DE4427690A1 - Deuterium enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung als Zytostatikum oder Tumor-Therapeutikum - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend Deuterium und/oder deuterierte Substanzen und/oder Substanzen, die Deuterium anreichern bzw. freisetzen, zur Verwendung als Zytostatikum oder Tumortherapeutikum für die Bekämpfung von Tumoren und/oder Metastasen.

Die bisher entwickelten Tumortherapeutika und Zytostatika leiden alle an dem Nachteil, daß sie nicht ausreichend selek­ tiv zwischen Tumorzelle und gesunder Zelle unterscheiden. Die bisher entwickelten Tumortherapeutika und Zytostatika leiden zudem alle an dem Nachteil, daß sie gegen Hirntumore, dort insbesondere Glioblastome, sowie gegen Melanome nur ungenü­ gend wirksam sind, und eine Tumorprogression nur ungenügend verlangsamen. Dies zeigen insbesondere die mittleren Über­ lebenszeiten bei Glioblastom- und Melanom-Patienten von unter einem Jahr. Ebenso sind Tumortherapeutika gegen Bronchialkar­ zinome und Karzinome des Magen-Darm-Traktes nur ungenügend wirksam.

Bisherige Tumortherapeutika leiden zudem unter dem Nachteil, bereits in geringsten Konzentrationen hohe Nebenwirkungen, insbesondere Immunsuppression und Blutbildveränderungen und Knochenmarksdepression sowie Induktion von neuen Tumoren zu verursachen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die eine zytotoxische und/oder zellzyklusarretierende Wirkung auf Tumorzellen ausübt und das Wachstum normaler Zellen weitge­ hend unbeeinflußt läßt. Dadurch würden auch einige der bei Tumortherapeutika bekannten Nebenwirkungen vermieden.

Gelöst wird diese Aufgabe durch eine pharmazeutische Zusam­ mensetzung gemäß Patentanspruch 1, d. h. durch eine pharmazeu­ tische Zusammensetzung enthaltend Deuterium und/oder deute­ rierte Substanzen und/oder Substanzen, die Deuterium anrei­ chern bzw. freisetzen. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Systematische Untersuchungen zum Einsatz von Deuterium-ent­ haltenden Substanzen als Therapeutikum gegen Tumoren wurden bisher nicht durchgeführt, unklar war bisher insbesondere, ob Unterschiede in der Beeinflussung des Wachstums von Tumorzel­ len und normalen Zellen bestehen.

Daher wurden von dem Anmelder Studien über das Verhalten von Tumorzellen unter Deuteriumeinfluß durchgeführt.

Überraschenderweise wurde dabei eine direkte zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen festgestellt. Zudem wurde überraschend festgestellt, daß die direkte zytotoxische Wir­ kung von Deuterium stark selektiv auf Tumorzellen ist, d. h. daß diese in sehr viel stärkerem Maße abgetötet werden als vergleichbare Normalzellpopulationen. Überraschenderweise wurde zudem festgestellt, daß die bekannten Effekte der Zell­ zyklusarretierung und der Wachstumshemmung ebenfalls in hohem Maße selektiv für Tumorzellen sind, d. h. daß Zellzyklusarre­ tierung und Wachstumshemmung auf Tumorzellen sehr viel stär­ ker ausgeprägt ist als auf Normalzellen und somit eine selek­ tive Wirkung auf Tumorzellen vorliegt.

Die direkte zytotoxische Wirkung kann in vitro an Zellkultur­ material nachgewiesen werden. Dabei werden Zellen in vitro durch Zusatz einer Deuterium-enthaltenden Substanz bzw. Ver­ bindung zum Kulturmedium abgetötet. Die nachfolgenden Vol.-% Angaben sind wie folgt zu verstehen. D₂O, Molgewicht 20.03 g/mol, enthält 2 Atome Deuterium (4 g/mol) und ein Atom Sauer­ stoff (16 g/mol). Wird daher die Konzentration einer "Deute­ rium enthaltenden Substanz" festgelegt, beträgt ihr Gehalt an reinem Deuterium ca. 1-25%. Allgemein bedeuten die Vol.-%- Angaben, daß für andere Deuterium-enthaltende Substanzen die angegebene Zahl die Prozentzahl durch D ersetzter H-Atome darstellt, wenn die Substanz als Reinsubstanz verabreicht wird.

100 Vol.-% Deuterium enthaltende Substanz bedeutet, daß dort alle H-Atome durch D-Atome ersetzt sind.

Eine geeignete Konzentration zur Abtötung von über 95% Zel­ len, z. B. des Tumors HTZ-19 (malignes Melanom), unter geeig­ neten Kulturbedingungen als Monolayer ist über 50 Vol-% D₂O bzw. 99,86 g Deuterium pro kg Wirksubstanz oder eine andere Deuterium-enthaltende Substanz mit 50% durch D ersetzten H- Atomen, vorzugsweise über 70 Vol-% (139,81 g Deuterium/kg), ganz bevorzugt über 90 Vol-% (179,75 g Deuterium/kg). Höhere oder geringere Konzentrationen sind jedoch ebenfalls zur Abtötung von Tumorzellen in höherem bzw. geringerem Umfang geeignet.

Die Wachstumsinhibierung und Zellzyklusarretierung äußert sich in einer antiproliferativen Wirkung. Dabei wird das mittlere Wachstum der Zellen bei Zusatz von Deuterium-enthal­ tenden Substanzen zum Kulturmedium deutlich verlangsamt. Eine geeignete Konzentration zur Wachstumshemmung, gemessen als Hemmung des Einbaus von radioaktiv markiertem [³H]-Thymidin, z. B. des Tumors HTZ-243 (Astrozytom, Grad III) um 60% ist vorzugsweise zwischen 1 und 10 Vol.-% D₂O (zwischen 1,99 g und 19,97 g Deuterium/kg) oder andere Deuterium-enthaltende Substanz mit 1-10% durch D ersetzten H-Atomen im Kulturmedi­ um. Es ist jedoch auch jede andere Konzentration bis ca. 50 Vol.-% (99,86 g Deuterium/kg) möglich. Ab dieser Konzentra­ tion kommt es zusätzlich zur Wachstumsinhibierung auch zum Zelltod.

Bei einer Konzentration von ca. 10 Vol.-% (19,97 g Deuteri­ um/kg) D₂O oder Deuterium-enthaltender Substanz wurden bei Normalgliazellen HTZ-140 im gleichen Zeitraum nur 5% Wachs­ tumshemmung beobachtet.

Es hat sich gezeigt, daß Deuterium auf Tumorzellen eine hem­ mende Wirkung durch Hemmung der DNA-Synthese [³H-Thymidin- Einbau, Coligan, J.E., Kruisbeek, A.M., Margulies, D.H. She­ vach, E.M., Strober, W., Current Protocols Immunology, NIH Monographie, J. Wiley & Sons, New York, 1992], sowie durch direkte Zelltötung [Trypanblau-Färbung, G.K. Smith, Duch, D.S., Dev, I.K. Kaufmann, S.H., Metabolic Effects and Kill of Human T-Cell Leukemia by 5-Deaza acyclotetrahydrofolate, a Specific Inhibitor of Glycineamide Ribonucleotide Transformy­ lase, Cancer Res. 52, 4895-4903, (1992)] hat. Das Wachstum von normalen, nicht entarteten Zellen wird dagegen nur in geringerem Umfang beeinflußt. Daher eignen sich Deuterium- enthaltende Substanzen zur Herstellung eines Therapeutikums zur Tumortherapie. Insbesondere ist ein solches Therapeutikum zur Therapie von malignen Melanomen, Gliomen und Astrozyto­ men, Bronchialkarzinomen (insbesondere kleinzellige Bronchi­ alkarzinome), Neuroblastomen, sowie Karzinomen des Magen- Darm-Traktes geeignet.

Für die therapeutische Anwendung werden Deuterium oder deute­ riumhaltige bzw. deuteriumfreisetzende oder deuteriumanrei­ chernde Substanzen üblicherweise mit Hilfs-, Füll- und/oder Zusatzstoffen zusammen in einer pharmazeutischen Formulierung verwendet, vorzugsweise in Form von Zäpfchen, Salben, Lösun­ gen, Dispersionen und Emulsionen, Aerosolen, Schäumen, teil­ chenförmigen Mitteln (z. B. Granulaten, Agglomeraten, Puder, Mikroperlen und Adsorbaten), Pillen, Pastillen, Tabletten, Dragees, Kapseln bzw. Mikrokapseln, Kaugummiarten, Gewebe-, Blatt- oder Fadengrundlagen, mit Bandagen oder Verbänden, zum Rauchen oder Inhalieren sowie in Carriern, wie z. B. Liposo­ men.

Die Verabreichung erfolgt zur Therapie vorzugsweise lokal, intracutan oder transcutan; zur systemischen Anwendung vor­ zugsweise intravenös, intraarteriell, oral, rectal; zur An­ wendung in Hohlräumen vorzugsweise intrathekal, intraperi­ toneal oder intracavitär. Für therapeutische Anwendungen werden Deuterium oder deuteriumhaltige bzw. deuteriumfreiset­ zende oder deuteriumanreichernde Substanzen auch mit anderen Wirkstoffen kombiniert, vorzugsweise anderen Zytostatika oder Tumortherapeutika. Durch den neuentdeckten Effekt der Zell­ abtötung sowie die Tumorspezifität der zellabtötenden und der zellzyklusarretierenden Wirkung können additive bzw. über­ additive Wirkungen in Kombination mit anderen Zytostatika und Tumortherapeutika erreicht werden. Insbesondere ist von einer Kombination mit erfindungsgemäßen deuteriumhaltigen Therapeu­ tika eine Reduktion der Dosis des kombinierten Zytostati­ kums/Tumortherapeutikums zu erwarten und demzufolge auch eine Minderung der oft Therapie-einschränkenden Nebenwirkungen.

Insbesondere ist eine Kombination mit Zytostatika/Tumorthera­ peutika erfolgversprechend, die auf gleichen oder ähnlichen Wirkprinzipien wie Deuterium beruhen, nämlich Zellabtötung (auch Apoptose) und Zellzyklusarrest.

Beispiele für mögliche Kombinationspartner sind daher:
Zelltodauslösende Substanzen: wie z. B. Adriamycin, Cisplatin, Cyclosporin A
Inhibierende Wachstumsfaktoren, die Zelltod auslösen können: wie z. B. TGV-β (Tumor growth factor β), TNF (Tumor necrosis factor)
Alkylantien: wie z. B. Cyclophosphamid, Busulfan, ACNU und andere Nitroseharnstoffderivate
Purin und Pyrimidin-Antagonisten wie z. B. Azathioprin, 6- Mercaptopurin, Cytarabin
Therapieeinschränkend ist bei vielen Zytostatika/Tumorthera­ peutika die hämatotoxische/immunsuppresive (Neben-)Wirkung (Verminderung der Blutzellzahlen/insbesondere Lymphozyten, sowie Knochenmarksdepression). Eine solche Wirkung ist von Deuterium bzw. Deuteriumhaltigen oder anreichernden Substan­ zen, wie für Normalhirnzellen und insbesondere Lymphozyten (Beispiel 6) gezeigt, nicht zu erwarten. Eine gleiche Wirkung kann daher durch Kombination solcher Tumortherapeutika mit Deuterium bzw. deuteriumhaltigen und freisetzenden Substanzen bei geringerer Dosis erzielt werden. Bei gleicher Dosis kann durch die Kombination mit Deuterium ein größerer Antitumor- Effekt als bisher möglich erreicht werden.

Deuterierte Tumortherapeutika sind daher insbesondere geeig­ net zur Kombination mit
Antimetaboliten: wie z. B. Methotrexat, Thioguanin
Alkaloide: wie z. B. Vinblastin, Vincristin
Antibiotika mit Tumor-therapeutischer Potenz: wie z. B. Dauno­ rubicin, Bleomycin, Epirubicin
verschiedenen anderen Knochenmarks-depressiv wirkenden Tumor­ therapeutika, wie z. B. Hydroxyharnstoff, Procarbazin sowie Alkylantien, und Purin/Pyrimidinderivate.

Die Zellproliferation wurde mittels ³H-Thymidin-Einbau, wie z. B. in "Bogdahn, U., R. Apfel, M. Hahn, M. Gorlach, C. Bohl, J. Hoppe und R. Martin: Autocrine tumor cell growth inhibi­ ting activities from Human Malignant Melanoma, cancer Res. 49, 5358-5363 (1989)" dargestellt, gemessen. Wachstums- und Überlebenskurven liegen Zellzählung mit Trypanblau-Farbstoff zugrunde.

Vorzugsweise werden die Tumore Glioblastoma multiforme, Astrozytom (WHO-Grad III), malignes Melanom, kleinzelliges Bronchialkarzinom und Colonkarzinom durch die erfindungsgemä­ ße Zusammensetzung therapiert.

Als Kontrolle für Normalzellen können Zellen aus Normalhirn (nach Schädel-Hirn-Trauma), Normalhirn oder IL-2 stimulierte (frisch isolierte) Lymphozyten, PHA stimulierte (frisch iso­ lierte) Lymphozyten verwendet werden.

Die Wirkung von Deuterium auf Zellen wird vorzugsweise mit D₂O erreicht. Die erfindungsgemäße Wirkung von Deuterium kann aber auch durch andere, Deuterium enthaltende oder Deuterium in geeigneter Weise freisetzende oder anreichernde Substanzen erzielt werden. Darunter sind alle denkbaren anorganischen oder organischen Verbindungen, die Deuterium enthalten, zu verstehen, z. B. insbesondere deuterierte Aminosäuren (wie z. B. deuteriertes Glutamin, deuteriertes Alanin und deute­ riertes Glutamat), deuterierte Zucker (wie z. B. deuterierte Glucose, deuterierte Fructose), deuterierte Fette, deuterier­ te DNA- oder RNA-Bausteine (z. B. deuteriertes Adenin, Guanin, Cytosin, Thymidin, Uracil) sowie deuterierte Stoffwechsel­ produkte (z. B. deuteriertes Pyruvat, deuteriertes Lactat) sowie deuterierte Stoffwechselprodukte des Intermediärstoff­ wechsels.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele in Verbin­ dung mit den anhängenden Abbildungen erläutert. Die Abbildun­ gen zeigen:

Abb. 1, 2, 9, 13, 14, 19, 23 ³H-Thymidin-Einbau in Relation zur Deuterium- Konzentration,

Abb. 3, 4, 10, 15, 16, 20, 24 Wachstumskurven von Tu­ morzellen und Kontrollen,

Abb. 5, 6, 11, 17, 21, 25 Überlebensrate von Tumor­ zellen in Relation zur Aufenthaltsdauer in Deu­ terium-enthaltenden Me­ dien,

Abb. 7, 8, 12, 18, 22, 26 Überlebensfraktion von Tumorzellen in Relation zur Aufenthaltsdauer in Deuterium-enthaltenden Medien.

Beispiel 1 Bestimmung der antiproliferativen Kapazität von Deuterium auf Tumorzellen

Zur Bestimmung der antiproliferativen Wirkung von Deuterium auf Tumorzellen werden exponentiell wachsende HTZ-209B, HTZ 243, HTZ 19, HTB 69, HTZ 25, CaCo-2 oder HT 29 Zellen für jeweils mindestens 24 Stunden in Mikrokulturplatten mit 96 Vertiefungen (wells) (Costar, Zürich) in 200 µl Kulturmedium mit einer Dichte von 3000 Zellen pro well ausgesät [nach Chambard et al. J. Cell. Physiol. 135 (1988), 101-107]. Das Kulturmedium besteht aus Dulbeccos MEM mit 10% FCS-Zusatz, 1% Vitaminen, 1% nichtessentielle Aminosäuren sowie 0,3% L-Glu­ tamin.

Danach wird ein Mediumwechsel durchgeführt und deuteriertes Medium zugesetzt. Deuterierte Medien werden unter Verwendung von MEM-Pulvermedium und hitzesterilisiertem D₂O sowie Ultra Pure Water zur Verdünnung mit identischen Zusätzen, wie kon­ ventionelles Kulturmedium, hergestellt.

Die Zellen werden in deuteriertem Medium in der gewünschten Konzentration für einen definierten Zeitraum bei 37°C, 5% CO₂, inkubiert. Nach Zugabe von 1 µCi ³H-Thymidin (spez. Akti­ vität 23 Ci/mol, Amersham Buchler, Braunschweig) pro well werden die Zellen 16 Stunden weiter inkubiert und anschlie­ ßend wird der ³H-Thymidin-Einbau in die zelluläre DNA nach Säurefällung in üblicher Weise mittels Flüssigszintillations­ zähler gemessen. Die Wirkung von Deuterium wird als Prozent­ satz des ³H-Thymidin-Einbaus der behandelten Zellen gegenüber dem ³H-Thymidin-Einbau in unbehandelten Kontrollzellen ausge­ drückt.

Unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von D20 kann eine Konzentration ermittelt werden, bei welcher der ³H-Thy­ midin-Einbau um 50% gegenüber der unbehandelten Kontrolle ge­ hemmt wird. (IC 50 Wert).

Beispiel 2 Bestimmung der zytotoxischen Aktivität von Deuterium auf Tumorzellen

Zur Bestimmung der zytotoxischen Wirkung von Deuterium auf Tumorzellen werden analog Beispiel 1 exponentiell wachsende HTZ-19, HTZ 209, HTZ 243, HTB 69, HTZ 25, CaCo-2 oder HT 29 Zellen für mindestens 24 Stunden in Mikrokulturplatten mit 96 Vertiefungen (wells) oder in Mikrokulturplatten mit 24 Ver­ tiefungen mit einer Dichte von 10 000 Zellen pro well ausge­ sät. Das Kulturmedium besteht analog Beispiel 1 aus Dulbeccos MEM mit 10% FCS Zusatz, 1% Vitaminen, 1% nichtessentiellen Aminosäuren sowie 0,3% L-Glutamin. Danach wird ein Medium­ wechsel durchgeführt und deuteriertes Medium in gewünschter Konzentration zugesetzt. Die Zellen werden in deuteriertem Medium in der gewünschten Konzentration für einen definierten Zeitraum bei 37°C, 5% CO₂, inkubiert. Danach werden die Zel­ len mit Trypsin abgelöst und in einem definierten Volumen mit Trypanblau (Trypan Blue Stain 0,4%, Sigma Chemicals St. Louis) versetzt. Die Zellzahl vitaler sowie geschädigter Zellen wird in der Fuchs-Rosenthal-Kammer gezählt und als Wachtumskurve bzw. Überlebenskurve aufgetragen. Als ein Maß für die Wirkung auf verschiedene Tumorzellkulturen kann die "surviving fraction", also der Anteil überlebender Zellen der behandelten Gruppe gegenüber unbehandelten Kontrollen, nach 3 bzw. 6 Tagen Inkubation mit 90 Vol-% D₂O-Medium angegeben werden.

Beispiel 3 Melanome

Getestet wurden zwei verschiedene Tumoren, HTZ-19 und HTB-69. Die Tumoren wurden in MEM mit 10 Vol.-% FCS Zusatz expan­ diert. ³H Thymidin Assays wurden in 96-well-Platten, Wachs­ tumskurven z. T. auch in 24-well-Platten durchgeführt.

Mittels ³H-Thymidin-Einbau (Abb. 1, 2) als Modell für die Proliferationsaktivität konnte bei beiden Tumoren eine Inhi­ bition von über 90% bei 6tägiger Exposition mit 90 Vol.-% Deuterium (D₂O) im Medium nachgewiesen werden (HTZ-19: 91 HTB-69 : 96%).

Die Wachstumskurven (Abb. 3, 4) zeigten bei HTZ-19 bereits bei 50 Vol.-% D₂O (99,86 g Deuterium/kg) eine deutliche Verlang­ samung des Wachstums, bei 90 Vol.-% D₂O (179,75 g D₂O/kg) kam es zur Stagnation des Wachstums über den vollen Beobach­ tungszeitraum von 13 Tagen. Bei HTB-69 konnte sogar ein deut­ licher absoluter Rückgang der Zellzahl verzeichnet werden, während die unbehandelten Kontrollen exponentielle Vermehrung zeigten.

Die Überlebensrate (Abb. 5,6), ("surviving rate") als Maß für den durch Deuterium ausgelösten Zelltod, zeigt einen deutli­ chen Anteil von toten Zellen: Nach 6 Tagen in 90 Vol.-% Deu­ teriummedium zeigten sich bei HTZ-19 68% tote Zellen (sr=32), bei HTB-69 58% tote (sr= 42%), nach 12 Tagen wurden 78% bzw. 73% tote Zellen registriert.

Der resultierende Gesamteffekt durch Deuterium-induzierte Proliferationshemmung und Deuterium induzierten Zelltod wurde als Überlebensfraktion (Abb. 7, 8) ("surviving fraction") gemessen; nach 6 Tagen in 90 Vol.-% Deuteriummedium ergab sich bei HTZ-19 eine Überlebensfraktion von 0,04, bei HTB 0,07, nach 12 Tagen bei beiden Tumoren kleiner als 0,01. Dies bedeutet einen Rückgang vitaler Tumorzellen unter Deuterium­ behandlung von mehr als zwei Zehnerpotenzen (2 log-cell kill). Bereits nach 1 Tag lag bei HTB-69 die Überlebensfrak­ tion unter 0,5.

Zusammenfassend läßt sich bei Melanomen ein ganz klares Po­ tential für Deuterium-Einsatz erkennen: eine bei 90 Vol.-% Deuterium hohe Inhibition als Ausdruck für "growth arrest" und ein hoher Anteil "cell kill" führen zu einem fulminanten Rückgang an vitalen Tumorzellen.

Beispiel 4 Kleinzelliges Bronchialkarzinom

Getestet wurden Zellen des kleinzelligen Bronchialkarzinoms HTZ-25. Die Tumoren wurden in MEM mit 10 Vol.-% FCS expan­ diert. ³H Thymidin Assays sowie Wachstumskurven wurden in 96- well-Platten durchgeführt.

Der ³H-Thymidin-Einbau (Abb. 9) zeigt eine nahezu lineare Dosis-Wirkungsbeziehung die weitgehend zeitunabhängig ist. In der Zeitskala 1 bis 6 Tage ist also bereits ein Sättigungs­ verhalten eingetreten, die Ausprägung der Effekte erfolgt offensichtlich sehr rasch im Bereich von Stunden. Bei HTZ-25 konnte mit 94% Inhibition ein sehr hoher Effekt nach 6tägi­ ger Exposition von 90 Vol.-% D₂O (179,75 g Deuterium/kg) im Medium erzielt werden.

Die Wachstumskurven (Abb. 10) zeigen einen deutlichen Rück­ gang der behandelten Zellen bei gutem Wachstum der unbehan­ delten Tumorzellen.

Die Überlebensrate (Abb. 11) bleibt jedoch über 80%, so daß nicht von einem signifikanten "cell kill" ausgegangen werden kann.

Die Überlebensfraktion (Abb. 12) erreicht bereits nach 6 Tagen 0,17, nach 13 Tagen sogar 0,09, so daß der gesamte Effekt auf die Tumorzellen zumindest bei 90 Vol.-% D₂O-Kon­ zentration eine volle Zehnerpotenz Reduktion vitaler Tumor­ zellen bedeutet.

Zusammenfassend läßt sich beim kleinzelligen Bronchialkarzi­ nom feststellen, daß ein insgesamt guter Effekt hier alleine durch die Proliferationshemmung entsteht, ein nennenswerter "cell kill" wie z. B. bei Melanomen dagegen nicht beobachtet werden konnte.

Beispiel 5 Colonkarzinome

Getestet wurden die Colonkarzinome der ATCC Zellinien CaCo-2 und HT-29. Die Tumoren wurden in MEM mit 10 Vol.-% FCS expan­ diert. ³H Thymidin Assays sowie Wachstumskurven wurden in 96- well-Platten durchgeführt.

Der ³H-Thymidin-Einbau (Abb. 13, 14) zeigt eine nahezu linea­ re Dosis-Wirkungs-Beziehung die tendenziell ebenfalls weit­ gehend zeitunabhängig ist. Die Ausprägung der Effekte erfolgt offensichtlich ebenfalls im Bereich von Stunden, die volle Ausprägung wird insbesondere bei CaCo-2 Zellen jedoch erst nach 3tägiger Inkubation erreicht. Bei HT-29 konnte mit 98 % Inhibition ein ausgesprochen hoher Effekt nach 6tägiger Exposition von 90 Vol.-% D₂O (179,75 g Deuterium/kg) im Medi­ um erzielt werden, CaCo-2 erreichte mit 94% Inhibition nach 6 Tagen Inkubation ähnliche Werte.

Die Wachstumskurven (Abb. 15, 16) zeigen einen fulminanten absoluten Rückgang der Zellen bei beiden Colonkarzinomen an, während sich die unbehandelten Kontrollen in exponentiellem Wachstum befinden.

Die Überlebensrate (Abb. 17) zeigt einen deutlichen Abfall, insbesondere bei CaCo-2 wurde mit 39% Überlebensrate nach 9 Behandlungstagen ein signifikanter "cell kill" erreicht.

Die Überlebensfraktion (Abb. 18) zeigt bereits nach 3 Tagen bei beiden Colonkarzinomen Werte unter 0,10 (CaCo-2 : 0,08, HT-29 : 0,04), nach 9 Tagen lag sie bei beiden Tumoren sogar unter 0,01 also zwei Zehnerpotenzen Reduktion vitaler Tumor­ zellen bei 90 Vol.-% D₂O-Konzentration.

Zusammenfassend läßt sich bei Colonkarzinomen feststellen, daß sich beide Effekte, Proliferationshemmung und "cell kill", sich in idealer Weise synergistisch ergänzen und so eine maximale Wirkung bei Colonkarzinomen entsteht.

Beispiel 6 Lymphozyten (Kontrolle; normale Zellen)

Getestet wurden frisch isolierte Blutlymphozyten, nach Fi­ coll-Gradient in RPMI-Medium mit 10 Vol.-% humanem AB-Serum- Zusatz expandiert. Die Lymphozyten wurden mit Interleukin 2 (IL-2) bzw. Phythämagglutinin (PHA) stimuliert.

Bei den ³H Thymidin-Assays (Abb. 19) als Modell für die Pro­ liferationsrate zeigte sich für einen Zeitraum von 2-6 Tagen, daß es bei allen PHA-stimulierten Lymphozyten bei Behandlung mit 90 Vol.-% Deuteriummedium (179,75 g Deuterium/kg) zum Auftreten von Inhibitionseffekten kam. Jedoch auch nach 6 Tagen Einwirkdauer lag die Inhibition noch unter 60%.

IL-2 stimulierte Lymphozyten zeigten zeitabhängiges Verhal­ ten; bei 3 und 6 Tagen zeigte sich Inhibition, maximal wurde 65% Inhibition bei 90 Vol.-% Deuterium ermittelt.

Die Wachstumskurven (Abb. 20) zeigen zwar sowohl bei 50 Vol.­ % (99,86 g Deuterium/kg) als auch bei 90 Vol.-% deuteriertem Medium einen Abfall gegenüber den Kontrollen, dieser ist jedoch deutlich weniger ausgeprägt als bei den getesteten Tumoren.

Die Überlebensrate (Abb. 21) als Maß für den durch Deuterium ausgelösten Zelltod wird nur bei den IL-2 stimulierten Zellen in 90 Vol.-% Deuterium signifikant erniedrigt; es wurden Werte bis 60% "Überlebensrate" entsprechend 40% abgetötete Zellen bei 6d IL-2 Stimulation gemessen.

Die Überlebensfraktion (Abb. 22) entsprechend dem Gesamtef­ fekt durch Proliferationshemmung und Zelltod wurde ebenfalls nur bei IL-2 stimulierten Lymphozyten erniedrigt (bis zu 0,36 bei 6d in 90 Vol.-% Deuteriummedium unter IL-2-Stimulation) die PHA stimulierten Zellen bleiben weitgehend unbeeinflußt (0,8 bei 6d PHA-Stimulation in 90 Vol.-% Deuterium).

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß das System stimulierter Lymphozyten bezüglich der durch Deuterium ver­ ursachten Proliferationshemmung und Zytotoxizität deutlich hinter den Effekten auf Tumorzellen zurückbleibt. Diese Ver­ suche zeigen, daß die Deuterium vermittelten Effekte nicht proliferationsabhängig sind, oder zumindest nicht alle diffe­ rentiellen Effekte nur durch die stärkere Proliferation bei Tumorzellen verursacht werden: Die IL-2-stimulierten Zellen mit der niedrigeren Teilungsrate werden stärker gehemmt und zeigen höhere "cell-kill-Empfindlichkeit" als die sich schnell teilenden PHA-stimulierten Lymphozyten, die durch niedrige Dosen von Deuterium sogar im Wachstum stimuliert werden und kaum "cell kill", aufweisen.

Beispiel 7 Gliome

Getestet wurden Zellen des Glioblastoms (Glioblastoma multi­ forme) HTZ-209 und des Astrozytoms HTZ-243 (Astrozytoma WHO Grad III). Die Tumoren wurden in MEM mit 10 Vol.-% FCS expan­ diert. ³H Thymidin Assays wurden in 96-well-Platten durch­ geführt, Wachstumskurven wurden in 24- und 96-well-Platten durchgeführt.

Der ³H-Thymidin-Einbau (Abb. 23) zeigt eine deutliche Schul­ terbildung im Dosisbereich zwischen 1 und 50 Vol.-% D₂O die weitgehend zeitunabhängig ist. Hier zeigt sich eine ganz deutliche Tumorselektivität insbesondere in der Anwendung von D₂O über 6 Tage, wobei bei HTZ-243 bereits mit 10% D₂O über 60% Inhibition erreicht wurde.

Die Wachstumskurven (Abb. 24) zeigen einen absoluten Rückgang der Zellen bei beiden Gliomen, besonders HTZ-209 an, während sich die unbehandelten Kontrollen in exponentiellem Wachstum befinden.

Die Überlebensrate (Abb. 25) zeigt einen deutlichen Abfall bei beiden Tumoren, insbesondere bei HTZ-209 wurde mit 33% survival rate nach 6 Behandungstagen ein hohes Ausmaß an Abtötung von Tumorzellen erreicht.

Die Überlebensfraktion (Abb. 26) zeigt bei beiden Hirntumoren einen nahezu linearen Abfall, und erreicht nach 6 Tagen für HTZ-209 Werte unter 0,10, also eine volle Zehnerpotenz Rück­ gang an vitalen Tumorzellen.

Zusammenfassend läßt sich bei den untersuchten Hirntumoren feststellen, daß sich beide Effekte, Proliferationshemmung und Zellabtötung, in idealer Weise synergistisch ergänzen und zu einem therapeutischen Erfolg führen.

Es konnte ganz klar durch die Beispiele 1-7 gezeigt werden, daß für die Wirkung von Deuterium auf Zellen zwei völlig verschiedene Mechanismen vorliegen: Der in der Literatur weitgehend beschriebene Effekt der Teilungsarretierung ("growth arrest") und der von uns erstmals entdeckte Effekt der direkten Zelltötung ("cell kill").

Die Spezifität der Effekte auf bestimmte Zellgruppen wurde in der Literatur bisher nicht systematisch untersucht. Auch hier konnten erstmals Hinweise auf ein tumorspezifisches Verhalten ermittelt werden.

Interessant ist die unterschiedliche Ausprägung der Effekte auf verschiedene Tumoren: so zeigte das kleinzellige Bron­ chialkarzinom z. B. stark ausgeprägte selektive Wachstumsarre­ tierung, jedoch nur sehr geringen "cell kill".

Hinweise, daß die Ausprägung der Effekte nicht nur prolifera­ tionsratenabhängig sind, geben die Lymphozyten, bei denen sowohl "growth arrest" als auch "cell kill" bei den schneller proliferierenden PHA-stimulierten Zellen deutlich geringer ausgeprägt sind.

Es kann daher angenommen werden, daß Tumorzellen zum einen durch die hohe Teilungsintensität, vor allem aber aufgrund verminderter Reparaturmöglichkeiten und vorgeschädigtem Spin­ delapparat deutlich empfindlicher auf eine Therapie mit Deu­ terium reagieren als normale Zellen.

Claims (7)

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend Deuterium und/oder deuterierte Substanzen und/oder Substanzen, die Deuterium anreichern bzw. freisetzen zur Verwendung als Zytostatikum oder Tumortherapeutikum für die Bekämpfung von Tumoren und/oder Metastasen.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Abtötung von entarteten Zel­ len in Konzentrationen über 50 Vol.-% (99,86 g Deuteri­ um/kg) D₂O oder eine andere Deuterium-enthaltende Sub­ stanz mit 50% durch D ersetzten H-Atomen angewendet wird.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Wachstumsinhibierung und Zellzyklusarretierung von entarteten Zellen in Konzen­ trationen von mind. 1 Vol.-% (1,99 g Deuterium/kg) D₂O oder eine andere Deuterium-enthaltende Substanz mit mind. 1% durch D ersetzten H-Atomen angewendet wird.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form von Zäpf­ chen, Salben, Lösungen, Dispersionen oder Emulsionen, Aerosolen, Schäumen, teilchenförmigen Mitteln, Pillen, Pastillen, Tabletten, Dragees, Kapseln bzw. Mikrokapseln, Kaugummiarten, Gewebe-, Blatt-, oder Fadengrundlagen in Bandagen oder Verbänden, zum Rauchen oder Inhalieren sowie in Carriern angewendet wird.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Therapie lokal, intracutan, transcutan; zur systemischen Anwendung in­ travenös, intraarteriell, oral, rectal; zur Anwendung in Hohlräumen, intrathekal, intraperitoneal, intracavitär verabreicht wird.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Therapie von malignen Melanomen, Gliomen, Astrozytomen, Bronchialkar­ zinomen, Neuroblastomen sowie Magen-Darm-Karzinomen verwendet wird.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich andere Zytostatika oder Tumortherapeutika enthält.