CN102676463A

CN102676463A - 与雌马酚合成有关的酶

Info

Publication number: CN102676463A
Application number: CN2012101265354A
Authority: CN
Inventors: 岛田良和; 保田世津子; 高桥真行; 林隆史; 宫泽宪浩; 阿比留康弘
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-12-27
Filing date: 2008-12-25
Publication date: 2012-09-19
Also published as: KR101543501B1; ES2424960T3; PT2404994E; KR20130006513A; EP2404994B1; DK2228441T3; HK1145189A1; WO2009084603A1; CN104830813A; CN101952417B; SG2013066634A; EP2404994A1; PT2404995E; DK2404994T3; SG2013066642A; AR070058A1; HK1166104A1; EP2404995A1; TWI468516B; EP2404995B1

Abstract

本发明的目的在于提供一种与雌马酚合成相关的酶、编码上述酶的基因、及使用上述酶和基因制备雌马酚的方法。本发明提供二氢黄豆苷元合成酶、四氢黄豆苷元合成酶及雌马酚合成酶和编码上述酶的基因。并且，本发明提供一种使用上述酶合成二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的方法。

Description

与雌马酚合成有关的酶

本申请是申请日为2008年12月25日、申请号为200880127246.8(国际申请号为PCT/JP2008/073649)、发明名称为“与雌马酚合成有关的酶”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种具有以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元活性的多肽、一种具有以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元活性的多肽、及一种具有以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚活性的多肽，并且涉及一种编码上述多肽的多核苷酸。并且，本发明涉及一种使用上述多肽制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及雌马酚的制备方法及在上述过程中使用的制备装置，本发明还提供一种与上述内容相关的技术。

背景技术

一直以来，通常认为异黄酮衍生物具有多种生理学和药学活性，被用作食品原料和药品原料。但是，随着与异黄酮衍生物有关的功能的阐明，有报道指出并不是一直以来所认为的仅异黄酮衍生物具有雌激素样活性，而是上述衍生物在各种肠内细菌的作用下在菌体内被代谢(生物合成)后生成了具有更强雌激素样作用的雌马酚，上述雌马酚被释放到菌体外，之后被肠吸收而在全身发挥雌激素作用。然而，并非所有人都有在肠内产生雌马酚的能力，雌马酚的产生能力因人而异。例如，有些人在肠内没有雌马酚产生菌，而有些人虽然在肠内有雌马酚产生菌但其雌马酚产生能力较低。

因此，在体内有效利用雌马酚对于面临高龄化社会的日本等是重要的，特别是从应对以骨质疏松为代表的慢性老年性疾病方面考虑也是重要的。并且，考虑到如上所述的有些人内在地含有雌马酚产生肠内细菌而有些人却没有的这一现实，需要研制一种能有效地人工生产雌马酚的雌马酚合成原料。

在上述背景下，从提供一种雌马酚合成原料这方面考虑，与上述生物合成通路有关的酶的鉴定及其使用是极其重要的。但是，对于生产或催化在上述生物合成通路中相关的几个中间体的酶，尚无任何相关信息，因此人们期望能够鉴定相关酶。

专利文献1：日本特开2006-296434号公报

发明内容

本发明的目的在于提供一种与用作雌马酚合成原料的二氢黄豆苷元的合成有关的酶。具体而言，本发明的目的在于提供具有以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元活性的多肽。并且，本发明的目的在于提供编码上述多肽的多核苷酸及与利用该多肽合成二氢黄豆苷元相关的技术等。

另外，本发明的目的在于提供与用作雌马酚合成原料的四氢黄豆苷元的合成有关的酶。具体而言，本发明的目的在于提供具有以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元活性的多肽。并且，本发明的目的在于提供编码上述多肽的多核苷酸及与利用该多肽合成四氢黄豆苷元相关的技术等。

进而，本发明的目的在于提供与雌马酚合成有关的酶。具体而言，本发明的目的在于提供具有以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚活性的多肽。并且，本发明的目的在于提供编码上述多肽的多核苷酸及与利用该多肽合成雌马酚相关的技术等。

进而，本发明的目的在于提供在由黄豆苷元制备雌马酚时所生成的二氢黄豆苷元和四氢黄豆苷元的制备方法即中间体的制备方法，及能够利用所得的中间体制备雌马酚的制备方法。并且，本发明的目的在于提供在上述制备中使用的制备装置。

本发明人等为了解决上述课题进行了潜心研究，结果成功地从雌马酚产生肠内细菌中分离出能够合成二氢黄豆苷元的酶、能够合成四氢黄豆苷元的酶及能够合成雌马酚的酶，用作合成雌马酚的原料，并阐明了上述酶的结构。另外，本申请发明人等通过进一步的研究，利用上述酶成功地人工制备出二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及雌马酚。基于上述发现并经过进一步改良完成了本发明。

即，本发明提供下述发明：

项A1.选自以下(Aa)～(Ac)中的多肽：

(Aa)多肽，由序列号1所示的氨基酸序列组成；

(Ab)多肽，由在序列号1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸得到的氨基酸序列组成，并且具有以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元的活性；

(Ac)多肽，由与序列号1所示的氨基酸序列具有60％以上同一性的氨基酸序列组成，并且具有以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元的活性。

项A2.选自以下(Ad)～(Af)中的多核苷酸：

(Ad)多核苷酸，由序列号4所示的核苷酸序列组成；

(Ae)多核苷酸，编码由序列号1所示的氨基酸序列组成的多肽；

(Af)多核苷酸，与上述(Ad)或(Ae)的多核苷酸的互补链在严格条件下杂交，并且编码具有以黄豆苷元为底物生成二氢黄豆苷元活性的多肽。

项A3.一种表达载体，含有项A2所述的多核苷酸。

项A4.一种重组细胞，是由项A3所述的表达载体转化得到的。

项A5.如项A4所述的重组细胞，该重组细胞为细菌性原核细胞。

项A6.如项A5所述的重组细胞，其中，细菌性原核细胞属于乳球菌属。

项A7.一种多肽的制备方法，所述方法包括培养项A4至A6中任一项所述的细胞，得到具有以黄豆苷元为底物生成二氢黄豆苷元活性的多肽的步骤。

项A8.一种多肽，由项A7所述的制备方法得到。

项A9.一种二氢黄豆苷元的制备方法，所述方法包括使项A1或A8所述的多肽、及NADPH及/或NADH作用于黄豆苷元的步骤。

项A10.一种二氢黄豆苷元的制备方法，所述方法包括使项A4至A6中任一项所述的细胞作用于黄豆苷元的步骤。

项A11.一种抗体，所述抗体与项A1所述的多肽或由项A2所述的多核苷酸编码的多肽具有亲和性。

项A12.一种免疫学方法，用于检测或测定项A1所述的多肽或由项A2所述的多核苷酸编码的多肽，所述方法包括使受试样品与项A11所述的抗体相接触的步骤。

项A13.如项A12所述的方法，其中，用作检测或测定对象的多肽存在于细菌性原核细胞内。

项A14.一种探针，所述探针含有能与编码项A1所述多肽的多核苷酸或项A2所述多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列。

项A15.一种引物，所述引物含有能与编码项A1所述多肽的多核苷酸或项A2所述多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列。

项A16.一种使用项A14所述的探针检测或测定编码项A1所述的多肽的多核苷酸或项A2所述的多核苷酸的方法。

项A17.如项A16所述的方法，其中，用作检测或测定对象的多肽存在于细菌性原核细胞内。

项A18.如项A16所述的方法，包括使用PCR扩增全部或部分编码A1所述多肽的多核苷酸或项A2所述的多核苷酸的步骤。

项A19.一种二氢黄豆苷元合成酶组合物，其特征在于，含有项A1所述的多肽或项A2的多核苷酸编码的多肽。

项A20.如项A19所述的组合物，所述组合物进一步含有NADPH及/或NADH。

项A21.一种二氢黄豆苷元合成原料组合物，其特征在于，含有

(Ai)项A1所述的多肽或项A2的多核苷酸编码的多肽；

(Aii)NADPH及/或NADH；及

(Aiii)黄豆苷元。

项A22.一种二氢黄豆苷元合成原料组合物，其特征在于，含有

(Aiv)项A4至A6中任一项所述的细胞；及

(Aiii)黄豆苷元。

项A23.一种二氢黄豆苷元合成用试剂盒，所述试剂盒含有

(Ai)项A1所述的多肽或项A2的多核苷酸编码的多肽；

(Aii)N ADPH及/或NADH；及

(Aiii)黄豆苷元。

项A24.一种二氢黄豆苷元合成用试剂盒，所述试剂盒含有

(Aiv)项A4至A6中任一项所述的细胞；及

(Aiii)黄豆苷元。

项A25.一种免疫学测定用试剂盒，用于测定项A1所述的多肽或项A2的多核苷酸编码的多肽，所述试剂盒至少含有项A11所述的抗体。

项A26.一种PCR用试剂盒，用于检测编码项A1所述多肽的多核苷酸或项A2所述的多核苷酸，所述试剂盒至少含有项A15所述的引物。

项A27.如项A26所述的鉴定用试剂盒，所述试剂盒用于鉴定含有编码项A1所述多肽的多核苷酸或项A2所述的多核苷酸的细胞。

项A28.如项A27所述的鉴定用试剂盒，所述试剂盒为PCR用试剂盒。

项A29.一种二氢黄豆苷元合成酶，由项A1所述的多肽组成。

项B1.选自下述(Ba)～(Bc)中的多肽：

(Ba)多肽，由序列号7所示的氨基酸序列组成；

(Bb)多肽，由在序列号7所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸得到的氨基酸序列组成，并且具有以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元的活性；

(Bc)多肽，由与序列号7所示的氨基酸序列具有60％以上同一性的氨基酸序列组成，并且具有以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元的活性。

项B2.选自以下(Bd)～(Bf)中的多核苷酸：

(Bd)多核苷酸，由序列号10所示的核苷酸序列组成的；

(Be)多核苷酸，编码由序列号7所示的氨基酸序列组成的多肽；

(Bf)多核苷酸，与上述(Bd)或(Be)的多核苷酸的互补链在严格条件下杂交，并且编码具有以二氢黄豆苷元为底物生成四氢黄豆苷元活性的多肽。

项B3.一种表达载体，含有项B2所述的多核苷酸。

项B4.一种重组细胞，是由项B3所述的表达载体转化得到的。

项B5.如项B4所述的重组细胞，该重组细胞为细菌性原核细胞。

项B6.如项B5所述的重组细胞，其中，细菌性原核细胞属于乳球菌属。

项B7.一种多肽的制备方法，所述方法包括培养项B4至B6中任一项所述的细胞，得到具有以二氢黄豆苷元为底物生成四氢黄豆苷元活性的多肽的步骤。

项B8.一种多肽，由项B7所述的制备方法得到。

项B9.一种四氢黄豆苷元的制备方法，所述方法包括使项B1或B8所述的多肽、及NADPH及/或NADH作用于二氢黄豆苷元的步骤。

项B10.一种四氢黄豆苷元的制备方法，所述方法包括使项B4至B6中任一项所述的细胞作用于二氢黄豆苷元的步骤。

项B11.一种抗体，所述抗体与B1所述的多肽或由项B2所述的多核苷酸编码的多肽具有亲和性。

项B12.一种免疫学方法，用于检测或测定项B1所述的多肽或由项B2所述的多核苷酸编码的多肽，所述方法包括使项B11所述的抗体与受试样品相接触的步骤。

项B13.如项B12所述的方法，其中，用作检测或测定对象的多肽存在于细菌性原核细胞内。

项B14.一种探针，所述探针含有能与编码项B1所述多肽的多核苷酸或项B2所述多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列。

项B15.一种引物，所述引物含有能与编码项B1所述多肽的多核苷酸或项B2所述多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列。

项B16.一种使用项B14所述的探针检测或测定编码项B1所述多肽的多核苷酸或项B2所述的多核苷酸的方法。

项B17.如项B16所述的方法，其中，用作检测或测定对象的多肽存在于细菌性原核细胞内。

项B18.如项B16所述的方法，包括使用PCR扩增全部或部分编码B1所述多肽的多核苷酸或项B2所述的多核苷酸的步骤。

项B19.一种四氢黄豆苷元合成酶组合物，其特征在于，含有项B1所述的多肽或项B2的多核苷酸编码的多肽。

项B20.如项B19所述的组合物，所述组合物进一步含有NADPH及/或NADH。

项B21.一种四氢黄豆苷元合成原料组合物，其特征在于，含有

(Bi)项B1所述的多肽或项B2的多核苷酸编码的多肽；

(Bii)NADPH及/或NADH；及

(Biii)二氢黄豆苷元。

项B22.一种四氢黄豆苷元合成原料组合物，其特征在于，含有

(Biv)项B4至B6中任一项所述的细胞；及

(Biii)二氢黄豆苷元。

项B23.一种四氢黄豆苷元合成用试剂盒，所述试剂盒含有

(Bi)项B1所述的多肽或项B2的多核苷酸编码的多肽；

(Bii)NADPH及/或NADH；及

(Biii)二氢黄豆苷元。

项B24.一种四氢黄豆苷元合成用试剂盒，所述试剂盒含有

(Biv)项B4至B6中任一项所述的细胞；及

(Biii)二氢黄豆苷元。

项B25.一种免疫学测定用试剂盒，用于测定项B1所述的多肽或项B2多核苷酸编码的多肽，所述试剂盒至少含有项B11所述的抗体。

项B26.一种PCR用试剂盒，用于检测编码项B1所述多肽的多核苷酸或项B2所述的多核苷酸，所述试剂盒至少含有项B15所述的引物。

项B27.如项B26所述的鉴定用试剂盒，所述试剂盒用于鉴定含有编码项B1所述多肽的多核苷酸或项B2所述的多核苷酸的细胞。

项B28.如项B27所述的鉴定用试剂盒，所述试剂盒为PCR用试剂盒。

项B29.一种四氢黄豆苷元合成酶，由项B1所述的多肽组成。

项C1.选自下述(Ca)～(Cc)中的多肽：

(Ca)多肽，由序列号13所示的氨基酸序列组成；

(Cb)多肽，由在序列号13所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸得到的氨基酸序列组成，并且具有以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚的活性；

(Cc)多肽，由与序列号13所示的氨基酸序列具有60％以上同一性的氨基酸序列组成，并且具有以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚的活性。

项C2.选自下述(Cd)～(Cf)中的多核苷酸：

(Cd)多核苷酸，由序列号16所示的核苷酸序列组成；

(Ce)多核苷酸，编码由序列号13所示的氨基酸序列组成的多肽；

(Cf)多核苷酸，与上述(Cd)或(Ce)的多核苷酸的互补链在严格条件下杂交，并且编码具有以四氢黄豆苷元为底物生成雌马酚活性的多肽。

项C3.一种表达载体，含有项C2所述的多核苷酸。

项C4.一种重组细胞，是由项C3所述的表达载体转化得到的。

项C5.如项C4所述的重组细胞，该重组细胞为细菌性原核细胞。

项C6.如项C5所述的重组细胞，其中，细菌性原核细胞属于乳球菌属。

项C7.一种多肽的制备方法，所述方法包括培养项C4至C6中任一项所述的细胞，得到具有以四氢黄豆苷元为底物生成雌马酚活性的多肽的步骤。

项C8.一种多肽，由项C7所述的制备方法得到。

项C9.一种雌马酚的制备方法，所述方法包括使项C1或C8所述的多肽作用于四氢黄豆苷元的步骤。

项C10.一种雌马酚的制备方法，所述方法包括使项C4至C6中任一项所述的细胞作用于四氢黄豆苷元的步骤。

项C11.一种抗体，所述抗体与项C1所述的多肽或由项C2所述的多核苷酸编码的多肽具有亲和性。

项C12.一种免疫学方法，用于检测或测定项C1所述的多肽或由项C2所述的多核苷酸编码的多肽，所述方法包括使项C11所述的抗体与受试样品相接触的步骤。

项C13.如项C12所述的方法，其中，用作检测或测定对象的多肽存在于细菌性原核细胞内。

项C14.一种探针，所述探针含有能与编码项C1所述多肽的多核苷酸或项C2所述多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列。

项C15.一种引物，所述引物含有能与编码项C1所述多肽的多核苷酸或项C2所述多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列。

项C16.一种使用项C14所述的探针检测或测定编码项C1所述多肽的多核苷酸或项C2所述的多核苷酸的方法。

项C17.如项C16所述的方法，其中，用作检测或测定对象的多肽存在于细菌性原核细胞内。

项C18.如项C16所述的方法，所述方法包括使用PCR扩增全部或部分编码C1所述多肽的多核苷酸或项C2所述的多核苷酸的步骤。

项C19.一种雌马酚合成酶组合物，其特征在于，含有项C1所述的多肽或C2的多核苷酸编码的多肽。

项C20.一种雌马酚合成原料组合物，其特征在于，含有

(Ci)项C1所述的多肽或项C2的多核苷酸编码的多肽；及

(Cii)四氢黄豆苷元。

项C21.一种雌马酚合成原料组合物，其特征在于，含有

(Ciii)项C4至C6中任一项所述的细胞；及

(Cii)四氢黄豆苷元。

项C22.一种雌马酚合成用试剂盒，所述试剂盒含有

(Ci)项C1所述的多肽或项C2的多核苷酸编码的多肽；及

(Cii)四氢黄豆苷元。

项C23.一种雌马酚合成用试剂盒，所述试剂盒含有

(Ciii)项C4至C6中任一项所述的细胞；及

(Cii)四氢黄豆苷元。

项C24.一种免疫学测定用试剂盒，用于测定项C1所述的多肽或项C2的多核苷酸编码的多肽，所述试剂盒至少含有项C11所述的抗体。

项C25.一种PCR用试剂盒，用于检测编码项C1所述多肽的多核苷酸或项C2所述的多核苷酸，所述试剂盒至少含有项C15所述的引物。

项C26.如项C25所述的鉴定用试剂盒，所述试剂盒用于鉴定含有编码项C1所述多肽的多核苷酸或项C2所述的多核苷酸的细胞。

项C27.如项C26所述的鉴定用试剂盒，所述试剂盒为PCR用试剂盒。

项C28.一种雌马酚合成酶，由项C1所述的多肽组成。

项D1.一种四氢黄豆苷元的制备方法，所述方法包括以下(第1步骤)及(第2步骤)：

(第1步骤)通过使由下述(Aa)～(Ac)中任一种多肽组成的酶、及NADPH及/或NADH作用于黄豆苷元，生成二氢黄豆苷元的步骤；

(Aa)多肽，由序列号1所示的氨基酸序列组成；

(第2步骤)通过使由下述(Ba)～(Bc)中任一种多肽组成的酶、及NADPH及/或NADH作用于二氢黄豆苷元，生成四氢黄豆苷元的步骤；

(Ba)多肽，由序列号7所示的氨基酸序列组成；

项D2.一种产物，含有由项D1所述方法制备的四氢黄豆苷元。

项D3.一种雌马酚的制备方法，所述方法包括以下(第2步骤)及(第3步骤)：

(Ba)多肽，由序列号7所示的氨基酸序列组成；

(第3步骤)通过使由下述(Ca)～(Cc)中任一种多肽组成的酶、及NADPH及/或NADH作用于四氢黄豆苷元，制备雌马酚的步骤；

(Ca)多肽，由序列号13所示的氨基酸序列组成；

项D4.一种产物，含有由项D3所述的方法制备的雌马酚。

项D5.一种雌马酚的制备方法，所述方法包括(第1步骤)～(第3步骤)。

项D6.一种产物，含有由项D5所述的方法制备的雌马酚。

项D7.一种表达载体，含有选自下述(Ad)～(Af)、(Bd)～(Bf)及(Cd)～(Cf)中的至少一种多核苷酸：

(Ad)多核苷酸，由序列号4所示的核苷酸序列组成；

(Af)多核苷酸，与上述(Ad)或(Ae)的多核苷酸互补链在严格条件下杂交，并且编码具有以黄豆苷元为底物生成二氢黄豆苷元活性的多肽。

(Bd)多核苷酸，由序列号10所示的核苷酸序列组成；

(Bf)多核苷酸，与上述(Bd)或(Be)的多核苷酸互补链在严格条件下杂交，并且编码具有以二氢黄豆苷元为底物生成四氢黄豆苷元活性的多肽。

(Cd)多核苷酸，由序列号16所示的核苷酸序列组成；

(Cf)多核苷酸，与上述(Cd)或(Ce)的多核苷酸互补链在严格条件下杂交，并且编码具有以四氢黄豆苷元为底物生成雌马酚活性的多肽。

项D8.一种重组细胞，由项D7所述的表达载体转化得到。

项D9.如项D8所述的重组细胞，该重组细胞为细菌性原核细胞。

项D10.如项D9所述的重组细胞，其中，细菌性原核细胞属于乳球菌属。

项D11.一种二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的制备方法，所述制备方法包括以下(第4步骤)～(第6步骤)中的至少2个步骤：

(第4步骤)通过在含有黄豆苷元的培养基中培养含有(Ad)～(Af)中任一种多核苷酸的重组细胞，生成二氢黄豆苷元的步骤：

(Ad)多核苷酸，由序列号4所示的核苷酸序列组成；

(第5步骤)通过在含有二氢黄豆苷元的培养基中培养含有(Bd)～(Bf)中任一种多核苷酸的重组细胞，生成四氢黄豆苷元的步骤：

(Bd)多核苷酸，由序列号10所示的核苷酸序列组成；

(第6步骤)通过在含有四氢黄豆苷元的培养基中培养含有(Cd)～(Cf)中任一种多核苷酸的重组细胞，生成雌马酚的步骤：

(Cd)多核苷酸，由序列号16所示的核苷酸序列组成；

此处，于一个重组细胞内可以存在选自(Ad)～(Af)、(Bd)～(Bf)及(Cd)～(Cf)中的至少两种多核苷酸。

项D12.如项D11所述的制备方法，其中，重组细胞为细菌性原核细胞。

项D13.如项D12所述的制备方法，其中，细菌性原核细胞属于乳球菌属。

项D14.一种产物，含有由项D11～D13中任一项所述的方法制备的二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚。

项D15.一种二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的制备装置，所述制备装置具有下述(第1反应槽)～(第3反应槽)中的至少一种反应槽：

(第1反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有由(Aa)～(Ac)中任一种多肽组成的酶，所述反应槽用于使用由上述多肽组成的酶由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，其中，上述反应装置被配置在能够与反应槽内的黄豆苷元接触的位置；

(第2反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有由(Ba)～(Bc)中任一种多肽组成的酶，所述反应槽用于使用由上述多肽组成的酶由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，其中，上述反应装置被配置在能够与反应槽内的二氢黄豆苷元接触的位置；

(第3反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有由(Ca)～(Cc)中任一种多肽组成的酶，所述反应槽用于使用由上述多肽组成的酶由四氢黄豆苷元制备雌马酚，其中，上述反应装置被配置在能够与反应槽内的四氢黄豆苷元接触的位置；

此处，在一个反应槽内可以同时存在至少两种上述反应装置。

项D16.一种二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的制备装置，所述制备装置具有以下(第4反应槽)～(第6反应槽)中的至少一种反应槽：

(第4反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有含有(Ad)～(Af)中任一种多核苷酸的重组细胞，所述反应槽用于使用上述反应装置由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，其中上述反应装置被配置在能够与反应槽内的黄豆苷元接触的位置；

(第5反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有含有(Bd)～(Bf)中任一种多核苷酸的重组细胞，所述反应槽用于使用上述反应装置由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，其中，上述反应装置被配置在能够与反应槽内的二氢黄豆苷元接触的位置；

(第6反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有含有(Cd)～(Cf)中任一种多核苷酸的重组细胞，所述反应槽用于使用上述反应装置由四氢黄豆苷元制备雌马酚，其中，上述反应装置被配置在能够与反应槽内的四氢黄豆苷元接触的位置；

由本发明的多肽，可以(1)以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元，(2)以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元及(3)以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚。因此，对于实现在由黄豆苷元制备雌马酚时产生的中间体即二氢黄豆苷元及/或四氢黄豆苷元的工业合成，以及雌马酚的工业合成方面，本发明是有用的。目前为止，对于雌马酚产生菌，只发现了难以处理的厌氧菌，但是利用本发明可以不使用现有的雌马酚产生菌，为雌马酚的工业制备开辟了一条道路。

具体实施方式

本说明书中的氨基酸、多肽、碱基序列、核酸等的缩写表示方式，遵照IUPAC-IUB的规定[IUPAC-IUB Communication on BiologicalNomenclature，Eur.J.Biochem.，138：9(1984)]、“the Guideline forDrafting Specifications containing Base Sequene or Amino AcidSequence”(Japan Patent Office)及该领域的惯用符号。

以下详细说明本发明。

A：二氢黄豆苷元合成酶

本项详细说明二氢黄豆苷元合成酶(以下有时也记为E1酶)。除了另有说明外，关于二氢黄豆苷元合成酶的一般说明也适用于下述四氢黄豆苷元合成酶及雌马酚合成酶。

A-1.多肽

本发明中，作为利用黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元的多肽，提供了下述(Aa)～(Ac)的多肽(以下有时也将该多肽记为“E1多肽”)：

(Aa)多肽，由序列号1所示的氨基酸序列组成；可以举出例如为1～250个，优选为1～200个，较优选为1～150个，较优选为1～100个，较优选为1～50个，较优选为1～30个，更优选为1～15个，更较优选为1～5个，特别优选为1～4个，较特别优选为1～3个，最优选为1或2个。

上述(Ab)多肽中，对于“一个或多个”的范围没有特殊限定，只要该多肽具有以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元的活性即可，作为上述(Ab)多肽的具体例子，可以举出由序列号2所示的氨基酸序列组成的多肽及由序列号3所示的氨基酸序列组成的多肽。与序列号1所示的氨基酸序列相比，序列号2所示的氨基酸序列含有3个被取代的氨基酸。与序列号1所示的氨基酸序列相比，序列号3所示的氨基酸序列含有10个被取代的氨基酸。序列号2所示的氨基酸序列相当于来自卵形假杆菌(Bacteroides ovatus)E-23-15株(FERM BP-6435号)的E1酶。序列号3所示的氨基酸序列相当于来自咽峡炎链球菌(Streptococcus constellatus)A6G-225株(FERM BP-6437号)的E1酶。

另外，对于上述(Ab)多肽中氨基酸的取代没有特别限定，从不引起多肽表型的变化这一观点考虑，优选使用类似的氨基酸进行取代。具体而言，作为类似氨基酸，可以如下分组：

芳香族氨基酸：Phe、Trp、Tyr

脂肪族氨基酸：Ala、Leu、Ile、Val

极性氨基酸：Gln、Asn

碱性氨基酸：Lys、Arg、His

酸性氨基酸：Glu、Asp

具有羟基的氨基酸：Ser、Thr

具有小侧链的氨基酸：Gly、Ala、Ser、Thr、Met。

进而，上述(Ab)多肽中氨基酸的取代、缺失、插入或添加，优选发生在对多肽的高级结构不产生大的影响的区域、或对作为二氢黄豆苷元合成酶的活性中心不产生阻碍影响的区域。上述区域可以举出例如序列号1、2及3所示的氨基酸序列之间的低保守区域及其周边，或N末端区域或C末端区域。具体而言，在序列号1所示的氨基酸序列中，可以举出第45位的亮氨酸、第80位的天冬酰胺、第167位的缬氨酸、第231位的天冬氨酸、第233位的异亮氨酸、第435位的精氨酸、第459位的天冬氨酸、第462位的缬氨酸、第528位的精氨酸、第540位的丝氨酸、第639位的异亮氨酸及上述氨基酸的周边区域。上述“周边区域”是在对二氢黄豆苷元合成酶活性不产生影响的范围内，以上述特定位置的氨基酸为基点，例如前后5个以内的氨基酸，优选前后4个以内的氨基酸，较优选前后3个的氨基酸，特别优选前后2个的氨基酸，较特别优选前后1个的氨基酸。

序列号1所示的氨基酸序列中第112位～第116位的氨基酸序列被认为相当于NADPH结合域。只要不阻碍NADPH结合域的功能，可以在上述5个氨基酸的序列中取代、缺失、插入或添加氨基酸。该序列中，优选3个以下氨基酸发生上述变异，较优选2个以下，更优选1个，最优选该氨基酸序列不发生变异。特别是优选第112位、115位及116位的氨基酸不发生取代、缺失、插入或添加。

序列号1所示的氨基酸序列中第260位组氨酸也被认为与上述质子中继站(proton relay site)有关。因此，只要不阻碍质子中继站的功能，上述组氨酸可以被其他氨基酸取代，但优选不被取代。

序列号1所示的氨基酸序列中的第343位～第363位氨基酸序列被认为相当于Fe-S簇模序(cluster motif)。因此，只要不阻碍上述模序的功能，可以在上述序列中取代、缺失、插入或添加任意氨基酸，但优选第343位、第346位、第350位及第363位的半胱氨酸不发生变异。上述序列中上述3个氨基酸之外的氨基酸被其他氨基酸取代时，优选4个以下的氨基酸被取代，较优选3个以下的氨基酸被取代，更优选2个以下的氨基酸被取代，特别优选1个氨基酸被取代。最优选上述序列中不发生氨基酸的取代、缺失、插入或添加。

序列号1所示的氨基酸序列中第390位～第413位氨基酸序列被认为相当于FAD结合域。因此，只要不阻碍上述区域的功能，可以在上述序列中取代、缺失、插入或添加任意氨基酸，但优选第390位、第392位及第395位的甘氨酸不发生变异。在上述序列中取代、缺失、插入或添加氨基酸时，优选4个以下的氨基酸发生上述变异，较优选3个以下的氨基酸，更优选2个以下的氨基酸，特别优选1个氨基酸。最优选上述序列中不发生氨基酸的变异。

序列号1所示的氨基酸序列中第512位～第540位的氨基酸序列也被认为相当于FAD结合域。因此，只要不阻碍上述区域的功能，可以在上述序列中取代、缺失、插入或添加任意氨基酸，但优选第512位、第514位及第517位的甘氨酸不发生变异。在上述序列中取代、缺失、插入或添加氨基酸时，优选4个以下的氨基酸发生上述变异，较优选3个以下的氨基酸，更优选2个以下的氨基酸，特别优选1个氨基酸。最优选上述序列中的氨基酸序列不发生变异。

表示具有上述预想功能的氨基酸序列区域的比对情况示于图27。

在特定氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸的技术为公知技术。

上述(Ac)多肽中，相对于序列号1所示的氨基酸序列，氨基酸的同一性例如为60％以上，通常为80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，为较优选95％以上，特别优选为98％以上、更特别优选为99％以上。

作为上述(Ac)多肽的具体例子，可以举出由序列号2所示的氨基酸序列组成的多肽及由序列号3所示的氨基酸序列组成的多肽。序列号1所示的氨基酸序列与序列号2所示的氨基酸序列的氨基酸同一性为99.5％，序列号1所示的氨基酸序列与序列号3所示的氨基酸序列的氨基酸同一性为98.6％(Blast2)。因此，在本发明的一个优选实施方式中，(Ac)多肽与序列号1所示的氨基酸序列的同一性优选为98.6％以上，较优选为99.5％以上。

氨基酸序列的同一性可以通过市售的或电信线路(因特网)的可利用分析工具进行计算，例如使用FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等软件计算。具体而言，BLAST检索中通常使用的主要初始条件如下所示。即，在高级BLAST 2.1中，使用blastp程序，期望值为10，过滤器为全OFF，矩阵为BLOSUM62，Gap existence cost、Per residue gap cost及Lambda ratio分别为11、1、0.85(缺省值)，通过将其他各种参数也设定为缺省值进行检索，计算氨基酸序列的同一性(identity)的值(％)。

另外，上述(Ab)及(Ac)的多肽中，“以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元的活性”可以通过以下方式确证。即，将用作检查对象的多肽加入下述组成的底物溶液中使其浓度为0.001mg/mL，在37℃下温育2小时后，确证溶液中是否存在二氢黄豆苷元。确认温育后的溶液中存在二氢黄豆苷元时，可以判定上述多肽具有“以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元的活性”。

底物溶液的组成

0.1M 磷酸钾缓冲液

1 mM PMSF(苯甲基磺酰氟)

2 mM 二硫苏糖醇

5 mM 连二亚硫酸钠

2 mM NADPH或NADH

40μM 黄豆苷元

pH 7.0

酶特性

E1多肽具有以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元的酶活性。因此，E1多肽也被称为E1酶。E1酶的酶活性在连二亚硫酸钠等还原剂或锰离子或铁离子等金属离子存在下被激活。E1酶需要以NADPH或NADH作为辅酶，最适温度在30℃左右，最适pH为7.0。E1酶不仅能以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元，还可以进行其逆反应，即以二氢黄豆苷元为底物合成黄豆苷元。

E1多肽可以通过下述基因工程学方法进行制备，也可以从能产生E1多肽的微生物中分离和纯化。另外，E1多肽还可以以序列号1、2或3所示的氨基酸序列信息为基础通过一般的化学合成法进行制备，上述化学合成法包括通常的液相或固相肽合成法。

以下对从能产生E1多肽的微生物中分离纯化E1肽的方法进行说明。首先，将能产生E1多肽的微生物的细胞破碎，得到该微生物的粗提物。此处，细胞的破碎可以使用在通常的细胞破碎处理中使用的方法，例如使用弗式压碎机、细胞破碎机等破碎机进行处理，或在低渗溶液中进行超声处理等。另外，可以在所得的粗提物中加入适当的缓冲液。另外，E1多肽为厌氧性时，优选在所得的粗提物中加入适当的还原剂来抑制E1多肽的失活。对于所得粗提物，为了提高其纯度，可以将其进行纯化处理，如硫酸铵沉淀、利用乙醇等有机溶剂沉淀、或等电点沉淀等。然后，通过对粗提物进行离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、疏水色谱法、各种亲和色谱法、反相色谱法、羟基磷灰石柱色谱法等处理来获得含有E1多肽的级分。需要说明的是，使用上述色谱法进行的处理，可以根据需要使用开管柱，或使用HPLC。另外，通过上述处理得到的含有E1多肽的级分的纯度，可以通过电泳、特别是SDS-PAGE进行可视的简便地推定。另外，E1多肽可以通过氨基酸序列分析法；使用MALDI-TOF MS、ESI Q-TOF MS或MALDI Q-TOF MS等质谱仪的质谱分析法；肽质量指纹图谱法等进行鉴定。

另外，此处，为了使能产生E1多肽的微生物有效地产生E1肽，优选将其在含有规定量黄豆苷元的培养基(无特殊限定，例如含有0.01μg/mL以上黄豆苷元的培养基)中进行培养。

另外，E1多肽可以作为单体存在，但只要具有合成二氢黄豆苷元的能力则也可以以二聚体或多聚物的形式存在。另外，为了提高E1多肽的稳定性等，可以根据需要添加聚乙二醇或糖链对E1多肽进行修饰。

E1多肽可以发挥催化作用，即催化以黄豆苷元作为底物转换为二氢黄豆苷元的反应。上述二氢黄豆苷元在下述四氢黄豆苷元合成酶(E2酶)及雌马酚合成酶(E3酶)的作用下转换为雌马酚。雌马酚被认为是在体内发挥多种生理作用的物质，从这一方面考虑，一般认为能提供雌马酚的合成原料的E1多肽是重要的。

A-2.多核苷酸

本发明还提供一种多核苷酸(以下有时也将该多核苷酸记为“E1多核苷酸”)，所述多核苷酸编码具有以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元活性的多肽。具体而言，作为E1多核苷酸，提供下述(Ad)～(Af)的多核苷酸：

(Ad)多核苷酸，由序列号4所示的核苷酸序列组成；

序列号1所示的氨基酸序列相当于序列号4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。序列号2所示的氨基酸序列相当于序列号5所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。序列号3所示的氨基酸序列相当于序列号6所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

上述(Af)的多核苷酸中，“在严格条件下杂交”是指，两个多核苷酸片段在标准的杂交条件下能够相互杂交，该条件记载于Sambrooket al.，Molecular Cloning：A laboratory manual(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，USA中。更具体而言，“严格条件”是指在6.0×SSC中在约45℃下进行杂交，并且使用2.0×SSC在50℃下进行清洗。作为上述(Af)的多核苷酸，可以举出例如序列号5所示的核苷酸序列及序列号6所示的核苷酸序列。

在严格条件下杂交的多核苷酸通常与作为探针使用的多核苷酸的核苷酸序列具有一定程度以上的同一性。上述同一性例如为60％以上，优选70％以上，更优选80％以上，较优选90％以上，特别优选95％以上，更特别优选98％以上。氨基酸序列的同一性可以通过市售的或电信线路(因特网)的可利用的分析工具进行计算，例如使用FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等软件进行计算。具体而言，BLAST检索中通常使用的主要初始条件如下所示。即，在高级BLAST 2.1中，使用blastp程序，将各种参数设定为缺省值进行检索，计算氨基酸序列同一性的值(％)。

序列号4所示的核苷酸序列与序列号5所示的核苷酸序列的碱基序列的同一性为99.6％，序列号4所示的核苷酸序列与序列号6所示的核苷酸序列的碱基序列的同一性为97.6％(Blast2)。因此，在本发明的一个优选实施方式中，(Af)的多核苷酸与序列号4所示的核苷酸序列具有97.6％以上的同源性，较优选99.6％以上。

另外，上述(Af)的多核苷酸的“以黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元的活性”，使用与上述(Ab)或(Ac)多肽相同的方法进行确证。

E1多核苷酸可以基于序列号4、5或6所示的序列信息通过化学DNA合成法制备、获得，也可以通过一般的基因工程学方法简单地制备·获得[参见Molecular Cloning 2d Ed，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；续生物化学实验讲座“基因研究法I、II、III”、日本生化学会编(1986)等]。

作为化学DNA合成法，可以举出使用亚磷酰胺法的固相合成法。上述合成法中可以使用自动合成机。

另外，作为一般的基因工程学方法，具体而言可以如下实施：由表达E1多核苷酸的适当的提供物，制备cDNA文库，并且使用E1多核苷酸特有的合适的探针或抗体从上述文库中选出所期望的克隆[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，78，6613(1981)；Science122，778(1983)等]。

此处，对于cDNA的提供物没有特殊限定，只要为表达E1多核苷酸的生物即可。具体而言，可以举出能产生雌马酚的微生物，优选能产生雌马酚的乳酸菌、属于拟杆菌属的细菌及属于链球菌属的细菌，更优选能产生雌马酚的格氏乳球菌、卵形假杆菌及咽峡炎链球菌，特别优选能产生雌马酚的来源于粪便的格氏乳球菌，特别优选能产生雌马酚的来源于粪便的作为格氏乳球菌的乳球菌20-92株(FERM BP-10036号；保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)、卵形假杆菌E-23-15株(FERM BP-6435号；保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)、咽峡炎链球菌A6G-225株(FERM BP-6437号；保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号))。

另外，从上述微生物中分离总RNA、分离mRNA和纯化、cDNA的获得和克隆等都可以按照常规方法进行。另外，对于从cDNA文库中筛选出本发明的多核苷酸的方法，也没有特殊限制，可以按照常规方法进行。具体而言，例如对由cDNA产生的多肽可以采用如下方法筛选：通过使用该多肽特异抗体的免疫筛选选出对应的cDNA克隆的方法，或使用与目的核苷酸序列选择性结合的探针的噬菌斑杂交、菌落杂交等或将上述技术组合的方法等。

作为此处使用的探针，一般可以举出基于与E1多核苷酸的核苷酸序列相关信息(例如，序列号4、5或6的核苷酸序列)进行化学合成的DNA等。另外，作为筛选用探针，也可以使用基于本发明的多核苷酸的碱基序列信息设定的有义引物及/或反义引物。

获取E1多核苷酸时，可以适当地使用PCR法[Science130，1350(1985)]或PCR法的变异方法例如DNA或RNA扩增法。特别是，从文库很难得到全长的cDNA时，优选采用RACE法[Rapid amplificationof cDNA ends；实验医学、12(6)，35(1994)]，特别是5’-RACE法[M.A.Frohman，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，8，8998(1988)]等。上述RACE法及5’-RACE法，在获得来源于真核生物的E1多核苷酸时有用。

采用上述PCR法时使用的引物可以基于E1多核苷酸的序列信息进行适当设定，上述引物可以按照常规方法合成。需要说明的是，扩增的DNA或RNA片段的分离和纯化可以按照上述常规方法进行，例如可以通过凝胶电泳法、杂交法等进行。

使用常规的基因工程学方法，可以由E1多核苷酸容易地、大量且稳定地制备该多核苷酸的产物(即上述多肽)。一直以来，关于雌马酚的产生菌只发现有难以处理的厌氧性菌株，但是通过成功分离E1多核苷酸，可以不使用现有雌马酚产生菌，为雌马酚的工业制备开辟了一条新道路。

A-3.表达载体

对于本发明的表达载体没有特殊限定，只要含有E1多核苷酸并且能表达E1多核苷酸即可，一般可以根据与宿主细胞的关系进行适当选择。

作为宿主细胞，使用原核生物的细胞时，作为表达载体可以举出例如为可以在该宿主细胞中复制的质粒载体，所述载体通过在上述多核苷酸的上游添加启动子及SD(核糖体结合)碱基序列来使上述多核苷酸能在上述载体中表达。具体而言，可以举出使用P_L启动子、T7启动子及lac启动子的表达质粒。作为其他优选的细菌表达载体，可以举出利用tac启动子或trc启动子的质粒pKK233-2及pKK233-3等。但是不限于上述例子，也可以使用公知的各种菌株及载体。

另外，作为宿主细胞，使用真核细胞时，作为表达载体，通常可以使用位于需要表达的上述多核苷酸上游的启动子，以及具有RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点及转录终止序列等的其他特殊序列，上述表达载体根据需要也可以含有复制起点。已知大量对插入上述多核苷酸有用的真核生物载体。例如，作为适当的真核生物载体可以举出pCD及pCMV。另外，除了上述例子之外，还可以举出pMSG及pSVL，所述pMSG及pSVL根据需要利用MMTV或SV40晚期启动子。但是不限于上述例子，也可以使用公知的各种真核生物及载体。

A-4.重组细胞

本发明提供一种重组细胞(转化体)，所述重组细胞由含有上述E1多核苷酸的表达载体转化得到。

作为用于重组细胞的宿主细胞，可以使用原核细胞及真核细胞中任一种。

作为用作宿主细胞的原核细胞，可以优选使用属于乳球菌属的乳酸菌等细菌性原核细胞，除此之外也可以举出在好氧条件下能生长的细菌性原核细胞(例如大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌、链球菌、葡萄球菌等)。

作为用作宿主细胞的真核细胞，可以举出例如酵母、曲霉等真核微生物；果蝇S2、秋粘虫Sf9等昆虫细胞；L细胞、CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、C127细胞、BALB/c3T3细胞(包含缺失二氢叶酸还原酶或胸肽激酶的突变株)、BHK21细胞、HEK293细胞、Bowes黑素瘤细胞、卵母细胞等动植物细胞等。

另外，对于将上述表达载体导入宿主细胞的方法没有特殊限定，可以使用常规的各种方法。例如，可以按照Davis等(BASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，1986)及Sambrook等(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2^nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)等多种标准实验室手册记载的方法，将上述表达载体导入宿主细胞，作为具体方法可以举出磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位(transvection)、微量注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载(scrape loading)、弹道导入(ballistic introduction)、感染等。

由于上述重组细胞能产生作为二氢黄豆苷元转换酶的E1多肽，因此可用于制备二氢黄豆苷元转换酶，另外上述重组细胞也可以以细胞的形态用于二氢黄豆苷元的制备。

A-5.使用重组细胞的多肽的制备

可以通过培养导入了E1多核苷酸的重组细胞，从细胞和培养物中回收E1多肽来制备E1多肽。

对于培养，可以使用适合于宿主的培养基，进行继代培养或分批培养。以产生于重组细胞内外的E1多肽量为指标，将细胞培养至可以得到适量的E1多肽。

作为用于上述培养的培养基，可以根据使用的宿主细胞从惯用的各种培养基中进行适当选择，培养也可以在适合于宿主细胞生长的条件下进行。

另外，由此得到的E1多肽，可以根据需要通过利用其物理性质、化学性质等的各种分离技术[参见“生物化学数据手册II”、1175-1259页、第1版第1次印刷、1980年6月23日株式会社东京化学同人发行；Biochemistry，25(25)，8274(1986)；Eur.J.Biochem.，163，313(1987)等]进行分离、纯化。具体而言，可以举出与上述“A-1.多肽”栏中所述的“从具有E1多肽产生能力的微生物中分离纯化E1肽的方法”相同的方法。

A-6.使用E1多肽的二氢黄豆苷元的制备

本发明提供一种使用E1多肽的二氢黄豆苷元的制备方法。即，上述制备方法通过在NADPH及/或NADH存在下使E1多肽作用于黄豆苷元，将黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元。优选通过在NADPH存在下使E1多肽作用于黄豆苷元而将黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元。

由于E1多肽的二氢黄豆苷元合成酶活性在Mn²⁺及Fe²⁺的存在下被激活，所以优选在Mn²⁺及/或Fe²⁺存在下使E1肽作用于黄豆苷元。对于Mn²⁺及/或Fe²⁺在反应液中的浓度没有特殊限定，只要能激活E1多肽的上述酶活性即可。Fe²⁺的浓度优选为2mM以上，较优选为2mM～100mM，更优选为10mM～40mM。Mn²⁺的浓度优选为0.2μM，较优选为0.2μM～100mM，更优选为1.0μM～40mM。

本制备方法中使用的反应可以在适当的缓冲液中进行。例如，作为缓冲液可以举出磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、醋酸缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液等。另外，可以适宜地设定反应条件，使上述反应中的pH条件在使所期望的E1多肽酶活性不灭活的范围内，例如优选pH为5.0～10.0，更优选为6.0～8.0。

另外，可以根据需要在上述反应中添加适量的PMSF、EDTA等蛋白酶抑制剂。另外，考虑到上述多肽来源于厌氧性菌，因此可以添加适量的DTT、2ME、DET、连二亚硫酸钠等还原剂。

本制备方法中使用的反应在下述条件下进行，例如在反应开始时在溶剂中在下述浓度范围内加入各组分制备原料混合物，在20～45℃、优选25～40℃、更优选30～38℃的温度条件下，温育混合物0.5～10小时，优选1～6小时，更优选2～4小时：

上述多肽含量为0.0001～1.0重量％，优选0.001～0.1重量％，更优选0.001～0.01重量％；

黄豆苷元含量为0.0001～10.0重量％，优选0.001～1.0重量％，更优选0.001～0.1重量％；及

NADPH及/或NADH的含量为0.01～5重量％，优选0.05～1重量％，更优选0.1～0.5重量％。

另外，作为用于合成二氢黄豆苷元的混合原料，本发明提供一种含有(Ai)E1多肽、(Aii)NADPH及/或NADH、及(Aiii)黄豆苷元的二氢黄豆苷元合成原料组合物。并且，作为用于合成二氢黄豆苷元的混合原料，本发明提供一种含有(Ai)E1多肽、(Aii)NADPH及/或NADH、(Aiii)黄豆苷元及(Aiv)Mn²⁺及/或Fe²⁺的二氢黄豆苷元合成原料组合物。通过在上述条件下温育上述合成原料组合物，可以将该合成原料组合物中的黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元。上述合成原料组合物相当于在上述二氢黄豆苷元的制备中反应开始时的原料混合物，该合成原料组合物中的E1多肽的配合浓度、NADPH及/或NADH的配合浓度、黄豆苷元的配合浓度、及可以配合于该合成原料组合物中的其他组分等，都与上述制备方法中使用的反应体系(反应开始时的原料混合溶液)相同。

进而，作为用于合成二氢黄豆苷元的试剂盒，本发明提供一种含有(Ai)E1多肽、(Aii)NADPH及/或NADH、及(Aiii)黄豆苷元的二氢黄豆苷元合成用试剂盒。作为用于合成二氢黄豆苷元的试剂盒，本发明提供一种含有(Ai)E1多肽、(Aii)NADPH及/或NADH、(Aiii)黄豆苷元及(Aiv)Mn²⁺及/或Fe²⁺的二氢黄豆苷元合成用试剂盒。为了能在上述条件下简便地由黄豆苷元合成二氢黄豆苷元，各组分可以根据需要分别储存在上述合成用试剂盒中。另外，上述合成用试剂盒中根据需要可以含有所需的缓冲液。并且，为了简便地进行二氢黄豆苷元的合成，上述合成用试剂盒可以含有必要的器具或操作手册。

A-7.二氢黄豆苷元合成酶组合物

本发明还提供一种含有E1多肽的二氢黄豆苷元合成酶组合物。上述酶组合物在使用了E1多肽的二氢黄豆苷元的制备方法中优选用作二氢黄豆苷元合成酶。

上述酶组合物可以为粗纯化状态的E1多肽，也可以为粗纯化或纯化的E1多肽与适当载体配合而形成的产物。

上述酶组合物中，对于E1多肽的配合比例没有特殊限定，只要在上述二氢黄豆苷元的制备方法中该组合物能用作二氢黄豆苷元合成酶即可。具体而言，相对于上述酶组合物的总量，E1多肽例如为0.001～20.0重量％，优选为0.005～5.0重量％，更优选为0.01～1.0重量％。

上述酶组合物中，可以含有作为E1多肽辅酶发挥作用的NADPH及/或NADH。上述酶组合物中配合NADPH及/或NADH时，对于该NADPH及/或NADH的配合比例没有特殊限定，相对于上述酶组合物，例如为0.0005～25.0重量％，优选为0.005～5.0重量％，更优选为0.01～2.5重量％。

另外在一个优选实施方式中，上述酶组合物含有Mn²⁺及/或Fe²⁺。该酶组合物含有Mn²⁺及/或Fe²⁺的金属离子时，对于金属离子的配合比例没有特殊限定，只要能激活E1多肽的二氢黄豆苷元合成酶活性即可。相对于上述组合物，Fe²⁺的配合比例优选为2mM以上，较优选为2mM～100mM，更优选为10mM～40mM。相对于上述组合物，Mn²⁺的配合比例优选为0.2μM以上，较优选为0.2μM～100mM，更优选为1.0μM～40mM。

进而，为了提高上述多肽的稳定性，上述酶组合物中除了含有E1多肽还可以含有亚硫酸盐、抗坏血酸、α-生育酚、半胱氨酸等抗氧化剂。另外，为了确保上述酶组合物的保存性，根据需要可以添加对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苄醇、2-苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等防腐剂。

A-8.使用上述重组细胞的二氢黄豆苷元的制备方法

本发明提供一种使用导入E1多核苷酸的重组细胞制备二氢黄豆苷元的制备方法。即，上述制备方法中通过使上述重组细胞作用于黄豆苷元而使黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元。

本制备方法使用的反应在上述重组细胞能够存活并且能将黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元的条件下进行。

具体而言，通过在上述重组细胞能生长的培养基中加入适量的上述重组细胞及黄豆苷元进行培养而进行。

本制备方法中使用的培养基，可以根据用作重组细胞的宿主细胞的细胞种类从惯用的各种培养基中适当选择。

另外，上述培养基中根据需要可以添加适量的PMSF、EDTA等蛋白酶抑制剂。另外，考虑到上述多肽来源于厌氧性菌，因此可以加入适量的DTT、2ME、DET、连二亚硫酸钠等还原剂。另外，使用上述重组细胞时，并非必须添加NADPH及/或NADH，但是可以根据需要在培养基中加入NADPH及/或NADH。并且上述培养基中可以添加Mn²⁺及/或Fe²⁺。

具体而言，本制备方法如下进行：将上述重组细胞接种在含有0.001～1重量％黄豆苷元的培养基中，优选含有0.01～1重量％，更优选含有0.01～0.5重量％，在可以生长的温度条件下培养6～30小时，优选7～24小时，更优选7～18小时。

另外，作为用于合成二氢黄豆苷元的混合原料，本发明提供一种含有(Aiv)上述重组细胞及(Aiii)黄豆苷元的二氢黄豆苷元合成原料组合物。通过在上述条件下培养上述合成原料组合物，可以将该合成原料组合物中的黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元。上述合成原料组合物相当于在上述二氢黄豆苷元的制备中反应开始时的原料混合物，在该合成原料组合物中上述重组细胞及黄豆苷元的浓度、及可以配合于该合成原料组合物中的其他组分等，都与上述制备方法中采用的条件等相同。

进而，作为用于合成二氢黄豆苷元的试剂盒，本发明提供一种含有(Aiv)上述重组细胞及(Aiii)黄豆苷元的二氢黄豆苷元合成用试剂盒。另外，作为用于合成二氢黄豆苷元的试剂盒，本发明提供一种含有(Aiv)上述重组细胞、(Aiii)黄豆苷元及(Aiv)Mn²⁺及/或Fe²⁺的二氢黄豆苷元合成用试剂盒。为了能在上述条件下简便地由黄豆苷元合成二氢黄豆苷元，上述重组细胞和黄豆苷元可以根据需要分别储存在上述合成用试剂盒中。另外，上述合成用试剂盒中根据需要可以含有缓冲液或培养基。并且，为了简便地进行二氢黄豆苷元的合成，上述合成用试剂盒可以含有必要的器具或操作手册。

需要说明的是，包含于上述合成用试剂盒中的上述重组细胞可以使用公知的方法保存。保存重组细胞的技术是公知技术，可以举出例如使用冷冻干燥机将装有含有重组细胞的二甲基甲酰胺等溶液的安瓿抽成真空，然后在4～25℃下保存的方法等。除此之外还可以举出液氮方法，即，将细胞悬浊于添加有10％丙三醇的保存培养基中，将其回收至专用安瓿中并保存在液氮灌(-150～-196℃)中。

A-9.与上述多肽具有亲和性的抗体

本发明还提供一种与E1多肽具有亲和性的抗体(IgG抗体)。

单克隆抗体按照现有方法制备。具体而言，可以按照Harlow，H.and Lane，D.，“抗体：实验室手册”，Cold Spring Harbor Lab，New York，139-240页(1988)所述的方法制备。

另外，多克隆抗体也按照现有方法制备。具体而言，可以按照细胞工程实验方案(东京大学医科学研究所制癌研究部编，1992年，155～173页)等所述的方法制备。

多克隆IgG抗体及单克隆IgG抗体都可以通过硫酸铵沉淀法及蛋白质A色谱法等常规方法进行纯化。

A-10.检测或测定上述多肽的免疫学方法

进而，本发明提供一种使用上述抗体检测或测定E1多肽的免疫学方法。具体而言，上述免疫学方法通过使上述抗体接触受试样品而进行。即，可以通过下述方法检测或测定受试样品中的上述多肽：将上述抗体与受试样品相接触，由此在受试样品中存在E1多肽时使上述抗体与E1多肽特异性结合，然后，检测与E1多肽相结合的上述抗体，根据需要对其进行定量。

此处，受试样品是指用作E1多肽的检测或测定对象的样品。由于可以预测E1多肽存在于细菌性原核细胞内，所以上述免疫学方法适合用于检测或测定存在于细菌性原核细胞内的E1多肽。需要说明的是，检测或测定存在于细胞内的E1多肽时，可以使用对上述细胞进行破碎处理得到的物质、或经该破碎处理后进行蛋白质的纯化处理得到的物质作为受试样品。

使用利用抗体的免疫学方法检测或测定目标多肽的技术是公知的，本领域技术人员可以适当地设定适合于免疫学方法的各种条件。例如，可以设定适当的条件，使用放射免疫分析法、ELISA法等。

进而，作为用于检测或测定E1多肽的试剂盒，本发明提供一种含有上述抗体的免疫学检测用试剂盒。上述检测用试剂盒中根据需要可以含有E1多肽作为标准品。并且，为了能在上述条件下简便地进行E1多肽的检测，根据需要上述检测用试剂盒还可以含有其他所需试剂等。另外，为了简便地进行E1多肽的检测，上述检测用试剂盒可以含有必要的器具或操作手册。

A-11.检测或测定编码上述多肽的多核苷酸的方法

另外，本发明提供一种检测或测定E1多核苷酸的方法。具体而言，上述方法通过使结合于E1多核苷酸的探针与受试样品相接触而进行。即，可以通过下述方法检测或测定受试样品中的E1多核苷酸：将上述探针与受试样品相接触，由此在受试样品中存在上述E1多核苷酸时使上述探针与E1多核苷酸杂交，然后，检测上述双链是否形成，根据需要对其进行定量。

此处，受试样品是指用作E1多核苷酸的检测或测定对象的样品。由于可预测E1多核苷酸存在于细菌性原核细胞内，所以上述免疫学方法适合用于检测或测定存在于细菌性原核细胞内的E1多核苷酸。需要说明的是，检测或测定存在于细胞内的E1多核苷酸时，可以使用对上述细胞进行破碎处理得到的物质、或经该破碎处理后进行核酸的纯化处理得到的物质作为受试样品。

另外，在上述方法中使用的探针具有在严格条件下能与上述多核苷酸杂交的核苷酸序列。此处，严格条件是指，例如用于探针或引物的通常条件，具体而言，例如为上述A-2部分所述的条件。

上述探针可以基于与E1多核苷酸的核苷酸序列(例如序列号4、5或6的核苷酸序列)相关的信息进行化学合成，另外也可以为已经获得的E1多核苷酸或其片段。另外，上述探针通常使用标记探针，但也可以为非标记探针。另外，将上述探针作为PCR用引物(有义引物或反义引物)使用时，其长度例如为约10～40个核苷酸左右，特别优选为20～30个核苷酸左右。作为使用上述探针特异性检测上述多核苷酸的方法，可以举出例如噬菌斑杂交、菌落杂交、DNA印迹法、RNA印迹法、PCR法等，但从灵敏度观点考虑，优选使用利用上述探针作为引物的PCR法扩增E1多核苷酸或其一部分。

作为PCR法，可以举出例如RT-PCR法，也可以为在该领域使用的各种变形方法。使用PCR法可以测定E1多核苷酸的存在和对其进行定量。作为上述方法可以举出如MSSA法的竞争定量法(Kinoshita，M.，et al.，CCA，228，83-90(1994))，和PCR-SSCP法(Orita，M.，et al.，Genomics，5，874-879(1989))，所述PCR-SSCP法为一种利用变化迁移率随单链DNA高级结构的变化而变化以检测突变的已知方法。

进而，作为用于检测或测定E1多核苷酸的试剂盒，本发明提供一种含有上述探针的E1多核苷酸检测用试剂盒。为了能在上述条件下简便地进行E1多核苷酸的检测，根据需要上述检测用试剂盒还可以含有除上述探针之外所需要的试剂等。另外，上述检测用试剂盒还可以作为用于鉴定含有E1多核苷酸的细胞的试剂盒使用。另外，从可以使检测精度高这一观点考虑，作为上述检测用试剂盒优选举出使用PCR进行检测的试剂盒。

B.四氢黄豆苷元合成酶

B-1.多肽

作为利用二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元的多肽，本发明提供下述(Ba)～(Bc)的多肽(以下也将该多肽记为“E2多肽”)：

(Ba)多肽，由序列号7所示的氨基酸序列组成；

(Bb)多肽，由在序列号7所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列组成，并且具有以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元的活性；

上述(Bb)多肽中，对于“一个或多个”的范围没有特殊限定，只要该多肽具有以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元的活性即可，可以举出例如1～50个，优选1～30个，较优选1～15个，更优选1～5个，较更优选1～4个，特别优选1～3个，更特别优选1或2个。

作为上述(Bb)多肽的具体例子，可以举出例如由序列号8所示的氨基酸序列组成的多肽及由序列号9所示的氨基酸序列组成的多肽。与序列号7所示的氨基酸序列相比较，序列号8所示的氨基酸序列含有2个被取代的氨基酸序列并在N末端添加了由24氨基酸组成的氨基酸序列。与序列号7所示的氨基酸序列相比较，序列号9所示的氨基酸序列含有20个被取代氨基酸并缺失1个氨基酸。序列号8所示的氨基酸序列相当于来自卵形假杆菌E-23-15株(FERM BP-6435号)的E2酶。序列号9所示的氨基酸序列相当于来自咽峡炎链球菌A6G-225株(FERM BP-6437号)的E2酶。

上述(Bb)多肽中氨基酸的取代、缺失、插入或添加可以以上述A-1.部分所述的E1多肽中的取代、缺失、插入或添加为基准而得到。(Bb)多肽中氨基酸的取代、缺失、插入或添加，优选发生在对多肽的高级结构不产生大的影响的区域或对作为四氢黄豆苷元合成酶的活性中心不产生阻碍影响的区域。作为上述区域，可以举出例如在序列号7、8及9所示的氨基酸序列间的低保守区域及其周边，或N末端区域或C末端区域。具体而言，在序列号7所示的氨基酸序列中，可以举出第7位的缬氨酸、第8位的脯氨酸、第26位的缬氨酸、第36位的亮氨酸、第46位的精氨酸、第94位的天冬氨酸、第101位的谷氨酸、第126位的甘氨酸、第137位的异亮氨酸、第156位的谷氨酰胺、第157位的赖氨酸、159位的天冬氨酸、第160位、第171位的丙氨酸、第185位的半胱氨酸、第221位的丝氨酸、第233位的丙氨酸、第241位的缬氨酸、第258位的丝氨酸、第266位的异亮氨酸及第286位的缬氨酸、及上述氨基酸的周边区域。上述“周边区域”是在对四氢黄豆苷元合成酶活性不产生影响的范围内，以上述特定位置的氨基酸为基点，例如前后5个以内的氨基酸，优选前后4个以内的氨基酸，较优选前后3个以内的氨基酸，更优选前后2个以内的氨基酸，特别优选前后1个的氨基酸。

序列号7所示的氨基酸序列中的第38位～第45位的氨基酸序列被认为相当于NADPH结合域。因此，只要不阻碍NADPH结合域的功能，可以在上述序列中取代、缺失、插入或添加任意氨基酸。但优选第38位的苏氨酸、第39位的甘氨酸、第43位的甘氨酸及第45位的甘氨酸不发生变异。上述序列中氨基酸的取代、缺失、插入或添加优选4个以下的氨基酸，较优选3个以下的氨基酸，更优选2个以下的氨基酸，特别优选1个氨基酸。

序列号7所示的氨基酸序列中的第115位～第118位的氨基酸序列被认为相当于SDR家族中的高度保守模序。上述序列中氨基酸的取代、缺失、插入或添加优选3个以下的氨基酸，较优选2个以下的氨基酸，更优选1个氨基酸。最优选上述序列中不发生氨基酸的变异。

序列号7所示的氨基酸序列中的第168位的丝氨酸、第182位的组氨酸、第186位的赖氨酸被认为与E2酶的活性中心有关。因此，只要不阻碍该酶的活性，上述3个氨基酸可以被任意其他的氨基酸取代，但优选上述氨基酸不发生变异。

序列号7所示的氨基酸序列中的第212位～217位的氨基酸序列被认为与辅因子的结合有关。因此，只要不阻碍该功能，可以在上述序列中取代、缺失、插入或添加任意氨基酸。但优选第212位的脯氨酸、第213位的甘氨酸及第217位的苏氨酸不发生变异。上述序列中氨基酸的取代、缺失、插入或添加优选3个以下的氨基酸，较优选2个以下的氨基酸，更优选1个氨基酸。特别优选上述序列中的氨基酸不发生变异。表示具有上述预想功能的氨基酸序列区域的比对示于图28。

相对于序列号7所示的氨基酸序列，上述(Bc)多肽中的氨基酸的同一性例如可以为60％以上，但通常为80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，较优选95％以上，特别优选98％以上，更特别优选99％以上。

作为上述(Bc)多肽的具体例子，可以举出由序列号8所示的氨基酸序列组成的多肽及由序列号9所示的氨基酸序列组成的多肽。序列号7所示的氨基酸序列与序列号8所示的氨基酸序列的同一性为99.3％，序列号7所示的氨基酸序列与序列号9所示的氨基酸序列的同一性为93.0％(Blast2)。因此，在本发明一个优选实施方式中，(Bc)多肽与序列号7所示的氨基酸序列的同一性优选为93.0％以上，较优选为99.3％以上。

另外，在上述(Bb)及(Bc)的多肽中，“以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元的活性”可以通过以下方式确证。即，将用作确证对象的多肽加入下述组成的底物溶液中使其浓度为0.001mg/mL，在37℃下温育2小时后，确证溶液中是否存在四氢黄豆苷元。确认温育后的溶液中存在四氢黄豆苷元时，判定上述多肽具有“以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元的活性”。

底物溶液的组成

0.1M 磷酸钾缓冲液(pH7.0)

1 mM PMSF(苯甲基磺酰氟)

2 mM 二硫苏糖醇

5 mM 连二亚硫酸钠

2 mM NADPH

2 mM NADH

40μM 二氢黄豆苷元

酶特性

E2多肽具有以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元的酶活性。因此，E2多肽也被称为E2酶。E2酶需要以NADPH或NADH作为辅酶。E2酶的最适温度在37℃左右，最适pH为4.5。E2酶不仅可以以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元，还可以进行其逆反应，即以四氢黄豆苷元为底物合成二氢黄豆苷元。

E2多肽与上述E1多肽相同，可以使用序列号10、11或12所示的核苷酸序列信息通过基因工程技术得到。另外，还可以基于序列号7、8或9所示的氨基酸序列信息通过化学合成法制备。并且E2多肽也可以从能产生E2多肽的微生物中分离和纯化而得到。上述方法可以按照上述A-1.部分的记述进行。

能产生E2多肽的微生物可以在含有所需量的二氢黄豆苷元、且含有所需量的黄豆苷元的培养基中培养。这种情况下，可以由能产生E2多肽的微生物中产生E2多肽。

E2多肽可以以单体形式存在，但只要具有四氢黄豆苷元合成能力，也可以以二聚体或多聚物形式存在。另外，为了提高E2多肽的稳定性等，可以根据需要添加聚乙二醇或糖链对E2多肽进行修饰。

E2多肽可以发挥催化作用，即催化以二氢黄豆苷元为底物转换为四氢黄豆苷元的反应。上述四氢黄豆苷元可以进一步通过下述雌马酚合成酶转换为雌马酚。雌马酚被认为是在体内发挥各种生理作用的物质，从此方面考虑，一般认为能提供雌马酚的合成原料的E2多肽是重要的。如上所述，本发明提供一种含有上述(Ba)～(Bc)多肽的四氢黄豆苷元合成酶。

B-2.多核苷酸

本发明还提供一种多核苷酸(以下也将该多核苷酸记为“E2多核苷酸”)，所述多核苷酸编码具有以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元活性的多肽。具体而言，提供下述(Bd)～(Bf)的多核苷酸作为E2多核苷酸：

(Bd)多核苷酸，由序列号10所示的核苷酸序列组成；

序列号7所示的氨基酸序列相当于序列号10所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。序列号8所示的氨基酸序列相当于序列号11所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。序列号9所示的氨基酸序列相当于序列号12所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

上述(Bf)的多核苷酸中的“在严格条件下杂交”与上述A-2.部分所述的“在严格条件下杂交”的意义相同。作为(Bf)的多核苷酸的具体例子，可以举出序列号11所示的核苷酸序列及序列号12所示的核苷酸序列。序列号10所示的核苷酸序列与序列号11所示的核苷酸序列的碱基序列的同一性为99.7％，序列号10所示的核苷酸序列与序列号12所示的核苷酸序列的碱基序列的同一性为91.0％(Blast2)。因此，在本发明的一个优选实施方式中，(Bf)的多核苷酸与序列号10所示的核苷酸序列具有91.0％以上的同源性，较优选具有99.7％以上的同源性。

上述(Bf)的多核苷酸中，“以二氢黄豆苷元为底物合成四氢黄豆苷元的活性”使用与为上述(Bb)或(Bc)多肽时相同的方法进行确证。

E2多核苷酸可以基于序列号10、11或12所示的序列信息通过化学合成法或基因工程技术制备·获得。作为具体方法，可以使用在上述A-2.部分所述的关于E1多核苷酸的方法。上述方法根据需要可以进行修正·变更。

对于E2多核苷酸的cDNA的提供物没有特殊限定，只要为表达E2多核苷酸的微生物即可。具体而言，可以举出能产生雌马酚的微生物，优选能产生雌马酚的乳酸菌、属于拟杆菌属的细菌及属于链球菌属的细菌，更优选能产生雌马酚的格氏乳球菌、卵形假杆菌、及咽峡炎链球菌，特别优选能产生雌马酚的来源于粪便的格氏乳球菌，特别优选能产生雌马酚的来源于粪便的作为格氏乳球菌的乳球菌20-92株(FERM BP-10036号；保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)、卵形假杆菌E-23-15株(FERM BP-6435号；保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)、咽峡炎链球菌A6G-225株(FERM BP-6437号；保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号))。

使用常规的基因工程学方法，通过使E2多核苷酸表达，可以容易地、大量且稳定地制备出该多核苷酸的产物(即上述多肽)。一直以来，关于雌马酚的产生菌只发现了难以处理的厌氧性菌株，但通过成功分离E2多核苷酸，也可以不使用现有的雌马酚产生菌，为雌马酚的工业制备开辟了一条新道路。

B-3.表达载体

对于本发明的表达载体没有特殊限定，只要含有E2多核苷酸并且能表达E2多核苷酸即可，含有E2多核苷酸的表达载体与含有E1多核苷酸的表达载体相同，一般可以根据与宿主细胞的关系进行适当选择。作为具体的宿主细胞，可以使用上述A-3.部分所述的宿主细胞。

B-4.重组细胞

本发明提供一种重组细胞(转化体)，所述重组细胞由上述含有E2多核苷酸的表达载体转化得到。对于用于重组细胞的宿主细胞没有特殊限定，可以为上述A-4.部分所述的宿主细胞。另外，可以按照上述A-4.部分记述的方法将表达载体导入宿主细胞。

由于上述重组细胞能产生作为四氢黄豆苷元转换酶的E2多肽，因此可用于制备四氢黄豆苷元转换酶，另外上述重组细胞也可以以细胞的形态用于四氢黄豆苷元的制备。

B-5.使用重组细胞的多肽的制备

将导入了E2多核苷酸的重组细胞进行培养，从培养物中回收E2多肽，由此来制备E2多肽。可以按照上述A-5.部分的记载进行培养。

B-6.使用E2多肽的四氢黄豆苷元的制备

本发明提供一种使用E2多肽制备四氢黄豆苷元的制备方法。即，上述制备方法通过在NADPH及/或NADH的存在下使E2多肽作用于二氢黄豆苷元，而将二氢黄豆苷元转换为四氢黄豆苷元。

本制备方法中使用的反应可以在如上述A-6.部分所述的适当的缓冲液中进行。

本制备方法中使用的反应在下述条件下进行，例如在反应开始时在缓冲液(反应开始时的原料混合物)中在下述浓度范围内加入各组分，在上述E2多肽、二氢黄豆苷元等原料及四氢黄豆苷元等产物不变质·不失活的温度条件下，温育0.5～10小时，优选1～6小时，更优选2～4小时而进行。上述温度条件下对于反应温度没有特殊限定，但例如设定为0℃以下时，使用在此反应温度下不冻结的缓冲液等。反应温度优选0～45℃，更优选0～37℃。另外，四氢黄豆苷元存在顺式及反式构型，通过改变上述反应温度或时间等条件可以控制顺式及反式构型的生成。例如，将反应温度设定为0℃时，可以生成混合有顺式及反式构型的四氢黄豆苷元，将反应温度设定为37℃时，可以使反式构型优先生成。

上述制备方法中各组分的浓度范围如下所示。

E2多肽含量为0.0001～1.0重量％，优选0.001～0.1重量％，更优选0.001～0.01重量％；

二氢黄豆苷元含量为0.0001～10.0重量％，优选0.001～1.0重量％，更优选0.001～0.1重量％；及

NADPH及/或NADH含量为0.01～5重量％，优选0.05～1重量％，更优选0.1～0.5重量％。

另外，作为用于合成四氢黄豆苷元的混合原料，本发明提供一种含有(Bi)E2多肽、(Bii)NADPH及/或NADH、及(Biii)二氢黄豆苷元的四氢黄豆苷元合成原料组合物。通过在上述条件下温育上述合成原料组合物，可以将该合成原料组合物中的二氢黄豆苷元转换为四氢黄豆苷元。上述合成原料组合物相当于在上述四氢黄豆苷元的制备中反应开始时的原料混合物，该合成原料组合物中的E2多肽的配合浓度、NADPH及/或NADH的配合浓度、二氢黄豆苷元的配合浓度及可以配合于该合成原料组合物中的其他组分等，都与上述制备方法中使用的反应体系(反应开始时的原料混合溶液)相同。

进而，作为用于合成四氢黄豆苷元的试剂盒，本发明提供一种含有(Bi)E2多肽、(Bii)NADPH及/或NADH、及(Biii)二氢黄豆苷元的四氢黄豆苷元合成用试剂盒。为了能在上述条件下简便地由二氢黄豆苷元合成四氢黄豆苷元，各组分可以根据需要分别储存在上述合成用试剂盒中。另外，上述合成用试剂盒中根据需要可以含有所需的缓冲液。并且，为了简便地进行四氢黄豆苷元的合成，上述合成用试剂盒可以含有必要的器具或操作手册。

B-7.四氢黄豆苷元合成酶组合物

本发明还提供一种含有E2多肽的四氢黄豆苷元合成酶组合物。上述酶组合物在使用了E2多肽的四氢黄豆苷元的制备方法中优选用作四氢黄豆苷元合成酶。

上述酶组合物可以为粗纯化状态的E2多肽，也可以为粗纯化或纯化的E2多肽与适当载体配合形成的物质。该载体为对E2多肽的活性不产生不良影响的物质，配合适量进行使用。

上述酶组合物中，对于E2多肽的配合比例没有特殊限定，只要在上述四氢黄豆苷元的制备方法中能作为四氢黄豆苷元合成酶使用即可。具体而言，相对于上述酶组合物的总量，E2多肽例如为0.001～20.0重量％，优选为0.005～5.0重量％，更优选为0.01～1.0重量％。

上述酶组合物中，可以含有作为E2多肽辅酶发挥作用的NADPH及/或NADH。上述酶组合物配合NADPH及/或NADH时，对于该NADPH及/或NADH的配合比例没有特殊限定，相对于上述酶组合物，例如为0.005～50.0重量％，优选为0.05～10.0重量％，更优选为0.1～5.0重量％。

进而，为了提高上述多肽的稳定性及/或确保上述酶组合物的保存性，上述酶组合物除了含有E2多肽外，还可以添加如上述A-7.部分所述的各种抗氧化剂或防腐剂。

B-8.使用上述重组细胞的四氢黄豆苷元的制备方法

本发明提供一种四氢黄豆苷元的制备方法，该制备方法使用导入了E2多核苷酸的重组细胞。即，上述制备方法中，通过使上述重组细胞作用于二氢黄豆苷元而使二氢黄豆苷元转换为四氢黄豆苷元。

该制备方法使用的反应在上述重组细胞能够存活并且能将二氢黄豆苷元转换为四氢黄豆苷元的条件下进行。

具体而言，是通过在上述重组细胞能生长的培养基中，加入适量的上述重组细胞及二氢黄豆苷元进行培养而进行。

本制备方法中使用的培养基可以根据用作重组细胞的宿主细胞的细胞种类从惯用的各种培养基中进行适当选择。

另外，上述培养基中，根据需要可以添加适量的PMSF、EDTA等蛋白酶抑制剂。另外，考虑到上述多肽来源于厌氧性菌，因此可以添加适量的DTT、2ME、DET、连二亚硫酸钠等还原剂。另外，使用上述重组细胞时，并非必须添加NADPH及/或NADH，但可以根据需要在培养基中添加NADPH及/或NADH。

具体而言，该制备方法如下进行：将上述重组细胞接种在含有0.001～1重量％、优选0.01～0.5重量％、更优选0.01～0.1重量％的二氢黄豆苷元的培养基中，在可以生长的温度条件下培养7～30小时，优选15～24小时，更优选17～20小时。此处，对于可以生长的温度条件没有特殊限定，可以在与上述“B-6.使用E2多肽的四氢黄豆苷元的制备”相同的温度下进行。

另外，作为用于合成四氢黄豆苷元的混合原料，本发明提供一种含有(Biv)上述重组细胞及(Biii)二氢黄豆苷元的四氢黄豆苷元合成原料组合物。通过在上述条件下培养上述合成原料组合物，可以将该合成原料组合物中的二氢黄豆苷元转换为四氢黄豆苷元。上述合成原料组合物相当于在上述四氢黄豆苷元的制备中反应开始时的原料混合物，在该合成原料组合物中的上述重组细胞及二氢黄豆苷元的浓度，及可以配合于该合成原料组合物中的其他组分等，都与上述制备方法中采用的条件等相同。

进而，作为用于合成四氢黄豆苷元的试剂盒，本发明提供一种含有(Biv)上述重组细胞及(Biii)二氢黄豆苷元的四氢黄豆苷元合成用试剂盒。为了能在上述条件下简便地由二氢黄豆苷元合成四氢黄豆苷元，上述重组细胞和二氢黄豆苷元可以根据需要分别储存在上述合成用试剂盒中。另外，根据需要上述合成用试剂盒中可以含有缓冲液或培养基。并且，为了简便地进行四氢黄豆苷元的合成，上述合成用试剂盒可以含有必要的器具或操作手册。

需要说明的是，包含于上述合成用试剂盒中的上述重组细胞可以使用公知的方法进行保存。作为保存重组细胞的公知技术，可以举出例如使用冷冻干燥机将装有含有重组细胞的二甲基甲酰胺等的溶液的安瓿抽成真空，然后在4～25℃下保存的方法等。除此之外还可以举出液氮方法，即，将细胞悬浊于添加有10％丙三醇的保存培养基中，将其回收至专用安瓿中并保存在液氮灌(-150～-196℃)中。

B-9.与上述多肽具有亲和性的抗体

本发明还提供一种与E2多肽具有亲和性的抗体(IgG抗体)。

单克隆抗体及多克隆抗体可以按照现有的方法制备。具体而言，可以按照上述A-9.部分所述的方法制备。

B-10.检测或测定上述多肽的免疫学方法

进而，本发明提供一种使用上述抗体检测或测定E2多肽的免疫学方法。具体而言，上述免疫学方法可以按照上述A-10.部分所述的方法进行。

作为用于检测或测定E2多肽的试剂盒，本发明提供一种含有上述抗体的免疫学检测用试剂盒。根据需要上述检测用试剂盒可以含有E2多肽作为标准品。并且，为了能在上述条件下简便进行E2多肽的检测，根据需要上述检测用试剂盒还可以含有其他所需的试剂等。另外，为了简便地进行E2多肽的检测，上述检测用试剂盒可以含有必要的器具或操作手册。

B-11.检测或测定编码上述多肽的多核苷酸的方法

另外，本发明提供一种检测或测定E2多核苷酸的方法。具体而言，上述方法通过使结合于E2多核苷酸的探针与受试样品相接触而进行，可以按照上述A-11.部分所述的方法进行。

进而，作为用于检测或测定E2多核苷酸的试剂盒，本发明提供一种含有上述探针的E2多核苷酸检测用试剂盒。为了能在上述条件下简便地进行E2多核苷酸的检测，根据需要上述检测用试剂盒中除上述探针之外还可以含有所需试剂等。另外，上述检测用试剂盒还可以用作用于鉴定含有E2多核苷酸的细胞的试剂盒。另外，从可以使检测精度高这一观点考虑，作为检测用试剂盒优选举出使用PCR进行检测的试剂盒。

C.雌马酚合成酶

C-1.多肽

作为以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚的多肽，本发明提供下述(Ca)～(Cc)的多肽(以下也将该多肽记为“E3多肽”)：

(Ca)多肽，由序列号13所示的氨基酸序列组成；

上述(Cb)多肽中，对于“一个或多个”的范围没有特殊限定，只要该多肽具有以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚的活性即可，可以举出例如1～200个，优选1～150个，较优选1～100个，较优选1～50个，较优选1～45个，较优选1～40个，较优选1～30个，较优选1～15个，更优选1～5个，更较优选1～4个，特别优选1～3个，更特别优选1或2个。

作为上述(Cb)多肽的具体例子，可以举出例如由序列号14所示的氨基酸序列组成的多肽及由序列号15所示的氨基酸序列组成的多肽。与序列号13所示的氨基酸序列相比较，序列号14所示的氨基酸序列含有2个被取代的氨基酸。与序列号13所示的氨基酸序列相比较，序列号15所示的氨基酸序列含有42个被取代的氨基酸并在C末端添加1个氨基酸(谷氨酸)。序列号14所示的氨基酸序列相当于来自于卵形假杆菌E-23-15株(FERM BP-6435号)的E3酶。序列号15所示的氨基酸序列相当于来自咽峡炎链球菌A6G-225株(FERM BP-6437号)的E3酶。

上述(Cb)多肽中“氨基酸的取代、缺失、插入或添加”可以以上述A-1.部分所述的E1多肽中的取代、缺失、插入或添加为基准而得到。上述(Cb)多肽中氨基酸的取代、缺失、插入或添加，优选发生在对多肽的高级结构不产生大的影响的区域或对于作为雌马酚合成酶的活性中心不产生影响的区域。作为上述区域可以举出例如在序列号13、14及15所示的氨基酸序列间的低保守区域及其周边，或N末端区域或C末端区域。具体而言，在序列号13所示的氨基酸序列中，可以举出第3位的谷氨酸、第28位的精氨酸、第29位的谷氨酸、第32位的精氨酸、第61位的天冬酰胺、第80位的异亮氨酸、第92位的天冬酰胺、第112位的天冬氨酸、第119位的丙氨酸、第129位的天冬酰胺、第172位的天冬氨酸、第174位的丙氨酸、第204位的丝氨酸、第206位的谷氨酸、第223位的苏氨酸、第230位的缬氨酸、第244位的脯氨酸、第246位的酪氨酸、第280位的苏氨酸、第282位的精氨酸、第285位的丙氨酸、第307位的缬氨酸、第322位的丙氨酸、第347位的谷氨酸、第359位的甘氨酸、第360位的丝氨酸、第366位的丙氨酸、第367位的亮氨酸、第368位的异亮氨酸、第372位的缬氨酸、第373位的天冬氨酸、第374位的苏氨酸、第377位的丙氨酸、第380位的丙氨酸、第381位的天冬氨酸、第399位的谷氨酰胺、第403位的脯氨酸、第404位的蛋氨酸、第405位的缬氨酸、第406位的谷氨酸、第407位的甘氨酸、第426位的精氨酸、第434位的缬氨酸、第436位的丙氨酸、第438位的酪氨酸、及第440位的丙氨酸及上述氨基酸的周边区域。上述“周边区域”是在对雌马酚合成酶活性不产生影响的范围内，以上述特定位置的氨基酸为基点，前后5个以内的氨基酸，优选前后4个的氨基酸，较优选前后3个的氨基酸，更优选前后2个的氨基酸，特别优选前后1个的氨基酸。作为上述低保守区域及其周边，优选举出在序列号13所示的氨基酸序列中相当于第25位～第35位的区域、相当于第170位～177位的区域、相当于第201位～第208位的区域、相当于242位～248位的区域、相当于第276位～第289位的区域、相当于第355位～第385位的区域、相当于第396位～第409位的区域、及相当于第431位～第443位的区域。

序列号13所示的氨基酸序列中的第14位～第19位的氨基酸序列被认为相当于FAD结合域。因此，只要不阻碍该结合域的功能，则可以在上述序列中取代、缺失、插入或添加任意氨基酸。但优选第14位的甘氨酸、第16位的甘氨酸及第19位的甘氨酸不发生变异。上述序列中氨基酸被取代、缺失、插入或添加时，优选3个以下的氨基酸、较优选2个以下的氨基酸、更优选1个的氨基酸发生变异，最优选不发生变异。

图29表示序列号13、14及15所示的氨基酸序列的比对情况。

相对于序列号13所示的氨基酸序列，上述(Cc)多肽中氨基酸的同一性例如可以为60％以上，但通常为80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，较优选95％以上，特别优选98％以上，更特别优选99％以上。

作为上述(Cc)多肽的具体例子，可以举出由序列号14所示的氨基酸序列组成的多肽及由序列号15所示的氨基酸序列组成的多肽。序列号13所示的氨基酸序列与序列号14所示的氨基酸序列的同一性为99.6％，序列号13所示的氨基酸序列与序列号15所示的氨基酸序列的同一性为90.9％(Blast2)。因此，在本发明一个优选实施方式中，(Cc)多肽与序列号14所示的氨基酸序列的同一性优选为90.9％以上，较优选为99.6％以上。

在上述(Cb)及(Cc)的多肽中，“以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚的活性”可以通过以下方式确证。即，将用作确认对象的多肽加入下述组成的底物溶液中使其浓度为0.001mg/mL，在37℃下温育2小时后，确证溶液中是否存在雌马酚。确证温育后溶液中存在雌马酚时，判定上述多肽具有“以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚的活性”。

底物溶液的组成

0.1M 磷酸钾缓冲液(pH7.0)

1 mM PMSF(苯甲基磺酰氟)

2 mM 二硫苏糖醇

5 mM 连二亚硫酸钠

40μM 四氢黄豆苷元

酶特性

E3多肽具有以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚的酶活性。因此，E3多肽也被称为E3酶。E3的最适温度在23～37℃左右，最适pH为4.5。E3酶不仅可以以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚，还可以进行其逆反应，即以雌马酚为底物合成四氢黄豆苷元。

E3多肽与E1多肽或E2多肽相同，可以基于序列号16、17或18所示的核苷酸序列信息通过基因工程技术进行制备。另外，也可以基于序列号13、14、或15所示的氨基酸序列信息通过化学合成法制备。并且，E3多肽也可以通过从能产生E3多肽的微生物中分离和纯化而得到。上述方法可以按照上述A-1.部分的记述而进行。

能产生E3多肽的微生物可以在含有所需量的四氢黄豆苷元的培养基中培养。这种情况下，可以由能产生E3多肽的微生物产生E3多肽。

另外，E3多肽可以以单体形式存在，但只要具有雌马酚合成能力，也可以以二聚体或多聚物的形式存在。另外，为了提高E3多肽的稳定性等，可以根据需要添加聚乙二醇或糖链对E3多肽进行修饰。

E3多肽可以发挥催化作用，即催化以四氢黄豆苷元为底物转换为雌马酚的反应。一般认为雌马酚是在体内发挥多种生理作用的物质，从此方面考虑通常认为能提供雌马酚的E3多肽是重要的。如上所述，本发明提供一种含有上述(Ca)～(Cc)多肽的雌马酚合成酶。

C-2.多核苷酸

本发明还提供一种多核苷酸(以下也将该多核苷酸记为“E3多核苷酸”)，所述多核苷酸编码具有以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚活性的多肽。具体而言，提供下述(Cd)～(Cf)的多核苷酸作为E3多核苷酸：

(Cd)多核苷酸，由序列号16所示的核苷酸序列组成；

序列号13所示的氨基酸序列相当于序列号16所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。序列号14所示的氨基酸序列相当于序列号17所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。序列号15所示的氨基酸序列相当于序列号18所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

上述(Cf)的多核苷酸中的“在严格条件下杂交”与上述A-2.部分所述的“在严格条件下杂交”意义相同。作为(Cf)的多核苷酸的具体例子，可以举出序列号17所示的核苷酸序列及序列号18所示的核苷酸序列。序列号16所示的核苷酸序列与序列号17所示的核苷酸序列的碱基序列的同一性为99.8％，序列号16所示的核苷酸序列与序列号18所示的核苷酸序列的同一性为85.2％。因此，在本发明的一个优选实施方式中，(Cf)的多核苷酸与序列号16所示的核苷酸序列具有85.2％以上的同源性，较优选具有99.8％以上的同源性。

另外，上述(Cf)的多核苷酸中，“以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚的活性”使用与上述(Cb)或(Cc)多肽相同的方法进行确证。

E3多核苷酸可以基于序列号16、17、或18所示的序列信息通过化学DNA合成法或基因工程技术制备·获得。作为具体方法，可以使用在上述A-2.部分所述的方法。

对于E3多核苷酸的cDNA的来源没有特殊限定，只要为表达E3多核苷酸的微生物即可。具体而言，可以举出能产生雌马酚的微生物，优选能产生雌马酚的乳酸菌、属于拟杆菌属的细菌及属于链球菌属的细菌，更优选能产生雌马酚的格氏乳球菌、卵形假杆菌、及咽峡炎链球菌，特别优选能产生雌马酚的来源于粪便的格氏乳球菌，特别优选能产生雌马酚的来源于粪便的作为格氏乳球菌的乳球菌20-92株(FERM BP-10036号；保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)、卵形假杆菌E-23-15株(FERM BP-6435号；保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)、咽峡炎链球菌A6G-225株(FERM BP-6437号；保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号))。

使用常规的基因工程学方法，使E3多核苷酸表达，由此可以容易地、大量且稳定地制备出该多核苷酸的产物(即上述多肽)。一直以来，关于雌马酚的产生菌只发现了难以处理的厌氧性菌株，但通过成功分离E3多核苷酸，也可以不使用现有的雌马酚产生菌，为雌马酚的工业制备开辟了一条新道路。

C-3.表达载体

对于本发明的表达载体没有特殊限定，只要含有E3多核苷酸并且能表达该E3多核苷酸即可，含有E3多核苷酸的表达载体与含有E1多核苷酸的表达载体相同，一般可以根据与宿主细胞的关系进行适当选择。作为具体的宿主细胞，可以使用上述A-3.部分所述的宿主细胞。

C-4.重组细胞

本发明提供一种重组细胞(转化体)，所述重组细胞由上述含有E3多核苷酸的表达载体转化得到。对于用于重组细胞的宿主细胞没有特殊限定，可以为上述A-4.部分所述的宿主细胞。另外，可以按照上述A-4.部分所述的方法将表达载体导入宿主细胞。

由于上述重组细胞能产生作为雌马酚转换酶的E3多肽，因此可用于制备雌马酚转换酶，另外上述重组细胞也可以以细胞的形态用于雌马酚的制备。

C-5.使用重组细胞的多肽的制备

将导入了E3多核苷酸的重组细胞进行培养，从培养物中回收E3多肽，由此制备E3多肽。可以按照上述A-5.部分的记述进行培养。

C-6.使用E3多肽的雌马酚的制备

本发明提供一种使用E3多肽制备雌马酚的制备方法。即，使用上述制备方法，通过使E3多肽作用于四氢黄豆苷元，而将四氢黄豆苷元转换为雌马酚。

该制备方法中使用的反应可以在适当的缓冲液中进行。具体而言，可以使用上述A-6.部分所述的缓冲液。

该制备方法中使用的反应如下进行：例如在反应开始时在缓冲液(反应开始时的原料混合物)中在下述的浓度范围内加入各组分，在上述E3多肽、四氢黄豆苷元等原料及雌马酚等的产物不变质·不失活的温度条件下，温育0.5～10小时，优选1～6小时，更优选2～4小时。只要为上述温度条件即可，对于反应温度没有特殊限定，但例如设定为0℃以下时，使用在此反应温度下不冻结的缓冲液等。反应温度优选0～45℃，更优选0～37℃。

上述E3多肽含量为0.0001～1.0重量％，优选0.001～0.1重量％，更优选0.001～0.01重量％；

四氢黄豆苷元含量为0.0001～10.0重量％，优选0.001～1.0重量％，更优选0.001～0.1重量％。

另外，作为用于合成雌马酚的混合原料，本发明提供一种含有(Ci)E3多肽及(Cii)四氢黄豆苷元的雌马酚合成原料组合物。通过在上述条件下温育上述合成原料组合物，可以将该合成原料组合物中的四氢黄豆苷元转换为雌马酚。上述合成原料组合物相当于在上述雌马酚的制备中反应开始时的原料混合物，在该合成原料组合物中的E3多肽的配合浓度、四氢黄豆苷元的配合浓度、及可以配合于该合成原料组合物中的其他组分等，都与上述制备方法中使用的反应体系(反应开始时的原料混合溶液)相同。

进而，作为用于合成雌马酚的试剂盒，本发明提供一种含有(Ci)E3多肽及(Cii)四氢黄豆苷元的雌马酚合成用试剂盒。为了能在上述条件下简便地由四氢黄豆苷元合成雌马酚，各组分可以根据需要分别储存在上述合成用试剂盒中。另外，根据需要上述合成用试剂盒中可以含有所需的缓冲液。并且，为了简便地进行雌马酚的合成，上述合成用试剂盒可以含有必要的器具或操作手册。

C-7.雌马酚合成酶组合物

本发明还提供一种含有E3多肽的雌马酚合成酶组合物。上述酶组合物在使用了E3多肽的雌马酚的制备方法中优选用作雌马酚合成酶。

上述酶组合物可以为粗纯化状态的E3多肽，也可以为粗纯化或纯化的E3多肽与适当载体配合形成的物质。该载体为对E3多肽的活性不产生不良影响的物质，适量配合进行使用。

上述酶组合物中，对于E3多肽的配合比例没有特殊限定，只要在上述雌马酚的制备方法中能作为雌马酚合成酶使用即可。具体而言，相对于上述酶组合物的总量，E3多肽例如为0.001～20.0重量％，优选为0.005～5.0重量％，更优选为0.01～1.0重量％。

进而，为了提高上述多肽的稳定性及/或确保上述酶组合物的保存性，上述酶组合物除了含有E3多肽之外，还可以添加如上述A-7.部分所述的各种抗氧化剂或防腐剂。

C-8.使用上述重组细胞的雌马酚的制备方法

本发明提供一种雌马酚的制备方法，该制备方法使用导入了E3多核苷酸的重组细胞。即，使用上述制备方法，通过使上述重组细胞作用于四氢黄豆苷元而使四氢黄豆苷元转换为雌马酚。

本制备方法使用的反应在上述重组细胞能够存活并且能将四氢黄豆苷元转换为雌马酚的条件下进行。

具体而言，是在上述重组细胞能生长的培养基中，加入适量的上述重组细胞及四氢黄豆苷元进行培养而进行。

本制备方法中使用的培养基，可以根据作为重组细胞的宿主细胞使用的细胞种类从惯用的各种培养基中进行适当选择。

另外，上述培养基中，根据需要可以添加适量的PMSF、EDTA等蛋白酶抑制剂。另外，考虑到上述多肽来源于厌氧性菌，因此可以添加适量的DTT、2ME、DET、连二亚硫酸钠等还原剂。另外，使用上述重组细胞时，并非必须加入NADPH及/或NADH，但可以根据需要在培养基中添加NADPH及/或NADH。

具体而言，本制备方法如下进行：将上述重组细胞接种在含有0.001～1重量％、优选0.01～0.5重量％、更优选0.01～0.1重量％的四氢黄豆苷元的培养基中，在可以生长的温度条件下培养7～30小时，优选15～24小时，更优选17～20小时。此处，对于可以生长的温度条件没有特殊限定，可以在与上述C-6.部分所述的温度相同的温度下进行。

另外，作为用于合成雌马酚的混合原料，本发明提供一种含有(Ciii)上述重组细胞及(Cii)四氢黄豆苷元的雌马酚合成原料组合物。通过在上述条件下培养上述合成原料组合物，可以将该合成原料组合物中的四氢黄豆苷元转换为雌马酚。上述合成原料组合物相当于在上述雌马酚的制备中反应开始时的原料混合物，在该合成原料组合物中的上述重组细胞及四氢黄豆苷元的浓度，及可以配合于该合成原料组合物中的其他组分等，都与上述制备方法中采用的条件等相同。

进而，作为用于合成雌马酚的试剂盒，本发明提供一种含有(Ciii)上述重组细胞及(Cii)四氢黄豆苷元的雌马酚合成用试剂盒。为了能在上述条件下简便地由四氢黄豆苷元合成雌马酚，上述重组细胞和四氢黄豆苷元可以根据需要分别储存在上述合成用试剂盒中。另外，根据需要上述合成用试剂盒中可以含有缓冲液或培养基。并且，为了简便地进行雌马酚的合成，上述合成用试剂盒可以含有必要的器具或操作手册。

需要说明的是，包含于上述合成用试剂盒中的上述重组细胞可以使用公知的方法进行保存。作为保存重组细胞的公知技术，可以举出例如使用冷冻干燥机将装有含有重组细胞的二甲基甲酰胺等溶液的安瓿抽成真空，然后在4～25℃下保存的方法等。除此之外还可以举出液氮方法，即，将细胞悬浊于添加有10％丙三醇的保存培养基中，将其回收至专用安瓿中并保存在液氮灌(-150～-196℃)中。

C-9.与上述多肽具有亲和性的抗体

本发明还提供一种与E3多肽具有亲和性的抗体(IgG抗体)。

C-10.检测或测定上述多肽的免疫学方法

进而，本发明提供一种使用上述抗体检测或测定E3多肽的免疫学方法。具体而言，上述免疫学方法可以按照上述A-10.部分所述的方法进行。

作为用于检测或测定E3多肽的试剂盒，本发明提供一种含有上述抗体的免疫学检测用试剂盒。根据需要上述检测用试剂盒中可以含有E3多肽作为标准品。并且，为了能在上述条件下简便地进行E3多肽的检测，根据需要上述检测用试剂盒还可以含有所需的试剂等。另外，为了简便地进行E3多肽的检测，上述检测用试剂盒可以含有必要的器具或操作手册。

C-11.检测或测定编码上述多肽的多核苷酸的方法

另外，本发明提供一种检测或测定E3多核苷酸的方法。具体而言，上述方法通过使结合于E3多核苷酸的探针与受试样品相接触而进行，可以按照上述A-11.部分所述的方法进行。

进而，作为用于检测或测定E3多核苷酸的试剂盒，本发明提供一种含有上述探针的E3多核苷酸检测用试剂盒。为了能在上述条件下简便地进行E3多核苷酸的检测，根据需要上述检测用试剂盒除含有上述探针外还可以含有所需的试剂等。另外，上述检测用试剂盒还可以作为用于鉴定含有E3多核苷酸的细胞的试剂盒。另外，从可以使检测精度高这一观点考虑，作为上述检测用试剂盒优选举出使用PCR进行检测的试剂盒。

D.使用E1～E3酶的雌马酚或其中间体的制备方法

D-I-1.包括第1步骤及第2步骤的四氢黄豆苷元的制备方法

本发明提供一种包括以下第1步骤及第2步骤的四氢黄豆苷元的制备方法(以下也将该制备方法记为“第1制备方法”)。其中，所述第1步骤由黄豆苷元生成二氢黄豆苷元，所述第2步骤由二氢黄豆苷元生成四氢黄豆苷元。

(Aa)多肽，由序列号1所示的氨基酸序列组成；

(第2步骤)通过使由下述(Ba)～(Bc)中任一种多肽(以下也将该多肽记为“E2多肽”)组成的酶、及NADPH及/或NADH作用于二氢黄豆苷元，生成四氢黄豆苷元的步骤；

(Ba)多肽，由序列号7所示的氨基酸序列组成；

使用本发明的第1制备方法可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元。

第1步骤

第1步骤中，在NADPH及/或NADH的存在下使由E1多肽组成的酶作用于黄豆苷元，由此将黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元。第1步骤中采用的反应如下实施：在上述含有由E1多肽组成的酶、黄豆苷元及NADPH及/或NADH溶液中，在使上述由E1多肽组成的酶、黄豆苷元等原料及二氢黄豆苷元等产物不变质·不灭活的温度条件及时间下温育而进行。具体而言，可以在上述A-6.部分所述的条件下进行。

上述第1步骤和下述第2步骤在相同条件下进行时，从第1及第2步骤两个步骤都能有效地进行这一观点考虑，使用的反应如下实施：配制原料混合物使在反应开始时的反应体系(反应开始时的原料混合物)中各组分满足下述浓度范围，并在15～45℃、优选25～40℃、更优选30～38℃的温度条件下，温育0.5～10小时、优选1～6小时、更优选2～4小时：

由E1多肽组成的酶的含量为0.0001～1.0重量％，优选0.001～0.1重量％，更优选0.001～0.01重量％；

黄豆苷元的含量为0.0001～10.0重量％，优选0.001～1.0重量％，更优选0.001～0.1重量％；及

NADPH/或NADH的含量为0.01～5重量％，优选0.05～1重量％，更优选0.1～0.5重量％。

对第1步骤中作为底物使用的黄豆苷元的来源没有特殊限定。例如可以使用市售的黄豆苷元，也可以使用通过适宜方法生成或合成的黄豆苷元。

另外，作为第1步骤中用于生成二氢黄豆苷元的混合原料，例如可以使用含有(Ai)由E1多肽组成的酶、(Aii)NADPH及/或NADH及(Aiii)黄豆苷元的二氢黄豆苷元合成原料组合物。通过在上述条件下温育上述合成原料组合物，可以使该合成原料组合物中的黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元。上述合成原料组合物在上述A-6.及A-7.部分已详细说明。

第2步骤

第2步骤中，在NADPH及/或NADH的存在下使由E2多肽组成的酶作用于二氢黄豆苷元，由此将二氢黄豆苷元转换为四氢黄豆苷元。

第2步骤中使用的反应例如可以如下实施：在上述含有由E2多肽组成的酶、二氢黄豆苷元及NADPH及/或NADH的溶液中在使上述由E2多肽组成的酶、二氢黄豆苷元等原料及四氢黄豆苷元等产物不变质·不灭活的温度条件及时间下温育而进行。具体而言，可以在上述B-6.部分所述的条件下进行。

四氢黄豆苷元存在顺式及反式构型，通过改变上述反应温度或时间等条件可以控制顺式及反式构型的形成。例如，将反应温度设定为0℃时，可以生成混合有顺式及反式构型的四氢黄豆苷元，将反应温度设定为37℃时，可以使反式构型优先生成。

另外，上述第1步骤和第2步骤在相同条件下进行时，从第1及第2步骤两个步骤都能有效地进行这一观点考虑，所采用的反应可以如下实施：在与上述“第1步骤”项中所述的第1步骤和第2步骤在相同条件下进行时的条件下温育两者而进行。在这种情况下，由E2多肽组成的酶、二氢黄豆苷元、及NADPH及/或NADH的浓度可以如下设定：

由E2多肽组成的酶的含量为0.0001～1.0重量％，优选0.001～0.1重量％，更优选0.001～0.01重量％；

二氢黄豆苷元的含量为0.0001～10.0重量％，优选0.001～1.0重量％，更优选0.001～0.1重量％；及

但是，在由E1多肽组成的酶及由E2多肽组成的酶共存的条件下进行第1步骤和第2步骤时，从有效进行使用由E1多肽组成的酶生成二氢黄豆苷元的反应这一观点考虑，需要加入NADPH。上述条件下，NADPH的浓度基于上述“第1步骤”项中所述的与第1步骤和第2步骤在相同条件下进行时的条件而确定。并且，将与NADPH同时使用的NADH的浓度设定为0.01～5重量％，优选0.05～1重量％，更优选0.1～0.5重量％。

第2步骤中，对于作为底物使用的二氢黄豆苷元的来源也没有限定。

例如，可以将第1步骤中由黄豆苷元生成的二氢黄豆苷元作为第2步骤中的底物使用。上述情况下，二氢黄豆苷元可以以第1步骤中生成的含有二氢黄豆苷元的溶液形式使用，也可以以粗纯化形式或纯化的形式使用。

另外，例如可以使用市售的二氢黄豆苷元，也可以使用通过适宜方法合成的二氢黄豆苷元。

另外，作为第2步骤中用于合成四氢黄豆苷元的混合原料，可以使用含有(Bi)由E2多肽组成的酶、(Bii)NADPH及/或NADH及(Biii)二氢黄豆苷元的四氢黄豆苷元合成原料组合物。通过在上述条件下温育上述合成原料组合物，可以将该合成原料组合物中的二氢黄豆苷元转换为四氢黄豆苷元。上述合成原料组合物在上述B-6.及B-7.部分已详细说明。

第2步骤中，作为其底物优选使用在第1步骤中由黄豆苷元生成的二氢黄豆苷元，也可以将市售的二氢黄豆苷元、上述合成原料组合物及上述酶组合物等与上述第1步骤中生成的二氢黄豆苷元混合使用。

E1多肽及E2多肽

本发明的第1制备方法中，使用上述A-1.中所述的由E1多肽组成的酶及上述B-1.所述的由E2多肽组成的酶。

D-I-2.通过第1制备方法制备的含有四氢黄豆苷元的产物

本发明提供一种由包括第1步骤及第2步骤的四氢黄豆苷元的制备方法(第1制备方法)制备的、含有四氢黄豆苷元的产物。

如上所述，使用本发明的第1制备方法可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，并由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元。

因此，通过本发明的第1制备方法制备的含有四氢黄豆苷元的产物中，不仅含有四氢黄豆苷元，还可能含有二氢黄豆苷元和/或黄豆苷元。

另外，本发明的产物可以以由第1制备方法得到的溶液的形式使用，也可以以通过从该溶液中粗纯化或纯化得到的四氢黄豆苷元等的产物的形式使用。

本发明的产物可以在食品、饮料、化妆用品、药品等中配合使用，也可以作为底物使用。

D-I-3.包括第2步骤及第3步骤的雌马酚的制备方法

本发明提供一种包括以下第2步骤及第3步骤的雌马酚的制备方法(以下也将该制备方法记为“第2制备方法”)。其中，所述第2步骤由二氢黄豆苷元生成四氢黄豆苷元，所述第3步骤由四氢黄豆苷元生成雌马酚。

通过使由下述(Ba)～(Bc)中任一种多肽(以下也将该多肽记为“E2多肽”)组成的酶、及NADPH及/或NADH作用于二氢黄豆苷元，生成四氢黄豆苷元的步骤；

(Ba)多肽，由序列号7所示的氨基酸序列组成；

(第3步骤)通过使由下述(Ca)～(Cc)中任一种多肽(以下也将该多肽记为“E3多肽”)组成的酶作用于四氢黄豆苷元，制备雌马酚的步骤；

(Ca)多肽，由序列号13所示的氨基酸序列组成；

使用本发明的第2制备方法，可以由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

第2步骤

本发明的第2制备方法中的第2步骤与上述第1制备方法中的第2步骤相同。

需要说明的是，第2步骤和下述第3步骤在相同条件下进行时，从第2及第3步骤两个步骤都能有效地进行这一观点考虑，所使用的反应可以如下实施：配制原料混合物使在反应开始时的反应体系(反应开始时的原料混合物)中各组分满足下述浓度范围，并在15～45℃、优选25～40℃、更优选30～38℃的温度条件下，温育0.5～10小时、优选1～6小时、更优选2～4小时而进行：

第3步骤

第3步骤中，通过将由E3多肽组成的酶作用于四氢黄豆苷元，使四氢黄豆苷元转换为雌马酚。

第3步骤使用的反应如下实施：在含有上述由E3多肽组成的酶、四氢黄豆苷元的溶液中在使上述由E3多肽组成的酶、四氢黄豆苷元等原料及雌马酚等产物不变质·不灭活的温度条件及时间下温育而进行。具体而言，可以在上述A-6.部分所述的条件进行该反应。

上述第2步骤和第3步骤在相同条件下进行时，从第2及第3步骤两个步骤都能有效地进行这一观点考虑，所使用的反应可以如下实施：在上述“第2步骤”项中所述的在与第2步骤和第3步骤在相同条件下进行时的条件下温育两者而进行。上述情况下，由E3多肽组成酶、四氢黄豆苷元、及NADPH及/或NADH的浓度可以如下设定：

由E3多肽组成的酶的含量为0.0001～1.0重量％，优选0.001～0.1重量％，更优选0.001～0.01重量％；

四氢黄豆苷元的含量为0.0001～10.0重量％，优选0.001～1.0重量％，更优选0.001～0.1重量％；及

第3步骤中，对于作为底物使用的四氢黄豆苷元的来源也没有限制。

例如，可以使用第2步骤中由二氢黄豆苷元生成的四氢黄豆苷元作为第3步骤中的底物。上述情况下，该四氢黄豆苷元可以以第2步骤中生成的含有四氢黄豆苷元的溶液形式使用，也可以以粗纯化形式或纯化的形式使用。

另外，例如可以使用市售的四氢黄豆苷元，也可以使用通过适宜方法合成的四氢黄豆苷元。

另外，作为第3步骤中用于合成雌马酚的混合原料，可以使用含有(Ci)由E3多肽组成的酶及(Cii)四氢黄豆苷元的雌马酚合成原料组合物。通过在上述条件下温育上述合成原料组合物，可以使该合成原料组合物中的四氢黄豆苷元转换为雌马酚。上述合成原料组合物在上述C-6.及C-7.部分已详细说明。

第3步骤中，作为其底物优选使用第2步骤中由二氢黄豆苷元生成的四氢黄豆苷元，也可以将市售的四氢黄豆苷元、上述合成原料组合物及上述酶组合物等与上述第2步骤中生成的四氢黄豆苷元混合使用。

E2多肽及E3多肽

本发明的第2制备方法中，使用上述B-1.部分所述的由E2多肽组成的酶及上述C-1.部分所述的由E3多肽组成的酶。

D-I-4.通过第2制备方法制备的含有雌马酚的产物

本发明提供一种含有雌马酚的产物，由包括第2步骤及第3步骤的雌马酚的制备方法(第2制备方法)制备得到。

如上所述，使用本发明的第2制备方法可以由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

因此，通过本发明的第2制备方法制备的含有雌马酚的产物中，不仅含有雌马酚，还可能含有四氢黄豆苷元和/或二氢黄豆苷元。

另外，本发明的产物可以以由第2制备方法得到的溶液的形式使用，也可以以通过从该溶液中粗纯化或纯化得到的雌马酚等的产物的形式使用。

D-I-5.包括第1步骤～第3步骤的、雌马酚的制备方法

本发明提供一种包括上述第1步骤、第2步骤及第3步骤的雌马酚的制备方法(以下也将该制备方法记为“第3制备方法”)。

使用本发明的第3制备方法可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

第1步骤

在本发明的第3制备方法所包含的第1步骤中，在NADPH及/或NADH的存在下使由E1多肽组成的酶作用于黄豆苷元，由此将黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元。本发明的第3制备方法中的第1步骤与上述第1步骤相同。

需要说明的是，第1步骤及第2步骤在相同条件下进行时，第1步骤及第3步骤在相同条件下进行时，或第1步骤～第3步骤在相同条件下进行时，从有效进行上述各步骤这一观点考虑，使用的反应可以在上述“第1步骤”项中所述的第1步骤和第2步骤在相同条件下进行时的条件·各浓度下通过温育进行。

第2步骤

在本发明的第3制备方法所包含的第2步骤中，在NADPH及/或NADH的存在下使由E2多肽组成的酶作用于二氢黄豆苷元，由此将二氢黄豆苷元转换为四氢黄豆苷元。第2步骤与上述第2步骤相同。

需要说明的是，第1步骤及第2步骤在相同条件下进行时，或第1步骤～第3步骤在相同条件下进行时，从有效进行上述各步骤这一观点考虑，所使用的反应可以如下实施：在上述“第2步骤”项中所述的、第1步骤和第2步骤在相同条件下进行时的条件·各浓度下进行温育。

另外，在由E1多肽组成的酶及由E2多肽组成的酶共存的条件下进行第1步骤和第2步骤时，或在由E1多肽组成的酶、由E2多肽组成的酶及由E3多肽组成的酶共存的条件下进行第1步骤～第3步骤时，反应可以如下实施：在上述“第2步骤”项等所述的由E1多肽组成的酶及由E2多肽组成的酶共存条件下进行的条件·各浓度下进行温育。

另外，第2步骤及第3步骤在相同条件下进行时，从有效进行各步骤这一观点考虑，所使用的反应可以如下实施：在上述“第2步骤”所述的第2步骤和第3步骤等在相同条件下进行时的条件·浓度下进行温育。

第3步骤

在本发明的第3制备方法所包含的第3步骤中，将由E3多肽组成的酶作用于四氢黄豆苷元，由此将四氢黄豆苷元转换为雌马酚。第3步骤与上述第3步骤相同。

需要说明的是，第1步骤及第3步骤在相同条件下进行时，或第1步骤～第3步骤在相同条件下进行时，从有效进行上述各步骤这一观点考虑，使用的反应可以如下实施：在上述“第1步骤”项中所述的、第1步骤和第2步骤在相同条件下进行时的条件下进行温育。上述情况下，由E3多肽组成的酶、四氢黄豆苷元及NADPH及/或NADH的浓度可以如下设定：

但是，在由E1多肽组成的酶及由E3多肽组成的酶共存的条件下进行第1步骤及第3步骤时，或在由E1多肽组成的酶、由E2多肽组成的酶及由E3多肽组成的酶共存的条件下进行第1步骤～第3步骤时，如上所述，从有效进行使用由E1多肽组成的酶生成二氢黄豆苷元的反应这一观点考虑，需要加入NADPH。上述情况下，基于上述“第1步骤”项中所述的、第1步骤和第2步骤在相同条件下进行时的条件，确定NADPH的浓度。并且，基于上述“第2步骤”项中所述的在由E1多肽组成的酶及由E2多肽组成的酶共存的条件下进行时的条件、及上述“第2步骤”项中所述的第2步骤及第3步骤等在相同条件下进行时的条件，确定与NADPH同时使用的NADH的浓度。

E1～E3多肽

本发明的第3制备方法使用上述由E1多肽组成的酶、由E2多肽组成的酶及由E3多肽组成酶。E1～E3多肽与上述相同。

D-I-6.通过第3制备方法制备的含有雌马酚的产物

本发明提供一种含有雌马酚的产物，由包括第1步骤～第3步骤的雌马酚的制备方法(第3制备方法)制备得到。

如上所述，使用本发明的第3制备方法，可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

因此，通过本发明的第3制备方法制备的含有雌马酚的产物中，不仅含有雌马酚，还可能含有四氢黄豆苷元、二氢黄豆苷元和/或黄豆苷元。

另外，本发明的产物可以以由第3制备方法得到的溶液的形式使用，也可以以通过从该溶液中粗纯化或纯化得到的雌马酚等产物的形式使用。

D-I-7.包括第4步骤～第6步骤中至少两个步骤的二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的制备方法

本发明提供一种包括以下第4步骤、第5步骤及第6步骤中至少两个步骤的二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的制备方法(以下也将该制备方法记为“第4制备方法”)。其中，所述第4步骤由黄豆苷元生成二氢黄豆苷元，所述第5步骤由二氢黄豆苷元生成四氢黄豆苷元，所述第6步骤由四氢黄豆苷元生成雌马酚。

(第4步骤)通过使含有(Ad)～(Af)中任一种多核苷酸(以下也将该多核苷酸记为“E1多核苷酸”)的重组细胞作用于黄豆苷元，生成二氢黄豆苷元的步骤，

(Ad)多核苷酸，由序列号4所示的核苷酸序列组成；

(第5步骤)通过使含有(Bd)～(Bf)中任一种多核苷酸(以下也将该多核苷酸记为“E2多核苷酸”)的重组细胞作用于二氢黄豆苷元，生成四氢黄豆苷元的步骤，

(Bd)多核苷酸，由序列号10所示的核苷酸序列组成；

(第6步骤)通过使含有(Cd)～(Cc)中任一种多核苷酸(以下也将该多核苷酸记为“E3多核苷酸”)的重组细胞作用于四氢黄豆苷元，生成雌马酚的步骤，

(Cd)多核苷酸，由序列号16所示的核苷酸序列组成；

(Cf)多核苷酸，与上述(Cd)或(Ce)的多核苷酸的互补链在严格条件下杂交，并且编码具有以四氢黄豆苷元为底物生成雌马酚的多肽。

使用本发明的第4制备方法，根据第4～6步骤的各种组合，可以制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚。

本发明的第4制备方法如上所述包括第4步骤、第5步骤及第6步骤中的至少两个步骤。

例如，本发明的第4制备方法包括第4步骤及第5步骤的两个步骤而不包括第6步骤时，使用本发明的第4制备方法可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元。

另外，例如本发明的第4制备方法包括第5步骤及第6步骤的两个步骤而不包含第4步骤时，使用本发明的第4制备方法可以由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

本发明的第4制备方法包括第4～6步骤的三个步骤时，使用本发明的第4制备方法，可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

本发明的第4制备方法中使用的重组细胞，每个细胞内可以含有选自(Ad)～(Af)、(Bd)～(Bf)及(Cd)～(Cf)中的1种多核苷酸，也可以含有选自该组中的2种以上的多核苷酸。

例如，一个细胞含有选自(Ad)～(Af)中的1种多核苷酸和选自(Bd)～(Bf)中的1种多核苷酸共2种多核苷酸时，可以使用上述重组细胞进行第4步骤及第5步骤，也就是说可以使用一种重组细胞进行第4步骤及第5步骤。

另外，例如一个细胞含有选自(Ad)～(Af)中的1种多核苷酸和选自(Bd)～(Bf)中的1种多核苷酸和选自(Cd)～(Cf)中的1种多核苷酸共3种多核苷酸时，可以使用上述重组细胞进行第4步骤～第6步骤，也就是说可以使用一种重组细胞进行第4步骤～第6步骤。

另外，本发明的第4制备方法中，例如可以通过使用如上所述的含有选自(Ad)～(Af)中的1种多核苷酸和选自(Bd)～(Bf)中的1种多核苷酸共2种多核苷酸的重组细胞和含有选自(Cd)～(Cf)中的1种多核苷酸的重组细胞，进行第4步骤～第6步骤。

同样，例如本发明的第4制备方法中，也可以通过使用含有选自(Ad)～(Af)中的1种多核苷酸和选自(Cd)～(Cf)中的1种多核苷酸共2种多核苷酸的重组细胞和含有选自(Bd)～(Bf)中的1种多核苷酸的重组细胞，进行第4步骤～第6步骤。

第4步骤

第4步骤中，通过使含有上述A-2.部分所述的E1多核苷酸的重组细胞作用于黄豆苷元，将黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元。

第4步骤中使用的反应可以在与上述第1步骤相同的条件下进行。具体而言，该制备方法如下进行：将上述重组细胞接种在含有0.001～1重量％、优选0.01～1重量％、更优选0.01～0.5重量％的黄豆苷元的培养基中，在可以生长的温度条件下温育6～30小时，优选7～24小时，更优选7～18小时。此处，对于可以生长的温度条件没有特殊限定，可以在与上述“第1步骤”项中的温度相同的温度下进行。

第4步骤中使用的重组细胞

对于第4步骤中使用的重组细胞没有限制，只要含有E1多核苷酸并能表达E1多核苷酸即可。具体而言，可以使用上述A-4.部分所述的重组细胞。

使用含有E1多核苷酸的重组细胞制备由E1多肽组成的酶

将导入了E1多核苷酸的重组细胞进行培养，从细胞及/或培养物中回收E1多肽，由此制备由E1多肽组成的酶。具体而言，可以通过按照上述A-5.部分所述的条件培养该重组细胞来制备E1多肽。

第5步骤

第5步骤中，通过使含有上述B-2.部分所述的E2多核苷酸的重组细胞作用于二氢黄豆苷元，将二氢黄豆苷元转换为四氢黄豆苷元。

第5步骤中使用的反应可以在与上述第2步骤相同的条件下进行。具体而言，该制备方法如下进行：将上述重组细胞接种在含有0.001～1重量％、优选0.01～0.5重量％、更优选0.01～0.1重量％的二氢黄豆苷元的培养基中，在可以生长的温度条件下温育7～30小时，优选15～24小时，更优选17～20小时。此处，对于可以生长的温度条件没有特殊限定，可以在与上述“第2步骤”项中的温度相同的温度下进行。

第5步骤中使用的重组细胞

对于第5步骤中使用的重组细胞没有限制，只要含有上述B-2.部分所述的E2多核苷酸并能表达E2多核苷酸即可。具体而言，可以使用上述B-4.部分所述的重组细胞。

使用含有E2多核苷酸的重组细胞制备由E2多肽组成的酶

将导入了E2多核苷酸的重组细胞进行培养，从细胞及/或培养物中回收E2多肽，由此制备由E2多肽组成的酶。

另外，导入了E2多核苷酸的重组细胞的培养、用于培养的培养基、及E2多肽的分离·纯化可以按照与上述“使用含有E1多核苷酸的重组细胞制备由E1多肽组成的酶”中相同的方式和条件进行。

第6步骤

第6步骤中，通过使含有上述C-2.部分所述的E3多核苷酸的重组细胞作用于四氢黄豆苷元，将四氢黄豆苷元转换为雌马酚。

第6步骤中使用的反应可以在与上述第3步骤相同的条件下进行。例如，可如下进行：将上述重组细胞接种在含有0.001～1重量％、优选0.01～0.5重量％、更优选0.01～0.1重量％的四氢黄豆苷元的培养基中，在可以生长的温度条件下温育7～30小时，优选15～24小时，更优选17～20小时。此处，对于可以生长的温度条件没有特殊限定，可以在与上述“第3步骤”项中的温度相同的温度下进行。

对于第6步骤中作为底物使用的四氢黄豆苷元的来源没有限制。

例如，可以将第5步骤中由二氢黄豆苷元生成的四氢黄豆苷元作为第6步骤中的底物使用。上述情况下，该四氢黄豆苷元可以以第5步骤生成的含有四氢黄豆苷元的溶液的形式使用，也可以以粗纯化或纯化的形式使用。

另外，例如可以使用市售的四氢黄豆苷元，也可以使用通过适宜的方法合成的四氢黄豆苷元。

另外，例如可以使用具有含有E3多核苷酸的重组细胞及四氢黄豆苷元的雌马酚合成原料组合物作为第6步骤中用于合成雌马酚的混合原料。通过在上述条件下培养上述合成原料组合物，可以使该合成原料组合物中的四氢黄豆苷元转换为雌马酚。上述合成原料组合物中上述重组细胞及四氢黄豆苷元的浓度，及可在上述合成原料组合物中配合的其他组分等或反应条件与上述相同。

优选将第5步骤中由二氢黄豆苷元生成的四氢黄豆苷元作为第6步骤中的底物使用，也可以将市售的四氢黄豆苷元或上述合成原料组合物等与第5步骤中生成的四氢黄豆苷元混合使用。

第6步骤中使用的重组细胞

对于第6步骤中使用的重组细胞没有限制，只要含有上述C-2.部分所述的E3多核苷酸并能表达E3多核苷酸即可。具体而言，可以使用上述C-4.部分所述的重组细胞。

使用含有E3多核苷酸的重组细胞制备由E3多肽组成的酶

将导入了E3多核苷酸的重组细胞进行培养，从细胞及/或培养物中回收E3多肽，由此制备由E3多肽组成的酶。

另外，导入了E3多核苷酸的重组细胞的培养、用于培养的培养基、及E3多肽的分离·纯化可以按照与上述“使用含有E1多核苷酸的重组细胞制备由E1多肽组成的酶”中相同的方式和条件进行。

E1～E3多核苷酸

本发明的第4制备方法中，使用E1～E3多核苷酸中的至少1种多核苷酸。上述多核苷酸已分别在上述A-2.、B-2.及C-2.部分进行了说明。

D-I-8.通过第4制备方法制备的含有二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的产物

本发明提供一种通过第4制备方法制备的含有二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的产物。

如上所述，使用本发明的第4制备方法，根据第4～6步骤的各种组合，可以制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚。

因此，由本发明的第4制备方法制备的产物中含有二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚。

另外，本发明的产物可以以通过第4制备方法得到的溶液形式使用，也可以为从该溶液中粗纯化或纯化的二氢黄豆苷元产物、四氢黄豆苷元产物及/或雌马酚产物的形式使用。

D-II-1.具有第1反应槽～第3反应槽中至少一种反应槽的二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的制备装置

本发明提供一种具有以下第1反应槽～第3反应槽中至少一种反应槽的二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的制备装置(以下也记为“第1制备装置”)。

(第1反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有由(Aa)～(Ac)中任一种多肽(即E1多肽)组成的酶(以下也将该工具记为“反应装置1”)，该反应槽用于使用上述多肽由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，其中，上述反应装置被配置在能够与反应槽内的黄豆苷元接触的位置；

(第2反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有由(Ba)～(Bc)中任一种多肽(即E2多肽)组成的酶(以下也将该工具记为“反应装置2”)，该反应槽用于使用上述多肽由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，其中，上述反应装置被配置在能够与反应槽内的二氢黄豆苷元接触的位置；

(第3反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有由(Ca)～(Cc)中任一种多肽(即E3多肽)组成的酶(以下也将该工具记为“反应装置3”)，该反应槽用于使用上述多肽由四氢黄豆苷元制备雌马酚，其中，上述反应装置被配置在能够与反应槽内的四氢黄豆苷元接触的位置；

使用本发明的第1制备装置，根据第1反应槽～第3反应槽的各种组合，可以制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚。

本发明的第1制备装置具有第1反应槽、第2反应槽及第3反应槽中的至少一个反应槽。

例如，本发明的第1制备装置含有第1反应槽而不具有第2反应槽及第3反应槽时，通过使用本发明的第1制备装置可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元。

例如，本发明的第1制备装置具有第2反应槽而不具有第1反应槽及第3反应槽时，通过使用本发明的第1制备装置可以由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元。

例如，本发明的第1制备装置具有第3反应槽而不具有第1反应槽及第2反应槽时，通过使用本发明的第1制备装置可以由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

另外，例如本发明的第1制备装置具有第1反应槽及第2反应槽两个反应槽而不具有第3反应槽时，通过使用本发明的第1制备装置可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元。

另外，例如本发明的第1制备装置具有第2反应槽及第3反应槽两个反应槽而不具有第1反应槽时，通过使用本发明的第1制备装置可以由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

另外，例如本发明的第1制备装置具有第1反应槽～第3反应槽三个反应槽时，通过使用本发明的第1制备装置，可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

另外，本发明的第1制备装置中，反应装置1～3中的至少两个装置可以共同存在于一个反应槽内。

例如，反应装置1及2共同存在于一个反应槽内时，分别在第1反应槽及第2反应槽进行的各反应可以在一个反应槽内进行。另外，例如反应装置1～3共同存在于一个反应槽内时，分别在第1反应槽～第3反应槽发生的各反应可以在一个反应槽内进行。

对于上述反应装置在反应槽内的配置方式没有限定，只要在反应槽内能发挥所期望的效果即可。

另外，本发明的第1制备装置中，上述制备装置具有反应装置1～3中的至少两个装置并具有不同的多个反应槽时，上述反应槽通过供给装置连接。

例如，本发明的第1制备装置具有第1反应槽及第2反应槽而不具有第3反应槽，且第1反应槽及第2反应槽彼此独立，第1反应槽内配置反应装置1，第2反应槽内配置反应装置2时，为了将第1反应槽中生成的含有二氢黄豆苷元的产物供给至第2反应槽内，将上述第1反应槽及第2反应槽通过供给装置相连接。

另外，例如本发明的第1制备装置具有存在于一个反应槽的反应装置1及2，及存在于另一个反应槽内的反应装置3时，为了将在配置有反应装置1及2的反应槽内生成的产物供给至配置有反应装置3的反应槽内，将配置有反应装置1及2的反应槽和配置有反应装置3的反应槽通过供给装置相连接。

此处，产物可以为所得的溶液的形式存在，也可以为通过粗纯化或纯化溶液得到的二氢黄豆苷元等产物形式存在。

反应槽

对于本发明的第1制备装置中使用的第1反应槽～第3反应槽的形状、大小、材料等没有限定，只要每个反应槽含有一个上述反应装置，并且适于制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚即可。

反应装置

对于本发明的第1制备装置中使用的反应装置1～3没有限定，只要每个反应装置都含有被固定的由上述多肽组成的酶，并且适于应用制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚即可。

被固定于各反应装置中的由各多肽组成的酶可以为粗纯化状态或纯化状态。由多肽组成的酶可以通过现有技术固定在反应装置上。

例如，由多肽组成的酶被固定于载体上时，对于该载体没有限定，只要不妨碍由各多肽组成的酶具有的所期望活性的表达即可。例如，上述载体可以为具有下述官能团的载体，所述官能团能与由上述多肽组成的酶通过共价键连接，例如氨基、羧基、羟基等，另外，可以为能通过连接体与由上述多肽组成的酶相连接的载体等。对于载体的形状也没有限定。上述载体、官能团、连接体等可以根据将由多肽组成的酶固定于载体的现有技术进行适当选择。另外，由多肽组成的酶可以通过现有技术固定在载体上。

供给装置

对于本发明的第1制备装置中使用的供给装置没有限定，只要通过该供给装置能使本发明的第1制备装置中使用的不同反应槽相连接，并能在本发明的第1制备装置中制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚即可。上述供给装置可以根据现有技术进行适宜选择。

E1～E3多肽

本发明的第1制备装置中使用的E1～E3多肽与上述E1～E3多肽相同。

在第1反应槽中二氢黄豆苷元的制备

在第1反应槽中，通过使固定于反应装置1上的由E1多肽组成的酶在NADPH及/或NADH的存在下作用于黄豆苷元，使黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元。由E1多肽组成的酶可以与NADPH及/或NADH一同被固定于反应装置上，所述NADPH及/或NADH作为由E1多肽组成的酶的辅酶而发挥作用。第1反应槽中的反应可以按照上述“第1步骤”所述的方法进行。

在第2反应槽中四氢黄豆苷元的制备

在第2反应槽中，通过使固定于反应装置2上的由E2多肽组成的酶在NADPH及/或NADH的存在下作用于二氢黄豆苷元，使二氢黄豆苷元转换为四氢黄豆苷元。由E2多肽组成的酶可以与NADPH及/或NADH一同被固定于反应装置上，所述NADPH及/或NADH作为由E2多肽组成的酶的辅酶而发挥作用。第2反应槽中的反应可以按照上述“第2步骤”所述的方法进行。

在第3反应槽中雌马酚的制备

在第3反应槽中，可以通过使固定于反应装置3上的由E3多肽组成的酶作用于四氢黄豆苷元，使四氢黄豆苷元转换为雌马酚。第3反应槽中的反应可以按照上述“第3步骤”所述的方法进行。

D-II-2.具有第4反应槽～第6反应槽中的至少一种反应槽的二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的制备装置

本发明提供一种具有以下第4反应槽～第6反应槽中的至少一种反应槽的二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的制备装置(以下也记为“第2制备装置”)。

(第4反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有含有(Ad)～(Af)中任一种多核苷酸(即E1多核苷酸)的重组细胞的反应装置(“以下也将其记为反应装置4”)，该反应槽用于使用上述反应装置由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，其中，上述反应装置被配置在能够与反应槽内的黄豆苷元接触的位置；

(第5反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有含有(Bd)～(Bf)中任一种多核苷酸(即E2多核苷酸)的重组细胞的反应装置(“以下也将其记为反应装置5”)，该反应槽用于使用上述反应装置由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，其中，上述反应装置被配置在能够与反应槽内的二氢黄豆苷元接触的位置；

(第6反应槽)该反应槽内具有反应装置，所述反应装置中固定有含有(Cd)～(Cf)中任一种多核苷酸(即E3多核苷酸)的重组细胞(“以下也将其记为反应装置6”)，该反应槽用于使用上述反应装置由四氢黄豆苷元制备雌马酚，其中，上述反应装置被配置在能够与反应槽内的四氢黄豆苷元接触的位置；

使用本发明的第2制备装置，根据第4反应槽～第6反应槽的各种组合，可以制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚。

本发明的第2制备装置具有第4反应槽、第5反应槽及第6反应槽中的至少一个反应槽。

例如，本发明的第2制备装置具有第4反应槽而不具有第5反应槽及第6反应槽时，通过使用本发明的第2制备装置可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元。

例如，本发明的第2制备装置具有第5反应槽而不具有第4反应槽及第6反应槽时，通过使用本发明的第2制备装置可以由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元。

例如，本发明的第2制备装置具有第6反应槽而不具有第4反应槽及第5反应槽时，通过使用本发明的第2制备装置可以由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

另外，例如本发明的第2制备装置具有第4反应槽及第5反应槽两个反应槽而不具有第6反应槽时，通过使用本发明的第2制备装置可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元。

另外，例如本发明的第2制备装置具有第5反应槽及第6反应槽两个反应槽而不具有第4反应槽时，通过使用本发明的第2制备装置可以由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

另外，例如本发明的第2制备装置具有第4反应槽～第6反应槽三个反应槽时，通过使用本发明的第2制备装置可以由黄豆苷元制备二氢黄豆苷元，由二氢黄豆苷元制备四氢黄豆苷元，由四氢黄豆苷元制备雌马酚。

另外，本发明的第2制备装置中，反应装置4～6中的至少两个可以共同存在于一个反应槽。

例如，反应装置4及5共同存在于一个反应槽内时，在第4反应槽及第5反应槽中进行的各反应可以在一个反应槽内进行。另外，例如反应装置4～6共同存在于一个反应槽时，在上述第4反应槽～第6反应槽中进行的各反应可以在一个反应槽内进行。

另外，本发明的第2制备装置中，上述制备装置具有反应装置4～6中的至少两个装置并具有不同的多个反应槽时，上述不同的反应槽通过供给装置连接。

例如，本发明的第2制备装置具有第4反应槽及第5反应槽而不具有第6反应槽，且第4反应槽及第5反应槽彼此独立，第4反应槽内配置反应装置4，第5反应槽内配置反应装置5时，为了将第4反应槽中生成的含有二氢黄豆苷元的产物供给至第5反应槽内，将上述第4反应槽及第5反应槽通过供给装置相连接。

另外，例如本发明的第2制备装置具有存在于一个反应槽的反应装置4及5，及存在于另一个反应槽内的反应装置6时，为了将在配置有反应装置4及5的反应槽内生成的产物供给至配置有反应装置6的反应槽内，将配置有反应装置4及5的反应槽和配置有反应装置6的反应槽通过供给装置相连接。

此处，产物可以为所得的溶液的形式存在，也可以为通过粗纯化或纯化溶液得到二氢黄豆苷元等产物形式存在。

反应槽

对于本发明的第2制备装置中使用的第4反应槽～第6反应槽的形状、大小、材料等没有限定，只要每个反应槽具有一个上述反应装置，并且适于制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚即可。

反应装置

对于本发明的第2制备装置中使用的反应装置4～6没有限定，只要每个反应装置都具有被固定的重组细胞，并且适于制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚即可。

对于重组细胞在反应装置上的固定没有限制，只要不妨碍各重组细胞具有的所期望活性的表达即可，可以按照现有技术进行实施。另外，重组细胞在反应装置上处于能培养或者被培养的状态。此处适用的重组细胞的培养条件，可以根据上述“第4步骤”、“第5步骤”及“第6步骤”等的记载分别进行设定。

供给装置

对于本发明的第2制备装置中使用的供给装置没有限定，只要通过该供给装置能使本发明的第2制备装置中使用的不同反应槽相连接，并能在本发明的第2制备装置中制备二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚即可。上述供给装置可以根据现有技术进行适宜选择。

重组细胞

本发明的第2制备装置中使用的重组细胞与上述“第4步骤中使用的重组细胞”、“第5步骤中使用的重组细胞”及“第6步骤中使用的重组细胞”等所述的重组细胞相同。

E1～E3多核苷酸

本发明的第2制备装置中使用的E1～E3多核苷酸与上述的E1～E3多核苷酸相同。

在第4反应槽中二氢黄豆苷元的制备

在第4反应槽中，使用固定于反应装置4上的含有E1多核苷酸的重组细胞，将黄豆苷元转换为二氢黄豆苷元。第4反应槽中的反应可以按照上述“第4步骤”等所述的方法进行。

在第5反应槽中四氢黄豆苷元的制备

在第5反应槽中，使用固定于反应装置5上的含有E2多核苷酸的重组细胞，将二氢黄豆苷元转换为四氢黄豆苷元。第5反应槽中的反应可以按照上述“第5步骤”等所述的方法进行。

在第6反应槽中雌马酚的制备

在第6反应槽中，使用固定于反应装置6上的含有E3多核苷酸的重组细胞，将四氢黄豆苷元转换为雌马酚。第6反应槽中的反应可以按照上述“第6步骤”等所述的方法进行。

D-II-3.具有第1反应槽～第3反应槽中的至少一个反应槽及第 4反应槽～第6反应槽中的至少一个反应槽的二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的制备装置

本发明提供一种具有上述第1反应槽～第3反应槽中的至少一个反应槽及第4反应槽～第6反应槽中的至少一个反应槽的二氢黄豆苷元、四氢黄豆苷元及/或雌马酚的制备装置(以下也记为“第3制备装置”)。

第3制备装置中的各反应槽、各反应装置的组合与上述第1及第2制备装置相同。另外，第3制备装置中使用的反应槽、反应装置、多核苷酸、重组细胞及各反应槽中的反应也与上述第1及第2制备装置相同。

实施例

实施例A

参考例A1

将乳球菌20-92株(FERM BP-10036号)接种于含有黄豆苷元的扩增用液体培养基中(含有10μg/mL黄豆苷元的改良GAM肉汤培养基(日水制药株式会社))，在厌氧条件下(使用BBL Gas Pack systems)，在37℃下适当培养7～18小时。培养后，通过离心分离收集细胞，并冷冻保存，在以下实施例中使用。

实施例A1 在细胞破碎物的离心上清液中二氢黄豆苷元生物合成活性存在的确证、及NADPH依存性的确证

将保存的冷冻细胞(67mL，2瓶)解冻后，在8000rpm，4℃下离心分离10分钟，沉淀物用于以下试验。将沉淀物悬浊于含有1mMPMSF(和光纯药工业株式会社)、2mM DTT(和光纯药工业株式会社)及5mM连二亚硫酸钠(和光纯药工业株式会社)的2mL 0.1M磷酸钾溶液中。将悬浊液移入事先装有0.1mm氧化锆/硅珠(BioSpecProducts，Inc.)的两支2ml螺旋盖试管(Assist Corporation)中，使用FastPrep(注册商标)FP 100A(Thermo ELECTRON CORPORATION)破碎细胞(6500rpm，10秒，冰冷，8次)，得到细胞破碎液。将所得到的细胞破碎液在4℃下以约10,000rpm离心10分钟得到离心上清液，用含有1mM PMSF、2mM DTT及5mM连二亚硫酸钠的0.1M磷酸钾溶液将离心上清液稀释至4.5mL，将其作为酶源。

调制下述组成的酶反应液，在37℃下温育2小时。温育后，将3mL乙酸乙酯加入所得的酶反应产物中进行提取处理，干燥后，使用HPLC进行分析。使用黄豆苷元(Funakoshi Corporation)、雌马酚(Funakoshi Corporation)、二氢黄豆苷元(Toronto Research Chemicals Inc.)的混合溶液(各2μg/mL)作为HPLC分析的标准溶液。

酶反应液组成

结果如图1所示。上述结果确证了细胞破碎物的离心上清液中存在二氢黄豆苷元生物合成活性。另外还确证了由黄豆苷元向二氢黄豆苷元的转换反应依存于辅酶NADPH。

实施例A2 二氢黄豆苷元合成酶的纯化

将乳球菌20-92株细胞在改良GAM肉汤培养基(日水制药株式会社)中培养18小时，每培养瓶中67ml，将9瓶上述乳球菌20-92株细胞离心后，使其悬浊于含有2mM DTT(1，4-二硫苏糖醇；Merck)、5mM连二亚硫酸钠(和光纯药工业株式会社)及蛋白酶抑制剂(complete proteinase inhibitor cocktail EDTA-free；Roche Diagnostics)的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7)中。将悬浊液移入事先装有0.1mm氧化锆/硅珠(BioSpec Products，Inc.)的三支2ml螺旋盖试管(AssistCorporation)中，使用FastPrep(注册商标)FP 100A(Thermo ELECTRONCORPORATION)破碎细胞(6500rpm，20秒，4次)，离心破碎液得到上清液。另外，将乳球菌20-92株细胞在相同液体培养基中培养18小时，每培养瓶中200ml，将8瓶上述乳球菌20-92株细胞离心后得到8瓶上清液。

使用含有1mM PMSF(苯甲基磺酰氟；Sigma Aldrich)、2mM DTT及5mM连二亚硫酸钠的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7)(以下记为“Buffer A”)进行纯化。将所得的细胞破碎上清液与含有等量2M硫酸铵的Buffer A混合，并将其加入用Butyl Sepharose 4Fast Flow(每瓶约有凝胶0.3ml；GE HEALTHCARE)填充的、用含有1M硫酸铵的Buffer A平衡的microbio spin columns(11个；Bio-Red Laboratories，Inc.)中。用含有1M硫酸铵的Buffer A清洗后，再用0.75ml含有0.5M硫酸铵的Buffer A冲洗2次，先后加入0.75ml和0.5ml Buffer A洗脱具有二氢黄豆苷元合成活性的级分。将上述加入0.75ml Buffer A得到的洗脱液记为洗脱液I，上述加入0.5ml Buffer A得到的洗脱液记为洗脱液II。

在0.75ml洗脱液I和0.5ml洗脱液II中分别加入0.3ml和0.2ml的含有3.4M硫酸铵的Buffer A后，混合上述两种洗脱液，将其用于使用TSKgel Ether-5PW柱(东曹株式会社)并使用含有1M硫酸铵的洗脱液进行平衡的HPLC。将0.5ml混合液注入柱中2～9次后，使用含有1M硫酸铵的洗脱液(洗脱液B)在0.1ml/min的流速下进行清洗，然后，使用程序改变洗脱液B和洗脱液A的混合比率为了使硫酸铵(洗脱液A)的浓度在15分钟内线性下降至0M。在0.6M～0.35M硫酸铵的洗脱级分中可见酶活性，得到约3.5ml的总洗脱液。HPLC的条件如下所示。测定280nm处蛋白质的吸收。

柱：TSKgel Ether-5PW

流速：供给样品时为0.05～0.1ml/min，洗脱时为0.1ml/min

洗脱液A：0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7)/2mM DTT/2.5mM连二亚硫酸钠/1％2-丙醇

洗脱液B：含有1M硫酸铵的洗脱液A

使用Buffer A稀释可见酶活性的洗脱级分的洗脱液，将其用于使用Buffer A平衡的用2’5’ADP Sepharose 4B(每瓶约有凝胶0.3ml；GE HEALTHCARE)填充的micro bio spin columns。使用Buffer A清洗柱后，先后用0.7ml和0.6ml含有20mM NADPH的pH 7.5的Buffer A组成液洗脱具有二氢黄豆苷元合成活性的级分。

将所得洗脱液用于使用以pH 7.5的洗脱液C平衡的Mono Q柱(GE HEALTHCARE)的HPLC。以0.1ml/min的流速将洗脱液C送至柱内，清洗后使用程序改变洗脱液C和洗脱液D的混合比率为了使NaCl的浓度在32.5分钟内线性变为0.65M。HPLC的条件如下所示。测定280nm处蛋白质的吸收。

柱：Mono Q PC 1.6/5

洗脱液C：0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.5)/3mM DTT/2.5mM连二亚硫酸钠/1％2-丙醇

洗脱液D：含有1M NaCl的洗脱液C

在0.4～0.46M NaCl级分(级分No.28～30)中可见酶活性。

所得到的Mono Q HPLC的结果和酶活性示于图2。另外，图3表示在还原条件下级分No.27～31的SDS-PAGE结果。结果显示具有二氢黄豆苷元合成活性的级分在还原条件下存在70kDa的条带。

实施例A3 N末端氨基酸序列的确定

将30μl0.1％三氟乙酸(TFA)加入使用Mono Q HPLC得到的具有二氢黄豆苷元合成活性的70μl的级分No.29中，使总体积为100μl。

使用10μl甲醇润湿ProSorb柱体(Biosystems Japan)的PVDF膜，然后加入上述混合液。使用ProSorb过滤器(Biosystems Japan)吸水后，使膜干燥，使用膜用打孔器(Biosystems Japan)对膜进行剪切。用20％甲醇清洗上述膜5次，使其干燥。使用蛋白质序列分析仪(Biosystems，Procise 494cLC)对上述膜进行N末端氨基酸序列分析，得到如下所示的含有22个残基的连续氨基酸序列。

Met Lys Asn Lys Phe Tyr Pro Lys Thr Phe Glu Arg Gly Tyr Ile GlyAsn Leu Glu Val Glu Asn(序列号19)

实施例A4 内部氨基酸序列的确定

使用消化酶将具有二氢黄豆苷元合成活性的酶蛋白质片段化，使其成为肽。通过分析肽的N末端氨基酸序列而获得内部氨基酸序列的信息。

(1)样品的制备

将乳球菌20-92株细胞在改良GAM肉汤培养基(日水制药株式会社)中培养18小时，每培养瓶中200ml，将3瓶上述乳球菌20-92株细胞离心后，使其悬浊于含有2mM DTT(1，4-二硫苏糖醇；Merck)、5mM连二亚硫酸钠(和光纯药工业株式会社)及蛋白酶抑制剂(complete proteinase inhibitor cocktail EDTA-free；Roche Diagnostics)的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7)中。将悬浊液移入事先装有0.1mm氧化锆/硅珠(BioSpec Products，Inc.)的三支2ml螺旋盖试管(AssistCorporation)中，使用FastPrep(注册商标)FP 100A(Thermo ELECTRONCORPORATION)破碎细胞(6500rpm，20秒，4次)，离心破碎液得到上清液。

以后的操作中使用含有1mM PMSF(苯甲基磺酰氟；SigmaAldrich)、2mM DTT及5mM连二亚硫酸钠的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7)(以下记为“Buffer A”)。将所得的细胞破碎上清液与含有等量2M硫酸铵的Buffer A混合，并将其加入用Butyl Sepharose 4 FastFlow(每瓶约有凝胶0.3ml；GE HEALTHCARE)填充的、用含有1M硫酸铵的Buffer A平衡的micro bio spin columns(3个；Bio-RedLaboratories，Inc.)中。用含有1M硫酸铵的Buffer A清洗后，再用0.75ml含有0.5M硫酸铵的Buffer A冲洗2次，先后两次加入0.75ml的Buffer A以洗脱具有二氢黄豆苷元合成活性的级分。

使用Buffer A平衡以2’5’ADP Sepharose 4B充填的一个micro biospin columns，加入1.5ml之前洗脱的溶液。用0.75ml的Buffer A清洗5次后，先后用0.75ml和0.45ml含有20mM NADPH的Buffer A洗脱。混合洗脱液，使用微量离心浓缩管(NANOSEP 10K OMEGA、Pall Life Sciences)脱盐浓缩至5μl。

将浓缩液与含有2-巯基乙醇的2倍浓度的SDS-PAGE用样品缓冲液混合，在90℃下加热处理7分钟后，按照Laemmuli法进行SDS-PAGE。电泳凝胶板使用SuperSep HG 10-20％(和光纯药工业株式会社)。使用Colloidal Blue(Invitrogen)染色，用Milli-Q水脱色后，切除约70kDa处的电泳条带。从无蛋白质电泳的区域切除相同分子量位置及大小的凝胶片作为对照，之后以同样的方式处理。需要说明的是，使用同样操作处理另一组细胞，并且在SDS-PAGE后将上述细胞转染至PVDF膜上，然后使用相同位置的条带进行N末端氨基酸序列分析以确证与Mono Q HPLC级分No.29序列的一致性。

(2)还原酰胺甲基化与酶消化

将切除的凝胶片切成碎片，使用50％乙腈水溶液脱色后用乙腈脱水，使用离心浓缩机(SpeedVac A160、Savant)干燥。加入含有55mMDTT的100mM碳酸氢氨水溶液，在56℃下还原1小时。除去DTT溶液，加入含有100mM碘乙酰胺的100mM碳酸氢氨水溶液，在避光条件下，室温下轻微震摇30分钟进行酰胺甲基化处理。除去反应试剂后，依次使用50％乙腈水溶液、乙腈、100mM碳酸氢氨水溶液及乙腈进行清洗，使用离心浓缩机干燥凝胶。加入含有2μg无色杆菌蛋白酶I(和光纯药工业株式会社)和0.02％Tween 20的20mM Tris盐酸缓冲液(pH 9)，在37℃下消化7小时。将离心上清液移至其他管中，在凝胶中加入60％乙腈-0.1％TFA水溶液并在30℃下加热20分钟，然后进行3次boltex操作，每次10分钟，以获得肽片段。使用Ultrafree-MC(0.22μm、Amicon)过滤收集的上清液，然后离心浓缩。

(3)肽作图

使用反相HPLC，分离酶消化后的肽。

柱：μRPC C2/C 18SC2.1/10(GE Healthcare Bio Science)

流速：0.1ml/min

洗脱液E：0.05％TFA

洗脱液F：90％乙腈/0.04％TFA

洗脱程序：0分钟5％F

3分钟5％F

43分钟65％F

48分钟100％F

68分钟100％F

级分：30μl

检测波长：215nm

需要说明的是，例如上述“0分钟5％F”表示洗脱0小时时使用含有95％洗脱液E和5％洗脱液F的洗脱液。

(4)内部氨基酸序列分析

通过与对照的色谱图相比较，挑选出具有二氢黄豆苷元合成活性的来源于酶蛋白质的肽峰，使用蛋白质序列分析仪(Applied Biosystems，Procise 492HT)进行N末端氨基酸序列分析。使用反相HPLC进行分离开始后，从20.6分钟开始洗脱，洗脱峰的氨基酸序列(以下记为Peptide1)如下所示。

PheAspGluProValTyrProGlnAlaGlu(序列号20)

从22.1分钟开始洗脱，洗脱峰的氨基酸序列(以下记为Peptide2)如下所示。

AlaSerArgMetValMetAspAlaValHisGluGlyTyrIleAlaGly(序列号21)

从26.6分钟开始洗脱的洗脱峰为被非特异性切断的肽，如下所示，上述肽为将上述酶蛋白质N末端第13个残基的甘氨酸作为N末端的肽(以下氨基酸序列记为Peptide3)。

GlyTyrIleGlyAsnLeuGluValGluAsnArgAlaIleArgMetProMet(序列号22)

图4表示在实施例A4中肽作图的结果及与各峰相对应的肽的氨基酸序列。

峰1(20.6分钟)

峰2(22.1分钟)

峰3(26.6分钟)

实施例A5 二氢黄豆苷元合成酶基因从纯化多肽的N末端及部分氨基酸序列的扩增

基于上述实施例A3及A4中得到的N末端及部分氨基酸序列设计并制备兼并引物(degenerative-primer)，以乳球菌20-92株的基因组DNA为模板，通过进行兼并PCR(degenerative-PCR)尝试进行编码二氢黄豆苷元合成酶的基因的扩增。

(1)对来自于乳球菌20-92株的基因组DNA的纯化

将使用40mL改良GAM肉汤培养基(日水制药株式会社)厌氧培养的乳球菌20-92株在4℃下以5000rpm离心10分钟，倾析除去培养基，收集细菌细胞。立即使收集的细胞悬浊于QIAGEN GenomicDNA Buffer Set(Qiagen)的11mLB1溶液(含有200μg/mL RNase)中，然后加入300μL溶菌酶溶液(100mg/mL)和500μL QIAGEN蛋白酶K溶液(Qiagen)，在37℃下培养16小时。然后，加入4mLB2溶液，多次倒置混合后，在50℃下培养3小时。

然后，在4℃下以5000rpm离心10分钟，将其上清液注入使用QBT溶液平衡的QIAGEN Genomic-tip 500/G(Qiagen)柱中，使基因组DNA吸附于柱上。用30mL的QC溶液清洗2次柱后，使用15mLQF从柱上洗脱基因组DNA，加入10.5mL异丙醇盐析DNA。将析出的线状基因组DNA加入1.5mL容量微管中，用75％乙醇清洗，风干后，用250μLTE溶液(0.4μg/μL)溶解。测定通过上述操作得到的基因组DNA溶液的浓度后，用TE溶液调制至40ng/μL，作为PCR的模板使用。

(2)兼并引物的设计、制备

在兼并引物的设计中为了减少简并数，5’端的序列基于格氏乳球菌的密码子使用信息(Codon Usage Database http://www.kazusa.or.jp/codon/)，采用在各氨基酸中表达频度最高的密码子。3’端通过使用混合碱基以避免发生与二氢黄豆苷元合成酶基因的错配。

基于实施例A3中确定的N末端序列：MKNKFYPKTFERGYIGNLEVEN，设计并制备以下兼并引物，将其用于兼并PCR。

E1-N-terminal-31：

TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGA(序列号23)

(序列号23中，在第11及14位的“N”表示肌苷，第20及26位的“N”表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。)

E1-N-terminal-37：

TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGARRGNGG(序列号24)

(序列号24中，第11、14、20及26位的“N”表示肌苷，第35位的“N”表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。)

E1-N-terminal-F32：

ATGAAGAATAAGTTTTAYCCNAARACNTTYGA(序列号25)

(序列号25中，第21及27位的“N”表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。)

另外，基于实施例A4中确定的内部序列肽2：ASRMVMDAVHEGYIAG设计并制备以下兼并引物，将其用于兼并PCR。

E1-internal-RP1：

CCTGCAATATAACCTTCATGTACNGCRTCCATNACCAT(序列号26)

(序列号26中，第24及33位的“N”表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。)

需要说明的是，本实施例中作为引物使用的寡核苷酸寡DNA全部由Sigma-Aldrich Japan制备。

(3)利用兼并PCR的二氢黄豆苷元合成酶基因的扩增

使用上述兼并引物，尝试通过兼并PCR扩增二氢黄豆苷元合成酶基因。

用于兼并PCR的兼并引物的组合如下所示。

[1]E1-N-terminal-31和E1-internal-RP1

[2]E1-N-terminal-37和E1-internal-RP1

[3]E1-N-terminal-F32和E1-internal-RP1

利用兼并PCR的二氢黄豆苷元合成酶基因的扩增使用Ex-TaqDNA聚合酶(Takara Bio Inc.)，扩增程序为：

95℃2min，(95℃45sec，38℃-54℃30sec，72℃2min)×50个周期，72℃3min。考虑到与兼并引物的基因组DNA的错配，退火通过5个阶段进行，即从38℃开始在每个阶段增加4℃直到54℃为止。PCR反应结束后，将1/10量的10×Dye加入PCR产物中，使用0.8％的琼脂糖凝胶对6μL产物进行电泳。在本实施例中的琼脂糖电泳中，使用溴化乙锭进行染色，使用λ/StyI(Nippongene Co.Ltd.)、100bpladder(Toyobo Co.Ltd.)作为分子量标准参照物。

兼并PCR产物的电泳结果示于图5。结果确证了本实施例内(3)中所示的[3]兼并引物的组合(E1-N-terminal-F32和E1-internal-RP1)在任何退火温度下都扩增了约1.9kb的DNA片段。其中扩增最多的退火温度为54℃。

(4)扩增的DNA片段的碱基序列的确定

将扩增的约1.9kb的DNA片段(退火温度为54℃)从琼脂糖凝胶上切除，使用凝胶回收试剂盒(Gel-Extraction kit)(Qiagen)进行纯化。将纯化的DNA片段插入pT7-Blue克隆载体(Novagen)中，确定碱基序列。

使用DNA序列拼接软件(DNA sequence assemble software)SEQUENCHER(Gene CodesInc，USA)对所得的DNA碱基序列进行分析。结果显示DNA片段包含与实施例A4确定的肽1及3的氨基酸序列相对应的碱基序列。

实施例A6 二氢黄豆苷元合成酶基因的全碱基序列的确定

为了确定实施例A5中得到的1.9kb二氢黄豆苷元合成酶基因的5’端及3’端的序列由此来确定全碱基序列，以乳球菌20-92株的基因组DNA文库为模板进行cDNA末端序列的快速扩增(5’、3’-RACE(cDNA末端的快速扩增)。

(1)基因组DNA文库的制备

使用限制酶(BamHI，EcoRI，HindIII，KpnI，PstI，SacI，SalI，Sau3AI，XhoI)(均为Takara Bio Inc.的产品)将实施例A5中纯化的乳球菌20-92株的基因组DNA在37℃下消化16小时，由此将其片段化，用苯酚·氯仿处理后，使用乙醇沉淀进行纯化。通过使用TaKaRa连接试剂盒var.2.1(Takara Bio Inc.)将纯化的基因组DNA片段与pUC19克隆载体连接，以制备基因组DNA文库，其中所述pUC19克隆载体事先已被相对应的限制酶切断，并被虾碱性磷酸酶(Shrimp AlkalinePhosphatase)(Takara Bio Inc.)处理进行了脱磷酸化。

(2)cDNA末端序列的快速扩增(5’-RACE、3’-RACE)

使用灭菌水将基因组DNA文库(连接反应液)稀释20倍，使用其中1μL作为模板，尝试通过使cDNA末端序列快速扩增(5’-RACE、3’-RACE)来扩增二氢黄豆苷元合成酶基因的5’端及3’端的序列。

(2-1)使用引物

5’-RACE、3’-RACE中分别使用的引物组合如下所示。

(2-1-1)5’-RACE

First-PCR：E1-RACE-N-P1和pUC19-FP-1、E1-RACE-N-P1和pUC19-RP-1

Nested-PCR：E1-RACE-N-P2和pUC19-FP-2、E1-RACE-N-P2和pUC19-RP-2

(2-1-2)3’-RACE

First-PCR：E1-RACE-RP2-1和pUC19-FP-1、E1-RACE-RP2-1和pUC 19-RP-1

Nested-PCR：E1-RACE-RP2-2和pUC19-FP-2、E1-RACE-RP2-2和pUC19-RP-2

(2-1-3)使用引物的序列

5’-RACE、3’-RACE中分别使用的引物序列如下所示。

载体侧引物：

pUC19-FP-1：

ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG(序列号27)

pUC19-RP-1：

AGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGC(序列号28)

pUC19-FP-2：

ATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGG(序列号29)

pUC19-RP-2：

CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG(序列号30)

二氢黄豆苷元合成酶基因侧引物

E1-RACE-N-P1：

ATGCGGATCGCTCGGTTCTCGACCTCTAGGTTAC(序列号31)

E1-RACE-RP2-1：

ATCGAGGAGAAGTGCGAGGACGTCAGGGTCATC(序列号32)

E1-RACE-N-P2：

TTCTCGACCTCTAGGTTACCGATGTAGCCGC(序列号33)

E1-RACE-RP2-2：

ACGTCAGGGTCATCGGCATCGGCGACTGCAAG(序列号34)

需要说明的是，本实施例中作为引物使用的寡DNA全部由Sigma-Aldrich Japan制备。

(2-2)使用5’-RACE及3’-RACE的二氢黄豆苷元合成酶基因 5’端及3’端序列的扩增

在5’-RACE、3’-RACE上使用Ex-Taq DNA聚合酶(TakaraBio Inc.)，使用相同的扩增程序进行First-PCR及Nested-PCR：

95℃2min，(95℃45sec，60℃30sec，72℃1min)×30个周期，72℃3min。First-PCR中，使用按照上述调制方法制备的基因组DNA稀释液1μL(40ng)作为模板，Nested-PCR中使用0.5μLFirst-PCR的产物。

Nested-PCR反应结束后，将1/10量的10×day加入PCR产物中，使用0.8％的琼脂糖凝胶对5μL混合物进行电泳，在5’-RACE观察到约1.2kb(SacI)和约1.0kb(Sau3AI)的DNA片段的扩增，在3’-RACE观察到约0.6kb(SacI)和0.3kb(KpnI)的DNA片段的扩增。

在本实施例中的琼脂糖电泳中，使用溴化乙锭(Nippongene Co.Ltd.)进行染色，使用λ/StyI(Nippongene Co.Ltd.)、100bp ladder(Toyobo Co.Ltd.)作为分子量标准参照物。

将扩增的DNA片段从琼脂糖凝胶上切除，使用凝胶回收试剂盒(Qiagen)进行纯化。通过在扩增中所使引物的直接序列，确定纯化DNA片段的碱基序列。结果显示，二氢黄豆苷元合成酶基因的序列出现在5’-RACE的上述约1.2kb(SacI)和约1.0kb(Sau3AI)的DNA片段中以及3’-RACE的约0.6kb(SacI)的DNA片段中。

(3)二氢黄豆苷元合成酶基因全碱基序列的确定

使用DNA序列拼接软件SEQUENCHER(Gene CodesInc，USA)对DNA碱基序列进行拼接分析，所述DNA碱基序列由实施例A5中所示的兼并PCR及本实施例(2)中的cDNA末端序列的快速扩增得到。结果，确定了在二氢黄豆苷元合成酶基因附近的3548bp的基因组结构，表明二氢黄豆苷元合成酶基因是由1935个核苷酸和由644个氨基酸组成的多肽。

将由碱基序列确定的全氨基酸序列和由氨基酸序列明确的部分氨基酸序列相核对，结果表明，所有由氨基酸序列明确的部分氨基酸序列都归属于由碱基序列确定的全氨基酸序列。

(4)编码区域的碱基序列的确证

在本实施例的(3)中得到的序列中，观察到克隆之间存在较多碱基不一致的部位，这是在使用PCR扩增时由DNA聚合酶碱基参入错误引起的。因此，使用First strand cDNA作为模板，通过使用PCR扩增含有二氢黄豆苷元合成酶基因编码区域的区域(2368bp)，所述PCR使用了作为High-FidelityDNA-聚合酶的Easy-A(R)-High-Fidelity PCR克隆酶(Stratagene)。

使用的扩增引物如下所示。

E1-conf-NP：

TGCCGGTGCAATGGCTGACATCATGTTCAACCTG(序列号35)

E1-conf-CP：

TCCTCCATCGTTCCTCCAATCAGTAAGACACGCG(序列号36)

使用凝胶回收试剂盒(Qiagen)对得到的DNA片段进行纯化，并使用直接序列进行序列的确证、最终确定。

实施例A7 通过在扩增培养液中添加黄豆苷元进行二氧黄豆苷元合成酶基因的表达诱导

如实施例A1所述，在乳球菌20-92株的扩增用培养液中加入作为底物的黄豆苷元时，所培养细胞具有二氢黄豆苷元合成活性。由此推测通过在扩增培养液中加入黄豆苷元可诱导二氢黄豆苷元合成酶基因的转录，进而诱导翻译成蛋白质。因此以上述假设为基础进行下述实验。制备分别在添加有黄豆苷元的培养基及未添加黄豆苷元的培养基中培养的来源于乳球菌20-92株细胞的cDNA，通过进行RT-PCR研究扩增培养液中黄豆苷元的添加是否诱导了二氢黄豆苷元合成酶基因的表达。

(1)对来自于乳球菌20-92株的全RNA的提取、纯化

对来自于乳球菌20-92株的全RNA的提取、纯化按照以下方法进行。

在37℃下，将在4℃下密封保存的乳球菌20-92株在含有10mg/L黄豆苷元(Funakoshi Co.，Ltd.)或不含黄豆苷元的改良GAM肉汤培养基中厌氧培养8小时，然后将25mL培养液移入50mL容量的管中，在4℃下以3500rpm离心10分钟，倾析除去培养基，收集细胞。立即用液氮对所收集的细胞进行冷冻，然后按照说明书使用1mL TRIzol溶液(Invitrogen)对全RNA进行提取、纯化。纯化的全RNA通过进行DNase I(Invitrogen)处理除去混入的基因组DNA，并将其用于first-strand cDNA的合成。

(2)来自全RNA的first-strand cDNA合成

由2μg经过DNase I处理的全RNA，通过使用用于RT-PCR(Invitrogen)的SuperScript(注册商标)First-Strand合成系统合成first-strand cDNA(逆转录产物)。按照说明书，使用附带的RandomHexamer mix作为用于DNA合成的延伸引物，进行first-strand cDNA的合成。另外，为了确证用于合成first-strand cDNA的已被DNase I处理的全RNA没有混入基因组DNA，也同时进行未进行逆转录的反应。使用最终的反应液作为RT-PCR的模板。

上述配制的最终反应液为以下4种。

1.全RNA的逆转录产物，所述全RNA来自由添加有黄豆苷元的培养基培养的细菌细胞(DZN(+)RT(+))

2.全RNA的逆转录产物，所述全RNA来自由未添加黄豆苷元的培养基培养的细菌细胞(DZN(-)RT(+))

3.全RNA的无逆转录产物，所述全RNA来自由添加有黄豆苷元的培养基培养的细菌细胞(DZN(+)RT(-))

4.全RNA的无逆转录产物，所述全RNA来自由未添加黄豆苷元的培养基培养的细菌细胞(DZN(-)RT(-))

(3)使用RT-PCR的二氢黄豆苷元合成酶基因表达的确证

通过以本实施例的(2)中所示的4种最终反应物为模板进行RT-PCR来扩增二氢黄豆苷元合成酶基因，比较彼此之间的表达量。作为对照，使用16S-核糖体RNA序列作为对照基因同时进行另一个RT-PCR。

RT-PCR的扩增条件及用于各自基因扩增的引物序列如下所示。

RT-PCR中使用Ex-Taq DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)，扩增程序为：

95℃2min，(95℃30sec，56℃20sec，72℃30sec)×30个周期，72℃2min。使用1μL本实施例的(2)中的最终反应液作为模板。

用于本实施例的RT-PCR的引物序列及扩增的DNA片段的尺寸如下所示。

二氢黄豆苷元合成酶：239bp

E1-FP：CTACATCGGTAACCTAGAGGTCG(序列号37)

E1-RP：CCGTGCTGCTTGATGGTCTTTGC(序列号38)

16S-核糖体RNA序列：326bp

Gar-16S-Ribo-FP：TGCGTAGATATATGGAGGAAC(序列号39)

Gar-16S-Ribo-RP：CTTATCTCTAAGGATAGCACG(序列号40)

需要说明的是，用于16S-核糖体RNA序列扩增的引物是基于美国生物工学信息中心(National Center of Biotechnology Information：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的碱基序列数据库(GenBank)内的格氏乳球菌菌株FLG1216S核糖体RNA基因、部分序列(AccesionNo.AF352163-66)的序列进行制备的。

将1/10量的10×day加入到PCR产物中，使用1.5％的琼脂糖凝胶对5μL混合物进行电泳，观察到每个基因均扩增。

在本实施例的琼脂糖电泳中，使用溴化乙锭(Nippongene Co.Ltd.)进行染色，使用λ/StyI(Nippongene Co.Ltd.)、100bp ladder(Toyobo Co.Ltd.)作为分子量标准参照物。

结果示于图6。

由使用RT-PCR的二氢黄豆苷元合成酶基因的扩增结果可知，上述基因的有效表达仅在全RNA的逆转录产物中被观察到，所述全RNA来自由添加有黄豆苷元的培养基培养的细菌细胞。作为对照可以观察到扩增的16S-核糖体RNA序列以同等水平表达，与培养基中是否添加黄豆苷元无关。另外，由于逆转录产物中二氢黄豆苷元合成酶基因及16S-核糖体RNA序列两者均未扩增，因此确证了用于合成first-strand cDNA的已被DNase I处理的全RNA中没有混入基因组DNA。以上结果显示，培养基中黄豆苷元的添加诱导了二氢黄豆苷元合成酶基因的mRNA的表达。

实施例A8 使用大肠杆菌的重组E1多肽的表达及其二氢黄豆苷元合成活性的确证

使用pET系统表达E1多肽，并确证其二氢黄豆苷元合成活性，所述pET系统为使用大肠杆菌的重组蛋白质表达系统。

(1)E1 多肽表达载体的制备

为了制备E1多肽表达载体(pET21-E1-His)，通过PCR扩增E1核苷酸可读框区域的DNA。

基于实施例A6确定的E1核苷酸序列制备下述扩增引物。

exp.E1pet F Nde：

AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA(序列号：41)

exp.E1pet His：

AATCGAATTCCTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT(序列号：42)

为了插入到pET21a(Novagen)中，上述扩增引物exp.E1pet F Nde、exp.E1pet His被设计为分别包含限制酶NdeI切割位点和EcoRI切割位点序列。

使用含有下述组成的25μL反应液进行PCR反应，所述反应液组成为：上述引物各5pmol；dNTP各5nmol；实施例A5中纯化的乳球菌20-92株的基因组DNA 40ng；KOD-plus DNA聚合酶用10×缓冲液(Toyobo Co.，Ltd.)2.5μL；KOD-Plus DNA聚合酶0.3U(ToyoboCo.，Ltd.)。扩增程序为：95℃3分钟，(94℃30秒，60℃30秒，68℃2分钟)×30个周期，68℃7分钟。PCR设备：GeneAmpPCR System9700(Applied Biosystems)。使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应液的一部分，结果，检测出所预测的尺寸的条带。使用QIAGEN PCR纯化试剂盒(Qiagen)回收全部PCR产物。

将回收的DNA片段用限制酶NdeI及EcoRI切断后，进行琼脂糖凝胶电泳。然后，切除包含目标条带的部分，用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化、回收。使用DNA连接试剂盒ver.2.1(Takara BioInc.)将所得的DNA片段与用NdeI及EcoRI消化的pET21a在16℃下连接一夜，然后使用连接反应液转化大肠杆菌JM109株(Takara BioInc.)。

在37℃下，将转化体在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基琼脂(GIBCO)板上培养一夜，得到菌落。将所得的单菌落在3mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基(GIBCO)中培养一夜后，使用质粒自动提取机PI-100(KURABO)提取质粒DNA。

使用染料终止法对插入了质粒的DNA碱基序列进行测序，确证了E1核苷酸如期望那样被成功插入，从而得到了pET21-E1-His。使用DNA测序仪ABI3700(Applied Biosystems)对本实施例中的DNA序列进行测定。

(2)在大肠杆菌内重组体的制备和重组E1多肽的表达及确证

使用表达重组E1多肽的质粒pET21-E1-His和pET21a(阴性对照)，转化大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen)。在37℃下，将转化体在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基琼脂板上培养一夜，得到单菌落。

在37℃下，将上述每个大肠杆菌BL21(DE3)转化体在3mL含有50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中培养一夜。然后向0.5mL上述培养液中加入50mL含有相同浓度氨苄青霉素的液体LB培养基，预培养3小时(直到OD在630nm变为约0.4)，加入IPTG(异丙基-p-硫代半乳糖吡喃糖苷；Wako Pure Chemical Industries)使最终浓度为1mM，在37℃培养4小时。

培养结束后，通过使用Avanti HP25(beckman coulter)离心分离(6000rpm 4℃15分钟)细胞以收集细胞。之后的操作在冰上进行。将离心上清液(培养基)除去，使细胞悬浊于1mL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0；KPB-PDH)中，所述磷酸钾缓冲液(pH7.0；KPB-PDH)中含有1mM PMSF、2mM DTT、5mM连二亚硫酸钠，将悬浊液移入2ml辅助管(Assist Corporation)中，所述辅助管中事先装有0.7mL氧化锆/硅珠(BioSpec Products，Inc.)及400μL KPB-PDH，使用FastPrep(R)(Thermo ELECTRON CORPORATION)，将6500rpm处理20秒-冰冷3分钟这一周期重复两次对细胞进行破碎，得到细胞破碎液。

使用SDS-聚丙烯酰胺-凝胶电泳(SDS-PAGE)对大肠杆菌内的重组E1多肽的表达进行确证。

在10μL上述细胞破碎液中加入2.5μL的5×样品缓冲液(125mMTris-HCl(pH6.5)/25％丙三醇/5％SDS/5％2-巯基乙醇/BPB 0.5％)，在98℃下加热变性5分钟后，冰冷悬浊液，使用SDS-PAGE对上述5μL悬浊液进行电泳。使用市售的凝胶板(SuperSep^TM5-20％(和光纯药工业株式会社))进行SDS-PAGE，用Quick CBB(和光纯药工业株式会社)进行染色。使用Prestained XL-Ladder Broad range(AproScience)作为分子量标准参照物。

SDS-PAGE的结果示于图7。结果确证了在来自pET21-E1-His转化体的细胞破碎液中存在分子量约为70kDa的重组E1多肽。

(3)由重组体得到的E1多肽的二氢黄豆苷元合成活性的确证

以本实施例的(2)中得到的细胞破碎液作为酶源测定由黄豆苷元向二氢黄豆苷元转换的转换活性，在表达的重组E1多肽中确证其活性。

本实施例中按照以下方法对由黄豆苷元向二氢黄豆苷元的转换活性进行测定。

制备下述组成的酶反应液，在37℃下温育2小时。

酶反应液组成

温育后，在所得的酶反应液中加入3mL乙酸乙酯进行提取处理，干燥后，用流动相(洗脱液)溶解。使用HPLC分析溶解产物来测定酶反应液中黄豆苷元及二氢黄豆苷元的含量。

HPLC分析的结果示于图8。结果观察到在来自由表达重组E1多肽的质粒pET21-E1-His的转化体的菌破碎液中，加入酶反应液中的黄豆苷元(底物)转换为二氢黄豆苷元，而在作为阴性对照的pET21a转化体中在酶反应液中未检测出二氢黄豆苷元。

以上结果表明，重组E1多肽具有由黄豆苷元合成二氢黄豆苷元的活性。

(实施例B)

参考例B1

顺式-四氢黄豆苷元及反式-四氢黄豆苷元的合成

按照以下流程制备顺式-四氢黄豆苷元及反式-四氢黄豆苷元。需要说明的是，以下关于化合物的表示均使用下述简称。

化合物1(黄豆苷元)：4’，7-二羟基异黄酮

化合物2：4’，7-二乙酰基异黄酮

化合物3：4’，7-二乙酰基异黄烷-4-酮

化合物4：顺式-4’，7-二乙酰基异黄烷-4-酚

化合物5：反式-4’，7-二乙酰基异黄烷-4-酚

化合物6：顺式-四氢黄豆苷元

化合物7：反式-四氢黄豆苷元

化合物2的合成

将0.76mL(8.0mmol)醋酸酐加入含有500mg(1.97mmol)黄豆苷元(化合物1)的吡啶(5mL)溶液中，在60℃下搅拌两小时。在反应液中加入少量甲醇后，加入3N盐酸中。用水稀释后过滤析出的固体，水洗。将所得固体在室温下风干得到609mg(1.80mmol，91％收率)白色粉末状的化合物2。

化合物2：¹HNMR(250MHz，CDCl₃)δ(ppm)：2.33(3H，s)，2.37(3H，s)，7.13-7.22(3H，m)，7.32(1H，d，J＝2.3Hz)，7.54-7.63(2H，m)，8.01(1H，s)，8.33(1H，d，J＝8.8Hz).

化合物3的合成

在氢气氛下室温搅拌甲醇(6mL)-乙酸乙酯(6mL)悬浊液2小时，所述悬浊液中含有400mg(1.18mmol)化合物2及150mg 10％披钯碳(含水物，约50wt％)。使用硅藻土过滤反应液，用乙酸乙酯清洗残渣。使用硅胶柱色谱法(硅胶：二氯甲烷/乙酸乙酯＝100/0-19/1)对由浓缩滤液所得的残渣进行纯化，得到312mg(0.917mmol，78％收率)白色粉末状的化合物3。

化合物3：¹H NMR(250MHz，CDCl₃)δ(ppm)：2.29(3H，s)，2.32(3H，s)，3.93-4.04(1H，m)，4.60-4.75(2H，m)，6.76-6.84(2H，m)，7.04-7.13(2H，m)，7.27-7.35(2H，m)，7.93-8.01(1H，m).

化合物4及化合物5的合成

在0℃下，在含有100mg(0.294mmol)化合物3的甲醇(1mL)-二氯甲烷(1mL)溶液中加入11mg(0.29mmol)硼氢化钠，在0℃下搅拌30分钟。依次将2mL 1N盐酸、50mL水加入反应液中，用乙酸乙酯进行提取。依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水对有机层进行清洗，用无水硫酸钠进行干燥。使用硅胶柱色谱法(硅胶：二氯甲烷/乙酸乙酯＝19/1-3/1)对蒸馏除去溶剂得到的残渣进行纯化。使用中压柱层析法(Yamazen，Ultra Pack SI-40B：正己烷/乙酸乙酯＝3/2)对所得的非对映体混合物进行纯化，得到44mg(0.13mmol，44％收率)无色针状化合物4及26mg(75mmol，26％收率)无色针状化合物5。

化合物4：¹H NMR(250MHz，CDCl₃)δ(ppm)：1.80(1H，d，J＝4.0Hz)，2.30(3H，s)，2.31(3H，s)，3.32(1H，td，J＝3.5，11.5Hz)，4.32(1H，ddd，J＝1.3，3.5，10.5Hz)，4.59(1H，dd，J＝10.5，11.5Hz)，4.76-4.83(1H，m)，6.64-6.73(2H，m)，7.06-7.14(2H，m)，7.27-7.35(3H，m).

化合物5：₁H NMR(250MHz，CDCl₃)δ(ppm)：2.02(1H，d，J＝5.5Hz)，2.29(3H，s)，2.30(3H，s)，3.11-3.24(1H，m)，4.26(1H，dd，J＝9.0，11.3Hz)，4.37(1H，dd，J＝3.8，11.3Hz)，4.92(1H，dd，J＝5.5，7.8Hz)，6.62(1H，d，J＝2.3Hz)，6.72(1H，dd，J＝2.3，8.5Hz)，7.04-7.12(2H，m)，7.21-7.30(2H，m)，7.47(1H，d，J＝8.5Hz).

化合物6的合成

在含有116mg(0.339mmol)化合物4的甲醇(4mL)溶液中加入55mg(1.0mmol)甲醇钠，在室温下搅拌2小时。在反应液中加入离子交换树脂(DOWEX 50×8W，铵形式)中和后，滤去树脂。用甲醇清洗由浓缩滤液所得的固体，得到62mg(0.24mmol，71％收率)白色粉末状的化合物6。

化合物6：¹H NMR(250MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：3.03(1H，td，J＝3.3，12.0Hz)，4.00-4.15(1H，m)，4.31-4.51(2H，m，including 4.39，dd，J＝10.3，12.0Hz)，4.96(1H，d，J＝5.8Hz)，6.18(1H，d，J＝2.3Hz)，6.32(1H，dd，J＝2.3，8.3Hz)，6.69(2H，d，J＝8.5Hz)，7.00(1H，d，J＝8.3Hz)，7.09(2H，d，J＝8.5Hz)，9.19(1H，br s)，9.31(1H，br s).

化合物7的合成

在含有84mg(0.25mmol)化合物5的甲醇(2mL)悬浊液中加入0.73mL(0.73mmol)的1N氢氧化钠，在室温下搅拌2.5小时。在反应液中加入饱和氯化铵水溶液，使用乙酸乙酯进行提取。依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水清洗有机层，用无水硫酸钠进行干燥。蒸馏除去溶剂，得到64mg(0.25mmol，定量收率)白色粉末状的化合物7。

化合物7：¹H NMR(250MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：2.82-2.96(1H，m)，4.04-4.22(2H，m)，4.60(1H，t，J＝7.0Hz)，5.18(1H，d，J＝7.0Hz)，6.14(1H，d，J＝2.3Hz)，6.34(1H，dd，J＝2.3，8.5Hz)，6.67(2H，d，J＝8.5Hz)，7.04(2H，d，J＝8.5Hz)，7.16(1H，d，J＝8.5Hz)，9.21(1H，s)，9.28(1H，s).

参考例B2

将乳球菌20-92株(FERM BP-10036号)接种于含有黄豆苷元的扩增用液体培养基中，在厌氧条件下，在37℃下培养7～24小时。培养后，通过离心分离收集细胞并冷冻保存，在以下实施例中使用。

实施例B1 四氢黄豆苷元生成的确证

通过进行以下试验确证四氢黄豆苷元为雌马酚生物合成的中间代谢物。

(1)菌破碎物的调制

将在-80℃保存的乳球菌20-92株细胞快速解冻后，通过穿刺术使细胞悬浊，使用VC-960(Taitec株式会社(制))在4℃下以8,000rpm离心分离5分钟，除去上清液后，加入0.1M磷酸钾缓冲液/1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)/2mM DTT(二硫苏糖醇)/5mM连二亚硫酸钠(pH7.0)得到细胞悬浊液。然后，将细胞悬浊液移入2ml管中，所述2ml管中事先装有氧化锆/硅珠(约0.8mL，0.1mm，1lb；WakenyakuCo.，Ltd.)，再在管中加入0.1M磷酸钾缓冲液/1mM PMSF/2mMDTT/5mM连二亚硫酸钠(pH7.0)使管几乎装满。然后，盖上管盖并将其保存在冰中，使用FastPrep(R)(Thermo ELECTRONCORPORATION)，6500rpm ×20秒离心-冰冷，将该操作重复4次，对细胞进行破碎，所得的菌破碎物在酶反应中作为酶源使用。

(2)酶反应

调制1mL下述组成的酶反应液，所述酶反应液中含有0.1ml上述(1)菌破碎物，在37℃下温育2小时。温育后，将3mL乙酸乙酯加入所得酶反应产物中进行提取处理，之后干燥，使用HPLC进行分析。

酶反应液组成

0.1M磷酸钾缓冲液/1mM PMSF/2mM DTT/5mM连二亚硫酸钠(pH7.0)

2mM NADPH

2mM NADH

10μg/mL二氢黄豆苷元或四氢黄豆苷元

(3)通过酶反应由二氢黄豆苷元生成四氢黄豆苷元

以二氢黄豆苷元为底物，以菌破碎物为酶源得到的酶反应产物的HPLC分析结果示于图9。另外，上述参考例1中合成的四氢黄豆苷元的HPLC分析也一并示于图9。结果显示，以二氢黄豆苷元为底物以菌破碎物为酶源得到的酶反应产物中存在中间体，所述中间体具有与反式-四氢黄豆苷元的保留时间相一致的保留时间，表明生成反式-四氢黄豆苷元。

(4)通过酶反应由四氢黄豆苷元生成雌马酚

以顺式-四氢黄豆苷元或反式-四氢黄豆苷元为底物，以菌破碎物为酶源得到的酶反应产物的HPLC分析结果示于图10。由图10可知由上述两种化合物均能生成雌马酚，四氢黄豆苷元在雌马酚生物合成过程中可以作为底物，与四氢黄豆苷元为顺式还是反式无关。

实施例B2 细胞破碎物的离心上清液中的四氢黄豆苷元生物合成活性存在的确证、及NADH或NADPH依存性的确证

将保存的冷冻细胞解冻后，在5000×G，4℃下离心分离15分钟，将沉淀物用于以下试验。将沉淀物(湿重量2.7g)悬浊于10mL 0.1M磷酸钾溶液中，所述磷酸钾溶液中含有1mM PMSF及5mM连二亚硫酸钠。在37℃下预热5分钟后，每克沉淀物(湿重量)加入100mg溶菌酶，在37℃下反应1.5小时。然后，在所得的反应液中加入等量的0.1M磷酸二钾溶液后，再加入3ml氧化锆/硅珠，用旋涡混合器剧烈搅拌，再用超音波仪(Branson超声波破碎仪200)破碎细胞(5min处理，2min休息的周期重复3次)。将所得的细胞破碎液在约10,000×G下离心15分钟得到离心上清液，将其用作酶源。

调制下述组成的酶反应液，在37℃下温育2小时。温育后，将5mL乙酸乙酯加入所得的酶反应产物中进行提取处理，之后干燥，使用HPLC进行分析。

酶反应液组成

结果示于图11。根据上述结果可以确证在细胞破碎物的离心上清液中存在四氢黄豆苷元生物合成活性。另外还确证了由二氢黄豆苷元向四氢黄豆苷元的转换依存于辅酶NADH，更强烈依存于NADPH。

实施例B3 四氢黄豆苷元合成酶的纯化

将乳球菌20-92株细胞在培养瓶中培养20小时，每培养瓶中含有67ml扩增用液体培养基，所述液体培养基中含有黄豆苷元，将10瓶上述细胞离心后，使其悬浊于0.02M磷酸钾缓冲液(pH 7；以下记为“Buffer A”)中，所述磷酸钾缓冲液含有1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)及4mM DTT(二硫苏糖醇)。使用French press(SLMINSTRUMENTS INC)破碎细胞(1800psi，6次)，离心破碎液得到上清液。另外，将乳球菌20-92株细胞在培养瓶中培养18小时，每培养瓶中含有200ml液体培养基，将5瓶上述细胞同样被French press细胞破碎后，离心得到上清液。将38ml前离心上清液与47ml后离心上清液混合，将上述82ml混合液用于预先被Buffer A平衡的红色琼脂糖凝胶(约7ml)。然后，用150mlBuffer A清洗红色琼脂糖凝胶，再用含有10mM NADPH的Buffer A进行洗脱(20ml/级分)。将各级分作为酶源，在与实施例B2所示的酶反应条件(使用NADPH作为辅酶)相同的条件下测定四氢黄豆苷元生物合成活性，得到活性级分No.1～5。

使用Amicon Ultra Centrifugal UFC801024(MW Cut：10,000)对具有四氢黄豆苷元生物合成活性的级分No.1～5进行超滤浓缩，得到约2.1ml的浓缩液。将浓缩液分成3份，分别与等量的含有3M硫酸铵的Buffer A混合后，将其用于使用TSKgel Phenyl-5PW(东曹株式会社)的HPLC。HPLC的条件如下所示。测定280nm处蛋白质的吸收。

柱：TSKgel Phenyl-5PW

流速：1ml/min

级分：2ml/2min/级分

洗脱液A：0.02M磷酸钾缓冲液(pH 7)/1mM DTT/2.5mM连二亚硫酸钠/0.5％isoProH

洗脱液B：含有1M硫酸铵的洗脱液A

上述HPLC结果表明，具有四氢黄豆苷元合成活性的级分存在于第15号以后(No.15级分以后，保留时间30分钟以后)的广范围内，混合HPLC的No.19～22级分，进行超滤浓缩[Amicon Ultra CentrifugalUFC801024(MW Cut：10,000)]。在以下条件下将所得的约130μl浓缩液中的100μl用于使用TSKgel G2000SWXL(东曹株式会社)的凝胶过滤HPLC。

柱：TSKgel G2000SWXL

流速：0.6ml/min

级分：1.2ml/2min/级分

洗脱液：0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7)/1mM DTT/2.5mM连二亚硫酸钠/1％isoProH/0.3M NaCl

凝胶过滤HPLC的结果示于图12。另外，图13表示在还原条件下各级分的SDS-PAGE结果。上述结果表明，作为具有四氢黄豆苷元合成活性的主级分的No.7级分在还原条件下存在28kDa及32kDa的条带。

实施例B4 四氢黄豆苷元合成酶氨基酸序列的分析

将上述实施例3中得到具有四氢黄豆苷元合成活性的级分(No.7级分)作为样品进行MS分析。具体而言，使用SDS-PAGE对样品进行分离，切除条带。在凝胶内对被切除的条带进行还原烷化，并在凝胶内使用胰蛋白酶进行消化。然后，回收·纯化胰蛋白酶消化肽，用LC-MS进行分析。使用作为MS分析支援软件的PEAKS^TM(Infocom株式会社)对使用LC-MS分析获得的数据进行从头测序，从而计算·推定肽的氨基酸序列。详细方法等如下所示。

(1)实验原料

本实验使用的试剂及仪器如下：SuperSep HG 10/20％(和光纯药工业株式会社)、Flamingo凝胶染色试剂盒(Bio-Rad)、TCEP(三(2-羧乙基)膦)(Pierce)、分子量标准参照物(株式会社AproScience)、DTT(Calbiochem)、碘乙酰胺(和光纯药工业株式会社)、乙腈(KantoKagaku)、胰蛋白酶(Promega)、TFA(Pierce)、碳酸氢铵(Sigma)、氨水(Merck株式会社)、甲酸(Kanto Kagaku)、Empore Cation-SRDisk(Sumitomo 3M株式会社)、MonoCap浓缩柱(GL Science株式会社)、MohoCap for Nano Flow 0.1X150mm(GL Science株式会社)、FortisTip(AMR株式会社)、真空离心浓缩仪(SAVANT)、HTS-PAL自动进样器(CTC-Analytics)、Chorus220(CTC-Analytics)、QSTAR Pulsari(Applied Biosystems)、PEAKS^TM软件(Infocom株式会社)。

(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

将1μl100mM TCEP加入20μl上述实施例B3中得到的具有四氢黄豆苷元合成活性的级分(No.7级分)中，在70℃下还原处理10分钟后，将全部样品用于SuperSep HG，并按照常规方法进行SDS-PAGE。电泳后使用Flamingo凝胶染色试剂盒(Bio-Rad)进行染色(参见图14)。然后将染色后出现的条带LG1及LG2分别切下1mm²左右。使用100mM碳酸氢铵溶液清洗被切下的凝胶后，用乙腈进行脱水，使用Speed Vac Concentrator干燥固化。

(3)凝胶内胰蛋白酶的消化

将DTT溶液(溶解于100mM碳酸氢铵中，浓度为1.54mg/ml)加入干燥的凝胶片上并在55℃下温育45分钟，进行还原处理。除去DTT溶液后加入碘乙酰胺溶液(溶解于100mM碳酸氢铵中，浓度为10.1mg/ml)，并在室温遮光条件下温育30分钟。除去溶液后，依次用50％乙腈溶液、100％乙腈溶液、100mM碳酸氢铵溶液、100％乙腈溶液清洗凝胶片，用真空离心浓缩仪干燥固化。在干燥凝胶片上加入少量的胰蛋白酶溶液(溶解于50mM碳酸氢铵中，浓度为12.5μg/ml)，在冰上浸渍45分钟。浸渍后除去多余的胰蛋白酶溶液，加入50mM碳酸氢铵溶液直至凝胶片被浸渍，然后在37℃下反应16小时。

(4)使用质谱进行氨基酸序列的分析

回收胰蛋白酶消化肽，使用在移液管尖端填充有Empore Cation-SR Disk的简易柱进行预处理纯化。用0.1％TFA/90％乙腈溶液清洗回收胰蛋白酶消化肽。在简易柱中，首先使用0.1％TFA/2％乙腈溶液对样品进行平衡，样品吸着后，使用0.1％TFA/90％乙腈溶液对柱进行清洗，然后用5％氨/30％乙腈溶液对样品进行洗脱，洗脱后使用真空离心浓缩仪对消化肽进行干燥浓缩。将TFA加入消化肽溶液中使其pH被调节至3左右，并且将样品放置在自动进样器HTS-PAL中。将放置于HTS-PAL中的样品装载在位于LC-MS用进样阀的样品浓缩柱中并在柱中进行清洗。使用nanoHPLC-Chorus220将浓缩柱的样品在分析柱中进行分离，并在位于分析柱中的FortisTip中离子化，然后使用QSTAR Pulsar i进行分析。LC-MS的分析条件如下所示。

LC部分Chorus220：A溶剂：0.1％甲酸/2％乙腈；B溶剂：0.1％甲酸/90％乙腈；流速＝300nl/min；梯度：5％A-65％B/20min；

MS部分：NanoESI正离子模式，信息依赖性获取模式(Informationdependent acquisition mode)(m/z＝400～1400，大于25counts，Chargestate＝2～4)；4次实验/1周期：实验1(TOF-MS，m/z＝400～1400，累积时间(Accumulation time)＝1sec)，实验2～4(Positive Product Ion，m/z＝100～1400，累积时间＝2sec)

将由LC-MS得到的条带LG1、LG2(参见图14)的数据使用PEAKS^TM软件进行从头测序分析，以推定消化肽的氨基酸序列。

实施例B5 二氢黄豆苷元合成(E1)酶基因的周边基因组DNA序列的分析

(1)Inverse-PCR用基因组DNA文库的制备

使用如下所示的限制酶(BamHI，EcoRI，HindIII，KpnI，PstI，SacI，SalI，Sau3AI，XhoI)(均来自Takara Bio)通过在37℃下消化16小时将实施例A5中纯化的乳球菌20-92株(FERM BP-10036号)基因组DNA进行片段化，用酚·氯仿处理后，使用乙醇沉淀进行纯化。通过使用TaKaRa连接试剂盒var.2.1(Takara Bio Inc.)使纯化的基因组DNA片段自我连接，使用灭菌水将各连接溶液稀释10倍，制备Inverse-PCR用基因组DNA文库。

(2)Inverse-PCR

以1μL(相当于40ng)上述(1)所述的Inverse-PCR用基因组DNA文库作为模板，使用Inverse-PCR尝试扩增E1多核苷酸周边上游及下游区域的基因组DNA。将用PstI、XhoI处理的片段作为Inverse-PCR扩增上游端区域的模板DNA，将用HindIII、PstI、SacI、XhoI处理的片段作为Inverse-PCR扩增下游端区域的模板DNA。在Inverse-PCR中使用TaKaRa LA Taq(Takara Bio Inc.)。使用包含下述组成的20μL反应液进行First-PCR：1×PCR Buffer(无Mg²⁺)；引物各0.5nM；dNTP，各0.5mM；MgCl₂2.5mM；TaKaRa LA Taq 0.2U；并使用1μL(40ng)基因组DNA文库稀释液作为模板，按以下程序进行扩增：98℃1min，(95℃10sec，62℃10sec，68℃10min)×35个周期，68℃15min。然后使用0.5μL First-PCR产物为模板，并使用包含下述成分的30μL反应液进行Nested-PCR：1×PCR Buffer(无Mg²⁺)，引物各0.5nM，dNTP各0.5mM，MgCl₂2.5mM，TaKaRa LA Taq 0.3U，扩增程序如下：98℃1min，(95℃10sec，62℃10sec，68℃10min)×30个周期68℃15min。

(2-1)使用引物

用于Inverse-PCR的引物组合如下所示。

(2-1-1)上游端

First-PCR：RACE-N-P3-1和E1-Bub-N-P1

Nested-PCR：RACE-N-P3-2和E1-Bub-N-P2

(2-1-2)下游端

First-PCR：RACE-C-P3-1和E1-Bub-C-P1

Nested-PCR：RACE-C-P3-2和E1-Bub-C-P2

(2-2)使用引物的序列

分别用于上游端及下游端的Inverse-PCR的引物序列如下所示。

上游端的扩增引物序列

RACE-N-P3-1：

ATGGAGATAGTGCCGCTGGCAAGGCAACGGCAC(序列号：43)

RACE-N-P3-2：

TCAACGAAGACTCGATTTGAGCGAGAGGCGAGG(序列号：44)

E1-Bub-N-P1：

ACGGTGGAACCGGCATCGTGTTCATGGACAAC(序列号：45)

E1-Bub-N-P2：

GCGTGACCCAGTTCCACCATGTCGGACTGTC(序列号：46)

下游端的扩增引物序列

RACE-C-P3-1：

GACATCCCGTTCGAGCGCAGGATCACCCATGAG(序列号：47)

RACE-C-P3-2：

AGGATCACCCATGAGCGCATCGCTATCATGGAC(序列号：48)

E1-Bub-C-P1：

CATCGCTCTTGCAGTCGTTGTCCAGGAAGTCC(序列号：49)

E1-Bub-C-P2：

TTGTCCAGGAAGTCCATCGCGTACACGACGGAG(序列号：50)

需要说明的是，本实施例中作为扩增引物使用的寡DNA全部由Sigma-Aldrich Japan合成。

(3)由Inverse-PCR扩增的二氢黄豆苷元合成酶基因周边基因组 DNA片段的纯化及碱基序列的确定

将10×day加入本实施例(2)中得到的Nested-PCR产物中，使其量相当于Nested-PCR产物的1/10，使用0.8％的琼脂糖凝胶对5μL产物进行电泳。结果确证了在上游端区域内0.5kb(PstI)、3.5kb(XhoI)DNA片段扩增，在下游端区域内1kb(HindIII)、1kb(SacI)、2.5kb(XhoI)DNA片段扩增。本实施例中琼脂糖电泳使用溴化乙锭(Nippongene Co.Ltd.)进行染色，使用λ/StyI(Nippongene Co.Ltd.)、100bpladder(Toyobo Co.Ltd.)作为分子量标准参照物。将扩增的DNA片段从琼脂糖凝胶上切除，使用QIAGEN凝胶回收试剂盒(Qiagen)进行纯化。通过直接序列法及步移法对纯化DNA片段的碱基序列进行确定，所述直接序列法及步移法使用在扩增中使用的引物。

(4)基因组序列的分析及ORF(开放阅读框)的预测

使用序列拼接软件SEQUENCHER(Gene Codes Inc，USA)对本实施例(3)中所得的DNA序列进行拼接分析，并且预测ORF。其结果确定了包含E1酶基因的周边基因组区域的6685bp序列。由分析结果得到的包含二氢黄豆苷元合成酶基因周边基因组结构的简图示于图15。通过预测ORF，发现在E1酶基因上游存在三个ORF(其中一个的N末端未鉴定)，下游存在一个ORF。将二氢黄豆苷元合成酶上游一侧的ORF记为Upstream(US)1、US2、US3，下游一侧的ORF 记为Downstream(DS)1。

实施例B6 通过LC-MS分析对消化肽序列与基因组序列的核对

将上述实施例B4中得到的推定的氨基酸序列与上述实施例B5中确定的二氢黄豆苷元合成(E1)酶基因的周边基因组DNA序列数据进行核对。结果，主要由LG2得到的若干序列与由ORF-US2核苷酸序列推定的多肽的序列一致。以上结果暗示ORF-US2多肽可能为四氢黄豆苷元合成酶。与ORF-US2多肽一致的消化肽的序列如下所示。另外，图16-1、16-2、16-3表示使用LC-MS获得的数据。

表1

m/z	z	Mass	Peptide	Score(％)
					629.348	2	1256.682	TPGVAASVADEXK(序列号51)	100
452.256	2	902.497	MPGAPVFGK(序列号52)	99.8
					487.847	2	973.680	KXXXTGTTK(序列号53)	99.8
654.670	3	1960.988	VTQEXXCAHGAFVCGSGR(序列号54)	99.6
					644.348	2	1286.681	WXSPEESVGQR(序列号55)	96.8
449.795	2	897.576	AQEVKVPK(序列号56)	74.9

上表中m/z表示质核比，z表示电荷数，Mass表示肽的质量，Peptide表示推定的氨基酸序列。Score表示用PEAKS软件进行的序列计算的准确分数值(100％为最大值)。需要说明的是，由于异亮氨酸(I)与亮氨酸(L)的分子量相同且不能区分，所以在与上述ORF-US2多肽一致的消化肽序列中将两者均用X表示。

实施例B7 使用无细胞类蛋白质合成系统的ORF-US2多肽的合成及其四氢黄豆苷元合成活性的确证

使用无细胞类蛋白质合成系统(PURESYSTEM Classic IImini(Post Genome Institute Co.，Ltd.))合成ORF-US2多肽并对其四氢黄豆苷元合成活性进行确证。

(1)模板DNA的制备

通过两个阶段的PCR，制备用于无细胞类蛋白质合成的ORF-US2多核苷酸模板DNA。

(1-1)使用引物

PCR中使用的、用于制备ORF-US2用模板DNA的引物如下所示。

E2-invitroTS-FP1：

ACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCACAGGAAGTCAAAGTCC(序列号：57)

E2-invitroTS-RP：

CTAGACCTCGATCTCGCCCTGCATGCCG(序列号：58)

通用引物：GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA(序列号：59)

E2-invitroTS-FP1及E2-invitroTS-RP由Sigma-AldrichJapan基于实施例B5中确定的ORF-US2核苷酸序列进行合成。另外，通用引物来自PURESYSTEM Classic II mini(Post Genome Institute CO，Ltd.)的附件。

(1-2)利用两阶段PCR的模板DNA的制备

按照手册利用两阶段PCR制备用于合成ORF-US2多肽的模板DNA。本实施例中PCR使用Easy-A(注册商标)High-Fidelity PCR克隆酶(Stratagene)作为DNA-聚合酶，使用GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems)作为PCR装置。

第一阶段的PCR使用乳球菌20-92株的基因组DNA为模板，用本实施例(1-1)中所述的引物E2-invitroTS-FP1和E2-invitroTS-RP来扩增ORF-US2核苷酸。以所得的PCR产物(ORF-US2核苷酸)为模板使用通用引物和E2-invitroTS-RP进行第二阶段的PCR。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)对300μL PCR产物(50μL×6瓶)进行纯化，作为模板DNA(ORF-US2多肽合成用模板DNA)用于ORF-US2多肽的合成。第一阶段及第二阶段的PCR在以下条件下进行。

第一阶段：使用50μL含有下述组成的反应液：扩增引物各10pmol，dNTP各2.5pmol，来自乳球菌20-92株的基因组DNA 40ng，Easy-A用缓冲液(Stratagene)，Easy-A(注册商标)High-Fidelity PCR克隆酶2U(Stratagene)；扩增程序如下：95℃2min，(95℃45sec，58℃20sec，72℃1min)×30个周期，72℃3min。

第二阶段：使用50μL含有下述组成的反应液：扩增引物各10pmol，dNTP各2.5pmol，第一阶段的PCR反应液0.5μL，Easy-A用缓冲液，Easy-A(注册商标)High-Fidelity PCR克隆酶2U；扩增程序如下：95℃2min，(95℃45sec，45℃20sec，72℃1min)×5个周期，(95℃45sec，60℃20sec，72℃1min)×25个周期72℃3min。

(2)ORF-US2多肽的无细胞类蛋白质合成及其四氢黄豆苷元合成活性的确证

将保存于-80℃的PURESYSTEM Classic II mini的A液25μL和B液10μL在冰上解冻后进行混合，向其加入0.6μg(60ng/μL，10μL)在第二阶段PCR制备的ORF-US2多肽合成用模板DNA(包含在起始密码子的5’端上游的T7-启动子序列及核糖体结合序列)，加入灭菌水使总体积为50μL，在37℃下温育90分钟以合成目标多肽。作为使用上述系统的蛋白质合成阳性对照，使用0.5μg(0.2μg/μL，2μL)附属于PURESYSTEM Classic II mini的二氢叶酸还原酶(DHFR)合成用模板DNA。在阴性对照中不添加作为模板的DNA，只使用灭菌水。活性测定如下进行：在以下组成的酶反应用缓冲液中加入40μL上述反应液，在37℃下温育6小时，反应结束后使用3mL乙酸乙酯对酶反应液进行提取、干燥，用电泳缓冲液溶解，使用HPLC分析，测定酶反应液中的四氢黄豆苷元。

酶反应用缓冲液组成

0.1M磷酸钾缓冲液/1mM PMSF/2mM DTT/5mM连二亚硫酸钠(pH7.0)

2mM NADPH

2mM NADH

10μg/mL 二氢黄豆苷元

需要说明的是，使用上述二氢叶酸还原酶(DHFR)合成用模板DNA时，基于该DNA，蛋白质被良好地表达，但不添加用作模板的DNA时，蛋白质不被表达。从以上结果判断，进行上述实验是合适的。

结果示于图17。表达有ORF-US2多肽的反应液反应6小时后，所得样品在约6.7分钟的位置存在一个四氢黄豆苷元峰。但是，在无蛋白质合成(NC)及表达二氢叶酸还原酶(DHFR)的反应液中不存在四氢黄豆苷元峰。另外，可观察到在表达ORF-US2多肽的反应液中二氢黄豆苷元(底物)随四氢黄豆苷元的生物合成而减少，而在无蛋白质合成(NC)及表达二氢叶酸还原酶(DHFR)的反应液中未见二氢黄豆苷元的减少。以上结果表明，ORF-US2多肽具有由二氢黄豆苷元合成四氢黄豆苷元的活性。即，可以说ORF-US2多肽相当于上述E2多肽。

实施例B8 使用大肠杆菌的重组ORF-US2多肽的表达及其四氢黄豆苷元合成活性的确证

使用pET系统表达ORF-US2多肽，并对其四氢黄豆苷元合成活性进行确证，其中，所述pET系统为使用大肠杆菌的重组蛋白质表达系统。

(1)ORF-US2多肽表达载体的制备

为了制备ORF-US2多肽表达载体(pET21-US2)，使用PCR扩增ORF-US2多肽可读框区域的DNA。

基于实施例B5中确定的ORF-US2多肽序列制备下述扩增引物。

exp.US2 pet F Nde：TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC(序列号：60)

exp.US2 pet：AATCGAATTCCTAGACCTCGATCTCGCCCTGC(序列号：61)

使用含有下述组成的25μL反应液进行PCR反应，所述组成为：上述引物各5pmol；dNTP各5nmol；乳球菌20-92株的基因组DNA40ng；KOD-plus DNA聚合酶用10×缓冲液(Toyobo Co.，Ltd.)2.5μL；KOD-Plus DNA聚合酶0.3U(Toyobo Co.，Ltd.)。扩增程序为：95℃3分钟，(94℃30秒，60℃30秒，68℃1分钟)×30个周期，68℃7分钟。PCR设备：GeneAmpPCR System 9700(Applied Biosystems)。使用琼脂糖凝胶电泳分析一部分PCR反应液，结果检测出预想尺寸的条带。使用QIAGEN PCR纯化试剂盒(Qiagen)回收全部PCR产物。

将回收的DNA片段用限制酶NdeI及EcoRI切断后，进行琼脂糖凝胶电泳。然后，切除包含目标条带的部分，用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化、回收。使用DNA连接试剂盒ver.2.1(TakaraBio Inc.)将DNA片段与被NdeI及EcoRI消化的pET21a在16℃下连接一夜，然后，使用连接反应液转化大肠杆菌JM109株(Takara BioInc.)。

使用染料终止法对插入质粒的DNA碱基序列进行测序，确证了E1核苷酸如期望那样被成功插入。使用DNA测序仪ABI3700(AppliedBiosystems)对本实施例中的DNA序列进行测定。

(2)在大肠杆菌内重组ORF-US2多肽的表达及确证

使用表达重组ORF-US2多肽的质粒pET21-US2和pET21a(阴性对照)转化大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen)。在37℃下，将转化体在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基琼脂板上培养一夜，得到单菌落。

在37℃下，将上述每个大肠杆菌BL21(DE3)转化体在3mL含有50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中培养一夜。然后将0.5mL上述培养液中加入50mL含有相同浓度氨苄青霉素的液体LB培养基，预培养3小时(直到OD在630nm变为约0.4)，加入IPTG(异丙基-p-硫代半乳糖吡喃糖苷；Wako Pure Chemical Industries)使最终浓度为1mM，在37℃培养4小时。

培养结束后，通过使用Avanti HP25(beckman coulter)离心分离(6000rpm 4℃15分钟)细胞以收集细胞。之后的操作在冰上进行。除去离心上清液(培养基)后，使细胞悬浊于1mL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0；KPB-PDH)中，所述磷酸钾缓冲液含有1mM PMSF、2mMDTT、5mM连二亚硫酸钠，将悬浊液移入2ml辅助管中，所述辅助管中事先装有0.7mL氧化锆/硅珠(BioSpec Products，Inc.)及400μLKPB-PDH，使用FastPrep(R)(Thermo ELECTRONCORPORATION)，将6500rpm处理20秒-冰冷3分钟这一周期重复两次，对细胞进行破碎，得到细胞破碎液。

使用SDS-聚丙烯酰胺-凝胶电泳(SDS-PAGE)对大肠杆菌内的重组ORF-US2多肽的表达进行确证。

在20μL上述细胞破碎液中加入5μL 5×样品缓冲液(125mM Tris-HCl(pH6.5)/25％丙三醇/5％SDS/5％2-巯基乙醇/BPB 0.5％)，在98℃下加热变性5分钟后，冰冷悬浊液，之后使用SDS-PAGE对其中的10μL悬浊液进行电泳。使用市售的凝胶板(SuperSep^TM5-20％(和光纯药工业株式会社))进行SDS-PAGE，用Quick CBB(和光纯药工业株式会社)进行染色。使用Prestained XL-Ladder Broad range(株式会社AproScience)作为分子量标准参照物。

SDS-PAGE的结果示于图18。结果确证了在来自pET21-US2转化体的细胞破碎液中存在分子量约29kDa的重组多肽。

(3)重组ORF-US2多肽的二氢黄豆苷元合成活性的确证

以本实施例(2)中得到的细胞破碎液作为酶源测定由二氢黄豆苷元向四氢黄豆苷元转换的转换活性，在被表达的重组ORF-US2多肽中确证了其活性。

本实施例中按照以下方法对由二氢黄豆苷元向四氢黄豆苷元转换的活性进行测定。

调制下述组成的酶反应液，在0℃下温育2小时。

酶反应液组成

温育后，在所得的酶反应液中加入3mL乙酸乙酯进行提取处理，干燥后用流动相(洗脱液)溶解。使用HPLC分析溶解产物来测定酶反应液中二氢黄豆苷元及顺式-、反式-四氢黄豆苷元的含量。

HPLC分析结果示于图19。结果观察到在来自质粒pET21-E1-His的转化体的菌破碎液中，所述转化体表达重组ORF-US2多肽，加入酶反应液中的二氢黄豆苷元(底物)转换为顺式-四氢黄豆苷元(c-THD)及反式-四氢黄豆苷元(t-THD)，而在作为阴性对照的pET21a转化体中在酶反应液中未检测出四氢黄豆苷元。

以上结果显示重组ORF-US2多肽具有由二氢黄豆苷元合成四氢黄豆苷元的活性。即，可以认为重组ORF-US2多肽相当于上述E2多肽。

实施例C

实施例C1 细胞的由四氧黄豆苷元生物合成雌马酚的活性的确证

将乳球菌20-92株(FERM BP-10036号)接种于含有四氢黄豆苷元扩增用液体培养基(加入了顺式-或反式-四氢黄豆苷元(由otsukaPharmaceutical Co.，Ltd.有机合成：参见参考例B1)使其浓度为10μg/mL的改良GAM肉汤培养基(日水制药株式会社))中，在厌氧条件下(使用BBL Gas Pack systems)在37℃下培养18小时。培养结束后立即将1mL培养液加入带盖的玻璃离心管中，加入3mL乙酸乙酯进行提取处理，之后干燥，进行HPLC分析。使用黄豆苷元(Funakoshi Corporation)、雌马酚(Funakoshi Corporation)、二氢黄豆苷元(Trend Research ChemicalsInc.)顺式-四氢黄豆苷元、反式-四氢黄豆苷元(均由otsukaPharmaceutical Co.，Ltd.化学合成)的混合溶液(各2μg/mL)作为HPLC分析的标准溶液。

结果示于图20。结果显示乳球菌20-92株具有由顺式-或反式-四氢黄豆苷元生物均能合成雌马酚的活性(图20中、下)。需要说明的是，图中黄豆苷元简称为DZN，二氢黄豆苷元简称为DD，顺式-四氢黄豆苷元简称为c-THD，反式-四氢黄豆苷元简称为t-THD，雌马酚简称为EQL。

实施例C2 利用使用了大肠杆菌的重组蛋白质表达系统对雌马酚合成酶的研究及鉴定

使用pET系统(Novagen)，使与三个ORF多核苷酸(ORF-US3，US1，DS1)相对应的多肽分别在大肠杆菌内表达，通过研究其催化由四氢黄豆苷元转换为雌马酚的活性来研究雌马酚合成(E3)酶，其中所述pET系统为使用大肠杆菌的重组蛋白质表达系统，所述三个ORF多核苷酸为在实施例B5中确定的二氢黄豆苷元合成(E1)酶基因的周边基因组DNA序列上鉴定出的多核苷酸，

(1)ORF多肽表达载体的制备

为了制备各ORF多肽(ORF-US3，US1，DS1)的表达载体，使用PCR扩增每个多肽在可读框区域的多核苷酸，并将其插入pET21a载体(Novagen)中。

(1-1)扩增引物

基于实施例B5中确定的二氢黄豆苷元合成酶(E1)的周边基因组序列制备下述扩增引物。

ORF-US3多肽

exp.US3 F：TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG(序列号：62)

exp.US3 R：CCGCAAGCTTCTACATAGTGGAGATCGCGTGG(序列号：63)

ORF-US1多肽

exp.US1 F：TATACATATGTTCAAGGGTCCACAGGGC(序列号：64)

exp.US1 R：GCTCGAATTCTTAGTGCTGCTGTGCCTTTTCAG(序列号：65)

ORF-DS1多肽

exp.DS1 F：ATATACATATGCAGGATATGGACTTCATGG(序列号：66)

exp.DS1 R：GCTCGAATTCTCATAGTGACATCAGCGCTCCC(序列号：67)

为了插入到pET21a(Novagen)中，上述扩增引物exp.US3F、exp.US1F、exp.DS1F被设计为包含限制酶NdeI切割位点序列，exp.US3F被设计为包含HindIII切割位点序列，exp.US1F和exp.DS1F被设计为包含EcoRI切割位点序列。

(1-2)各ORF多核苷酸的扩增

使用含有下述组成的25μL反应液进行PCR反应，所述组成为：上述引物各5pmol；dNTP各5nmol；在实施例A5中纯化的乳球菌20-92株的基因组DNA 40ng；KOD-plus DNA聚合酶用10×缓冲液(Toyobo Co.，Ltd.)2.5μL；KOD-Plus DNA聚合酶0.3U(Toyobo Co.，Ltd.)。扩增程序为：95℃3分钟，(94℃30秒，60℃30秒，68℃2分钟)×30个周期，68℃7分钟。PCR 设备：GeneAmpPCR System9700(Applied Biosystems)。使用琼脂糖凝胶电泳分析一部分PCR反应液，结果检测出了每个引物都具有预想尺寸的条带。使用QIAGENPCR纯化试剂盒(Qiagen)回收全部PCR产物。

(1-3)ORF多肽表达载体的制备

将(1-2)中回收的ORF-US3多核苷酸片段用限制酶NdeI及HindIII切断，将ORF-US1及ORF-DS1多核苷酸片段用NdeI及EcoRI切断后，进行琼脂糖凝胶电泳，切除包含目标条带的部分，用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化、回收。使用DNA连接试剂盒ver.2.1(Takara Bio Inc.)，将所得的多核苷酸片段与用NdeI及HindIII或EcoRI消化的pET21a在16℃下连接一夜，然后用常规方法使用连接反应液转化大肠杆菌JM109株(Takara Bio Inc.)。在37℃下，将由此得到的转化体在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基琼脂(GIBCO)板上培养一夜，得到菌落。将所得的单菌落在3mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基(GIBCO)中培养一夜后，使用质粒自动提取机PI-100(KURABO)提取质粒DNA。

使用染料终止法对插入了质粒的DNA碱基序列进行测序，确证了各多核苷酸如期望那样被成功插入，从而得到了pET-US3、pET-US1、pET-DS1。使用DNA测序仪ABI3700(Applied Biosystems)对本实施例中的DNA序列进行测定。

(2)在大肠杆菌内各重组多肽的表达

(2-1)大肠杆菌BL21转化体的制备

按照常规方法，使用表达重组ORF多肽的质粒pET-US3、pET-US1、pET-DS1和pET21a(阴性对照)转化大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen)。在37℃下，将转化体在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基琼脂板上培养一夜，得到单菌落。

(2-2)重组多肽的表达诱导

在37℃下，分别将上述大肠杆菌BL21(DE3)转化体在3mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中培养一夜。然后将0.5mL上述培养液加入50mL含有相同浓度氨苄青霉素的液体LB培养基中，预培养3小时(直到OD在630nm变为0.4-0.7)，加入IPTG(异丙基-p-硫代半乳糖吡喃糖苷；Wako Pure Chemical Industries)使最终浓度为1mM，在37℃下培养4小时。由此，诱导重组多肽在大肠杆菌内的表达。

(2-3)细胞破碎液的调制

上述(2-2)中的表达诱导结束后，通过使用Avanti HP25(beckmancoulter)离心分离(6000rpm 4℃15分钟)细胞来收集细胞。之后的操作在冰上进行。除去离心上清液(培养基)，之后使细胞悬浊于1mL0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0；以后简称为KPB-PDH)中，所述磷酸钾缓冲液含有1mM PMSF、2mM DTT、5mM连二亚硫酸钠，将悬浊液移入2ml辅助管中，所述辅助管中事先装有0.7mL氧化锆/硅珠(BioSpecProducts，Inc.)及400μL KPB-PDH，使用FastPrep(R)(ThermoELECTRON CORPORATION)以6500rpm处理20秒-冰冷3分钟，将该操作重复两次，对细胞进行破碎，得到细胞破碎液。

(2-4)使用SDS-聚丙烯酰胺-凝胶电泳(SDS-PAGE)的重组多肽的表达确证

使用SDS-PAGE对大肠杆菌内的各重组ORF多肽的表达进行确证。在(2-3)所述的20μL细胞破碎液中加入5μL 5×样品缓冲液(125mM Tris-HCl(pH6.5)/25％丙三醇/5％SDS/5％2-巯基乙醇/BPB 0.5％)，在98℃下加热变性5分钟后，冰冷悬浊液，之后使用SDS-PAGE对上述4μL悬浊液进行电泳。使用市售的凝胶板(SuperSep^TM5-20％(和光纯药工业株式会社))进行SDS-PAGE，用Quick CBB(和光纯药工业株式会社)进行染色。使用Prestained XL-Ladder Broad range(株式会社AproScience)作为分子量标准参照物。SDS-PAGE的结果示于图21。结果确证了分子量约52kDa、50kDa的重组ORF-US3及ORF-DS 1多肽分别在来自pET-US3、pET-DS1转化体的细胞破碎液中表达。但在来自pET-US1转化体的细胞破碎液中未观察到重组ORF-US1多肽的表达。

实施例C3 重组OR F多肽的雌马酚合成活性的测定

以实施例C2中得到的各转化体菌破碎液作为酶源，测定由四氢黄豆苷元转换为雌马酚的转换活性。在本实施例中，按照以下方法测定由四氢黄豆苷元向雌马酚转换的转换活性。

调制下述组成的酶反应液，在37℃下温育1小时。

酶反应液组成

温育后，在所得的酶反应液中加入3mL乙酸乙酯进行提取处理，干燥后，用流动相(洗脱液)溶解。使用HPLC分析溶解产物，由此测定酶反应液中二氢黄豆苷元及顺式-四氢黄豆苷元、反式-四氢黄豆苷元及雌马酚的含量。使用黄豆苷元(Funakoshi Corporation)、雌马酚(Funakoshi Corporation)、二氢黄豆苷元(Trend Research Chemicals Inc.)、顺式-四氢黄豆苷元、反式-四氢黄豆苷元(均由otsuka PharmaceuticalCo.，Ltd.化学合成)的混合溶液(各2μg/mL)作为HPLC分析的标准溶液。

从HPLC分析的结果观察到在来自质粒pET-US3的转化体衍生的菌破碎液中，所述转化体表达重组ORF-US3多肽，加入酶反应液中的四氢黄豆苷元转换为雌马酚(图22)。另外在雌马酚生物合成通路中，向作为四氢黄豆苷元前体的二氢黄豆苷元的转换活性也得到了确证(图22)。对于pET-US1、pET-DS1转化体及作为阴性对照的pET21a转化体，在酶反应液中只检测到了四氢黄豆苷元。需要说明的是，图中黄豆苷元简称为DZN，二氢黄豆苷元简称为DD，顺式-四氢黄豆苷元简称为c-THD，反式-四氢黄豆苷元简称为t-THD，雌马酚简称为EQL。

以上结果显示ORF-US3多肽具有由四氢黄豆苷元生物合成雌马酚的活性。即，可以说ORF-US3多肽相当于上述E3多肽。

实施例D

实施例D1 使用大肠杆菌的、带有His标记的重组雌马酚产生相关酶的表达及纯化

使用pET系统(Novagen)表达带有His标记的雌马酚产生相关酶[二氢黄豆苷元合成酶(E1)，四氢黄豆苷元合成酶(E2)，雌马酚合成酶(E3)]，使用带有His标记的蛋白质纯化用(Ni)柱进行亲和纯化，所述pET系统为使用大肠杆菌的重组蛋白质表达系统。

(1)带有His标记的酶表达载体的制备

为了制备各酶(E1，E2，E3)的表达载体，使用PCR在每个可读框区域扩增多核苷酸并插入pET21a载体(Novagen)。

(1-1)扩增引物

基于实施例B5中确定的二氢黄豆苷元合成酶(E1)周边基因组序列，制备下述扩增引物。

带有His标记的E1酶

exp.E1 pet F Nde：AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA(序列号：41)

exp.E1 pet His：AATCGAATTCGTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT(序列号：42)

带有His标记的E2酶

exp.US2 pet F Nde：TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC(序列号：60)

exp.E2 pet His：AATCGAATTCGAGACCTCGATCTCGCCCTGC(序列号：68)

带有His标记的E3酶

exp.US 3F：TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG(序列号：62)

exp.E3R His：CCGCAAGCTTGTACATAGTGGAGATCGCGTGG(序列号：69)

为了插入到pET21a(Novagen)中，上述扩增引物exp.E1pet F Nde、exp.US2 pet F、exp.US3 F被设计为每个均包含一个限制酶NdeI切割位点序列，exp.E1 pet His和exp.E2 pet His被设计为包含EcoRI切割位点序列，exp.E3R His被设计为包含HindIII切割位点序列

(1-2)各个带有His标记的酶多核苷酸的扩增

使用含有下述组成的25μL反应液进行PCR反应，所述组成为：上述引物各5pmol；dNTP各5nmol；在实施例A5中纯化的乳球菌20-92株(FERM BP-10036号)的基因组DNA 40ng；KOD-plus DNA聚合酶用10×缓冲液(Toyobo Co.，Ltd.)，2.5μL；KOD-Plus DNA聚合酶0.3U(Toyobo Co.，Ltd.)。扩增程序为：使用GeneAmpPCR System9700(Applied Biosystems)以95℃3分钟，(94℃30秒，60℃30秒，68℃2分钟)×30个周期，68℃7分钟进行扩增。使用琼脂糖凝胶电泳分析一部分PCR反应液，结果检测出了每个引物都具有预想尺寸的条带。使用QIAGEN PCR纯化试剂盒(Qiagen)回收全部PCR产物。

(1-3)带有His标记的酶多肽表达载体的制备

将(1-2)中回收的各个带有His标记的酶多核苷酸片段用限制酶NdeI及EcoRI切断后，进行琼脂糖凝胶电泳，切除包含目标条带的部分，用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化、回收。使用DNA连接试剂盒ver.2.1(Takara BioInc.)将所得的多核苷酸片段与用NdeI及EcoRI消化的pET21a在16℃下连接一夜，然后用常规方法使用连接反应液转化大肠杆菌JM109株(Takara Bio Inc.)。在37℃下，将由此得到的转化体在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基琼脂(GIBCO)板上培养一夜，得到菌落。将所得的单菌落在3mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基(GIBCO)中培养一夜后，使用质粒自动提取机PI-100(KURABO)提取质粒DNA。

使用染料终止法对插入了质粒的DNA碱基序列进行测序，确证了各个多核苷酸如期望那样被成功插入，从而得到了pET-E1-His、pET-E2-His、pET-E3-His。使用DNA测序仪ABI3700(AppliedBiosystems)对本实施例中的DNA序列进行测定。

(2)在大肠杆菌内的各带有His标记的重组酶多肽的表达及亲和纯化

(2-1)大肠杆菌BL21转化体的制备

按照常规方法，使用表达带有His标记的酶多肽的质粒pET-E1-His、pET-E2-His和pET-E3-His转化大肠杆菌BL21(DE3)株(Novagen)。在37℃下，将转化体在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基琼脂板上培养一夜，得到单菌落。

(2-2)带有His标记的重组E1及E2酶多肽的纯化

(2-2-1)大肠杆菌的培养及带有His标记的重组E1及E2酶多肽的表达诱导

在37℃下，将由上述pET-E1-His或pET-E2-His转化得到的大肠杆菌BL21(DE3)转化体分别在10mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中培养一夜。然后将7.5mL上述培养液加入150mL含有相同浓度氨苄青霉素的液体LB培养基中，在37℃下预培养2小时(直到OD在600nm变为约0.5)，加入IPTG(异丙基-p-硫代半乳糖吡喃糖苷；Wako Pure Chemical Industries)使最终浓度为0.5mM，在30℃轻微振荡的条件下培养4小时。由此来诱导带有His标记的重组E1及E2酶多肽在大肠杆菌内的表达。

(2-2-2)菌裂解液的调制

上述(2-2)中的表达诱导结束后，使用Avanti HP25(beckmancoulter)对细胞离心分离(6000rpm 4℃10分钟)来收集细胞，由此得到在大肠杆菌中表达的带有His标记的重组E1及E2酶多肽，其湿重量分别为0.66g及0.73g。将BugBuster蛋白抽提试剂(Novagen)以每g细胞(湿重量)15mL的比例加入所得细胞中，用吸管轻微处理使混合物悬浊，然后分别以2000units/mL和25units(1μL)/mL在悬浊液中加入溶菌酶(SIGMA)和Benzonase(Novagen)。之后，使用旋转器(RT-50：Taitec)在室温下缓慢搅拌30分钟，得到菌裂解液A。然后使用Avanti HP25(beckman coulter)离心分离(8000rpm 4℃15分钟)菌裂解液A，得到其上清液(菌裂解液B)。

(2-2-3)带有His标记的重组E1及E2酶多肽的亲和纯化

使用His GraviTrap(GE Healthcare Bioscience)作为带有His标记的蛋白质纯化用柱，按照用户手册所述的程序，使用部分变更的方法对带有His标记的E1及E2酶多肽进行亲和纯化。即，使用10mL冰冷过的结合缓冲液平衡His GraviTrap，之后，为了使目标物即带有His标记的E1或E2酶吸附于His GraviTrap上，以自由落体的方式加入(2-2-2)中调制的全部菌裂解液B。然后用冰冷过的10mL清洗缓冲液清洗His GraviTrap 2次，使用冰冷过的3mL洗脱缓冲液从HisGraviTrap上洗脱目标物即带有His标记的E1及E2酶。在洗脱液中加入DTT[二硫苏糖醇](和光纯药工业株式会社)使最终浓度为3mM，将每300μL装入一个微管。使用一部分微管确证在各洗脱液中的E1酶活性及E2酶活性，将洗脱液在4℃下保存直至用于酶实验。

本纯化中使用的结合缓冲液、清洗缓冲液、洗脱缓冲液的组成如下所示。

结合缓冲液：20mM Tris-HCl，20mM咪唑(和光纯药工业株式会社)，0.5M NaCl(和光纯药工业株式会社)，1mM DTT[二硫苏糖醇](和光纯药工业株式会社)，1mM PMSF[苯甲基磺酰氟](和光纯药工业株式会社)

清洗缓冲液：20mM Tris-HCl，60mM咪唑，0.5M NaCl，1mMDTT[二硫苏糖醇]，1mM PMSF[苯甲基磺酰氟]

洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl，500mM咪唑，0.5M NaCl，1mMDTT[二硫苏糖醇]，1mM PMSF[苯甲基磺酰氟]

(2-3)带有His标记的重组E3酶多肽的纯化

(2-3-1)大肠杆菌培养及带有His标记的重组E3酶多肽的表达诱导

在37℃下，将上述(2-1)所述的使用pET-E3-His转化的大肠杆菌BL21(DE3)转化体在50mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中培养一夜。然后将20mL上述培养液加入1L含有相同浓度氨苄青霉素的液体LB培养基中，在37℃下预培养3小时(直到OD在660nm变为约0.4)，加入IPTG(异丙基-p-硫代半乳糖吡喃糖苷；Wako Pure Chemical Industries)使最终浓度为0.5mM，在37℃下振荡培养4小时。由此来诱导带有His标记的重组E3酶多肽在大肠杆菌内的表达。使用Avanti HP25(beckman coulter)对进行了表达诱导的大肠杆菌离心分离(6000rpm 4℃15分钟)，收集细胞。之后使细胞悬浊于25ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0；以后记为缓冲液A)中，所述磷酸钾缓冲液含有1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)、2mM DTT(和光纯药工业株式会社)、5mM连二亚硫酸钠(和光纯药工业株式会社)，离心分离(6000rpm 4℃10分钟)后以该状态在-80℃下保存。

(2-3-2)菌裂解液的调制

将上述(2-3-1)中保存的细胞解冻后，离心(10,000xg 15min)，加入25ml新缓冲液A使其悬浊。使用FastPrep(R)(ThermoELECTRON CORPORATION)对上述重复悬浊液以6500rpm处理20秒-冰冷3分钟，将上述操作重复3次，由此破碎细胞。离心(10000X g，15min)所得的细胞破碎液，分离其上清液，得到菌裂解液。

(2-3-3)带有His标记的重组E3酶多肽的亲和纯化

在以下所示的纯化条件下，将上述(2-3-3)中得到的4mL菌裂解液用于作为带有His标记的融合蛋白质纯化用柱的HisTrap HP(GEHealthcare Bioscience)来纯化带有His标记的重组E3酶。测定280nm处蛋白质的吸收。另外，当旁路级分在280nm处的吸收降到基线时开始使用级分收集器收集级分。

流速：1ml/min

级分：2ml/2min/级分

洗脱液A：0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7)/0.5M NaCl/1％isoPrOH

洗脱液B：含有0.5M咪唑的洗脱液A

结果确认了No.7～9级分具有E3合成活性。将多个由纯化得到的活性级分合并后，加入丙三醇使其浓度为8％，在-28℃下保存，在用于实验时解冻。

实施例D2 使用带有His标记的重组E1及E2酶由黄豆苷元向四氢黄豆苷元的合成

以在上述实施例D1(2-2-3)中得到的带有His标记的重组E1酶及E2酶为酶源，调制下述组成的酶反应液，在37℃下反应2小时，由此由黄豆苷元合成四氢黄豆苷元。另外，同时分别以带有His标记的重组E1、E2酶单独作为酶源进行反应。

酶反应液组成

温育后，在所得的酶反应液中加入3mL乙酸乙酯(和光纯药)进行提取处理，干燥后，用流动相(洗脱液)溶解。使用HPLC分析溶解产物，由此测定酶反应液中顺式-四氢黄豆苷元及反式-四氢黄豆苷元的含量。

使用黄豆苷元(Funakoshi Corporation)、雌马酚(FunakoshiCorporation)、二氢黄豆苷元(Trend Research Chemicals Inc.)、顺式-四氢黄豆苷元(参考例B1)、反式-四氢黄豆苷元(参考例B1)的混合溶液(各2μg/mL)作为HPLC分析的标准溶液。

HPLC分析结果示于图23。结果显示，使用带有His标记的重组E1酶及E2酶的混合物作为酶源时，其产物中存在顺式-四氢黄豆苷元及反式-四氢黄豆苷元。但是，单独使用带有His标记的重组E1酶或带有His标记的重组E2酶作为酶源时，其产物中不存在顺式-四氢黄豆苷元及反式-四氢黄豆苷元。

实施例D3 使用带有His标记的重组E2及E3酶由二氢黄豆苷元合成雌马酚

以在上述实施例D1(2-2-3)及(2-3-3)中得到的带有His标记的重组E2及E3酶作为酶源，调制下述组成的酶反应液，在37℃下反应2小时来由二氢黄豆苷元合成雌马酚。另外，同时分别以带有His标记的重组E2、E3酶单独作为酶源进行反应。

酶反应液组成

温育后，在所得的酶反应液中加入3mL乙酸乙酯(和光纯药)进行提取处理，干燥后，用流动相(洗脱液)溶解。使用HPLC分析溶解产物来测定酶反应液中雌马酚的含量。

HPLC分析结果示于图24。结果显示，使用带有His标记的重组E2酶及E3酶的混合物作为酶源时，其产物中存在雌马酚。但是，单独使用带有His标记的重组E2酶或带有His标记的重组E3酶作为酶源时，其产物中不存在雌马酚。

实施例D4 使用带有His标记的重组E1酶、E2酶及E3酶由黄豆苷元合成雌马酚

以在上述实施例D1(2-2-3)及(2-3-3)中得到的带有His标记的重组E1酶、E2及E3酶为酶源，调制下述组成的酶反应液，在37℃下反应2小时，由此由黄豆苷元合成雌马酚。另外，同时进行作为酶源分别单独使用带有His标记的重组E1酶、E2酶及E3酶的反应。

酶反应液组成

温育后，在所得的酶反应液中加入3mL乙酸乙酯(和光纯药)进行提取处理，干燥后，用流动相(洗脱液)溶解。使用HPLC分析溶解产物，由此测定酶反应液中雌马酚的含量。

HPLC分析结果示于图25。结果显示，单独使用各带有His标记的重组酶作为酶源时，其产物中不存在雌马酚。但是，使用带有His标记的重组E1酶、E2酶及E3酶的混合物作为酶源时，其产物中存在雌马酚。

实施例E金属离子对带有His标记的重组E1酶的二氢黄豆苷元合成活性的影响

使用由Ni-Sepharose纯化的在大肠杆菌中表达的带有His标记的重组E1酶(E1-His)作为酶源，研究金属离子对由黄豆苷元向二氢黄豆苷元转换的转换活性的影响。使用蒸馏水溶解各种金属(MnCl₂·2H₂O、FeSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、Zn(CH₃COO)₂·2H₂O、CoSO₄·7H₂O、MgSO₄·7H₂O、NiSO₄·6H₂O)使其浓度为100mM。使用金属离子溶液调制下述组成的酶反应液，在37℃下温育1小时测定活性。

酶反应液组成

温育后，在所得的酶反应液中加入3mL乙酸乙酯进行提取处理，干燥后，用流动相(洗脱液)溶解。使用HPLC分析溶解产物来测定酶反应液中黄豆苷元和二氢黄豆苷元的含量。实验结果显示，Mn²⁺、Fe²⁺具有活性促进作用(图26)。

附图说明

[图1]表示实施例A1中HPLC分析结果。图1中，上面三个色谱图为对照(未添加辅酶)、加入NADH作为辅酶、加入NADPH作为辅酶时得到的酶反应产物的HPLC分析结果。另外，图1中，下面柱形图为表示对照(未添加辅酶)、加入NADH作为辅酶、加入NADPH作为辅酶时相当于二氢黄豆苷元峰面积的图。

[图2]表示实施例A2中进行的Mono Q HPLC的结果(图2上部)和各级分中二氢黄豆苷元合成酶的活性(图2下部)。酶活性以由黄豆苷元为底物生成的二氢黄豆苷元的峰面积来表示。

[图3]表示实施例A2中进行的SDS-PAGE的结果(图3中左部)和各级分中二氢黄豆苷元合成酶的活性(图3右部)。酶活性以由黄豆苷元为底物生成的二氢黄豆苷元的峰面积来表示。SDS-PAGE中使用市售的凝胶板(SuperSep^TM10-20％(和光纯药工业株式会社))。

[图4]表示实施例A4中进行肽作图的结果及相当于各峰的肽的氨基酸序列。图4中，上部HPCL分析图内所示的箭头

的序号分别表示1：FDEPVYPQAE、2：ASRMVMDAVHEGYIAG、3：GYIGNLEVENRAIRMPM所示的肽。

[图5]表示实施例A5中进行的兼并PCR产物的琼脂糖电泳结果。(1)E1-N-terminal-31和E1-internal-RP1，(2)E1-N-terminal-37和E1-internal-RP1，(3)E1-N-terminal-F32和E1-internal-RP1，markerM1：λ/Styl，M2：100bp Ladder

[图6]表示实施例A7中进行的RT-PCR产物的琼脂糖电泳的结果。上图为二氢黄豆苷元合成酶，下图为核糖体RNA。

[图7]表示实施例A8中进行的SDS-PAGE的结果。

[图8]表示实施例A8中进行的HPLC分析的结果。上图表示对照，中图表示pET-E1-His，下图表示pET21a。

[图9]表示实施例1中HPLC分析的结果。图9中，上图表示顺式-四氢黄豆苷元(REF-000312)的HPLC分析结果；中图表示使用二氢黄豆苷元为底物，以菌破碎物为酶源得到的酶反应产物的HPLC分析结果；下图表示反式-四氢黄豆苷元(REF-000313)的HPLC分析结果。

[图10]表示实施例B 1中HPLC分析结果。图10中，上面两图表示以顺式-四氢黄豆苷元(REF-000312)为底物，以菌破碎物为酶源得到的酶反应产物的HPLC分析结果；下面两图表示以反式-四氢黄豆苷元(REF-000313)为底物，以菌破碎物为酶源得到的酶反应产物的HPLC分析结果。

[图11]表示实施例B2中HPLC分析结果。图11中，上面三个图为对照(未添加辅酶)、加入NADH作为辅酶、加入NADPH作为辅酶时得到的酶反应产物的HPLC分析结果。另外，图11中，下面柱形图为表示对照(未添加辅酶)、加入NADH作为辅酶、加入NADPH作为辅酶时与四氢黄豆苷元相当的峰面积的图。

[图12]表示实施例B3中凝胶过滤HPLC分析结果。图12中，上图为标准蛋白质的凝胶过滤HPLC分析结果；中图为以与生成的四氢黄豆苷元相当的峰面积表示各级分的酶活性的图；下图表示与各级分的蛋白质相当的吸收(280nm)强度。

[图13]表示实施例B3中进行SDS-PAGE的结果。

[图14]表示实施例B4中进行SDS-PAGE的结果。

[图15]表示实施例B5中确定的二氢黄豆苷元合成(E1)酶基因的周边基因组结构的示意图。

[图16-1]表示实施例B6中由LC-MS分析得到的数据及由此推定的消化肽氨基酸序列的一个例子。图16-1中以L表示的氨基酸残基与说明书中以X表示的氨基酸残基相同。上图为关于肽：TPGVAASVADEXK的图。下图为关于肽：MPGAPVFGK的图。

[图16-2]表示实施例B6中由LC-MS分析得到的数据及由此推定的消化肽氨基酸序列的一个例子。图16-2中以L表示的氨基酸残基与说明书中X表示的氨基酸残基相同。上图为关于肽：KXXXTGTTK的图。下图为关于肽：VTQEXXCAHGAFVCGSGR的图。

[图16-3]表示实施例B6中由LC-MS分析得到的数据及由此及推定的消化肽氨基酸序列的一个例子(WXSPEESVGQR)。图16-3中以L表示的氨基酸残基与说明书中以X表示的氨基酸残基相同。

[图17]表示实施例B7中HPLC分析结果。图17中，上部的左边2图表示以二氢黄豆苷元为底物，以使ORF-US2多肽表达的反应液为酶源得到的酶反应产物的HPLC分析结果(ORF-US2)；上部的右两图表示以不使蛋白质合成的反应液为酶源得到的酶反应产物的HPLC分析结果(NC)。另外，图17中，下部柱形图为表示以NC(无蛋白质合成)、DHFR(二氢叶酸还原酶表达反应液)、ORF-US2(ORF-US2多肽表达反应液)为酶源进行酶反应时与酶反应中的DD(二氢黄豆苷元)及THD(四氢黄豆苷元)相当的峰面积的图。

[图18]表示实施例B8中进行SDS-PAGE的结果。

[图19]表示实施例B8中HPLC分析结果。图19中，上面两个图中的上图表示以二氢黄豆苷元为底物，以来自表达重组ORF-US2多肽的质粒pET21-US2的转化体的菌破碎液为酶源，得到的酶反应产物的HPLC分析结果(pET21-US2)。图19中，上面两个图中的下图表示以二氢黄豆苷元为底物，以来自作为阴性对照的pET21a转化体的菌破碎液为酶源，得到的酶反应产物的HPLC分析结果(pET21a)。另外，图19中，下部柱形图为表示以来自使ORF-US2多肽表达的反应液或pET21a转化体衍生的菌破碎液为酶源，进行酶反应时与酶反应中的二氢黄豆苷元(DD)及顺式-(c-THD)及反式-四氢黄豆苷元(t-THD)相当的峰面积的图。

[图20]表示实施例C 1中HPLC分析的结果。

[图21]表示实施例C2中进行的SDS-PAGE的结果。

[图22]表示实施例C3中进行的HPLC分析的结果。上图为标准，中图为pET-US3，下图为pET21a。

[图23]表示实施例D2中进行的HPLC分析结果。最上图为标准，上面第二图为E1及E2，上面第三图为E1，最下图为E2。

[图24]表示实施例D3中进行的HPLC分析的结果。最上图为标准，上面第二图为E2及E3，上面第三图为E2，最下图为E3。

[图25]表示实施例D4中进行的HPLC分析结果。最上图为标准，上面第二图为E1、E2及E3，上面第三图为E1，上面第四图为E2，最下图为E3。

[图26]表示金属离子对E1酶的影响。

[图27]表示序列号1、2及3所示的氨基酸序列的比对。

[图28]表示序列号7、8及9所示的氨基酸序列的比对。

[图29]表示序列号13、14及15所示的氨基酸序列的比对。

序列表自由文本

序列号23表示引物E1-N-terminal-31的碱基序列。

序列号24表示引物E1-N-terminal-37的碱基序列。

序列号25表示引物E1-N-terminal-F32的碱基序列。

序列号26表示引物E1-internal-RP1的碱基序列。

序列号27表示引物pUC19-FP-1的碱基序列。

序列号28表示引物pUC19-RP-1的碱基序列。

序列号29表示引物pUC19-FP-2的碱基序列。

序列号30表示引物pUC19-RP-2的碱基序列。

序列号31表示引物E1-RACE-N-P1的碱基序列。

序列号32表示引物E1-RACE-RP2-1的碱基序列。

序列号33表示引物E1-RACE-N-P2的碱基序列。

序列号34表示引物E1-RACE-RP2-2的碱基序列。

序列号35表示引物E1-conf-NP的碱基序列。

序列号36表示引物E1-conf-CP的碱基序列。

序列号37表示引物E1-FP的碱基序列。

序列号38表示引物E1-RP的碱基序列。

序列号39表示引物Gar-16S-Ribo-FP的碱基序列。

序列号40表示引物Gar-16S-Ribo-RP的碱基序列。

序列号41表示引物exp.E1 pet F Nde的碱基序列。

序列号42表示引物exp.E1 pet His的碱基序列。

序列号43表示引物RACE-N-P3-1的碱基序列。

序列号44表示引物RACE-N-P3-2的碱基序列。

序列号45表示引物E1-Bub-N-P1的碱基序列。

序列号46表示引物E1-Bub-N-P2的碱基序列。

序列号47表示引物RACE-C-P3-1的碱基序列。

序列号48表示引物RACE-C-P3-2的碱基序列。

序列号49表示引物E1-Bub-C-P1的碱基序列。

序列号50表示引物E1-Bub-C-P2的碱基序列。

序列号57表示引物E2-invitroTS-FP的碱基序列。

序列号58表示引物E2-invitroTS-RP的碱基序列。

序列号59表示引物通用引物的碱基序列。

序列号60表示引物exp.US2 pet F Nde的碱基序列。

序列号61表示引物exp.US2 pet的碱基序列。

序列号62表示引物exp.US3 F的碱基序列。

序列号63表示引物exp.US3 R的碱基序列。

序列号64表示引物exp.US1 F的碱基序列。

序列号65表示引物exp.US1 R的碱基序列。

序列号66表示引物exp.DS1 F的碱基序列。

序列号67表示引物exp.DS1 R的碱基序列。

Claims

1.一种多肽，所述多肽具有以四氢黄豆苷元为底物合成雌马酚的活性。

2.如权利要求1所述的多肽，所述多肽的最适温度在23℃～37℃。

3.如权利要求1或2所述的多肽，所述多肽的最适pH为4.5。

4.如权利要求1～3中任一项所述的多肽，所述多肽通过SDS-PAGE测定的分子量约为52kDa。

5.如权利要求1～4中任一项所述的多肽，所述多肽为来自拟杆菌、链球菌、或乳球菌的多肽。

6.如权利要求1～5中任一项所述的多肽，所述多肽为由序列号13所示的氨基酸序列组成的多肽、由序列号14所示的氨基酸序列组成的多肽或由序列号15所示的氨基酸序列组成的多肽。

7.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1～6中任一项所述的多肽。

8.如权利要求7所述的多核苷酸，所述多核苷酸为由序列号16所示的核苷酸序列组成的多核苷酸、由序列号17所示的核苷酸序列组成的多核苷酸、或由序列号18所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。

9.一种表达载体，所述表达载体含有权利要求7或8所述的多核苷酸。

10.一种重组细胞，所述重组细胞是由权利要求9所述的表达载体转化得到的。

11.一种多肽的制备方法，所述制备方法包括培养权利要求10所述的细胞，得到具有以四氢黄豆苷元为底物生成雌马酚活性的多肽的步骤。

12.一种雌马酚的制备方法，所述制备方法包括使权利要求10所述的细胞作用于四氢黄豆苷元的步骤。

13.一种抗体，所述抗体与权利要求1～6中任一项所述的多肽具有亲和性。

14.一种雌马酚合成用试剂盒，所述试剂盒含有权利要求10所述的细胞、及四氢黄豆苷元。