肿瘤平均体积比对比组的低的多。

表4

贫氘水对小鼠中人的HT-29结肠肿瘤细胞的作用

肿瘤平均体积,cm³

天对比组治疗组

1 0.16 0.16

20 0.81 0.45

35 2.28 1.88

55 5.82 4.85

70 8.09 6.80

85 19.48 10.96

90 20.74 12.35

总结动物试验的结果，可以得知使用本发明的治疗肿瘤病的药品，在疾病的早期恢复率可达约50%，在疾病的晚期存活期可增加20-30%。这些结果可通过使用含更低的氘的水而进一步改进。

为了治疗目的，本发明的产品可以以含活性组分与惰性的生理上可接受的载体和/或助剂的形式使用。活性组分可转变成口服组合物（例如，溶液、乳液、悬浮液等），非肠道给药组合物（如注射液）或直肠给药组合物（如用于直肠灌输的溶液）。活性组也分可以外用如以软膏的形式使用。

本发明的药品可通过常规用于药品工业的已知方法来制备，即通过将活性剂与惰性无机或有机载体混合，然后将混合物加工成盖仑氏制剂。

作为液体载体最好使用水或乙醇。

本药品还可含常规用于药品工业的助剂如润湿剂、甜味剂、香味剂、缓冲剂等。

本发明的药用溶液可用通常用于食品工业制备果汁、糖桨、软饮料和啤酒的已知方法制备，即通过混合活性剂与软饮料和啤酒工业的基本物料如果汁、浓缩汁、调味剂、甜味剂、香味剂、精油及常规用于软饮料和啤酒工业的其它添加剂和助剂。

本发明的药品日剂量可以在相当宽范围内变化，取决于几个因素，例如活性组分的活性、病人的病情和年龄，肿瘤类型和恶化程度等。对于体重为70kg的病人，日口服剂量为氘浓度为0.1到110ppm的1.2升贫氘液体。

贫氘水可含例如30-50g碳水化合物和其它调味剂或香味剂以使得药品味道更好。

对于注射液，日剂量可高达2-6升且水的氘浓度可在相当宽间隔（0.1-110ppm）变化。通常，在病人体内水的氘浓度应至少每天降低0.5ppm以确保所希望的治疗效果。这些剂量只是参考性的，所用剂量一定应按医护人员的规定。

本发明的产品和方法主要优点如下：

a）该方法提供了一种以自然的方式直接干预细胞增殖的调节机理的机会。

b）通过使用本发明的药品可预防和治疗肿瘤疾病。

c）产品的组分没有毒副作用。

d）在制备过程中，无对环境有害的废料产生。

e）该方法可用技术简单方法进行。

f）在治疗过程中不会产生突变细胞，因为活性组分不是致突变物。（讫今所用的大部分抑制细胞剂都有强烈的致突变性，因此，常常诱发新型的肿瘤）。

g）使用本发明的药品会促进病情的恢复而不会延误病情。

用下列非限制性实施例进一步详细说明本发明的产品和方法。

实施例1

用电解法制备贫氘水

对15-20w/v%的KOH水溶液，用电压为2-5伏的直流电，带有彼此分开的阴极和阳极进行电解。在阴极上形成的含降低浓度的氘的氢气燃烧，所生成的水蒸汽冷凝并单独收集。所得的水氘浓度为30-40ppm，通过进一步电解该浓度可降至6-20ppm。

所得产品可用于满足患肿瘤病人对液体的需求并可作为生产氘含量降低的化合物的原料。

该方法的终产品是蒸馏水，因此在使用前，最好加入必需的盐以供人消费。按1升计算，终产品最好补充含1000mg钠、200mg钾、160mg钙、88mg镁、650mg磷和600mg氯的盐混合物。

实施例2

用蒸馏法制备贫氘水

在装有30-50块塔板的分馏塔中，于50-60毫巴压力和45到50℃下，蒸馏水。在蒸馏过程中维持回流比在12到13之间。为确保低的氘浓度，在蒸馏过程中在塔底加入氘浓度稀释10倍的水。使用这些参数，塔顶产品的氘浓度为20-30ppm。通过进一步增加塔板数和/或通过反复蒸馏，水的氘浓度可降低到1-10ppm。

本方法的终产品为蒸馏水，因此在使用前，加入必需的盐以供人消费是适宜的。实施例1的盐混合物最好用于该目的。

实施例3

贫氘生理盐溶液的制备

将8.5gNaCl加到1升按实施例1或2制备的蒸馏水中。生理盐溶液通常在进行常规的消毒过程后作为灌输液使用。使用这种产品剂型，在严重在病情例中，日剂量可增加到2-6升。

实施例4

贫氘果汁的制备

按实施例1或2制备的含氘20-30ppm的蒸馏水与水和果汁浓缩物按如下混合：

a）0.8份（体积）含氘20-30ppm的水+0.2份（体积）的果汁浓缩物（氘的终浓度约为45-50ppm）;

b）0.5份（体积）含氘20-30ppm的水+0.2份（体积）果汁浓缩物+0.3份（体积）地正常水（氘的终浓度约为85-90ppm）;

c）0.3份（体积）的含氘20-30ppm的水+0.2份（体积）果汁浓缩物+0.5份（体积）的正常水（氘的终浓度约105-110ppm）。

由氘浓度更低的水，可制得更低氘含量的果汁。

实施例5

含有碳酸的贫氘软饮料的制备

按实施例1或2制备的含20-30ppm氘的蒸馏水与含下列组分的软饮料浓缩物：50g/l糖，5%（体积）桔汁，6g/l碳酸，1g/l柠檬酸，500mg/l抗坏血酸和500mg/l天然调味剂，按如下方式混合：

a）0.8份（体积）的含20-30ppm氘的水+0.2份（体积）的软饮料浓缩物（氘的终浓度为约45-50ppm）;

b）0.5份（体积）的含20-30ppm氘的水+0.3份（体积）正常水+0.2份软饮料浓缩物（氘的终浓度为约85-90ppm）;

c）0.3份（体积）的含20-30ppm氘的水+0.5份（体积）正常水+0.2份（体积）的软饮料浓缩物（氘的终浓度约为105-110ppm）;

由氘浓度更低的水，可制备氘浓度更低的软饮料。

实施例6

低氘浓度啤洒的制备

将大麦先浸在氘含量为0.1到110ppm的水中以制备麦芽，然后于5-15℃，通风良好的条件下在厚度5-15cm的板上发芽。

将发芽后的大麦在56℃到75℃之间脱水，并与残余的芽根分离，然后磨碎。磨细后的麦芽与适量的含氘为0.1到110ppm的水混合。混合物在50℃到75℃之间的温度下加热，然后过滤并用啤酒花酿造。酿造后的啤酒过滤、冷却，然后与预培养的酿酒酵母一起温育。第一发酵过程在5-6℃下持续10-14天。第二发酵过程是于0℃下在密封的桶中发酵几周，然后将所得的啤酒过滤、装瓶并消毒。

本实施例所制备的啤酒氘含量取决于所用水的氘含量，它也影响乙醇和其它组分的氘含量。

实施例7

低氘含量的含水软膏的制备

含水软膏使用贫氘水以常规方式制备。对于1000g产品适宜的含水软膏的组成如下：

Unguentum hydrosum 500g

Unguentum stearini 150g

含氘30-40ppm的蒸馏水 300g

Claims

1、治疗肿瘤病的产品，该产品包括氘含量为0.1到110ppm的水和/或适于人消费的氘含量为0.1到110ppm的水溶液作为活性剂，必要时还有载体和/或助剂，该产品为药品或药用溶液形式。

2、按权利要求1所述的药品，它为氘含量为0.1到110ppm的生理盐溶液。

3、按权利要求1所述的氘含量为0.1到110ppm的药用溶液，它为果味糖桨、软饮料或无醇或低醇含量的啤酒。

4、制备权利要求1所述的治疗肿瘤病的产品的方法，该方法包括：通过电解和/或蒸馏制备氘含量为.01到110ppm的作为活性剂的水和/或水溶液，然后将所制备的氘含量为0.1到110ppm水和/或水溶液，必要时可有载体和助剂转变成药品或药用溶液。

5、权利要求4的方法，其中氘含量为0.1到110ppm的药品被制备成生理盐溶液。

6、权利要求4的方法，其中氘含量为0.1到110ppm的药用溶液被制成果味糖桨、软饮料、或无醇或低醇啤酒。

7、权利要求4的方法，其中产品被配制成氘含量为0.1到110ppm的注射液、灌输液、糖桨、汁或含水软膏。

8、使用氘含量为0.1到110ppm的水和/或水溶液预防或治疗肿瘤病。