EA030161B1

EA030161B1 - Траустохитридиевые, композиции жирных кислот и способы их получения и применения

Info

Publication number: EA030161B1
Application number: EA201190218A
Authority: EA
Inventors: Кирк Е. Эпт; Джозеф В. Пфайфер III; Джон Милтон Хансен; Пол Уоррен Беренс; Росс Зиркл; Трейси Линн Шталь
Original assignee: ДиЭсЭм АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2009-03-19
Publication date: 2018-06-29
Also published as: AU2016203427B2; MX356532B; ES2757878T3; EP4183883A1; ZA201107517B; EP2408922A4; EP2408922A1; KR20110128944A; BRPI0923968A8; CA2754952A1; BRPI0923968B1; IL215141A0; JP5762393B2; KR101861375B1; EA201190218A1; NZ703725A; EP3196309A3; AU2009342676A1; WO2010107415A1; EP3196309B1

Abstract

Изобретение относится к выделенным траустохитридиевым микроорганизмам, а также к их штаммам и мутантам. Настоящее изобретение также относится к биомассе, жирам микробного происхождения, композициям, культурам, способам получения микробных жиров и способам применения выделенных траустохитрид, биомасс и жиров микробного происхождения.

Description

030161

Уровень техники Область техники

Настоящее изобретение относится к выделенным траустохитридиевым микроорганизмам, а также к их штаммам и мутантам. Настоящее изобретение также относится к биомассе траустохитрид, жирам микробного происхождения, композициям, культурам, способам получения микробных жиров и способам применения выделенных траустохитрид, биомассы и микробных жиров.

Предпосылки создания изобретения

Жирные кислоты классифицируют на основе характеристик длины и насыщенности углеродной цепи. Жирные кислоты с короткой цепью обычно содержат 12 или менее атомов углерода, жирные кислоты с цепью средней длины обычно содержат от 14 до 18 атомов углерода, а жирные кислоты с длинной цепью обычно содержат 20 или более атомов углерода. Жирные кислоты называют насыщенными жирными кислотами, если между атомами углерода отсутствуют двойные связи, и ненасыщенными жирными кислотами, если между атомами углерода присутствуют двойные связи. Ненасыщенные жирные кислоты с длинной цепью являются мононенасыщенными, если у них присутствует лишь одна двойная связь, и полиненасыщенными, если у них присутствует более одной двойной связи.

Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) классифицируют на основе положения первой двойной связи относительно метильного конца жирной кислоты: жирные кислоты омега-3 (п-3) содержат первую двойную связь у третьего атома углерода, а жирные кислоты омега-6 (п-6) содержат первую двойную связь у шестого атома углерода. Например, докозагексаеновая кислота ("ДГК") представляет собой полиненасыщенную жирную кислоту с длинной цепью омега-3 (ПНЖК-ДЦ) с длиной цепи 22 атома углерода и 6 двойными связями, часто обозначаемую "22:6 п-3". Другие ПНЖК-ДЦ омега-3 включают эйкозапентаеновую кислоту (ЭПК), обозначаемую "20:5 п-3", и омега-3 докозапентаеновую кислоту ("ДПК п-3"), обозначаемую "22:5 п-3". ДГК и ЭПК назвали "незаменимыми" жирными кислотами. ПНЖК-ДЦ омега-6 включают арахидоновую кислоту ("АРА"), обозначаемую "20:4 п-6", и омега-6 докозапентаеновую кислоту ("ДПК п-6"), которую обозначают "22:5 п-6".

Жирные кислоты омега-3 являются биологически важными молекулами, которые влияют на физиологию клетки благодаря их присутствию в мембранах клетки, регулируют выработку и экспрессию генов биологически активных соединений и служат субстратами для биосинтеза (РосНе Н.М., Ргос. ΝιιΙγ. §ос. 58: 397-401 (1999)). ДГК, например, составляет примерно 15-20% липидов коры головного мозга человека, 30-60% липидов сетчатки, демонстрирует высокое содержание в семенниках и сперме и является важным компонентом грудного молока Цеап-Ра8са1 Вегде & 0Л1е8 ВагпаШап, РаЛу Άαάδ Ггот Ыр1Й8 оГ Маппе Огдапйпъ: Мо1еси1аг ВюбАегейу, Ро1е8 а§ Вютагкеге, Вю1одюа11у Лсйуе Сотроипбк, апб Есопотюа1 АщесК т Маппе Вю1есНпо1оду I 49 (Т. §сНерег, еб., 2005)). ДГК составляет до 97% жирных кислот омега-3 мозга и до 93% жирных кислот омега-3 сетчатки. Кроме того, ДГК необходима для развития плода и ребенка, а также для поддержания когнитивных функций у взрослых (там же.) Жирные кислоты омега-3, включая ДГК и ЭПК, также обладают противовоспалительными свойствами (см., например, там же и §1торои1о8 А.Р., Г Ат. Со11. ΝιιΙγ. 21: 495-595 (2002)). Поскольку жирные кислоты омега-3 в организме человека не синтезируются бе поуо, эти жирные кислоты необходимо получать с пищей.

Льняное масло и рыбий жир считают хорошими пищевыми источниками жирных кислот омега-3. Льняное масло не содержит ЭПК, ДГК, ДПК или АРА, но содержит линоленовую кислоту (С18:3 п-3), структурный элемент, позволяющий организму синтезировать ЭПК. Однако существуют данные о том, что скорость метаболического превращения может быть низкой и вариабельной, особенно в случае ослабленного здоровья. Рыбьи жиры в значительной степени различаются по типу и уровню содержания жирных кислот в зависимости от вида и режима питания. Например, у рыб, выращенных на рыбных фермах, наблюдается тенденция к преобладанию более низкого уровня жирных кислот омега-3 по сравнению с выросшими на воле рыбами. Кроме того, присутствует риск содержания в рыбьих жирах загрязнителей из окружающей среды, и с рыбьими жирами могут быть связаны проблемы со стабильностью и рыбный запах и вкус.

Траустохитридиевые представляют собой микроорганизмы из порядка ТЬгаи81осЬу1г1а1е8. Траустохитридиевые включают членов рода 5>с1и/осНу1пит и являются признанным альтернативным источником жирных кислот омега-3, включая ДГК (см. патент США № 5130242). Получаемые из этих морских гетеротрофных микроорганизмов жиры часто имеют более простые профили полиненасыщенных жирных кислот, чем соответствующие жиры из рыб или микроскопических водорослей (Бе\\35 Т.Е., Маг. Вю1есНпо1. 1:580-587 (1999)). Были описаны штаммы видов траустохитрид, вырабатывающие высокий процент жирных кислот омега-3 среди от общего количества жирных кислот (патент США № 5130242; Ниапд Г е! а1., Г Ат. ОЛ. СНет. §ос. 78: 605-610 (2001); Ниапд Г е! а1., Маг. Вю1есЬпо1. 5: 450-457 (2003)). Однако выделенные траустохитридиевые различаются по составу и количеству вырабатываемых ПНЖКДЦ, так что некоторые ранее описанные штаммы могут иметь нежелательные уровни жирных кислот омега-6 и/или могут демонстрировать низкую продуктивность в культуре. В связи с этим присутствует постоянная потребность в выделении траустохитридиевых, демонстрирующих высокую продуктивность и желаемые профили ПНЖК-ДЦ.

- 1 030161

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенному траустохитридиевому микроорганизму вида траустохитрид, депонированному под учетным номером АКТК РТА-9695, или полученному из него штамму, причем общее количество жирных кислот, вырабатываемое указанным микроорганизмом или полученным из него штаммом, включает примерно 10 вес.% или менее эйкозапентаеновой кислоты.

Настоящее изобретение также относится к выделенному траустохитридиевому микроорганизму, обладающему характеристиками вида траустохитрид, депонированному под учетным номером АКТК РТА-9695, причем общее количество жирных кислот, вырабатываемое указанным микроорганизмом или полученным из него штаммом, включает примерно 10 вес.% или менее эйкозапентаеновой кислоты.

Настоящее изобретение также относится к выделенному траустохитридиевому микроорганизму или полученному из него штамму, который содержит фракцию триглицеридов, причем содержание докозагексаеновой кислоты в указанной фракции триглицеридов составляет по меньшей мере примерно 40 вес.%, при этом содержание п-6 докозапентаеновой кислоты в указанной фракции триглицеридов составляет по меньшей мере примерно от 0,5 до 6 вес.%, и общее количество жирных кислот, вырабатываемое указанным микроорганизмом или полученным из него штаммом, включает примерно 10 вес.% или менее эйкозапентаеновой кислоты.

Настоящее изобретение также относится к выделенному траустохитридиевому микроорганизму того же вида, что и траустохитриды, депонированные под учетным номером АКТК РТА-9695, или полученному из него штамму, причем общее количество жирных кислот, вырабатываемое указанным микроорганизмом или полученным из него штаммом, включает примерно 10 вес.% или менее эйкозапентаеновой кислоты.

Согласно некоторым вариантам реализации указанный штамм, полученный из выделенного траустохитридиевого микроорганизма согласно настоящему изобретению, представляет собой мутантный штамм.

Настоящее изобретение также относится к выделенному микроорганизму, депонированному под учетными номерами АКТК РТА-9695, РТА-9696, РТА-9697 или РТА-9698.

Настоящее изобретение также относится к биомассе траустохитрид, содержащей любой из траустохитридиевых микроорганизмов согласно настоящему изобретению или их смесь.

Настоящее изобретение также относится к выделенной биомассе траустохитрид, в которой по меньшей мере примерно 50% сухого веса клеток указанной биомассы составляют жирные кислоты, и по меньшей мере примерно 50 вес.% жирных кислот составляют жирные кислоты омега-3. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере примерно 50 вес.% указанных жирных кислот составляет докозагексаеновая кислота. Настоящее изобретение также относится к выделенной биомассе траустохитрид, в которой по меньшей мере примерно 25% сухого веса клеток указанной биомассы составляет докозагексаеновая кислота.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение также относится к выделенной биомассе траустохитрид, в которой примерно 10 вес.% или менее жирных кислот составляет эйкозапентаеновая кислота, и весовое соотношение докозагексаеновой кислоты к эйкозапентаеновой кислоте составляет по меньшей мере примерно 5:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение также относится к выделенной биомассе траустохитрид, в которой примерно 1,5 вес.% или менее жирных кислот составляет арахидоновая кислота, и весовое соотношение докозагексаеновой кислоты к арахидоновой кислоте составляет по меньшей мере примерно 20:1.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение также относится к выделенной биомассе траустохитрид, которая содержит докозагексаеновую кислоту и докозапентаеновую кислоту п6 в весовом соотношении по меньшей мере примерно 10:1.

Настоящее изобретение также относится к выделенной культуре траустохитрид, которая содержит любой из траустохитридиевых микроорганизмов согласно настоящему изобретению или их смесь. Согласно некоторым вариантам реализации указанная культура содержит по меньшей мере примерно 5% растворенного кислорода.

Настоящее изобретение также относится к пищевому продукту, косметическому продукту или фармацевтической композиции, предназначенным для животных или человека, которые содержат любой из траустохитридиевых микроорганизмов или биомассу согласно настоящему изобретению или их смесь.

Настоящее изобретение также относится к жиру микробного происхождения, который содержит фракцию триглицеридов, составляющую по меньшей мере примерно 70 вес.%, причем содержание докозагексаеновой кислоты в указанной фракции триглицеридов составляет по меньшей мере примерно 50 вес.%, а содержание докозапентаеновой кислоты п-6 в указанной фракции триглицеридов составляет примерно от 0,5 до 6 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации указанный микробный жир также характеризуется содержанием арахидоновой кислоты в указанной фракции триглицеридов, составляющим примерно 1,5 вес.% или менее.

Настоящее изобретение также относится к микробному жиру, который содержит фракцию триглицеридов, составляющую по меньшей мере примерно 70 вес.%, причем содержание докозагексаеновой

- 2 030161

кислоты в указанной фракции триглицеридов составляет по меньшей мере примерно 40 вес.%, содержание докозапентаеновой кислоты п-6 в указанной фракции триглицеридов составляет по меньшей мере примерно от 0,5 до 6 вес.%, а отношение докозагексаеновой кислоты к докозапентаеновой кислоте п-6 превышает примерную величину 6:1.

Настоящее изобретение также относится к жиру микробного происхождения, который содержит фракцию триглицеридов, составляющую по меньшей мере примерно 70 вес.%, причем содержание докозагексаеновой кислоты в указанной фракции триглицеридов составляет по меньшей мере примерно 60 вес.%.

Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере примерно 20% триглицеридов во фракции триглицеридов микробного жира содержат докозагексаеновую кислоту в двух положениях триглицерида, выбранных из любых двух из положений 8п-1, §п-2 и 8п-3. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере примерно 5% триглицеридов фракции триглицеридов микробного жира содержат докозагексаеновую кислоту во всех трех положениях триглицерида 8п-1, §п-2 и 8п-3.

Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир дополнительно содержит примерно 5 вес.% или менее гептадекановой кислоты.

Настоящее изобретение также относится к пищевому продукту, косметическому продукту или фармацевтической композиции, предназначенным для животных или человека, которые содержат любой из микробных жиров согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации указанный пищевой продукт представляет собой детское питание. Согласно некоторым вариантам реализации детское питание пригодно для недоношенных детей. Согласно некоторым вариантам реализации указанный пищевой продукт представляет собой молоко, напиток, терапевтическое средство, обогащенный напиток или их сочетание. Согласно некоторым вариантам реализации указанный пищевой продукт представляет собой добавку для пищи животных или человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанный пищевой продукт представляет собой пищевую добавку. Согласно некоторым вариантам реализации указанный пищевой продукт представляет собой корм для животных. Согласно некоторым вариантам реализаци указанный корм для животных представляет собой корм для рыб. Согласно некоторым вариантам реализации корм для животных представляет собой корм для домашних животных, корм для животных из зоопарка, корм для рабочих животных, корм для скота или их сочетание.

Настоящее изобретение также относится к способу получения микробного жира, который содержит жирные кислоты омега-3, который включает: (а) выращивание любого из выделенных траустохитридиевых микроорганизмов согласно настоящему изобретению или их смеси в культуре для получения биомассы, и (б) выделение жира, содержащего жирные кислоты омега-3, из указанной биомассы. Согласно некоторым вариантам реализации указанная культура содержит по меньшей мере примерно 5% растворенного кислорода. Согласно некоторым вариантам реализации рН культуры поддерживают в диапазоне примерно от 6,5 до 8,5. Согласно некоторым вариантам реализации культура содержит глюкозу в концентрации примерно от 5 до 50 г/л.

Настоящее изобретение также относится к способу получения микробного жира, который содержит жирные кислоты омега-3, который включает выделение жира, содержащего жирные кислоты омега-3, из любой биомассы согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир выделяют с использованием процесса экстракции гексаном. Согласно некоторым вариантам реализации указанный микробный жир выделяют с использованием процесса экстракции без растворителя.

Согласно некоторым вариантам реализации сухой вес клеток биомассы, выделенной из каждого литра любой из культур согласно настоящему изобретению, составляет по меньшей мере примерно 50 г после культивирования в течение 7 дней в диапазоне примерно от 17 до 30°С в культуральной среде с рН примерно от 6,5 до 8,0, содержащей источники углерода, азота, питательные вещества и примерно от 950 до 8500 м.д. хлорид-ионов.

Согласно некоторым вариантам реализации любая из выделенных культур согласно настоящему изобретению характеризуется продуктивностью по жирным кислотам омега-3 по меньшей мере примерно 2 г/л/день после культивирования в течение примерно 7 дней в диапазоне примерно от 17 до 30°С в культуральной среде с рН примерно от 6,5 до 8,0, содержащей источники углерода, азота, питательные вещества и примерно от 950 до 8500 м.д. хлорид-ионов.

Настоящее изобретение также относится к микробному жиру, полученному способом согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к применению любого выделенного микроорганизма, биомассы или микробного жира согласно настоящему изобретению или их смеси для производства лекарственного средства для лечения воспаления или связанного с ним заболевания.

Настоящее изобретение также относится к применению любого выделенного микроорганизма, биомассы или микробного жира согласно настоящему изобретению или их смеси для лечения воспаления или связанного с ним заболевания.

Настоящее изобретение также относится к любому выделенному микроорганизму, биомассе или микробному жиру согласно настоящему изобретению или их смеси для применения в лечении воспале- 3 030161

ния или связанного с ним заболевания.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения воспаления или связанного с ним заболевания у нуждающегося в этом пациента, включающему введение указанному пациенту любого из выделенного микроорганизма, биомассы или микробного жирасогласно настоящему изобретению или их смеси и фармацевтически приемлемого носителя.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным траустохитридиевым микроорганизмам, к их штаммам и мутантам, а также к их биомассе, микробным жирам, композициям и культурам. Настоящее изобретение также относится к способам получения жиров микробного происхождения из траустохитрид согласно настоящему изобретению и способам применения траустохитрид, биомассы и микробного жира. Описанные в настоящей заявке траустохитриды высокопродуктивны по сравнению с предшествующими изолятами и вырабатывают уникальные профили жирных кислот, отчасти характеризующиеся высокими уровнями жирных кислот омега-3, в частности высокими уровнями ДГК.

Траустохитридиевые микроорганизмы.

Настоящее изобретение относится к выделенным траустохитридам, включая их мутанты, рекомбинанты и варианты.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение относится к траустохитридам вида, депонированного под учетным номером АКТК РТА-9695. Выделенные траустохитриды также обозначаются в настоящей заявке δοϊιίζοοίινίπιιιη вр.АКТК РТА-9695. АКТК РТА-9695. Траустохитриды с учетным номером АКТК РТА-9695 были депонированы согласно условиям Будапештского договора 7 января 2009 г. в Американскую коллекцию типовых культур, Патентный Депозитарий, 10801 Ишуегейу Вои1еуагб, Мапа88а8, УА 20110-2209.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение относится к выделенному штамму траустохитрид, депонированному под учетным номером АКТК РТА-9695. Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение относится к выделенному траустохитридиевому микроорганизму того же вида, что и траустохитриды, депонированные под учетным номером АКТК РТА-9695.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение относится к выделенному траустохитридиевому, обладающему характеристиками вида, депонированного под учетным номером АКТК РТА-9695, или к полученному из него штамму. Характеристики вида траустохитрид, депонированного под учетным номером АКТК РТА-9695, включают признаки его роста и фенотипа (примеры фенотипических признаков включают морфологические и репродуктивные признаки), физические и химические признаки (такие как сухой вес и профили липидов) и последовательности его генов. Согласно некоторым вариантам реализации выделенные траустохитриды согласно настоящему изобретению характеризуются фенотипическими признаками, в значительной степени идентичными признакам траустохитрид, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695. Согласно некоторым вариантам реализации выделенные траустохитриды согласно настоящему изобретению имеют характеристики роста, в значительной степени идентичные таковым у траустохитрид, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение относится к мутанту, варианту или рекомбинанту выделенных траустохитрид согласно настоящему изобретению, причем общее количество жирных кислот, вырабатываемых мутантом, вариантом или рекомбинантом, включает примерно 10 вес.% или менее эйкозапентаеновой кислоты. Мутантные штаммы можно получить с помощью широко известных процедур. Обычные процедуры включают облучение; воздействие высоких температур и обработку мутагеном. Вариантные штаммы могут представлять собой другие природные изоляты и/или субизоляты видов, описанных в настоящей заявке. Рекомбинантные штаммы можно получить любым из широко известных методов молекулярной биологии для экспрессии экзогенных генов или изменения функции или экспрессии эндогенного гена. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный, вариантный или рекомбинантный штамм вырабатывает повышенное количество жирных кислот омега-3, включая ДГК и/или ЭПК, по сравнению со штаммом дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный, вариантный или рекомбинантный штамм вырабатывает пониженное количество одной или нескольких жирных кислот, как например, пониженное количество ЭПК, АРА или ДПК п-6, или их сочетаний. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный, вариантный или рекомбинантный штамм характеризуется повышенным значением сухого веса клеток в пересчете на литр культуры по сравнению со штаммом дикого типа. Согласно настоящему изобретению такие мутантные, вариантные или рекомбинантные штаммы являются примерами штаммов, полученных из выделенных траустохитрид согласно настоящему изобретению.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение относится к мутантному штамму траустохитрид, депонированному под учетным номером АКТК РТА-9695. Согласно другим вариантам реализации указанный мутантный штамм представляет собой штамм, депонированный под учетными номерами АКТК РТА-9696, РТА-9697 или РТА-9698. Штаммы траустохитрид под учетными номерами АКТК РТА-9696, РТА-9697 и РТА-9698 были депонированы согласно условиям Будапештского договора 7 января 2009 г. в Американскую коллекцию типовых культур, Патентный Депозитарий, 10801 ИшуегкИу Вои1еуагб, Мапа88а8, УА 20110-2209. Эти депонированные мутантные штаммы являются произ- 4 030161

водными траустохитрид, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695.

Согласно некоторым вариантам реализации выделенные траустохитриды согласно настоящему изобретению, включая их мутанты, варианты или рекомбинанты, содержат профиль жирных кислот в одной или нескольких фракциях, выделенных из траустохитридиевых. Одна или несколько фракций, выделенных из траустохитридиевых, включают фракцию всех жирных кислот, фракцию эфиров стероидных спиртов, фракцию триглицеридов, фракцию свободных жирных кислот, фракцию стероидных спиртов, фракцию диглицеридов, полярную фракцию (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетания.

Культуры траустохитрид и биомасса выделенных траустохитрид.

Настоящее изобретение также относится к культуре, которая содержит один или несколько выделенных траустохитрид согласно настоящему изобретению. В данной области техники известны различные ферментационные параметры инокуляции, культивирования и сбора микрофлоры, как например, описанные в патенте США № 5130242. Для выращивания траустохитрид можно использовать любую стандартную среду. Жидкие или твердые среды могут содержать природную или искусственную морскую воду. Источники углерода включают, без ограничений, глюкозу, фруктозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, растворимый крахмал, мелассу, фукозу, глюкозамин, декстран, жиры, масла, глицерол, ацетат натрия и маннит. Источники азота включают, без ограничений, пептон, дрожжевой экстракт, полипептон, солодовый экстракт, мясной экстракт, казаминовую кислоту, кукурузный экстракт, органические источники азота, глутамат натрия, мочевину, неорганические источники азота, ацетат аммония, сульфат аммония, хлорид аммония, нитрат аммония, сульфат натрия. Типичная среда представлена в табл. 1.

Таблица 1

Среда для культивирования

Компонент	концентрация	диапазон
N□01	г/л	12.5	0-25, 5-20 или 10-15
КС1	г/л	1.0	0-5, 0,25-3 или 0,5-2
Мд5О₄-7Н₂О	г/л	5,0	0-10, 2-8 или 3-6
(ΝΗ₄)₂5Ο₄	г/л	0,6	0-10, 0,25-5 или 0,5-3
СаС1₂	г/л	0,29	0,1-5, 0,15-3 или 0,2-1
Т 154	г/л	6,0.0	0-20, 1-15 или 5-10
(дрожжевой экстракт)
КН₂РО₄	г/л 1,2	0,1-10, 0,5	-5 или 1-3

После автоклавирования (металлы)

Лимонная кислота	г/л	3,5	0,1-100, 1-50 или 2-25
Ре5О₄-7Н₂О	г/л	10,30.	0,1-100, 1-50 или 5-25
МпС1₂-4Н₂О	г/л	3,10	0,1-100, 1-50 или 2-25
Ζπ5Ο₄·7Η₂Ο	г/л	3,10	0,1-100, 1-50 или 2-25
СоС1₂-6Н₂О	г/л	0,04	0,001-1, 0,005-0,5 или 0,01-0,1
Ыа₂МоО₄-2Н₂О	г/л	0,04	0,001-1, 0,005-0,5 или 0,01-0,1
Си5О₄-5Н₂О	г/л	2,07	0,1-100, 0,5-50 или 1-25
Νΐ5Ο₄·6Η₂Ο	г/л	2,07	0,1-100, 0,5-50 или 1-25

После автоклавирования (витамины)

Тиамин**	г/л	9,75	0,1-100, 1-50 или 5-25
Витамин В12**	г/л	0,16	0,1-100, 0,1-10 или 0,1-1
Са¹/2-пантотенат**	г/л	3,33	0,1-100, 0,1-50 или 1-10

После автоклавирования (углерод)

Глюкоза г/л 30,0.5 0-150, 10-100 или 20-50

Азотистое питание

Компонент Концентрация

ΝΗ₄0Η г/л 21,6 0-150, 10-100 или 15-50

Типичные условия культивирования должны включать следующее:

рН примерно 6,5 - примерно 8,5, примерно 6,5 примерно 8,0 или примерно 7,0 - примерно 7,5 температура: примерно 17 - примерно 30 градусов Цельсия,

примерно 20 - примерно 25 градусов Цельсия или примерно от 22 до 23 градусов Цельсия

растворенный кислород: насыщение примерно 5 - примерно 100%,

насыщение примерно 10 - примерно 80% или насыщение примерно 20 - примерно 50%

глюкоза, поддерживаемая на уровне: примерно 5 - примерно 50 г/л, примерно 10 - примерно 40 г/л или примерно 20 - примерно 35 г/л

- 5 030161

Согласно некоторым вариантам реализации культуральная среда содержит по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80% или по меньшей мере примерно 90% растворенного кислорода в процентах от уровня насыщения. Согласно некоторым вариантам реализации культуральная среда содержит примерно от 5 до 20%, примерно от 5 до 50%, примерно от 5 до 100%, примерно от 10 до 20%, примерно от 10 до 50%, примерно от 10 до 100%, примерно от 20 до 50% или примерно от 20 до 100% растворенного кислорода в процентах от уровня насыщения.

Настоящее изобретение также относится к выделенной биомассе траустохитрид согласно настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению выделенная биомасса траустохитрид представляет собой собранную клеточную биомассу, полученную любым общепринятым способом для выделения биомассы траустохитрид, таким, как описано в патенте США № 5130242 и публикации заявки на патент США № 2002/0001833.

Согласно некоторым вариантам реализации сухой вес клеток биомассы, выделенной из каждого литра культуры, составляет по меньшей мере примерно 50 г, по меньшей мере примерно 60 г, по меньшей мере примерно 70 г, по меньшей мере примерно 80 г, по меньшей мере примерно 100 г, по меньшей мере примерно 120 г, по меньшей мере примерно 140 г, по меньшей мере примерно 160 г, по меньшей мере примерно 180 г или по меньшей мере примерно 200 г после культивирования в течение примерно 7 дней в диапазоне примерно от 17 до 30°С в культуральной среде с рН примерно от 6,5 до 8,5, содержащей источники углерода и азота, питательные вещества и примерно от 950 до 8500 м.д. хлорид-ионов. Согласно некоторым вариантам реализации сухой вес клеток биомассы, выделенной из каждого литра культуры, составляет по меньшей мере примерно 50 г, по меньшей мере примерно 60 г, по меньшей мере примерно 70 г, по меньшей мере примерно 80 г, по меньшей мере примерно 100 г, по меньшей мере примерно 120 г, по меньшей мере примерно 140 г, по меньшей мере примерно 160 г, по меньшей мере примерно 180 г или по меньшей мере примерно 200 г после культивирования в течение примерно 7 дней примерно при 17°С, примерно при 18°С, примерно при 19°С, примерно при 20°С, примерно при 21°С,

примерно при 22°С, примерно при 23°С, примерно при 24°С, примерно при 25°С, примерно при 26°С,

примерно при 27°С, примерно при 28°С, примерно при 29°С или примерно при 30°С в культуральной

среде с рН примерно 6,5, примерно 7, примерно 7,5, примерно 8,0 или примерно 8,5, содержащей источники углерода и азота, питательные вещества и примерно от 950 до 8500 м.д. хлорид-ионов. Согласно некоторым вариантам реализации сухой вес клеток биомассы, выделенной из каждого литра культуры, составляет примерно от 50 до 200 г после культивирования в течение примерно 7 дней в диапазоне примерно от 17 до 30°С в культуральной среде с рН примерно от 6,5 до 8,5, содержащей источники углерода и азота, питательные вещества и примерно от 950 до 8500 м.д. хлорид-ионов. Согласно некоторым вариантам реализации сухой вес клеток биомассы, выделенной из каждого литра культуры, составляет примерно от 50 до 200 г после культивирования в течение примерно 7 дней примерно при 17°С, примерно при 18°С, примерно при 19°С, примерно при 20°С, примерно при 21°С, примерно при 22°С, примерно при 23°С, примерно при 24°С, примерно при 25°С, примерно при 26°С, примерно при 27°С, примерно при 28°С, примерно при 29°С или примерно при 30°С в культуральной среде с рН примерно 6,5, примерно 7, примерно 7,5, примерно 8,0 или примерно 8,5, содержащей источники углерода и азота, питательные вещества и примерно от 950 до 8500 м.д. хлорид-ионов.

Согласно некоторым вариантам реализации выделенная культура траустохитрид обладает продуктивностью по жирным кислотам омега-3 по меньшей мере примерно 2 г/л/день, по меньшей мере примерно 4 г/л/день или по меньшей мере примерно 8 г/л/день после культивирования в течение примерно 7 дней в диапазоне примерно от 17 до 30°С в культуральной среде с рН примерно от 6,5 до 8,5, содержащей источники углерода и азота, питательные вещества и примерно от 950 до 8500 м.д. хлорид-ионов. Согласно некоторым вариантам реализации выделенная культура траустохитрид обладает продуктивностью по жирным кислотам омега-3 в диапазоне примерно от 1 до 20 г/л/день, примерно от 2 до 15 г/л/день, примерно от 2 до 10 г/л/день, примерно от 3 до 10 г/л/день или примерно от 4 до 9 г/л/день после культивирования в течение примерно 7 дней в диапазоне примерно от 17 до 30°С в культуральной среде с рН примерно от 6,5 до 8,5, содержащей источники углерода и азота, питательные вещества и примерно от 950 до 8500 м.д. хлорид-ионов.

Согласно некоторым вариантам реализации культивационный объем (объем культуры) составляет по меньшей мере примерно 2 л, по меньшей мере примерно 10 л, по меньшей мере примерно 50 л, по меньшей мере примерно 100 л, по меньшей мере примерно 200 л, по меньшей мере примерно 500 л, по меньшей мере примерно 1000 л, по меньшей мере примерно 10000 л, по меньшей мере примерно 20000 л, по меньшей мере примерно 50000 л, по меньшей мере примерно 100000 л, по меньшей мере примерно 150000 л, по меньшей мере примерно 200000 л или по меньшей мере примерно 250000 л. Согласно некоторым вариантам реализации культивационный объем составляет примерно от 2 до 300000 л, примерно 2 л, примерно 10 л, примерно 50 л, примерно 100 л, примерно 200 л, примерно 500 л, примерно 1000 л, примерно 10000 л, примерно 20000 л, примерно 50000 л, примерно 100000 л, примерно 150000 л, примерно 200000 л, примерно 250000 л или примерно 300000 л. Согласно некоторым вариантам реализации

- 6 030161

настоящее изобретение относится к выделенной биомассе траустохитрид, которая содержит профиль жирных кислот согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации жирные кислоты составляют по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70% или по меньшей мере примерно 80% сухого веса клеток биомассы. Согласно некоторым вариантам реализации жирные кислоты составляют более чем примерно 50%, более чем примерно 55% или более чем примерно 60% сухого веса клеток биомассы. Согласно некоторым вариантам реализации жирные кислоты составляют примерно от 50 до 60%, примерно от 50 до 70%, примерно от 50 до 70%, примерно от 50 до 80%, примерно от 55 до 70%, примерно от 55 до 80%, примерно от 60 до 70% или примерно от 60 до 80% сухого веса клеток биомассы. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса содержит по меньшей мере примерно 50 вес.%, по меньшей мере примерно 60 вес.%, по меньшей мере примерно 70 вес.% или по меньшей мере примерно 80 вес.% жирных кислот в форме жирных кислот омега-3. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса содержит примерно от 50 до 60 вес.%, примерно от 50 до 70 вес.%, примерно от 50 до 80 вес.% жирных кислот в форме жирных кислот омега-3. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса содержит по меньшей мере примерно 50 вес.%, по меньшей мере примерно 55 вес.%, по меньшей мере примерно 60 вес.%, по меньшей мере примерно 65 вес.%, по меньшей мере примерно 70 вес.%, по меньшей мере примерно 75 вес.% или по меньшей мере примерно 80 вес.% жирных кислот в форме ДГК. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса содержит примерно от 50 до 60 вес.%, примерно от 50 до 70 вес.% или примерно от 50 до 80 вес.% жирных кислот в форме ДГК. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50% или по меньшей мере примерно 60% сухого веса клеток биомассы составляет докозагексаеновая кислота. Согласно некоторым вариантам реализации примерно от 25 до 65%, примерно от 25 до 50%, примерно от 30 до 40% или примерно от 25 до 35% сухого веса клеток биомассы составляет докозагексаеновая кислота. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса содержит примерно 10 вес.% или менее, примерно 9 вес.% или менее, примерно 8 вес.% или менее, примерно 7 вес.% или менее, примерно 6 вес.% или менее, примерно 5 вес.% или менее, примерно 4 вес.% или менее, примерно 3 вес.% или менее, примерно 2 вес.% или менее или примерно 1 вес.% или менее жирных кислот в форме ЭПК. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса содержит примерно от 1 до 10 вес.%, примерно от 1 до 5 вес.%, примерно от 2 до 5 вес.%, примерно от 3 до 5 вес.% или примерно от 3 до 10 вес.% жирных кислот в форме ЭПК. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса существенным образом не содержит ЭПК. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса характеризуется отношением веса ДГК к ЭПК по меньшей мере примерно 5:1, по меньшей мере примерно 7:1, по меньшей мере примерно 10:1, по меньшей мере примерно 11:1, по меньшей мере примерно 14:1, по меньшей мере примерно 15:1, по меньшей мере примерно 17:1, по меньшей мере примерно 20:1, по меньшей мере примерно 25:1, по меньшей мере примерно 50:1 или по меньшей мере примерно 100:1, причем биомасса содержит примерно 10 вес.% или менее жирных кислот в форме ЭПК. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса содержит примерно от 0,1 до 0,2 вес.%, примерно от 0,1 до 0,3 вес.%, примерно от 0,1 до 0,4 вес.%, примерно от 0,1 до 0,5 вес.% или примерно от 0,1 до 1,5 вес.% жирных кислот в форме АРА. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса содержит примерно 1,5 вес.% или менее, примерно 1 вес.% или менее, примерно 0,5 вес.% или менее, примерно 0,4 вес.% или менее, примерно 0,3 вес.% или менее, примерно 0,2 вес.% или менее или примерно 0,1 вес.% или менее жирных кислот в форме АРА. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса, по существу, не содержит АРА. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса характеризуется отношением веса ДГК к АРА по меньшей мере примерно 20:1, по меньшей мере примерно 40:1, по меньшей мере примерно 60:1, по меньшей мере примерно 80:1, по меньшей мере примерно 100:1, по меньшей мере примерно 150:1, по меньшей мере примерно 200:1, по меньшей мере примерно 250:1 или по меньшей мере примерно 300:1. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса содержит примерно от 0,5 до 1 вес.%, примерно от 0,5 до 2 вес.%, примерно от 0,5 до 5 вес.%, примерно от 0,5 до 6 вес.%, примерно от 1 до 5 вес.%, примерно от 1 до 6 вес.%, примерно от 2 до 5 вес.% или примерно от 2 до 6 вес.% жирных кислот в форме ДПК п-6. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса содержит примерно 6 вес.% или менее, примерно 5 вес.% или менее, примерно 2 вес.% или менее, примерно 1 вес.% или менее или примерно 0,5 вес.% или менее жирных кислот в форме ДПК п-6. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса существенным образом не содержит ДПК п-6. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса характеризуется отношением веса ДГК к ДПК п-6, превышающим примерно 6:1, по меньшей мере примерно 8:1, по меньшей мере примерно 10:1, по меньшей мере примерно 15:1, по меньшей мере примерно 20:1, по меньшей мере примерно 25:1, по меньшей мере примерно 50:1 или по меньшей мере примерно 100:1. Согласно некоторым вариантам реализации биомасса содержит жирные кислоты, среди которых примерно 5 вес.% или менее, примерно 4 вес.% или менее, примерно 3 вес.% или менее или примерно 2 вес.% или менее составляет линолевая кислота (18:2 п-6), линоленовая кислота (18:3 п-3), эйкозеновая кислота (20:1 п-9) и эруковая кислота (22:1 п-9).

Согласно настоящему изобретению характеристики выделенной биомассы связаны с эндогенными или природными свойствами выделенной биомассы, а не с привнесенным извне материалом.

- 7 030161

Жиры микробного происхождения.

Настоящее изобретение также относится к способам получения микробных жиров. Согласно некоторым вариантам реализации способ включает выращивание траустохитридиевых согласно настоящему изобретению в культуре для получения биомассы и выделения из биомассы жира, содержащего жирные кислоты омега-3. Жиры можно выделять из свежесобранной биомассы или из ранее собранной биомассы, которую хранили в условиях, предотвращающих деградацию. Для культивирования траустохитридх согласно настоящему изобретению выделения биомассы из культуры, выделения микробного жира из биомассы и анализа профиля жирных кислот у жиров, выделенных из биомассы, можно использовать известные способы (см., например, патент США № 5130242).

Настоящее изобретение также относится к микробному жиру, который содержит профиль жирных кислот согласно настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению микробный жир может быть любым жиром, полученным из микроорганизмов, включая, например, неочищенный жир, выделенный из биомассы микроорганизма без дальнейшей обработки; очищенный жир, который получают с помощью обработки неочищенного микробного жира на следующих стадиях обработки, таких как очистка, отбеливание и/или дезодорация; разбавленный микробный жир, полученный путем разбавления неочищенного или очищенного микробного жира; или обогащенный жир, который получают, например, путем обработки неочищенного или очищенного микробного жира с помощью дальнейших способов очистки для увеличения концентрации жирной кислоты (такой как ДГК) в указанном жире.

Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию эфиров стероидных спиртов, составляющую примерно 0 вес.%, по меньшей мере примерно 0,1 вес.%, по меньшей мере примерно 0,2 вес.%, по меньшей мере примерно 0,5 вес.%, по меньшей мере примерно 1 вес.%, по меньшей мере примерно 1,5 вес.%, по меньшей мере примерно 2 вес.% или по меньшей мере примерно 5 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию эфиров стероидных спиртов, составляющую примерно от 0 до 1,5 вес.%, примерно от 0 до 2 вес.%, примерно от 0 до 5 вес.%, примерно от 1 до 1,5 вес.%, примерно от 0,2 до 1,5 вес.%, примерно от 0,2 до 2 вес.% или примерно от 0,2 до 5 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию эфиров стероидных спиртов, составляющую менее чем примерно 5 вес.%, менее чем примерно 4 вес.%, менее чем примерно 3 вес.% или менее чем примерно 2 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию триглицеридов, составляющую по меньшей мере примерно 65 вес.%, по меньшей мере примерно 70 вес.%, по меньшей мере примерно 75 вес.%, по меньшей мере примерно 80 вес.%, по меньшей мере примерно 85 вес.% или по меньшей мере примерно 90 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию триглицеридов, составляющую примерно от 65 до 95 вес.%, примерно от 75 до 95 вес.% или примерно от 80 до 95 вес.% или примерно 97 вес.% или примерно 98 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию свободных жирных кислот, составляющую по меньшей мере примерно 0,5 вес.%, по меньшей мере примерно 1 вес.%, по меньшей мере примерно 1,5 вес.%, по меньшей мере примерно 2 вес.%, по меньшей мере примерно 2,5 вес.% или по меньшей мере примерно 5 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию свободных жирных кислот, составляющую примерно от 0,5 до 5 вес.%, примерно от 0,5 до 2,5 вес.%, примерно от 0,5 до 2 вес.%, примерно от 0,5 до 1,5 вес.%, примерно от 0,5 до 1 вес.%, примерно от 1 до 2,5 вес.%, примерно от 1 до 5 вес.%, примерно от 1,5 до 2,5вес.%, примерно от 2 до 2,5 вес.% или примерно от 2 до 5 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию свободных жирных кислот, составляющую менее чем примерно 5 вес.%, менее чем примерно 4 вес.%, менее чем примерно 3 вес.%, менее чем примерно 2 вес.% или менее чем примерно 1 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию стероидных спиртов, составляющую по меньшей мере примерно 0,5 вес.%, по меньшей мере примерно 1 вес.%, по меньшей мере примерно 1,5 вес.%, по меньшей мере примерно 2 вес.% или по меньшей мере примерно 5 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию стероидных спиртов, составляющую примерно от 0,5 до 1,5 вес.%, примерно от 1 до 1,5 вес.%, примерно от 0,5 до 2 вес.%, примерно от 0,5 до 5 вес.%, примерно от 1 до 2 вес.% или примерно от 1 до 5 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию стероидных спиртов, составляющую менее чем примерно 5 вес.%, менее чем примерно 4 вес.%, менее чем примерно 3 вес.%, менее чем примерно 2 вес.% или менее чем примерно 1 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию диглицеридов, составляющую по меньшей мере примерно 1,5 вес.%, по меньшей мере примерно 2 вес.%, по меньшей мере примерно 2,5 вес.%, по меньшей мере примерно 3 вес.%, по меньшей мере примерно 3,5 вес.% или по меньшей мере примерно 5 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию диглицеридов, составляющую примерно от 1,5 до 3 вес.%, примерно от 2 до 3 вес.%, примерно от 1,5 до 3,5 вес.%, примерно от 1,5 до 5 вес.%, примерно от 2,5 до 3 вес.%, примерно от 2,5 до 3,5 вес.% или примерно от 2,5 до 5 вес.%. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит неомыляемые фракции, составляющие менее чем примерно 2 вес.%, менее чем примерно 1,5 вес.%, менее чем примерно 1 вес.% или менее чем примерно 0,5 вес.% жира. Классы липидов, присутствующие в микробном жире, такие как фракция триглицеридов, можно разделить с помощью флэш-хроматографии и проанализировать с помощью тон- 8 030161

кослойной хроматографии (ТСХ) или разделить и проанализировать другими способами, известными в данной области техники.

Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов и их сочетаний, содержат по меньшей мере примерно 40 вес.%, по меньшей мере примерно 45 вес.%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60 вес.%, по меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75 вес.% или по меньшей мере примерно 80% ДГК. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов и их сочетаний, содержат примерно от 40 до 45 вес.%, примерно от 40 до 50 вес.%, примерно от 40 до 60 вес.%, примерно от 50 до 60 вес.%, примерно от 55 до 60 вес.%, примерно от 40 до 65 вес.%, примерно от 50 до 65%, примерно от 55 до 65 вес.%, примерно от 40 до 70 вес.%, примерно от 40 до 80 вес.%, примерно от 50 до 80 вес.%, примерно от 55 до 80 вес.%, примерно от 60 до 80 вес.% или примерно от 70 до 80 вес.% ДГК. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию эфиров стероидных спиртов, которая содержит примерно 45 вес.% или менее, примерно 40 вес.% или менее, примерно 35 вес.% или менее, примерно 30% или менее, примерно 25% или менее, примерно 20 вес.% или менее, примерно 15 вес.% или менее или примерно 13 вес.% или менее ДГК. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов и их сочетаний, содержат примерно 10 вес.% или менее, примерно 9 вес.% или менее, примерно 8 вес.% или менее, примерно 7 вес.% или менее, примерно 6 вес.% или менее, примерно 5 вес.% или менее, примерно 4 вес.% или менее, примерно 3 вес.% или менее, примерно 2 вес.% или менее или примерно 1 вес.% или менее ЭПК. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов и их сочетаний, содержат примерно от 2 до 3 вес.%, примерно от 2 до 3,5 вес.%, примерно от 2,5 до 3,5 вес.%, примерно от 2 до 6 вес.%, примерно от 2,5 до 6 вес.%, примерно от 3,0 до 6 вес.%, примерно от 3,5 до 6 вес.%, примерно от 5 до 6 вес.% или примерно от 2 до 10 вес.% ЭПК. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, существенным образом не содержат ЭПК. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, характеризуется отношением веса ДГК к ЭПК по меньшей мере примерно 5:1, по меньшей мере примерно 7:1, по меньшей мере примерно 9:1, по меньшей мере примерно 10:1, по меньшей мере примерно 15:1, по меньшей мере примерно 20:1, по меньшей мере примерно 25:1, по меньшей мере примерно 30:1 или по меньшей мере примерно 50:1, причем микробный жир и/или одна или несколько его фракций содержат 10 вес.% или менее ЭПК. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, характеризуется отношением веса ДГК к ЭПК по меньшей мере примерно 5:1, но менее чем примерно 20:1. Согласно некоторым вариантам реализации отношение веса ДГК к ЭПК составляет примерно от 5:1 до 18:1, примерно от 7:1 до 16:1 или примерно от 10:1 до 15:1. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, содержит примерно от 0,1 до 0,25 вес.%, примерно от 0,2 до 0,25 вес.%, примерно от 0,1 до 0,5 вес.% или примерно от 0,1 до 1,5 вес.% АРА. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, содержит примерно 1,5 вес.% или менее, примерно 1 вес.% или менее, примерно 0,5 вес.% или менее, примерно 0,2 вес.% или менее или примерно 0,1 вес.% или менее АРА. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, по существу, не содержат АРА. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, характеризуется отношением

- 9 030161

веса ДГК к АРА по меньшей мере примерно 20:1, по меньшей мере примерно 30:1, по меньшей мере примерно 35:1, по меньшей мере примерно 40:1, по меньшей мере примерно 60:1, по меньшей мере примерно 80:1, по меньшей мере примерно 100:1, по меньшей мере примерно 150:1, по меньшей мере примерно 200:1, по меньшей мере примерно 250:1 или по меньшей мере примерно 300:1. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, содержит примерно от 0,5 до 1 вес.%, примерно от 0,5 до 2 вес.%, примерно от 0,5 до 2,5 вес.%, примерно от 0,5 до 3 вес.%, примерно от 0,5 до 3,5 вес.%, примерно от 0,5 до 5 вес.%, примерно от 0,5 до 6 вес.%, примерно от 1 до 2 вес.%, примерно от 2 до 3 вес.%, примерно от 2 до 3,5 вес.%, примерно от 1 до 2,5 вес.%, примерно от 1 до 3 вес.%, примерно от 1 до 3,5 вес.%, примерно от 1 до 5 вес.% или примерно от 1 до 6 вес.% ДПК п-6. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, содержит примерно 6 вес.% или менее, примерно 5 вес.% или менее, примерно 3 вес.% или менее, примерно 2,5 вес.% или менее, примерно 2% или менее, примерно 1 вес.% или менее или примерно 0,5 вес.% или менее ДПК п-6. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, существенным образом не содержат ДПК п-6. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, характеризуется отношением веса ДГК к ДПК п-6, превышающим примерно 6:1, составляющим по меньшей мере примерно 8:1, по меньшей мере примерно 10:1, по меньшей мере примерно 15:1, по меньшей мере примерно 20:1, по меньшей мере примерно 25:1, по меньшей мере примерно 50:1 или по меньшей мере примерно 100:1. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, содержит примерно 5 вес.% или менее, примерно 4 вес.% или менее, примерно 3 вес.% или менее, примерно 2 вес.% или менее, примерно 1,5 вес.% или менее, примерно 1 вес.% или менее или примерно 0,5 вес.% или менее линолевой кислоты (18:2 п-6), линоленовой кислоты (18:3 п-3), эйкозеновой кислоты (20:1 п-9) и эруковой кислоты (22:1 п-9). Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций, выбранных из фракции эфиров стероидных спиртов, фракции триглицеридов, фракции свободных жирных кислот, фракции стероидных спиртов, фракции диглицеридов, полярной фракции (включая фракцию фосфолипидов) и их сочетаний, содержит примерно 5 вес.% или менее, примерно 4 вес.% или менее, примерно 3 вес.% или менее, примерно 2 вес.% или менее, примерно 1,5 вес.% или менее или примерно 1 вес.% или менее гептадекановой кислоты (17:0). Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир и/или одна или несколько его фракций содержат примерно от 0,01 до 5 вес.%, примерно от 0,05 до 3 вес.% или примерно от 0,1 до 1 вес.% гептадекановой кислоты.

Молекула триглицерида содержит 3 центральных атома углерода (С_8п-1Н₂К.1-С_8п-2Н2К2-С_8п-зН₂К3), что создает возможность образования различных позиционных изомеров. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию триглицеридов, в которой по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 35% или по меньшей мере примерно 40% триглицеридов в указанной фракции триглицеридов содержат ДГК в двух положениях триглицерида (дизамещенные ДГК), выбранных из любых двух из положений ъп-1, §п-2 и 8п-3 на основе процента относительной области пиков на хроматографе ВЭЖХ. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию триглицеридов, в которой примерно от 20 до 40%, примерно от 20 до 35%, примерно от 30 до 40% или примерно от 30 до 35% триглицеридов в указанной фракции триглицеридов содержат ДГК в двух положениях триглицерида, выбранных из любых двух из положений ъп-1. 8п2 или §п-3 на основе процента относительной области пиков на хроматографе ВЭЖХ. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию триглицеридов, в которой по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 15% или по меньшей мере примерно 20% триглицеридов в указанной фракции триглицеридов содержат ДГК во всех из положений §п-1, 5П-2 и §п-3 (тризамещенные ДГК) на основе процента относительной области пиков на хроматографе ВЭЖХ. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию триглицеридов, в которой примерно от 5 до 20%, примерно от 5 до 15%, примерно от 10 до 20% или примерно от 10 до 15% триглицеридов в указанной фракции триглицеридов содержат ДГК во всех из положений §п-1, §п-2 и §п-3 на основе процента относительной области пиков на хроматографе ВЭЖХ. Напротив, виды ТАГ, описанные в патенте США № 6582941, не содержат ДГК во всех трех положениях. Согласно

- 10 030161

некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию триглицеридов, в которой по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70% или по меньшей мере примерно 75% триглицеридов в указанной фракции триглицеридов содержат ДГК в одном положении триглицерида, выбранном из любого из положений 8п-1, 8п-2 или 8п-3 на основе процента относительной области пиков на хроматографе ВЭЖХ. Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир содержит фракцию триглицеридов, в которой примерно от 50 до 75%, примерно от 50 до 70%, примерно от 50 до 65%, примерно от 60 до 75%, примерно от 60 до 70% или примерно от 60 до 65% триглицеридов в указанной фракции триглицеридов содержат ДГК в одном положении триглицерида, выбранном из любого из положений 8п-1, 8П-2 и 8П-3 на основе процента относительной области пиков на хроматографе ВЭЖХ.

Композиции.

Настоящее изобретение также относится к композициям, которые содержат траустохитридиевые согласно настоящему изобретению, выделенную биомассу согласно настоящему изобретению, микробный жир согласно настоящему изобретению или их комбинацию.

Траустохитридиевые, биомасса или микробный жир согласно настоящему изобретению можно химически или физически модифицировать или подвергнуть другой обработки в зависимости от требований, предъявляемых к композиции, по любой известной технологии.

Клетки траустохитридиевых или биомассу можно предварительно перед применением в композиции высушить способами, включающими, без ограничений, сублимационную сушку, естественную сушку, распылительную сушку, туннельную сушку, вакуумную сушку (лиофилизация) или схожий процесс. Альтернативно, собранную и промытую биомассу можно применять в композиции сразу, без сушки (см., например, патенты США № 5130242 и 6812009).

Микробные жиры согласно настоящему изобретению можно применять как исходный материал для более эффективного получения продукта, обогащенного жирными кислотами, такими как ДГК. Например, микробные жиры согласно настоящему изобретению можно подвергнуть различным технологиям очистки, известным из уровня техники, таким как дистилляция или добавление мочевины с целью получения продукта более высокого качества, с более высокой концентрацией ДГК или другой жирной кислоты. Микробные жиры согласно настоящему изобретению также можно использовать в химических реакциях для получения соединений-производных жирных кислот, присутствующих в жирах, таких как эфиры и соли ДГК или другой жирной кислоты.

Композиции согласно настоящему изобретению могут содержать в своем составе один или более наполнитель. Используемый в настоящей заявке термин "наполнитель" относится к компоненту или смеси компонентов, которые применяются в композициях согласно настоящему изобретению для придания композициям желаемых характеристик, включая пищевые продукты, а также фармацевтические, парфюмерно-косметические и промышленные композиции. Наполнитель согласно настоящему изобретению можно рассматривать как "фармацевтически приемлемый" наполнитель, если указано, что его добавляют в фармацевтическую композицию, что означает, что наполнитель представляет собой соединение, материал, композицию, соль и/или лекарственную форму, которая в пределах действующих медицинских норм пригодна для применения при контакте с тканями людей и животных без повышенной нежелательной токсичности, раздражения, аллергического ответа или другой проблемы или осложнения, соответствующих разумному соотношению польза/риск. Согласно некоторым вариантам реализации термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный контрольным органом Федерального уровня или правительства штата или внесенный в список Фармакопеи США или другой общепризнанной международной фармакопеи для применения на животных и более предпочтительно на людях. Можно использовать различные наполнители. Согласно некоторым вариантам реализации наполнитель может представлять собой, без ограничений, щелочной агент, стабилизатор, антиоксидант, адгезионный агент, разделительный агент, покровное вещество, компонент внешней фазы, компонент с контролируемым высвобождением, растворитель, поверхностно-активное вещество, увлажнитель, буферный агент, наполнитель, смягчающее средство или их комбинации. Дополнительно к упомянутым здесь наполнителям относятся, но не ограничиваются ими, наполнители, приведенные в РепппдЮп: ТЬе §с1епсе апб Ргасйсе οί РЬагтасу, 21^8ί еб. (2005). Отнесение здесь отдельных типов наполнителей к тем или иным классам (например "растворитель") приведено для иллюстрации, а не с целью ограничить роль наполнителя. Отдельный наполнитель может одновременно подпадать под различные классификации.

К композициям согласно настоящему изобретению относятся, без ограничений, пищевые продукты, фармацевтические композиции, парфюмерно-косметические и промышленные композиции.

Согласно некоторым вариантам реализации композиция представляет собой пищевой продукт. Пищевой продукт представляет собой пищу для потребления животным или человеком и к ним относятся как твердые, так и жидкие композиции. Пищевой продукт может быть пищевой добавкой для пищи для животных или человека. Продукты питания включают в себя, без ограничений, распространенные продукты питания; жидкие продукты, включая разные типы молока, напитков, терапевтических напитков, питательных напитков; функциональные продукты питания; добавки; продукты с увеличенной питательной ценностью; составы детского питания, включая составы для недоношенных детей; продукты питания

- 11 030161

для беременных и кормящих женщин; продукты питания для взрослых; гериатрические продукты питания и корма для животных.

Согласно некоторым вариантам реализации траустохитридиевые, биомассу или микробный жир согласно настоящему изобретению можно применять в качестве добавки к или непосредственно как одно или более из следущего: масло, кулинарный жир, пастообразный продукт (паштет, масло), другой жирный ингредиент, напиток, соус, молочный или соевый продукт питания (такой как молоко, йогурт, сыр и мороженое), хлебопекарные изделия, питательные продукты, например пищевые добавки (в форме капсул или таблеток), витаминные добавки, добавки к специальным рационам (диетам), порошковые напитки, готовые или полуготовые порошковые продукты питания и их комбинации.

Неполный список продуктовых композиций, которые могут содержать микробный жир согласно настоящему изобретению, включает в себя, без ограничений, соевые продукты (молоко, мороженое, йогурты, напитки, кремы, пастообразные продукты, сухие заменители молока или сливок); супы и суповые смеси; тесто, жидкое тесто, хлебобулочные изделия, в том числе сладкие хлебобулочные изделия, хлопья для завтрака, торты, чизкейкы, пироги, кексы, печенья, пирожки, полоски, хлеб, рулеты, бисквиты, маффины, пирожные, лепешки, гренки, крекеры, сладости, закуски, пирожки, батончики Гранола, полуфабрикаты для приготовления в тостере; конфеты; твердые кондитерские изделия; шоколад и другие кондитерских изделий; жевательные резинки; жидкие продукты питания, например молоко, энергетические напитки, детское питание, газированные напитки, чай, жидкие продукты, фруктовые соки, напитки на основе фруктов, напитки на основе овощей; мультивитаминные сиропы, пищевые заменители, медицинская еда и сиропы; смеси порошковых напитков; паста; переработанная рыбная продукция; переработанная мясная продукция; переработанная продукция из мяса птицы; подливки и соусы; приправы (кетчуп, майонез и т.д.); пастообразные продукты на основе овощных масел; молочные продукты; йогурт; масла; замороженные молочные продукты; мороженое; замороженные десерты; замороженные йогурты; полутвердые продукты питания, такие как детское питание; пудинги и десерты на основе желатина; обработанные и необработанные сыры; смеси для приготовления блинов; батончики, включая энергетические батончики; смеси для приготовления вафель; заправки для салатов; заменитель яичной смеси; ореховые пасты и пасты на основе орехов; соленые закуски, такие как картофельные чипсы и другие типы картофельных продуктов, кукурузные чипсы, тортилья, прессованные закуски, попкорн, крендельки, картофель жареный и орехи; специальные закуски, такие как крем-соус, сухофрукты, мясные закуски, свиные шкварки, компоненты здорового питания и рисовые или кукурузные торты.

Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир согласно настоящему изобретению можно использовать в качестве добавки к детскому питанию. В детское питание можно добавлять только микробный жир согласно настоящему изобретению либо добавлять его в комбинации с физически очищенным жиром, полученным из микроорганизмов, продуцирующих арахидоновую кислоту (АРА). АРАпродуцирующие микроорганизмы представляют собой, например, МоШеге11а а1рша или Могйеге11а кес1. ксНишсксп. Альтернативно, в составы детского питания можно добавлять микробный жир согласно настоящему изобретению в комбинации с маслом с высоким содержанием АРА, включая АКА8СО® (Майек Вюкаеисек, Со1итЫа, ΜΌ).

Согласно некоторым вариантам реализации композиция представляет собой корм для животных. Термин "животное" означает любой организм, не являющийся человеком, относящийся к царству животных, и включает, без ограничений, водных и наземных животных. Термин "корм для животных" или "пища для животных" относится к любому продукту питания, предназначенному для потребления животным, не являющимся человеком, будь-то рыбы; рыбы, разводимые в коммерческих целях; декоративные виды рыб; личинки рыб; двустворчатые молюски; моллюски; ракообразные; креветки; личинки креветок; артемии; коловратки; животные-фильтраторы; амфибии; пресмыкающиеся; млекопитающие; животные, проживающие в неволе; сельскохозяйственные животные; животные, проживающие в зоопарке; спортивные животные; животные-производители; животные, приспособленные для бега; животные, участвующие в развлекательных программах; животные, представляющие семейную ценность; животные, относящиеся к редким или вымирающим видам; животные-компаньоны; домашние животные, такие как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши или лошади; приматы, такие как мартышковые (например, капуцин, резус, африканская зеленая, мартышка-гусар, яванский макак и мартышки), человекообразные обезьяны, орангутанги, павианы, гиббоны, шимпанзе; псовые, такие как собаки и волки; кошачьи, такие как кошки, львы, тигры; непарнокопытное, такие как лошади, ослы и зебры; животные, разводимые для пищи, такие как коровы, крупный рогатый скот, свиньи и овцы; копытные, такие как олени и жирафы; грызуны, такие как мыши, крысы, хомячки и морские свиньи; и так далее. К корму для животных относятся, без ограничений, корм для аквакультур, корм для животных, проживающих в неволе, включая корм для домашних животных, корм для животных из зоопарка, корм для рабочих животных, корм для скота или их сочетание.

Согласно некоторым вариантам реализации композиция представляет собой корм или кормовую добавку для любого животного, чье мясо или производимый им продукт потребляется человеком в пищу, такие как животные, чье мясо, яйца или молоко получают для потребления человеком. При кормлении таких животных питательные вещества, такие как ДЦ ПНЖК, могут включаться в тело, молоко, яйца или

- 12 030161

другие продукты таких животных и увеличить содержание этих питательных веществ.

Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция представляет собой материал, высушенный распылительной сушкой, который можно измельчить до частиц подходящего размера для потребления зоопланктоном, артемиями, коловратками и животными-фильтраторами. Согласно некоторым вариантам реализации зоопланктон, артемии или коловратки, которых кормят указанной композицией, в свою очередь, являются кормом для личинок рыб, рыб, молюсков, двустворчатых моллюсков или ракообразных.

Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция представляет собой фармацевтическую композицию. К подходящим фармацевтическим композициям относятся, без ограничений, противовоспалительные композиции, лекарственные средства для лечения ишемической болезни сердца, лекарственные средства для лечения артериосклероза, агенты для химиотерапии, активные наполнители, лекарства от остеопороза, антидепрессанты, противосудорожные средства, лекарства против НсПеоЬаеЮг ру1ог1, лекарственные средства для лечения нейродегенеративных заболеваний, лекарственные средства для лечения дегенеративных заболеваний печени, антибиотики, композиции, снижающие уровень холестерина, и композиции, снижающие уровень триглициридов.

Согласно некоторым вариантам реализации композиция представляет собой медицинский продукт питания. К медицинским продуктам питания относятся продукты питания, которые присутствуют в композициях, предназначенных для потребления или введения извне под наблюдением врача, и предназначены для конкретных диетических режимов, для которых требуется отличительный набор питательных веществ, в зависимости от признанных научных принципов, которые установлены медицинской экспертизой.

Согласно некоторым вариантам реализации микробный жир можно использовать в составе лекарственной формы. К лекарственным формам можно отнести, без ограничений, таблетки, капсулы, облатки, пилюли, порошки и гранулы и лекарственные формы для парентерального введения, которые включают, без ограничений, растворы, суспензии, эмульсии и сухие порошки, содержащие эффективное количество микробного жира. Из уровня техники также известно, что подобные составы также могут содержать фармацевтически приемлемые растворители, наполнители, дезинтегрирующие агенты, связывающие агенты, любриканты, ПАВ, гидрофобные носители, растворимые в воде носители, эмульгаторы, буферы, влагоудерживающие вещества, увалжняющие вещества, солюбилизаторы, консерванты и тому подобное. К формам для введения относятся, без ограничений, таблетки, драже, капсулы, таблетки в виде капсул и пилюли, которые содержат микробный жир и один или более подходящих фармацевтически приемлемых носителей.

Для перорального введения микробный жир можно комбинировать с фармацевтически приемлемыми носителями, известными из уровня техники. Указанные носители позволяют использовать микробный жир согласно настоящему изобретению в составе таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, суспензий и т.п., подходящих для орального потребления субъектом, нуждающимся в лечении. Согласно некоторым вариантам реализации лекарственная форма представляет собой таблетку, пилюлю или таблетку в виде капсулы. Фармацевтические препараты для орального применения можно получать путем добавления твердого наполнителя факультативно с перемалыванием полученной смеси и производства из полученной смеси после добавления подходящих дополнительных компонентов, если желательно, гранул таблеток или ядра драже. К подходящим наполнителям относятся, без ограничений, такие наполнители, как сахара, включая, без ограничений, лактозу, сахарозу, манит и сорбит; препараты на основе целлюлозы, включая, без ограничений, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагантовую камедь, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу и поливинилпирролидон (ПВП). Если желательно, можно добавить дезинтегрирующие агенты, такие как, без ограничений, кросссвязанный поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, например альгинат натрия. К фармацевтическим препаратам, которые можно применять орально, относятся, без ограничений, твердые желатиновые капсулы из двух частей, а также мягкие закрытые капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит.

Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция представляет собой парфюмерно-косметическую композицию. К косметическим средствам относятся, без ограничений, эмульсии, кремы, лосьоны, маски, мыла, шампуни, моющие средства, кремы для лица, кондиционеры, средства макияжа, средства для ванной и жидкости, предназначенные для нанесения распылением. Косметический агент может быть медицинского или немедецинского назначения.

Согласно некоторым вариантам реализации композиция представляет собой промышленную композицию. Согласно некоторым вариантам реализации композиция представляет собой исходный материал для одного или более промышленных изделий. К промышленным изделиям относятся, без ограничений, полимеры; фотографические чувствительные к свету материалы; детергенты; промышленные жиры или промышленные детергенты. Для примера, в патенте США № 7259006 описано применение ДГКсодержащих жиров и масел, используемых для производства бегеновой кислоты, и производство фотографически чувствительных материалов с использованием бегеновой кислоты.

- 13 030161

Способы применения композиций.

Согласно некоторым вариантам реализации композицию можно использовать для лечения патологических состояний людей или животных.

Термины "лечить" и "лечение" относятся как к терапевтическим, так и профилактическим или превентивным мерам, в которых объект используют для предотвращения или замедления (уменьшение) нежелательного физиологического состояния, болезни или расстройства или для достижения благоприятных или желаемых клинических результатов. В соответствии с целями согласно настоящему изобретению благоприятные или желаемые клинические результаты включают, без ограничений, облегчение симптомов или признаков, ассоциированных с состоянием, болезнью или расстройством; уменьшение степени тяжести состояния, болезни или расстройства; стабилизацию состояния, болезни или расстройства (т.е. когда состояние, болезнь или расстройство не ухудшаются); задержку или замедление прогрессирования состояния, болезни или расстройства; улучшение состояния, болезни или расстройства; ремиссию (будь то частичная или полная, заметная или скрытая) состояния болезни или расстройства или восстановление или излечение состояния, болезни или расстройства. Лечение включает достижение клинически значимого ответа без значительно выраженных побочных эффектов. "Лечение" также включает продление срока жизни по сравнению с ожидаемым сроком жизни при отсутствии лечения.

Согласно некоторым вариантам реализации указанные композиции используют для лечения состояний, заболеваний или расстройств, таких как угревая сыпь, острые воспаления, возрастная макулопатия, аллергия, болезнь Альцгеймера, артрит, астма, атеросклероз, аутоиммунные заболевания, нарушения липидов крови, цистит молочной железы, кахексия, рак, сердечный рестеноз, сердечно-сосудистые заболевания, хронические воспаления, ишемическая болезнь сердца, муковисцидоз, дегенеративное расстройство печени, сахарный диабет, экзема, желудочно-кишечные расстройства, болезни сердца, высокий уровень триглицеридов, гипертоническая болезнь, гиперактивность, иммунологические заболевания, подавление роста опухоли, воспалительные состояния, кишечные расстройства, дисфункция почек, лейкемия, депрессии, рассеянный склероз, нейродегенеративные расстройства, остеоартроз, остеопороз, пероксисомальные расстройства, преэклампсия, преждевременные роды, псориаз, легочные расстройства, ревматоидный артрит, риск сердечно-сосудистых заболеваний или тромбоз.

Согласно некоторым вариантам реализации композицию согласно настоящему изобретению используют для увеличения продолжительности срока беременности на третьем триместе.

Согласно некоторым вариантам реализации композицию используют для контроля за кровяным давлением.

Согласно некоторым вариантам реализации композицию используют для улучшения или сохранения когнитивных функций.

Согласно некоторым вариантам реализации композицию используют для улучшения или сохранения памяти.

Композицию или лекарственную форму можно вводить в тело субъекта любым способом, подходящим для композиции или лекарственной формы. Вещество рассматривают как "вводимое", если сам пациент вводит себе данное веществ или другая персона, машина или устройство вводит данное вещество в тело пациента. "Введение", таким образом, включает, например, самостоятельное введение, введение другими людьми или устройствами, непрямое введение. Использование в настоящей заявке по отношению к "введению" термины "продолжительное" или "непрерывное" означает, что частота введения составляет по меньше мере один раз в день. Следует заметить, что хотя частота введения может превышать "один раз в день", оно также будет относиться к "продолжительному" или "непрерывному" введению, например два или три раза в день, до тех пор пора указанный уровень дозировки остается в указанных границах. Средства и способы введения известны из уровня техники, и практикующий специалист может обратится к различным фармакологическим справочникам и руководствам. Например, информацию можно получить в "Мойет РНагтасеийск," Вапкег & РНойех ГиТогта НеаННсаге, И8А, 41Н ей. (2002); и "Ооойтаи & Ойтаи'8 ТНе РНагтасеийса1 ВаЙ5 оТ ТНегареиНск," МсОга^-НШ Сотратек, 1ис., Ыете Уогк, 101Н ей. (2001).

Под "субъектом", "персоной" или "пациентом" подразумевается любой субъект, являющийся или не являющийся человеком, для которого желательно провести диагностику, составить прогноз или осуществить курс терапии. К млекопитающим субъектам относятся, без ограничений, люди; животные, проживающие в неволе; сельскохозяйственные животные; животные, проживающие в зоопарке; спортивные животные; домашние животные, такие как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши или лошади; приматы, такие как мартышковые (например, капуцин, резус, африканская зеленая, мартышкагусар, яванский макак и мартышки), человекообразные обезьяны, орангутанги, павианы, гиббоны, шимпанзе; псовые, такие как собаки и волки; кошачьи, такие как кошки, львы, тигры; непарнокопытное, такие как лошади, ослы и зебры; животные, разводимые для пищи, такие как коровы, крупный рогатый скот, свиньи и овцы; копытные, такие как олени и жирафы; грызуны, такие как мыши, крысы, хомячки и морские свиньи; и так далее. Термин "субъект" также включает модельных животных, например модельных животных для изучения болезней. Согласно некоторым вариантам реализации термин "субъект" включает животных, представляющих ценность, как экономическую, так и другого рода, например жи- 14 030161

вотные-производители; животные, приспособленные для участия в бегах; животные, участвующие в развлекательных программах; животные, представляющие семейную ценность; животные, относящиеся к редким или вымирающим видам; животные-компаньоны. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой субъект, не являющийся человеком.

Композиции можно вводить как "терапевтически эффективное количество", "профилактически эффективное количество", "терапевтическую дозу" или "профилактическую дозу". "Терапевтически эффективное количество" или "терапевтическая доза" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение временных промежутков, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтический результат может заключаться, например, в уменьшении симптомов, в продлении срока жизни, в увеличении мобильности и т.п. Терапевтический результат должен быть следствием "курса лечения". "Профилактически эффективное количество" или "профилактическая доза" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение временных промежутков, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, поскольку профилактическую дозу вводят субъекту до заболевания или на раннем этапе заболевания, профилактически эффективное количество может быть меньше терапевтически эффективного количества.

Субъекту можно вводить различные дозы композиции в зависимости от количества ДГК или другого жирно-кислотного компонента траустохитридиевых, биомассы или микробного жира, которые следует ввести субъекту. Термины "дневная доза", "дневной уровень дозировки" и "дневное количество дозы" относятся в настоящей заявка к итоговому количеству ДГК или другого жирно-кислотного компонента, вводимого в течение дня (период в 24 ч). Так, например, введение субъекту ДГК в дневной дозе 2 мг означает, что субъект получает в общей сложности 2 мг ДГК в день, и введение ДГК проходит в единичной лекарственной форме, содержащей 2 мг ДГК, или, альтернативно, в четырех лекарственных формах, содержащих 0,5 мг ДГК каждая (в общей сложности 2 мг ДГК). Согласно некоторым вариантам реализации дневное количество ДГК вводят в единичной лекарственной форме или двух лекарственных формах. Лекарственные формы согласно настоящему изобретению можно принимать за один раз или за несколько раз. Например, если ежедневно принимаются 4 таблетки, каждая из которых содержит 0,5 мг ДГК, то все четыре таблетки можно принимать вместе раз в день, или по две таблетки можно принимать два раза в день, или одну таблетку можно принимать каждые 6 ч. Согласно некоторым вариантам реализации дневная лекарственная форма содержит от примерно 100 мг до примерно 15 мг ДГК. Согласно некоторым вариантам реализации дневная лекарственная доза содержит от примерно 100 мг до примерно 250 мг, от примерно 100 мг до примерно 500 мг, от примерно 100 мг до примерно 1 г, от примерно 1 г до примерно 2,5 г, от примерно 1 г до примерно 5 г, от примерно 1 г до примерно 10 г, от примерно 1 г до примерно 15 г, от примерно 5 г до примерно 10 г, от примерно 5 г до примерно 15 г, от примерно 10 г до примерно 15 г, от примерно 100 мг до примерно 10 г, от примерно 100 мг до примерно 5 г или от примерно 100 мг до примерно 2,5 г.

Введение композиций или лекарственных форм согласно настоящему изобретению можно осуществлять в различных режимах. Например, согласно некоторым вариантам реализации введение проводят ежедневно в течение нескольких дней или, в качестве альтернативы, проводят каждый второй день (через день). Введение можно проводить в течение одного или большего числа дней.

Введение композиций или лекарственных форм можно совмещать с другими режимами, которые используются для лечения состояния, на которое направлено воздействие. Например, способы согласно настоящему изобретению можно совмещать с режимами питания (например, диеты с низким содержанием углеводов, диеты с высоким содержанием белка, диеты с высоким содержанием пищевых волокон и т.д.), режимами физической нагрузки, режимами для снижения веса, режимами для отказа от курения или их комбинаций. Данный способ согласно настоящему изобретению также можно использовать совместно с другими фармацевтическими продуктами для лечения состояния, на которое направлено воздействие. Композиции и лекарственные формы согласно настоящему изобретению можно вводить до или после других режимов лечения или фармацевтических продуктов.

Наборы, содержащие композиции.

Настоящее изобретение также относится к наборам или комплектам, содержащих одну или более единиц композиций согласно настоящему изобретению. Наборы или комплекты могут включать в себя единицы пищевых продуктов, фармацевтических композиций, парфюмерно-косметических или индустриальных композиций, содержащих траустохитридиевые, биомассу или микробный жир согласно настоящему изобретению или их комбинации. Наборы или комплекты также могут включать в себя аддитивные составы, содержащие траустохитридиевые, биомассу или микробный жир согласно настоящему изобретению или их комбинации, предназначенные для подготовки продуктов питания, косметических средств, фармацевтических композиций или промышленных композиций.

Согласно некоторым вариантам реализации набор или комплект содержит одну или более единиц фармацевтической композиции для введения согласно способам согласно настоящему изобретению. Набор или комплект может содержать одну лекарственную единицу или более чем одну лекарственную единицу (например, множественные лекарственные единицы). Если в наборе или комплекте присутст- 15 030161

вуют множественные лекарственные единицы, множественные лекарственные единицы могут быть факультативно разделены для последовательного введения.

Наборы согласно настоящему изобретению могут факультативно содержать инструкции, касающиеся единиц и лекарственных формы, находящихся в наборе. Такие инструкции могут быть составлены в форме, предписанной правительственным агенством, регулирующим изготовление, использование или продажу фармацевтических препаратов, такая надпись является отражением одобрения агенством производимого изделия, его использования или продажи для введения человеку и лечения состояния или заболевания. Данная инструкция может быть составлена в любой форме, которая сообщает информацию о использовании единиц или лекарственных форм, присутствующих в наборе, согласно способам согласно настоящему изобретению. Например, инструкция может быть составлена в печатной форме или в форме подготовленного медийного устройства.

В ходе осмотра пациента профессиональный медицинский работник может определить, что применение одного из способов согласно настоящему изобретению подходит для пациента, или врач-терапевт может определить, что состояние пациента может улучшиться после применения одного из способов согласно настоящему изобретению. Перед назначением любого курса врач-терапевт может проконсультировать пациента, например, о различных рисках и возможной пользе, ассоциированных с назначаемым курсом. Пациенту может быть представлено полное описание всех известных и предполагаемых рисков, ассоциированных с назначаемым курсом. Подобные консультации могут быть проведены в устной, но также и в письменной форме. Согласно некоторым вариантам реализации врач-терапевт может снабдить пациента литературой о назначаемом курсе, такой как информация о продукте, образовательные материалы и т. п.

Настоящее изобретение также направлено на способы просвещения потребителей о способах лечения, способы, включающие распространение лекарственных форм совместно с информацией для потребителей в момент продажи. Согласно некоторым вариантам реализации передача данной информации будет происходить в момент продажи, осуществляемой фармацевтом или распространителем медицинских услуг.

Термин "информация для потребителей" включает, без ограничений, английский текст, текст на языке, не являющемся английским, наглядное изображение, схемы, телефонные записи, веб-сайты и возможность контакта с живыми потребителями предоставляемых услуг. Согласно некоторым вариантам реализации информация для потребителей будет предоставлять инструкции для потребления лекарственных форм согласно способам согласно настоящему изобретению, возраст для применения, показания для применения, противопоказания, предупреждения о приемлемых дозах, номера телефонов и адреса веб-сайтов. Согласно некоторым вариантам реализации данный способ также включает предоставление профессиональной информации соответствующим персонам, которые будут способны ответить на вопросы потребителей, касающиеся применения описанного курса согласно способам согласно настоящему изобретению. Термин "профессиональная информация" включает, без ограничений, информацию, касающуюся курсов, применяемых согласно способам согласно настоящему изобретению, которая предназначена для действующих профессиональных медицинских работников, чтобы они могли отвечать на вопросы потребителей.

К "профессиональным медицинским работникам" относятся, для примера, врач-терапевт, помощник врача, практикующая медсестра, фармацевт и служащие по работе с клиентами.

По завершению полного описания изобретения для дальнейшего его понимания следует обратиться к приведенным в настоящем документе примерам. Данные примеры приведены исключительно с иллюстративной целью и ни в коей мере не ограничивают изобретение.

Пример 1. Выделенные траустохитридиевые, депонированные под учетным номером АКТК РТА9695, охарактеризовали для отнесения к таксономической группе.

Образцы собирали в литоральной зоне в период отлива. Пробы воды, осадочных пород, живого растительного материала и разлагающихся остатков растений и животных помещали в стерильные пробирки объемом 50 мл. Часть каждого образца вместе с водой растирали по чашкам, содержащим твердую (агаризованную) разделительную среду. Разделительная среда состояла из 500 мл искусственной морской воды, 500 мл дистиллированной воды, 1 г глюкозы, 1 г глицерина, 13 г агара, 1 глутамата, 0,5 г дрожжевого экстракта, 0,5 г гидролизата казеин, 1 мл раствора витаминов (100 мг/л тиамина, 0,5 мг/л биотина, 0,5 мг Β_Ί2), 1 мл раствора микроэлементов (ΡΙΙ-раствор металлов, содержащий на 1 л 6,0 г РеС1₃6Н₂О, 6,84 г Н₃ВО₃, 0,86 г МпС1₂4Н₂О, 0,06 г ΖηΟ1₂, 0,026 г СоС1₂6Н₂О, 0,052 г ΝΐδΟ^Ο, 0,002 г С'и5>О₄5Н₂О и 0,005 г №-1₂МоО₄2Н₂О) и по 500 мг пенициллина О и стрептомицина сульфата. Чашки с агаризованной средой инкубировали в темноте при 20-25°С.

По прошествии 2-4 дней чашки с агаризованной средой анализировали при оптическом увеличении, и выявленные колонии клеток отбирали при помощи стерильных зубочисток и засевали штрихом на чашки со свежей питательной средой. Клетки повторно многократно пересевали на свежую питательную среду до тех пор, пока не были удалены организмы-контаминанты.

Колонии с чашек с агаризованной средой переносили в чашки Петри, содержащие разведенную в два раза морскую воду и 1 мл суспензии автоклавированных свежевыведенных личинок артемий. По

- 16 030161

прошествии 2-3 дней личинки артемий зарастали гроздями спорангий. Высвобожденные зооспоры после освобождения характеризовались наличием двух жгутиков и активно двигались в сторону от зрелого спорангия, и остатки стенок после их высвобождения были отчетливо видны при использовании фазового контраста. Спорангии имели размер от 12,5 до 25 мкм в диаметре, и размер зооспор составлял от 2,5 до 2,8 мкм на от 4.5 до 4,8 мкм. В отдельном спорангии насчитывалось от 8 до 24 спор. Проросшие зооспоры увеличивались в размерах и быстро претерпевали ряд бинарных делений, приводящих к образованию тетрад, октад и в конечном счете гроздей спорангиев. Формирование тетрад началось еще на самом раннем этапе до начала созревания спорангиев. Эти характеристики согласуются со сведениями о роде 8с1ч/осН\1пит.

Выделенных траустохитрид, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695, позднее охарастеризовали по схожести последовательности их гена 18з рРНК с соответствующими генами известных видов. Тотальную геномную ДНК траустохитридиевых, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695, выделяли в соответствии со стандартными процедурами (8атЬгоок Т апй Ки§8е11 Ό. 2001. Мо1еси1аг с1ошп§: А 1аЬога1огу тапиа1, 3гй ейШоп. Со1й 8рпп§ НагЬог ЬаЬога1огу Рге§§, Со1й 8рпп§ НагЬог, Ые^ Уогк) и использовали для амплификации гена 18з РНК. ПЦР-амплификацию гена 18з рРНК проводили с использованием описанных ранее праймеров (Нопйа е1. а1., I Еикагуо!. М1сгоЬю1. 46(6) 1999). ПЦР на матрицах хромосомных ДНК проводили при следующих условиях: 0,2 мкм дНТФ, 0,1 мкМ каждого праймера, 8% ДМСО, 200 нг хромосомной ДНК, 2,5 Ед ДНК-полимеразы РШИИга® II Ги§юп Н8 (8!га!а§епе) и 1хРШи1!га® ЬиН'ег (8!га!а§епе) в итоговом объеме 50 мкл. Протокол ПЦР вклчал следующие этапы: (1) 95°С в течение 2 мин; (2) 95°С в течение 45 с; (3) 55°С в течение 30 с; (4) 72°С в течение 2 мин; (5) повтор этапов 2-4 40 раз; (6) 72°С в течение 5 мин и (7) выдерживание при 6°С.

ПЦР-амплификация с использованием хромосомных матриц приводила к получению определенного ДНК-продукта ожидаемого размера. Данный продукт ПЦР клонировали в вектор рЗЕТ1.2/Ь1ип! (Еегтеп!а§) в соответствии с инструкциями производителя, и наличие последовательности вставки определяли с использованием стандартных поставляемых праймеров.

Табл. 2 показывает данные сравнения последовательностей 18з рРНК траустохитридиевых, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695, с последовательностями из электронной базы данных Национального центра биотехнологической информации (ЫСВ1). Вкратце, "% идентичности" определяли с использованием матрицы замен "з^дарйпат!" в программе "ЛНдиХ" из пакета Уес!огЫТ1 (1пуИго§еп), что является стандартом при выравнивании последовательностей ДНК. "% покрытия" был взят из результатов расчета Ва§1с Еоса1 АЕдитеп! 8еагсЕ Тоо1 (ВЕА8Т) - инструмента, предоставляемого электронной базой данных ЫСВ1, и представляет собой процент от длины сравниваемой последовательности, который содержится в выравненных участках.

Таблица 2

Сравнение последовательностей 18з рРНК

Т раустохитридиевые	% Идентичности Расчет №1	% Покрытия Расчет №2
ТРга из(осРу(п ит аддгеда!ит (р)	98	90
ТРгаиз(осРиРгИс1ае зр. Н1Л	84	86
ТРгаизЁосРиНгИРае зр. 8-7	84	91
ТРга изйосРуйп ит т иШгисИтета1е	81	88
ТРгаизйосРийгийае зр. РХЛ/19	81	85
ЗсРп/осРу^пит зр. АТСС 20888	81	95

(р) - сравнение по неполной последовательности.

Как показано в табл. 2, на основании % идентичности было обнаружено, что последовательность гена 18δ рРНК (δ8Ερ ΙΌ N0: 1), полученная из траустохитрид, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695, имеет наибольшое сродство, хотя и не полностью идентична, с последовательностью гена 18δ рРНК Т. аддгедаШт, описанной у Нопйа Ό. е! а1., Т Еик. М1сго. 46(6): 637-647 (1999). Последовательность 18δ рРНК, представленная для ТЕгаш!осЕу!пит аддгедаШт, представляет собой частичную последовательность ДНК с отсутствием примерно 71 нуклеотида в середине последовательности. По данным процента охвата последовательность гена 18δ рРНК изолята согласно настоящему изобретению имеет большее сродство с 8сЫ/осЕу!пит δр. АТСС 20888, чем с Т. аддгедаШт.

Высококонсервативные белки, такие как актин и бета-тубулин, широко используются наряду с геном 18δ рРНК в качестве маркеров для установления филогенетического родства между организмами (Ва1йаи£ 8.М. Ат. Ыа!. 154, 8178 (1999)). Тотальную геномную ДНК траустохитридиевых, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695, также использовали как матрицу для ПЦР-амплификации генов актина и бета-тубулина. ПЦР-амплификацию проводили с праймерами, сконструированными к консервативным регионам ДНК-последовательностей актина и бета-тубулина Т. а§§ге§а!ит.

ПЦР на матрицах хромосомных ДНК проводили при следующих условиях: 0,2 мкм дНТФ, 0,1 мкМ

- 17 030161

каждого праймера, 8% ДМСО, 200 нг хромосомной ДНК, 2,5 Ед ДНК-полимеразы Негси1азе® II Гизюп (81га!адепе) и 1хНегси1азе® Ьийег (81га!адепе) в итоговом объеме 50 мкл. Протокол ПЦР включал следующие этапы: (1) 95°С в течение 2 мин; (2) 95°С в течение 30 с; (3) 55°С в течение 30 с; (4) 72°С в течение 2 мин; (5) повтор этапов 2-4 40 раз; (6) 72°С в течение 5 мин и (7) выдерживание при 6°С.

ПЦР-амплификация с использованием хромосомных матриц приводила к получению определенных ДНК-продуктов ожидаемых размеров. Данные продукты ПЦР клонировали в вектор р1ЕТ1.2/Ыип! (Еегшеп!аз) в соответствии с инструкциями производителя, и наличие каждой последовательности вставок определяли с использованием стандартных поставляемых праймеров.

В табл. 3 показана идентичность аминокислотной последовательности актина (8Ер ГО ΝΟ: 3) траустохитридиевых, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695, с последовательностями актина, доступными в открытом доступе в базе данных. Идентичность оценивали с использованием матрицы замен "Ыозиш62ш12" в программе "АйдпХ" из пакета Уес1огЭТ1, что является стандартом при выравнивании белковых последовательностей.

Таблица 3

% Идентичности при сравнении последовательностей белка актина

Т раустохитридиевые	% Идентичности
ТЬгаиз1:осЬу{:гИс1ае зр. КТ49	98
ЗсЫхосЬуМит зр. АТСС 20888	96
ТЬгаиз1:осЬу{:г1ит з£па1:ит	96
ТЬ га из£осЬ урчит аддгедаЁит	96
баропосЬуБшт тап'пит	95
ТЬ га изРэсЬу Мит а и гейт	95

В табл. 4 показана идентичность аминокислотной последовательности бета-тубулина (8Ер ГО ΝΟ: 5) траустохитридиевых, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695, с последовательностями бета-тубулина, доступными в открытом доступе в базе данных. Идентичность оценивали с использованием матрицы замен "Ыозиш62ш12" в программе "АйдпХ" из пакета Уес1огЭТ1, что является стандартом при выравнивании белковых последовательностей.

Таблица 4

% Идентичности при сравнении последовательностей белка бета-тубулина

Т раустохитридиевые	% Идентичности
Ар1апосЬу1:пит кегдие/епзе	100
Ар/апосЬуМит з^оссЫпо/	100
ЗаропосЬуМит тап'пит	100
ЬаЬупп1:Ьи1а зр. N8	100
ТЬгаизтсЬуБНЬае зр. КТ49	100
ТЬгаизРэсЬуЫит аддгедаЬлт)	100
ТЬгаизтсЬуЬ'Пс/ае зр. Н1Л	100
ТЬгаизРэсЬуЫит аигеит	100
ТЬгаиз(:осЬу(:пит Ιαηηβϊ	100
ТЬгаизтсЬуБНЬае зр. #32	100
ТЬгаизтсЬуБНЬае зр. РМ19	100
ЗсЫхосЬуМит аддгедаЁит	100
ЗсЫгосЬуЬч'ит зр. АТСС 20888	100

Исходя из вышеизложенных характеристик выделенные траустохитридиевые, депонированные под учетным номером АКТК РТА-9695, можно считать новым видом 8сЫ7осЬу1пиш и таким образом обозначить его как 8сЫ7осЬу1пиш зр. АТСС РТА-9695.

Пример 2.

Выделенные траустохитриды, депонированные под учетным номером АКТК РТА-9695, показывали высокие показатели клеточного роста при различных условиях культивирования, что описано ниже. Типичная питательная среда и условия культивирования представлены в табл.1. Также наблюдали высокие показатели содержания жирных кислот и ДГК (то есть более 50% сухого веса клеток составляли жирные кислоты и более 50% веса метиловых эфиров жирных кислот составляли эфиры ДГК).

При культивировании с источниками углерода и азота, при концентрации С1^- 8200 м.д., температуре 22,5°С, уровне растворенного кислорода 20%, рН 7,0 изолят продуцировал сухого клеточного веса 140 г/л за 7 дней культивирования при содержании жирных кислот 70 вес.%. Использовали систему поддержания температуры с циркуляцией аммиака в замкнутом контуре и поддерживали рН на уровне 7,0. При

- 18 030161

данных условиях производительность омега-3 составляла 8,92 г/(л*день), при этом ЭПК 4,7 г/л (5% от веса жирных кислот) и ДГВ 56,3 г/л (57% от веса жирных кислот) за 7 дней.

При культивировании с источниками углерода и азота, при концентрации С1^- 3640 м.д., температуре 22,5°С, уровне растворенного кислорода 20%, рН 7,0 изолят продуцировал сухого клеточного веса 82 г/л за 7 дней культивирования, при содержании жирных кислот 58 вес.%. При данных условиях производительность омега-3 составляла 4,5 г/(л*день), при этом ЭПК 2,1 г/л (4,3% от веса жирных кислот) и ДГВ 28,5 г/л (58,7% от веса жирных кислот) за 7 дней.

При культивировании с источниками углерода и азота, при концентрации С1^- 980 м.д., температуре 22,5°С, уровне растворенного кислорода 20%, рН 7,0 изолят продуцировал сухого клеточного веса 60 г/л за 7 дней культивирования, при содержании жирных кислот 53 вес.%. При данных условиях производительность омега-3 составляла 2,8 г/(л*день), при этом ЭПК 1,1 г/л (3,4% от веса жирных кислот) и ДГВ 18,4 г/л (56,8% от веса жирных кислот) за 7 дней.

Пример 3.

Из образца биомассы (образец А) выделенных траустохитрид, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695, экстрагировали жиры. Образец биомассы был получен при культивировании с источниками углерода и азота, при концентрации С1^- 3640 м.д., температуре 22,5°С, уровне растворенного кислорода 20%, рН 7,0. Для получения жиров, образец А1, проводили экстракцию жиров из биомассы образца А способом экстракции гексаном. Вкратце, высушенную биомассу трясли вместе с гексаном в пробирках из нержавеющей стали в присутствии шариков из нержавеющей стали в течение примерно 2 ч. Суспензию фильтровали при помощи вакуума, и собирали фильтрат. Гексан удаляли с помощью роторного эвапоратора. Также для получения микробного жира, образец А2, проводили экстракцию жиров из образца А с использованием ЕКЮЬЕХ® (ОБА ХУсЧГаПа 8ерата1от ИК ИТ. Μίΐΐοη Кеуиек, Еид1аиб). Методом флэш-хроматографии низкого давления выделяли отдельные липидный классы из микробного жира, образцы А1 и А2, и высчитывали весовой процент каждого класса. Для каждого класса определяли профиль жирных кислот, как метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК), методом газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора (ГХ-ПИД).

Флэш-хроматография.

Флэш-хроматографию использовали для разделения различных классов липидов в неочищенных жирах и определения весового процента каждого класса, присутствующего в жире. В хроматографической системе использовали 8Шса Ое1 60 (ΕΜΌ СЬетюа1, ОФЪкФ^и, N1) и в качестве подвижной фазы смесь петролейного эфира и этилацетата при скорости потока 3 мл/мин. В ход анализа включали этап градиента для раздельного выхода каждого класса липидов из колонки. Градиент подвижной фазы начинали со 100%-ного петролейного эфира и заканчивали содержанием этилацетата 50% (с последующей промывкой 100%-м метанолом). Фракции собирали в пробирки объемом 10 мл с использованием многообразцового сборника фракций ΟίΕοη ЕС 204 (Ойкои, 1ис., ММб1е1ои, ^1). Каждую пробирку анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), и пробирки, содержащие отдельные липидные классы (о чем судили по появлению единичного пятна на ТСХ-пластинке с ожидаемым значением коэффициента удержания (КГ)), объединяли, концентрировали до полного удаления влаги и взвешивали. Общее содержание фракций позже определяли гравиметрически.

ТСХ-анализ.

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинах на основе силикагеля. Пластины элюировали с использованием растворителя, состоящего из петролейного эфира:этилового эфира:уксусной кислоты (80:20:1), и визуализировали парами йода. Значение КГ для каждого пятна сравнивали со значениями, известными из литературных данных, для каждого класса липидов.

Анализ жирных кислот.

Образцы биомассы и выделенные классы липидов анализировали на состав жирных кислот как МЭЖК. Образцы взвешивали непосредственно в пробирках для анализа с завинчивающимся крышками, и в каждую пробирку добавляли 1 мл раствора внутреннего стандарта С19:0 (ШСНеск Е1у81аи, ΜΝ) в толуоле и 2 мл 1,5Н НС1 в метаноле. Пробирки аккуратно перемешивали на вортексе и помещали в нагревательный блок на 2 ч при температуре 100°С. После пробирки вынимали из нагревательного блока, оставляли до остывания и добавляли в пробирки по 1 мл насыщенного водного раствора №С1. Пробирки снова перемешивали на вортексе, центрифугировали, и верхний (органический) слой переносили в пузырьки для ГХ и анализировали методом ГХ-ПИД. Количественный состав МЭЖК определяли используя метод внутренних стандартов с калибровочной кривой из 3 точек, построенную на основе №-СЬекРгер ОЬС стандартов (Νυ-Скек Ргер, 1ис., Е1у81аи, ΜΝ), и предварительно идентифицировали на основании времени выхода. Процент жирных кислот выражен в мг/г и в % от общего количества МЭЖК.

Для анализа образец А1 подготовили путем растворения неочищенного жира в гексане и ввели его в колонку. По результатам разделения образца с использованием флэш-хроматографии: фракция эфиров стероидных спиртов (ЭСС) составила 1,2 вес.%, фракция триглицеридов (ТГ) составила 82,7 вес.%, фракция свободных жирных кислот (СЖК) составляли 0,9 вес.% и фракция диглицеридов (ДГ) составила 2,9 вес.% от веса неочищенного жира. Общий профиль жирных кислот неочищенного жира образца А1 и выделенные фракции представлены ниже в табл. 5 и 6 как мг/г и % МЭЖК соответственно.

- 19 030161

Таблица 5

Профиль жирных кислот образца А1, представленный в виде мг/(г МЭЖК)

	Биомасса	Неочищенный Жир	Эфиры Стероидных Спиртов	ТГ	СЖК	ДГ
% вес.	н/д	38%	1,2%	82,7%	0,9	2,9%
Жирная Кислота	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)
С12:0*	0,6	0,0	1,9	3,2	1,7	0,0
С14:0*	5,7	13,6	12,8	20,2	13,0	17,6
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С15:0	1,3	3,4	3,1	3,1	2,1	2,6
С16:0*	105,5	239,5	222,2	274,3	183,3	225,1
С16:1*	0,0	0,0	0,8	0,0	0,8	0,0
С18:0*	6,4	16,4	43,1	16,8	9,8	14,0
С18:1 N9*	0,0	3,8	1,9	3,3	1,0	3,5
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:0*	1,8	5,5	13,0	4,7	2,0	2,9
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:4 N3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,6	0,0
С20:2 N6*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N6	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:0*	0,0	0,8	7,3	0,8	0,0	1,2
С20:4 N7	0,0	0,0	0,8	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
020:4Ν6*	1,о	3,4	0,0	2,6	2,0	1,9
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	1,5	4,1	1,5	3,5	2,1	2,1
С20:5 N3*	18,2	39,5	3,5	38,4	30,6	42,8
С24:0*	0,0	0,0	6,3	0,0	0,0	0,0
С22:4 N9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С24:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:5 N6*	11,9	29,5	8,9	26,9	14,8	18,7
С22:5 N3*	1,1	4,7	0,9	3,6	3,4	2,7
С22:6 N3*	253,5	569,7	107,3	556,5	352,8	451,4
Общее количество МЭЖК	408,6	934,0	435,4	958,0	620,1	786,4

- 20 030161

Таблица 6

Профиль жирных кислот образца А1, представленный в процентах от общего количества МЭЖК

	Биомасса	Неочищенный жир	Эфиры Стероидных Спиртов	ТГ	СЖК	ДГ
Жирная Кислота	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК
С12:0*	0,1	0,0	0,4	0,3	0,3	0,0
С14:0*	1,4	1,5	2,9	2,1	2,1	2,2
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С15:0	0,3	0,4	0,7	0,3	0,3	0,3
С16:0*	25,8	25,6	51,0	28,6	29,6	28,6
С16:1*	0,0	0,0	0,2	0,0	0,1	0,0
С18:0*	1,6	1,8	9,9	1,8	1,6	1,8
С18:1 N9*	0,0	0,4	0,4	0,3	0,2	0,4
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:0*	0,4	0,6	3,0	0,5	0,3	0,4
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:4 N3	0,0	0,0	0,0	0,0	о,1	0,0
С20:2 N6*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N6	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:0*	0,0	0,1	1,7	о,1	0,0	0,1
С20:4 N7	0,0	0,0	0,2	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
020:4Ν6	0,3	0,4	0,0	0,3	0,3	0,2
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	0,4	0,4	0,4	0,4	0,3	0,3
С20:5 N3*	4,5	4,2	0,8	4,0	4,9	5,4
С24:0*	0,0	0,0	1,4	0,0	0,0	0,0
С22:4 N9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С24:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:5 N6*	2,9	3,2	2,1	2,8	2,4	2,4
С22:5	0,3	0,5	0,2	0,4	0,5	0,3
N3*
С22:6 N3*	62,0	61,0	24,6	58,1	56,9	57,4
Общее количест во МЭЖК %	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0

Для анализа образец А2 подготовили путем растворения неочищенного жира в гексане и наносили его на колонку. По результатам разделения образца с использованием флэш-хроматографии: фракция эфиров стероидных спиртов (ЭСС) составила 0,8 вес.%, фракция триглицеридов (ТГ) составила 83,4 вес.%, фракция свободных жирных кислот (СЖК) составляли 1,8 вес.% и фракция диглицеридов (ДГ) составила 5,6 вес.% от веса неочищенного жира. Общий профиль жирных кислот неочищенного жира образца А2 и выделенные фракции представлены ниже в табл. 7 и 8 как мг/г и % МЭЖК соответственно.

- 21 030161

Таблица 7

Профиль жирных кислот образца А2, представленный в виде мг/(г МЭЖК)

	Биомасса	Неочищенный жир	Эфиры Стероидных Спиртов	ТГ	СЖК	ДГ
% вес.	н/д	н/д	0,8%	83,4%	1,8%	5,6%
Жирная Кислота	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)
С12:0*	0,6	0,0	0,0	1,5	0,0	1,0
С14:0*	5,7	13,2	8,9	14,1	9,5	5,4
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С15:0	1,3	3,3	2,8	3,4	2,1	2,2
С16:0*	105,5	233,7	183,8	246,1	159,7	137,3
С16:1*	0,0	0,0	0,0	0,8	0,0	0,0
018:0*	6,4	16,6	23,6	16,9	11,3	5,6
С18:1 N9*	0,0	7,6	5,0	4,3	2,4	2,6
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	0,0	2,2	0,7	1,6	0,8	5,1
С20:0*	1,8	5,2	12,1	5,5	2,6	1,1
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:4 N3	0,0	0,0	0,0	0,8	1,0	0,0
С20:2 N6*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N6	0,0	0,0	0,0	0,3	0,0	0,0
С22:0*	0,0	0,7	6,0	1,3	0,8	0,0
С20:4 N7	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N6*	1,0	3,0	0,0	3,1	2,3	1,2
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	1,5	4,1	1,4	4,3	2,7	1,0
С20:5 N3*	18,2	38,6	2,7	38,6	39,5	45,5
С24:0*	0,0	0,0	4,7	0,6	0,0	0,3
С22:4 N9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С24:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:5 N6*	11,9	28,2	8,6	29,6	18,0	14,7
С22:5 N3*	1,1	3,4	0,0	3,5	2,5	2,2
С22:6 N3*	253,5	566,7	102,2	575,0	475,3	447,2
Общее количество МЭЖК	408,6	926,5	362,3	951,3	730,4	672,5

Таблица 8

Профиль жирных кислот образца А2, представленный в процентах от общего количества МЭЖК

	Биомасса	Неочищенный жир	Эфиры Стероидных Спиртов	ТГ	СЖК	ДГ
Жирная Кислота	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК
С12:0*	0,1	0,0	0,0	0,2	0,0	0,2
С14:0*	1,4	1,4	2,4	1,5	1,3	0,8
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С15:0	0,3	0,4	0,8	0,4	0,3	0,3
С16:0*	25,8	25,2	50,7	25,9	21,9	20,4
С16:1*	0,0	0,0	0,0	0,1	0,0	0,0
С18:0*	1,6	1,8	6,5	1,8	1,5	0,8
С18:1 N9*	0,0	0,8	1,4	0,5	0,3	0,4
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	0,0	0,2	0,2	0,2	0,1	0,8
С20:0*	0,4	0,6	3,3	0,6	0,4	0,2
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:4 N3	0,0	0,0	0,0	0,1	0,1	0,0
С20:2 N6*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N6	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:0*	0,0	0,1	1,7	0,1	0,1	0,0
С20:4 N7	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N6*	0,3	0,3	0,0	0,3	0,3	0,2
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,2
С20:5 N3*	4,5	4,2	0,7	4,1	5,4	6,8
С24:0*	0,0	0,0	1,3	0,1	0,0	0,0
С22:4 N9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С24:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:5 N6*	2,9	3,0	2,4	3,1	2,5	2,2
С22:5 N3*	0,3	0,4	0,0	0,4	0,3	0,3
С22:6 N3*	62,0	61,2	28,2	60,4	65,1	66,5
Общее количество МЭЖК %	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0

22

030161

Пример 4.

Триглицериды (ТГ) выделяли из образцов микробного жира, ранее экстрагированного из выделенных траустохитридиевых, депонированных под учетным номером АКТК РТА-9695, способом экстракции гексаном (образец А1) или ЕКЮЬЕХ® (СЕА ХУезТаПа ЗерагаТог ИК ИГ. Μίΐΐοη Кеупез, Епд1апй) (образец А2), как это описано в пример 3. Относительную процентную долю каждого изомера ТГ определяли с использованием безводной, обратно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (БВОФ-ВЭЖХ) с использованием масс-спектрометрического детектора с химической ионизацией при атмосферном давлении (ХИАД-МС), и каждый выявленный изомер предварительно идентифицировали на основании паттерна масс-спектра фрагментов.

Отдельные липидные классы, в том числе ТГ, выделяли с использованием флэш-хроматографии. Для определения, какие остатки жирных кислот присутствуют у ТГ каждого вида и относительного количества каждого вида ТГ, фракцию ТГ анализировали методом ВЭЖХ/ХИАД-МС. Предварительную идентификацию пиков ТГ проводили на основание данных о времени выхода и ХИАД-спектра каждого пика. При использовании БВОФ-ВЭЖХ время выхода каждого ТГ увеличивалось с увеличением эквивалентного углеродного числа (ЭУЧ), которое определяется как общее количество атомов углерода в ацильной цепи минус удвоенное число двойных связей. Кроме того, при использовании оптимальных условий проведения хроматографического анализа можно различать виды ТГ, характеризующиеся одинаковым ЭУЧ, но с различным распределением насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, так же как и жирные кислоты с разной длиной цепи. ХИАД масс-спектр каждого пика ТГ дает информацию о массах протонированных молекулярных ионов [Μ+Η]+, амонийных ионах-аддуктах [Μ+ΝΗ₄]+ и фрагментарных ДГ-ионов. Каждый ТГ выдает отличительный масс-спектр, и данные о массе фрагментарных ДГ-ионов помогает идентифицировать каждый вид ТГ. Фрагментарные ионы, соответствующие отрыву ацильной группы из положения зи-2, выдают сигнал наименьшей интенсивности в ХИАД-спектре в виду того, что данный вариант энергетически наименее предпочтителен по сравнению с отрывами в положениях 5п-1 или 5п-3 ροδίΐίοη. Мобеги МеТйобз Гог ЫрШ Апа1у818 Ьу МциШ СЬготаТодгарЬу Ма88 ЗресТготе1гу апй Ке1аТей ТесЬпкщез 276-297 (ЛУППат Снид Вугй^ей ей., 2005).

Флэш-хроматография.

Флэш-хроматографию использовали для разделения различных классов липидов в неочищенном жире и определению весового процента каждого класса, присутствующего в жире. В хроматографической системе использовали ЗШса Се1 60 и в качестве подвижной фазы - смесь петролейного эфира и этилацетата при скорости потока 3 мл/мин. В ходе анализа включали этап градиента для раздельного выхода каждого класса липидов из колонки. Градиент подвижной фазы начинали со 100%-ного петролейного эфира и заканчивали содержанием этилацетата 50% (с последующей промывкой 100%-м метанолом). Фракции собирали в пробирки объемом 20 мл с использованием многообразцового сборника фракций СПзоп ЕС 204 (СШоп, 1пс., МШЫеТоп, У1). Каждую пробирку анализировали методом ТСХ, и пробирки, содержащие отдельные липидные классы (о чем судили по появлению единичного пятна на ТСХпластинке с ожидаемым значением КГ), объединяли, концентрировали до удаления влаги и взвешивали. Общее содержание фракций позже определяли гравиметрически.

ТСХ-анализ.

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинах на основе силикагеля. Пластины элюировали с использованием растворителя, состоящего из петролейного эфира: этилового эфира:уксусной кислоты (80: 20: 1), и визуализировали парами йода. Значение КГ для каждого пятна сравнивали со значениями, известными из литературных данных, для каждого класса липидов.

ВЭЖХ/ХИАД-МС анализ.

Используемая ЖХ/МС система состояла из 1100 моделей ВЭЖ-хроматографа Не\\'1е11 Раскагй, оснащенного системой химической ионизации при атмосферном давления (ХИАД) и масс-селективным детектором (МСД) Не\\'1еП Раскагй модель 1100 (АдйепТ ТесЬпо1од1е8, 1пс., Зайа С1ага, СА). В данном методе ВЭЖХ использовали две последовательно соединенные колонки ΡΗΕΝΟΜΕΝΕΧ® С18 (250x4,6 мм, 5 мкм; РЬепотепех, 1пс. (Тоггапсе, СА)), скорость потока составляла 1 мл/мин, вводимый объем 2 мкл, температура колонок 50°С. В качестве подвижной фазы использовали 0,1% ацетат аммония в изопропаноле (растворитель А) и ацетонитрил (растворитель В). Использовали линейный градиент: начинали с 20% растворителя А с увеличением содержания растворителя А до 75% в течение 40 мин, поддерживали содержание растворителя А на уровне 75% в течение 5 мин, возвращали содержание растворителя А до 20% в течение 1 мин, и поддерживали содержание растворителя А на уровне 20% еще 9 мин. Устанавливали диапазон масс МСД - т/ζ 400-1150, напряжение фрагментатора 150, поток сухого газа 6 л/мин, ультразвуковое давление 45 фунтов на квадратный дюйм, температуру сухого газа 350°С, температуру испарителя 325°С, капиллярное напряжение 3500 В и силу тока коронного разряда 10 мкА.

Тридокозагексоенион (три-ДГК).

Стандарт три-ДГК ЩиСЬеск, Е1у81ап, ΜΝ) использовали для оценки работы хроматографической системы и точности ответа детектора. Время выхода три-ДГК составило 22,5 мин, и на хроматограмме общего ионного тока (ХОИТ) видно удовлетворительное соотношение сигнал/шум. ХИАД масс-спектр

- 23 030161

пика три-ДГК показал: для протонированного молекулярнога иона [М+Н]+ т/ζ 1023,7, для амонийных ионов-аддуктов [М+ЫН₄]⁺ т/ζ 1040,8 и для единственного фрагментарного ДГ-иона т/ζ 695,5.

Для идентификации отдельных изомеров ТГ образцы выделенных фракций ТГ готовили в гексане и анализировали методом БВОФ ВЭЖХ/ХИАД-МС.

Масс-спектр каждого пика анализировали, и проводили предварительную идентификацию каждого остатка жирной кислоты, что представлено ниже в табл. 9 и 10.

Таблица 9

Предварительная идентификация видов ТГ по результатам ХИАД-МС-анализа в образце А1

Время Выхода	Пик №	Предваритель ная Идентификац ИЯ (ЯЛ-1/5Л2/5Л-3)	Проце нт площа Ди	[М + Н]	[М + ΝΗ4] ⁺	Основной (ДГ) Фрагмент
21,4	1	эпк/эпк/дгк	0,3	971,7	988,8	643,5, 669,3
21,9	2	дгк/дгк/эпк	4,4	997,8	1014,7	669,5, 695,5
22,4	3	дгк/дгк/дгк	11,6	1023,7	1040,7	695,5
23,3	4	ДГК/АРА/ДГК	0,5	999,6	1016,7	671,4
23,6	5	дгк/дпк/дгк	0,2	1025,9	1042,8	697,5
24,1	6	ДГК/ДГК/АРА	0,7	999,7	1016,8	671,5, 695,5
24,6	7	дгк/дгк/дпк	2,4	1025,7	1042,5	695,5, 697,4
25,3	8	ЭПК/14:0/ДГК	0,3	897,6	914,6	569,4, 595,3
25,9	9	ДГК/ДГК/14:0	2,6	923,7	940,7	595,4, 695,5
27,2	10	ДГК/ДГК/15:0	0,4	937,8	954,7	609,5, 695,5
27,5	11	ЭПК/ЭПК/16:0	0,2	899,5	916,7	597,5, 643,5
28,0	12	ДГК/1б:0/ЭПК	4,7	925,8	942,7	597,4, 623,5, 669,3
28,5	13	ДГК/ДГК/16:0	30,8	951,7	968,7	623,7, 695,5
29,5	14	ДГК/АРА/16:0	0,7	927,6	944,7	599,5, 671,5
29,7	15	ДГК/ДПК/1б:0	0,9	953,7	970,8	625,5, 697,5
30,4	16	ДГК/1б:0/АРА	0,9	927,7	944,6	599,5, 623,5
30,8	17	ДГК/16:0/ДПК	4,5	953,8	970,7	623,4, 625,3
31,1	18	ДГК/18:0/ДГК	1,8	979,7	996,7	651,5
32,3	19	ДГК/14:0/16:0	2,3	851,7	868,7	523,5
33,6	20	ДГК/15:0/16:0	0,8	865,7	882,7	537,4

		ДГК/20:0/ДГК		1007,8	1024,9	679,5
34,9	21	ДГК/16:0/16:0	19,3	879,7	896,7	551,5, 623,5
36,1*	22	ДГК/22:0/ДГК ДГК/18:0/15:0 ДПК/16:0/16:0	0,5	1035.8 893.8 881.8	1052.8 910.8 898.8	707,7 565,5 551,5, 625,4
37,4	23	ДГК/16:0/18:0	3,7	907,7	924,7	579,5, 623,5
38,9	24	16:0/16:0/14:0	0,3	н/д	796,7	523,4, 551,5
40,1	25	тг, Содержащие ДГК	0,4	1117,9	1134,9	789,7
40,8	26	тг, Содержащие ДГК	0,4	1091,9	1108,9	763,7
41,3	27	16:0/16:0/16:0	1,0	н/д	824,6	551,5
42,0	28	ДГК/16:0/22:0	0,2	963,8	980,8	623,3, 635,4
43,5*	29	ДГК/20:0/22:1 16:0/20:0/14:0	0,3	1017,8 835,6	1034.8 852.8	689,7 579,5, 607,5
45,6*	30	ДГК/22:0/22:1	0,7	1045,8	1062,8	717,7
46,3*	31	ДГК/20:0/22:0	0,5	1019,8	1036,9	691,7

Таблица 10

Предварительная идентификация видов ТГ по результатам ХИАД-МС-анализа в образце А2

Время Выхода	Пик №	Предварительная Идентификация (5Л-1/5Л-2/5Л-3)	Процент площади	[М + Н] ⁺	[Μ + ΝΗ4]	(ДГ) Фрагмент
21,4	1	ЭПК/ЭПК/ДГК	0,3	971,7	988,8	643,5, 669,3
21,9	2	дгк/дгк/эпк	4,5	997,8	1014,7	669,5, 695,5
22,3	3	дгк/дгк/дгк	14,0	1023,7	1040,7	695,5
23,3	4	ДГК/АРА/ДГК	0,6	999,6	1016,7	671,4
23,6	5	дгк/дпк/дгк	0,3	1025,9	1042,8	697,5
24,1	6	ДГК/ДГК/АРА	0,9	999,7	1016,8	671,5, 695,5
24,6	7	дгк/дгк/дпк	3,0	1025,7	1042,5	695,5, 697,4
25,4	8	ЭПК/14:0/ДГК	0,2	897,6	914,6	569,4, 595,3
25,9	9	ДГК/ДГК/14:0	2,1	923,7	940,7	595,4, 695,5
27,2	10	ДГК/ДГК/15:0	0,5	937,8	954,7	609,5, 695,5

- 24 030161

27,6	11	ЭПК/ЭПК/16:0	0,2	899,5	916,7	597,5, 643,5
28,1	12	ДГК/16:0/ЭПК	4,2	925,8	942,7	597,4, 623,5, 669,3
28,5	13	ДГК/ДГК/16:0	31,4	951,7	968,7	623,7, 695,5
29,6	14	ДГК/АРА/16:0	0,7	927,6	944,7	599,5, 671,5
29,8	15	ДГК/ДПК/16:0	0,6	953,7	970,8	625,5, 697,5
30,4	16	ДГК/16:0/АРА	0,9	927,7	944,6	599,5, 623,5
30,8	17	ДГК/16:0/ДПК	4,5	953,8	970,7	623,4, 625,3
31,1	18	ДГК/18:0/ДГК	2,2	979,7	996,7	651,5
32,4	19	ДГК/14:0/16:0	1,5	851,7	868,7	523,5
33,6	20	ДГК/15:0/16:0 ДГК/20:0/Д ГК	0,9	865,7 1007,8	882,7 1024,9	537.4 679.5
34,9	21	ДГК/16:0/16:0	16,1	879,7	896,7	551,5, 623,5
36,1*	22	ДГК/22:0/Д ГК ДГК/18:0/15:0 ДПК/16:0/16:0	0,4	1035.8 893.8 881.8	1052.8 910.8 898.8	707,7 565,5 551,5, 625,4
37,3	23	ДГК/16:0/18:0	3,4	907,7	924,7	579,5, 623,5
39,7	24	16:0/16:0/14:0	0,9	н/д	796,7	523,4, 551,5
40,0	25	ТГ, Содержащие ДГК	0,8	1117,9	1134,9	789,7
40,8	26	ТГ, Содержащие ДГК	0,6	1091,9	1108,9	763,7
41,3	27	16:0/16:0/16:0	0,7	н/д	824,6	551,5
42,1	28	ДГК/16:0/22:0	0,3	963,8	980,8	623,3, 635,4
43,5*	29	ДГК/20:0/22:1 16:0/20:0/14:0	0,2	1017,8 835,6	1034.8 852.8	689,7 579,5, 607,5
45,6*	30	ДГК/22:0/22:1	0,8	1045,8	1062,8	717,7
46,3*	31	ДГК/20:0/22:0	0,7	1019,8	1036,9	691,7

Пример 5.

После того как жир экстрагировали из ферментационной среды способом с использованием Рпо1ех, как описано в примере 3, для получения готового жира неочищенный жир подвергали дальнейшей обработке: очищали, обесцвечивали и дезодорировали. Для получения готового коммерческого продукта с содержанием ДГВ примерно 400 мг/г готовый жир разводили с высокомасличным подсолнечным маслом. Выделяли отдельные липидные классы, и для каждого класса определяли профиль жирных кислот методом газовой хромотографии с использованием пламенно-ионизационного детектора (ГХ-ПИД), как метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК).

Р1азН-хроматография.

Р1азН-хроматографию использовали для разделения различных классов липидов в готовом жире и определения весового процента каждого класса, присутствующего в жире. В хроматографической системе использовали 8Шса Ое1 60 (ΕΜΌ СРеш1са1, СлЫшохсп, Ν) и в качестве подвижной фазы - смесь петролейного эфира и этилацетата при скорости потока 3 мл/мин. В ход анализа включали этап градиента для раздельного выхода каждого класса липидов из колонки. Градиент подвижной фазы начинали со 100% петролейного эфира и заканчивали содержанием этилацетата 50% (с последующей промывкой 100%-м метанолом). Фракции собирали в пробирки объемом 10 мл с использованием многообразцового сборника фракций ОПзоп РС 204 (ОПзоп, 1пс., МШ1е1оп, ^1). Каждую пробирку анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), и пробирки, содержащие отдельные липидные классы (о чем судили по появлению единичного пятна на ТСХ-пластинке с ожидаемым значением коэффициента удержания (КГ)), объединяли, концентрировали до полного удаления влаги и взвешивали. Общее содержание фракций позже определяли гравиметрически.

ТСХ-анализ.

Анализ жирных кислот.

Образец готового жира и выделенные классы липидов анализировали для определения состава жирных кислот как МЭЖК. Образцы взвешивали непосредственно в пробирках для анализа с завинчивающимся крышками, и в каждую пробирку добавляли 1 мл раствора внутреннего стандарта С19:0 (N4СНеск, Е1уз1ап, ΜΝ) в толуоле и 2 мл 1,5Н НС1 в метаноле. Пробирки аккуратно перемешивали на вортексе и помещали в нагревательный блок на 2 ч при температуре 100°С. После пробирки вынимали из нагревательного блока, оставляли до остывания и добавляли в пробирки по 1 мл насыщенного водного раствора №С1. Пробирки снова перемешивали на вортексе, центрифугировали, и верхний (органический) слой переносили в пузырьки для ГХ и анализировали методом ГХ-ПИД. Количественный состав МЭЖК определяли используя метод внутренних стандартов с калибровочной кривой из 3 точек, построенной на основе Νιι-СНек-Ргер СРС стандартов (Νιι-СНек Ргер, 1пс., Е1уз1ап, ΜΝ), и предварительно идентифицировали на основании времени выхода. Процент жирных кислот выражен в мг/г и в % от общего количества МЭЖК.

Для анализа образец подготовили путем растворения 250 мг готового жира в 600 мкл гексана и вве- 25 030161

ли его в колонку. По результатам разделения образца с использованием флэш-хроматографии: фракция эфиров стероидных спиртов (ЭСС) составила 1,2 вес.%, фракция триглицеридов (ТГ) составила 92,1 вес.%, фракция свободных жирных кислот (СЖК) составляли 2,1 вес.%, фракция стеролов составила 1,1 вес.% и фракция диглицеридов (ДГ) составила 2,8 вес.% от веса готового жира.

Анализ методом ТСХ объединенных фракций показал, что фракции СЖК и стеролов включали в свой состав ТГ и ДГ соответственно. Общий профиль жирных кислот готового жира ТКЮЬЕХ® и выделенные фракции представлены ниже в табл. 11 и 12 как мг/г и % МЭЖК соответственно.

Таблица 11

Профиль жирных кислот, представленный в виде мг/(г МЭЖК)

	Готовый жир	Эфиры Стероидных Спиртов	ТГ	СЖК	Стерол	ДГ
% вес.	н/д	1,2	92,1	2,1	1,1	2,8
Жирная Кислота	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖ К (мг/г )	МЭЖ К (мг/г )	МЭЖК (мг/г)	МЭЖ К (мг/г )
С12:0*	0,0	0,0	1,0	0,0	1,2	0,6
С14:0*	11,5	5,1	11,3	6,0	9,6	5,7
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С15:0	2,3	0,0	2,3	1,2	2,0	1,9
С16:0*	183,3	80,0	180, 8	99,9	149,3	132, 2
С16:1*	0,0	0,0	0,9	0,0	0,8	0,6
С18:0*	19,6	17,5	19,6	7,5	16,2	6,7
С18:1 N9*	243,3	242,8	249, 6	62,9	190,5	84,0
С18:1 N7	1,9	1,7	2,0	0,8	1,9	0,9
С18:2 N6*	13,8	5,6	13,8	6,2	14,3	9,1
С20:0*	4,3	6,6	4,5	1,5	3,6	1,4
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,3	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,8	0,0	0,8	0,0
С18:4 N3	0,0	0,0	0,7	1,3	0,9	0,4
С20:2 N6*	0,0	0,0	0,6	0,0	0,0	0,0
С20:3 N6	0,0	0,0	0,3	0,0	0,0	0,0
С22:0*	3,3	61,0	3,2	1,1	3,0	1,2
С20:4 N7	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4Ы6*	1,7	0,0	2,3	1,4	1,9	1,3
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	2,4	4,5	3,0	2,2	2,6	1,3
С20:5 N3*	28,1	3,0	27,7	38,6	25,6	43,2
С24:0*	1,4	64,3	1,4	0,0	2,0	1,0
С22:4 N9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С24:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:5 N6*	20,0	7,6	21,0	10,1	17,2	14,4
С22:5 N3*	2,8	0,0	3,1	3,7	3,4	2,9
С22:6 N3*	407,1	72,5	417, 4	443, 6	350,5	428, 5
Общее количество МЭЖК	936,1	572,1	967, 6	688, 0	797,3	737, 3

- 26 030161

Профиль жирных кислот, представленный в процентах от общего количества МЭЖК

Таблица 12

	Готовый жир	Эфиры Стероидны х Спиртов	ТГ	СЖК	Стерол	ДГ
Жирная Кислота	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК
С12:0*	0,0	0,0	0,1	0,0	0,2	0,1
С14:0*	1,2	0,9	1,2	0,9	1,2	0,8
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С15:0	0,2	0,0	0,2	0,2	0,2	0,3
С16:0*	19,6	14,0	18,7	14,5	18,7	17,9
С16:1*	0,0	0,0	0,1	0,0	0,1	0,1
С18:0*	2,1	3,1	2,0	1,1	2,0	0,9
С18:1 N9*	26,0	42,4	25,8	9,1	23,9	11,4
С18:1 N7	0,2	0,3	0,2	0,1	0,2	0,1
С18:2 N6*	1,5	1,0	1,4	0,9	1,8	1,2
С20:0*	0,5	1,1	0,5	0,2	0,5	0,2
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,1	0,0	0,1	0,0
С18:4 N3	0,0	0,0	0,1	0,2	0,1	0,1
С20:2 N6*	0,0	0,0	0,1	0,0	0,0	0,0
С20:3 N6	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:0*	0,4	10,7	0,3	0,2	0,4	0,2
С20:4 N7	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4Ы6*	0,2	0,0	0,2	0,2	0,2	0,2
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	0,3	0,8	0,3	0,3	0,3	0,2
С20:5 N3*	3,0	0,5	2,9	5,6	3,2	5,9
С24:0*	0,2	11,2	0,1	0,0	0,2	0,1
С22:4 N9	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С24:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:5 N6*	2,1	1,3	2,2	1,5	2,2	1,9
С22:5 N3*	0,3	0,0	0,3	0,5	0,4	0,4
С22:6 N3*	43,6	12,7	43,1	64,5	44,0	58,1
Общее количество МЭЖК %	100	100	100	100	100	100

Пример 6.

Анализ триглицеридов (ТГ) в готовом жире, описанном в примере 5, проводили с использованием способов, описанных в пример 4. Проводили предварительную идентификацию каждого остатка жирной кислоты, что представлено ниже в табл. 13 и 14.

Таблица 13

Предварительная идентификация основного вида ТГ

Время Выхода Пика, мин.	Предварительная Идентификация (5Л-1/5Л-2/5Л-3)	Процент площад и

22,0	дгк/дгк/эпк	3,4
22,5	дгк/дгк/дгк	10,4
24,7	дгк/дгк/дпк	2Д
28,2	ДГК/16:0/ЭПК	3,4
28,7	ДГК/16:0/ДГК	23,0
31,0	ДГК/16:0/ДПК	3,3
35,2	ДГК/1б:0/16:0	11,6
37,6	ДГК/16:0/18:0	4,3
40,4	18:1/18:1/18:1	14,0

- 27 030161

Таблица 14

Предварительная идентификация видов ТГ по результатам ХИАД-МС-анализа

Время Выхода	Пик №	Предварительная Идентификация (5Л-1/5Л-2/5Л-3)	Процент площади	[М + Н] ⁺	[М + ΝΗ4] ⁺	(ДП Фрагмент
21,5	1	эпк/эпк/дгк	0,4	971,7	988,7	643,5, 669,5
22,0	2	дгк/дгк/эпк	3,4	997,8	1014,7	669,4, 695,5
22,5	3	дгк/дгк/дгк	10,4	1023,8	1040,7	695,5
23,4	4	ДГК/ДГК/АРА	0,5	999,8	1016,7	671,4, 695,3
23,7	5	дгк/дпк/дгк	0,3	1025,7	1042,7	697,5
24,2	6	ДГК/ДГК/АРА	0,8	999,7	1016,8	671,5,

						695,5
24,7	7	дгк/дгк/дпк	2,1	1025,7	1042,5	695,5, 697,4
25,6	8	ЭПК/14:0/ДГК	0,2	897,7	914,8	569,4, 595,3
26,1	9	ДГК/14:0/ДГК	1,4	923,7	940,7	595,5, 695,5
27,4	10	ДГК/15:О/ДГК	0,3	937,8	954,8	609,3
27,7	11	ЭПК/1б:0/ЭПК	0,2	899,5	916,7	597,5
28,2	12	ДГК/16:0/ЭПК	3,4	925,7	942,7	597,5, 623,4, 669,3
28,7	13	ДГК/16:0/ДГК	23,0	951,7	968,7	623,5, 695,5
29,8	14	ДГК/16:0/АРА	0,5	927,7	944,8	599,5, 623,5
30,0	15	ДГК/16:0/ДПК	0,7	953,8	970,8	623,4, 625,5
30,6	16	ДГК/16:0/АРА	0,8	927,7	944,8	599,5, 623,5
31,0	17	ДГК/16:0/ДПК	3,3	953,7	970,7	623,4, 625,5
31,3	18	ДГК/18:0/ДГК	1,6	979,8	996,8	651,5
32,6	19	ДГК/14:0/16:0	1,6	851,8	868,8	523,5
33,9	20	ДГК/15:0/16:0 ДГК/20:0/ДГК	0,8	865,7 1007,8	882,7 1024,8	537.4 679.5
35,2	21	ДГК/16:0/16:0	11,6	879,7	896,8	551,5, 623,5
36,4	22	ДГК/22-.0/ДГК ДГК/18:0/15:0	0,5	1035.8 893.8	1052.8 910.8	707,7 565,5

		ДПК/1б:0/16:0		881,8	898,8	551,5, 625,4
37,6	23	ДГК/16:0/18:0	4,3	907,8	924,8	579,5, 623,5
40,0	24	ДГК/16:0/20:0	0,8	935,8	952,8	607,6, 623,5
40,4	25	18:1/18:1/18:1	14,0	885,8	902,8	603,5
40,7	26	18:1/16:0/18:1	2,2	859,8	876,8	577,5
41,1	27	ТГ, Содержащие ДГК	1,6	1092,0	1108,8	763,7
42,4	28	ТГ, Содержащие 24:0	0,5	963,8	980,9	594,5
43,0	29	18:1/18:1/18:0	1,9	887,7	904,8	603,6, 605,6
45,9	30	ДГК/22:0/22:1	0,9	1045,9	1062,9	717,6
46,6	31	ДГК/20:0/22:0	0,7	1019,8	1036,8	691,5

Пример 7.

Флакон с инокуляционным материалом, выделенными траустохитридиевыми, депонированными под учетным номером АКТК РТА-9695, в возрасте 2 дня получали путем их культивирования с источниками углерода и азота при концентрации С1^- 980 м.д. (среда для роста траустохитридиевых).

Мутагенез проводили согласно описанной ниже процедуре.

Содержимое двухдневного (Т=2) стерильного флакона объемом примерно 50 мл переносили в стерильный стеклянный гомогенизатор объемом 40 мл. В гомогенизаторе культуру гомогенизировали, поднимая и опуская пестик 50 раз. Культуру отбирали пипеткой и фильтровали через сетчатый фильтр с размером ячеек 50 мкм, фильтрат из которого собирали в стерильные пробирки (сетчатый фильтр использовали как средство, которое удерживает крупные колонии и позволяет пройти через 50-микронную

- 28 030161

сетку небольшим кластерам и одиночным клеткам). Концентрированные мацерированные клетки полностью собирали в стерильные пробирки объемом 50 мл. Мацерированные клетки перемешивали на вортексе и разводили их в пробирках, содержащих среду для роста траустохитридиевых, вплоть до уровня 1:100. Разведенные мацерированные образцы перемешивали на вортексе и после наносили 200 мкл инокулюма на агаризованную среду для роста траустохитридиевых в чашки Петри, 100x15 мм, которые содержали 4-5 стеклянных шариков (стеклянные шарики размером 3 мм). Каждую чашку аккуратно перемешивали для того, чтобы с помощью шариков равномерно распределить инокулюм по всей чашке. Шарики удаляли из чашек, и оставляли закрытые чашки примерно на 5 мин для высыхания. Свет как в стерильном боксе, так и на прилегающих территориях был выключен, таким образом все действия проводили при неярком освещении. В рабочую зону при выполнении процедур поступало небольшое необходимое количество света, но не прямо и небольшой интенсивности.

Пять чашек (повторности) размещали в камере кросслинкера ХЬ (8рес1гои1с8 Согрогайоп, №\у Уогк), в период облучения чашки не были закрыты крышками. Мощность, производимая кросслинкером, выражалась в микродожулях, поэтому опытным путем определили уровень, при котором гибель достигала 90-95%. Пять контрольных чашек, клетки в которых не подвергали мутагенезу, инокулировали по такому же протоколу. Количество клеток, подсчитанное в этих чашках, использовали для расчета % погибших клеток. После завершения процедуры облучения чашки вынимали, закрывали крышками, герметизировали парафином и затем заворачивали в алюминиевую фольгу. Было крайне важно, чтобы чашки росли в темноты в течение первой недели, таким образом клетки не могли восстановить поврежденные гены.

Чашки помещали в комнату при температуре 22,5°С на срок примерно 10 дней, после чего проводили подсчет колоний. После осуществления подсчета отдельные колонии собирали стерильной микробиологической петлей и штрихом засевали в новые чашки со средой для роста траустохитридиевых. Каждую колонию переносили в отдельную чашку. После того как плотность в чашках достигала подходящего уровня, из чашек микробиологической петлей отбирали образец и инокулировали им стерильный флакон для качалки объемом 250 мл, содержащий 50 мл среда для роста траустохитридиевых. Флаконы переносили на качалку при перемешивании 200 об/мин и температуре в комнате 22.5°С. При Т=7 дней культуры из флаконов с качалки собирали и переносили в стерильные пробирки объемом 50 мл. Проводили измерение рН в образцах, клетки осаждали после чего собирали осадок с биомассой. Каждый образец промывали и ресуспендировали в смеси 50:50 изопропилового спирта и дистиллированной воды, после чего клетки повторно осаждали. Полученный осадок сублимировали, взвешивали и проводили анализ МЭЖК. В табл. 15-21 представлены данные о мутантах, полученных после проведения вышеописанного процесса.

Таблица 15

Мутанты, полученные из штамма траустохитридиевых, учетный номер АКТК РТА-9695

Жирные Кислоты	контроль АКТК РТА9695	Мутант 1	Мутант 2	Мутант 3	Мутант 4	Мутант 5	Мутант 8	Мутант 9	Мутант 10
% 08:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 09:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 10:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 12:0	0,10	0,10	0,08	0,08	0,13	0,07	0,11	0,08	0,08
% 12:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 13:0	0,11	0,11	0,17	0,13	0,12	0,18	0,11	0,15	0,14
% 13:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 14:0	1,79	1,85	1,49	1,37	2,36	1,29	1,85	1,72	1,57
% 14:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 15:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 16:0	30,98	28,75	29,96	29,97	30,33	29,86	30,97	30,11	29,20
% 16:1	0,27	0,20	0,31	0,14	0,25	0,27	0,16	0,27	0,24
% 16:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 16:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 17:0	0,12	0,15	0,13	0,17	0,27	0,12	0,16	0,13	0,13

- 29 030161

% 18:0	1,29	1,22	1,38	1,47	1,22	1,57	1,25	1,34	1,34
% 18:1 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:1 п-7	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-6	0,00	0,03	0,00	0,00	0,07	0,00	0,03	0,00	0,00
% 18:3 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:4 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:0	0,39	0,36	0,42	0,45	0,34	0,46	0,37	0,40	0,40
% 20:1 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-3	0,37	0,38	0,32	0,42	0,44	0,32	0,41	0,33	0,36
% 20:4 АРА	0,55	0,55	0,94	0,57	0,80	0,89	0,60	0,73	0,75
% 20:5 п-3 ЭПК	2,62	2,94	3,01	2,40	3,64	2,83	2,54	2,81	2,81
% 22:0	0,08	0,08	0,09	0,09	0,07	0,10	0,07	0,09	0,09
% 22:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:4 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:5 п-6	3,19	3,19	2,94	3,43	3,35	2,87	3,34	3,01	3,15
% 22:5 п-3	0,18	0,18	0,21	0,23	0,20	0,18	0,20	0,17	0,18
% 22:6 п-3 ДГК	56,88	58,63	57,56	57,85	54,87	57,98	56,62	57,53	58,52
% 24:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 24:1	0,00	0,08	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,09	0,00
% Жира	46,83	46,10	31,23	47,39	49,78	30,62	54,71	37,72	37,87
% Неизвестных	0,85	0,46	0,35	0,51	0,51	0,36	0,50	0,38	0,39

Таблица 16

Жирные Кислоты	контро ль АКТК РТА9695	Мутант 11	Мутант 13	Мутант 14	Мутант 15	Мутант 16	Мутант 20	Мутант 21	Мутант 22
% 08:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 09:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 10:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 12:0	0,10	0,10	0,08	0,09	0,11	0,11	0,09	0,09	0,10
% 12:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 13:0	0,11	0,15	0,16	0,14	0,13	0,12	0,17	0,16	0,13
% 13:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 14:0	1,79	1,89	1,43	1,75	1,83	1,98	1,76	1,77	1,81
% 14:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 15:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 16:0	30,98	31,08	30,27	29,92	31,79	30,18	28,84	30,05	30,81
% 16:1	0,27	0,32	0,26	0,28	0,21	0,24	0,23	0,23	0,33
% 16:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 16:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 17:0	0,12	0,24	0,15	0,13	0,15	0,12	0,14	0,16	0,14
% 18:0	1,29	1,36	1,44	1,31	1,36	1,21	1,28	1,34	1,33
% 18:1 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:1 п-7	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-6	0,00	0,05	0,00	0,00	0,00	0,03	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:4 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:0	0,39	0,38	0,42	0,39	0,40	0,37	0,37	0,38	0,38
% 20:1 п-9	0,00	0,00	0,06	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-б	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-3	0,37	0,43	0,36	0,33	0,36	0,37	0,33	0,35	0,34
% 20:4 АРА	0,55	0,79	0,72	0,80	0,64	0,62	0,83	0,73	0,69
% 20:5 п-3 ЭПК	2,62	3,17	2,72	2,97	2,52	2,66	3,03	2,90	2,87
% 22:0	0,08	0,08	0,09	0,08	0,08	0,08	0,08	0,08	0,08

- 30 030161

% 22:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:4 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:5 п-6	3,19	3,25	3,06	2,97	3,07	3,16	2,98	3,01	3,02
% 22:5 п-3	0,18	0,20	0,19	0,17	0,19	0,16	0,17	0,18	0,18
% 22:6 п-3 ДГК	56,88	55,17	57,52	57,63	56,02	57,38	58,58	57,45	56,65
% 24:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 24:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,07	0,00	0,00	0,08
% Жира	46,83	46,19	37,00	38,41	48,46	47,32	37,71	40,23	43,55
% Неизвестны	0,85	0,47	0,39	0,36	0,47	0,44	0,37	0,39	0,38

Таблица 17

Жирные Кислоты	контро ль АКТК РТА9695	Мутант 24	Мутант 26	Мутант 27	Мутант 29	Мутант 30	Мутант 33	Мутант 34	Мутант 35
% 08:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 09:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 10:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 12:0	0,10	0,11	0,09	0,09	0,08	0,08	0,10	0,11	0,09
% 12:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 13:0	0,11	0,12	0,13	0,14	0,16	0,14	0,12	0,12	0,10
% 13:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 14:0	1,79	1,98	1,71	1,69	1,63	1,66	1,93	2,01	1,59
% 14:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 15:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,70	0,54	0,39
% 16:0	30,98	30,61	30,32	30,21	29,70	29,50	30,26	32,28	30,78
% 16:1	0,27	0,19	0,22	0,22	0,26	0,26	0,29	0,26	0,16
% 16:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 16:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 17:0	0,12	0,15	0,18	0,16	0,13	0,13	0,26	0,16	0,12
% 18:0	1,29	1,24	1,31	1,31	1,32	1,30	1,32	1,37	1,34
% 18:1 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,10	0,11	0,09
% 18:1 п-7	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:4 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:0	0,39	0,37	0,39	0,40	0,40	0,39	0,37	0,40	0,40
% 20:1 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,13	0,14
% 20:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-3	0,37	0,38	0,37	0,35	0,35	0,35	0,00	0,00	0,00
% 20:4 АРА	0,55	0,61	0,59	0,69	0,68	0,32	0,34	0,24	0,28
% 20:5 п-3 ЭПК	2,62	2,62	2,70	2,85	2,90	2,91	3,28	2,51	2,59
% 22:0	0,08	0,08	0,08	0,08	0,09	0,08	0,08	0,08	0,08
% 22:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:4 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:5 п-6	3,19	3,10	3,11	3,05	3,10	3,11	3,43	3,26	3,56

% 22:5 п-3	0,18	0,16	0,18	0,19	0,18	0,18	0,18	0,15	0,24
% 22:6 п-3 ДГК	56,88	57,03	57,46	57,46	57,96	58,52	55,92	54,96	56,73
% 24:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 24:1	0,00	0,08	0,00	0,00	0,00	0,00	0,07	0,07	0,07
% Жира	46,83	47,80	43,50	38,86	38,60	38,16	46,95	46,43	51,55
% Неизвестных	0,85	0,45	0,42	0,39	0,37	0,82	1,25	1,23	1,25

- 31

030161

Таблица 18

Жирные Кислоты	контро ль АКТК РТА9695	Мутант 36	Мутант 37	Мутант 38	Мутант 39	Мутант 40	Мутант 42	Мутант 43	Мутант 44
% 08:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 09:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 10:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 12:0	0,10	0,00	0,11	0,00	0,11	0,09	0,08	0,12	0,09
% 12:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 13:0	0,11	0,44	0,09	0,24	0,12	0,11	0,12	0,08	0,15
% 13:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 14:0	1,79	1,25	1,99	1,48	1,96	1,76	1,43	2,17	1,75
% 14:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 15:1	0,00	2,12	0,48	0,71	0,54	0,55	0,36	0,62	0,50
% 16:0	30,98	26,95	28,04	32,28	30,84	30,25	25,77	43,37	30,18
% 16:1	0,27	0,00	0,26	0,23	0,22	0,21	0,10	1,05	0,22
% 16:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 16:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 17:0	0,12	0,95	0,13	0,28	0,16	0,16	0,10	0,26	0,13
% 18:0	1,29	1,58	1,11	1,79	1,30	1,29	1,25	2,21	1,34
% 18:1 п-9	0,00	0,37	0,08	0,25	0,09	0,09	0,12	0,09	0,10
% 18:1 п-7	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,05	0,00
% 18:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-6	0,00	0,00	0,06	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:4 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:0	0,39	0,34	0,31	0,43	0,38	0,39	0,36	0,61	0,40
% 20:1 п-9	0,00	0,00	0,00	0,43	0,00	0,14	0,15	0,15	0,49
% 20:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-3	0,37	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:4 АРА	0,55	0,41	0,31	0,24	0,27	0,24	0,30	0,35	0,23
% 20:5 п-3 ЭПК	2,62	5,36	2,77	4,00	2,72	2,80	3,21	3,47	2,80
% 22:0	0,08	0,00	0,07	0,14	0,07	0,08	0,07	0,14	0,08
% 22:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:4 п-6	0,00	0,00	0,06	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:5 п-6	3,19	2,40	3,94	2,57	3,48	3,29	3,89	2,37	3,33
% 22:5 п-3	0,18	0,00	0,19	0,00	0,17	0,17	0,30	0,33	0,17
% 22:6 п-3 ДГК	56,88	57,52	58,57	54,20	56,24	57,09	60,99	41,61	56,76
% 24:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 24:1	0,00	0,00	0,08	0,00	0,08	0,09	0,08	0,06	0,09
% Жира	46,83	12,73	54,86	18,08	45,74	42,59	42,48	56,44	41,20
% Неизвестных	0,85	0,29	1,36	0,73	1,28	1,20	1,31	0,90	1,20

- 32 030161

Таблица 19

Жирные Кислоты	контро ль АКТК РТА9695	Мутант 45	Мутант 46	Мутант 47	Мутант 48	Мутант 49	Мутант 50	Мутант 51	Мутант 52
% 08:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 09:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 10:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 12:0	0,10	0,10	0,13	0,11	0,07	0,09	0,09	0,09	0,11
% 12:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 13:0	0,11	0,11	0,10	0,09	0,13	0,09	0,13	0,10	0,09
% 13:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 14:0	1,79	1,79	2,07	1,86	1,52	1,62	1,78	1,78	1,85
% 14:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 15:1	0,00	0,41	0,76	0,57	0,46	0,48	0,55	0,53	0,53
% 16:0	30,98	28,79	24,90	30,07	29,07	31,21	30,46	30,79	32,53
% 16:1	0,27	0,19	0,24	0,18	0,17	0,17	0,18	0,21	0,22
% 16:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00

% 16:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 17:0	0,12	0,11	0,24	0,16	0,12	0,14	0,17	0,18	0,15
% 18:0	1,29	1,24	1,07	1,28	1,41	1,43	1,36	1,48	1,35
% 18:1 п-
9	0,00	0,08	0,07	0,09	0,09	0,08	0,10	0,09	0,06
% 18:1 п-
7	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-
6	0,00	0,00	0,12	0,05	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-
3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:4 п-
3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:0	0,39	0,36	0,29	0,37	0,42	0,42	0,39	0,40	0,41
% 20:1 п-
9	0,00	0,15	0,13	0,11	0,24	0,13	0,19	0,16	0,19
% 20:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-
9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-
6	0,00	0,00	0,05	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-
3	0,37	0,00	0,12	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:4
АРА	0,55	0,29	0,65	0,26	0,18	0,21	0,22	0,24	0,24
% 20:5 п-
3 ЭПК	2,62	3,05	4,28	2,66	2,93	2,46	2,71	2,94	2,44
% 22:0	0,08	0,07	0,06	0,07	0,09	0,09	0,08	0,08	0,08
% 22:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:4 п-6	0,00	0,06	0,07	0,05	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:5 п-6	3,19	3,59	4,28	3,46	3,07	3,32	3,17	3,18	3,24
% 22:5 п-3	0,18	0,25	0,27	0,18	0,17	0,17	0,16	0,17	0,17
% 22:6 п-3
ДГК	56,88	57,74	58,32	56,70	58,65	56,45	56,83	56,19	55,06
% 24:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 24:1	0,00	0,07	0,15	0,10	0,10	0,11	0,10	0,10	0,07
% Жира	46,83	48,91	58,95	54,80	35,41	48,60	44,93	43,01	51,93
%
Неизвестны
X	0,85	1,55	1,63	1,57	1,09	1,35	1,31	1,28	1,19

- 33 030161

Таблица 20

Жирные Кислоты	контро ль АКТК РТА9695	Мутант 53	Мутант 54	Мутант 55	Мутант 56	Мутант 57	Мутант 58	Мутант 60	Мутант 61	Мутант 65
% 08:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 09:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 10:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 12:0	0,10	0,09	0,08	0,12	0,08	0,08	0,08	0,08	0,10	0,08
% 12:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 13:0	0,11	0,11	0,12	0,08	0,09	0,13	0,16	0,14	0,09	0,14
% 13:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 14:0	1,79	1,74	1,63	2,13	1,67	1,59	1,59	1,59	1,85	1,58
% 14:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 15:1	0,00	0,53	0,52	0,48	0,51	0,52	0,45	0,50	0,51	0,48
% 16:0	30,98	30,13	29,54	33,01	31,08	29,37	30,65	29,39	31,15	30,03
% 16:1	0,27	0,21	0,23	0,26	0,26	0,14	0,25	0,22	0,26	0,25
% 16:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 16:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 17:0	0,12	0,15	0,14	0,14	0,14	0,16	0,12	0,13	0,14	0,13
% 18:0	1,29	1,30	1,30	1,37	1,38	1,37	1,46	1,30	1,30	1,35
% 18:1 п-9	0,00	0,08	0,08	0,00	0,06	0,11	0,09	0,10	0,07	0,07
% 18:1 п-7	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:4 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:0	0,39	0,38	0,39	0,40	0,42	0,38	0,43	0,39	0,39	0,41
% 20:1 п-9	0,00	0,19	0,16	0,13	0,19	0,20	0,17	0,14	0,13	0,21
% 20:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:3 п-3	0,37	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:4 АРА	0,55	0,25	0,21	0,26	0,22	0,25	0,51	0,20	0,24	0,19
% 20:5 п-3 ЭПК	2,62	2,75	2,78	2,81	2,67	2,78	5,76	2,72	2,59	2,82
% 22:0	0,08	0,08	0,08	0,08	0,09	0,08	0,09	0,08	0,08	0,09
% 22:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:4 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,06	0,00
% 22:5 п-6	3,19	3,47	3,20	3,25	3,19	3,43	2,62	3,30	3,42	3,18
% 22:5 п-3	0,18	0,18	0,18	0,17	0,17	0,20	0,59	0,17	0,17	0,17
% 22:6 п-3 ДГК	56,88	56,99	58,07	54,04	56,38	57,76	54,09	58,21	55,91	57,56
% 24:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 24:1	0,00	0,09	0,09	0,07	0,10	0,09	0,11	0,10	0,07	0,08
% Жира	46,83	45,83	39,59	48,81	41,92	43,97	33,96	36,97	50,40	36,21
% Неизвестны X	0,85	1,28	1,19	1,19	1,29	1,35	0,77	1,24	1,48	1,17

- 34 030161

Таблица 21

Жирны е Кислот ы	контрол АКТК РТА9695	Мутант 66	Мутант 67	Мутант 68 АКТК РТА9696	Мутант 69	Мутант 70 АКТК РТА9697	Мутант 71	Мутант 72 АКТК РТА9698	Мутант 73	Мутант 74
% 08:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 09:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 10:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 11:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 12:0	0,15	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,13	0,00	0,00
% 12:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 13:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 13:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,22	0,00	0,00	0,00
% 14:0	2,42	2,29	2,07	2,09	2,11	2,21	2,27	2,29	1,97	2,05
% 14:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,19	0,00	0,00	0,00
% 15:1	0,55	0,47	0,48	0,47	0,47	0,44	0,46	0,40	0,50	0,47
% 16:0	39,19	31,02	26,20	25,84	27,79	28,14	28,89	33,49	24,50	23,95
% 16:1	0,43	0,19	0,00	0,00	0,00	0,00	0,19	0,21	0,00	0,00
% 16:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 16:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 17:0	0,16	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,13	0,00	0,00
% 18:0	1,67	1,68	1,22	1,22	1,44	1,49	1,51	2,24	1,11	1,02
% 18:1 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:1 п-7	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00

% 18:3 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 18:3 п-3	0,00	0,18	0,20	0,21	0,19	0,17	0,22	0,16	0,22	0,22
% 18:4 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 20:0	0,49	0,41	0,32	0,31	0,35	0,37	0,44	0,52	0,29	0,27
% 20:1 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
20:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
20:3 п-9	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
20:3 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,15	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
20:3 п-3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
20:4 АРА	0,18	0,16	0,33	0,27	0,24	0,37	0,30	0,27	0,38	0,39

35

030161

% 20:5 п-3 ЭПК	1,76	2,30	3,86	3,97	3,32	4,12	3,09	2,74	4,43	4,53
% 22:0	0,33	0,46	0,35	0,44	0,48	0,38	0,43	0,12	0,35	0,34
% 22:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:2	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:3	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
22:4 п-6	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% 22:5 п-б	2,62	2,83	3,17	2,66	2,72	2,95	3,46	2,79	3,17	3,19
% 22:5 п-3	0,18	0,18	0,46	0,42	0,34	0,61	0,25	0,27	0,48	0,57

22:6 п-3 ДГК	49,52	57,01	60,60	61,42	59,74	58,03	55,62	53,06	61,83	62,23
% 24:0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
24:1	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
% Жира	52,70	49,32	48,51	49,49	48,80	53,65	40,38	63,40	48,27	46,63
% Неизве стных	0,35	0,82	0,73	0,66	0,67	0,73	2,46	1,18	0,78	0,76

Пример 8.

Из Американской коллекции типовых культур (АТСС) получили четыре образца траустохитрид, и для каждого образца проанализировали профиль жирных кислот в биомассе, профиль жирных кислот в экстрагированном неочищенном жире, фракцию триглицеридов (ТГ) в неочищенном жире и фракцию полярных липидов (ПЛ) в неочищенном жире. Проанализировали следующие образцы из АКТК: 34304, 20890, 20889 и 20892. Штаммы инокулировали во флаконы для качалки объемом 250 мл, содержащие 50 мл среды следующего состава: 1 г пептона, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г глюкозы в 1 л искусственной морской воды. Культуры инкубировали на шейкере орбитального типа при температуре 20°С с перемешиванием 200 об/мин. После 7 дней культивирования культуры собирали путем центрифугирования (5087хд), промывали смесью вода:изопропанол (1:1) и повторно центрифугировали. Полученный осадок сублимировали. Неочищенный жир экстрагировали из высушенной биомассы методом, описанным в Β1ΐ§Ε апб Г)уег (Сап. Т о£ Вю1. Апб РЕу§. 37: 911-917 (1959)). ТГ и ПЛ выделяли из неочищенного жира, используя метод вариабельности при твердофазной экстракции липидов, разработанный Клюжным с коллегами (Е При Ке§. 26: 135-140 (1959)). Неочищенный жир и выделенные фракции анализировали на содержание ДГК и ЭПК, а также общее содержание жирных кислот (в виде метиловых эфиров жирных кислот).

Экстракция липидов.

Для экстракции неочищенного жира из замороженной высушенной биомассы навеску биомассы в 100-200 мг помещали в пробирки для анализа с завинчивающимися крышками размером 1,5х10 см, добавления в них 8 мл монофазной смеси, состоящей из хлороформа, метанола и воды (СНС1₃:МеОН:Н₂О) в соотношении 1:2:0,8, и гомогенизировали смесь с помощью блока для диспергирования ΡΟΕΥΤΚΟΝ® РТ 3100, оснащенного модулем ΡΤ-ΌΑ 3012/2. Образцы гомогенизировали в течение 2 мин при 10000 об/мин, при этом образцы находились на ледяной бане. Получали двухфазную систему, для этого добавляли 2,1 мл СНО3, перемешивали на вортексе в течение 1 мин, добавляли 1,7 мл Н2О и снова перемешивали на вортексе 1 мин. Нижний (органический) слой отбирали при помощи пипетки Пастера и переносили в флакон-сборник. Оставшийся в пробирке МеОН-Н2О-слой заново экстрагировали 2,1 мл СНС13 еще два раза. Органические слои объединили и высушили под потоком азота.

Твердофазная экстракция.

Фракции ТГ и ПЛ сепарировали из неочищенного жира методом ТФЭ, используя аминопропиловый картридж (ВигФск & 1аск§оп) и Уас Е1и! аппарат. Картридж промывали 5 мл гексана, и от 10 до 20 мг каждого образца, растворенного в 400 мкл СНС13, вносили в картридж. Для элюирования нейтральных липидов колонку промывали 4 мл смеси СНС1₃: изопропиловый спирт (ИПС) в соотношении 2:1, липиды собирали и высушивали под азотом. Затем элюировали жирные кислоты, добавляя 5 мл 2%-ного раствора уксусной кислоты (Еоас) в эфире, жирные кислоты не анализировали. ПЛ элюировали, добавляя 5 мл МеОН, ПЛ собирали и высушивали под азотом. Фракцию нейтральных липидов заново растворяли в 400 мкл гексана и вносили во вторую аминопропиловую колонку, предварительно промытую в 5 мл гексана. Эфиры стероидных спиртов элюировали, добавляя 5 мл 1%-ного этилацетата (ЕЮАс) в гексане, их не

- 36 030161

анализировали. В конце ТГ элюировали, добавляя 5 мл 3%-ного ЕЮАс в гексане, ТГ собирали и высушивали под азотом.

ТСХ-анализ.

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинах на основе силикагеля. Пластины элюировали с использованием растворителя, состоящего из петролейного эфира:этилового эфира:уксусной кислоты (80:20:1), и визуализировали парами йода.

Анализ жирных кислот.

В образцах биомассы, неочищенного жира, выделенных фракций ТГ и ПЛ определяли состав жирных кислот, определяя их как МЭЖК. Образцы взвешивали непосредственно в пробирках для анализа с завинчивающимся крышками и в каждую пробирку добавляли 1 мл раствора внутреннего стандарта С19:0 в толуоле и 2 мл 1,5Н НС1 в метаноле. Пробирки аккуратно перемешивали на вортексе и помещали в нагревательный блок на 2 ч при температуре 100°С. После пробирки вынимали из нагревательного блока, оставляли до остывания и добавляли в пробирки по 1 мл насыщенного водного раствора №С1. Пробирки снова перемешивали на вортексе, центрифугировали, и верхний (органический) слой переносили в пузырьки для ГХ и анализировали методом ГХ-ПИД. Количественный состав МЭЖК определяли, используя метод внутренних стандартов с калибровочной кривой из 3 точек, построенную на основе ΝυСНек-Ргер ОЬС стандартов, и предварительно идентифицировали на основании времени выхода. Процент жирных кислот выражен в мг/г и в % от общего количества МЭЖК.

АТСС 34304.

Содержание липидов в биомассе АТСС 34304 составило 9,1%, что определили как сумму МЭЖК, и количество неочищенного жира, полученного при экстракции растворителем, составило 9,2 вес.%, что составляет 101% от жиров, присутствующих в биомассе. Содержание ЭПК и ДГК, определенное в биомассе, составило 4,8 и 38,7 мг/г соответственно. В экстрагированном неочищенном жире содержание ЭПК составило 25,9 мг/г, а ДГК - 238,7 мг/г. В выделенных ТГ содержание ЭПК составило 13,9 мг/г, ДГК - 303,9 мг/г, в то время как в выделенных ПЛ содержание ЭПК составило 38,7 мг/г, ЭПК - 237,980 мг/г. Общий профиль жирных кислот в биомассе, экстрагированном неочищенном жире, фракции ТГ и фракции ПЛ представлены ниже в табл. 22 и 23, как мг/г и % МЭЖК соответственно.

Таблица 22

Профиль жирных кислот АТСС 34304, представленный в виде мг/г

	Биомасса	Неочищенный жир	ТГ	ПЛ
Жирная Кислота	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)
С12:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С14:0*	1,5	8,5	13,7	1,5
С14:1*	0,0	0,2	0,0	0,0
С15:0	0,0	0,0	0,0	0,0
С16:0*	20,8	138,9	250,8	73,9
С16:1*	0,2	2,9	6,9	0,3
С18:0*	2,1	17,8	45,6	0,8
С18:1 N9*	3,8	29,8	74,2	4,2
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	1,5	12,0	31,0	2,5
С20:0*	0,1	0,7	1,7	0,1
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,1	0,3	0,0
С18:4 N3	0,0	8,5	0,3	0,0
С20:2 N6*	0,1	0,8	2,2	0,0
С20:3 N6	0,0	2,5	6,3	0,5
С22:0*	0,3	5,2	0,3	0,0
С20:4 N7	0,4	2,7	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,6	0,0
С20:4Ы6*	3,4	20,8	20,9	27,5
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	0,1	0,6	1,3	0,3
С20:5 N3*	4,8	25,9	13,9	38,7
С24:0*	0,4	0,2	0,3	0,0
С22:4 N9	0,0	1,2	0,7	0,4
С24:1 N9*	0,9	6,9	18,2	0,8
С22:5 N6*	11,0	60,8	51,9	45,9
С22:5 N3*	0,4	3,1	6,8	1,0
С22:6 N3*	38,7	238,7	303,9	237,9

Общее количество МЭЖК	91,2	590,9	855,7	437,3

- 37 030161

Таблица 23

Профиль жирных кислот АТСС 34304, представленный в процентах от общего количества МЭЖК

	Биомасса	Неочищенный жир	ТГ	ПЛ
Жирная Кислота	% МЭЖК	% МЭЖК	°/о МЭЖК	°/о МЭЖК
С12:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С14:0*	1,7	1,5	1,6	0,4
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,0
С15:0	0,0	0,0	0,0	0,0
С16:0*	22,8	24,2	29,3	16,9
С16:1*	0,2	0,5	0,8	0,1
С18:0*	2,3	3,1	5,3	0,2
С18:1 N9*	4,2	5,2	8,7	1,0
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	1,6	2,1	3,6	0,6
С20:0*	0,1	0,1	0,2	0,0
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:4 N3	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:2 N6*	0,1	0,1	0,3	0,0
С20:3 N6	0,0	0,4	0,7	0,1
С22:0*	0,3	0,9	0,0	0,0
С20:4 N7	0,5	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,1	0,0
020:4Ν6*	3,7	3,4	2,4	6,3
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	0,1	0,1	0,2	0,1
С20:5 N3*	5,3	4,5	1,6	8,8
С24:0*	0,5	0,0	0,0	0,0
С22:4 N9	0,0	0,0	0,1	0,1
С24:1 N9*	1,0	1,2	2,1	0,2
С22:5 N6*	12,1	10,5	6,1	10,5
С22:5 N3*	0,5	0,5	0,8	0,2
С22:6 N3*	42,5	41,5	35,5	54,4

Общее количество МЭЖК %	100,0	100,0	100,0	100,0

АТСС 20890.

Содержание липидов в биомассе АТСС 20890 составило 9,2%, что определили как сумму МЭЖК, и количество неочищенного жира, полученного при экстракции растворителем, составило 10,2 вес.%, что составляет 111% от жиров, присутствующих в биомассе. Содержание ЭПК и ДГК, определенное в биомассе, составило 12,2 и 36,6 мг/г соответственно. В экстрагированном неочищенном жире содержание ЭПК составило 64,7 мг/г, а ДГК - 194,2 мг/г. В выделенных ТГ содержание ЭПК составило 41,9 мг/г, ДГК - 230,2 мг/г, в то время как в выделенных ПЛ содержание ЭПК составило 54,4 мг/г, ЭПК - 149,5 мг/г. Общий профиль жирных кислот в биомассе, экстрагированном неочищенном жире, фракции ТГ и фракции ПЛ представлены ниже в табл. 24 и 25, как мг/г и % МЭЖК соответственно.

- 38 030161

Таблица 24

Профиль жирных кислот АТСС 20890, представленный в виде мг/г

	Биомасса	Неочищенный жир	ТГ	ПЛ
Жирная Кислота	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)
С12:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С14:0*	0,6	5,2	22,6	3,2
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,2
С15:0	0,0	0,0	0,0	0,0
С1б:0*	25,4	161,1	206,1	142,5
С16:1*	0,2	1,3	4,7	0,8
С18:0*	1,8	12,1	58,9	7,1
С18:1 N9*	1,0	9,7	37,6	2,4
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	0,8	4,8	6,9	3,9
С20:0*	0,1	0,0	0,0	0,3
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:4 N3	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:2 N6*	1,9	П,1	14,2	13,1
С20:3 N6	1,0	5,4	2,4	8,0
С22:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0
Ο20:4Ν6*	5,3	33,6	35,8	35,3
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,2	0,0	0,0	1,1
С20:4 N3	0,1	2,2	0,0	3,1
С20:5 N3*	12,2	64,7	41,9	54,4
С24:0*	0,3	0,0	0,0	0,2
С22:4 N9	0,0	0,0	0,0	0,0
С24:1 N9*	0,3	1,4	1,6	1,9
С22:5 N6*	0,5	2,4	1,4	3,0
С22:5 N3*	3,6	19,4	23,9	19,8
С22:б N3*	36,6	194,2	230,2	149,5

Общее количество МЭЖК	92,3	535,1	735,0	450,9

Профиль жирных кислот АТСС 20890, представленный в процентах от общего количества МЭЖК

Таблица 25

	Биомасса	Неочищенный жир	ТГ	ПЛ
Жирная Кислота	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК
С12:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С14:0*	0,7	1,0	3,1	0,7
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,0
С15:0	0,0	0,0	0,0	0,0
С16:0*	27,6	30,1	28,0	31,6
С16:1*	0,2	0,3	0,6	0,2
С18:0*	2,0	2,3	8,0	1,6
С18:1 N9*	1,1	1,8	5,1	0,5
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	0,9	0,9	0,9	0,9

- 39 030161

С20:0*	0,1	0,0	0,0	0,1
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:4 N3	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:2 N6*	2,1	2,1	1,9	2,9
С20:3 N6	1,1	1,0	0,3	1,8
С22:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4Ы6*	5,8	6,3	4,9	7,8
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,2	0,0	0,0	0,3
С20:4 N3	0,1	0,4	0,0	0,7
С20:5 N3*	13,2	12,1	5,7	12,1
С24:0*	0,3	0,0	0,0	0,0
С22:4 N9	0,0	0,0	0,0	0,0
С24:1 N9*	0,3	0,3	0,2	0,4
С22:5 N6*	0,6	0,4	0,2	0,7
С22:5 N3*	3,9	3,6	3,2	4,4
С22:6 N3*	39,7	36,3	31,3	33,2

Общее количество МЭЖК %	100,00	100,0	100,0	100,0

АТСС 20889.

Содержание липидов в биомассе составило 3,3%, что определили как сумму МЭЖК, и количество неочищенного жира, полученного при экстракции растворителем составило 3,4 вес.%, что составляет 103% от жиров, присутствующих в биомассе. Содержание ЭПК и ДГК, определенное в биомассе, составило 2,3 и 16,5 мг/г соответственно. В экстрагированном неочищенном жире содержание ЭПК составило 26,8 мг/г, а ДГК - 205,1 мг/г. В выделенных ТГ содержание ЭПК составило 7,3 мг/г, ДГК - 185,9 мг/г, в то время как в выделенных ПЛ содержание ЭПК составило 35,2 мг/г, ЭПК - 218,6 мг/г. Общий профиль жирных кислот в биомассе, экстрагированном неочищенном жире, фракции ТГ и фракции ПЛ представлены ниже в табл. 26 и 27, как мг/г и % МЭЖК соответственно.

Таблица 26

Профиль жирных кислот АТСС 20889, представленный в виде мг/г

	Биомасса	Неочищенный жир	ТГ	ПЛ
Жирная Кислота	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)
С12:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С14:0*	0,5	8,3	32,0	2,8
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,0
С15:0	0,0	0,0	0,0	0,1
С16:0*	6,6	80,3	150,8	50,4
С16:1*	0,1	1,7	12,3	0,0
С18:0*	0,3	4,8	9,7	1,6
С18:1 N9*	0,6	6,6	7,6	1,2
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	0,0	0,4	1,1	0,1
С20:0*	0,0	0,1	2,1	0,0
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0

- 40 030161

С20:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:4 N3	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:2 N6*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N6	0,0	0,1	0,7	0,1
С22:0*	0,0	0,0	0,1	0,0
С20:4 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0
020:4Ν6*	0,4	1,4	1,1	7,2
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	0,0	0,5	0,9	0,5
С20:5 N3*	2,3	26,8	7,3	35,2
С24:0*	0,1	0,4	1,8	0,0
С22:4 N9	0,0	3,4	0,2	2,8
С24:1 N9*	0,0	0,0	0,8	0,3
С22:5 N6*	5,0	63,6	76,2	45,9
С22:5 N3*	0,2	1,8	2,2	2,0
С22:6 N3*	16,5	205,1	185,9	218,6

Общее количество МЭЖК	32,8	405,2	493,0	368,7

Таблица 27

Профиль жирных кислот АТСС 20889, представленный в процентах от общего количества МЭЖК

	Биомасса	Неочищенный жир	ТГ	ПЛ
Жирная Кислота	°/о МЭЖК	°/о МЭЖК	% МЭЖК	°/о МЭЖК
С12:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С14:0*	1,4	2,0	6,5	0,8
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,0
С15:0	0,0	0,0	0,0	0,0
С16:0*	20,3	19,8	30,6	13,7
С16:1*	0,4	0,4	2,5	0,0
С18:0*	0,8	1,2	2,0	0,4
С18:1 N9*	1,8	1,6	1,5	0,3
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	0,1	0,1	0,2	0,0
С20:0*	0,0	0,0	0,4	0,0
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:4 N3	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:2 N6*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N6	0,0	0,0	0,1	0,0
С22:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4Ы6*	1,3	0,4	0,2	2,0
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	0,1	0,1	0,2	0,1
С20:5 N3*	7,0	6,6	1,5	9,5
С24:0*	0,3	0,1	0,4	0,0
С22:4 N9	0,0	0,8	0,0	0,8
С24:1 N9*	0,0	0,0	0,2	0,1
С22:5 N6*	15,3	15,7	15,5	12,5
С22:5 N3*	0,5	0,5	0,5	0,5
С22:6 N3*	50,2	50,6	37,7	59,3

Общее количество МЭЖК %	100,0	100,0	100,0	100,0

АТСС 20892.

Содержание липидов в биомассе составило 8,8%, что определили как сумму МЭЖК, и количество неочищенного жира, полученного при экстракции растворителем, составило 12,1 вес.%, что составляет 138% от жиров, присутствующих в биомассе. Содержание ЭПК и ДГК, определенное в биомассе, составило 8,3 и 43,3 мг/г соответственно. В экстрагированном неочищенном жире содержание ЭПК составило 50,5 мг/г, а ДГК - 260,1 мг/г. В выделенных ТГ содержание ЭПК составило 98,7 мг/г, ДГК - 407,7 мг/г, в

- 41 030161

то время как в выделенных ПЛ содержание ЭПК составило 50,4 мг/г, ЭПК - 243,12 мг/г. Общий профиль жирных кислот в биомассе, в экстрагированном неочищенном жире, фракции ТГ и фракции ПЛ представлены ниже в табл. 28 и 29, как мг/г и % МЭЖК соответственно.

Таблица 28

Профиль жирных кислот АТСС 20892, представленный в виде мг/г

	Биомасса	Неочищенный жир	ТГ	ПЛ
Жирная Кислота	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)	МЭЖК (мг/г)
С12:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С14:0*	7,3	42,2	29,7	54,7
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,2
С15:0	0,0	0,0	0,0	0,0
С16:0*	18,9	109,0	133,5	116,7
С16:1*	0,0	0,8	3,5	0,2
С18:0*	0,0	2,6	9,1	0,7
С18:1 N9*	0,6	7,3	22,0	1,3
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	0,0	1,4	9,7	0,4
С20:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:4 N3	0,0	0,6	0,0	0,1
С20:2 N6*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N6	0,3	1,1	6,3	0,6
С22:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4Ы6*	1,3	7,6	15,8	7,8
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	0,3	1,5	4,7	1,4
С20:5 N3*	8,3	49,6	97,0	49,8
С24:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:4 N9	0,2	0,0	0,0	0,1
С24:1 N9*	0,0	1,1	4,9	1,0
С22:5 N6*	2,8	16,1	25,3	15,8
С22:5 N3*	1,1	6,6	23,9	6,0
С22:6 N3*	43,4	254,3	398,3	239,5

Общее количество МЭЖК	87,5	508,0	800,7	498,2

Таблица 29

Профиль жирных кислот АТСС 20892, представленный в процентах от общего количества МЭЖК

	Биомасса	Неочищенный жир	ТГ	ПЛ
Жирная Кислота	% МЭЖК	% МЭЖК	% МЭЖК	°/о МЭЖК
С12:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С14:0*	8,3	8,3	3,6	11,0
С14:1*	0,0	0,0	0,0	0,0
С15:0	0,0	0,0	0,0	0,0
С16:0*	21,6	21,4	16,4	23,4
С16:1*	0,0	0,2	0,5	0,0
С18:0*	0,0	0,5	1,1	0,1
С18:1 N9*	0,7	1,4	2,6	0,2
С18:1 N7	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:2 N6*	0,0	0,2	1,1	0,1

- 42 030161

С20:0*	0,0	0,1	0,6	0,0
С18:3 N3*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С18:4 N3	0,0	0,1	0,0	0,0
С20:2 N6*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:3 N6	0,3	0,2	0,7	0,1
С22:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N7	1,9	0,8	1,6	0,2
С20:3 N3	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4Ы6*	1,4	1,5	1,9	1,6
С22:1 N9*	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N5	0,0	0,0	0,0	0,0
С20:4 N3	0,3	0,3	0,5	0,3
С20:5 N3*	9,5	9,7	11,9	10,0
С24:0*	0,0	0,0	0,0	0,0
С22:4 N9	0,2	0,0	0,0	0,0
С24:1 N9*	0,0	0,2	0,5	0,2
С22:5 N6*	3,2	3,1	3,0	3,2
С22:5 N3*	1,3	1,2	2,8	1,2
С22:б N3*	49,6	49,8	49,0	48,0

Общее количество МЭЖК %	100,0	100,0	100,0	100,0

Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в настоящем описании, включены сюда посредством ссылок в таком же ключе, как если бы для каждой отдельной публикации, патента или заявки на патент было специально и индивидуально указано, что она включены сюда посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕОТИДОВ И/ИЛИ АМИНОКИСЛОТ

<110> Эпт, Кирк

Пфайфер III, Джозеф В.

Хансен, Джон Милтон Беренс, Пол Уорен Зиркл, Росс

Шталь, Трейси Линн

<120> ТРАУСТОХИТРИДИЕВЫЕ, КОМПОЗИЦИИ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 2715.003РС00

<140> То Ье аезЬдпей <141> НегешЮК

<160> 5

<170> РаЬепЫп легеьоп 3.3

<210> 1

<211> 1713

<212> ΏΝΑ

<213> ЗсЫ2ОсИуЬг1ит ер.

<400> 1

ассЬддЬЬда	ЬссЬдссадс	ЬдЬсаЬЬЬдс	ЬсдЬсЬаааа	даЬЬаадсса	ЬдсаЬдЬсЬа	60
адЬаЬаааса	ааЬЬаЬасдд	ЬдааасЬдсд	аасддсЬсаЬ	ЬаЬаЬсадЬЬ	аЬадЬЬЬсЬЬ	120
ЬдаЬадЬдЬа	ЬЬЬсЬаЬаЬс	ЬаЬЬЬддаЬа	асЬдЬддсаа	ЬЬсЬададсЬ	аасасаЬдсЬ	180
ЬЬсдадЬддд	асЬЬЬЬЬддЬ	ассасЬдсаЬ	ЬЬаЬЬадаЬЬ	ЬЬдаадссаа	сдЬааааЬЬд	240
дЬдаЬЬсаЬд	аЬаасЬЬЬдс	дааЬсдсадЬ	адсдЬсЬЬдЬ	асдсддсдаЬ	дааЬсаЬЬса	300
адЬЬЬсЬдсс	ссаЬсадсЬд	ЬсдаЬддЬас	ддЬаЬЬддсс	ЬассаЬддсЬ	ЬЬсасдддЬд	360

- 43 030161

асддадааББ	адддБББдаБ	Бссддададд	асдсББдада	дасддсдасс	асаБссаадд	420
ааддсадсад	дсдсдБаааБ	БасссааБдд	ддасБссссд	аддБадБдас	аадаааБааа	480
ааБдаддадс	дсБББдсдББ	БББсааБББд	ааБдададаа	БсдБасааБс	сБсаБсдадд	540
аБсааББдда	дддсаадБсБ	ддБдссадса	дссдсддБаа	сБссадсБсс	ааБадсаааБ	600
аББададББд	ББдсадББаа	ааадсБсдБа	дББдааБББс	сдаБадБсББ	БддссдБдБс	660
сББддБсБсд	БаБсаБдддБ	ББаББдБдсс	аадаБдаБсд	БссБсБаБдд	ББадБдаБад	720
БсаБадБсдБ	ББасБдБааа	аааасБддад	БдБББааадс	аБББсБББдд	даааддБаса	780
БаББадБаБа	ддаБааББад	аБаддассБд	БдаББсББаБ	ББддББддББ	БдБдадБсаБ	840
ддБааБдаББ	ааБадддаса	аБсдддддБа	ББсдааБББа	аББдБсадад	дБдаааББсБ	900
БддаБББаад	ааадБсдаас	БасБдсдаад	дсаБББасса	аддаБдББББ	саББааБааа	960
даасдааадБ	БаддддаБсд	аадаБдаББа	даБассаБсд	БадБсББаас	БдБааасБаБ	1020
дссдасББдс	даББдБссдБ	сдББдБББББ	Бсаааааада	дассБдддса	дсадсасаБд	1080
адаааБсааа	дБББББдддБ	Бссдддддда	дБаБддБсдс	ааддсБдааа	сББаааддаа	1140
ББдасддаад	ддсассасса	ддадБддадс	сБдсддсББа	аББсдасБса	асасдддааа	1200
асББассадд	БссадасаБа	дБааддаББд	асадаББдад	адсБсБББсБ	БдаББсБаБд	1260
ддБддБддБд	саБддссдББ	сББадББддБ	ддадБдаБББ	дБсБддББаа	ББссдББаас	1320
даасдадасс	БсадссБасБ	аааБадБддБ	дсаБаББдБд	адаБаБдБда	саааааБсдс	1380
ББсББададд	дасаБББсдд	дБББассдда	аддаадБББд	аддсааБаас	аддБсБдБда	1440
БдссссБада	БдББсБдддс	сдсасдсдсд	сБасааБдас	адаББсааса	адБссддБад	1500
БддадсББББ	дсББсБсБаБ	БаББасББББ	ссдададдаа	БддББааБсБ	БсБаааБдБс	1560
БдБсдБдаБд	дддсБадаББ	БББдсааББа	ББааБсБсса	асдаддааББ	ссБадБааас	1620
дсаадБсаБс	адсББдсаББ	даББасдБсс	сБдсссБББд	Басасассдс	ссдБсдсасс	1680
БассдаББда	асддБссБаБ	даааБсББсд	даБ			1713
<210> 2 <211> 924 <212> ΌΝΑ <213> 5сЫ2осЬуБг1ит	зр.
<400> 2 аБсдассада	аддаБдссБа	сдБаддддас	даддсдсада	дсаадсдБдд	БдБдсБдасд	60
сБсаадБасс	сдаБсдадса	сддсаБсдБд	ассаасБддд	асдасаБдда	даадаБсБдд	120
саБсасассБ	БсБасаасда	дсБдсдсдБд	дсдсссдадд	адсассссдБ	дсБдсБсасс	180
даддсссссс	Бсаассссаа	ддсдаассдс	дадсдсаБда	сссадаБсаБ	дББсдадасс	240
ББсаасдБдс	сддссаБдБа	сдБсаасаБс	саддссдБдс	БдБсссБдБа	сдсББсдддс	300

- 44 030161

сдсассассд	дсдссдЬдсЬ	сдаЬЬсддда	даЬддсдЬса	сдсасассдЬ	дсссаЬсЬас	360
дадддсЬасд	сдсЬсссдса	сдсддЬдсЬд	сдсаЬсдасс	ЬддсЬддссд	сдассЬдасс	420
дасЬасаЬда	ЬдаадаЬссЬ	дасддадсдс	дддЬасЬсдЬ	Ьсасдасдас	сдссдадсдс	480
даааЬсдЬдс	дсдасаЬсаа	ддадаадсЬд	ЬдсЬасдЬдд	сдсЬсдасЬЬ	сдассаддад	540
аЬдаадасдд	ссдссдадЬс	дЬсдЬсдсЬд	дадаададсЬ	асдадсЬдсс	ддасддсаас	600
дЬдаЬсасда	Ьсддсаасда	дсдсЬЬссдс	Ьдссссдадд	ЬдсЬсЬЬсса	дссдЬсдЬЬс	660
аЬсддсаадд	аддссдссдд	сдЬдсасдад	ассаЬдЬЬсс	адасдаЬсаЬ	даадЬдсдас	720
дЬсдаЬаЬсс	дсааддассЬ	дЬасдссаас	аЬсдЬсаЬдЬ	ссддЬддсЬс	сассаЬдЬас	780
дадддсаЬсд	ссдсдсдссЬ	ддадааддад	аЬддЬдЬсас	ЬддсдсссЬс	сассаЬдаад	840
аЬсааддЬдд	Ьсдсдссссс	сдадсдсаад	ЬасЬсддЬдЬ	ддаЬсддсдд	сЬссаЬссЬд	900
дссЬсдсЬсЬ	ссассЬЬсса	дсаа				924

<210> 3

<211> 291

<212> РКТ

<213> ЗсЫ2осЬуЬг1ит зр.

<400> 3

Уа1 1

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Ьуз 5

Туг

Рго

11е

О1и

НЬз 10

О1у

11е

Уа1

ТЬг

Азп 15

Тгр

Азр

МеЬ

О1и

Ьуз

11е

Тгр

НЬз

ТЬг

РЬе

Туг

Азп

О1и

Ьеи

Агд

20

25

30

Уа1

А1а

Рго

О1и

НЬз

Рго

Уа1

Ьеи

ТЬг

О1и

А1а

Рго

Ьеи

Азп

35

40

45

Рго

Ьуз

А1а

Азп

Агд

О1и

Агд

МеЬ

ТЬг

О1п

11е

МеЬ

РЬе

О1и

ТЬг

РЬе

50

55

60

Азп

Уа1

Рго

А1а

МеЬ

Туг

Уа1

Азп

11е

О1п

А1а

Уа1

Ьеи

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

А1а

Зег

О1у

Агд

ТЬг

О1у

А1а

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

О1у

Азр

О1у

Уа1

85

90

95

ТЬг

НЬз

ТЬг

Уа1

Рго

11е

Туг

О1и

О1у

Туг

А1а

Ьеи

Рго

НЬз

А1а

Уа1

100

105

110

Ьеи

Агд

11е

Азр

Ьеи

А1а

О1у

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

Азр

Туг

МеЬ

Ьуз

115

120

125

- 45 030161

11е

Ьеи 130

ТЬг

О1и Агд

О1у

Туг 135

Зег

РЬе

ТЬг

ТЬг 140

А1а

О1и

Агд

О1и

11е

Уа1

Агд

Азр

11е

Ьуз

О1и

Ьуз

Ьеи

Суз

Туг

Уа1

А1а

Ьеи

Азр

РЬе

145

150

155

160

Азр

Θίη

О1и

МеЬ

Ьуз

ТЬг

А1а

О1и

Зег

Ьеи

О1и

Ьуз

Зег

165

170

175

Туг

О1и

Ьеи

Рго

Азр

О1у

Азп

Уа1

11е

ТЬг

11е

О1у

Азп

О1и

Агд

РЬе

180

185

190

Агд

Суз

Рго

О1и

Уа1

Ьеи

РЬе

Θ1η

Рго

Зег

РЬе

11е

О1у

Ьуз

О1и

А1а

195

200

205

А1а

О1у

Уа1

Н1з

О1и

ТЬг

МеЬ

РЬе

Θ1η

ТЬг

11е

МеЬ

Ьуз

Суз

Азр

Уа1

210

215

220

Азр

11е

Агд

Ьуз

Азр

Ьеи

Туг

А1а

Азп

11е

Уа1

МеЬ

Зег

О1у

Зег

225

230

235

240

ТЬг

МеЬ

Туг

О1и

О1у

11е

А1а

Агд

Ьеи

О1и

Ьуз

О1и

МеЬ

Уа1

Зег

245

250

255

Ьеи

А1а

Рго

Зег

ТЬг

МеЬ

Ьуз

11е

Ьуз

Уа1

А1а

Рго

О1и

Агд

260

265

270

Ьуз

Туг

Зег

Уа1

Тгр

11е

О1у

Зег

11е

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

275 280 285

РЬе Θίη Θίη 290

<210> 4

<211> 918

<212> ΌΝΑ

<213> ЗсЫ2осЬуЬг1ит зр.

<400> 4

даЬсЬдсадс	ЬддадсдсаЬ	саасдЬдЬас	ЬЬсаасдадд	ссасдддсдд	ссдсЬасдЬд	60
ссдсдсдсса	ЬссЬсаЬдда	ссЬддадссс	ддЬасдаЬдд	асЬсЬдЬссд	сдссддсссс	120
ЬЬЬддссадс	ЬсЬЬссдссс	адасаасЬЬс	дЬсЬЬсдддс	адасдддсдс	сддЬаасаас	180
Ьдддссаадд	дссасЬасас	Ьдадддсдсд	дадсЬЬаЬсд	асЬсддЬдсЬ	сдасдЬддЬд	240
сдсааддадд	сададЬсдЬд	сдасЬдссЬд	садддсЬЬсс	адаЬсассса	сЬсдсЬсддс	300
ддсддсасдд	дсЬссддЬаЬ	дддсасдсЬЬ	сЬсаЬсадса	адаЬссдсда	ддадЬасссс	360
дассдсаЬса	ЬдсЬдассЬЬ	сЬссаЬсдЬд	сссЬсдссса	аддЬдЬсдда	сассдЬсдЬд	420

- 46 030161

дадсссДаса	асдсдасдсД	сДсддДдсас	садсДсдДдд	адаасдссда	сдаддДсаДд	480
дДссДсдаса	асдаддсдсД	дДасдасаДс	ДдсДДссдса	ссДДдаадсД	сассасдссс	540
ассДасддсд	ассДсаасса	ссДсдДдДдс	дссдссаДда	дсдддДдсас	дДдсДдссДд	600
сдсДДсссдд	дссадсДсаа	сДсддассДд	сдсаадсДдд	ссдДсаассД	ддДдсссДДД	660
ссдсдссДсс	асДДсДДсаД	даДсддсДДс	ДсдссссДса	ссДсдсдДдд	сДсдсадсад	720
Дассдсдссс	ДдассдДДсс	ддадсДсасд	садсаддсдД	ДДдасдсДаа	даасаДдаДд	780
Ддсдссдссд	асссдсдсса	сддссдсДас	сДдасддсда	сдасдсДсДД	ссдсдддсдс	840
аДдДсдасса	аддаддДдда	сдадсадаДд	сДсаасаДсс	адаасаадаа	сДсдДсдДас	900
ДДДдДсдадД	ддаДсссс					918

<210> 5

<211> 307

<212> РКТ

<213> ЗсЫ2осЬуДг1ит зр.

<400> 5

Азр 1

Азр

Ьеи О1п Ьеи О1и 5

Агд

11е

Азп Уа1 10

Туг

РЬе

Азп

О1и

А1а 15

ТЬг

О1у

Агд

Туг

Уа1

Рго

Агд

А1а

11е

Ьеи

МеД

Азр

Ьеи

О1и

Рго

О1у

20

25

30

ТЬг

МеД

Азр

Зег

Уа1

Агд

А1а

О1у

Рго

РЬе

О1у

О1п

Ьеи

РЬе

Агд

Рго

35

40

45

Азр

Азп

РЬе

Уа1

РЬе

О1у

О1п

ТЬг

О1у

А1а

О1у

Азп

Тгр

А1а

Ьуз

50

55

60

О1у

НЬз

Туг

ТЬг

О1и

О1у

А1а

О1и

Ьеи

11е

Азр

Зег

Уа1

Ьеи

Азр

Уа1

65

70

75

80

Уа1

Агд

Ьуз

О1и

А1а

О1и

Зег

Суз

Азр

Суз

Ьеи

О1п

О1у

РЬе

О1п

11е

85

90

95

ТЬг

НЬз

Зег

Ьеи

О1у

ТЬг

О1у

Зег

О1у

МеД

О1у

ТЬг

Ьеи

100

105

110

11е

Зег

Ьуз

11е

Агд

О1и

Туг

Рго

Азр

Агд

11е

МеД

Ьеи

ТЬг

РЬе

115

120

125

Зег

11е

Уа1

Рго

Зег

Рго

Ьуз

Уа1

Зег

Азр

ТЬг

Уа1

О1и

Рго

Туг

130

135

140

- 47 030161

Азп 145

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Уа1 150

Нгз

О1п

Ьеи

Уа1

О1и Азп А1а Азр 155

О1и

Уа1 160

МеЬ

Уа1

Ьеи

Азр

Азп

О1и

А1а

Ьеи

Туг

Азр

11е

Суз

РЬе

Агд

ТЬг

Ьеи

165

170

175

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Рго

ТЬг

Туг

О1у

Азр

Ьеи

Азп

Нгз

Ьеи

Уа1

Суз

А1а

180

185

190

А1а

МеЬ

Зег

О1у

Суз

ТЬг

Суз

Ьеи

Агд

РЬе

Рго

О1у

О1п

Ьеи

Азп

195

200

205

Зег

Азр

Ьеи

Агд

Ьуз

Ьеи

А1а

Уа1

Азп

Ьеи

Уа1

Рго

РЬе

Рго

Агд

Ьеи

210

215

220

Нгз

РЬе

МеЬ

11е

О1у

РЬе

Зег

Рго

Ьеи

ТЬг

Зег

Агд

О1у

Зег

О1п

225

230

235

240

О1п

Туг

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

О1и

Ьеи

ТЬг

О1п

А1а

РЬе

Азр

245

250

255

А1а

Ьуз

Азп

МеЬ

Суз

А1а

Азр

Рго

Агд

Нгз

О1у

Агд

Туг

Ьеи

260

265

270

ТЬг

А1а

ТЬг

Ьеи

РЬе

Агд

О1у

Агд

МеЬ

Зег

ТЬг

Ьуз

О1и

Уа1

Азр

275

280

285

О1и

О1п

МеЬ

Ьеи

Азп

11е

О1п

Азп

Ьуз

Азп

Зег

Туг

РЬе

Уа1

О1и

290

295

300

Тгр 11е Рго

305

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Микробный жир, который содержит фракцию триглицеридов, составляющую по меньшей мере 70 вес.%, причем содержание докозагексаеновой кислоты в указанной фракции триглицеридов составляет по меньшей мере 50 вес.%, а содержание докозапентаеновой кислоты п-6 в указанной фракции триглицеридов составляет от 0,5 до 6 вес.%.
2. Микробный жир по п.1, дополнительно характеризующийся содержанием арахидоновой кислоты в указанной фракции триглицеридов, составляющим 1,5 вес.% или менее.
3. Микробный жир, который содержит фракцию триглицеридов, составляющую по меньшей мере 70 вес.%, причем содержание докозагексаеновой кислоты в указанной фракции триглицеридов составляет по меньшей мере 40 вес.%, а содержание докозапентаеновой кислоты п-6 в указанной фракции триглицеридов составляет по меньшей мере от 0,5 до 6 вес.%, причем отношение докозагексаеновой кислоты к докозалентаеновой кислоте п-6 выше чем 6:1.
4. Микробный жир, который содержит фракцию триглицеридов, составляющую по меньшей мере 70 вес.%, причем содержание докозагексаеновой кислоты в указанной фракции триглицеридов составляет по меньшей мере 60 вес.%, а содержание докозапентаеновой кислоты п-6 во фракции триглицеридов составляет от 0,5 до 6 вес.%.
5. Микробный жир по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что по меньшей мере 20% триглицеридов в указанной фракции триглицеридов содержат докозагексаеновую кислоту в двух положениях триглицерида, выбранных из любых двух положений 8п-1, §п-2 и 8п-3.

- 48 030161
6. Микробный жир по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что по меньшей мере 5% триглицеридов в указанной фракции триглицеридов содержат докозагексаеновую кислоту во всех трех положениях триглицерида 8п-1, зп-2 и зп-3.
7. Микробный жир по любому из пп.1-4, дополнительно содержащий 5 вес.% или менее гептадекановой кислоты.
8. Микробный жир по любому из пп.1-7, дополнительно содержащий 10 вес.% или менее эйкозапентаеновой кислоты.
9. Микробный жир по любому из пп.1-8, где указанный жир является нерафинированным жиром.
10. Микробный жир по любому из пп.1-8, где указанный жир является рафинированным жиром.
11. Микробный жир по любому из пп.1-8, где указанный жир является разведенным микробным жиром.