KR101861375B1 - 트라우스토키트리드, 지방산 조성물, 및 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

트라우스토키트리드, 지방산 조성물, 및 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분리된 트라우스토키트리드 미생물뿐만 아니라 이의 균주 및 돌연변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생물량, 미생물 오일, 조성물, 배양물, 미생물 오일의 생산 방법, 및 분리된 트라우스토키트리드, 생물량 및 미생물 오일을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

트라우스토키트리드, 지방산 조성물, 및 이의 제조방법 및 용도{THRAUSTOCHYTRIDS, FATTY ACID COMPOSITIONS, AND METHODS OF MAKING AND USES THEREOF}
본 발명은 분리된 트라우스토키트리드(thraustochytrid) 미생물 뿐만 아니라 이의 균주 및 돌연변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 트라우스토키트리드 생물량(biomass), 미생물 오일, 조성물, 배양물, 미생물 오일의 생산방법, 및 분리된 트라우스토키트리드, 생물량, 및 미생물 오일을 사용하는 방법에 관한 것이다.
지방산은 탄소 쇄의 길이 및 포화 특성을 기초로 하여 분류된다. 단쇄 지방산은 일반적으로 12개 이하의 탄소를 가지며, 중쇄 지방산은 일반적으로 14 내지 18개의 탄소를 가지고, 장쇄 지방산은 일반적으로 20개 이상의 탄소를 가진다. 지방산은, 이중 결합이 탄소 원자들 사이에 존재하지 않는 경우 포화 지방산으로 명명되며 이중 결합이 존재하는 경우 불포화 지방산으로 명명된다. 불포화 장쇄 지방산은, 단지 하나의 이중 결합이 존재하는 경우 일불포화되며 하나 이상의 이중 결합이 존재하는 경우 다중불포화된다.
다중불포화 지방산(PUFA)은 지방산의 메틸 말단으로부터 첫번째 이중 결합의 위치를 기초로 하여 분류되며: 오메가-3(n-3) 지방산은 세번째 탄소에서 제1 이중 결합을 함유하는 반면, 오메가-6(n-6) 지방산은 6번째 탄소에서 제1 이중 결합을 함유한다. 예를 들어, 도코사헥사에노산("DHA")은, 쇄 길이가 22개 탄소이고 6개의 이중 결합을 갖는, 흔히 "22:6 n-3"으로 지정되는 오메가-3 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA)이다. 다른 오메가-3 LC-PUFA는 "20:5 n-3"으로 지정된 에이코사펜타에노산("EPA"), 및 "22:5 n-3"으로 지정된 오메가-3 도코사펜타에노산("DPA n-3")을 포함한다. DHA 및 EPA는 "필수" 지방산으로 명명된다. 오메가-6 LC-PUFA는 "20:4 n-6"으로 지정된 아라키돈산("ARA"), 및 "22:5 n-6"으로 지정된 오메가-6 도코사펜타에노산("DPA n-6")을 포함한다.
오메가-3 지방산은 세포막내 이들의 존재로 인하여 세포 생리학에 영향을 미치며, 생물학적 활성 화합물의 생산 및 유전자 발현을 조절하고, 생합성 기질(substrate)로서 제공되는 생물학적으로 중요한 분자이다[참조: Roche, H. M., Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999)]. 예를 들면, 사람 대뇌 피질 속 지질의 약 15% 내지 20%, 망막 속 지질의 30% 내지 60%를 차지하는 DHA는 고환 및 정자 속에서 농축되며, 모유의 중요한 성분이다[참조: Jean-Pascal Berge & Gilles Barnathan, Fatty Acids from Lipids of Marine Organisms: Molecular Biodiversity, Roles as Biomarkers, Biologically Active Compounds, and Economical Aspects, in Marine Biotechnology I 49 (T. Scheper, ed., 2005)]. DHA는 뇌 속 오메가-3 지방산의 97% 이하 및 망막내 오메가-3 지방산의 93% 이하를 차지한다. 또한, DHA는 태아 및 유아 발달 둘 다 뿐만 아니라, 성인에서 인지 기능의 유지에도 필수적이다(상기 문헌 참조). DHA 및 EPA를 포함하는 오메가-3 지방산은 또한 소염 특성을 지닌다[참조: 예를 들면, Id. and Simopoulos, A.P., J. Am. Coll. Nutr. 21: 495-595 (2002)]. 오메가-3 지방산은 사람 체내에서 새로이 합성되지 않으므로, 이들 지방산은 영양원으로부터 기원되어야만 한다.
아마씨유(flaxseed oil) 및 어유(fish oil)는 오메가-3 지방산의 우수한 식이원으로 고려된다. 아마씨유는 EPA, DHA, DPA, 또는 ARA를 함유하지 않지만 오히려 체내에서 EPA를 제조할 수 있도록 하는 구성 요소(building block)인, 리놀렌산(C18:3 n-3)을 함유한다. 그러나, 대사 전환률은, 특히 건강이 악화된 사람들 중에서 느리고 가변적일 수 있다는 증거가 존재한다. 어유는 특수한 종 및 이들의 식이에 따라 지방산 조성의 유형 및 수준이 상당히 변한다. 예를 들어, 양식에 의해 길러낸 어류는 야생의 것보다 더 낮은 수준의 오메가-3 지방산을 갖는 경향이 있다. 더욱이, 어유는 환경 오염 물질을 함유할 위험성을 수반하며 안정성 문제 및 비린내 또는 맛과 관련될 수 있다.
트라우스토키트리드는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목의 미생물이다. 트라우스토키트리드는 스키조키트리움(Schizochytrium) 속의 구성원들을 포함하며 DHA를 포함하는 오메가-3 지방산의 대체 공급원으로서 인식되어 왔다(참조: 미국 특허 제5,130,242호). 이러한 해양 종속영양성 미생물로부터 생산된 오일은 흔히 상응하는 어유 또는 미세조류 오일보다 더 단순한 다중불포화 지방산 프로파일을 갖는다[참조: Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1: 580-587 (1999)]. 트라우스토키트리드 종의 균주는 유기체에 의해 생산된 총 지방산의 높은 퍼센트로 오메가-3 지방산을 생산하는 것으로 보고되어 있다[참조: 미국 특허 제5,130,242호; Huang, J. et al., J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: 605-610 (2001); Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5: 450-457 (2003)]. 그러나, 분리된 트라우스토키트리드는 생산된 LC-PUFA의 동일성 및 양에 있어 다양하여, 일부 앞서 기술된 균주는 바람직하지 않은 수준의 오메가-6 지방산을 가질 수 있고/있거나 배양시 낮은 생산성을 입증할 수 있다. 이에, 높은 생산성 및 바람직한 LC-PUFA 프로파일이 입증된 트라우스토키트리드의 분리가 지속적으로 요구되고 있다.
본 발명은 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드 종의 분리된 트라우스토키트리드 미생물 또는 이로부터 기원한 균주에 관한 것이며, 여기서, 상기 미생물 또는 이로부터 기원한 균주에 의해 생산된 총 지방산은 약 10% 중량% 이하의 에이코사펜타에노산을 포함한다.
본 발명은 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드 종의 특징을 갖는 분리된 트라우스토키트리드 미생물에 관한 것이며, 여기서 상기 미생물 또는 이로부터 기원한 균주에 의해 생산된 총 지방산은 약 10 중량% 이하의 에이코사펜타에노산을 포함한다.
본 발명은 또한 트리글리세라이드 분획을 포함하는, 분리된 트라우스토키트리드 미생물 또는 이로부터 기원한 균주에 관한 것이며, 여기서, 트리글리세라이드 분획중 도코사헥사에노산 함량은 적어도 약 40 중량%이고, 여기서, 트리글리세라이드 분획중 도코사펜타에노산 n-6 함량은 적어도 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량%이며, 여기서, 상기 미생물 또는 이로부터 기원한 균주에 의해 생산된 총 지방산은 약 10 중량% 이하의 에이코사펜타에노산을 포함한다.
본 발명은 또한 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드와 동일한 종의 분리된 트라우스토키트리드 미생물 또는 이로부터 기원한 균주에 관한 것이며, 여기서, 상기 미생물 또는 이로부터 기원한 균주에 의해 생산된 총 지방산은 약 10 중량% 이하의 에이코사펜타에노산을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 분리된 트라우스토키트리드 미생물로부터 기원한 균주는 돌연변이체 균주이다.
본 발명은 또한 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호, 제PTA-9696호, 제PTA-9697호, 또는 제PTA-9698호로 기탁된 분리된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 트라우스토키트리드 미생물 중 어느 하나 또는 이의 혼합물을 포함하는 트라우스토키트리드 생물량에 관한 것이다.
본 발명은 또한 분리된 트라우스토키트리드 생물량에 관한 것이며, 여기서, 생물량의 무수 세포 중량의 적어도 약 50 중량%는 지방산이고, 여기서, 지방산의 적어도 약 50 중량%는 오메가-3 지방산이다. 일부 양태에서, 지방산의 적어도 약 50 중량%는 도코사헥사에노산이다. 본 발명은 또한 분리된 트라우스토키트리드 생물량에 관한 것이며, 여기서, 생물량의 무수 세포 중량의 적어도 약 25 중량%는 도코사헥사에노산이다.
일부 양태에서, 본 발명은 또한 분리된 트라우스토키트리드 생물량에 관한 것이며, 여기서, 지방산의 약 10 중량% 이하는 에이코사펜타에노산이고, 여기서, 도코사헥사에노산 대 에이코사펜타에노산의 중량비는 적어도 약 5:1이다.
일부 양태에서, 본 발명은 또한 분리된 트라우스토키트리드 생물량에 관한 것이며, 여기서, 지방산의 약 1.5 중량% 이하는 아라키돈산이고, 여기서, 도코사헥사에노산 대 아라키돈산의 중량비는 적어도 약 20:1이다.
일부 양태에서, 본 발명은 또한 도코사헥사에노산 및 도코사펜타에노산 n-6을 적어도 약 10:1의 중량비로 포함하는 분리된 트라우스토키트리드 생물량에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 트라우스토키트리드 미생물 중 어느 하나 또는 이의 혼합물을 포함하는 분리된 트라우스토키트리드 배양물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 배양물은 적어도 약 5%의 용존 산소를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 트라우스토키트리드 미생물 중 어느 하나 또는 생물량 또는 이의 혼합물을 포함하는 동물 또는 사람용 식품, 화장품 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 약 70 중량%의 트리글리세라이드 분획을 포함하는 미생물 오일에 관한 것이고, 여기서, 트리글리세라이드 분획중 도코사헥사에노산 함량은 적어도 약 50 중량%이고, 여기서, 트리글리세라이드 분획 중 도코사펜타에노산 n-6 함량은 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량%이다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 또한 약 1.5 중량% 이하의 트리글리세라이드 분획 중 아라키돈산 함량을 포함한다.
본 발명은 또한 적어도 약 70 중량%의 트리글리세라이드 분획을 포함하는 미생물 오일에 관한 것이며, 여기서, 트리글리세라이드 분획 중 도코사헥사에노산 함량은 적어도 약 40 중량%이고, 여기서, 트리글리세라이드 분획 중 도코사펜타에노산 n-6 함량은 적어도 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량%이며, 여기서, 도코사헥사에노산 대 도코사펜타에노산 n-6의 비는 약 6:1 초과이다.
본 발명은 적어도 약 70 중량%의 트리글리세라이드 분획을 포함하는 미생물 오일에 관한 것이며, 여기서, 트리글리세라이드 분획 중 도코사헥사에노산 함량은 적어도 약 60 중량%이다.
일부 양태에서, 미생물 오일 중의 트리글리세라이드 분획 중 트리글리세라이드의 적어도 약 20%는 sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 어느 2개로부터 선택된 트리글리세라이드내 2개 위치에서 도코사헥사에노산을 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일의 트리글리세라이드 분획 중 트리글리세라이드의 적어도 약 5%는 트리글리세라이드의 sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 모든 3개 위치에서 도코사헥사에노산을 함유한다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 또한 약 5 중량% 이하의 헵타데카노산을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 미생물 오일 중 어느 것을 포함하는 동물 또는 사람용 식품, 화장품 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 식품은 영아용 조제분유(infant formula)이다. 일부 양태에서, 영아용 조제분유는 조산아에 적합하다. 일부 양태에서, 식품은 우유, 음료, 치료학적 음료, 영양 음료 또는 이의 배합물이다. 일부 양태에서, 식품은 동물 또는 사람 음식용 첨가제이다. 일부 양태에서, 식품은 영양 보충물이다. 일부 양태에서, 식품은 동물 사료이다. 일부 양태에서, 동물 사료는 양식 사료이다. 일부 양태에서, 동물 사료는 애완 동물 사료, 동물원 동물 사료, 노동 동물(work animal) 사료, 가축 사료, 또는 이의 배합물이다.
본 발명은 또한 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 생산하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은: (a) 본 발명의 분리된 트라우스토키트리드 미생물 중의 어느 하나 또는 이의 혼합물을 배양속에서 성장시켜 생물량을 생산하는 단계; 및 (b) 생물량으로부터 오메가-3 지방산을 포함하는 오일을 추출하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 배양물은 적어도 약 5%의 용존 산소를 포함한다. 일부 양태에서, 배양물 pH는 약 6.5 내지 약 8.5에서 유지된다. 일부 양태에서, 배양 온도는 약 17℃ 내지 약 30℃에서 유지된다. 일부 양태에서, 배양물은 약 5 g/L 내지 약 50 g/L의 글루코즈 농도를 포함한다.
본 발명은 또한 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 생산하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 본 발명의 생물량 중의 어느 하나로부터 오메가-3 지방산을 포함하는 오일을 추출하는 방법을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 헥산 추출법을 사용하여 추출된다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 무용매 추출법을 사용하여 추출된다.
일부 양태에서, 본 발명의 배양물 중 어느 하나의 각각의 리터로부터 분리된 생물량의 무수 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양물의 공급원 및 약 950ppm 내지 약 8500ppm 클로라이드 이온을 포함하는, 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.0의 배양 배지 속에서 약 17℃ 내지 약 30℃로 7일 동안 성장시킨 후 적어도 약 50g이다.
일부 양태에서, 본 발명의 분리된 배양물 중 어느 하나는 탄소, 질소 및 영양물의 공급원 및 약 950ppm 내지 약 8500ppm 클로라이드 이온을 포함하는, 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.0의 배양 배지 속에서 약 17℃ 내지 약 30℃로 7일 동안 성장시킨 후 적어도 약 2 g/L/일의 오메가-3 지방산 생산성을 가진다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 생산된 미생물 오일에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 미생물, 생물량 또는 미생물 오일 중의 어느 하나, 또는 이의 혼합물의, 염증 또는 이와 관련된 증상을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 미생물, 생물량 또는 미생물 오일 중의 어느 하나, 또는 이의 혼합물의, 염증 또는 이와 관련된 증상 치료를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료시 사용하기 위한, 본 발명의 분리된 미생물, 생물량, 또는 미생물 오일 중의 어느 하나, 또는 이의 혼합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 분리된 미생물, 생물량 또는 미생물 오일 중 어느 하나, 또는 이의 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 대상체에게 투여함을 포함하는, 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료가 요구되는 대상체에서 염증 또는 이와 관련된 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 분리된 트라우스토키트리드 미생물, 및 이의 균주 및 돌연변이체, 및 이의 생물량, 미생물 오일, 조성물 및 배양물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 트라우스토키트리드로부터 미생물 오일을 생산하는 방법, 및 트라우스토키트리드, 생물량, 및 미생물 오일을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기술된 트라우스토키트리드는 선행기술의 분리체와 비교하여 고도로 생산성이며 유일한 지방산 프로파일을 생산하고, 높은 수준의 오메가-3 지방산, 특히 높은 수준의 DHA에 의해 부분적으로 특징화된다.
트라우스토키트리드 미생물
본 발명은 이의 돌연변이체, 재조합체, 및 변이체를 포함하는, 분리된 트라우스토키트리드에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 종의 트라우스토키트리드에 관한 것이다. 분리된 트라우스토키트리드는 또한 본원에서 스키조키트리움 아종(Schizochytrium sp.) ATCC 제PTA-9695호로 공지되어 있다. ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호와 관련된 트라우스토키트리드는 2009년 1월 7일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에 기탁되었다.
일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 분리된 트라우스토키트리드 균주에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드와 동일한 종의 분리된 트라우스토키트리드 미생물에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 종의 특징을 갖는 분리된 트라우스토키트리드 또는 이로부터 기원한 균주에 관한 것이다. ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드 종의 특징은 이의 성장 및 표현형 특성(표현형 특성의 예는 형태학적 및 재생 특성을 포함한다), 이의 물리적 및 화학적 특성(무수 중량 및 지질 프로파일과 같은), 및 이의 유전자 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 분리된 트라우스토키트리드는 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드의 실질적으로 동일한 표현형 특성을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명의 분리된 트라우스토키트리드는 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드와 실질적으로 동일한 성장 특성을 갖는다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 트라우스토키트리드의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체에 관한 것이며, 여기서, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체에 의해 생산된 총 지방산은 약 10 중량% 이하의 에이코사펜타에노산을 포함한다. 돌연변이체 균주는 잘 공지된 공정으로 생산할 수 있다. 일반적인 공정은 조사; 고온 처리; 및 돌연변이유발원을 사용한 처리를 포함한다. 변이체 균주는 본원에 기술된 종의 다른 천연적으로 존재하는 분리체 및/또는 아분리체일 수 있다. 재조합체 균주는 외인성 유전자의 발현 또는 외인성 유전자의 기능 또는 발현의 대안을 위해 분자 생물학에서 잘 공지된 어떠한 방법으로도 생산할 수 있다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체, 또는 재조합체 균주는 야생형 균주보다 더 많은 양의, DHA 및/또는 EPA를 포함하는, 오메가-3 지방산을 생산한다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체, 또는 재조합체 균주는 보다 적은 양의 EPA, ARA, DPA n-6, 또는 이의 배합물과 같은 보다 적은 양의 하나 이상의 지방산을 생산한다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체, 또는 재조합체 균주는 야생형 균주보다 배양물 리터당 보다 많은 무수 세포 중량을 생산한다. 이러한 돌연변이체, 변이체, 또는 재조합체 균주는 본 발명의 분리된 트라우스토키트리드로부터 기원한 균주의 예이다.
일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드의 돌연변이체 균주에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 돌연변이체 균주는 ATCC 수탁 번호 제PTA-9696호, 제PTA-9697호, 또는 제PTA-9698호에 기탁된 균주이다. ATCC 수탁 번호 제PTA-9696호, 제PTA-9697호, 및 제PTA-9698호와 관련된 트라우스토키트리드 균주는 2009년 1월 7일자로 부다페스트 조약 하에 미국 버지니아주 20119-2209, 마나사스, 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 기탁 기관인, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁되었다. 이들 기탁된 돌연변이체 균주는 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드의 유도체이다.
일부 양태에서, 이의 돌연변이체, 변이체, 또는 재조합체를 포함하는, 본 발명의 분리된 트라우스토키트리드는 트라우스토키트리드로부터 분리된 하나 이상의 분획 속에 지방산 프로파일을 포함한다. 트라우스토키트리드로부터 분리된 하나 이상의 분획은 총 지방산 분획, 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이의 배합물을 포함한다.
트라우스토키트리드 배양물 및 분리된 트라우스토키트리드 생물량
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 분리된 트라우스토키트리드를 포함하는 배양물에 관한 것이다. 미소식물을 접종하고, 성장시키며 회수하기 위한 다양한 발효 매개변수가 미국 특허 제5,130,242호와 같이, 당해 분야에 공지되어 있다. 트라우스토키트리드의 성장을 위한 어떠한 통상적인 배지도 사용할 수 있다. 액체 또는 고체 배지는 천연 또는 인공 해수를 함유할 수 있다. 탄소원은 글루코즈, 프럭토즈, 크실로즈, 사카로즈, 말토즈, 가용성 전분, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨 및 만니톨을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 폴리펩톤, 맥아 추출물, 고기 추출물, 카사미노산, 옥수수대 액, 유기 질소원, 글루탐산나트륨, 우레아, 무기 질소원, 아세트산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄, 황산나트륨을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 대표적인 배지는 표 1에 나타나 있다.
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일부 양태에서, 배양 배지는 포화수준의 퍼센트로서, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 용존 산소를 포함한다. 일부 양태에서, 배양 배지는 포화수준의 퍼센트로서, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 50%, 또는 약 20% 내지 약 100%의 용존 산소를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 트라우스토키트리드의 분리된 생물량에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 트라우스토키트리드 생물량은 미국 특허 제5,130,242호 및 미국 출원 공개 제2002/0001833호에 기술된 바와 같은 트라우스토키트리드 생물량의 분리를 위한 어떠한 통상의 방법에 의해 수득된 수거된 세포 생물량이다.
일부 양태에서, 배양물의 리터 각각으로부터 분리된 생물량의 무수 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양물의 공급원 및 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 8.5의 배양 배지 속에서 약 17℃ 내지 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후 적어도 약 50g, 적어도 약 60g, 적어도 약 70g, 적어도 약 80g, 적어도 약 100g, 적어도 약 120g, 적어도 약 140g, 적어도 약 160g, 적어도 약 180g, 또는 적어도 약 200g이다. 일부 양태에서, 배양물의 리터 각각으로부터 분리된 생물량의 무수 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양물의 공급원 및 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0 또는 약 pH 8.5의 배양 배지 속에서 약 17℃에서, 약 18℃에서, 약 19℃에서, 약 20℃에서, 약 21℃에서, 약 22℃에서, 약 23℃에서, 약 24℃에서, 약 25℃에서, 약 26℃에서, 약 27℃에서, 약 28℃에서, 약 29℃에서, 또는 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후 적어도 약 50g, 적어도 약 60g, 적어도 약 70g, 적어도 약 80g, 적어도 약 100g, 적어도 약 120g, 적어도 약 140g, 적어도 약 160g, 적어도 약 180g, 또는 적어도 약 200 g이다. 일부 양태에서 배양물의 리터 각각으로부터 분리된 생물량의 무수 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양물의 공급원 및 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 8.5의 배양 배지 속에서 약 17℃ 내지 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후 약 50g 내지 약 200g이다. 일부 양태에서, 배양물의 리터 각각으로부터 분리된 생물량의 무수 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양물의 공급원 및 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 또는 약 pH 8.5의 배양 배지 속에서 약 17℃에서, 약 18℃에서, 약 19℃에서, 약 20℃에서, 약 21℃에서, 약 22℃에서, 약 23℃에서, 약 24℃에서, 약 25℃에서, 약 26℃에서, 약 27℃에서, 약 28℃에서, 약 29℃에서, 또는 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후 약 50g 내지 약 200 g이다.
일부 양태에서, 분리된 트라우스토키트리드 배양은, 탄소, 질소 및 영양물의 공급원 및 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 8.5의 배양 배지 속에서 약 17℃ 내지 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후 오메가-3 지방산 생산성이 적어도 약 2 g/L/일, 적어도 약 4 g/L/일, 또는 적어도 약 8 g/L/일이다. 일부 양태에서, 분리된 트라우스토키트리드 배양은 탄소, 질소 및 영양물의 공급원 및 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 8.5의 배양 배지 속에서 약 17℃ 내지 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후, 오메가-3 지방산 생산성이 약 1 g/L/일 내지 약 20 g/L/일, 약 2 g/L/일 내지 약 15 g/L/일, 약 2 g/L/일 내지 약 10 g/L/일, 약 3 g/L/일 내지 약 10 g/L/일, 또는 약 4 g/L/일 내지 약 9 g/L/일이다.
일부 양태에서, 발효 용적(배양 용적)은 적어도 약 2 리터, 적어도 약 10 리터, 적어도 약 50 리터, 적어도 약 100 리터, 적어도 약 200 리터, 적어도 약 500 리터, 적어도 약 1000 리터, 적어도 약 10,000 리터, 적어도 약 20,000 리터, 적어도 약 50,000 리터, 적어도 약 100,000 리터, 적어도 약 150,000 리터, 적어도 약 200,000 리터, 또는 적어도 약 250,000 리터이다. 일부 양태에서, 발효 용적은 약 2 리터 내지 약 300,000 리터, 약 2 리터, 약 10 리터, 약 50 리터, 약 100 리터, 약 200 리터, 약 500 리터, 약 1000 리터, 약 10,000 리터, 약 20,000 리터, 약 50,000 리터, 약 100,000 리터, 약 150,000 리터, 약 200,000 리터, 약 250,000 리터, 또는 약 300,000 리터이다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 분리된 트라우스토키트리드 생물량에 관한 것이다. 일부 양태에서, 생물량의 무수 세포 중량의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%는 지방산이다. 일부 양태에서, 생물량의 무수 세포 중량의 약 50% 초과, 약 55% 초과 또는 약 60% 초과는 지방산이다. 일부 양태에서, 생물량의 무수 세포 중량의 약 50 중량% 내지 약 60 중량%, 약 50 중량% 내지 약 70 중량%, 약 50 중량% 내지 약 80 중량%, 약 55 중량% 내지 약 70 중량%, 약 55 중량% 내지 약 80 중량%, 약 60 중량% 내지 약 70% 또는 약 60 중량% 내지 약 80 중량%는 지방산이다. 일부 양태에서, 생물량은 지방산을 오메가-3 지방산로서 적어도 약 50 중량%, 적어도 약 60 중량%, 적어도 약 70 중량% 또는 적어도 약 80 중량% 포함한다. 일부 양태에서, 생물량은 지방산을 오메가-3 지방산로서 약 50 중량% 내지 약 60 중량%, 약 50 중량% 내지 약 70 중량%, 약 50 중량% 내지 약 80 중량% 포함한다. 일부 양태에서, 생물량은 지방산을 DHA로서 적어도 약 50 중량%, 적어도 약 55 중량%, 적어도 약 60 중량%, 적어도 약 65 중량%, 적어도 약 70 중량%, 적어도 약 75 중량%, 또는 적어도 약 80 중량% 포함한다. 일부 양태에서, 생물량은 지방산을 DHA로서 약 50 중량% 내지 약 60 중량%, 약 50 중량% 내지 약 70%, 또는 약 50 중량% 내지 약 80 중량% 포함한다. 일부 양태에서, 생물량의 건조 세포 중량의 적어도 약 25 중량%, 적어도 약 30 중량%, 적어도 약 40 중량%, 적어도 약 50 중량%, 또는 적어도 약 60 중량%는 도코사헥사에노산이다. 일부 양태에서, 생물량의 건조 세포 중량의 약 25 중량% 내지 약 65 중량%, 약 25 중량% 내지 약 50 중량%, 약 30 중량% 내지 약 40%, 또는 약 25 중량% 내지 약 35 중량%는 도코사헥사에노산이다. 일부 양태에서, 생물량은 지방산을 EPA로서 약 10 중량% 이하, 약 9 중량% 이하, 약 8 중량% 이하, 약 7 중량% 이하, 약 6 중량% 이하, 약 5 중량% 이하, 약 4 중량% 이하, 약 3 중량% 이하, 약 2 중량% 이하, 또는 약 1 중량% 이하로 포함한다. 일부 양태에서, 생물량은 지방산을 EPA로서 약 1 중량% 내지 약 10 중량%, 약 1 중량% 내지 약 5 중량%, 약 2 중량% 내지 약 5 중량%, 약 3 중량% 내지 약 5%, 또는 약 3 중량% 내지 약 10 중량%로 포함한다. 일부 양태에서, 생물량은 실질적으로 EPA를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 생물량은, DHA 대 EPA의 중량비가 적어도 약 5:1, 적어도 약 7:1, 적어도 약 10:1, 적어도 약 11:1, 적어도 약 14:1, 적어도 약 15:1, 적어도 약 17:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 25:1, 적어도 약 50:1, 또는 적어도 약 100:1이고, 여기서, 생물량은 지방산을 EPA로서 약 10 중량% 이하로 포함한다. 일부 양태에서, 생물량은 지방산을 ARA로서 약 0.1 중량% 내지 0.2 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 0.3 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 0.4 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 0.5 중량%, 또는 약 0.1 중량% 내지 약 1.5 중량%로 포함한다. 일부 양태에서, 생물량은 지방산을 ARA로서 약 1.5 중량% 이하, 약 1 중량% 이하, 약 0.5 중량% 이하, 약 0.4 중량% 이하, 약 0.3 중량% 이하, 약 0.2 중량% 이하, 또는 약 0.1 중량% 이하로 포함한다. 일부 양태에서, 생물량은 실질적으로 ARA를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 생물량은, DHA 대 ARA의 중량비가 적어도 약 20:1, 적어도 약 40:1, 적어도 약 60:1, 적어도 약 80:1, 적어도 약 100:1, 적어도 약 150:1, 적어도 약 200:1, 적어도 약 250:1, 또는 적어도 약 300:1이다. 일부 양태에서, 생물량은 지방산을 DPA n-6으로서 약 0.5 중량% 내지 약 1 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량%, 약 1 중량% 내지 약 5 중량%, 약 1 중량% 내지 약 6 중량%, 약 2 중량% 내지 약 5%, 또는 약 2 중량% 내지 약 6 중량%로 포함한다. 일부 양태에서, 생물량은 지방산을 DPA n-6으로서 약 6 중량% 이하, 약 5 중량% 이하, 약 2 중량% 이하, 약 1 중량% 이하, 또는 약 0.5 중량% 이하로 포함한다. 일부 양태에서, 생물량은 실질적으로 DPA n-6을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 생물량은, DHA 대 DPA n-6의 중량비가 약 6:1 이상, 적어도 약 8:1, 적어도 약 10:1, 적어도 약 15:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 25:1, 적어도 약 50:1, 또는 적어도 약 100:1이다. 일부 양태에서, 생물량은, 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코세노산(20:1 n-9), 및 에루시산(22:1 n-9) 각각을 약 5 중량% 이하, 약 4 중량% 이하, 약 3 중량% 이하, 또는 약 2 중량% 이하로 지닌 지방산을 포함한다.
본 발명의 분리된 생물량의 특징은 외인성으로 도입된 물질보다 분리된 생물량의 내인성 또는 천연의 특성과 관련되어 있다.
미생물 오일
본 발명은 또한 미생물 오일을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 당해 방법은 본 발명의 트라우스토키트리드를 배양물 속에서 성장시켜 생물량을 생산하는 단계 및 생물량으로부터 오메가-3 지방산을 포함하는 오일을 추출하는 단계를 포함한다. 오일은 새로이 수거된 생물량으로부터 추출할 수 있거나 부패를 방지하는 조건하에서 저장된 이미 수거된 생물량으로부터 추출할 수 있다. 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 트라우스토키트리드를 배양하고, 배양물로부터 생물량을 분리하고, 생물량으로부터 미생물 오일을 추출하며, 생물량으로부터 추출된 오일의 지방산 프로파일을 분석할 수 있다(참조: 미국 특허 제5,130,242호).
본 발명은 또한 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 미생물 오일에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 오일은 예를 들면, 추가의 공정없이 미생물의 생물량으로부터 추출된 조 오일; 정제, 표백 및/또는 탈취와 같은 추가의 공정 단계를 사용하여 조 미생물 오일을 처리함으로써 수득된 정제 오일; 조 또는 정제 미생물 오일을 희석하여 수득한 희석 미생물 오일; 또는 예를 들면, 조 또는 정제 미생물 오일을 추가의 정제 방법을 사용하여 처리함으로써 오일 중에 지방산(예를 들면, DHA)의 농도를 증가시켜 수득한 농축 오일을 포함하는, 미생물로부터 기원한 특정 오일일 수 있다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0 중량%, 적어도 약 0.1 중량%, 적어도 약 0.2 중량%, 적어도 약 0.5 중량%, 적어도 약 1 중량%, 적어도 약 1.5 중량%, 적어도 약 2 중량%, 또는 적어도 약 5 중량%의 스테롤 에스테르 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0 중량% 내지 약 1.5 중량%, 약 0 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0 중량% 내지 약 5 중량%, 약 1 중량% 내지 약 1.5 중량%, 약 0.2 중량% 내지 약 1.5 중량%, 약 0.2 중량% 내지 약 2%, 또는 약 0.2 중량% 내지 약 5 중량%의 스테롤 에스테르 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 또는 약 2 중량% 미만의 스테롤 에스테르 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 적어도 약 65 중량%, 적어도 약 70 중량%, 적어도 약 75 중량%, 적어도 약 80 중량%, 적어도 약 85 중량%, 또는 적어도 약 90 중량%의 트리글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 65 중량% 내지 약 95 중량%, 약 75 중량% 내지 약 95 중량%, 또는 약 80 중량% 내지 약 95 중량%, 또는 약 97 중량%, 또는 약 98 중량%의 트리글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 적어도 약 0.5 중량%, 적어도 약 1 중량%, 적어도 약 1.5 중량%, 적어도 약 2 중량%, 적어도 약 2.5 중량%, 또는 적어도 약 5 중량%의 유리 지방산 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.5 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 2.5 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 1.5 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 1 중량%, 약 1 중량% 내지 약 2.5 중량%, 약 1 중량% 내지 약 5 중량%, 약 1.5 중량% 내지 약 2.5 중량%, 약 2 중량% 내지 약 2.5%, 또는 약 2 중량% 내지 약 5 중량%의 유리 지방산 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5 중량% 미만, 약 4 중량% 미만, 약 3 중량% 미만, 약 2 중량%미만, 또는 약 1 중량% 미만의 유리 지방산 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 적어도 약 0.5 중량%, 적어도 약 1 중량%, 적어도 약 1.5 중량%, 적어도 약 2 중량%, 또는 적어도 약 5 중량%의 스테롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.5 중량% 내지 약 1.5 중량%, 약 1 중량% 내지 약 1.5 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 5 중량%, 약 1 중량% 내지 약 2%, 또는 약 1 중량% 내지 약 5 중량%의 스테롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5 중량% 미만, 약 4 중량% 미만, 약 3 중량% 미만, 약 2 중량% 미만 또는 약 1 중량% 미만의 스테롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 적어도 약 1.5 중량%, 적어도 약 2 중량%, 적어도 약 2.5 중량%, 적어도 약 3 중량%, 적어도 약 3.5 중량%, 또는 적어도 약 5 중량%의 디글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 1.5 중량% 내지 약 3 중량%, 약 2 중량% 내지 약 3 중량%, 약 1.5 중량% 내지 약 3.5 중량%, 약 1.5 중량% 내지 약 5 중량%, 약 2.5 중량% 내지 약 3 중량%, 약 2.5 중량% 내지 약 3.5%, 또는 약 2.5 중량% 내지 약 5 중량%의 디글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 오일 중 약 2 중량% 미만, 약 1.5 중량% 미만, 약 1 중량%, 또는 약 0.5 중량% 미만의 불검화물(unsaponifiable)을 포함한다. 트리글리세라이드 분획과 같은 미생물 오일 속에 존재하는 지질 부류는 플래쉬 크로마토그래피로 분리하여 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석할 수 있거나, 당해 분야에 공지된 다른 방법으로 분리하여 분석할 수 있다.
일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 적어도 약 40 중량%, 적어도 약 45 중량%, 적어도 약 50 중량%, 적어도 약 55 중량%, 적어도 약 60 중량%, 적어도 약 65 중량%, 적어도 약 70 중량%, 적어도 약 75 중량%, 또는 적어도 약 80 중량%의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 40 중량% 내지 약 45 중량%, 약 40 중량% 내지 약 50 중량%, 약 40 중량% 내지 약 60 중량%, 약 50 중량% 내지 약 60 중량%, 약 55 중량% 내지 약 60 중량%, 약 40 중량% 내지 약 65 중량%, 약 50 중량% 내지 약 65 중량%, 약 55 중량% 내지 약 65 중량%, 약 40 중량% 내지 약 70 중량%, 약 40 중량% 내지 약 80 중량%, 약 50 중량% 내지 약 80 중량%, 약 55 중량% 내지 약 80 중량%, 약 60 중량% 내지 약 80%, 또는 약 70 중량% 내지 약 80 중량%의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 45 중량% 이하, 약 40 중량% 이하, 약 35 중량% 이하, 약 30 중량% 이하, 약 25 중량% 이하, 약 20 중량% 이하, 약 15 중량% 이하, 또는 약 13 중량% 이하의 DHA를 포함하는 스테롤 에스테르 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 10 중량% 이하, 약 9 중량% 이하, 약 8 중량% 이하, 약 7 중량% 이하, 약 6 중량% 이하, 약 5 중량% 이하, 약 4 중량% 이하, 약 3 중량% 이하, 약 2 중량% 이하, 또는 약 1 중량% 이하의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 2 중량% 내지 약 3 중량%, 약 2 중량% 내지 약 3.5 중량%, 약 2.5 중량% 내지 약 3.5 중량%, 약 2 중량% 내지 약 6 중량%, 약 2.5 중량% 내지 약 6 중량%, 약 3.0 중량% 내지 약 6 중량%, 약 3.5 중량% 내지 약 6 중량%, 약 5 중량% 내지 약 6%, 또는 약 2 중량% 내지 약 10 중량%의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 실질적으로 EPA를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은, DHA 대 EPA의 중량비가 적어도 약 5:1, 적어도 약 7:1, 적어도 약 9:1, 적어도 약 10:1, 적어도 약 15:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 25:1, 적어도 약 30:1, 또는 적어도 약 50:1이며, 여기서, 미생물 오일 및/또는 하나 이상이 이의 분획은 10 중량% 이하의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은, DHA 대 EPA의 중량비가 적어도 약 5:1이지만, 약 20:1 미만이다. 일부 양태에서, DHA 대 EPA의 중량비는 약 5:1 내지 약 18:1, 약 7:1 내지 약 16:1, 또는 약 10:1 내지 약 15:1이다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 0.1 중량% 내지 약 0.25 중량%, 약 0.2 중량% 내지 약 0.25 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 0.5 중량%, 또는 약 0.1 중량% 내지 약 1.5 중량%의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 1.5 중량% 이하, 약 1 중량% 이하, 약 0.5 중량% 이하, 약 0.2 중량% 이하, 또는 약 0.1 중량% 이하의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 실질적으로 ARA를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은, DHA 대 ARA의 중량비가 적어도 약 20:1, 적어도 약 30:1, 적어도 약 35:1, 적어도 약 40:1, 적어도 약 60:1, 적어도 약 80:1, 적어도 약 100:1, 적어도 약 150:1, 적어도 약 200:1, 적어도 약 250:1, 또는 적어도 약 300:1이다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 0.5 중량% 내지 약 1 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 2.5 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 3 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 3.5 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 6 중량%, 약 1 중량% 내지 약 2 중량%, 약 2 중량% 내지 약 3 중량%, 약 2 중량% 내지 약 3.5 중량%, 약 1 중량% 내지 약 2.5 중량%, 약 1 중량% 내지 약 3 중량%, 약 1 중량% 내지 약 3.5 중량%, 약 1 중량% 내지 약 5%, 또는 약 1 중량% 내지 약 6 중량% DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 6 중량% 이하, 약 5 중량% 이하, 약 3 중량% 이하, 약 2.5 중량% 이하, 약 2 중량% 이하, 약 1 중량% 이하, 또는 약 0.5 중량% 이하의 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 실질적으로 DPA n-6을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은, DHA 대 DPA n-6의 중량비가 약 6:1 초과, 적어도 약 8:1, 적어도 약 10:1, 적어도 약 15:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 25:1, 적어도 약 50:1, 또는 적어도 약 100:1이다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5 중량% 이하, 약 4 중량% 이하, 약 3 중량% 이하, 약 2 중량% 이하, 약 1.5 중량% 이하, 약 1 중량% 이하, 또는 약 0.5 중량% 이하의 각각의 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코세노산(20:1 n-9), 및 에루크산(22:1 n-9)을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 스테롤 에스테르 분획, 트리글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5 중량% 이하, 약 4 중량% 이하, 약 3 중량% 이하, 약 2 중량% 이하, 약 1.5 중량% 이하, 또는 약 1 중량% 이하의 헵타데카노산(17:0)을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 하나 이상의 이의 분획은 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.05 중량% 내지 약 3 중량%, 또는 약 0.1 중량% 내지 약 1 중량%의 헵타데카노산을 포함한다.
트리글리세라이드 분자는 3개의 중심 탄소 원자(C sn -1H2R1-C sn -2H2R2-C sn -3H2R3)를 함유함으로서 상이한 위치 이성체의 형성을 허용한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리글리세라이드 분획을 포함하며, 여기서, 트리글리세라이드 분획중 트리글리세라이드의 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%는, HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중의 어느 2개로부터 선택된 트리글리세라이드(이-치환된 DHA)내 2개 위치에서 DHA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리글리세라이드 분획을 포함하며, 여기서, 트리글리세라이드 분획중 트리글리세라이드의 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 40%, 또는 약 30% 내지 약 35%는, HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중의 어느 2개로부터 선택된 트리글리세라이드내 2개 위치에서 DHA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리글리세라이드 분획을 포함하며, 여기서, 트리글리세라이드 분획중 트리글리세라이드의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 또는 적어도 약 20%는, HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치(3-치환된 DHA) 중 모두에서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리글리세라이드 분획을 포함하며, 여기서, 트리글리세라이드 분획중 트리글리세라이드의 약 5 중량% 내지 약 20 중량%, 약 5 중량% 내지 약 15 중량%, 약 10 중량% 내지 약 20%, 또는 약 10 중량% 내지 약 15 중량%는, HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 모두에서 DHA를 포함한다. 대조적으로, 미국 특허 제 6,582,941호에 보고된 TAG 종은 모든 3개 위치에서 DHA를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리글리세라이드 분획을 포함하며, 여기서, 트리글리세라이드 분획중 트리글리세라이드의 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%는, HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 어느 하나로부터 선택된 트리글리세라이드내 하나의 위치에서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리글리세라이드 분획을 포함하며, 여기서, 트리글리세라이드 분획중 트리글리세라이드의 약 50% 내지 약 75%, 약 50% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 65%, 약 60% 내지 약 75%, 약 60% 내지 약 70%, 또는 약 60% 내지 약 65%는, HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 어느 하나로부터 선택된 트리글리세라이드내 하나의 위치에서 DHA를 포함한다.
조성물
본 발명은 또한 본 발명의 트라우스토키트리드, 본 발명의 분리된 생물량, 본 발명의 미생물 오일 또는 이의 조합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 트라우스토키트리드, 생물량 또는 미생물 오일은 또한 어떠한 공지된 기술에 의해서도 조성물의 요건을 기초로 하여 화학적으로 또는 물리적으로 개질되거나 또는 가공될 수 있다.
트라우스토키트리드 세포 또는 생물량은 냉동 건조, 공기 건조, 분무 건조, 터널 건조(tunnel drying), 진공 건조(동결 건조: lyophilization), 또는 유사한 공정을 포함하는 방법에 의해 조성물에서 사용하기 전에 건조시킬 수 있으나, 이에 제한 되지는 않는다. 이와는 달리, 수거하거나 세척한 생물량은 건조하지 않고 조성물 속에 직접 사용할 수 있다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,130,242호 및 제6,812,009호).
본 발명의 미생물 오일은 DHA와 같은 지방산 속에 강화된 생성물을 더 효율적으로 생산하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 미생물 오일은 증류 또는 우레아 첨가와 같은, 당해 분야에 공지된 각종의 정제 기술에 적용시켜 보다 높은 농도의 DHA 또는 다른 지방산을 갖는 보다 높은 효능의 생성물을 생산할 수 있다. 본 발명의 미생물 오일은 또한 DHA 또는 다른 지방 산의 에스테르 및 염과 같은, 오일내 지방산으로부터 기원한 화합물을 생산하기 위한 화학 반응에 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "부형제"는 식품 및 약제, 화장품 및 산업용 조성물을 포함하는 조성물에 바람직한 특성을 제공하기 위해 본 발명의 조성물에 사용된, 성분 또는 성분들의 혼합물을 말한다. 본 발명의 부형제는 약제학적 조성물에 첨가되는 경우 "약제학적으로 허용되는" 부형제로 기술될 수 있으며, 이는, 부형제가 이상적인 이익/위험 비에 적합한 바람직한 접촉 기간에 걸쳐 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제가 많은 합병증없이 사람 및 동물의 조직과 접촉하기에 적합한 온전한 의학적 판단 영역내에 있는 화합물, 물질, 조성물, 염 및/또는 투여형태임을 의미한다. 일부 양태에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물 및 보다 특히 사람에서 사용하기 위한 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인지된 국제 약전에 나열되거나 연방 또는 주 정부의 감독 기관에 의해 승인됨을 의미한다. 각종 부형제가 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 부형제는 알칼리제, 안정화제, 항산화제, 부착제, 분리제, 피복제, 외부 상 성분, 방출 조절 성분, 용매, 표면활성제, 습윤제, 완충제, 충전제, 진정제 또는 이의 조합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기술된 것 외에, 부형제는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2005)]에 나열되어 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본원의 특수 분류(예를 들면, "용매")에서 부형제의 포함은 부형제의 역할을 제한하는 것이 아니라 설명하는 것으로 의도된다. 특수 부형제는 다중 분류내에 속할 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품 생성물, 약제학적 조성물, 화장품 및 산업용 조성물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 조성물은 식료품이다. 식료품은 동물 또는 사람 소비용의 임의의 식품이며, 고체 및 액체 조성물을 포함한다. 식료품은 동물 또는 사람 식품에 대한 첨가제일 수 있다. 식료품은 일반적인 식품; 우유, 음료, 치료학적 음료, 및 영양 음료를 포함하는 액체 제품; 기능성 식품; 보충물; 기능 식품; 조산아용 분유를 포함하는 조제분유; 임신 또는 수유모용 식품; 성인용 식품; 노인용 식품; 및 동물 식품을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 본 발명의 트라우스토키트리드, 생물량, 또는 미생물 오일은 직접 사용되거나 오일, 쇼트닝(shortening), 스프레드(spread), 다른 지방 성분, 음료, 소스, 낙농 또는 대두 식품(예를 들면, 우유, 요구르트, 치즈 및 아이스크림), 구운 제품, 영양 제품, 예를 들면, 영양 보충물(캅셀 또는 정제형)로서, 비타민 보충물, 식이 보충물, 분말 음료, 가공 또는 반-가공 분말 식료품, 및 이의 조합물 중의 하나 이상 속에 첨가제로서 포함될 수 있다.
본 발명의 미생물 오일을 포함할 수 있는 조성물의 부분 목록은 대두계 제품(우유, 아이스크림, 요구르트, 음료, 크림, 스프레드, 분말 크림(whitener); 수프 및 수프 혼합물; 도우(dough), 배터(batter) 및, 예를 들면, 빵 제품(bakery ware), 아침식사용 시리얼, 케익, 치즈케익, 파이, 컵케익, 쿠키, 바(bar), 빵, 롤, 비스킷, 머핀, 페스트리, 스콘(scone), 크루톤(crouton), 크래커, 감미 제품, 스낵 케익, 파이, 그래놀라(granola)/스낵 바 및 토우스트 페스트리를 포함하는 구운 식품 항목; 사탕; 단단한 과자류; 쵸콜렛 및 다른 과자류; 츄잉검; 액체 식료품, 예를 들면, 우유, 열량 음료, 조제 분유, 탄산음료, 차, 액상 식사(liquid meal), 과일 쥬스, 과일계 음료, 야채-계 음료; 다중비타민 시럽, 식사 대용품, 의료용 식품 및 시럽; 분말 음료 혼합물; 파스타; 가공된 어류 제품; 가공된 고기 제품; 가공된 가금류 제품; 그래비(gravy) 및 소스; 조미료(케찹, 마요네스 등); 야채 오일-계 스프레드; 유제품; 요구르트; 버터; 냉동 유제품; 아이스크림; 냉동 디저트; 냉동 요구르트; 유아 식품과 같은 반-고체 식료품; 푸딩 및 젤라틴 디저트; 가공된 및 가공되지 않는 치즈; 팬케익 믹스; 열량 바를 포함하는 식품 바; 와플 믹스; 샐러드 드레싱; 대체란 믹스(replacement egg mix); 견과 및 견과-계 스프레드; 감자칩 및 기타 칩 또는 크리스프(crisp), 옥수수 칩, 토틸라 칩(tortilla chip), 압출된 스넥, 팝콘, 프레첼(pretzel), 감자 크리스프 및 견과와 같은 소금가미된 스낵; 딥(dips), 건조 과일 스낵, 고기 스낵, 돼지껍질 스낵(pork rinds), 건강 식품 바 및 쌀/옥수수 케익과 같은 특수 스낵을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 본 발명의 미생물 오일은 조제 분유를 보충하는데 사용될 수 있다. 조제 분유는 본 발명의 미생물 오일을 단독으로 또는 아라키돈산(ARA)-생산 미생물로부터 기원한 물리적으로 정제된 오일과 함께 보충시킬 수 있다. ARA-생산 미생물은, 예를 들면, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) 또는 모르티에렐라 종파 슈무크케리(Mortierella sect. schmuckeri)이다. 이와는 달리, 조제 분유는 본 발명의 미생물 오일을, 아라스코(ARASCO: 등록상표)[제조원: 마르텍 바이오사이언시스(Martek Biosciences), 미들랜드 콜롬비아 소재]를 포함하는, ARA가 풍부한 오일과 함께 보충할 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 동물 사료이다. "동물"은 동물계에 속하는 특정의 비-사람 유기체를 의미하며, 수생 동물 및 육상 동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 용어 "동물 사료" 또는 "동물 식품"은, 어류; 시판 어류; 관상 어류; 어류 유충; 쌍각류; 연체동물; 갑각류; 패류; 새우; 새우 유충; 아르테미아(artemia); 담륜충(rotifer); 브라인 새우(brine shrimp); 여과 섭식동물; 양서류; 파충류; 포유류; 사육동물; 농장 동물; 동물원 동물; 스포츠 동물; 종계(breeding stock); 경주용 동물; 쇼 동물(show animal); 보존 동물(heirloom animal); 희귀 동물 또는 멸종위기 동물; 애완동물, 예를 들면, 개, 고양이, 기니아 피크, 토끼, 랫트, 마우스 또는 말; 원숭이[예를 들면, 세부스(cebus), 레서스(rhesus), 아프리카 녹색(African green), 파타스(patas), 시노몰구스(cynomolgus), 및 세르코피테쿠스(cercopithecus)], 유인원, 우랑우탄, 개코원숭이, 긴팔원숭이, 및 침팬지와 같은 영장류; 개 및 늑대와 같은 개과 동물; 고양이, 사자 및 호랑이와 같은 고양이과; 말, 당나귀 및 얼룩말과 같은 말과; 암소, 소, 돼지 및 양과 같은 식용 동물; 사슴 및 기린과 같은 유제류; 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아 피그와 같은 설치류 등에 상관없이, 비-사람 동물에 의도된 특정 식품을 말한다. 동물 식품은 양식 사료, 애완동물 사료, 동물원 동물 사료, 노동 동물 사료, 가축 동물 사료 또는 이의 조합을 포함하는 사육 동물 사료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 조성물은, 이의 고기 또는 생산물이 사람에 의해 소비되는 특정 동물, 예를 들면, 고기, 알 또는 우유가 이로부터 사람 소비용으로 기원되는 특정 동물용 사료 또는 사료 보충물이다. 이러한 동물에게 공급되는 경우, LC-PUFA와 같은 영양물이 고기, 우유, 알 또는 이러한 동물의 다른 생산물에 혼입되어 이들 영양분들의 함량을 증가시킬 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 동물성 플랑크톤, 아르테미아(artemia), 담륜충, 및 여과 섭식 동물에 의한 소비용으로 적합한 크기의 입자를 형성하기 위해 부서질 수 있는 분무-건조시킨 물질이다. 일부 양태에서, 조성물에 의해 공급된 동물성 플랑크톤, 아르테미아 또는 담륜충은 최종적으로 어류 유충, 어류, 조개류, 쌍각류 또는 갑각류에게 공급된다.
일부 양태에서, 조정물은 약제학적 조성물이다. 적합한 약제학적 조성물은 소염 조성물, 관상동맥심질환의 치료용 약물, 동맥경화증의 치료용 약물, 화학치료제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항-우울증제, 항경련제, 항-헬리코박터 필로리 약물, 신경변성 질환의 치료용 약물, 변성 간 질환의 치료용 약물, 항생제, 콜레스테롤 강하 조성물, 및 트리글리세라이드 강하 조성물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 조성물은 의학 식품이다. 의학 식품은 조성물 속에서 주치의의 감독하에 외부적으로 소모되거나 투여되고 인지된 과학 원리를 기초로 하여, 명백한 영양 요건이 의학적 평가에 의해 확립되는 조건의 특수한 식이 조절을 위해 의도된 식품을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 투여형태 속에 제형화될 수 있다. 투여형태는 유효량의 미생물 오일을 포함하는 액제, 현탁제, 유제 및 무수 분말을 포함하나, 이에 제한되지 않는 정제, 캅셀제, 카쉐제(cachet), 펠렛, 환제, 산제 및 과립제 및 비경구적 투여형태를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 제형이 또한 약제학적으로 허용되는 희석제, 충전제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 표면활성제, 소수성 비히클, 수용성 비히클, 유화제, 완충제, 습윤제, 습윤화제, 가용화제, 방부제 등을 함유할 수 있음은 당해 분야에 또한 공지되어 있다. 투여 형태는 미생물 오일 및 하나 이상의 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 정제, 당의제(dragee), 캅셀제, 캐플렛(caplet), 및 환제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
경구 투여를 위해, 미생물 오일은 당해 분야에 잘 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합할 수 있다. 이러한 담체는, 본 발명의 미생물 오일을 치료할 대상체가 경구 섭취하기 위한 정제, 환제, 당의제, 캅셀제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제 등과 같이 제형되되도록 할 수 있다. 일부 양태에서, 투여형태는 정제, 환제 또는 카플렛이다. 경구용의 약제학적 제제는 고체 부형체를 첨가하고, 수득되는 혼합물을 임의로 분쇄하고, 경우에 따라, 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의제 코어를 수득함으로써 수득할 수 있다. 적합한 부형제는 락토즈, 슈크로즈, 만니톨 및 소르비톨을 포함하나, 이에 제한되지 않는 슈가와 같은 충전제; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 셀룰로즈 제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 필요에 따라, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가(agar), 또는 알긴산 또는 알긴산나트륨과 같은 이의 염과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 붕해제를 가할 수 있다. 경구적으로 사용될 수 있는 약제학적 제제는 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏 캅셀(push-fit capsule), 및 또한 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제로 제조된 연질의 밀봉된 젤라틴 캅셀을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 조성물은 화장품이다. 화장품은 유제, 크림제, 로션제, 차폐제, 비누, 샴푸, 세척액, 화장 크림(facial cream), 컨디셔너(conditioner), 메이크업(make-up), 목욕 제제, 및 분산 액체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 화장 제제는 의약이거나 의약이 아닐 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 산업용 조성물이다. 일부 양태에서, 조성물은 하나 이상의 제제(manufacture)용 출발 물질이다. 제제는 중합체; 사진 광민감성 물질; 세제; 산업용 오일; 또는 산업용 세제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 미국 특허 제7,259,006호는 베헨산의 생산 및 베헨산을 사용한 사진 민감성 물질의 생산을 위한 DHA-함유 지방 및 오일의 용도를 기술하고 있다.
조성물의 사용 방법
일부 양태에서, 조성물은 사람 또는 동물에서의 증상 치료에 사용될 수 있다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치(measure) 둘 다를 말하며, 여기서, 이의 목적은 바람직하지 않는 생리학적 증상, 질병 또는 질환을 방지하거나 서서히 강하(경감)시키거나, 또는 유리하거나 바람직한 임상 결과를 수득하기 위한 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유리하거나 바람직한 임상 결과는 증상, 질병 또는 질환과 관련된 징후 또는 전조의 완화; 증상, 질병 또는 질환의 정도의 축소; 증상, 질병 또는 질환의 안정화(즉, 증상, 질병 또는 질환이 악화되지 않는 경우); 증상, 질병 또는 질환의 발병 또는 진행의 지연; 증상, 질병 또는 질환의 개량; 증상, 질병 또는 질환의 차도(부분적이거나 전체적인 것에 상관없이 및 검출가능하거나 검출가능하지 않는 것에 상관없이); 또는 증상, 질병 또는 질환의 향상 또는 개선을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 치료는 과도한 부작용 없이 임상적으로 상당한 반응을 끌어내는 것을 포함한다. 치료는 또한 치료를 받지 않는 경우 예측 수명과 비교하여 연장된 생존을 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 여드름, 급성 염증, 나이 관련 황반병, 알레르기, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 관절염, 천식, 죽상경화증, 자가면역병, 혈중지질 질환, 낭성 질환(breast cyst), 악액질, 암, 심장 재협착, 심혈관병, 만성 염증, 관상심질환, 낭성섬유증, 간의 변성 질환, 당뇨병, 습진, 위장 질환, 심장병, 고 트리글리세라이드 수준, 고혈압, 과다활동, 면역질환, 억제성 종양 성장, 염증 증상, 장 질환, 신장 기능장애, 백혈병, 주요 우울증, 다발경화증, 신경변성질환, 골관절염, 골다공증, 퍼옥시말 질환(peroxisomal disorder), 자간전증, 조기분만, 건선, 폐질환 류마티스 관절염, 심장병의 위험 또는 혈전증과 같은 증상, 질병 또는 질환을 치료하는데 사용된다.
일부 양태에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 임신 후기에서 임신 기간을 증가시킨다.
일부 양태에서, 조성물은 혈압을 조절하는데 사용된다.
일부 양태에서, 조성물은 인지 기능을 개선시키거나 유지하는데 사용된다.
일부 양태에서, 조성물은 기억을 개선시키거나 유지하는데 사용된다.
조성물 또는 투여형태는 대상체의 체내에 조성물 또는 투여형태와 혼화성인 어떠한 경로로도 투여할 수 있다. 물질이 대상체에 의해 대상체의 신체내로 도입되는 경우, 또는 다른 사람, 기계 또는 장치가 물질을 대상체의 체내로 도입하는 경우 "투여"되는 것으로 고려된다. 따라서, "투여하는"은 예를 들면, 자가-투여, 다른 것에 의한 투여 및 간접 투여를 포함한다. "투여"와 관련하여 본원에 사용된 것으로서, 용어 "연속" 또는 "연이은"은, 투여 횟수가 매일 적어도 1회임을 의미한다. 그러나, 투여 횟수는 매일 1회보다 클 수 있으며 여전히 '연속" 또는 "연이은", 예를 들면, 본원에 규정된 투여 수준을 초과하지 않는 한, 매일 2회 또는 심지어 3회 이상일 수 있다. 투여 수단 및 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 숙련가들은 각종의 안내용 약리학적 문헌을 참조할 수 있다. 예를 들면, "Modern Pharmaceutics," Banker & Rhodes, Informa Healthcare, USA, 4th ed. (2002); and "Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics," McGraw-Hill Companies, Inc., New York, 10th ed. (2001)을 참고할 수 있다.
"대상체", "개인" 또는 "환자'는, 진단, 예후 또는 치료요법이 요구되는 사람 또는 비-사람에 상관없는 특정 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 사람; 사육 동물; 농장 동물; 동물원 동물; 스포츠 동물; 애완 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스 또는 말; 영장류, 예를 들면, 원숭이(예를 들면, 세부스, 레서스(rhesus), 아프리카 녹색, 파타스, 시노몰구스, 및 세르코피테쿠스), 유인원, 우랑우탄, 개코원숭이, 긴팔원숭이, 및 침팬지와 같은 영장류; 개 및 늑대와 같은 개과 동물; 고양이, 사자 및 호랑이와 같은 고양이과; 말, 당나귀 및 얼룩말과 같은 말과; 암소, 소, 돼지 및 양과 같은 식용 동물; 사슴 및 기린과 같은 유제류; 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아 피그와 같은 설치류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 용어 대상체는 또한 모델 동물, 예를 들면, 질병 모델 동물을 포함한다. 일부 양태에서, 용어 대상체는 경제적으로 또는 이와는 달리 예를 들면, 경제적으로 중요한 종축, 경주용 동물, 쇼 동물, 국보 동물, 희귀 또는 멸종위기 동물, 또는 반려동물을 포함한다. 특정 양태에서, 대상체는 사람 대상체이다. 특정 양태에서, 대상체는 비-사람 대상체이다.
조성물은 "치료학적 유효량", "예방학적 유효량", "치료학적 투여량" 또는 "예방학적 투여량"으로서 투여될 수 있다. "치료학적 유효량" 또는 "치료학적 투여량"은 바람직한 치료 효과를 달성하기에 효과적인 양, 필수적인 용량 및 기간을 말한다. 치료학적 결과는 예를 들면, 징후의 감소, 연장된 생존, 개선된 이동성 등일 수 있다. 치료학적 결과는 "치유"일 필요는 없다. "예방학적 유효량" 또는 "예방학적 투여량"은 바람직한 예방학적 결과를 달성하기에 효과적인 양, 필수적인 용량 및 기간을 말한다. 통상적으로, 예방학적 투여량은 질병의 조기 단계 이전에 또는 조기 단계에 대상체에서 사용되므로, 예방학적 유효량은 질병의 진전된 단계의 치료를 위한 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
약제학적 조성물의 각종 용량은 대상체에게 투여될 트라우스토키트리드, 생물량 또는 미생물 오일의 DHA 또는 다른 지방산 성분의 양을 기초로 하여, 대상체에게 투여될 수 있다. 용어 "1일 투여량(dosage)", "1일 투여량 수준", 및 "1일 투여량(dosage amount)"은 본원에서 1일당(24시간 주기 당) 투여된 DHA 또는 다른 지방산 성분의 총량을 말한다. 따라서, 예를 들어, 2 mg의 1일 용량에서 대상체에게 DHA를 투여하는 것은, DHA가 2 mg의 DHA를 포함하는 단일 투여형태로서, 또는 이와는 달리 0.5　mg의 DHA 각각을 포함하는 4회 투여형태(총 2 mg의 DHA)로서 투여되는 것에 상관없이, 대상체가 1일 기초로 총 2 mg의 DHA를 제공받음을 의미한다. 일부 양태에서, DHA의 1일 양은 단일 투여형태, 또는 2회 투여형태로 투여된다. 본 발명의 투여형태는 단일 적용 또는 다중 적용으로 취해질 수 있다. 예를 들어, 4개의 정제를 매일 섭취하는 경우, 0.5 mg의 DHA를 포함하는 각각의 정제에 이어 모두 4개의 정제를 매1일 1회 섭취할 수 있거나, 2개의 정제를 1일 2회 섭취할 수 있거나, 1개의 정제를 매 6시간마다 섭취할 수 있다. 일부 양태에서, 1일 용량은 약 100 mg 내지 약 15 g의 DHA이다. 일부 양태에서, 1일 용량은 약 100 mg 내지 약 250 mg, 약 100 mg 내지 약 500 mg, 약 100 mg 내지 약 1 g, 약 1 g 내지 약 2.5 g, 약 1 g 내지 약 5 g, 약 1 g 내지 약 10 g, 약 1 g 내지 약 15 g, 약 5 g 내지 약 10 g, 약 5 g 내지 약 15 g, 약 10 g 내지 약 15 g, 약 100 mg 내지 약 10 g, 약 100 mg 내지 약 5 g, 또는 약 100 mg 내지 약 2.5 g이다.
본 발명의 조성물 또는 투여형태의 투여는 각종 섭생을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서, 투여는 매일 연속일로, 또는 이와는 달리 격일마다(2일마다) 수행한다. 투여는 하루 이상의 날들 동안 수행할 수 있다.
조성물 및 투여형태의 투여는 증상의 치료를 위해 사용된 다른 섭생과 조합시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 식이 섭생(예를 들면, 저 탄수화물 식이, 고 단백질 식이, 고 섬유 식이 등), 연습 섭생, 체중 감소 섭생, 금연 섭생 또는 이의 조합을 결합시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 증상의 치료시 다른 약제학적 제품과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 투여형태는 다른 섭생 또는 약제학적 제품의 투여 전 또는 후에 투여할 수 있다.
조성물을 포함하는 키트
본 발명은 또한 본 발명의 조성물의 하나 이상의 단위를 함유하는 키트 또는 포장에 관한 것이다. 키트 또는 포장은 본 발명의 트라우스토키트리드, 생물량 또는 미생물 오일, 또는 이의 조합을 포함하는 식품, 약제학적 조성물, 화장품 또는 산업용 조성물의 단위를 포함할 수 있다. 키트 또는 포장은 또한 식품, 화장품, 약제학적 조성물 또는 산업용 조성물의 제조를 위한 본 발명의 트라우스토키트리드, 생물량 또는 미생물 오일, 또는 이의 조합을 포함하는 첨가물을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 키트 또는 포장은 본 발명의 방법에 따라 투여될 약제학적 조성물의 하나 이상의 단위를 함유한다. 키트 또는 포장은 하나의 용량 단위 또는 하나 이상의 용량 단위(즉, 다중 용량 단위)를 함유할 수 있다. 다중 용량 단위가 키트 또는 포장 속에 존재하는 경우, 다중 용량 단위는 순차적인 투여를 위해 임의로 정렬될 수 있다.
본 발명의 키트는 임의로 키트의 단위 또는 투여형태와 관련된 지시사항을 함유할 수 있다. 이러한 지시사항은 약제학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 감독하는 정부 기관에 의해 규정된 형태일 수 있으며, 이러한 주의사항은 증상 또는 질환을 치료하기 위해 사람 투여용으로 제조, 사용 또는 판매 대리인에 의한 승인을 반영한다. 지시사항은 본 발명의 방법에 따른 키트내 단위 또는 투여형태의 사용에 있어서 정보를 전달하는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 지시사항은 인쇄물의 형태, 또는 앞서 기록된 의학 장치의 형태일 수 있다.
환자의 시험 과정 중에, 의학 전문의는 본 발명의 방법 중 하나의 투여가 환자에게 적절한지를 측정할 수 있거나, 주치의는, 환자의 증상이 본 발명의 방법 중 하나의 투여에 의해 개선될 수 있는지를 측정할 수 있다. 특정 섭생을 기술하기 전에, 주치의는 환자와 예를 들면, 섭생과 관련된 각종 위험 및 이점에 대해 조언할 수 있다. 환자는 섭생과 관련된 모든 공지되고 예측된 위험의 완전한 기술내용을 제공받을 수 있다. 이러한 조언과정은 구두로, 및 인쇄물로 제공될 수 있다. 일부 양태에서, 주치의는 환자에게 제품 정보, 교육 자료 등과 같은 섭생에 대한 문헌 자료를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 치료 방법에 대해 소비자를 교육시키는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 투여형태을 판매 시점에 소비자 정보로 분배함을 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 분배는 약사 또는 건강관리 제공자의 판매 시점에 수행할 것이다.
용어 "소비자 정보"는 영문 교재, 비-영문 교재, 시각적 정보, 도표, 전화 기록물, 웹사이트 및 실시간 소비자 서비스 대표자에 대한 접근을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 소비자 정보는 본 발명의 방법에 따른 투여형태의 사용, 적절한 연령 사용, 지표, 부작용, 적절한 투여량, 경고문, 웹사이트 주소의 전화번호에 대한 지시사항을 제공할 것이다. 일부 양태에서, 당해 방법은 본 발명의 방법에 따라 기재된 섭생의 사용에 관한 소비자 질문에 답하는 위치에 있는 관계자에 대한 전문 정보를 제공함을 추가로 포함한다. 용어 "전문 정보"는 의학적으로 전문적이어서 소비자 질문에 답할 수 있도록 설계된 본 발명의 방법에 따라 투여된 경우 섭생에 관한 정보를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"의학적 전문(의)"은 예를 들면, 의사, 의사 보조자, 간호원, 약사 및 소비자 서비스 대표자를 포함한다.
본 발명에 일반적으로 기술되어 있지만, 본원에 제공된 실시예를 참조로 하여 추가의 이해를 수득할 수 있다. 이들 실시예는 단지 설명할 목적이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
높은 생산성 및 바람직한 LC-PUFA 프로파일이 입증된 트라우스토키트리드의 분리 및 이의 균주 및 돌연변이체를 통한 생물량, 미생물 오일, 조성물, 배양물, 미생물 오일의 생산, 및 분리된 트라우스토키트리드, 생물량 및 미생물 오일을 사용이 가능하다.
실시예 1
ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 분리된 트라우스토키트리드는 분류학 범주로 특징화되었다.
시료를 간조 동안 조간대 해안 서식지(intertidal habitat)로부터 수집하였다. 물, 침전물, 살아있는 식물 물질 및 부패하는 식물/동물 부스러기를 멸균 50 ml의 튜브 속에 두었다. 각각의 시료 중 일부를 물과 함께 분리 배지의 고체 한천 플레이트 위에 펼쳤다. 분리 배지는 500 ml의 인공 해수, 500 ml의 멸균수, 1 g의 글루코즈, 1 g의 글리세롤, 13 g의 한천, 1 g의 글루타메이트, 0.5 g의 효모 추출물, 0.5 g의 카제인 가수분해물, 1 ml의 비타민 용액(100 mg/L 티아민, 0.5 mg/L 바이오틴, 0.5 mg B12), 1 ml의 미량 광물 용액(PII 금속, 리터당 함유량: 6.0 g의 FeCl36H2O, 6.84 g의 H3BO3, 0.86 g의 MnCl24H2O, 0.06 g의 ZnCl2, 0.026 g의 CoCl26H20, 0.052 g의 NiSO4H2O, 0.002 g의 CuSO45H2O 및 0.005 g의 Na2MoO42H2O), 및 500 mg의 페니실린 G 및 스트렙토마이신 설페이트 각각으로 이루어졌다. 한천 플레이트를 암실에서 20 내지 25℃로 항온처리하엿다. 2 내지 4일 후, 한천 플레이트를 확대하여 시험하고, 세포의 콜로니를 멸균 이쑤시개로 집어서 새로운 배지 플레이트 위에 재스트리킹(restreaking)하였다. 오염된 유기체가 제거될 때까지 세포를 반복적으로 새로운 배지 위해 스트리킹하였다.
한천 플레이트로부터의 콜로니를 페트리 디쉬(petri dish)에 1/2 농도의 해수 및 오토클레이브시켜 새로이 부화된 브라인 새우 유충의 (1 ml)의 현탁액을 이동시켰다. 브라인 새우 유충은 2 내지 3일 후에 포자낭의 군집으로 심하게 과성장하기 시작하였다. 방출된 유주자(zoospore)는 석방시 쌍편모이며, 성숙한 포자낭으로부터 활발하게 유영하며, 포자낭의 벽 나머지는 포자가 방출된 후 명백히 가시적이다(위상차에 있어서). 포자낭은, 직경이 12.5 ㎛ 내지 25 ㎛이고, 유주자는, 크기가 2.5 ㎛ 내지 2.8 ㎛ x 4.5 ㎛ 내지 4.8 ㎛이다. 개개의 포자낭 당 8 내지 24개의 포자가 존재하였다. 정착된 유주자는 확대되어 신속하게 이분열하여 4개, 8개 및 최종적으로 포자낭의 군집으로 된다. 4개 형성은 포자낭의 성숙 전 매우 조기 단계에서 시작되었다. 이러한 특징은 스키조키트리움과 일치한다.
ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 분리된 트라우스토키트리드는 공지된 종의 것에 대한 이의 18s rRNA 유전자의 유사성을 기초로 추가로 특성화되었다. ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드로부터의 총 게놈 DNA는 표준 과정으로 제조하고(참조: Sambrook J. and Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) 18s RNA 유전자의 PCR 증폭을 위해 사용하였다. 18s rRNA 유전자의 PCR 증폭은 앞서 기술된 프라이머로 수행하였다[참조: Honda et. al., J. Eukaryot. Microbiol. 46(6) 1999]. 염색체 DNA 주형을 사용한 PCR 조건은 다음과 같았다: 50 μL의 총 용적 중 0.2 μM dNTP, 0.1 μM의 각각의 프라이머, 8% DMSO, 200 ng 염색체 DNA, 2.5 U PfuUltra(등록상표) II 융합 HS DNA 폴리머라제[제조원: 스트라타젠(Stratagene)], 및 1X PfuUltra(등록상표) 완충액(제조원: 스트라타젠). PCR 프로토콜은 다음 단계를 포함하였다: (1) 95℃에서 2분; (2) 95℃에서 45초; (3) 55℃에서 30초; (4) 72℃에서 2분; (5) 2 내지 4 단계를 40 주기 동안 반복; (6) 72℃에서 5분; 및 (7) 6℃로 유지.
PCR 증폭으로 위에서 기술한 염색체 주형을 사용하여 예측된 크기를 갖는 명백한 DNA 생성물을 수득하였다. PCR 생성물을 제조업자의 지시에 따라 벡터 pJET1.2/blunt[제조원: 페르멘타스(Fermentas)]내로 클로닝하고, 삽입 서열을 공급된 표준 프라이머를 사용하여 측정하였다.
표 2는 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드로부터의 18s rRNA 서열을 생명과학 정보를 위한 국립 기관(National Center for Biotechnology Information: NCBI)의 전자 데이타베이스에서의 DNA 서열과의 비교를 나타낸다. 요약하면, "동질성 %"는 DNA 정렬을 위한 표준인, VectorNTI 프로그램의 "AlignX" 프로그램(제조원: 인비트로겐)내 점수매김 매트릭스 "swgapdnamt"로 측정하였다. "범위(Coverage) %"는 NCBI 전자 데이타베이스로부터의 기본 국부 배열 조사 도구(Basic Local Alignment Search Tool: BLAST) 계산의 결과로부터 취하였으며 정렬된 분절내 포함된 의문 길이(query length)의 퍼센트이다.
Figure 112014026218817-pct00038
표 2에 나타낸 바와 같이, 동질성 %의 측면에서, ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드로부터의 18s rRNA 유전자 서열(서열 번호 1)은 문헌[참조: Honda, D. et al., J. Euk. Micro. 46(6): 637-647 (1999)]에서 제공된 트라우스토키트리움 아그레가툼(T. aggregatum)의 18s rRNA 유전자 서열과 비록 동일하지 않지만, 밀접하게 관련되어 있다. 트라우스토키트리움 아그레가툼(Thraustochytrium aggregatum)에 대해 발표된 18s rRNA 서열은 서열의 중간에 대략 71개 DNA 뉴클레오타이드 갭을 갖는 부분 서열이다. 범위 %의 측면에서, 본 발명의 분리체의 18s rRNA 유전자 서열은 트라우스토키트리움 아그레가툼 보다 스키조키트리움 아종 ATCC 20888과 더 밀접하게 관련되어 있다.
액틴 및 베타-투불린과 같은 고도로 보존된 단백질은 유기체들 사이에 계통발생적 관계를 평가하기 위한 마커로서 18s rRNA 유전자와 함께, 광범위하게 사용되어 왔다[참조: Baldauf, S. M. Am. Nat. 154, S178 (1999)]. ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드로부터의 총 게놈 DNA를 또한 액틴 및 베타-투불린 유전자 둘다의 PCR 증폭용 주형으로 사용하였다. PCR 증폭은 트라우스토키트리움 아그레가툼으로부터의 액틴 및 베타-투불린 DNA 서열로부터의 보전된 영역에 대해 설계된 프라이머를 사용하여 수행하였다.
염색체 DNA 주형을 사용한 PCR 조건은 다음과 같았다: 50 μM의 총 용적 중 0.2 μM dNTP, 0.1 μM의 각각의 프라이머, 8% DMSO, 200 ng 염색체 DNA, 2.5 U 헤르쿨라제(Herculase: 등록상표) II 융합 DNA 폴리머라제(제조원: 스트라타젠), 및 1X 헤르쿨라제(등록상표) 완충액(제조원: 스트라타제). PCR 프로토콜은 다음 단계들을 포함하였다: (1) 95℃에서 2분; (2) 95℃에서 30초; (3) 55℃에서 30초; (4) 72℃에서 2분; (5) 2 내지 4 단계를 40 주기 동안 반복; (6) 72℃에서 5분; 및 (7) 6℃에서 유지.
PCR 증폭으로 위에서 기술한 염색체 주형을 사용하여 예측된 크기를 갖는 명백한 DNA 생성물을 수득하였다. 각각의 PCR 생성물을 제조업자의 지시에 따라 벡터 pJET1.2/blunt(제조원: 페르멘타스)내로 클로닝하고, 각각의 삽입 서열을 공급된 표준 프라이머를 사용하여 측정하였다.
표 3은 공공의 데이타베이스에서 이용가능한 액틴 서열과 비교하여 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드로부터의 액틴 아미노산 사열(서열 번호 3)에 대한 동질성을 나타낸다. 동질성은 단백질 정렬에 대한 표준물인 VectorNTI 프로그램의 "AlignX" 프로그램내 점수매김 매트릭스 "blosum62mt2"의 사용을 통해 측정하였다.
Figure 112011081484214-pct00003
표 4는 공공의 데이타베이스에서 이용가능한 베타-투부린 서열과 비교하여 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드로부터의 베타-투불린 아미노산 서열(서열 번호 5)에 대한 동질성을 나타낸다. 동질성은 단백질 정렬에 대한 표준물인 VectorNTI 프로그램의 "AlignX" 프로그램내 점수매김 매트릭스 "blosum62mt2"의 사용을 통해 측정하였다.
Figure 112014026218817-pct00039
상기 특성화를 기초로 하여, ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 분리된 트라우스토키트리드는 새로운 스키조키트리움 종을 나타내는 것으로 여겨지므로 또한 스키조키트리움 아종 ATCC 제PTA-9695호로 지정한다.
실시예 2
ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 분리된 트라우스토키트리드는 하기 기술된 바와 같이 다양한 배양 조건하에서 높은 수준의 세포 성장을 생산하였다. 대표적인 배지 및 배양 조건은 표 1에 나타낸다. 또한, 지방산과 DHA의 높은 수준이 관측되었다(즉, 무수 세포 중량의 50 중량% 이상은 지방산이었고 지방산 메틸 에스테르의 50 중량% 이상은 DHA이었다.).
22.5℃에서 8200 ppm Cl-와 pH 7.0에서 20%의 용존 산소를 지닌 탄소 및 질소-공급된 배양물 속에서, 분리체는 7일 배양 후 지방산 함량이 70 중량%인 140 g/L의 무수 세포 중량을 생산하였다. 밀폐된 루프 암모니아 공급을 사용하였으며, pH는 7.0에서 유지하였다. 오메가-3 생산성은 이들 조건하에서, 7일내에 4.7 g/L EPA(5 중량%의 지방산) 및 56.3 g/L DHA(57 중량%의 지방산)와 함께, 8.92 g/(L*일)이었다.
22.5℃에서 3640 ppm Cl-와 pH 7.0에서 20%의 용존 산소를 지닌 탄소 및 질소-공급된 배양물 속에서, 분리체는 7일 배양 후 지방산 함량이 58 중량%인 82 g/L의 무수 세포 중량을 생산하였다. 오메가-3 생산성은 당해 조건하에서, 7일내에 2.1 g/L EPA(4.3 중량%의 지방산) 및 28.5 g/L DHA(58.7 중량%의 지방산)와 함께, 4.5 g/(L*일)이었다.
22.5℃에서 980 ppm Cl-와 pH 7.0에서 20%의 용존 산소를 지닌 탄소 및 질소-공급된 배양물 속에서, 분리체는 7일 배양 후 지방산 함량이 53 중량%인 60 g/L의 무수 세포 중량을 생산하였다. 오메가-3 생산성은 당해 조건하에서, 7일내에 1.1 g/L EPA(3.4 중량%의 지방산) 및 18.4 g/L DHA(56.8 중량%의 지방산)과 함께, 2.8 g/(L*일)이었다.
실시예 3
오일을 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 분리된 트라우스토키트리드의 생물량 시료(시료 A)로부터 추출하였다. 생물량 시료를 탄소 및 질소-공급 배양물 속에서 22.5℃에서 980 ppm Cl-과 pH 7.0에서 20% 용존 산소와 함께 생산하였다. 오일을 생물량 시료 A로부터 헥산 추출 과정으로 추출함으로서 미생물 오일 시료 A1을 수득하였다. 요약하면, 무수 생물량을 헥산과 함께 스테인레스강 튜브 및 스테인레스 강 볼 베어링를 대략 2시간 동안 사용하여 분쇄하였다. 슬러리를 진공 여과하고 여액을 수집하였다. 헥산을 회전 증발기를 사용하여 제거하였다. 오일을 또한 시료 A로부터 프리올렉스(FRIOLEX: 등록상표) 공정[공급원: 지이에이 웨스트팔리아 세퍼레이터 유케이 리미티드(GEA Westfalia Separator UK Ltd.), 영국 밀톤 케인스 소재]을 사용하여 추출함으로써 미생물 오일 시료 A2를 수득하였다. 개개의 지질 부류를 미생물 오일 시료 A1 및 A2로부터 저압 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 분리하고 각각의 부류의 중량%를 측정하였다. 각각의 부류의 지방산 프로파일을 지방산 메틸 에스테르(FAME)로서 화염 이온화 검출(GC-FID)을 사용한 가스 크로마토그래피로 측정하였다.
플래쉬 크로마토그래피 - 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 조 오일 속에 존재하는 지질 부류를 분리하고 오일 속에 존재하는 각각의 부류의 중량%를 측정하였다. 크로마토그래피 시스템은 석유 에테르 및 에틸 아세테이트로 구성된 이동상을 3mL/분으로 사용하는 실리카겔 60[제조원: 이엠디 케미칼(EMD Chemical), 미국 뉴저지주 깁스타운 소재]을 이용하였다. 단계 구배를 사용하여 컬럼으로부터의 각각의 지질 부류를 선택적으로 용출하였다. 이동상 구배는 100% 석유 에테르로부터 출발하여 50% 에틸 아세테이트(이어서 100% 메탄올 세척)로 끝났다. 분획을 길슨 FC 204 대규모-층 분획 수집기(large-bed fraction collector)[제조원; 길슨, 인코포레이션(Gilson, Inc.), 미국 위스콘신주 미들톤 소재]를 사용하여 10 mL 시험 튜브 속에서 수집하였다. 각각의 튜브를 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석하고 각각의 지질 부류[예측된 보유 인자(Rf)를 갖는 TLC 플레이트 상의 단일 점으로 판단함]를 혼주(pooling)시키고, 농축 건조시켜, 칭량하였다. 이후에, 총 분획 함량을 중량측정으로 측정하였다.
TLC 분석 - 박층 크로마토그래피는 실리카 겔 플레이트 위에서 수행하였다. 플레이트를 석유 에테르:에틸 에테르:아세트산(80:20:1)으로 이루어진 용매 시스템을 사용하여 용출시키고 요오드 증기를 사용하여 가시화하였다. 이후에, 각각의 점의 Rf 값을 각각의 지질 부류에 대한 보고된 문헌 값과 비교하였다.
지방산 분석 - 생물량 및 분리된 지질 부류의 시료를 FAME로서 지방산 조성에 대해 분석하였다. 시료를 스크류 마개 시험 튜브내로 직접 칭량하고, 톨루엔 중 1 mL의 C19:0 내부 표준물[제조원: 누체크(NuCheck), 미국 미네소타주 엘리시안 소재] 및 메탄올 중 2 mL의 1.5 N HCl을 각각의 튜브에 가하였다. 튜브를 약간 와동시키고 가열 블록(heating block) 속에 2시간 동안 100℃에서 두었다. 튜브를 가열 블록으로부터 제거하고, 냉각되도록 한 후, 수중 1 ml의 포화 NaCl을 가하였다. 튜브를 다시 와동시키고, 원심분리하며, 상부(유기) 층의 일부를 GC 바이알에 두고 GC-FID로 분석하였다. FAME를 누-첵-프렙(Nu-Chek-Prep) GLC 참조 표준물[제조원: 누-첵 프렙, 인코포레이티드(Nu-Chek Prep, Inc.), 미국 미네소타주 엘리시안 소재]을 사용하여 생성시킨 3-점 내부 표준 계산 곡선을 사용하여 정량화하고 보유 시간을 기초로 하여 실험적으로 확인하였다. 존재하는 지방산은 총 FAME의 mg/g 및 %로서 나타내었다.
시료 A1은 헥산 속에 조 오일을 용해하고 컬럼의 상단에 적용시켜 제조하였다. 플래쉬 크로마토그래피를 사용한 시료의 분획화 후, 스테롤 에스테르 분획은 조 오일의 1.2 중량%로 계수되고, 트리아실글리세롤(TAG) 분획은 조 오일의 82.7 중량%로 계수되며, 유리 지방산(FFA) 분획은 조 오일의 0.9 중량%로 계수되고, 디아실글리세롤(DAG) 분획은 조 오일의 2.9 중량%로 계수되었다. 시료 A1 조 오일의 총 지방산 프로파일 및 분리된 분획은 각각 mg/g 및 %FAME로서 계산된 하기 표 5 및 표 6에 나타낸다.
Figure 112014026218817-pct00040
Figure 112011081484214-pct00006
시료 A2는 조 오일을 핵산 속에 용해하고 컬럼의 상단에 적용시켜 제조하였다. 시료를 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 분획화한 후, 스테롤 에스테르 분획은 조 오일의 0.8 중량%로 계수되고, 트리글리세롤(TAG) 분획은 조 오일의 83.4 중량%로 계수되며, 유리 지방산(FFA) 분획은 조 오일의 1.8 중량%로 계수되고, 디아실글리세롤(DAG) 분획은 조 오일의 5.6 중량%로 계수되었다. 시료 A2 조 오일 및 분리된 분획의 총 지방산 프로파일은 각각 mg/g 및 %FAME으로 계산된 하기 표 7 및 표 8에 나타낸다.
Figure 112014026218817-pct00041
Figure 112014026218817-pct00042
실시예 4
트리글리세라이드(TAG)를 ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 분리된 트라우스토키트리드로부터 헥산 추출(시료 A1) 또는 프리올렉스(등록상표) 공정[공급원: 지이에이 웨스트팔리아 세퍼레이터 유케이 리미티드(GEA Westfalia Separator UK Ltd.), 영국 밀톤 케인스 소재]을 사용하여 실시예 3에 기술된 바와 같이 추출하였다. 각각의 TAG 이성체의 상대적인 부위 퍼센트를 비-수성 역상 고 성능 액체 크로마토그래피(NARP-HPLC)를 사용하여 대기압 화학 이온화-질량 분광법(APCI-MS) 검출로 측정하고 각각의 위치 이성체의 실험적 확인을 질량 스펙트럼 분획화 패턴을 사용하여 수행하였다.
TAG를 포함하는 개개의 지질 부류를 플래쉬 크로마토그래피로 분리하였다. TAG 분획은 HPLC/APCI-MS로 분석하여 각각의 TAG 종 속에 존재하는 지방산 잔기으 종류, 및 각각의 TAG 종의 상대적인 양을 측정하였다. 각각의 TAG 피크의 실험적인 확인은 각각의 피크의 보유 시간 및 APCI 스펙트럼을 기초로 하였다. NARP-HPLC를 사용하는 경우, 각각의 TAG의 보유는 동등한 탄소수(ECN)와 함께 증가하며, 이는 모든 아실 쇄의 탄소의 총 수에서 이중 결합의 수를 2배한 값을 감한 것으로 정의한다. 또한, 최적 크로마토그래피 조건을 사용하여, 동일한 ECN을 가지지만 포화 및 불포화 지방산의 분포가 상이한 TAG 종의 중요한 쌍, 및 또한 쇄 길이가 다양한 지방산을 또한 분해(resolved)하였다. 각각의 TAG 피크의 APCI 질량 스펙트럼은 양성자화된 분자 이온 [M + H]+, 암모늄 부가물 이온 [M + NH4]+, 및 DAG 단편 이온의 질량을 제공한다. 각각의 TAG는 명백한 질량 스펙트럼을 수득하며, DAG 단편 이온의 중량은 각각의 TAG 종의 동질성을 측정하는 것을 돕는다. sn-2 위치로부터 아실 그룹의 손실에 상응하는 단편 이온은 sn-1 또는 sn-3 위치에서의 손실보다 훨씬 덜 바람직하므로 APCI 스펙트럼에서 최소한의 강도 시그날일 것이다[참조: Modern Methods for Lipid Analysis by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Related Techniques 276-297 (William Craig Byrdwell ed., 2005].
플래쉬 크로마토그래피 - 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 조 오일 속에 존재하는 지질 부류를 분리하고 오일 속에 존재하는 각각의 부류의 중량%를 측정하였다. 크로마토그래피 시스템은 석유 에테르 및 에틸 아세테이트로 구성된 이동상을 사용하는 실리카겔 60을 3 mL/분으로 사용하였다. 단계 구배를 사용하여 컬럼으로부터 각각의 지질부류를 선택적으로 용출하였다. 이동상 구배는 100% 석유 에테르로부터 시작하여 50% 에틸 아세테이트(이어서 100% 메탄올 세척)로 끝났다. 분획을 길슨(Gilson) FC 204 거대 층 분획 수집기(제조원: 길슨 인코포레이티드, 미국 위스콘신주 미들톤 소재)를 사용하여 20 mL의 시험 튜브 속에서 수집하였다. 각각의 튜브를 TLC로 분석하고, 개개의 지질 부류(예측된 Rf를 갖는 TLC 플레이트 상의 단일 점으로 판단)를 함유하는 튜브를 담그고(pooled), 농축 건조시키고, 칭량하였다. 이어서, 총 분획 함량을 중량 측정으로 측정하였다.
TLC 분석 - 박층 크로마토그래피를 실리카 겔 플레이트 위에서 수행하였다. 플레이트를 석유 에테르:에틸 에테르:아세트산(80:20:1)으로 이루어진 용매 시스템을 사용하여 용출시키고 요오드 증기를 사용하여 가시화하였다. 이후에, 각각의 점의 Rf 값을 각각의 지질 부류에 대한 보고된 문헌 값과 비교하였다.
HPLC/APCI-MS 분석 - 사용된 LC/MS 시스템은 대기압 화학 이온화(APCI) 및 휴렛 팩카드(Hewlett Packard) 모델 1100 질량 선택적 검출기(MSD)[제조원: 아질런트 테크놀로지스, 인코포레이티드(Agilent Technologies, Inc.), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재]가 장착된 휴렛 팩카드 모델 1100 HPLC로 이루어졌다. HPLC 방법은 일렬로 연결된 2개의 페노메넥스(PHENOMENEX: 등록상표) C18 컬럼[250 mm x 4.6 mm, 5 ㎛; 제조원: 페노메넥스 인코포레이티드(Phenomenex, Inc.)(미국 캘리포니아주 토란스 소재]을 1 mL/분의 유동 속도, 2 μL의 주입 용적, 및 50℃의 컬럼 온도로 이용하였다. 이동 상은 이소프로판올 중 0.1% 아세트산암모늄(용매 A) 및 아세토니트릴(용매 B)로 이루어졌다. 20% 용매 A로 시작하여, 40분 내에 75% 용매 A로 증가시키고, 75% 용매 A에서 5분 동안 유지시키고, 1분 내에 20% 용매 A로 되돌아가며, 20% 용매 A로 추가로 9분 동안 유지시키는, 선형 구배를 사용하였다. MSD 질량 범위는 m/z 400-1150, 150의 단편화기 전압, 6 L/분의 건조 가스 유동, 45 psig의 분무기압, 350℃의 건조 가스 온도, 325℃의 증발기 온도, 3500 V의 모세관 전압, 및 10 μA의 코로나 전류로 설정하였다.
트리도코사헥사에노인(트리-DHA) - 트리-DHA STD[제조원: 누체크(NuCheck), 미국 미네소타주 엘리시안 소재]를 사용하여 크로마토그래피 시스템 및 검출기 반응의 정확도를 평가하였다. 트리-DHA 피크의 보유 시간은 22.5분이었고, 총 이온 크로마토그램(TIC)은 우수한 시그날 대 노이즈 비를 제공하였다. 트리-DHA 피크의 APCI 질량 스펙트럼은 m/z 1023.7에서 양성자화된 분자 이온 [M + H]+, m/z 1040.8에서 암모늄 부가물 이온 [M + NH4]+, 및 m/z 695.5에서 단일의 특징적인 DAG 단편 이온을 나타낸다.
분리된 TAG 분획의 시료를 헥산 속에서 제조하고 NARP HPLC/APCI-MS로 분석하여 개개의 TAG 이성체의 동질성을 측정하였다.
각각의 피크의 질량 스펙트럼을 평가하고 각각의 지방산 잔기의 실험적 확인을 하기 표 9 및 10에 요약한 바와 같이 수행하였다.
Figure 112011081484214-pct00009
Figure 112011081484214-pct00010
실시예 5
실시예 3에 기술된 바와 같이, 프리올렉스 공정(Friolex process)을 사용하여 발효 브로쓰(fermentation broth)로부터 오일을 추출한 후, 조 오일을 정제, 표백 및 탈취 단계를 통해 추가로 가공하여 최종 오일을 수득하였다. 최종 오일을 고 올레산 해바라기 오일로 희석하여, DHA 함량이 대략 400 mg/g인 가공된 시판 오일을 수득하였다. 개개의 지질 부류를 분리하고 각각의 부류의 지방산 프로파일을 가스 크로마토그래피를 사용하여 지방산 매틸 에스테르(FAME)로서 화염 이온화 검출(GC-FID)로 측정하였다.
플래쉬 크로마토그래피 - 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 최종 오일 속에 존재하는 지질 부류를 분리하고, 오일 속에 존재하는 각각의 부류의 중량%를 측정하였다. 크로마토그래피 시스템은 석유 에테르 및 에틸 아세테이트로 구성된 이동상을 3 mL/분으로 사용하는 실리카겔 60(제조원: 이엠디 케미칼, 미국 뉴저지주 깁스타운 소재]을 이용하였다. 단계 구배를 사용하여 컬럼으로부터의 각각의 지질 부류를 선택적으로 용출하였다. 이동상 구배는 100% 석유 에테르로부터 출발하여 50% 에틸 아세테이트(이어서 100% 메탄올 세척)로 끝났다. 분획을 10 mL 시험 튜브 속에 길슨 FC 204 대규모-층 분획 수집기(제조원; 길슨, 인코포레이티드, 위스콘신 미들톤 소재)로 수집하였다. 각각의 튜브를 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석하고 개개의 지질 부류[예측된 보유 인자(Rf)를 갖는 TLC 플레이트 상의 단일 점으로 판단]를 함유하는 튜브를 담그고, 농축 건조시켜, 칭량하였다. 이후에, 총 분획 함량을 중량측정으로 측정하였다.
TLC 분석 - 박층 크로마토그래피는 실리카 겔 플레이트 위에서 수행하였다. 플레이트를 석유 에테르:에틸 에테르:아세트산(80:20:1)으로 이루어진 용매 시스템을 사용하여 용출시키고 요오드 증기를 사용하여 가시화하였다. 이후에, 각각의 점의 Rf 값을 각각의 지질 부류에 대한 보고된 문헌 값과 비교하였다.
지방산 분석 - 최종 오일 시료 및 분리된 지질 부류를 FAME로서 지방산 조성에 대해 분석하였다. 시료를 스크류 마개 시험 튜브내로 직접 칭량하고, 톨루엔 중 1 mL의 C19:0 내부 표준물(제조원: 누체크, 미국 미네소타주 엘리시안 소재) 및 메탄올 중 2 mL의 1.5 N HCl을 각각의 튜브에 가하였다. 튜브를 약간 와동시키고 가열 블록 속에 100℃에서 2시간 동안 두었다. 튜브를 가열 블록으로부터 제거하고, 냉각되도록 한 후, 수중 1 ml의 포화 NaCl을 가하였다. 튜브를 다시 와동시키고, 원심분리하며, 상부(유기) 층의 일부를 GC 바이알에 두고 GC-FID로 분석하였다. FAME를 누-첵-프렙 GLC 참조 표준물(제조원: 누-첵 프렙, 인코포레이티드, 미국 미네소타주 엘리시안 소재)을 사용하여 생성시킨 3-점 내부 표준 계산 곡선을 사용하여 정량화하고 보유 시간을 기초로 하여 실험적으로 확인하였다. 존재하는 지방산은 총 FAME의 mg/g 및 %로서 나타내었다.
시료는 600 μL의 헥산 속에 250 mg의 최종 오일을 용해하고 컬럼의 상단에 적용시켜 제조하였다. 플래쉬 크로마토그래피를 사용한 시료의 분획화 후, 스테롤 에스테르 분획은 최종 오일의 1.2 중량%로 계수되고, 트리아실글리세롤(TAG) 분획은 최종 오일의 92.1 중량%로 계수되며, 유리 지방산(FFA) 분획은 최종 오일의 2.1 중량%로 계수되고, 스테롤 분획은 최종 오일의 1.1%로 계수되며, 디아실글리세롤(DAG) 분획은 최종 오일의 2.8 중량%로 계수되었다.
담갔던 분획의 TLC 분석은, FFA 및 스테롤 분획이 TAG 및 DAG 각각과 혼합되었음을 나타내었다. 프리올렉스(등록상표) 최종 오일과 분리된 분획의 총 지방산 프로파일은 각각 mg/g 및 %FAME로서 계산된 하기 표 11 및 표 12에 나타낸다.
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Figure 112011081484214-pct00012
실시예 6
실시예 5에 기술된 최종 오일의 트리글리세라이드(TAG)의 분석을 실시예 4에 기술된 기술을 사용하여 수행하였다. 각각의 지방산 잔기의 실험적 확인을 하기 표 13 및 14에 요약한 바와 같이 수행하였다.
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Figure 112011081484214-pct00014
실시예 7
ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 분리된 트라우스토키트리드의 2일된 접종 플라스크를 980 ppm Cl-가 들어있는 탄소 및 질소-공급 배지(트라우스토키트리드 배지) 속에서 제조하였다.
돌연변이유발은 다음 공정에 따라 수행하였다:
대략 50 ml의 멸균 T=2일된 플라스크를 멸균 40 ml 유리 균질화기에 부었다. 배양물에 균질화기 속에서 50 플런지(plunge)를 제공하였다. 배양물을 피펫팅하고 멸균 50 마이크론 메쉬 여과기(mesh filter)를 통해 여과하고, 이를 50 ml 멸균 튜브 속에 두었다(메쉬는 50 마이크론 메쉬를 통해 보다 작은 무리 및 단일 세포가 통과하도록 하는 동안 보다 큰 콜로니 무리를 남기는 수단으로서 사용하였다). 전체의 농축 침연(macerate)을 멸균 50 ml 튜브 속에 수집하였다. 침연된 배양물을 와동시키고 1:100배 이하 수준에서의 희석을 트라우스토키트리드 배지를 함유하는 튜브 속에서 수행하였다. 희석된 침연 시료를 200 μl의 접종물을 4 내지 5개 유리 비드(3 mm 유리 비드)를 함유하는, 트라우스토키트리드 배지 아가 페트리 디쉬, 100 x 15 mm에 가하기 전에 와동시켰다. 플레이트 주변 접종물에 비드가 균일하게 확산되도록 하기 위한 노력으로 각각의 플레이트를 온화하게 교반하였다. 비드를 플레이트로부터 버리고 플레이트를 커버와 함께 대략 5분 동안 두어 건조시켰다. 공정을 어두운 광 속에서 수행하기 때문에 멸균 후드 및 인접한 지역에서의 광을 껐다. 공정을 수행할 수 있도록 이용가능한 광은 최소였으나, 간접 및 어두움만 존재하였다.
5개의 복제 플레이트를 XL 가교결합제[제조원: 스펙트로닉스 코포레이션(Spectronics Corporation), 미국 뉴욕주 소재]의 바닥 위에 뚜껑을 열어 두고 시료를 조사(irradiating)하였다. 마이크로주울 및 수준 측면에서 교차결합제 전달된 힘은 90% 내지 95% 사멸을 달성한 것으로 나타났다. 5개의 복제 대조군 플레이트를 동일한 프로토콜을 사용하여 돌연변이유발되지 않은 세포와 함께 접종하였다. 이들 세포 수를 사용하여 사멸%를 계산하였다. 조사가 완료되면, 플레이트를 제거하고, 뚜껑을 교체하고, 플레이트를 파라핀으로 싼 후 알루미늄 호일로 쌌다. 플레이트를 암실 속에서 1주 동안 성장시켜 이들이 손상된 유전자를 복구할 수 없도록 하는 것이 필수적이었다.
플레이트를 22.5℃ 방에 약 10일 동안 둔 후 콜로니를 계수하였다. 최종 계수하는 경우, 개개 콜로니를 멸균 접종 루프로 집어올려 새로운 트라우스토키트리드 배지 플레이트 위에 재-스트리킹(re-streaking)하였다. 각각의 콜로니를 개개의 플레이트 위에 두었다. 플레이트가 조밀해지면 시료를 접종 루프를 사용하여 취하고, 50 ml의 트라우스토키트리드 배지를 함유하는 멸균 250 ml 진탕 플라스크내로 접종하였다. 당해 플라스크를 22.5℃ 방 속에 200 rpm에서 진탕기 위에 두었다. T=7일 째에, 진탕 플라스크 배양물을 50 ml 멸균 튜브내로 수거하였다. pH를 취하고 시료를 스핀다운(spin-down)시켜 생물량 펠렛을 수집하였다. 각각의 시료를 세정하고 이소프로필 알코올 및 증류수의 50:50 혼합물 속에 재-회전시키기 전에 재-현탁시켰다. 수집된 펠렛을 동결 건조시키고, 칭량하고 FAME 분석을 수행하였다. 표 15 내지 21에서의 데이타는 상기 과정으로 생산된 돌연변이체를 나타낸다.
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실시예 8
4개의 트라우스토키트리드 시료를 아메리칸 티슈 앤드 컬쳐 컬렉션(American Tissue and Culture Collection:ATCC)으로부터 수득하고 각각의 시료를 생물량의 지방산 프로파일, 추출된 조 오일의 지방산 프로파일, 조 오일의 트리아실글리세라이드(TAG) 분획, 및 조 오일의 극성 지방(PL) 분획에 대해 분석하였다. 분석한 시료는 ATCC 34304, 20890, 20889, 및 20892이었다. 균주를 50 ml의 다음 배지를 하유하는 250 ml 진탕 플라스크내로 접종하였다: 1 g 펩톤, 1 g 효모 추출물, 1 리터의 인공 해수 중 5 g 글루코즈. 배양물을 오비탈 진탕기에서 200 rpm으로 진탕시키면서 20℃에서 항온처리하였다. 7일 후에, 배양물을 원심분리(5087 xg)로 수거하고, 물:이소프로판올(1:1)의 혼합물로 세척하고, 다시 원심분리하였다. 수득되는 펠렛을 동결 건조시켰다. 조 오일을 문헌[참조: Bligh and Dyer, Can. J. of Biol. And Phys. 37: 911-917 (1959)]의 방법을 사용하여 무수 생물량으로부터 추출하였다. TAG 및 PL을 조 오일로부터 칼루츠니(Kaluzny) 등이 개발한 고체 상 추출된(SPE) 방법[참조: J. Lipid Res. 26: 135-140 (1959)]의 변형법을 사용하여 분리하였다. 조 오일 및 분리된 분획을 DHA 및 EPA 함량 및 총 지방산 함량(지방산 메틸 에스테르로서)에 대해 분석하였다.
지질 추출 - 조 오일을 1.5 x 10 cm 스크류 탑 시험 튜브내로 100 내지 200 mg으로 칭량하고, 1:2:0.8 클로로포름:메탄올:물(CHCl3:MeOH:H2O)로 이루어진 단상 시스템 8 mL를 가하며, PT-DA 3012/2 응집체가 장착된 폴리트론(POLYTRON: 등록상표) PT 3100 분산 장치로 균질화함으로써 동결 건조된 생물량으로부터 추출하였다. 시료를 2분 동안 10000 rpm에서 균질화하면서 빙욕 속에 침지시켰다. 2.1 mL의 CHCl3을 첨가하고, 1분 동안 와동시키며, 1.7 mL의 H2O를 가하고, 추가로 1분 동안 다시 와동시켜 이상 (biphase) 시스템을 생성하였다. 하부(유기) 층을 파스퇴르 피펫을 사용하여 제거하고 수집 플라스크내로 두었다. 시험 튜브 속에 남은 MeOH-H2O 층을 CHCl3의 2.1 mL 부분으로 2회 이상 재-추출하였다. 유기 층을 합하고 질소 스트림하에서 건조시켰다.
고체 상 추출 - TAG 및 PL 분획을 Vac Elut 장치 속에 있는 500 mg 아미노프로필 카트릿지[제조원: 부르딕 앤드 잭슨(Burdick & Jackson)]를 사용하여 SPE에 의해 조 지질로부터 분리하였다. 카트릿지를 5 mL의 헥산으로 조건화하고, 10 내지 20 mg의 각각의 시료를 400 μL의 CHCl3 속에 용해하고 카트릿지에 적용시켰다. 컬럼을 4 mL의 2:1 CHCl3:이소프로필 알코올(IPA)로 세척하여 모든 중성 지질을 용출시키고, 이를 수집하여 질소하에 건조시켰다. 이후에, 지방산을 에테르 중 5 mL의 2% 아세트산(HOAc)으로 용출시키고, 이를 버렸다. PL 부분은 5 mL의 MeOH로 용출시키고, 이를 수집하여 질소 하에 건조시켰다. 중성 지질 분획을 400 μL의 헥산 속에 재-용해하고 제2의 아미노프로필 컬럼(5 mL의 헥산으로 미리 조건화시킴)에 적용시켰다. 스테롤 에스테르를 헥산 중 5 mL의 1% 에틸 아세테이트(EtOAc)로 용출시키고 버렸다. 최종적으로, TAG를 헥산 중 5 mL의 3% EtOAc로 용출시키고, 이를 수집하여 질소하에 건조시켰다.
TLC 분석 - 박층 크로마토그래피를 실리카 겔 플레이트 위에서 수행하였다. 플레이트를 석유 에테르:에틸 에테르:아세트산(80:20:1)으로 이루어진 용매 시스템을 사용하여 용출시키고 요오드 증기로 가시화하였다.
지방산 분석 - 생물량, 조 오일, 분리된 TAG, 및 PL 분획의 시료를 FAME로서 지방산 조성에 대해 분석하였다. 시료를 스크류 캡 시험 튜브내로 직접 칭량하고, 톨루엔 중 1 mL의 C19:0 내부 표준물 및, 메탄올 중 2 mL의 1.5 N HCl을 각각의 튜브에 가하였다. 튜브를 온화하게 와동시키고 가열 블록 속에 100℃에서 2시간 동안 두었다. 튜브를 가열 블록으로부터 제거하고, 냉각되도록 하고, 수중 1 mL의 포화된 NaCl을 가하였다. 튜브를 다시 와동시키고, 원심분리하고, 상부(유기) 층 부분을 GC 바이알 속에 두고 GC-FID로 분석하였다. FAME를 누-체크-프렙 GLC 참조 표준물을 사용하여 생성시킨 3-점 내부 표준 계산 곡선을 사용하여 정량하고 보유 시간을 기초로 하여 실험적으로 확인하였다. 존재하는 지방산은 총 FAME의 mg/g 및 %로 나타내었다.
ATCC 34304 - ATCC 34304 생물량의 지질 함량은 FAME의 합으로서 9.1%로 추정되었으며, 용매 추출 후 수득된 조 오일의 양은 9.2 중량%이었으며 생물량 속에 존재하는 지방의 101%가 회수되었다. 생물량의 EPA 및 DHA 함량은 각각 4.8 mg/g 및 38.7 mg/g으로 측정되었다. 추출된 조 오일은 25.9 mg/g EPA 및 238.7 mg/g DHA를 함유하였다. 분리된 TAG는 13.9 mg/g EPA 및 303.9 mg/g DHA를 함유한 반면, 분리된 PL은 38.7 mg/g EPA 및 237.980 mg/g DHA를 함유하였다. 생물량의 총 지방산 프로파일, 추출된 조 오일, TAG 분획, 및 PL 분획은 각각 mg/g 및 FAME%로 계산된 하기 표 22 및 표 23에서 나타낸다.
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Figure 112011081484214-pct00030
ATCC 20890 - ATCC 20890 생물량의 지질 함량은 FAME의 합으로서 9.2%로 추정되었으며, 용매 추출 후 수득된 조 오일의 양은 10.2 중량%이었으며, 생물량 속에 존재하는 지방의 111%가 회수되었다. 생물량의 EPA 및 DHA 함량은 각각 12.2 mg/g 및 36.6 mg/g으로 측정되었다. 추출된 조 오일은 64.7 mg/g EPA 및 194.2 mg/g DHA를 함유하였다. 분리된 TAG는 41.9 mg/g EPA 및 230.2 mg/g DHA를 함유한 반면, 분리된 PL은 54.4 mg/g EPA 및 149.5 mg/g DHA를 함유하였다. 생물량의 총 지방산 프로파일, 추출된 조 오일, TAG 분획, 및 PL 분획은 각각 mg/g 및 % FAME으로 계산된 하기 표 24 및 표 25에서 나타낸다.
Figure 112011081484214-pct00031
Figure 112011081484214-pct00032
ATCC 20889 - 생물량의 지질 함량은 FAME의 합으로서 3.3%로 추정되었으며, 용매 추출 후 수득된 조 오일의 양은 3.4 중량%이었으며, 생물량 속에 존재하는 지방의 103%가 회수되었다. 생물량의 EPA 및 DHA 함량은 각각 2.3 mg/g 및 16.5 mg/g으로 측정되었다. 추출된 조 오일은 26.8 mg/g EPA 및 205.1 mg/g DHA를 함유하였다. 분리된 TAG는 7.3 mg/g EPA 및 185.9 mg/g DHA를 함유한 반면, 분리된 PL은 35.2 mg/g EPA 및 218.6 mg/g DHA를 함유하였다. 생물량의 총 지방산 프로파일, 추출된 조 오일, TAG 분획, 및 PL 분획은 각각 mg/g 및 % FAME으로 계산된 하기 표 26 및 표 27에서 나타낸다.
Figure 112014026218817-pct00044
Figure 112014026218817-pct00045
ATCC 20892 - 생물량의 지질 함량은 FAME의 합으로서 8.8%로 추정되었으며, 용매 추출 후 수득된 조 오일의 양은 12.1 중량%이었으며 생물량 속에 존재하는 지방의 138%가 회수되었다. 생물량의 EPA 및 DHA 함량은 각각 8.3 mg/g 및 43.3 mg/g으로 측정되었다. 추출된 조 오일은 50.5 mg/g EPA 및 260.1 mg/g DHA를 함유하였다. 분리된 TAG는 98.7 mg/g EPA 및 407.7 mg/g DHA를 함유한 반면, 분리된 PL은 50.4 mg/g EPA 및 243.12 mg/g DHA를 함유하였다. 생물량의 총 지방산 프로파일, 추출된 조 오일, TAG 분획, 및 PL 분획은 각각 mg/g 및 % FAME으로 계산된 하기 표 28 및 표 29에서 나타낸다.
Figure 112011081484214-pct00035
Figure 112011081484214-pct00036
본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허출원은, 각각의 개개 공보, 특허, 또는 특허출원이 상세하게 및 개별적으로 참고로 포함하는 것으로 나타낸 바와 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
American Type Culture Collection(ATCC) PTA9695 20090107 American Type Culture Collection(ATCC) PTA9696 20090107 American Type Culture Collection(ATCC) PTA9697 20090107 American Type Culture Collection(ATCC) PTA9698 20090107
<110> Martek biosciences corporation <120> Thraustochytrids, Fatty acid compositions, and methods or making and uses thereof <130> IPA110738 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1713 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 1 acctggttga tcctgccagc tgtcatttgc tcgtctaaaa gattaagcca tgcatgtcta 60 agtataaaca aattatacgg tgaaactgcg aacggctcat tatatcagtt atagtttctt 120 tgatagtgta tttctatatc tatttggata actgtggcaa ttctagagct aacacatgct 180 ttcgagtggg actttttggt accactgcat ttattagatt ttgaagccaa cgtaaaattg 240 gtgattcatg ataactttgc gaatcgcagt agcgtcttgt acgcggcgat gaatcattca 300 agtttctgcc ccatcagctg tcgatggtac ggtattggcc taccatggct ttcacgggtg 360 acggagaatt agggtttgat tccggagagg acgcttgaga gacggcgacc acatccaagg 420 aaggcagcag gcgcgtaaat tacccaatgg ggactccccg aggtagtgac aagaaataaa 480 aatgaggagc gctttgcgtt tttcaatttg aatgagagaa tcgtacaatc ctcatcgagg 540 atcaattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ctccagctcc aatagcaaat 600 attagagttg ttgcagttaa aaagctcgta gttgaatttc cgatagtctt tggccgtgtc 660 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gcttctctat tattactttt ccgagaggaa tggttaatct tctaaatgtc 1560 tgtcgtgatg gggctagatt tttgcaatta ttaatctcca acgaggaatt cctagtaaac 1620 gcaagtcatc agcttgcatt gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgcacc 1680 taccgattga acggtcctat gaaatcttcg gat 1713 <210> 2 <211> 924 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 2 atcgaccaga aggatgccta cgtaggggac gaggcgcaga gcaagcgtgg tgtgctgacg 60 ctcaagtacc cgatcgagca cggcatcgtg accaactggg acgacatgga gaagatctgg 120 catcacacct tctacaacga gctgcgcgtg gcgcccgagg agcaccccgt gctgctcacc 180 gaggcccccc tcaaccccaa ggcgaaccgc gagcgcatga cccagatcat gttcgagacc 240 ttcaacgtgc cggccatgta cgtcaacatc caggccgtgc tgtccctgta cgcttcgggc 300 cgcaccaccg gcgccgtgct cgattcggga gatggcgtca cgcacaccgt gcccatctac 360 gagggctacg cgctcccgca cgcggtgctg cgcatcgacc tggctggccg cgacctgacc 420 gactacatga tgaagatcct gacggagcgc gggtactcgt tcacgacgac cgccgagcgc 480 gaaatcgtgc gcgacatcaa ggagaagctg tgctacgtgg cgctcgactt cgaccaggag 540 atgaagacgg ccgccgagtc gtcgtcgctg gagaagagct acgagctgcc ggacggcaac 600 gtgatcacga tcggcaacga gcgcttccgc tgccccgagg tgctcttcca gccgtcgttc 660 atcggcaagg aggccgccgg cgtgcacgag accatgttcc agacgatcat gaagtgcgac 720 gtcgatatcc gcaaggacct gtacgccaac atcgtcatgt ccggtggctc caccatgtac 780 gagggcatcg ccgcgcgcct ggagaaggag atggtgtcac tggcgccctc caccatgaag 840 atcaaggtgg tcgcgccccc cgagcgcaag tactcggtgt ggatcggcgg ctccatcctg 900 gcctcgctct ccaccttcca gcaa 924 <210> 3 <211> 291 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 3 Val Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Thr Asn Trp 1 5 10 15 Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg 20 25 30 Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn 35 40 45 Pro Lys Ala Asn Arg Glu Arg Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr Phe 50 55 60 Asn Val Pro Ala Met Tyr Val Asn Ile Gln Ala Val Leu Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ala Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val 85 90 95 Thr His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala Val 100 105 110 Leu Arg Ile Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Met Met Lys 115 120 125 Ile Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu 130 135 140 Ile Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe 145 150 155 160 Asp Gln Glu Met Lys Thr Ala Ala Glu Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser 165 170 175 Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Asn Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe 180 185 190 Arg Cys Pro Glu Val Leu Phe Gln Pro Ser Phe Ile Gly Lys Glu Ala 195 200 205 Ala Gly Val His Glu Thr Met Phe Gln Thr Ile Met Lys Cys Asp Val 210 215 220 Asp Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Ile Val Met Ser Gly Gly Ser 225 230 235 240 Thr Met Tyr Glu Gly Ile Ala Ala Arg Leu Glu Lys Glu Met Val Ser 245 250 255 Leu Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Val Val Ala Pro Pro Glu Arg 260 265 270 Lys Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr 275 280 285 Phe Gln Gln 290 <210> 4 <211> 918 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 4 gatctgcagc tggagcgcat caacgtgtac ttcaacgagg ccacgggcgg ccgctacgtg 60 ccgcgcgcca tcctcatgga cctggagccc ggtacgatgg actctgtccg cgccggcccc 120 tttggccagc tcttccgccc agacaacttc gtcttcgggc agacgggcgc cggtaacaac 180 tgggccaagg gccactacac tgagggcgcg gagcttatcg actcggtgct cgacgtggtg 240 cgcaaggagg cagagtcgtg cgactgcctg cagggcttcc agatcaccca ctcgctcggc 300 ggcggcacgg gctccggtat gggcacgctt ctcatcagca agatccgcga ggagtacccc 360 gaccgcatca tgctgacctt ctccatcgtg ccctcgccca aggtgtcgga caccgtcgtg 420 gagccctaca acgcgacgct ctcggtgcac cagctcgtgg agaacgccga cgaggtcatg 480 gtcctcgaca acgaggcgct gtacgacatc tgcttccgca ccttgaagct caccacgccc 540 acctacggcg acctcaacca cctcgtgtgc gccgccatga gcgggtgcac gtgctgcctg 600 cgcttcccgg gccagctcaa ctcggacctg cgcaagctgg ccgtcaacct ggtgcccttt 660 ccgcgcctcc acttcttcat gatcggcttc tcgcccctca cctcgcgtgg ctcgcagcag 720 taccgcgccc tgaccgttcc ggagctcacg cagcaggcgt ttgacgctaa gaacatgatg 780 tgcgccgccg acccgcgcca cggccgctac ctgacggcga cgacgctctt ccgcgggcgc 840 atgtcgacca aggaggtgga cgagcagatg ctcaacatcc agaacaagaa ctcgtcgtac 900 tttgtcgagt ggatcccc 918 <210> 5 <211> 307 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 5 Asp Asp Leu Gln Leu Glu Arg Ile Asn Val Tyr Phe Asn Glu Ala Thr 1 5 10 15 Gly Gly Arg Tyr Val Pro Arg Ala Ile Leu Met Asp Leu Glu Pro Gly 20 25 30 Thr Met Asp Ser Val Arg Ala Gly Pro Phe Gly Gln Leu Phe Arg Pro 35 40 45 Asp Asn Phe Val Phe Gly Gln Thr Gly Ala Gly Asn Asn Trp Ala Lys 50 55 60 Gly His Tyr Thr Glu Gly Ala Glu Leu Ile Asp Ser Val Leu Asp Val 65 70 75 80 Val Arg Lys Glu Ala Glu Ser Cys Asp Cys Leu Gln Gly Phe Gln Ile 85 90 95 Thr His Ser Leu Gly Gly Gly Thr Gly Ser Gly Met Gly Thr Leu Leu 100 105 110 Ile Ser Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Pro Asp Arg Ile Met Leu Thr Phe 115 120 125 Ser Ile Val Pro Ser Pro Lys Val Ser Asp Thr Val Val Glu Pro Tyr 130 135 140 Asn Ala Thr Leu Ser Val His Gln Leu Val Glu Asn Ala Asp Glu Val 145 150 155 160 Met Val Leu Asp Asn Glu Ala Leu Tyr Asp Ile Cys Phe Arg Thr Leu 165 170 175 Lys Leu Thr Thr Pro Thr Tyr Gly Asp Leu Asn His Leu Val Cys Ala 180 185 190 Ala Met Ser Gly Cys Thr Cys Cys Leu Arg Phe Pro Gly Gln Leu Asn 195 200 205 Ser Asp Leu Arg Lys Leu Ala Val Asn Leu Val Pro Phe Pro Arg Leu 210 215 220 His Phe Phe Met Ile Gly Phe Ser Pro Leu Thr Ser Arg Gly Ser Gln 225 230 235 240 Gln Tyr Arg Ala Leu Thr Val Pro Glu Leu Thr Gln Gln Ala Phe Asp 245 250 255 Ala Lys Asn Met Met Cys Ala Ala Asp Pro Arg His Gly Arg Tyr Leu 260 265 270 Thr Ala Thr Thr Leu Phe Arg Gly Arg Met Ser Thr Lys Glu Val Asp 275 280 285 Glu Gln Met Leu Asn Ile Gln Asn Lys Asn Ser Ser Tyr Phe Val Glu 290 295 300 Trp Ile Pro 305

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  20. 적어도 70 중량%의 트리글리세라이드 분획을 포함하고, 트리글리세라이드 분획중 도코사헥사에노산 함량이 적어도 50 중량%이고, 트리글리세라이드 분획 중 도코사펜타에노산 n-6 함량이 0.5 중량% 내지 6 중량%인, 미생물 오일.
  21. 제20항에 있어서,
    1.5 중량% 이하의 트리글리세라이드 분획 중 아라키돈산 함량을 추가로 포함하는 미생물 오일.
  22. 적어도 70 중량%의 트리글리세라이드 분획을 포함하고, 트리글리세라이드 분획 중 도코사헥사에노산 함량이 적어도 40 중량%이고, 트리글리세라이드 분획 중 도코사펜타에노산 n-6 함량이 적어도 0.5 중량% 내지 6 중량%이며, 도코사헥사에노산 대 도코사펜타에노산 n-6의 비가 6:1 초과인, 미생물 오일.
  23. 적어도 70 중량%의 트리글리세라이드 분획을 포함하고, 트리글리세라이드 분획 중 도코사헥사에노산 함량이 적어도 60 중량%인, 미생물 오일.
  24. 제20항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서,
    트리글리세라이드 분획 중의 트리글리세라이드의 적어도 20%가 sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 어느 2개로부터 선택된 트리글리세라이드내 2개 위치에서 도코사헥사에노산을 함유하는, 미생물 오일.
  25. 제20항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서,
    트리글리세라이드 분획 중의 트리글리세라이드의 적어도 5%가 트리글리세라이드의 sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 모든 3개 위치에서 도코사헥사에노산을 함유하는, 미생물 오일.
  26. 제20항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서,
    5 중량% 이하의 헵타데카노산을 추가로 포함하는 미생물 오일.
  27. 제20항에 따른 미생물 오일을 포함하는 사람용 식품.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 식품이 영아용 조제분유인 식품.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 영아용 조제분유가 조산아를 위한 것인 식품.
  30. 제27항에 있어서,
    상기 식품이 우유, 음료, 영양 음료 또는 이의 배합물인 식품.
  31. 제27항에 있어서,
    상기 식품이 사람 음식용 첨가제인 식품.
  32. 제27항에 있어서,
    상기 식품이 영양 보충물인 식품.
  33. 제20항의 미생물 오일을 포함하는 동물 사료.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 동물 사료가 양식 사료인 동물 사료.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 동물 사료가 애완 동물 사료, 동물원 동물 사료, 노동 동물(work animal) 사료, 가축 사료, 또는 이의 배합물인 동물 사료.
  36. (a) ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드 종의 분리된 트라우스토키트리드 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 10 중량% 이하의 에이코사펜타에노산을 포함하는 분리된 트라우스토키트리드 미생물을 배양물 속에서 성장시켜 생물량을 생산하는 단계; 및
    (b) 생물량으로부터, 트리글리세라이드 분획을 포함하는 오일로서 트리글리세라이드 분획중 도코사헥사에노산 함량이 적어도 40 중량%이고, 트리글리세라이드 분획중 도코사펜타에노산 n-6 함량이 적어도 0.5 중량% 내지 6 중량%이며, 분리된 트라우스토키트리드 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 10 중량% 이하의 에이코사펜타에노산을 포함하는 오일을 추출하는 단계
    를 포함하는, 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 생산하는 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    배양물이 적어도 5%의 용존 산소를 포함하는 방법.
  38. 제36항에 있어서,
    배양물 pH가 6.5 내지 8.5에서 유지되는 방법.
  39. 제36항에 있어서,
    배양 온도가 17℃ 내지 30℃에서 유지되는 방법.
  40. 제36항에 있어서,
    배양물이 5 g/L 내지 50 g/L 농도의 글루코즈를 포함하는 방법.
  41. ATCC 수탁 번호 제PTA-9695호로 기탁된 트라우스토키트리드 종의 분리된 트라우스토키트리드 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 10 중량% 이하의 에이코사펜타에노산을 포함하는 분리된 트라우스토키트리드 미생물을 포함하는 분리된 트라우스토키트리드 생물량으로부터, 트리글리세라이드 분획을 포함하는 오일로서 트리글리세라이드 분획중 도코사헥사에노산 함량이 적어도 40 중량%이고, 트리글리세라이드 분획중 도코사펜타에노산 n-6 함량이 적어도 0.5 중량% 내지 6 중량%이며, 분리된 트라우스토키트리드 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 10 중량% 이하의 에이코사펜타에노산을 포함하는 오일을 추출하는 단계를 포함하는, 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 생산하는 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일이 헥산 추출법을 사용하여 추출되는 방법.
  43. 제41항에 있어서,
    오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일이 무용매 추출법을 사용하여 추출되는 방법.
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 제36항에 따른 방법으로 생산된 미생물 오일.
  47. 제20항에 따른 미생물 오일을 포함하는 화장품 조성물.
  48. 제20항에 따른 미생물 오일을 포함하는 염증 치료용 약학 조성물.
  49. 삭제
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