ES2602121T3 - Composiciones de ácidos grasos de traustoquítridos y métodos de fabricación y usos de las mismas - Google Patents
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Abstract
Un aceite microbiano que comprende una fracción de triglicéridos de al menos 70% en peso, en el que el contenido en ácido docosahexaenoico de la fracción de triglicéridos es al menos 40% en peso, en el que el contenido en ácido docosapentaenoico n-6 de la fracción de triglicéridos es de al menos 0,5% en peso a 6% en peso y en el que a) el contenido en ácido docosahexaenoico de la fracción de triglicéridos es al menos 50% en peso o b) la relación de ácido docosahexaenoico a ácido docosapentaenoico n-6 es mayor que 6:1.
Description
Cultivos de traustoquítridos y biomasas de traustoquítridos aisladas.
La descripción se refiere además a un cultivo que comprende uno o más traustoquítridos aislados de la descripción.
Se conocen en la técnica varios parámetros de fermentación para inoculación, crecimiento y recuperación de
microflora, tal como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.130.242. Se puede usar cualquier medio convencional
5 para crecimiento de los traustoquítridos. Los medios líquidos o sólidos pueden contener agua marina natural o
artificial. Las fuentes de carbono incluyen, pero no se limitan a, glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidón
soluble, molasas, fucosa, glucosamina, dextrano, grasas, aceites, glicerol, acetato de sodio y manitol. Las fuentes de
nitrógeno incluyen, pero no se limitan a, peptona, extracto de levadura, polipeptona, extracto de malta, extracto de
carne, casaminoácido, agua empleada para remojar el maíz, fuentes de nitrógeno orgánico, glutamato sódico, urea, 10 fuentes de nitrógeno inorgánico, acetato de amonio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio, sulfato
de sodio. Se muestra un medio típico en la Tabla 1:
Tabla 1: Medios de recipiente
- Ingrediente
-
concentración
imagen5 intervalos
- NaCl
-
g/l
12,5
imagen6 0-25, 5-20 ó 10-15
- KCl
-
g/l
1,0
imagen7 0-5, 0,25-3 ó 0,5-2
- MgSO4·7H2O
-
g/l
5,0
imagen8 0-10, 2-8 ó 3-6
- (NH4)2SO4
-
g/l
0,6
imagen9 0-10, 0,25-5 ó 0,5-3
- CaCl2
-
g/l
0,29
imagen10 0,1-5, 0,15-3 ó 0,2-1
- T 154 (extracto de levadura)
-
g/l
6,0
imagen11 0-20, 1-15 ó 5-10
- KH2PO4
-
g/l
1,2
imagen12 0,1-10, 0,5-5 ó 1-3
- imagen13
-
imagen14 imagen15 imagen16
- postautoclave (metales)
-
imagen17
- Ácido cítrico
-
mg/l
3,5
imagen18 0,1-100, 1-50 ó 2-25
- FeSO4·7H2O
-
mg/l
10,30
imagen19 0,1-100, 1-50 ó 5-25
- MnCl2·4H2O
-
mg/l
3,10
imagen20 0,1-100, 1-50 ó 2-25
- ZnSO4·7H2O
-
mg/l
3,10
imagen21 0,1-100, 1-50 ó 2-25
- CoCl2·6H2O
-
mg/l
0,04
imagen22 0,001-1, 0,005-0,5 ó 0,01-0,1
- Na2MoO4·2H2O
-
mg/l
0,04
imagen23 0,001-1, 0,005-0,5 ó 0,01-0,1
- CuSO4·5H2O
-
mg/l
2,07
imagen24 0,1-100, 0,5-50 ó 1-25
- NiSO4·6H2O
-
mg/l
2,07
imagen25 0,1-100, 0,5-50 ó 1-25
- imagen26
-
imagen27 imagen28 imagen29
- postautoclave (vitaminas)
-
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- Tiamina**
-
imagen31 mg/l 9,75 0,1-100, 1-50 ó 5-25
- Ingrediente
- concentración intervalos
- Vitamina B12**
- mg/l 0,16 0,1-100, 0,1-10 ó 0,1-1
- Ca½-pantotenato**
- mg/l 3,33 0,1-100, 0,1-50 ó 1-10
- postautoclave (carbono)
-
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- Glucosa
- g/l 30,0 5-150, 10-100 ó 20-50
Alimentación de nitrógeno:
Las condiciones típicas de cultivo incluirían lo siguiente:
5 En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80% o al menos aproximadamente 90% de oxígeno disuelto, como un porcentaje de nivel de saturación. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende de
10 aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, aproximadamente 5% a aproximadamente 100%, aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 100%, aproximadamente 20% a aproximadamente 50% o aproximadamente 20% a aproximadamente 100% de oxígeno disuelto, como un porcentaje de nivel de saturación.
15 La descripción se refiere además a una biomasa aislada de un traustoquítrido de la descripción. Una biomasa de traustoquítrido aislada de la descripción es una biomasa celular recogida obtenida por cualquier método convencional para el aislamiento de una biomasa de traustoquítrido, tal como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.130.242 y la Publ. de Patente de EE.UU. Nº 2002/0001833.
En algunas realizaciones, el peso de células seco de la biomasa aislada de cada litro de cultivo es al menos
20 aproximadamente 50 g, al menos aproximadamente 60 g, al menos aproximadamente 70 g, al menos aproximadamente 80 g, al menos aproximadamente 100 g, al menos aproximadamente 120 g, al menos aproximadamente 140 g, al menos aproximadamente 160 g, al menos aproximadamente 180 g o al menos aproximadamente 200 g después de cultivo durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 17°C a aproximadamente 30°C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente 8,5 que comprende
25 fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes y aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8.500 ppm de iones cloruro. En algunas realizaciones, el peso de células seco de la biomasa aislada de cada litro de cultivo es al menos aproximadamente 50 g, al menos aproximadamente 60 g, al menos aproximadamente 70 g, al menos aproximadamente 80 g, al menos aproximadamente 100 g, al menos aproximadamente 120 g, al menos aproximadamente 140 g, al menos aproximadamente 160 g, al menos aproximadamente 180 g o al menos
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aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50% o al menos aproximadamente 60% en peso del peso de células seco de la biomasa es ácido docosahexaenoico. En algunas realizaciones, aproximadamente 25% a aproximadamente 65%, aproximadamente 25% a aproximadamente 50%, aproximadamente 30% a aproximadamente 40% o aproximadamente 25% a aproximadamente 35% en peso del peso de células seco de la biomasa es ácido docosahexaenoico. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 10% o menos, aproximadamente 9% o menos, aproximadamente 8% o menos, aproximadamente 7% o menos, aproximadamente 6% o menos, aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos o aproximadamente 1% o menos en peso de los ácidos grasos como EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, aproximadamente 2% a aproximadamente 5%, aproximadamente 3% a aproximadamente 5% o aproximadamente 3% a aproximadamente 10% en peso de los ácidos grasos como EPA. En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente exenta de EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende una relación en peso de DHA a EPA de al menos aproximadamente 5:1, al menos aproximadamente 7:1, al menos aproximadamente 10:1, al menos aproximadamente 11:1, al menos aproximadamente 14:1, al menos aproximadamente 15:1, al menos aproximadamente 17:1, al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 25:1, al menos aproximadamente 50:1 o al menos aproximadamente 100:1, en la que la biomasa comprende aproximadamente 10% o menos en peso de los ácidos grasos como EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente 0,1% a 0,2%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,5% o aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1,5% en peso de los ácidos grasos como ARA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 1,5% o menos, aproximadamente 1% o menos, aproximadamente 0,5% o menos, aproximadamente 0,4% o menos, aproximadamente 0,3% o menos, aproximadamente 0,2% o menos o aproximadamente 0,1% o menos en peso de los ácidos grasos como ARA. En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente exenta de ARA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende una relación en peso de DHA a ARA de al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 40:1, al menos aproximadamente 60:1, al menos aproximadamente 80:1, al menos aproximadamente 100:1, al menos aproximadamente 150:1, al menos aproximadamente 200:1, al menos aproximadamente 250:1 o al menos aproximadamente 300:1. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 6%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 6%, aproximadamente 2% a aproximadamente 5% o aproximadamente 2% a aproximadamente 6% en peso de los ácidos grasos como DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 6% o menos, aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1% o menos o aproximadamente 0,5% o menos en peso de los ácidos grasos como DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente exenta de DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa comprende una relación en peso de DHA a DPA n-6 de mayor que aproximadamente 6:1, al menos aproximadamente 8:1, al menos aproximadamente 10:1, al menos aproximadamente 15:1, al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 25:1, al menos aproximadamente 50:1 o al menos aproximadamente 100:1. En algunas realizaciones, la biomasa comprende ácidos grasos con aproximadamente 5%
o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos o aproximadamente 2% o menos en peso cada uno de ácido linoleico (18:2 n-6), ácido linolénico (18:3 n-3), ácido eicosenoico (20:1 n-9) y ácido erúcico (22:1 n-9).
Las características de una biomasa aislada de la descripción se asocian a propiedades endógenas o naturales de la biomasa aislada en vez de materiales introducidos de manera exógena.
Aceites microbianos
La presente descripción se refiere además a métodos para producir aceites microbianos. En algunas realizaciones, el método comprende cultivar un traustoquítrido de la descripción en un cultivo para producir una biomasa y extraer un aceite que comprende ácidos grasos omega-3 de la biomasa. El aceite puede extraerse de una biomasa recién recogida o puede extraerse de una biomasa recogida previamente que se haya almacenado en condiciones que eviten el deterioro. Se pueden usar métodos conocidos para cultivar un traustoquítrido de la descripción, aislar una biomasa del cultivo, extraer un aceite microbiano de la biomasa y analizar el perfil de ácidos grasos de los aceites extraídos de la biomasa. Véase, por ej., la Patente de EE.UU. Nº 5.130.242.
La invención se refiere además a un aceite microbiano que comprende un perfil de ácidos grasos de la invención. Un aceite microbiano de la invención puede ser cualquier aceite procedente de un microorganismo, incluyendo, por ejemplo: Un aceite bruto extraído de la biomasa del microorganismo sin tratamiento adicional; un aceite refinado que se obtiene por tratamiento de un aceite microbiano bruto con etapas de tratamiento adicionales tales como refinado, blanqueamiento y/o desodorización; un aceite microbiano diluido obtenido por dilución de un aceite microbiano bruto
o refinado o un aceite enriquecido que se obtiene, por ejemplo, por tratamiento de un aceite microbiano bruto o refinado con métodos adicionales de purificación para aumentar la concentración de un ácido graso (tal como DHA) en el aceite.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol de aproximadamente
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0%, al menos aproximadamente 0,1%, al menos aproximadamente 0,2%, al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 1,5%, al menos aproximadamente 2% o al menos aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol de desde aproximadamente 0% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0% a aproximadamente 5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 2% o aproximadamente 0,2% a aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol menor que aproximadamente 5%, menor que aproximadamente 4%, menor que aproximadamente 3% o menor que aproximadamente 2% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos de al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85% o al menos aproximadamente 90% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos de desde aproximadamente 65% a aproximadamente 95%, aproximadamente 75% a aproximadamente 95% o aproximadamente 80% a aproximadamente 95% en peso o aproximadamente 97% en peso o aproximadamente 98% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ácidos grasos libres de al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 1,5%, al menos aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 2,5% o al menos aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ácidos grasos libres de desde aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2,5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2,5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, aproximadamente 1,5% a aproximadamente 2,5%, aproximadamente 2% a aproximadamente 2,5% o aproximadamente 2% a aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ácidos grasos libres menor que aproximadamente 5%, menor que aproximadamente 4%, menor que aproximadamente 3%, menor que aproximadamente 2% o menor que aproximadamente 1% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esteroles de al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 1,5%, al menos aproximadamente 2% o al menos aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esteroles de desde aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2% o aproximadamente 1% a aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esteroles menor que aproximadamente 5%, menor que aproximadamente 4%, menor que aproximadamente 3%, menor que aproximadamente 2% o menor que aproximadamente 1% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de diglicéridos de al menos aproximadamente 1,5%, al menos aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 2,5%, al menos aproximadamente 3%, al menos aproximadamente 3,5% o al menos aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de diglicéridos de desde aproximadamente 1,5% a aproximadamente 3%, aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, aproximadamente 1,5% a aproximadamente 3,5%, aproximadamente 1,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 2,5% a aproximadamente 3%, aproximadamente 2,5% a aproximadamente 3,5% o aproximadamente 2,5% a aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende insaponificables de menos de aproximadamente 2%, menos de aproximadamente 1,5%, menos de aproximadamente 1% o menos de aproximadamente 0,5% en peso del aceite. Las clases de lípidos presentes en el aceite microbiano, tal como la fracción de triglicéridos, pueden separarse por cromatografía por desorción súbita y analizarse por cromatografía de capa fina (TLC, por sus siglas en inglés) o separarse y analizarse por otros métodos conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esteroles, la fracción de diglicéridos y combinaciones de las mismas, comprende al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75% o al menos aproximadamente 80% en peso de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esteroles, la fracción de diglicéridos y combinaciones de las mismas, comprende desde aproximadamente 40% a aproximadamente 45%, aproximadamente 40% a aproximadamente 50%, aproximadamente 40% a aproximadamente 60%, aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 55% a aproximadamente 60%, aproximadamente 40% a aproximadamente 65%, aproximadamente 50% a aproximadamente 65%, aproximadamente 55% a aproximadamente 65%, aproximadamente 40% a aproximadamente 70%, aproximadamente 40% a aproximadamente 80%, aproximadamente 50% a aproximadamente 80%, aproximadamente 55% a aproximadamente 80%, aproximadamente 60% a aproximadamente 80% o aproximadamente 70% a aproximadamente 80% en peso de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol que comprende aproximadamente 45% o menos, aproximadamente 40% o menos, aproximadamente 35% o menos, aproximadamente 30% o menos, aproximadamente 25% o menos, aproximadamente 20% o menos, aproximadamente 15% o menos o aproximadamente 13% o menos en peso de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de
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el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esteroles, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprenden una relación en peso de DHA a DPA n-6 mayor que aproximadamente 6:1, al menos aproximadamente 8:1, al menos aproximadamente 10:1, al menos aproximadamente 15:1, al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 25:1, al menos aproximadamente 50:1 o al menos aproximadamente 100:1. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esteroles, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprenden aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1,5% o menos, aproximadamente 1% o menos o aproximadamente 0,5% o menos en peso de cada uno de ácido linoleico (18:2 n-6), ácido linolénico (18:3 n-3), ácido eicosenoico (20:1 n-9) y ácido erúcico (22:1 n-9). En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esteroles, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprenden aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1,5% o menos o aproximadamente 1% o menos en peso de ácido heptadecanoico (17:0). En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo comprenden aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5% en peso, aproximadamente 0,05% a aproximadamente 3% en peso o aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1% en peso de ácido heptadecanoico.
La molécula de triglicérido contiene 3 átomos de carbono centrales (Csn-1H2R1-Csn-2H2R2-CSn-3H2R3), que permite la formación de diferentes isómeros de posición. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos en la que al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35% o al menos aproximadamente 40% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contiene DHA en dos posiciones en el triglicérido (DHA disustituido) seleccionadas de dos cualesquiera de las posiciones sn1, sn-2y sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos en la que de aproximadamente 20% a aproximadamente 40%, aproximadamente 20% a aproximadamente 35%, aproximadamente 30% a aproximadamente 40% o aproximadamente 30% a aproximadamente 35% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contiene DHA en dos posiciones en el triglicérido seleccionadas de dos cualesquiera de las posiciones sn-1, sn-2 o sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos en la que al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15% o al menos aproximadamente 20% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contiene DHA en todas las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3 (DHA trisustituido), basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos en la que de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, aproximadamente 10% a aproximadamente 20% o aproximadamente 10% a aproximadamente 15% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contiene DHA en todas las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo HPLC. Por el contrario, las especies TAG indicadas en la Patente de EE.UU. Nº 6.582.941 no contienen DHA en las tres posiciones. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos en la que al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 75% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contiene DHA en una posición en el triglicérido seleccionada de una cualquiera de las posiciones sn-1, sn-2 o sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos en la que de aproximadamente 50% a aproximadamente 75%, aproximadamente 50% a aproximadamente 70%, aproximadamente 50% a aproximadamente 65%, aproximadamente 60% a aproximadamente 75%, aproximadamente 60% a aproximadamente 70% o aproximadamente 60% a aproximadamente 65% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contiene DHA en una posición en el triglicérido seleccionada de una cualquiera de las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo HPLC.
Composiciones
La invención se refiere además a composiciones que comprenden un traustoquítrido de la invención, una biomasa aislada de la invención, un aceite microbiano de la invención o combinaciones de los mismos.
Un aceite de traustoquítrido, biomasa o microbio de la invención se puede modificar o tratar más de manera química
o de manera física basándose en los requerimientos de la composición por cualquier técnica conocida.
Las células o biomasas de traustoquítrido pueden secarse previamente a su uso en una composición por métodos que incluyen, pero no se limitan a, secado por congelación, secado al aire, secado por pulverización, secado en túnel, secado a vacío (liofilización) o un procedimiento similar. Alternativamente, se puede usar directamente una biomasa recogida y lavada en una composición sin secado. Véanse, por ej., las Patentes de EE.UU. Nos. 5.130.242 y 6.812.009.
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afección o trastorno. Las instrucciones pueden estar en cualquier forma que exprese información sobre el uso de las unidades o formas farmacéuticas en el estuche según los métodos de la descripción. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar en la forma de materia impresa o en la forma de un dispositivo de medio prerregistrado.
Durante el examen de un paciente, un profesional médico puede determinar que la administración de uno de los métodos de la presente descripción sea apropiada para el paciente o el médico puede determinar que la afección del paciente puede mejorarse por la administración de uno de los métodos de la presente descripción. Previamente a prescribir cualquier régimen, el médico puede asesorar al paciente, por ejemplo, sobre los diversos riesgos y beneficios asociados al régimen. Se puede proporcionar al paciente una descripción completa de todos los riesgos conocidos y sospechados asociados al régimen. Dicho asesoramiento se puede proporcionar de manera verbal, así como en forma escrita. En algunas realizaciones, el médico puede proporcionar al paciente materiales bibliográficos sobre el régimen, tal como información del producto, materiales educacionales y similares.
La presente descripción también se refiere a métodos para educar a los consumidores sobre los métodos de tratamiento, comprendiendo el método distribuir las formas farmacéuticas con información al consumidor en un punto de venta. En algunas realizaciones, la distribución tendrá lugar en un punto de venta con un farmacéutico o profesional de la salud.
El término “información para el consumidor” puede incluir, pero no se limita a, un texto en inglés, texto no en inglés, imagen visual, diagrama, grabación telefónica, sitio web para un representante de atención al cliente en directo. En algunas realizaciones, la información para el consumidor proporcionará direcciones para uso de las formas farmacéuticas según los métodos de la presente descripción, uso para la edad apropiada, indicación, contraindicaciones, dosificación apropiada, advertencias, número de teléfono de la dirección del sitio web. En algunas realizaciones, el método comprende además proporcionar información profesional a personas relevantes en una posición para contestar las preguntas del consumidor teniendo en cuenta el uso de los regímenes descritos según los métodos de la presente descripción. El término “información profesional” incluye, pero no se limita a, información acerca del régimen cuando se administra según los métodos de la presente descripción que se diseña para permitir que un profesional médico conteste las preguntas del consumidor.
Un “profesional médico” incluye, por ejemplo, un médico, auxiliar médico, enfermera especializada, farmacéutico y representante de atención al cliente.
Habiéndose descrito en general esta invención, se puede obtener más entendimiento por referencia a los ejemplos proporcionados en la presente memoria. Estos ejemplos son para fines ilustrativos sólo.
Ejemplo 1
El traustoquítrido aislado depositado con el Nº de Acceso ATCC PTA-9695 se caracterizó por clasificación tauxonómica.
Se recogieron muestras de hábitats entre mareas durante la marea baja. Se pusieron agua, sedimento, material vegetal vivo y restos vegetales/animales descompuestos en tubos de 50 ml estériles. Se extendieron porciones de cada muestra junto con el agua sobre placas de agar sólido de medio de aislamiento. El medio de aislamiento consistía en: 500 ml de agua de mar artificial, 500 ml de agua destilada, 1 g de glucosa, 1 g de glicerol, 13 g de agar, 1 g de glutamato, 0,5 g de extracto de levadura, 0,5 g hidrolizado de caseína, 1 ml de una disolución de vitaminas (100 mg/l de tiamina, 0,5 mg/l de biotina, 0,5 mg de B12), 1 ml de una disolución de mineral traza (metales PII, conteniendo por litro: 6,0 g de FeCl36H2O, 6,84 g de H3BO3, 0,86 g de MnCl24H2O, 0,06 g de ZnCl2, 0,026 de CoCl26H2O, 0,052 g de NiSO4H2O, 0,002 g de CuSO45H2O y 0,005 g de Na2MoO42H2O) y 500 mg cada uno de penicilina G y sulfato de estreptomicina. Se incubaron las placas de agar en la oscuridad a 20-25°C. Después de 2-4 días se examinaron las placas de agar con aumento y se recogieron colonias de células con un palillo estéril y se volvieron a sembrar en estrías sobre una placa fresca del medio. Se volvió a repetir la siembra en estrías de las células sobre medio fresco hasta que se eliminaron los organismos contaminados.
Se transfirieron colonias de placas de agar a placas de petri con agua de mar de media concentración y (1 ml) de una suspensión de larva de camarón de salmuera recién incubada en autoclave. La larva de camarón de salmuera llegó a multiplicarse intensamente con agrupaciones de esporangios después de 2-3 días. Las zoosporas se biflagelaron en el vertido, nadando activamente lejos del esporangio maduro, los restos de las paredes de los cuales son claramente visibles (en contraste de fase) después de la liberación de esporas. El esporangio midió 12,5 µm a 25 µm de diámetro y las zoosporas tuvieron 2,5 µm a 2,8 µm x 4,5 µm a 4,8 µm de tamaño. Hubo 8 a 24 esporas por esporangio individual. Las zoosporas sedimentadas se expandieron y experimentaron rápidamente divisiones binarias conduciendo a tétradas, octadas y finalmente a agrupaciones de esporangios. La formación de tetradas comenzó en una fase muy temprana previa a la madurez de los esporangios. Estas características están de acuerdo con el género Schizochytrium.
El traustoquítrido aislado depositado con el Nº de Acceso ATCC PTA-9695 se caracterizó además basándose en la similitud de su gen de ARNr 18s al de especies conocidas. El ADN genómico total del traustoquítrido depositado con el Nº de Acceso ATCC PTA-9695 se preparó por procedimientos clásicos (Sambrook J. y Rusell D. 2.001. Molecular
(Fermentas) según las instrucciones del fabricante y se determinó la secuencia de inserto de cada uno usando cebadores clásicos suministrados.
La Tabla 3 muestra identidades para la secuencia de aminoácidos de actina (SEC ID Nº 3) del traustoquítrido depositado con el Nº de Acceso ATCC PTA-9695 cuando se compara con secuencias de actina disponibles en la base de datos pública. Las identidades se determinaron por el uso de la matriz de clasificación "blosum62mt2" en el programa "AlignX" del programa VectorNTI, un patrón para alineamiento de proteínas.
Tabla 3: Comparación de % de Identidades de secuencias de proteína actina.
- Traustoquítridos
- % Identidad
- Thraustochytriidae sp. RT49
- 98
- Schizochytrium sp. ATCC 20888
- 96
- Thraustochytrium striatum
- 96
- Thraustochytrium aggregatum
- 96
- Japonochytrium marinum
- 95
- Thraustochytrium aureum
- 95
La Tabla 4 muestra identidades para la secuencia de aminoácidos de beta-tubulina (SEC ID Nº 5) del traustoquítrido 10 depositado con el Nº de Acceso ATCC PTA-9695 cuando se compara con secuencias de beta-tubulina disponibles en la base de datos pública. Las identidades se determinaron por el uso de la matriz de clasificación "blosum62mt2" en el programa "AlignX" del programa VectorNTI, un patrón para alineamiento de proteínas.
Tabla 4: Comparación de % Identidades de secuencias de proteína beta-tubulina.
- Traustoquítridos
- % Identidad
- Aplanochytrium kerguelense
- 100
- Aplanochytrium stocchinoi
- 100
- Japonochytrium marinum
- 100
- Labyrinthula sp. N8
- 100
- Thraustochytriidae sp. RT49
- 100
- Thraustochytrium aggregatum
- 100
- Thraustochytriidae sp. HU1
- 100
- Thraustochytrium aureum
- 100
- Thraustochytrium kinnei
- 100
- Thraustochytriidae sp. #32
- 100
- Thraustochytriidae sp. PW 19
- 100
- Schizochytrium aggregatum
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- Traustoquítridos
- % Identidad
- Schizochytrium sp. ATCC 20888
- 100
Basándose en las caracterizaciones anteriores, se cree que el traustoquítrido aislado depositado con el Nº de Acceso ATCC PTA-9695 representa una nueva especie de Schizochytrium y se designa por lo tanto también como Schizochytrium sp. ATCC PTA-9695.
Ejemplo 2
El traustoquítrido aislado depositado con el Nº de Acceso ATCC PTA-9695 produjo altos niveles de crecimiento celular en condiciones de cultivo variables, como se describe más adelante. Los típicos medios y condiciones de cultivo se muestran en la Tabla 1. También, se observaron altos niveles de ácidos grasos y DHA (es decir, más del 50% en peso del peso de células seco eran ácidos grasos y más de 50% en peso de los ésteres metílicos de ácidos grasos era DHA).
En cultivos alimentados con carbono y nitrógeno con 8.200 ppm de Cl-a 22,5°C con 20% de oxígeno disuelto a pH 7,0, el aislado produjo un peso de células seco de 140 g/l después de 7 días de cultivo, con un contenido de ácidos grasos de 70% en peso. Se usó alimento de amoníaco de bucle cerrado y se mantuvo el pH a 7,0. La productividad de omega-3 fue 8,92 g/(l*día) en estas condiciones, con 4,7 g/l de EPA (5% en peso de ácidos grasos) y 56,3 g/l de DHA (57% en peso de ácidos grasos) en 7 días.
En cultivos alimentados con carbono y nitrógeno con 3.640 ppm de Cl-a 22,5 °C con 20% de oxígeno disuelto a pH 7,0, el aislado produjo un peso de células seco de 82 g/l después de 7 días de cultivo, con un contenido de ácidos grasos de 58% en peso. La productividad de omega-3 fue 4,5 g/(l*día) en estas condiciones, con 2.1 g/l de EPA (4,3% en peso de ácidos grasos) y 28,5 g/l de DHA (58,7% en peso de ácidos grasos) en 7 días.
En cultivos alimentados con carbono y nitrógeno con 980 ppm de Cl-a 22,5°C con 20% de oxígeno disuelto a pH 7,0, el aislado produjo un peso de células seco de 60 g/l después de 7 días de cultivo, con un contenido de ácidos grasos de 53% en peso. La productividad de omega-3 fue 2,8 g/(l*día) en estas condiciones, con 1,1 g/l de EPA (3,4% en peso de ácidos grasos) y 18,4 g/l de DHA (56,8% en peso de ácidos grasos) en 7 días.
Ejemplo 3
Se extrajeron aceites de una muestra de biomasa (muestra A) del traustoquítrido aislado depositado con el Nº de Acceso ATCC PTA-9695. La muestra de biomasa fue producida en un cultivo alimentado con carbono y nitrógeno con 980 ppm de Cl-a 22,5°C con 20% de oxígeno disuelto a pH 7,0. Los aceites se extrajeron de muestra A de biomasa por el procedimiento de extracción con hexano para proporcionar muestra A1 de aceite microbiano. En resumen, se molió la biomasa seca con hexano usando tubos de acero inoxidable y rodamientos de bolas de acero inoxidable durante aproximadamente 2 horas. Se filtró a vacío la suspensión acuosa y se recogió el líquido filtrado. Se retiró el hexano usando un evaporador rotatorio. También se extrajeron aceites de Muestra A de biomasa usando el procedimiento FRIOLEX® (GEA Westfalia Separator UK Ltd., Milton Keynes, Inglaterra) para proporcionar Muestra A2 de aceite microbiano. Se aislaron clases de lípidos individuales de las muestras A1 y A2 de aceite microbiano usando cromatografía por desorción súbita de baja presión y se determinó el porcentaje en peso de cada clase. Se determinó el perfil de ácidos grasos de cada clase usando cromatografía de gases con detección de ionización de llama (GC-FID, por sus siglas en inglés) como ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME, por sus siglas en inglés).
Cromatografía por desorción súbita – Se usó cromatografía por desorción súbita para separar las clases de lípidos presentes en los aceites brutos y determinar el porcentaje en peso de cada clase presente en los aceites. El sistema cromatográfico utilizó gel de sílice 60 (EMD Chemical, Gibbstown, NJ) con fase móvil constituida por éter de petróleo y acetato de etilo a 3 ml/min. Se usó un gradiente de etapa para eluir de manera selectiva cada clase de lípido de la columna. El gradiente de fase móvil partió de 100% de éter de petróleo y acabó con 50% de acetato de etilo (seguido por un lavado con metanol al 100%). Se recogieron las fracciones en tubos de ensayo de 10 ml usando un recolector de fracciones de lecho grande Gilson FC 204 (Gilson, Inc., Middleton, WI). Se analizó cada tubo por cromatografía de capa fina (TLC) y se mezclaron los tubos que contenían las clases de lípidos individuales (como se juzgó por manchas únicas en placa TLC con factor de retención (Rf) esperado), se concentró a sequedad y se secó. Después se determinó por gravimetría el contenido de la fracción total.
Análisis TLC – Se realizó cromatografía de capa fina sobre placas de gel de sílice. Se eluyeron las placas usando un sistema de disolventes que consistía de éter de petróleo: etil éter : ácido acético (80:20:1) y se visualizaron usando vapor de yodo. Los valores Rf de cada mancha se compararon después con valores de la bibliografía referidos para cada clase de lípidos.
Análisis de ácidos grasos – Se analizó en las muestras de biomasa y clases de lípidos aisladas la composición de
ácidos grasos como los FAME. Se pesaron las muestras directamente en tubos de ensayo con tampón de rosca y se añadió 1 ml de patrón interno C19:0 (NuCheck, Elysian, MN) en tolueno y 2 ml de HCl 1,5 N en metanol a cada tubo. Se sometieron los tubos a agitación vorticial brevemente y se pusieron en un bloque térmico durante 2 horas a 100°C. Se retiraron los tubos del bloque térmico, se dejaron enfriar y se añadió 1 ml de NaCl saturado en agua. Se
5 sometieron de nuevo los tubos a agitación vorticial, se centrifugaron y se puso una porción de la capa de arriba (orgánica) en un vial de GC y se analizaron por GC-FID. Se cuantificaron los FAME usando una curva de calibración de patrón interno de 3 puntos generada usando patrón de referencia de GLC Nu-Chek-Prep (Nu-Chek Prep, Inc., Elysian, MN) y se identificaron provisionalmente basándose en tiempo de retención. Los ácidos grasos presentes se expresaron como mg/g y % de FAME total.
10 Se preparó la Muestra A1 por disolución del aceite bruto en hexano y aplicación a la cabeza de la columna. Después de fraccionamiento de la muestra usando cromatografía por desorción súbita, la fracción de éster de esterol representó 1,2% en peso, la fracción de triacilglicerol (TAG) representó 82,7% en peso, la fracción de ácidos grasos (AFG) representó 0,9% en peso y la fracción de diacilglicerol (DAG) representó 2,9% en peso del aceite bruto. Los perfiles de ácidos grasos totales del aceite bruto de la Muestra A1 y las fracciones aisladas se muestran a
15 continuación en la Tabla 5 y la Tabla 6 calculados como mg/g y % FAME, respectivamente.
Tabla 5: Perfiles de ácidos grasos de la Muestra A1 calculados como miligramos por gramo de FAME.
- imagen42
- Biomasa Aceite bruto Ésteres de esterol TAG AFG DAG
- % en peso
- NA 38% 1,2% 82,7% 0,9 2,9%
- Ácido graso
- FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g)
- C12:0*
- 0,6 0,0 1,9 3,2 1,7 0,0
- C14:0*
- 5,7 13,6 12,8 20,2 13,0 17,6
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C15:0
- 1,3 3,4 3,1 3,1 2,1 2,6
- C16:0*
- 105,5 239,5 222,2 274,3 183,3 225,1
- C16:1*
- 0,0 0,0 0,8 0,0 0,8 0,0
- C18:0*
- 6,4 16,4 43,1 16,8 9,8 14,0
- C18:1 N9*
- 0,0 3,8 1,9 3,3 1,0 3,5
- C18:1 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:2 N6*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:0*
- 1,8 5,5 13,0 4,7 2,0 2,9
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:4 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,6 0,0
- C20:2 N6*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N6
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- imagen43
- Biomasa Aceite bruto Ésteres de esterol TAG AFG DAG
- C22:0*
- 0,0 0,8 7,3 0,8 0,0 1,2
- C20:4 N7
- 0,0 0,0 0,8 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N6*
- 1,0 3,4 0,0 2,6 2,0 1,9
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 1,5 4,1 1,5 3,5 2,1 2,1
- C20:5 N3*
- 18,2 39,5 3,5 38,4 30,6 42,8
- C24:0*
- 0,0 0,0 6,3 0,0 0,0 0,0
- C22:4 N9
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C24:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C22:5 N6*
- 11,9 29,5 8,9 26,9 14,8 18,7
- C22:5 N3*
- 1,1 4,7 0,9 3,6 3,4 2,7
- C22:6 N3*
- 253,5 569,7 107,3 556,5 352,8 451,4
- Suma de todos los FAME
- 408,6 934,0 435,4 958,0 620,1 786,4
Tabla 6: Perfiles de ácidos grasos de la Muestra A1 como un porcentaje de FAME Total.
- imagen44
- Biomasa Aceite bruto Ésteres de esterol TAG AFG DAG
- Ácido graso
- % FAME % FAME % FAME % FAME % FAME % FAME
- C12:0*
- 0,1 0,0 0,4 0,3 0,3 0,0
- C14:0*
- 1,4 1,5 2,9 2,1 2,1 2,2
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C15:0
- 0,3 0,4 0,7 0,3 0,3 0,3
- C16:0*
- 25,8 25,6 51,0 28,6 29,6 28,6
- C16:1*
- 0,0 0,0 0,2 0,0 0,1 0,0
- C18:0*
- 1,6 1,8 9,9 1,8 1,6 1,8
- imagen45
- Biomasa Aceite bruto Ésteres de esterol TAG AFG DAG
- C18:1 N9*
- 0,0 0,4 0,4 0,3 0,2 0,4
- C18:1 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:2 N6*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:0*
- 0,4 0,6 3,0 0,5 0,3 0,4
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:4 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0
- C20:2 N6*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N6
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C22:0*
- 0,0 0,1 1,7 0,1 0,0 0,1
- C20:4 N7
- 0,0 0,0 0,2 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4N6*
- 0,3 0,4 0,0 0,3 0,3 0,2
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,3 0,3
- C20:5 N3*
- 4,5 4,2 0,8 4,0 4,9 5,4
- C24:0*
- 0,0 0,0 1,4 0,0 0,0 0,0
- C22:4 N9
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C24:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C22:5 N6*
- 2,9 3,2 2,1 2,8 2,4 2,4
- C22:5 N3*
- 0,3 0,5 0,2 0,4 0,5 0,3
- C22:6 N3*
- 62,0 61,0 24,6 58,1 56,9 57,4
- Suma de % FAME
- 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
Se preparó la muestra A2 por disolución del aceite bruto en hexano y aplicación a la cabeza de la columna. Después de fraccionamiento de la muestra usando cromatografía por desorción súbita, la fracción de éster de esterol representó 0,8% en peso, la fracción de triacilglicerol (TAG) representó 83,4% en peso, la fracción de ácidos grasos libre (AFG) representó 1,8% en peso y la fracción de diacilglicerol (DAG) representó 5,6% en peso del aceite bruto.
Los perfiles de ácidos grasos totales del aceite bruto de la Muestra A2 y las fracciones aisladas se muestran a continuación en la Tabla 7 y Tabla 8 calculados como mg/g y % FAME, respectivamente.
Tabla 7: Perfiles de ácidos grasos de la Muestra A2 calculados como miligramos por gramo de FAME.
- imagen46
- Biomasa Aceite bruto Ésteres de esterol TAG AFG DAG
- % en peso
- NA NA 0,8% 83,4% 1,8% 5,6%
- Ácido graso
- FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g)
- C12:0*
- 0,6 0,0 0,0 1,5 0,0 1,0
- C14:0*
- 5,7 13,2 8,9 14,1 9,5 5,4
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C15:0
- 1,3 3,3 2,8 3,4 2,1 2,2
- C16:0*
- 105,5 233,7 183,8 246,1 159,7 137,3
- C16:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,8 0,0 0,0
- C18:0*
- 6,4 16,6 23,6 16,9 11,3 5,6
- C18:1 N9*
- 0,0 7,6 5,0 4,3 2,4 2,6
- C18:1 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:2 N6*
- 0,0 2,2 0,7 1,6 0,8 5,1
- C20:0*
- 1,8 5,2 12,1 5,5 2,6 1,1
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:4 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,8 1,0 0,0
- C20:2 N6*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N6
- 0,0 0,0 0,0 0,3 0,0 0,0
- C22:0*
- 0,0 0,7 6,0 1,3 0,8 0,0
- C20:4 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N6*
- 1,0 3,0 0,0 3,1 2,3 1,2
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- imagen47
- Biomasa Aceite bruto Ésteres de esterol TAG AFG DAG
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 1,5 4,1 1,4 4,3 2,7 1,0
- C20:5 N3*
- 18,2 38,6 2,7 38,6 39,5 45,5
- C24:0*
- 0,0 0,0 4,7 0,6 0,0 0,3
- C22:4 N9
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C24:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C22:5 N6*
- 11,9 28,2 8,6 29,6 18,0 14,7
- C22:5 N3*
- 1,1 3,4 0,0 3,5 2,5 2,2
- C22:6 N3*
- 253,5 566,7 102,2 575,0 475,3 447,2
- Suma de todos los FAME
- 408,6 926,5 362,3 951,3 730,4 672,5
Tabla 8: Perfiles de ácidos grasos de la Muestra A2 como un porcentaje de FAME total.
- imagen48
- Biomasa Aceite bruto Ésteres de esterol TAG AFG DAG
- Ácido graso
- % FAME % FAME % FAME % FAME % FAME % FAME
- C12:0*
- 0,1 0,0 0,0 0,2 0,0 0,2
- C14:0*
- 1,4 1,4 2,4 1,5 1,3 0,8
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C15:0
- 0,3 0,4 0,8 0,4 0,3 0,3
- C16:0*
- 25,8 25,2 50,7 25,9 21,9 20,4
- C16:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0
- C18:0*
- 1,6 1,8 6,5 1,8 1,5 0,8
- C18:1 N9*
- 0,0 0,8 1,4 0,5 0,3 0,4
- C18:1 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:2 N6*
- 0,0 0,2 0,2 0,2 0,1 0,8
- C20:0*
- 0,4 0,6 3,3 0,6 0,4 0,2
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- imagen49
- Biomasa Aceite bruto Ésteres de esterol TAG AFG DAG
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:4 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,0
- C20:2 N6*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N6
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C22:0*
- 0,0 0,1 1,7 0,1 0,1 0,0
- C20:4 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N6*
- 0,3 0,3 0,0 0,3 0,3 0,2
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,2
- C20:5 N3*
- 4,5 4,2 0,7 4,1 5,4 6,8
- C24:0*
- 0,0 0,0 1,3 0,1 0,0 0,0
- C22:4 N9
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C24:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C22:5 N6*
- 2,9 3,0 2,4 3,1 2,5 2,2
- C22:5 N3*
- 0,3 0,4 0,0 0,4 0,3 0,3
- C22:6 N3*
- 62,0 61,2 28,2 60,4 65,1 66,5
- Suma de % FAME
- 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
Ejemplo 4
Se aislaron los triacilglicéridos (los TAG) de una muestra de aceite microbiano extraída previamente del traustoquítrido aislado depositado con el Nº de Acceso ATCC PTA-9695 usando extracción de hexano (muestra A1) 5 o el procedimiento FRIOLEX® (GEA Westfalia Separator UK Ltd., Milton Keynes, Inglaterra) (muestra A2), como se describe en el Ejemplo 3. El porcentaje de área relativa de cada isómero TAG se determinó usando por cromatografía líquida de alta realización de fase inversa no acuosa (NARP-HPLC, por sus siglas en inglés) con detección por ionización química a presión atmosférica-espectrometría de masa (APCI-MS, por sus siglas en inglés) y se realizó identificación provisional de cada isómero de posición usando patrones de fragmentación de los
10 espectros de masas.
Se aislaron clases de lípidos individuales, incluyendo los TAG, usando cromatografía por desorción súbita. Se analizó la fracción de TAG por HPLC/APCI-MS para determinar qué restos de ácidos grasos están presentes en cada especie de TAG y las cantidades relativas de cada especie de TAG. La identificación provisional de cada pico de TAG se basaba en el tiempo de retención y el espectro APCI de cada pico. Cuando se usa NARP-HPLC, la 15 retención de cada TAG aumenta con el número de carbonos equivalente (NCE), que se define como el número total
- Tiempo de retención
- Pico Identificación provisional (sn-1/sn-2/sn-3) Porcentaje del área [M+H]+ [M + NH4]+ Fragmentos (DAG) principales
- 23,6
- 5 DHA/DPA/DHA 0,2 1.025,9 1.042,8 697,5
- 24,1
- 6 DHA/DHA/ARA 0,7 999,7 1.016,8 671,5; 695,5
- 24,6
- 7 DHA/DHA/DPA 2,4 1.025,7 1.042,5 695,5; 697,4
- 25,3
- 8 EPA/14:0/DHA 0,3 897,6 914,6 569,4; 595,3
- 25,9
- 9 DHA/DHA/14:0 2,6 923,7 940,7 595,4; 695,5
- 27,2
- 10 DHA/DHA/15:0 0,4 937,8 954,7 609,5; 695,5
- 27,5
- 11 EPA/EPA/16:0 0,2 899,5 916,7 597,5; 643,5
- 28,0
- 12 DHA/16:0/EPA 4,7 925,8 942,7 597,4; 623,5; 669,3
- 28,5
- 13 DHA/DHA/16:0 30,8 951,7 968,7 623,7; 695,5
- 29,5
- 14 DHA/ARA/16:0 0,7 927,6 944,7 599,5; 671,5
- 29,7
- 15 DHA/DPA/16:0 0,9 953,7 970,8 625,5; 697,5
- 30,4
- 16 DHA/16:0/ARA 0,9 927,7 944,6 599,5; 623,5
- 30,8
- 17 DHA/16:0/DPA 4,5 953,8 970,7 623,4; 625,3
- 31,1
- 18 DHA/18:0/DHA 1,8 979,7 996,7 651,5
- 32,3
- 19 DHA/14:0/16:0 2,3 851,7 868,7 523,5
- 33,6
- 20 DHA/15:0/16:0 0,8 865,7 882,7 537,4
- DHA/20:0/DHA
- 1.007,8 1.024,9 679,5
- 34,9
- 21 DHA/16:0/16:0 19,3 879,7 896,7 551,5; 623,5
- imagen51
-
imagen52 DHA/22:0/DHAimagen53 1.035,8 1.052,8 707,7
- 36,1*
- 22 DHA/18:0/15:0 0,5 893,8 910,8 565,5
- imagen54
-
imagen55 DPA/16:0/16:0imagen56 881,8 898,8 551,5; 625,4
- 37,4
- 23 DHA/16:0/18:0 3,7 907,7 924,7 579,5; 623,5
- 38,9
- 24 16:0/16:0/14:0 0,3 NA 796,7 523,4; 551,5
- 40,1
- 25 TAG que contiene DHA 0,4 1.117,9 1.134,9 789,7
- 40,8
- 26 TAG que contiene DHA 0,4 1.091,9 1.108,9 763,7
- 41,3
- 27 16:0/16:0/16:0 1,0 NA 824,6 551,5
- Tiempo de retención
- Pico Identificación provisional (sn-1/sn-2/sn-3) Porcentaje del área [M+H]+ [M + NH4]+ Fragmentos (DAG) principales
- 42,0
- 28 DHA/16:0/22:0 0,2 963,8 980,8 623,3; 635,4
- 43,5*
- 29 DHA/20:0/22:1 0,3 1.017,8 1.034,8 689,7
- 16:0/20:0/14:0
- 835,6 852,8 579,5; 607,5
- 45,6*
- 30 DHA/22:0/22:1 0,7 1.045,8 1.062,8 717,7
- 46,3*
- 31 DHA/20:0/22:0 0,5 1.019,8 1.036,9 691,7
Tabla 10: Identificación provisional de especies TAG por LC/APCI-MS en Muestra A2
- Tiempo de retención
- Pico Identificación provisional (sn1/sn-2/sn-3) Porcentaje del área [M+H]+ [M + NH4]+ Fragmentos (DAG)
- 21,4
- 1 EPA/EPA/DHA 0,3 971,7 988,8 643,5; 669,3
- 21,9
- 2 DHA/DHA/EPA 4,5 997,8 1.014,7 669,5; 695,5
- 22,3
- 3 DHA/DHA/DHA 14,0 1.023,7 1.040,7 695,5
- 23,3
- 4 DHA/ARA/DHA 0,6 999,6 1.016,7 671,4
- 23,6
- 5 DHA/DPA/DHA 0,3 1.025,9 1.042,8 697,5
- 24,1
- 6 DHA/DHA/ARA 0,9 999,7 1.016,8 671,5; 695,5
- 24,6
- 7 DHA/DHA/DPA 3,0 1.025,7 1.042,5 695,5; 697,4
- 25,4
- 8 EPA/14:0/DHA 0,2 897,6 914,6 569,4; 595,3
- 25,9
- 9 DHA/DHA/14:0 2,1 923,7 940,7 595,4; 695,5
- 27,2
- 10 DHA/DHA/15:0 0,5 937,8 954,7 609,5; 695,5
- 27,6
- 11 EPA/EPA/16:0 0,2 899,5 916,7 597,5; 643,5
- 28,1
- 12 DHA/16:0/EPA 4,2 925,8 942,7 597,4; 623,5; 669,3
- 28,5
- 13 DHA/DHA/16:0 31,4 951,7 968,7 623,7; 695,5
- 29,6
- 14 DHA/ARA/16:0 0,7 927,6 944,7 599,5; 671,5
- 29,8
- 15 DHA/DPA/16:0 0,6 953,7 970,8 625,5; 697,5
- 30,4
- 16 DHA/16:0/ARA 0,9 927,7 944,6 599,5; 623,5
- 30,8
- 17 DHA/16:0/DPA 4,5 953,8 970,7 623,4; 625,3
- Tiempo de retención
- Pico Identificación provisional (sn1/sn-2/sn-3) Porcentaje del área [M+H]+ [M + NH4]+ Fragmentos (DAG)
- 31,1
- 18 DHA/18:0/DHA 2,2 979,7 996,7 651,5
- 32,4
- 19 DHA/14:0/16:0 1,5 851,7 868,7 523,5
- 33,6
- 20 DHA/15:0/16:0 0,9 865,7 882,7 537,4
- DHA/20:0/DHA
- 1.007,8 1.024,9 679,5
- 34,9
- 21 DHA/16:0/16:0 16,1 879,7 896,7 551,5; 623,5
- imagen57
-
imagen58 DHA/22:0/DHAimagen59 1.035,8 1.052,8 707,7
- 36,1*
- 22 DNA/18:0/15:0 0,4 893,8 910,8 565,5
- imagen60
-
imagen61 DPA/16:0/16:0imagen62 881,8 898,8 551,5; 625,4
- 37,3
- 23 DHA/16:0/18:0 3,4 907,7 924,7 579,5; 623,5
- 39,7
- 24 16:0/16:0/14:0 0,9 NA 796,7 523,4; 551,5
- 40,0
- 25 TAG que contiene DHA 0,8 1.117,9 1.134,9 789,7
- 40,8
- 26 TAG que contiene DHA 0,6 1.091,9 1.108,9 763,7
- 41,3
- 27 16:0/16:0/16:0 0,7 NA 824,6 551,5
- 42,1
- 28 DHA/16:0/22:0 0,3 963,8 980,8 623,3; 635,4
- 43,5*
- 29 DHA/20:0/22:1 0,2 1.017,8 1.034,8 689,7
- 16:0/20:0/14:0
- 835,6 852,8 579,5; 607,5
- 45,6*
- 30 DHA/22:0/22:1 0,8 1.045,8 1.062,8 717,7
- 46,3*
- 31 DHA/20:0/22:0 0,7 1.019,8 1.036,9 691,7
Ejemplo 5
Después de extraer el aceite a partir del caldo de fermentación usando el procedimiento Friolex, como se describe en el Ejemplo 3, se trató más el aceite bruto por etapas de refinado, blanqueado y desodorización para obtener un 5 aceite final. Se diluyó el aceite final con aceite de girasol de alto contenido en oleico para obtener aceite comercial acabado con un contenido en DHA de aproximadamente 400 mg/g. Se aislaron las clases de lípidos individuales y se determinaron los perfiles de ácidos grasos de cada clase usando cromatografía de gases con detección de ionización de llama (GC-FID) como ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME).
Cromatografía por desorción súbita – Se usó cromatografía por desorción súbita para separar las clases de lípidos
10 presentes en el aceite final y determinar el porcentaje en peso de cada clase presente en el aceite. El sistema cromatográfico utilizó gel de sílice 60 (EMD Chemical, Gibbstown, NJ) con fase móvil constituida por éter de petróleo y acetato de etilo a 3 ml/min. Se usó un gradiente de etapas para eluir de manera selectiva cada clase de lípidos de la columna. El gradiente de fase móvil partió de 100% éter de petróleo y acabó con 50% de acetato de etilo (seguido por un lavado con metanol al 100%). Se recogieron las fracciones en tubos de ensayo de 10 ml usando un recolector
15 de fracciones de lecho grande Gilson FC 204 (Gilson, Inc., Middleton, WI). Se analizó cada tubo por cromatografía de capa fina (TLC) y se mezclaron los tubos que contenían clases de lípidos individuales (como se juzgó por manchas únicas en placa TLC con factor de retención (Rf) esperado), se concentró a sequedad y se secó. Después
se determinó por gravimetría el contenido de la fracción total.
Análisis TLC -Se realizó cromatografía de capa fina en placas de gel de sílice. Se eluyeron las placas usando un sistema disolvente que consistía en éter de petróleo: etil éter: ácido acético (80:20:1) y se visualizaron usando vapor de yodo. Los valores Rf de cada mancha se compararon después con los valores de la bibliografía indicados para
5 cada clase de lípidos.
Análisis de ácidos grasos – Se analizó en la muestra de aceite final y las clases de lípidos aisladas la composición de ácidos grasos como los FAME. Se pesaron las muestras directamente en tubos de ensayo con tapón de rosca y se añadió 1 ml de patrón interno C19:0 (NuCheck, Elysian, MN) en tolueno y 2 ml de HCl 1,5 N en metanol a cada tubo. Se sometieron los tubos a agitación vorticial brevemente y se pusieron en un bloque térmico durante 2 horas a 10 100°C. Se retiraron los tubos del bloque térmico, se dejaron enfriar y se añadió 1 ml de NaCl saturado en agua. Se sometieron de nuevo los tubos a agitación vorticial, se centrifugó y se puso una porción de la capa de arriba (orgánica) en un vial de GC y se analizó por GC-FID. Se cuantificaron los FAME usando una curva de calibración de patrón interno de 3 puntos generada usando patrón de referencia GLC Nu-Chek-Prep (Nu-Chek Prep, Inc., Elysian, MN) y se identificaron provisionalmente basándose en tiempo de retención. Los ácidos grasos presentes se
15 expresaron como mg/g y % de FAME total.
Se preparó la muestra por disolución de 250 mg de aceite final en 600 µl de hexano y aplicación a la cabeza de la columna. Después de fraccionamiento de la muestra usando cromatografía por desorción súbita, la fracción de éster de esterol representó 1,2% en peso, la fracción de triacilglicérido (TAG) representó 92,1% en peso, la fracción de ácidos grasos libres (FAG) representó 2,1% en peso, la fracción de esteroles representó 1,1%, la fracción de
20 diacilglicérido (DAG) representó 2,8% en peso del aceite final.
El análisis TLC de las fracciones mezcladas mostró que la AFG y las fracciones de esteroles se mezclaron con TAG y DAG, respectivamente. Los perfiles de ácidos grasos totales del aceite final FRIOLEX® y las fracciones aisladas se muestran a continuación en la Tabla 11 y Tabla 12 calculados como mg/g y % FAME, respectivamente.
Tabla 11: Perfil de ácidos grasos calculado como miligramos por gramo de FAME.
- imagen63
- Aceite Final Ésteres de esterol TAG AFG Esterol DAG
- % en peso
- NA 1,2 92,1 2,1 1,1 2,8
- Ácido graso
- FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g)
- C12:0*
- 0,0 0,0 1,0 0,0 1,2 0,6
- C14:0*
- 11,5 5,1 11,3 6,0 9,6 5,7
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C15:0
- 2,3 0,0 2,3 1,2 2,0 1,9
- C16:0*
- 183,3 80,0 180,8 99,9 149,3 132,2
- C16:1*
- 0,0 0,0 0,9 0,0 0,8 0,6
- C18:0*
- 19,6 17,5 19,6 7,5 16,2 6,7
- C18:1 N9*
- 243,3 242,8 249,6 62,9 190,5 84,0
- C18:1 N7
- 1,9 1,7 2,0 0,8 1,9 0,9
- C18:2 N6*
- 13,8 5,6 13,8 6,2 14,3 9,1
- C20:0*
- 4,3 6,6 4,5 1,5 3,6 1,4
- imagen64
- Aceite Final Ésteres de esterol TAG AFG Esterol DAG
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,3 0,0 0,0 0,0
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,8 0,0 0,8 0,0
- C18:4 N3
- 0,0 0,0 0,7 1,3 0,9 0,4
- C20:2 N6*
- 0,0 0,0 0,6 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N6
- 0,0 0,0 0,3 0,0 0,0 0,0
- C22:0*
- 3,3 61,0 3,2 1,1 3,0 1,2
- C20:4 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4N6*
- 1,7 0,0 2,3 1,4 1,9 1,3
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 2,4 4,5 3,0 2,2 2,6 1,3
- C20:5 N3*
- 28,1 3,0 27,7 38,6 25,6 43,2
- C24:0*
- 1,4 64,3 1,4 0,0 2,0 1,0
- C22:4 N9
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C24:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C22:5 N6*
- 20,0 7,6 21,0 10,1 17,2 14,4
- C22:5 N3*
- 2,8 0,0 3,1 3,7 3,4 2,9
- C22:6 N3*
- 407,1 72,5 417,4 443,6 350,5 428,5
- Suma de todos los FAME
- 936,1 572,1 967,6 688,0 797,3 737,3
Tabla 12: Perfiles de ácidos grasos como un porcentaje de FAME Total.
- imagen65
- Aceite Final Ésteres de esterol TAG AFG Esterol DAG
- Ácido graso
- % FAME % FAME % FAME % FAME % FAME % FAME
- C12:0*
- 0,0 0,0 0,1 0,0 0,2 0,1
- C14:0*
- 1,2 0,9 1,2 0,9 1,2 0,8
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C15:0
- 0,2 0,0 0,2 0,2 0,2 0,3
- C16:0*
- 19,6 14,0 18,7 14,5 18,7 17,9
- C16:1*
- 0,0 0,0 0,1 0,0 0,1 0,1
- C18:0*
- 2,1 3,1 2,0 1,1 2,0 0,9
- C18:1 N9*
- 26,0 42,4 25,8 9,1 23,9 11,4
- C18:1 N7
- 0,2 0,3 0,2 0,1 0,2 0,1
- C18:2 N6*
- 1,5 1,0 1,4 0,9 1,8 1,2
- C20:0*
- 0,5 1,1 0,5 0,2 0,5 0,2
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,1 0,0 0,1 0,0
- C18:4 N3
- 0,0 0,0 0,1 0,2 0,1 0,1
- C20:2 N6*
- 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N6*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C22:0*
- 0,4 10,7 0,3 0,2 0,4 0,2
- C20:4 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4N6*
- 0,2 0,0 0,2 0,2 0,2 0,2
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 0,3 0,8 0,3 0,3 0,3 0,2
- C20:5 N3*
- 3,0 0,5 2,9 5,6 3,2 5,9
- imagen66
- Aceite Final Ésteres de esterol TAG AFG Esterol DAG
- C24:0*
- 0,2 11,2 0,1 0,0 0,2 0,1
- C22:4 N9
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C24:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
- C22:5 N6*
- 2,1 1,3 2,2 1,5 2,2 1,9
- C22:5 N3*
- 0,3 0,0 0,3 0,5 0,4 0,4
- C22:6 N3*
- 43,6 12,7 43,1 64,5 44,0 58,1
- Suma de % de FAME
- 100 100 100 100 100 100
Ejemplo 6
Se realizó un análisis de los triacilglicéridos (los TAG) del aceite final descrito en el Ejemplo 5 usando técnicas descritas en el Ejemplo 4. Se realizó la identificación provisional de cada resto de ácido graso, como se resume en las Tablas 13 y 14 a continuación.
Tabla 13: Identificación provisional de especies TAG principales.
- Tiempo de retención máx., min,
- Identificación provisional (sn-1/sn-2/sn-3) Porcentaje del área
- imagen67
-
imagen68 imagen69
- 22,0
- DHA/DHA/EPA 3,4
- 22,5
- DHA DHA/DHA 10,4
- 24,7
- DHA/DHA/DPA 2,1
- 28,2
- DHA/16:0/EPA 3,4
- 28,7
- DHA/16:0/DHA 23,0
- 31,0
- DHA/16:0/DPA 3,3
- 35,2
- DHA/16:0/16:0 11,6
- 37,6
- DHA/16:0/18:0 4,3
- 40,4
- 18:1/18:1/18:1 14,0
Tabla 14: Identificación provisional de especies TAG por LC/APCI-MS
- Tiempo de retención
- Pico Identificación provisional (sn1/sn-2/sn-3) Porcentaje del área [M + H]+ [M + NH4]+ Fragmentos (DAG)
- 21,5
- 1 EPA/EPA/DHA 0,4 971,7 988,7 643,5; 669,5
- 22,0
- 2 DHA/DHA/EPA 3,4 997,8 1.014,7 669,4; 695,5
- Tiempo de retención
- Pico Identificación provisional (sn1/sn-2/sn-3) Porcentaje del área [M + H]+ [M + NH4]+ Fragmentos (DAG)
- 22,5
- 3 DHA/DHA/DHA 10,4 1.023,8 1.040,7 695,5
- 23,4
- 4 DHA/DHA/ARA 0,5 999,8 1.016,7 671,4; 695,3
- 23,7
- 5 DHA/DPA/DHA 0,3 1.025,7 1.042,7 697,5
- 24,2
- 6 DHA/DHA/ARA 0,8 999,7 1.016,8 671,5; 695,5
- 24,7
- 7 DHA/DHA/DPA 2,1 1.025,7 1.042,5 695,5; 697,4
- 25,6
- 8 EPA/14:0/DHA 0,2 897,7 914,8 569,4; 595,3
- 26,1
- 9 DHA/14:0/DHA 1,4 923,7 940,7 595,5; 695,5
- 27,4
- 10 DHA/15:0/DHA 0,3 937,8 954,8 609,3
- 27,7
- 11 EPA/16:0/EPA 0,2 899,5 916,7 597,5
- 28,2
- 12 DHA/16:0/EPA 3,4 925,7 942,7 597,5; 623,4; 669,3
- 28,7
- 13 DHA/16:0/DHA 23,0 951,7 968,7 623,5; 695,5
- 29,8
- 14 DHA/16:0/ARA 0,5 927,7 944,8 599,5; 623,5
- 30,0
- 15 DHA/16:0/DPA 0,7 953,8 970,8 623,4; 625,5
- 30,6
- 16 DHA/16:0/ARA 0,8 927,7 944,8 599,5; 623,5
- 31,0
- 17 DHA/16:0/DPA 3,3 953,7 970,7 623,4; 625,5
- 31,3
- 18 DHA/18:0/DHA 1,6 979,8 996,8 651,5
- 32,6
- 19 DHA/14:0/16:0 1,6 851,8 868,8 523,5
- 33,9
- 20 DHA/15:0/16:0 0,8 865,7 882,7 537,4
- DHA/20:0/DHA
- 1.007,8 1.024,8 679,5
- 35,2
- 21 DHA/16:0/16:0 11,6 879,7 896,8 551,5; 623,5
- imagen70
-
imagen71 DHA/22:0/DHAimagen72 1.035,8 1.052,8 707,7
- 36,4
- 22 DHA/18:0/15:0 0,5 893,8 910,8 565,5
- imagen73
-
imagen74 DPA/16:0/16:0imagen75 881,8 898,8 551,5; 625,4
- 37,6
- 23 DHA/16:0/18:0 4,3 907,8 924,8 579,5; 623,5
- 40,0
- 24 DHA/16:0/20:0 0,8 935,8 952,8 607,6; 623,5
Tabla 15: Mutantes de cepa de traustoquítrido Nº Acceso ATCC PTA-9695.
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 1 Mutante 2 Mutante 3 Mutante 4 Mutante 5 Mutante 8 Mutante 9 Mutante 10
- % 08:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 09:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 10:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 12:0
- 0,10 0,10 0,08 0,08 0,13 0,07 0,11 0,08 0,08
- % 12:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 13:0
- 0,11 0,11 0,17 0,13 0,12 0,18 0,11 0,15 0,14
- % 13:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 14:0
- 1,79 1,85 1,49 1,37 2,36 1,29 1,85 1,72 1,57
- % 14:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 15:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 16:0
- 30,98 28,75 29,96 29,97 30,33 29,86 30,97 30,11 29,20
- % 16:1
- 0,27 0,20 0,31 0,14 0,25 0,27 0,16 0,27 0,24
- % 16:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 16:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 17:0
- 0,12 0,15 0,13 0,17 0,27 0,12 0,16 0,13 0,13
- % 18:0
- 1,29 1,22 1,38 1,47 1,22 1,57 1,25 1,34 1,34
- % 18:1 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:1 n-7
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-6
- 0,00 0,03 0,00 0,00 0,07 0,00 0,03 0,00 0,00
- % 18:3 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:4 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:0
- 0,39 0,36 0,42 0,45 0,34 0,46 0,37 0,40 0,40
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 1 Mutante 2 Mutante 3 Mutante 4 Mutante 5 Mutante 8 Mutante 9 Mutante 10
- % 20:1 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-3
- 0,37 0,38 0,32 0,42 0,44 0,32 0,41 0,33 0,36
- % 20:4 ARA
- 0,55 0,55 0,94 0,57 0,80 0,89 0,60 0,73 0,75
- % 20:5 n-3 EPA
- 2,62 2,94 3,01 2,40 3,64 2,83 2,54 2,81 2,81
- % 22:0
- 0,08 0,08 0,09 0,09 0,07 0,10 0,07 0,09 0,09
- % 22:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:4 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:5 n-6
- 3,19 3,19 2,94 3,43 3,35 2,87 3,34 3,01 3,15
- % 22:5 n-3
- 0,18 0,18 0,21 0,23 0,20 0,18 0,20 0,17 0,18
- % 22:6 n-3 DHA
- 56,88 58,63 57,56 57,85 54,87 57,98 56,62 57,53 58,52
- % 24:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 24:1
- 0,00 0,08 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,09 0,00
- % Grasa
- 46,83 46,10 31,23 47,39 49,78 30,62 54,71 37,72 37,87
- % Desconocido
- 0,85 0,46 0,35 0,51 0,51 0,36 0,50 0,38 0,39
Tabla 16: Mutantes de cepa de traustoquítrido Nº Acceso ATCC PTA-9695.
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 11 Mutante 13 Mutante 14 Mutante 15 Mutante 16 Mutante 20 Mutante 21 Mutante 22
- % 08:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 09:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 11 Mutante 13 Mutante 14 Mutante 15 Mutante 16 Mutante 20 Mutante 21 Mutante 22
- % 10:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 12:0
- 0,10 0,10 0,08 0,09 0,11 0,11 0,09 0,09 0,10
- % 12:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 13:0
- 0,11 0,15 0,16 0,14 0,13 0,12 0,17 0,16 0,13
- % 13:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 14:0
- 1,79 1,89 1,43 1,75 1,83 1,98 1,76 1,77 1,81
- % 14:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 15:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 16:0
- 30,98 31,08 30,27 29,92 31,79 30,18 28,84 30,05 30,81
- % 16:1
- 0,27 0,32 0,26 0,28 0,21 0,24 0,23 0,23 0,33
- % 16:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 16:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 17:0
- 0,12 0,24 0,15 0,13 0,15 0,12 0,14 0,16 0,14
- % 18:0
- 1,29 1,36 1,44 1,31 1,36 1,21 1,28 1,34 1,33
- % 18:1 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:1 n-7
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-6
- 0,00 0,05 0,00 0,00 0,00 0,03 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:4 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:0
- 0,39 0,38 0,42 0,39 0,40 0,37 0,37 0,38 0,38
- % 20:1 n-9
- 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 11 Mutante 13 Mutante 14 Mutante 15 Mutante 16 Mutante 20 Mutante 21 Mutante 22
- % 20:3 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-3
- 0,37 0,43 0,36 0,33 0,36 0,37 0,33 0,35 0,34
- % 20:4 ARA
- 0,55 0,79 0,72 0,80 0,64 0,62 0,83 0,73 0,69
- % 20:5 n-3 EPA
- 2,62 3,17 2,72 2,97 2,52 2,66 3,03 2,90 2,87
- % 22:0
- 0,08 0,08 0,09 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08
- % 22:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:4 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:5 n-6
- 3,19 3,25 3,06 2,97 3,07 3,16 2,98 3,01 3,02
- % 22:5 n-3
- 0,18 0,20 0,19 0,17 0,19 0,16 0,17 0,18 0,18
- % 22:6 n-3 DHA
- 56,88 55,17 57,52 57,63 56,02 57,38 58,58 57,45 56,65
- % 24:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 24:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,07 0,00 0,00 0,08
- % Grasa
- 46,83 46,19 37,00 38,41 48,46 47,32 37,71 40,23 43,55
- % Desconocido
- 0,85 0,47 0,39 0,36 0,47 0,44 0,37 0,39 0,38
Tabla 17: Mutantes de cepa de traustoquítrido Nº Acceso ATCC PTA-9695.
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 24 Mutante 26 Mutante 27 Mutante 29 Mutante 30 Mutante 33 Mutante 34 Mutante 35
- % 08:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 09:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 10:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 24 Mutante 26 Mutante 27 Mutante 29 Mutante 30 Mutante 33 Mutante 34 Mutante 35
- % 12:0
- 0,10 0,11 0,09 0,09 0,08 0,08 0,10 0,11 0,09
- % 12:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 13:0
- 0,11 0,12 0,13 0,14 0,16 0,14 0,12 0,12 0,10
- % 13:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 14:0
- 1,79 1,98 1,71 1,69 1,63 1,66 1,93 2,01 1,59
- % 14:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 15:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,70 0,54 0,39
- % 16:0
- 30,98 30,61 30,32 30,21 29,70 29,50 30,26 32,28 30,78
- % 16:1
- 0,27 0,19 0,22 0,22 0,26 0,26 0,29 0,26 0,16
- % 16:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 16:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 17:0
- 0,12 0,15 0,18 0,16 0,13 0,13 0,26 0,16 0,12
- % 18:0
- 1,29 1,24 1,31 1,31 1,32 1,30 1,32 1,37 1,34
- % 18:1 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,10 0,11 0,09
- % 18:1 n-7
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:4 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:0
- 0,39 0,37 0,39 0,40 0,40 0,39 0,37 0,40 0,40
- % 20:1 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 0,14
- % 20:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-3
- 0,37 0,38 0,37 0,35 0,35 0,35 0,00 0,00 0,00
- % 20:4 ARA
- 0,55 0,61 0,59 0,69 0,68 0,32 0,34 0,24 0,28
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 24 Mutante 26 Mutante 27 Mutante 29 Mutante 30 Mutante 33 Mutante 34 Mutante 35
- % 20:5 n-3 EPA
- 2,62 2,62 2,70 2,85 2,90 2,91 3,28 2,51 2,59
- % 22:0
- 0,08 0,08 0,08 0,08 0,09 0,08 0,08 0,08 0,08
- % 22:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:4 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:5 n-6
- 3,19 3,10 3,11 3,05 3,10 3,11 3,43 3,26 3,56
- % 22:5 n-3
- 0,18 0,16 0,18 0,19 0,18 0,18 0,18 0,15 0,24
- % 22:6 n-3 DHA
- 56,88 57,03 57,46 57,46 57,96 58,52 55,92 54,96 56,73
- % 24:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 24:1
- 0,00 0,08 0,00 0,00 0,00 0,00 0,07 0,07 0,07
- % Grasa
- 46,83 47,80 43,50 38,86 38,60 38,16 46,95 46,43 51,55
- % Desconocido
- 0,85 0,45 0,42 0,39 0,37 0,82 1,25 1,23 1,25
Tabla 18: Mutantes de cepa de traustoquítrido Nº Acceso ATCC PTA-9695.
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 36 Mutante 37 Mutante 38 Mutante 39 Mutante 40 Mutante 42 Mutante 43 Mutante 44
- % 08:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 09:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 10:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 12:0
- 0,10 0,00 0,11 0,00 0,11 0,09 0,08 0,12 0,09
- % 12:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 13:0
- 0,11 0,44 0,09 0,24 0,12 0,11 0,12 0,08 0,15
- % 13:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 14:0
- 1,79 1,25 1,99 1,48 1,96 1,76 1,43 2,17 1,75
- % 14:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 15:1
- 0,00 2,12 0,48 0,71 0,54 0,55 0,36 0,62 0,50
- % 16:0
- 30,98 26,95 28,04 32,28 30,84 30,25 25,77 43,37 30,18
- % 16:1
- 0,27 0,00 0,26 0,23 0,22 0,21 0,10 1,05 0,22
- % 16:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 16:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 17:0
- 0,12 0,95 0,13 0,28 0,16 0,16 0,10 0,26 0,13
- % 18:0
- 1,29 1,58 1,11 1,79 1,30 1,29 1,25 2,21 1,34
- % 18:1 n-9
- 0,00 0,37 0,08 0,25 0,09 0,09 0,12 0,09 0,10
- % 18:1 n-7
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00
- % 18:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-6
- 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:4 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:0
- 0,39 0,34 0,31 0,43 0,38 0,39 0,36 0,61 0,40
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 36 Mutante 37 Mutante 38 Mutante 39 Mutante 40 Mutante 42 Mutante 43 Mutante 44
- % 20:1 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,43 0,00 0,14 0,15 0,15 0,49
- % 20:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-3
- 0,37 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:4 ARA
- 0,55 0,41 0,31 0,24 0,27 0,24 0,30 0,35 0,23
- % 20:5 n-3 EPA
- 2,62 5,36 2,77 4,00 2,72 2,80 3,21 3,47 2,80
- % 22:0
- 0,08 0,00 0,07 0,14 0,07 0,08 0,07 0,14 0,08
- % 22:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:4 n-6
- 0,00 0,00 0,06 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:5 n-6
- 3,19 2,40 3,94 2,57 3,48 3,29 3,89 2,37 3,33
- % 22:5 n-3
- 0,18 0,00 0,19 0,00 0,17 0,17 0,30 0,33 0,17
- % 22:6 n-3 DHA
- 56,88 57,52 58,57 54,20 56,24 57,09 60,99 41,61 56,76
- % 24:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 24:1
- 0,00 0,00 0,08 0,00 0,08 0,09 0,08 0,06 0,09
- % Grasa
- 46,83 12,73 54,86 18,08 45,74 42,59 42,48 56,44 41,20
- % Desconocido
- 0,85 0,29 1,36 0,73 1,26 1,20 1,31 0,90 1,20
Tabla 19: Mutantes de cepa de traustoquítrido Nº Acceso ATCC PTA-9695.
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 45 Mutante 46 Mutante 47 Mutante 48 Mutante 49 Mutante 50 Mutante 51 Mutante 52
- % 08:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 09:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 45 Mutante 46 Mutante 47 Mutante 48 Mutante 49 Mutante 50 Mutante 51 Mutante 52
- % 10:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 12:0
- 0,10 0,10 0,13 0,11 0,07 0,09 0,09 0,09 0,11
- % 12:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 13:0
- 0,11 0,11 0,10 0,09 0,13 0,09 0,13 0,10 0,09
- % 13:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 14:0
- 1,79 1,79 2,07 1,86 1,52 1,62 1,78 1,78 1,85
- % 14:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 15:1
- 0,00 0,41 0,76 0,57 0,46 0,48 0,55 0,53 0,53
- % 16:0
- 30,98 28,79 24,90 30,07 29,07 31,21 30,46 30,79 32,53
- % 16:1
- 0,27 0,19 0,24 0,18 0,17 0,17 0,18 0,21 0,22
- % 16:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 16:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 17:0
- 0,12 0,11 0,24 0,16 0,12 0,14 0,17 0,18 0,15
- % 18:0
- 1,29 1,24 1,07 1,28 1,41 1,43 1,36 1,48 1,35
- % 18:1 n-9
- 0,00 0,08 0,07 0,09 0,09 0,08 0,10 0,09 0,06
- % 18:1 n-7
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-6
- 0,00 0,00 0,12 0,05 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:4 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:0
- 0,39 0,36 0,29 0,37 0,42 0,42 0,39 0,40 0,41
- % 20:1 n-9
- 0,00 0,15 0,13 0,11 0,24 0,13 0,19 0,16 0,19
- % 20:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 45 Mutante 46 Mutante 47 Mutante 48 Mutante 49 Mutante 50 Mutante 51 Mutante 52
- % 20:3 n-6
- 0,00 0,00 0,05 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-3
- 0,37 0,00 0,12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:4 ARA
- 0,55 0,29 0,65 0,26 0,18 0,21 0,22 0,24 0,24
- % 20:5 n-3 EPA
- 2,62 3,05 4,28 2,66 2,93 2,46 2,71 2,94 2,44
- % 22:0
- 0,08 0,07 0,06 0,07 0,09 0,09 0,08 0,08 0,08
- % 22:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:4 n-6
- 0,00 0,06 0,07 0,05 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:5 n-6
- 3,19 3,59 4,28 3,46 3,07 3,32 3,17 3,18 3,24
- % 22:5 n-3
- 0,18 0,25 0,27 0,18 0,17 0,17 0,16 0,17 0,17
- % 22:6 n-3 DHA
- 56,88 57,74 58,32 56,70 58,65 56,45 56,83 56,19 55,06
- % 24:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 24:1
- 0,00 0,07 0,15 0,10 0,10 0,11 0,10 0,10 0,07
- % Grasa
- 46,83 48,91 58,95 54,80 35,41 48,60 44,93 43,01 51,93
- % Desconocido
- 0,85 1,55 1,63 1,57 1,09 1,35 1,31 1,28 1,19
Tabla 20: Mutantes de cepa de traustoquítrido Nº Acceso ATCC PTA-9695.
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 53 Mutante 54 Mutante 55 Mutante 56 Mutante 57 Mutante 58 Mutante 60 Mutante 61 Mutante 65
- % 08:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 09:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 10:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 53 Mutante 54 Mutante 55 Mutante 56 Mutante 57 Mutante 58 Mutante 60 Mutante 61 Mutante 65
- % 12:0
- 0,10 0,09 0,08 0,12 0,08 0,08 0,08 0,08 0,10 0,08
- % 12:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 13:0
- 0,11 0,11 0,12 0,08 0,09 0,13 0,16 0,14 0,09 0,14
- % 13:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 14:0
- 1,79 1,74 1,63 2,13 1,67 1,59 1,59 1,59 1,85 1,58
- % 14:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 15:1
- 0,00 0,53 0,52 0,48 0,51 0,52 0,45 0,50 0,51 0,48
- % 16:0
- 30,98 30,13 29,54 33,01 31,08 29,37 30,65 29,39 31,15 30,03
- % 16:1
- 0,27 0,21 0,23 0,26 0,26 0,14 0,25 0,22 0,26 0,25
- % 16:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 16:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 17:0
- 0,12 0,15 0,14 0,14 0,14 0,16 0,12 0,13 0,14 0,13
- % 18:0
- 1,29 1,30 1,30 1,37 1,38 1,37 1,46 1,30 1,30 1,35
- % 18:1 n-9
- 0,00 0,08 0,08 0,00 0,06 0,11 0,09 0,10 0,07 0,07
- % 18:1 n-7
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:4 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:0
- 0,39 0,38 0,39 0,40 0,42 0,38 0,43 0,39 0,39 0,41
- % 20:1 n-9
- 0,00 0,19 0,16 0,13 0,19 0,20 0,17 0,14 0,13 0,21
- % 20:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-3
- 0,37 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 53 Mutante 54 Mutante 55 Mutante 56 Mutante 57 Mutante 58 Mutante 60 Mutante 61 Mutante 65
- % 20:4 ARA
- 0,55 0,25 0,21 0,26 0,22 0,25 0,51 0,20 0,24 0,19
- % 20:5 n-3 EPA
- 2,62 2,75 2,78 2,81 2,67 2,78 5,76 2,72 2,59 2,82
- % 22:0
- 0,08 0,08 0,08 0,08 0,09 0,08 0,09 0,08 0,08 0,09
- % 22:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:4 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,06 0,00
- % 22:5 n-6
- 3,19 3,47 3,20 3,25 3,19 3,43 2,62 3,30 3,42 3,18
- % 22:5 n-3
- 0,18 0,18 0,18 0,17 0,17 0,20 0,59 0,17 0,17 0,17
- % 22:6 n-3 DHA
- 56,88 56,99 58,07 54,04 56,38 57,76 54,09 58,21 55,91 57,56
- % 24:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 24:1
- 0,00 0,09 0,09 0,07 0,10 0,09 0,11 0,10 0,07 0,08
- % Fat
- 46,83 45,83 39,59 48,81 41,92 43,97 33,96 36,97 50,40 36,21
- % Desconocido
- 0,85 1,28 1,19 1,19 1,29 1,35 0,77 1,24 1,48 1,17
Tabla 21: Mutantes de cepa de traustoquítrido Nº Acceso ATCC PTA-9695.
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 66 Mutante 67 Mutante 68 ATCC PTA9696 Mutante 69 Mutante 70 ATCC PTA9697 Mutante 71 Mutante 72 ATCC PTA9698 Mutante 73 Mutante 74
- % 08:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 09:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 10:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 11:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 12:0
- 0,15 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 0,00 0,00
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 66 Mutante 67 Mutante 68 ATCC PTA9696 Mutante 69 Mutante 70 ATCC PTA9697 Mutante 71 Mutante 72 ATCC PTA9698 Mutante 73 Mutante 74
- % 12:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 13:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 13:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,22 0,00 0,00 0,00
- % 14:0
- 2,42 2,29 2,07 2,09 2,11 2,21 2,27 2,29 1,97 2,05
- % 14:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,19 0,00 0,00 0,00
- % 15:1
- 0,55 0,47 0,48 0,47 0,47 0,44 0,46 0,40 0,50 0,47
- % 16:0
- 39,19 31,02 26,20 25,84 27,79 28,14 28,89 33,49 24,50 23,95
- % 16:1
- 0,43 0,19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,19 0,21 0,00 0,00
- % 16:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 16:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 17:0
- 0,16 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,13 0,00 0,00
- % 18:0
- 1,67 1,68 1,22 1,22 1,44 1,49 1,51 2,24 1,11 1,02
- % 18:1 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:1 n-7
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 18:3 n-3
- 0,00 0,18 0,20 0,21 0,19 0,17 0,22 0,16 0,22 0,22
- % 18:4 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:0
- 0,49 0,41 0,32 0,31 0,35 0,37 0,44 0,52 0,29 0,27
- % 20:1 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-9
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,15 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:3 n-3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 20:4 ARA
- 0,18 0,16 0,33 0,27 0,24 0,37 0,30 0,27 0,38 0,39
- Ácidos grasos
- ATCC PTA9695 control Mutante 66 Mutante 67 Mutante 68 ATCC PTA9696 Mutante 69 Mutante 70 ATCC PTA9697 Mutante 71 Mutante 72 ATCC PTA9698 Mutante 73 Mutante 74
- % 20:5 n-3 EPA
- 1,76 2,30 3,86 3,97 3,32 4,12 3,09 2,74 4,43 4,53
- % 22:0
- 0,33 0,46 0,35 0,44 0,48 0,38 0,43 0,12 0,35 0,34
- % 22:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:2
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:3
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:4 n-6
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 22:5 n-6
- 2,62 2,83 3,17 2,66 2,72 2,95 3,46 2,79 3,17 3,19
- % 22:5 n-3
- 0,18 0,18 0,46 0,42 0,34 0,61 0,25 0,27 0,48 0,57
- % 22:6 n-3 DHA
- 49,52 57,01 60,60 61,42 59,74 58,03 55,62 53,06 61,83 62,23
- % 24:0
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % 24:1
- 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
- % Grasa
- 52,70 49,32 48,51 49,49 48,80 53,65 40,38 63,40 48,27 46,63
- % Desconocido
- 0,35 0,82 0,73 0,66 0,67 0,73 2,46 1,18 0,78 0,76
Ejemplo 8
Se obtuvieron cuatro muestras de traustoquítridos de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y se analizó en cada muestra el perfil de ácidos grasos de la biomasa, el perfil de ácidos grasos del aceite bruto extraído, la 5 fracción de triacilglicérido (TAG) del aceite bruto y la fracción de lípidos polares (LP) del aceite bruto. Las muestras analizadas fueron ATCC 34304, 20890, 20889 y 20892. Se inocularon las cepas en matraces oscilantes de 250 ml que contenían 50 ml del siguiente medio: 1 g de peptona, 1 g de extracto de levadura, 5 g de glucosa en 1 litro de agua de mar artificial. Se incubaron los cultivos a 20°C con agitación a 21 rad/s (200 rpm) en un agitador orbital. Después de 7 días se recogieron los cultivos por centrifugación (5.087 xg), se lavaron con una mezcla de agua: 10 isopropanol (1:1) y se centrífugo de nuevo. Se liofilizó el botón resultante. Se extrajo el aceite bruto de la biomasa seca usando el método de Bligh y Dyer (Can. J. de Biol. And Phys. 37: 911-917 (1.959)). Se aislaron los TAG y LP del aceite bruto usando una variación del método de la fase sólida extraída (SPE, por sus siglas en inglés) desarrollado por Kaluzny et al. (J. Lipid Res. 26: 135-140 (1.959)). Se analizó en el aceite bruto y las fracciones aisladas el contenido en DHA y EPA así como el contenido en ácido graso total (como ésteres metílicos de ácidos
15 grasos).
Extracción de lípidos – Se extrajo aceite bruto de la biomasa liofilizada pesando 100 a 200 mg en un tubo de ensayo de parte superior roscada de 1,5 x 10 cm, añadiendo 8 ml de un sistema monofásico que consistía en cloroformo : metanol : agua (CHCl3:MeOH:H2O) 1:2:0,8 homogeneizando con una unidad de dispersión PT 3100 POLYTRON® provista de un agregado de PT-DA 3012/2. Se homogeneizó la muestra durante 2 minutos a 1.047 rad/s (10.000 20 rpm) mientras se sumergía en un baño de hielo. Se produjo un sistema bifásico por adición de 2,1 ml de CHCl3, agitando de manera vorticial durante 1 minuto, añadiendo 1,7 ml de H2O y sometiendo a agitación vorticial de nuevo durante 1 minuto adicional. Se retiró la capa del fondo (orgánica) usando una pipeta Pasteur y se puso en un matraz de recogida. Se volvió a extraer la capa de MeOH-H2O dejada en el tubo de ensayo, dos veces más con porciones
5
10
15
20
25
30
de 2,1 ml de CHCl3. Se combinaron las capas orgánicas y se secó bajo una corriente de nitrógeno.
Extracción de fase sólida – Se separaron las fracciones de TAG y LP del lípido bruto por SPE usando cartuchos de aminopropilo de 500 mg (Burdick & Jackson) puestos en un aparato Vac Elut. Se acondicionó el cartucho con 5 ml de hexano y se disolvieron 10 a 20 mg de cada muestra en 400 µl de CHCl3 y se aplicaron al cartucho. Se lavó la columna con 4 ml de CHCl3: alcohol isopropílico 2:1 (AIP) para eluir todos los lípidos neutros, que se recogieron y se secaron en nitrógeno. Después se eluyeron los ácidos grasos con 5 ml de ácido acético (HOAc) al 2% en éter, que se desechó. Se eluyó la porción de LP con 5 ml de MeOH, que se recogió y se secó en nitrógeno. Se volvió a disolver la fracción de lípidos neutra en 400 µl de hexano y se aplicó a una segunda columna de aminopropilo (acondicionada previamente con 5 ml de hexano). Se eluyeron de ésteres de esterol con 5 ml de acetato de etilo (EtOAc) al 1% en hexano y se desecharon. Finalmente, se eluyeron los TAG con 5 ml de EtOAc al 3% en hexano, que se recogieron y se secaron en nitrógeno.
Análisis TLC -Se realizó cromatografía de capa fina en placas de gel de sílice. Se eluyeron las placas usando un sistema disolvente que consistía en éter de petróleo : etil éter : ácido acético (80:20:1) y se visualizaron usando vapor de yodo.
Análisis de ácidos grasos – Se analizó en las muestras de biomasa, aceite bruto, fracciones aisladas de TAG y LP la composición de ácidos grasos como los FAME. Se pesaron las muestras directamente en tubos de ensayo con tapón de rosca y se añadió 1 ml de patrón interno C19:0 en tolueno y 2 ml de HCl 1,5 N en metanol a cada tubo. Se sometieron los tubos a agitación vorticial brevemente y se pusieron en un bloque térmico durante 2 horas a 100°C. Se retiraron los tubos del bloque térmico, se dejaron enfriar y se añadió 1 ml de NaCl saturado en agua. Se sometieron de nuevo los tubos a agitación vorticial, se centrifugó y se puso una porción de la capa de arriba (orgánica) en un vial de GC y se analizó por GC-FID. Se cuantificaron los FAME usando una curva de calibración de patrón interno de 3 puntos generada usando patrón de referencia GLC Nu-Chek-Prep y se identificaron provisionalmente basándose en tiempo de retención. Los ácidos grasos presentes se expresaron como mg/g y % de FAME total.
ATCC 34304 – Se estimó que el contenido en lípidos de la biomasa ATCC 34304 era 9,1% como la suma de FAME y la cantidad de aceite bruto obtenida después de extracción de disolvente fue 9,2% en peso, dando una recuperación del 101% de grasa presente en la biomasa. Se determinó que el contenido en EPA y DHA de la biomasa era 4,8 mg/g y 38,7 mg/g, respectivamente. El aceite bruto extraído contenía 25,9 mg/g de EPA y 238,7 mg/g de DHA. El TAG aislado contenía 13,9 mg/g de EPA y 303,9 mg/g de DHA, mientras el LP aislado 38,7 mg/g de EPA y 237,980 mg/g de DHA. Los perfiles de ácidos grasos totales de la biomasa, aceite bruto extraído, fracción de TAG y fracción de LP se muestran a continuación en la Tabla 22 y Tabla 23 calculados como mg/g y % FAME, respectivamente.
Tabla 22: Perfil de ácidos grasos de ATCC 34304 calculado como miligramos por gramo.
- imagen77
- Biomasa Aceite bruto TAG LP
- Ácido graso
- FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g)
- C12:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C14:0*
- 1,5 8,5 13,7 1,5
- C14:1*
- 0,0 0,2 0,0 0,0
- C15:0
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C16:0*
- 20,8 138,9 250,8 73,9
- C16:1*
- 0,2 2,9 6,9 0,3
- C18:0*
- 2,1 17,8 45,6 0,8
- C18:1 N9*
- 3,8 29,8 74,2 4,2
- C18:1 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- imagen78
- Biomasa Aceite bruto TAG LP
- Ácido graso
- FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g)
- C18:2 N6*
- 1,5 12,0 31,0 2,5
- C20:0*
- 0,1 0,7 1,7 0,1
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:1 N9*
- 0,0 0,1 0,3 0,0
- C 18:4 N3
- 0,0 8,5 0,3 0,0
- C20:2 N6*
- 0,1 0,8 2,2 0,0
- C20:3 N6
- 0,0 2,5 6,3 0,5
- C22:0*
- 0,3 5,2 0,3 0,0
- C20:4 N7
- 0,4 2,7 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,6 0,0
- C20:4N6*
- 3,4 20,8 20,9 27,5
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 0,1 0,6 1,3 0,3
- C20:5 N3*
- 4,8 25,9 13,9 38,7
- C24:0*
- 0,4 0,2 0,3 0,0
- C22:4 N9
- 0,0 1,2 0,7 0,4
- C24:1 N9*
- 0,9 6,9 18,2 0,8
- C22:5 N6*
- 11,0 60,8 51,9 45,9
- C22:5 N3*
- 0,4 3,1 6,8 1,0
- C22:6 N3*
- 38,7 238,7 303,9 237,9
- imagen79
-
imagen80 imagen81 imagen82
- Suma de todo FAME
- 91,2 590,9 855,7 437,3
Tabla 23: Perfiles de ácidos grasos de ATCC 34304 calculados como un porcentaje de FAME total.
- Ácido graso
- % FAME % FAME % FAME % FAME
- C12:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C14:0*
- 1,7 1,5 1,6 0,4
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C15:0
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C16:0*
- 22,8 24,2 29,3 16,9
- C16:1*
- 0,2 0,5 0,8 0,1
- C18:0*
- 2,3 3,1 5,3 0,2
- C18:1 N9*
- 4,2 5,2 8,7 1,0
- C1R:1 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C1R:2 N6*
- 1,6 2,1 3,6 0,6
- C20:0*
- 0,1 0,1 0,2 0,0
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:4 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:2 N6*
- 0,1 0,1 0,3 0,0
- C20:3 N6
- 0,0 0,4 0,7 0,1
- C22:0*
- 0,3 0,9 0,0 0,0
- C20:4 N7
- 0,5 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,1 0,0
- C20:4N6*
- 3,7 3,4 2,4 6,3
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 0,1 0,1 0,2 0,1
- C20:5 N3*
- 5,3 4,5 1,6 8,8
- C24:0*
- 0,5 0,0 0,0 0,0
- C22:4 N9
- 0,0 0,0 0,1 0,1
- imagen85
- Biomasa Aceite bruto TAG LP
- Ácido graso
- FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g)
- C18:4 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:2 N6*
- 1,9 11,1 14,2 13,1
- C20:3 N6
- 1,0 5,4 2,4 8,0
- C22:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4N6*
- 5,3 33,6 35,8 35,3
- C22:1N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,2 0,0 0,0 1,1
- C20:4 N3
- 0,1 2,2 0,0 3,1
- C20:5 N3*
- 12,2 64,7 41,9 54,4
- C24:0*
- 0,3 0,0 0,0 0,2
- C22:4 N9
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C24:1 N9*
- 0,3 1,4 1,6 1,9
- C22:5 N6*
- 0,5 2,4 1,4 3,0
- C22:5 N3*
- 3,6 19,4 23,9 19,8
- C22:6 N3*
- 36,6 194,2 230,2 149,5
- imagen86
-
imagen87 imagen88 imagen89 imagen90
- Suma de todo FAME
- 92,3 535,1 735,0 450,9
Tabla 25: Perfiles de ácidos grasos de ATCC 20890 calculados como un porcentaje de FAME total.
- imagen91
- Biomasa Aceite crudo TAG LP
- Ácido graso
- % FAME % FAME % FAME % FAME
- C12:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C14:0*
- 0,7 1,0 3,1 0,7
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C15:0
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C16:0*
- 27,6 30,1 28,0 31,6
- C16:1*
- 0,2 0,3 0,6 0,2
- C18:0*
- 2,0 2,3 8,0 1,6
- C18:1 N9*
- 1,1 1,8 5,1 0,5
- C18:1 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:2 N6*
- 0,9 0,9 0,9 0,9
- C20:0*
- 0,1 0,0 0,0 0,1
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:4 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:2 N6*
- 2,1 2,1 1,9 2,9
- C20:3 N6
- 1,1 1,0 0,3 1,8
- C22:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N6*
- 5,8 6,3 4,9 7,8
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,2 0,0 0,0 0,3
- C20:4 N3
- 0,1 0,4 0,0 0,7
- C20:5 N3*
- 13,2 12,1 5,7 12,1
- imagen92
- Biomasa Aceite crudo TAG LP
- Ácido graso
- % FAME % FAME % FAME % FAME
- C24:0*
- 0,3 0,0 0,0 0,0
- C22:4 N9
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C24:1 N9*
- 0,3 0,3 0,2 0,4
- C22:5 N6*
- 0,6 0,4 0,2 0,7
- C22:5 N3*
- 3,9 3,6 3,2 4,4
- C22:6 N3*
- 39,7 36,3 31,3 33,2
- imagen93
-
imagen94 imagen95 imagen96 imagen97
- Suma de % FAME
- 100,00 100,0 100,0 100,0
ATCC 20889 – Se estimó que el contenido en lípidos de la biomasa era 3,3% como la suma de FAME y la cantidad de aceite bruto obtenida después de la extracción de disolvente fue 3,4% en peso, dando una recuperación del 103% de grasa presente en la biomasa. Se determinó que el contenido de EPA y DHA de la biomasa era 2,3 mg/g y
5 16,5 mg/g, respectivamente. El aceite bruto extraído contenía 26,8 mg/g de EPA y 205,1 mg/g de DHA. El TAG aislado contenía 7,3 mg/g de EPA y 185,9 mg/g de DHA, mientras que el LP aislado contenía 35,2 mg/g de EPA y 218,6 mg/g de DHA. Los perfiles de ácidos grasos totales de la biomasa, el aceite bruto extraído, la fracción TAG y la fracción LP se muestran a continuación en la Tabla 26 y Tabla 27 calculados como mg/g y % FAME, respectivamente.
10 Tabla 26: Perfil de ácidos grasos de ATCC 20889 calculado como miligramos por gramo.
- imagen98
- Biomasa Aceite crudo TAG LP
- Ácido graso
- FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g)
- C12:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C14:0*
- 0,5 8,3 32,0 2,8
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C15:0
- 0,0 0,0 0,0 0,1
- C16:0*
- 6,6 80,3 150,8 50,4
- C16:1*
- 0,1 1,7 12,3 0,0
- C18:0*
- 0,3 4,8 9,7 1,6
- C18:1 N9*
- 0,6 6,6 7,6 1,2
- C18:1 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:2 N6*
- 0,0 0,4 1,1 0,1
- imagen99
- Biomasa Aceite crudo TAG LP
- Ácido graso
- FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g)
- C20:0*
- 0,0 0,1 2,1 0,0
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:4 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:2 N6*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N6
- 0,0 0,1 0,7 0,1
- C22:0*
- 0,0 0,0 0,1 0,0
- C20:4 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4N6*
- 0,4 1,4 1,1 7,2
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 0,0 0,5 0,9 0,5
- C20:5 N3*
- 2,3 26,8 7,3 35,2
- C24:0*
- 0,1 0,4 1,8 0,0
- C22:4 N9
- 0,0 3,4 0,2 2,8
- C24:1 N9*
- 0,0 0,0 0,8 0,3
- C22:5 N6*
- 5,0 63,6 76,2 45,9
- C22:5 N3*
- 0,2 1,8 2,2 2,0
- C22:6 N3*
- 16,5 205,1 185,9 218,6
- imagen100
-
imagen101 imagen102 imagen103 imagen104
- Suma de todo FAME
- 32,8 405,2 493,0 368,7
Tabla 27: Perfiles de ácidos grasos de ATCC 20889 calculados como un porcentaje de FAME total.
- imagen105
- Biomasa Aceite crudo TAG LP
- Ácido graso
- % FAME % FAME % FAME % FAME
- imagen106
- Biomasa Aceite crudo TAG LP
- Ácido graso
- % FAME % FAME % FAME % FAME
- C12:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C14:0*
- 1,4 2,0 6,5 0,8
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C15:0
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C16:0*
- 20,3 19,8 30,6 13,7
- C16:1*
- 0,4 0,4 2,5 0,0
- C18:0*
- 0,8 1,2 2,0 0,4
- C18:1 N9*
- 1,8 1,6 1,5 0,3
- C18:1 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:2 N6*
- 0,1 0,1 0,2 0,0
- C20:0*
- 0,0 0,0 0,4 0,0
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:4 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:2 N6*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N6
- 0,0 0,0 0,1 0,0
- C22:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N6*
- 1,3 0,4 0,2 2,0
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 0,1 0,1 0,2 0,1
- C20:5 N3*
- 7,0 6,6 1,5 9,5
- C24:0*
- 0,3 0,1 0,4 0,0
- imagen107
- Biomasa Aceite crudo TAG LP
- Ácido graso
- % FAME % FAME % FAME % FAME
- C22:4 N9
- 0,0 0,8 0,0 0,8
- C24:1 N9*
- 0,0 0,0 0,2 0,1
- C22:5 N6*
- 15,3 15,7 15,5 12,5
- C22:5 N3*
- 0,5 0,5 0,5 0,5
- C22:6 N3*
- 50,2 50,6 37,7 59,3
- imagen108
-
imagen109 imagen110 imagen111 imagen112
- Suma de % FAME
- 100,0 100,0 100,0 100,0
ATCC 20892 – Se estimó que el contenido en lípidos de la biomasa era 8,8% como la suma de FAME y la cantidad de aceite bruto obtenida después de extracción de disolvente fue 12,1% en peso, dando una recuperación de 138% de grasa presente en la biomasa. Se determinó que el contenido en EPA y DHA de la biomasa era 8,3 mg/g y 43,3 mg/g, respectivamente. El aceite bruto extraído contenía 50,5 mg/g de EPA y 260,1 mg/g de DHA. El TAG aislado contenía 98,7 mg/g de EPA y 407,7 mg/g de DHA, mientras el LP aislado contenía 50,4 mg/g de EPA y 243,12 mg/g de DHA. Los perfiles de ácidos grasos totales de la biomasa, aceite bruto extraído, fracción de TAG y fracción de LP se muestran a continuación en la Tabla 28 y Tabla 29 calculados como mg/g y % FAME, respectivamente.
Tabla 28: Perfil de ácidos grasos de ATCC 20892 calculado como miligramos por gramo.
- imagen113
- Biomasa Aceite crudo TAG LP
- Ácido graso
- FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g)
- C12:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C14:0*
- 7,3 42,2 29,7 54,7
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,2
- C15:0
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C16:0*
- 18,9 109,0 133,5 116,7
- C16:1*
- 0,0 0,8 3,5 0,2
- C18:0*
- 0,0 2,6 9,1 0,7
- C18:1 N9*
- 0,6 7,3 22,0 1,3
- C18:1 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:2 N6*
- 0,0 1,4 9,7 0,4
- C20:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- imagen114
- Biomasa Aceite crudo TAG LP
- Ácido graso
- FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g) FAME (mg/g)
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C 18:4 N3
- 0,0 0,6 0,0 0,1
- C20:2 N6*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N6
- 0,3 1,1 6,3 0,6
- C22:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N6*
- 1,3 7,6 15,8 7,8
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 0,3 1,5 4,7 1,4
- C20:5 N3
- 8,3 49,6 97,0 49,8
- C24:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C22:4 N9
- 0,2 0,0 0,0 0,1
- C24:1 N9*
- 0,0 1,1 4,9 1,0
- C22:5 N6*
- 2,8 16,1 25,3 15,8
- C22:5 N3*
- 1,1 6,6 23,9 6,0
- C22:6 N3*
- 43,4 254,3 398,3 239,5
- imagen115
-
imagen116 imagen117 imagen118 imagen119
- Suma de todo FAME
- 87,5 508,0 800,7 498,2
Tabla 29: Perfiles de ácidos grasos de ATCC 20892 calculados como un porcentaje de FAME total.
- imagen120
- Biomasa Aceite crudo TAG LP
- Ácido graso
- % FAME % FAME % FAME % FAME
- C12:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C14:0*
- 8,3 8,3 3,6 11,0
- imagen121
- Biomasa Aceite crudo TAG LP
- Ácido graso
- % FAME % FAME % FAME % FAME
- C14:1*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C15:0
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C16:0*
- 21,6 21,4 16,4 23,4
- C16:1*
- 0,0 0,2 0,5 0,0
- C18:0*
- 0,0 0,5 1,1 0,1
- C18:1 N9*
- 0,7 1,4 2,6 0,2
- C18:1 N7
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:2 N6*
- 0,0 0,2 1,1 0,1
- C20:0*
- 0,0 0,1 0,6 0,0
- C18:3 N3*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C18:4 N3
- 0,0 0,1 0,0 0,0
- C20:2 N6*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:3 N6
- 0,3 0,2 0,7 0,1
- C22:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N7
- 1,9 0,8 1,6 0,2
- C20:3 N3
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N6*
- 1,4 1,5 1,9 1,6
- C22:1 N9*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N5
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C20:4 N3
- 0,3 0,3 0,5 0,3
- C20:5 N3*
- 9,5 9,7 11,9 10,0
- C24:0*
- 0,0 0,0 0,0 0,0
- C22:4 N9
- 0,2 0,0 0,0 0,0
- C24:1 N9*
- 0,0 0,2 0,5 0,2
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imagen1 imagen2
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