KR101265400B1 - 에쿠올 합성에 관여하는 효소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 에쿠올 합성에 관여하는 효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자 및 이들을 이용하여 에쿠올 및 그의 중간체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 디히드로다이드제인 합성 효소, 테트라히드로다이드제인 합성 효소 및 에쿠올 합성 효소, 및 이들을 코딩하는 유전자를 제공한다. 또한, 이들 효소를 이용하여 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올을 합성하는 방법을 제공한다.

Description

에쿠올 합성에 관여하는 효소 {ENZYME INVOLVED IN SYNTHESIS OF EQUOL}
본 발명은 다이드제인(daidzein)을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 이들 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 이용한 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및 에쿠올의 제조 방법, 및 그것에 이용되는 제조 장치에 관한 것이고, 이들에 관련된 기술을 제공한다.
종래 이소플라본 유도체는 생리학적 또는 약학적으로 다양한 효능이 있다고 생각되었고, 식품 원료나 의약품 원료로서 이용되고 있다. 그러나, 이소플라본 유도체에 관한 기능이 해명됨에 따라서, 종래 믿어졌던 바와 같이 이소플라본 유도체만이 에스트로겐과 같은 효과를 나타내는 것은 아니고, 각종 장내 세균에 의해 이들 유도체가 균체 내에서 대사(생합성)된 후에, 보다 강한 에스트로겐과 같은 작용을 갖는 에쿠올이 생산되고, 이 에쿠올이 균체 밖으로 방출된 후 장관으로부터 흡수됨으로써 에스트로겐 작용을 전신적으로 발휘하고 있는 것으로 보고되기에 이르렀다. 또한, 모든 사람에게 장 내에서 에쿠올을 생산하는 능력이 있는 것은 아니고, 에쿠올 생산능은 사람에 따라서 개인차가 있다. 예를 들면, 장 내에 에쿠올 생산균을 가지고 있지 않은 사람이나 장 내에 에쿠올 생산균을 가지고 있더라도 그 에쿠올 생산능이 낮은 사람도 있다.
따라서, 에쿠올을 체 내에서 유효하게 이용시키는 것은, 고령화 사회를 맞이한 일본 등에서는 특히 골다공증을 대표로 하는 만성 노인성 질환에 대한 대응면에서도 중요하다. 또한, 상술한 바와 같이 에쿠올 생산 장내 세균을 내재하고 있는 사람과 내재하고 있지 않은 사람이 존재한다고 하는 현실을 고려하면, 에쿠올의 효율적인 인적 생산을 염두에 두고, 그 재료의 제조에 대해서도 관심을 가져야만 한다.
이러한 배경하에 에쿠올 합성 원료의 공급이라는 면에서 상기 생합성 경로에 관계하는 효소의 동정 및 그의 이용은 매우 중요하다. 그러나, 이들 생합성 경로에서 관련되는 몇몇 중간 생성물을 생산 또는 촉매하는 효소에 관한 정보는 전혀 없으므로, 관련 효소의 동정이 요망되었다.
일본 특허 공개 제2006-296434호 공보
본 발명은 에쿠올 합성의 원료가 되는 디히드로다이드제인 합성에 관련되는 효소를 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로는 본 발명은 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리펩티드를 이용한 디히드로다이드제인의 합성에 관한 기술 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 에쿠올 합성의 원료가 되는 테트라히드로다이드제인 합성에 관련되는 효소를 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로는 본 발명은 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리펩티드를 이용한 테트라히드로다이드제인의 합성에 관한 기술 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 에쿠올 합성에 관련되는 효소를 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로는, 본 발명은 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리펩티드를 이용한 에쿠올의 합성에 관한 기술 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 때에 생성되는 디히드로다이드제인이나 테트라히드로다이드제인이라는 중간체의 제조 방법, 및 얻어진 중간체를 이용할 수 있는 에쿠올의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 이들 제조에 이용되는 제조 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 노력을 거듭한 결과, 에쿠올 생산 장내 세균으로부터 에쿠올 합성의 원료가 되는 디히드로다이드제인을 합성할 수 있는 효소, 테트라히드로다이드제인을 합성할 수 있는 효소 및 에쿠올을 합성할 수 있는 효소를 단리하여, 이들의 구조를 밝히는 것에 성공하였다. 또한, 본원 발명자들은 한층 더 연구를 거듭하여, 상기 효소를 이용하여 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인, 에쿠올을 인위적으로 제조하는 것에 성공하였다. 본 발명은 이러한 발견에 기초하여 더욱 개량을 거듭함으로써 완성한 것이다.
즉, 본 발명은 하기에 게시된 양태의 발명을 제공한다:
항 A1. 이하의 (Aa) 내지 (Ac) 중 어느 하나인 폴리펩티드:
(Aa) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Ab) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Ac) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
항 A2. 이하의 (Ad) 내지 (Af) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드:
(Ad) 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Ae) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Af) 상기 (Ad) 또는 (Ae)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
항 A3. 항 A2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
항 A4. 항 A3에 기재된 발현 벡터에 의해서 형질 전환된 재조합 세포.
항 A5. 재조합 세포가 세균성 원핵 세포인, 항 A4에 기재된 재조합 세포.
항 A6. 세균성 원핵 세포가 락토코커스속에 속하는 것인, 항 A5에 기재된 재조합 세포.
항 A7. 항 A4 내지 A6 중 어느 한 항에 기재된 세포를 배양하고, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 얻는 공정을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
항 A8. 항 A7에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드.
항 A9. 다이드제인에 대하여 항 A1 또는 A8에 기재된 폴리펩티드, 및 NADPH 및/또는 NADH를 작용시키는 공정을 포함하는 디히드로다이드제인의 제조 방법.
항 A10. 다이드제인에 항 A4 내지 A6 중 어느 한 항에 기재된 세포를 작용시키는 공정을 포함하는 디히드로다이드제인의 제조 방법.
항 A11. 항 A1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 A2에 기재된 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드에 결합성을 갖는 항체.
항 A12. 항 A11에 기재된 항체를 피검 시료에 접촉시키는 공정을 포함하는, 항 A1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 A2에 기재된 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드를 검출 또는 측정하는 면역학적 방법.
항 A13. 검출 또는 측정 대상이 되는 폴리펩티드가 세균성 원핵 세포 내에 존재하는 것인, 항 A12에 기재된 방법.
항 A14. 항 A1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 A2에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브.
항 A15. 항 A1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 A2에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머.
항 A16. 항 A14에 기재된 프로브를 이용하여 항 A1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 A2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 측정하는 방법.
항 A17. 검출 또는 측정 대상이 되는 폴리펩티드가 세균성 원핵 세포 내에 존재하는 것인, 항 A16에 기재된 방법.
항 A18. 항 A1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 항 A2에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 일부를 PCR에 의해 증폭시키는 공정을 포함하는, 항 A16에 기재된 방법.
항 A19. 항 A1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 A2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 디히드로다이드제인 합성 효소 조성물.
항 A20. NADPH 및/또는 NADH를 더 포함하는, 항 A19에 기재된 조성물.
항 A21. (Ai) 항 A1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 A2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드, (Aii) NADPH 및/또는 NADH, 및 (Aiii) 다이드제인을 함유하는 것을 특징으로 하는 디히드로다이드제인 합성 원료 조성물.
항 A22. (Aiv) 항 A4 내지 A6 중 어느 한 항에 기재된 세포 및 (Aiii) 다이드제인을 함유하는 것을 특징으로 하는 디히드로다이드제인 합성 원료 조성물.
항 A23. (Ai) 항 A1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 A2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드, (Aii) NADPH 및/또는 NADH, 및 (Aiii) 다이드제인을 포함하는 디히드로다이드제인 합성용 키트.
항 A24. (Aiv) 항 A4 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 세포 및 (Aiii) 다이드제인을 포함하는 디히드로다이드제인 합성용 키트.
항 A25. 적어도 항 A11에 기재된 항체를 포함하는, 항 A1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 A2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드를 측정하기 위한 면역학적 측정용 키트.
항 A26. 적어도 항 A15에 기재된 프라이머를 포함하는, 항 A1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 A2에 기재된 폴리뉴클레오티드의 검출용 PCR용 키트.
항 A27. 항 A1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 A2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포의 동정용인, 항 A26에 기재된 동정용 키트.
항 A28. PCR용 키트인, 항 A27에 기재된 동정용 키트.
항 A29. 항 A1에 기재된 폴리펩티드로 이루어지는 디히드로다이드제인 합성 효소.
항 B1. 이하의 (Ba) 내지 (Bc) 중 어느 하나인 폴리펩티드:
(Ba) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Bb) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Bc) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
항 B2. 이하의 (Bd) 내지 (Bf) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드:
(Bd) 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Be) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Bf) 상기 (Bd) 또는 (Be)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
항 B3. 항 B2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
항 B4. 항 B3에 기재된 발현 벡터에 의해서 형질 전환된 재조합 세포.
항 B5. 재조합 세포가 세균성 원핵 세포인, 항 B4에 기재된 재조합 세포.
항 B6. 세균성 원핵 세포가 락토코커스속에 속하는 것인, 항 B5에 기재된 재조합 세포.
항 B7. 항 B4 내지 B6 중 어느 한 항에 기재된 세포를 배양하고, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 얻는 공정을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
항 B8. 항 B7에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드.
항 B9. 디히드로다이드제인에 대하여 항 B1 또는 B8에 기재된 폴리펩티드, 및 NADPH 및/또는 NADH를 작용시키는 공정을 포함하는 테트라히드로다이드제인의 제조 방법.
항 B10. 디히드로다이드제인에 항 B4 내지 B6 중 어느 한 항에 기재된 세포를 작용시키는 공정을 포함하는 테트라히드로다이드제인의 제조 방법.
항 B11. 항 B1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 B2에 기재된 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드에 결합성을 갖는 항체.
항 B12. 항 B11에 기재된 항체를 피검 시료에 접촉시키는 공정을 포함하는, 항 B1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 B2에 기재된 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드를 검출 또는 측정하는 면역학적 방법.
항 B13. 검출 또는 측정 대상이 되는 폴리펩티드가 세균성 원핵 세포 내에 존재하는 것인, 항 B12에 기재된 방법.
항 B14. 항 B1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 B2에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브.
항 B15. 항 B1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 B2에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머.
항 B16. 항 B14에 기재된 프로브를 이용하여 항 B1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 B2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 측정하는 방법.
항 B17. 검출 또는 측정 대상이 되는 폴리펩티드가 세균성 원핵 세포 내에 존재하는 것인, 항 B16에 기재된 방법.
항 B18. 항 B1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 항 B2에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 이들 일부를 PCR에 의해 증폭시키는 공정을 포함하는, 항 B16에 기재된 방법.
항 B19. 항 B1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 B2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 테트라히드로다이드제인 합성 효소 조성물.
항 B20. NADPH 및/또는 NADH를 더 포함하는, 항 B19에 기재된 조성물.
항 B21. (Bi) 항 B1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 B2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드, (Bii) NADPH 및/또는 NADH, 및 (Biii) 디히드로다이드제인을 함유하는 것을 특징으로 하는 테트라히드로다이드제인 합성 원료 조성물.
항 B22. (Biv) 항 B4 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 세포 및 (Biii) 디히드로다이드제인을 함유하는 것을 특징으로 하는 테트라히드로다이드제인 합성 원료 조성물.
항 B23. (Bi) 항 B1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 B2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드, (Bii) NADPH 및/또는 NADH, 및 (Biii) 디히드로다이드제인을 포함하는 테트라히드로다이드제인 합성용 키트.
항 B24. (Biv) 항 B4 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 세포 및 (Biii) 디히드로다이드제인을 포함하는 테트라히드로다이드제인 합성용 키트.
항 B25. 적어도 항 B11에 기재된 항체를 포함하는, 항 B1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 B2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드를 측정하기 위한 면역학적 측정용 키트.
항 B26. 적어도 항 B15에 기재된 프라이머를 포함하는, 항 B1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 B2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 검출용 PCR용 키트.
항 B27. 항 B1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 B2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포의 동정용인, 항 B26에 기재된 동정용 키트.
항 B28. PCR용 키트인, 항 B27에 기재된 동정용 키트.
항 B29. 항 B1에 기재된 폴리펩티드로 이루어지는 테트라히드로다이드제인 합성 효소.
항 C1. 이하의 (Ca) 내지 (Cc) 중 어느 하나인 폴리펩티드:
(Ca) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Cb) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Cc) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
항 C2. 이하의 (Cd) 내지 (Cf) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드:
(Cd) 서열 번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Ce) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Cf) 상기 (Cd) 또는 (Ce)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
항 C3. 항 C2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
항 C4. 항 C3에 기재된 발현 벡터에 의해서 형질 전환된 재조합 세포.
항 C5. 재조합 세포가 세균성 원핵 세포인, 항 C4에 기재된 재조합 세포.
항 C6. 세균성 원핵 세포가 락토코커스속에 속하는 것인, 항 C5에 기재된 재조합 세포.
항 C7. 항 C4 내지 C6 중 어느 한 항에 기재된 세포를 배양하고, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 얻는 공정을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
항 C8. 항 C7에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드.
항 C9. 테트라히드로다이드제인에 대하여 항 C1 또는 C8에 기재된 폴리펩티드를 작용시키는 공정을 포함하는 에쿠올의 제조 방법.
항 C10. 테트라히드로다이드제인에 항 C4 내지 C6 중 어느 한 항에 기재된 세포를 작용시키는 공정을 포함하는 에쿠올의 제조 방법.
항 C11. 항 C1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 C2에 기재된 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드에 결합성을 갖는 항체.
항 C12. 항 C11에 기재된 항체를 피검 시료에 접촉시키는 공정을 포함하는, 항 C1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 C2에 기재된 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드를 검출 또는 측정하는 면역학적 방법.
항 C13. 검출 또는 측정 대상이 되는 폴리펩티드가 세균성 원핵 세포 내에 존재하는 것인, 항 C12에 기재된 방법.
항 C14. 항 C1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 C2에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브.
항 C15. 항 C1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 C2에 기재된 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머.
항 C16. 항 C14에 기재된 프로브를 이용하여 항 C1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 C2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 측정하는 방법.
항 C17. 검출 또는 측정 대상이 되는 폴리펩티드가 세균성 원핵 세포 내에 존재하는 것인, 항 C16에 기재된 방법.
항 C18. 항 C1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 항 C2에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 이들 일부를 PCR에 의해 증폭시키는 공정을 포함하는, 항 C16에 기재된 방법.
항 C19. 항 C1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 C2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 에쿠올 합성 효소 조성물.
항 C20. (Ci) 항 C1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 C2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드 및 (Cii) 테트라히드로다이드제인을 함유하는 것을 특징으로 하는 에쿠올 합성 원료 조성물.
항 C21. (Ciii) 항 C4 내지 C6 중 어느 한 항에 기재된 세포 및 (Cii) 테트라히드로다이드제인을 함유하는 것을 특징으로 하는 에쿠올 합성 원료 조성물.
항 C22. (Ci) 항 C1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 C2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드 및 (Cii) 테트라히드로다이드제인을 포함하는 에쿠올 합성용 키트.
항 C23. (Ciii) 항 C4 내지 C6 중 어느 한 항에 기재된 세포 및 (Cii) 테트라히드로다이드제인을 포함하는 에쿠올 합성용 키트.
항 C24. 적어도 항 C11에 기재된 항체를 포함하는, 항 C1에 기재된 폴리펩티드 또는 항 C2의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드를 측정하기 위한 면역학적 측정용 키트.
항 C25. 적어도 항 C15에 기재된 프라이머를 포함하는, 항 C1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 C2에 기재된 폴리뉴클레오티드의 검출용 PCR용 키트.
항 C26. 항 C1에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 항 C2에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포의 동정용인, 항 C25에 기재된 동정용 키트.
항 C27. PCR용 키트인, 항 C26에 기재된 동정용 키트.
항 C28. 항 C1에 기재된 폴리펩티드로 이루어지는 에쿠올 합성 효소.
항 D1. 이하의 (제1 공정) 및 (제2 공정)을 포함하는 테트라히드로다이드제인의 제조 방법:
(제1 공정) 다이드제인에 이하의 (Aa) 내지 (Ac) 중 어느 하나인 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 및 NADPH 및/또는 NADH를 작용시킴으로써 디히드로다이드제인을 생성하는 공정;
(Aa) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Ab) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Ac) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(제2 공정) 디히드로다이드제인에 이하의 (Ba) 내지 (Bc) 중 어느 하나인 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 및 NADPH 및/또는 NADH를 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 생성하는 공정;
(Ba) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Bb) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Bc) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
항 D2. 항 D1에 기재된 방법에 의해 제조된 테트라히드로다이드제인을 함유하는 생성물.
항 D3. 이하의 (제2 공정) 및 (제3 공정)을 포함하는 에쿠올의 제조 방법:
(제2 공정) 디히드로다이드제인에 이하의 (Ba) 내지 (Bc) 중 어느 하나인 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 및 NADPH 및/또는 NADH를 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 생성하는 공정;
(Ba) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Bb) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Bc) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(제3 공정) 테트라히드로다이드제인에 이하의 (Ca) 내지 (Cc) 중 어느 하나인 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 및 NADPH 및/또는 NADH를 작용시킴으로써 에쿠올을 제조하는 공정,
(Ca) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Cb) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Cc) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
항 D4. 항 D3에 기재된 방법에 의해 제조된 에쿠올을 함유하는 생성물.
항 D5. (제1 공정) 내지 (제3 공정)을 포함하는 에쿠올의 제조 방법.
항 D6. 항 D5에 기재된 방법에 의해 제조된 에쿠올을 함유하는 생성물.
항 D7. 이하의 (Ad) 내지 (Af), (Bd) 내지 (Bf) 및 (Cd) 내지 (Cf)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터:
(Ad) 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Ae) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Af) 상기 (Ad) 또는 (Ae)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Bd) 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Be) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Bf) 상기 (Bd) 또는 (Be)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Cd) 서열 번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Ce) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Cf) 상기 (Cd) 또는 (Ce)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
항 D8. 항 D7에 기재된 발현 벡터에 의해서 형질 전환된 재조합 세포.
항 D9. 재조합 세포가 세균성 원핵 세포인, 항 D8에 기재된 재조합 세포.
항 D10. 세균성 원핵 세포가 락토코커스속에 속하는 것인, 항 D9에 기재된 재조합 세포.
항 D11. 이하의 (제4 공정) 내지 (제6 공정) 중 적어도 2개의 공정을 포함하는, 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조 방법:
(제4 공정) (Ad) 내지 (Af) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 다이드제인을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 디히드로다이드제인을 생성시키는 공정,
(Ad) 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Ae) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Af) 상기 (Ad) 또는 (Ae)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(제5 공정) (Bd) 내지 (Bf) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 디히드로다이드제인을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 테트라히드로다이드제인을 생성시키는 공정,
(Bd) 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Be) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Bf) 상기 (Bd) 또는 (Be)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(제6 공정) (Cd) 내지 (Cc) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 테트라히드로다이드제인을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 에쿠올을 생성시키는 공정,
(Cd) 서열 번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Ce) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Cf) 상기 (Cd) 또는 (Ce)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
여기서, (Ad) 내지 (Af), (Bd) 내지 (Bf) 및 (Cd) 내지 (Cf)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 2개가 하나의 재조합 세포 내에 있을 수도 있다.
항 D12. 재조합 세포가 세균성 원핵 세포인, 항 D11에 기재된 제조 방법.
항 D13. 세균성 원핵 세포가 락토코커스속에 속하는 것인, 항 D12에 기재된 제조 방법.
항 D14. 항 D11 내지 C13 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올을 함유하는 생성물.
항 D15. 이하의 (제1 반응조) 내지 (제3 반응조) 중 적어도 1개의 반응조를 구비하는 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조 장치:
(제1 반응조) (Aa) 내지 (Ac) 중 어느 하나인 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 고정되어 있는 반응 수단을 가지고, 상기 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 이용하여 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 반응조 내의 다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음;
(제2 반응조) (Ba) 내지 (Bc) 중 어느 하나인 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 고정되어 있는 반응 수단을 가지고, 상기 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 이용하다 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 반응조 내의 디히드로다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음;
(제3 반응조) (Ca) 내지 (Cc) 중 어느 하나인 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 고정되어 있는 반응 수단을 가지고, 상기 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 이용하여 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 반응조 내의 테트라히드로다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음;
여기서, 상기 반응 수단 중 적어도 2개는 하나의 반응조에 함께 존재할 수도 있음.
항 D16. 이하의 (제4 반응조) 내지 (제6 반응조) 중 적어도 1개의 반응조를 구비하는, 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조 장치:
(제4 반응조) (Ad) 내지 (Af) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포가 고정되어 있는 반응 수단을 가지고, 상기 반응 수단을 이용하여 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 반응조 내의 다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음;
(제5 반응조) (Bd) 내지 (Bf) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포가 고정되어 있는 반응 수단을 가지고, 상기 반응 수단을 이용하여 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 반응조 내의 디히드로다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음;
(제6 반응조) (Cd) 내지 (Cf) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포가 고정되어 있는 반응 수단을 가지고, 상기 반응 수단을 이용하여 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 반응조 내의 테트라히드로다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음;
여기서, 상기 반응 수단 중 적어도 2개가 하나의 반응조에 함께 존재할 수도 있음.
본 발명의 폴리펩티드에 따르면, (1) 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 것, (2) 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 것, 및 (3) 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 때에 출현할 수 있는 중간체인 디히드로다이드제인 및/또는 테트라히드로다이드제인의 공업적인 합성, 또한 에쿠올의 공업적인 합성을 실현하기 위해서 유용하다. 종래 에쿠올 생산균에 대해서는 취급이 곤란한 혐기성 균주밖에 발견되지 않았지만, 본 발명에 의해서 종래의 에쿠올 생산균을 사용하지 않고도 에쿠올의 공업적 제조로의 길이 열린다.
본 명세서에서의 아미노산, 폴리펩티드, 염기 서열, 핵산 등의 약호에 의한 표시는 IUPAC-IUB의 규정[IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)], 「염기 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 명세서 등의 작성을 위한 가이드라인」(특허청편) 및 상기 분야에서의 관용 기호에 따르는 것으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
A: 디히드로다이드제인 합성 효소
본 항에서는 디히드로다이드제인 합성 효소(이하, E1 효소라 표기하는 경우도 있음)에 대하여 자세히 설명한다. 디히드로다이드제인 합성 효소에 관한 일반적인 설명은 특별히 기재되는 경우를 제외하고, 후술하는 테트라히드로다이드제인 합성 효소 및 에쿠올 합성 효소에 대해서도 적용된다.
A-1. 폴리펩티드
본 발명은 다이드제인을 기질로서 이용하여 디히드로다이드제인을 합성하는 폴리펩티드로서, 이하의 (Aa) 내지 (Ac)의 폴리펩티드(이하, 상기 폴리펩티드를 「E1 폴리펩티드」라고 표기하는 경우도 있음)를 제공한다:
(Aa) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 예를 들면 1 내지 250개, 바람직하게는 1 내지 200개, 보다 바람직하게는 1 내지 150개, 보다 바람직하게는 1 내지 100개, 보다 바람직하게는 1 내지 50개, 보다 바람직하게는 1 내지 30개, 더욱 바람직하게는 1 내지 15개, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 4개, 특히 더 바람직하게는 1 내지 3개, 가장 바람직하게는 1 또는 2개를 들 수 있다.
(Ab) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Ac) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
상기 (Ab)의 폴리펩티드에 있어서 「하나 또는 복수」의 범위는, 상기 폴리펩티드가 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 것을 한도로 하여 특별히 한정되지 않지만, 이러한 (Ab)의 폴리펩티드의 구체예로서는, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 및 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열 번호 1에 기재되는 아미노산 서열과 비교하여 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열은, 3개의 아미노산이 치환되어 있다. 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열은, 10개의 아미노산이 치환되어 있다. 서열 번호 2에 기재되는 아미노산 서열은 박테로이데스ㆍ오바투스 E-23-15주(FERM BP-6435호) 유래의 E1 효소에 상당한다. 서열 번호 3에 기재되는 아미노산 서열은 스트렙토코커스ㆍ콘스텔라투스 A6G-225주(FERM BP-6437호) 유래의 E1 효소에 상당한다.
또한, 상기 (Ab)의 폴리펩티드에서의 아미노산 치환으로서는 특별히 제한되지 않지만, 폴리펩티드의 표현형에 변화를 주지 않는 관점에서 유사 아미노산끼리에 의한 치환이 바람직하다. 구체적으로는 유사 아미노산으로서는, 이하와 같은 그룹으로 나눌 수 있다:
방향족 아미노산: Phe, Trp, Tyr
지방족 아미노산: Ala, Leu, Ile, Val
극성 아미노산: Gln, Asn
염기성 아미노산: Lys, Arg, His
산성 아미노산: Glu, Asp
수산기를 갖는 아미노산: Ser, Thr
측쇄가 작은 아미노산: Gly, Ala, Ser, Thr, Met.
또한, 상기 (Ab)의 폴리펩티드에서의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 부가는, 폴리펩티드의 고차 구조에 크게 영향을 주지 않는 영역이나 디히드로다이드제인 합성 효소로서의 활성 중심에 저해적 영향을 주지 않는 영역에서 행해지는 것이 바람직하다. 그와 같은 영역은, 예를 들면 서열 번호 1, 2, 및 3에 기재된 아미노산 서열 사이에서 보존성이 낮은 영역 및 그의 근변, 또는 N 말단 영역 또는 C 말단 영역을 들 수 있다. 구체적으로는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 제45번의 류신, 제80번째의 아스파라긴, 제167번째의 발린, 제231번째의 아스파라긴산, 제233번째의 이소류신, 제435번째의 아르기닌, 제459번째의 아스파라긴산, 제462번째의 발린, 제528번째의 아르기닌, 제540번째의 세린 및 제639번째 이소류신, 및 이들 아미노산의 근변 영역을 들 수 있다. 상기 「근변 영역」이란, 디히드로다이드제인 합성 효소 활성에 영향을 주지 않는 범위에 있어서 상기 특정 위치의 아미노산을 기점으로 하여, 예를 들면 전후 5개 이내의 아미노산, 바람직하게는 전후 4개 이내의 아미노산, 보다 바람직하게는 전후 3개의 아미노산, 특히 바람직하게는 전후 2개의 아미노산을 의미하고, 특히 더 바람직하게는 전후 1개의 아미노산이다.
서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에서 제112번째 내지 제116번째의 아미노산 서열은 NADPH 결합 도메인에 상당한다고 생각된다. NADPH 결합 도메인의 기능을 저해하지 않는 한, 상기 5개의 아미노산으로 이루어지는 서열에서 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가가 행해져 있을 수도 있다. 바람직하게는, 상기 서열에서 3개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 2개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산에 대하여 그와 같은 변이가 행해져 있을 수도 있고, 가장 바람직하게는 상기 아미노산 서열에는 변이가 행해져 있지 않다. 특히 제112번째, 115번째 및 116번째의 아미노산에 대해서는, 치환, 결실, 삽입 또는 부가는 행해져 있지 않는 것이 바람직하다.
서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에서의 제260번째의 히스티딘도 상기 양성자 전달 부위(proton relay site)와 관련이 있는 것으로 생각된다. 따라서, 양성자 전달 부위의 기능을 저해하지 않는 한, 상기 히스티딘은 다른 아미노산으로 치환될 수도 있지만, 바람직하게는 치환되어 있지 않다.
서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서, 제343번째 내지 제363번째의 아미노산으로 이루어지는 서열은 Fe-S 클러스터 모티브에 상당한다고 생각된다. 따라서, 상기 모티브의 기능을 저해하지 않는 한, 상기 서열에서 임의의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가될 수도 있지만, 제343번째, 제346번째, 제350번째 및 제363번째의 시스테인은 변이되어 있지 않은 것이 바람직하다. 상기 서열에서의 상기 3개의 아미노산 이외의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 경우에는, 바람직하게는 4개 이하의 아미노산이 치환되고, 보다 바람직하게는 3개 이하의 아미노산이 치환되고, 더욱 바람직하게는 2개 이하의 아미노산이 치환되고, 특히 바람직하게는 1개의 아미노산이 치환되어 있다. 가장 바람직하게는, 상기 서열에서 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가는 행해져 있지 않다.
서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 제390번째 내지 제413번째의 아미노산으로 이루어지는 서열은 FAD 결합 도메인에 상당한다고 생각된다. 따라서, 상기 도메인의 기능을 저해하지 않는 한, 상기 서열에서 임의의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가될 수도 있지만, 제390번째, 제392번째, 및 제395번째의 글리신은 변이되어 있지 않은 것이 바람직하다. 상기 서열에서 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 경우에는, 바람직하게는 4개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 3개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 2개 이하의 아미노산, 특히 바람직하게는 1개의 아미노산에 대하여 행해져 있는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 상기 서열에서 아미노산의 변이는 행해져 있지 않다.
서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 제512번째 내지 제540번째의 아미노산으로 이루어지는 서열도 FAD 결합 도메인에 상당한다고 생각된다. 따라서, 상기 도메인의 기능을 저해하지 않는 한, 상기 서열에서 임의의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가될 수도 있지만, 제512번째, 제514번째 및 제517번째의 글리신은 변이되어 있지 않은 것이 바람직하다. 상기 서열에서 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 경우에는, 바람직하게는 4개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 3개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 2개 이하의 아미노산, 특히 바람직하게는 1개의 아미노산에 대하여 행해져 있는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 상기 서열에 있어서 아미노산 서열에서 변이는 행해져 있지 않다.
상기와 같은 기능이 상정되는 아미노산 서열 영역을 나타내는 얼라인먼트를 도 27에 나타낸다.
특정 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입또는 부가시키는 기술은 공지되어 있다.
상기 (Ac)의 폴리펩티드에 있어서, 아미노산의 동일성은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 예를 들면 60 ％ 이상이면 되지만, 통상 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 특히 더 바람직하게는 99 ％ 이상인 것이 바람직하다.
상기 (Ac)의 폴리펩티드의 구체예로서는, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 및 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열 번호 1의 아미노산 서열과 서열 번호 2의 아미노산 서열의 아미노산 동일성은 99.5 ％이고, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 서열 번호 3의 아미노산 서열의 아미노산 동일성은 98.6 ％이다(Blast2). 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, (Ac) 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 바람직하게는 98.6 ％ 이상, 보다 바람직하게는 99.5 ％ 이상의 동일성을 갖는다.
아미노산 서열의 동일성은 시판되거나 또는 전기 통신 회선(인터넷)을 통하여 이용 가능한 해석 툴을 이용하여 산출할 수 있고, 예를 들면 FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH 등의 소프트웨어를 이용하여 계산된다. 구체적으로는, BLAST 검색에 일반적으로 이용되는 주된 초기 조건은 이하와 같다. 즉, Advanced BLAST 2.1에서 프로그램으로 blastp를 이용하여 익스펙트(Expect)값을 10, 필터(Filter)는 전부 OFF로 하고, 매트릭스(Matrix)로 BLOSUM62를 이용하고, 갭 익지스턴스 코스트(Gap existence cost), 퍼 레지듀 갭 코스트(Per residue gap cost) 및 람다 레이시오(Lambda ratio)를 각각 11, 1, 0.85(디폴트값)로 하고, 다른 각종 매개 변수도 디폴트값으로 설정하여 검색을 행함으로써 아미노산 서열의 동일성(identity)의 값(％)을 산출한다.
또한, 상기 (Ab) 및 (Ac)의 폴리펩티드에 있어서, 「다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성」은 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 즉, 하기 조성의 기질 용액 중에, 확인 대상이 되는 폴리펩티드를 0.001 mg/mL가 되도록 첨가하여 37 ℃에서 2 시간 인큐베이션하고, 그 후 용액 중에 디히드로다이드제인의 유무를 확인한다. 인큐베이션 후의 용액에 디히드로다이드제인의 존재가 확인된 경우, 그 폴리펩티드는 「다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성」을 가지고 있다고 판정된다.
기질 용액의 조성
0.1 M 인산칼륨 완충액
1 mM PMSF(페닐메틸술포닐플루오라이드)
2 mM 디티오트레이톨
5 mM 히드로아황산나트륨
2 mM NADPH 또는 NADH
40 μM 다이드제인
pH 7.0
효소 특성
E1 폴리펩티드는 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 효소 활성을 갖는다. 따라서, E1 폴리펩티드는 E1 효소라고도 불린다. E1 효소는 히드로아황산나트륨 등의 환원제나 망간 이온이나 철 이온 등의 금속 이온의 존재에 의해 그 효소 활성이 부활화된다. E1 효소는 보효소로서 NADPH 또는 NADH를 필요로 하고, 최적 온도는 30 ℃ 부근이고, 최적 pH는 7.0이다. E1 효소는 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성할 뿐만 아니라 그의 역반응, 즉 디히드로다이드제인을 기질로 하여 다이드제인을 합성하는 것도 가능하다.
E1 폴리펩티드는 후술하는 유전자 공학적 수법에 의해 제조할 수 있지만, E1 폴리펩티드 생산능을 갖는 미생물로부터 단리 정제하는 것도 가능하다. 또한, E1 폴리펩티드는 서열 번호 1, 2, 또는 3에 기재된 아미노산 서열 정보에 따라 일반적인 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있으며, 이 화학 합성법에는 통상적인 액상법 및 고상법에 의한 펩티드 합성법이 포함된다.
이하, E1 폴리펩티드 생산능을 갖는 미생물로부터 E1 펩티드를 단리 정제하는 방법에 대하여 설명한다. 우선, E1 폴리펩티드 생산능을 갖는 미생물의 균체를 파쇄하여 상기 미생물의 조추출물을 얻는다. 여기서, 균체의 파쇄에는, 프렌치 프레스, 셀 밀 등의 파쇄기에 의한 처리; 저장 용액하 초음파 처리 등의 통상적인 균체 파쇄 처리에 사용되고 있는 방법이 사용된다. 또한, 얻어진 조추출물에는, 적당한 완충액을 첨가해 둘 수도 있다. 또한, E1 폴리펩티드가 혐기성으로 순화되어 있는 경우에는, 얻어진 조추출물에 적당한 환원제를 첨가하여 E1 폴리펩티드의 실활을 억제시켜 두는 것이 바람직하다. 얻어진 조추출물에 대해서는, 그의 정제도를 높이기 위해서, 또한 황산암모늄 침전, 에탄올 등을 이용한 유기 용매 침전, 또는 등전점 침전 등의 정제 처리에 적용시킬 수도 있다. 이어서, 조추출물을 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 각종 친화성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 히드록시인회석 컬럼 크로마토그래피 등의 처리에 적용함으로써, E1 폴리펩티드를 포함하는 분획을 얻을 수 있다. 또한, 이들 크로마토그래피에 의한 처리는 필요에 따라서 오픈 칼럼을 사용할 수도 있고, 또한 HPLC를 사용할 수도 있다. 또한, 이렇게 하여 얻어진 E1 폴리펩티드를 포함하는 분획의 순도에 대해서는, 전기 영동, 특히 SDS-PAGE에 의해서 가시적으로 간편하게 추정할 수 있다. 또한, E1 폴리펩티드는 아미노산 서열 분석법; MALDI-TOF MS, ESI Q-TOF MS 또는 MALDI Q-TOF MS 등의 질량 분석 장치를 이용한 질량 분석법; 펩티드 매스 핑거 프린팅법 등에 의해서 확인할 수도 있다.
또한, 여기서 E1 폴리펩티드 생산능을 갖는 미생물은 다이드제인을 소정량 함유하는 배지(특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 0.01 μg/mL 이상 함유하는 배지)에서 배양되는 것이, 효율적으로 E1 펩티드를 생산시킨다는 점에서 바람직하다.
또한, E1 폴리펩티드는 단량체로서 존재할 수도 있지만, 디히드로다이드제인 합성능을 갖는 한, 2량체 또는 그 이상의 다량체로서 존재할 수도 있다. 또한, E1 폴리펩티드는 안정성을 향상시킬 목적 등으로, 필요에 따라서 폴리에틸렌글리콜 또는 당쇄를 부가 수식된 것일 수도 있다.
E1 폴리펩티드는 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인으로 변환시키는 촉매적 역할을 행할 수 있다. 상기 디히드로다이드제인은 후술하는 테트라히드로다이드제인 합성 효소(E2 효소) 및 에쿠올 합성 효소(E3 효소)에 의해서 에쿠올로 변환된다. 에쿠올은 생체 내에서 다양한 생리 작용을 발휘하는 것으로 생각되고, 그 의미에서 에쿠올의 합성 원료를 제공할 수 있는 E1 폴리펩티드는 중요하다고 말할 수 있다.
A-2. 폴리뉴클레오티드
본 발명은, 또한 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(이하, 상기 폴리뉴클레오티드를 「E1 폴리뉴클레오티드」라고 표기하는 경우도 있음)를 제공한다. 구체적으로는, E1 폴리뉴클레오티드로서 이하의 (Ad) 내지 (Af)의 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
(Ad) 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Ae) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Af) 상기 (Ad) 또는 (Ae)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열은 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열에 상당한다. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열은 서열 번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열에 상당한다. 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열은 서열 번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열에 상당한다.
상기 (Af)의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 「엄격한 조건하에 혼성화한다」는 것은 표준 혼성화 조건하에 2개의 폴리뉴클레오티드 단편이 서로 혼성화될 수 있는 것을 의미하고, 본 조건은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning; A laboratory manual(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA]에 기재되어 있다. 보다 구체적으로는 「엄격한 조건」이란, 6.0 x SSC 중에 약 45 ℃에서 혼성화를 행하고, 이어서 2.0 x SSC에 의해 50 ℃에서 세정하는 것을 의미한다. 이러한 상기 (Af)의 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들면 서열 번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 들 수 있다.
엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 프로브로서 사용하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 일정 이상의 상동성을 갖는다. 그 상동성은 예를 들면 60 ％ 이상, 바람직하게는 70 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 특히 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 더 바람직하게는 98 ％ 이상이다. 뉴클레오티드 서열의 상동성은 시판되거나 또는 전기 통신 회선(인터넷)을 통하여 이용 가능한 해석 툴을 이용하여 산출할 수 있고, 예를 들면 FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH 등의 소프트웨어를 이용하여 계산된다. 구체적으로는, BLAST 검색에 일반적으로 이용되는 주된 초기 조건은 이하와 같다. 즉, Advanced BLAST 2.1에서 프로그램으로 blastn을 이용하고, 각종 매개 변수는 디폴트값으로 설정하여 검색을 행함으로써, 뉴클레오티드 서열의 상동성의 값(％)을 산출한다.
서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열과 서열 번호 5의 뉴클레오티드 서열의 염기 서열 상동성은 99.6 ％이고, 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열과 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열의 염기 서열의 상동성은 97.6 ％이다(Blast2). 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, (Af)의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대하여 97.6 ％ 이상의 상당성을 가지고, 보다 바람직하게는 99.6 ％ 이상의 상당성을 갖는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (Af)의 폴리뉴클레오티드에 있어서 「다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성」은 상기 (Ab) 또는 (Ac)의 폴리펩티드의 경우와 동일한 방법으로 확인된다.
E1 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4, 5 또는 6의 서열 정보에 기초하여 화학적 DNA 합성법에 의해 제조하여 취득할 수 있지만, 일반적 유전자 공학적 수법에 의해 용이하게 제조ㆍ취득할 수 있다(문헌[Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); 속 생화학 실험 강좌「유전자 연구법 I, II, III」, 일본 생화학회편(1986)] 등 참조).
화학적 DNA 합성법으로서는, 포스포아미다이트법에 의한 고상 합성법을 예시할 수 있다. 이 합성법에는 자동 합성기를 이용할 수 있다.
또한, 일반적 유전자 공학적 수법으로서는, 구체적으로는 E1 폴리뉴클레오티드가 발현되는 적당한 기원으로부터 통상법에 따라서 cDNA 라이브러리를 제조하고, 상기 라이브러리로부터 E1 폴리뉴클레오티드에 특유의 적당한 프로브나 항체를 이용하여 목적 클론을 선택함으로써 실시할 수 있다(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science 122, 778 (1983)] 등).
여기서, cDNA의 기원으로서는, E1 폴리뉴클레오티드를 발현하는 생물이면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는 에쿠올 생산능을 갖는 미생물, 바람직하게는 에쿠올 생산능을 갖는 유산균, 박테로이데스속에 속하는 균 및 스트렙토코커스속에 속하는 균, 더욱 바람직하게는 에쿠올 생산능을 갖는 락토코커스ㆍ가르비에, 박테로이데스ㆍ오바투스 및 스트렙토코커스ㆍ콘스텔라투스, 특히 바람직하게는 에쿠올 생산능을 갖는 분변(糞便) 유래의 락토코커스ㆍ가르비에, 특히 에쿠올 생산능을 갖는 분변 유래의 락토코커스ㆍ가르비에인 락토코커스 20-92주(FERM BP-10036호; 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁), 박테로이데스ㆍ오바투스 E-23-15주(FERM BP-6435호; 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁), 스트렙토코커스ㆍ콘스텔라투스 A6G-225주(FERM BP-6437호; 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라기껭 츠꾸바시 히가시 1쪼메 1반 1고)에 기탁)가 예시된다.
또한, 이들로부터의 전체 RNA의 분리, mRNA의 분리나 정제, cDNA의 취득과 그의 클로닝 등은 모두 통상법에 따라서 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝하는 방법도 특별히 제한되지 않고, 통상적인 방법에 따를 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 cDNA에 의해서 생산되는 폴리펩티드에 대하여, 상기 폴리펩티드 특이 항체를 사용한 면역적 스크리닝에 의해 대응하는 cDNA 클론을 선택하는 방법, 목적하는 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 결합하는 프로브를 이용한 플라크 혼성화, 콜로니 혼성화 등이나 이들의 조합 등을 예시할 수 있다.
여기서 이용되는 프로브로서는, E1 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 관한 정보(예를 들면, 서열 번호 4, 5 또는 6의 뉴클레오티드 서열)를 바탕으로 하여 화학 합성된 DNA 등을 일반적으로 예시할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 염기 서열 정보에 기초하여 설정한 센스 프라이머 및/또는 안티센스 프라이머를 스크리닝용 프로브로서 이용할 수도 있다.
E1 폴리뉴클레오티드의 취득시에는, PCR법[Science130, 1350 (1985)] 또는 그의 변법에 의한 DNA 또는 RNA 증폭법을 바람직하게 이용할 수 있다. 특히 라이브러리로부터 전장의 cDNA가 얻어지기 어려운 경우에는, RACE법(문헌[Rapid amplification of cDNA ends; 실험 의학, 12(6), 35 (1994)]), 특히 5'-RACE법(문헌[M.A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)] 등의 채용이 바람직하다. 이들 RACE법 및 5'-RACE법은 진핵 생물 유래의 E1 폴리뉴클레오티드를 취득할 때에 유용하다.
이러한 PCR법의 채용시에 사용되는 프라이머는 E1 폴리뉴클레오티드의 서열 정보에 기초하여 적절하게 설정할 수 있고, 이것은 통상법에 따라서 합성할 수 있다. 또한, 증폭시킨 DNA 또는 RNA 단편의 단리 정제는 상기한 대로 통상법에 따를 수 있고, 예를 들면 겔 전기 영동법, 혼성화법 등으로 할 수 있다.
E1 폴리뉴클레오티드에 따르면, 통상적인 유전자 공학적 수법을 이용함으로써 상기 폴리뉴클레오티드의 산물(즉, 상기 폴리펩티드)을 용이하게 대량으로 안정적으로 제조할 수 있다. 종래 에쿠올 생산균에 대해서는 취급이 곤란한 혐기성 균주밖에 발견되지 않지만, E1 폴리뉴클레오티드의 단리에 성공함에 따라서 종래의 에쿠올 생산균을 사용하지 않고도 에쿠올의 공업적 생산으로의 길이 열린다.
A-3. 발현 벡터
본 발명의 발현 벡터는 E1 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있으며, 상기 E1 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, 일반적으로 숙주 세포와의 관계로부터 적절하게 선택된다.
숙주 세포로서 원핵 생물의 세포를 사용하는 경우, 발현 벡터로서는, 예를 들면 상기 숙주 세포 중에서 복제 가능한 플라스미드 벡터이며, 이 벡터 중에 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있도록 상기 폴리뉴클레오티드의 상류에 프로모터 및 SD(샤인ㆍ앤드ㆍ달가노) 염기 서열을 부여한 발현 플라스미드를 들 수 있다. 구체적으로는 PL 프로모터, T7 프로모터 및 lac 프로모터를 이용한 발현 플라스미드를 들 수 있다. 다른 바람직한 세균 발현 벡터로서는 tac 프로모터 또는 trc 프로모터를 이용한 플라스미드 pKK233-2 및 pKK233-3 등을 들 수 있다. 즉, 이들로 한정되지 않고 공지된 각종 균주 및 벡터도 이용할 수 있다.
또한, 숙주 세포로서 진핵 세포를 사용하는 경우, 발현 벡터로서는 통상 발현하고자 하는 상기 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치하는 프로모터, RNA의 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종료 서열 등을 보유하는 것을 사용할 수 있고, 이것은 또한 필요에 따라서 복제 기점을 가질 수도 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 데 유용한 진핵 생물 벡터는 잘 알려져 있다. 예를 들면, 적당한 진핵 생물 벡터로서는 pCD 및 pCMV를 예시할 수 있다. 또한, 이들 외에는 필요에 따라서 MMTV 또는 SV40 후기 프로모터를 이용한 pMSG 및 pSVL을 들 수 있다. 단, 이들로 한정되지 않고 공지된 각종 진핵 생물 및 벡터도 이용할 수 있다.
A-4. 재조합 세포
본 발명은 상기 E1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 의해서 형질 전환된 재조합 세포(형질 전환체)를 제공한다.
재조합 세포에 사용되는 숙주 세포로서는, 원핵 세포 및 진핵 세포를 모두 사용할 수도 있다.
숙주 세포로서 사용되는 원핵 세포로서는, 락토코커스속에 속하는 유산균 등의 세균성 원핵 세포를 바람직하게 사용할 수 있지만, 그 외에 호기적 조건하에서 생육 가능한 세균성 원핵 세포(예를 들면, 대장균, 스트렙토미세스, 고초균, 스트렙토코커스, 스타필로코커스 등)를 예시할 수 있다.
숙주 세포로서 사용되는 진핵 세포로서는, 예를 들면 효모, 아스퍼질러스 등의 진핵 미생물; 드로소필라 S2, 스포돕테라 Sf9 등의 곤충 세포; L 세포, CHO 세포, COS 세포, HeLa 세포, C127 세포, BALB/c3T3 세포(디히드로엽산 리덕타제나 티미딘 키나제 등을 결손시킨 변이주를 포함함), BHK21 세포, HEK293 세포, Bowes 흑색종 세포, 난모 세포 등의 동식물 세포 등을 예시할 수 있다.
또한, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 일반적인 각종 방법을 채용할 수 있다. 예를 들면, 상기 발현 벡터의 숙주 세포로의 도입은 문헌[Davis 등(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) 및 Sambrook 등(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989] 등의 많은 표준 실험실 메뉴얼에 기재된 방법에 따라서 행할 수 있고, 그 구체적 수법으로서는 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 트랜스벡션(transvection), 마이크로인젝션, 양이온성 지질 매개 트랜스펙션, 전기 천공, 형질 도입, 스크레이프 로딩 (scrape loading), 탄환 도입(ballistic introduction), 감염 등을 들 수 있다.
상기 재조합 세포는 디히드로다이드제인 변환 효소인 E1 폴리펩티드를 생산할 수 있기 때문에, 디히드로다이드제인 변환 효소의 제조를 위해서 이용할 수 있고, 또한 세포 상태 그대로 디히드로다이드제인의 제조에 이용할 수도 있다.
A-5. 재조합 세포를 이용한 폴리펩티드의 제조
E1 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포를 배양하고, 세포 및 또는 배양물로부터 E1 폴리펩티드를 회수함으로써 E1 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
배양은 숙주에 적합한 배지를 이용하여 계대 배양 또는 배치 배양을 행할 수 있다. 배양은 재조합 세포의 내외에 생산된 E1 폴리펩티드량을 지표로 하여, E1 폴리펩티드가 적당량 얻어질 때까지 행할 수 있다.
상기 배양에 이용되는 배지로서는, 채용한 숙주 세포에 따라서 관용되는 각종의 것을 적절하게 선택 이용할 수 있고, 배양도 숙주 세포의 생육에 적합한 조건하에서 실시할 수 있다.
또한, 이렇게 하여 얻어지는 E1 폴리펩티드는 목적에 따라서 그의 물리적 성질, 화학적 성질 등을 이용한 각종 분리 조작(문헌[「생화학 데이터북 II」, 1175 내지 1259 페이지, 제1판 제1쇄, 1980년 6월 23일 가부시끼가이샤 도꾜 가가꾸 도진 발행; Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)] 등 참조)에 의해 분리, 정제할 수 있다. 구체적으로는 상기 「A-1. 폴리펩티드」란에 기재된 「E1 폴리펩티드 생산능을 갖는 미생물로부터 E1 펩티드를 단리 정제하는 방법」과 동일한 방법이 예시된다.
A-6. E1 폴리펩티드를 이용한 디히드로다이드제인의 제조
본 발명은 E1 폴리펩티드를 이용한 디히드로다이드제인의 제조 방법을 제공한다. 즉, 상기 제조 방법에서는, E1 폴리펩티드를 NADPH 및/또는 NADH의 존재하에서 다이드제인에 작용시킴으로써 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킨다. 바람직하게는 E1 폴리펩티드를 NADPH의 존재하에서 다이드제인에 작용시킴으로써 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킨다.
E1 폴리펩티드의 디히드로다이드제인 합성 효소 활성은 Mn2+및 Fe2+의 존재에 의해 부활되기 때문에, Mn2+및/또는 Fe2+의 존재하에서 E1 펩티드를 다이드제인에 작용시키는 것이 바람직하다. E1 폴리펩티드의 상기 효소 활성을 부활시킬 수 있는 한 Mn2+및/또는 Fe2+의 반응 용액에서의 농도는 특별히 제한되지 않는다. Fe2+의 농도는 바람직하게는 2 mM 이상이고, 보다 바람직하게는 2 mM 내지 100 mM이고, 더욱 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM이다. Mn2+의 농도는 바람직하게는 0.2 μM이고, 보다 바람직하게는 0.2 μM 내지 100 mM이고, 더욱 바람직하게는 1.0 μM 내지 40 mM이다.
본 제조 방법에 채용되는 반응은 적당한 완충액 중에서 행할 수 있다. 예를 들면, 완충액으로서는, 인산 완충액, 탄산 완충액, 아세트산 완충액, 트리스 완충액, 붕산 완충액 등이 예시된다. 또한, 상기 반응에서의 pH 조건에 대해서는, E1 폴리펩티드가 원하는 효소 활성이 실활되지 않는 범위에서 적절하게 반응 조건으로 할 수 있지만, 바람직하게는 pH 5.0 내지 10.0, 더욱 바람직하게는 6.0 내지 8.0을 예시할 수 있다.
또한, 상기 반응에는, 필요에 따라서 PMSF, EDTA 등의 프로테아제 저해제를 적당량 첨가할 수도 있다. 또한, 상기 폴리펩티드가 혐기성균 유래인 것을 고려하면, DTT, 2ME, DET, 히드로아황산나트륨 등의 환원제를 적당량 첨가할 수도 있다.
본 제조 방법에 채용되는 반응은, 예를 들면 반응 개시시에 용매 중에서 각 성분을 하기의 농도 범위를 만족시키도록 첨가하여 원료 혼합물을 제조하고, 이것을 20 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 내지 40 ℃, 더욱 바람직하게는 30 내지 38 ℃의 온도 조건에서 0.5 내지 10 시간, 바람직하게는 1 내지 6 시간, 더욱 바람직하게는 2 내지 4 시간 인큐베이션함으로써 실시된다:
상기 폴리펩티드가 0.0001 내지 1.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.01 중량％;
다이드제인이 0.0001 내지 10.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％; 및
NADPH 및/또는 NADH가 0.01 내지 5 중량％, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량％.
또한, 본 발명은 디히드로다이드제인을 합성하기 위한 혼합 원료로서, (Ai) E1 폴리펩티드, (Aii) NADPH 및/또는 NADH, 및 (Aiii) 다이드제인을 함유하는 디히드로다이드제인 합성 원료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 디히드로다이드제인을 합성하기 위한 혼합 원료로서, (Ai) E1 폴리펩티드, (Aii) NADPH 및/또는 NADH, (Aiii) 다이드제인, 및 (Aiv) Mn2+및/또는 Fe2+를 함유하는 디히드로다이드제인 합성 원료 조성물을 제공한다. 상기 합성 원료 조성물을 상술하는 조건에서 인큐베이션함으로써, 상기 합성 원료 조성물 중의 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킬 수 있다. 상기 합성 원료 조성물은 상기 디히드로다이드제인의 제조에 있어서 반응 개시시의 원료 혼합물에 상당하는 것이고, 상기 합성 원료 조성물에서의 E1 폴리펩티드의 배합 농도, NADPH 및/또는 NADH의 배합 농도, 다이드제인의 배합 농도, 및 상기 합성 원료 조성물에 배합 가능한 다른 성분 등에 대해서도, 상기 제조 방법에 채용되는 반응계(반응 개시시의 원료 혼합 용액)의 경우와 동일하다.
또한, 본 발명은 디히드로다이드제인을 합성하기 위한 키트로서, (Ai) E1 폴리펩티드, (Aii) NADPH 및/또는 NADH, 및 (Aiii) 다이드제인을 함유하는 디히드로다이드제인 합성용 키트를 제공한다. 본 발명은 디히드로다이드제인을 합성하기 위한 키트로서, (Ai) E1 폴리펩티드, (Aii) NADPH 및/또는 NADH, (Aiii) 다이드제인, 및 (Aiv) Mn2+및/또는 Fe2+를 함유하는 디히드로다이드제인 합성용 키트를 제공한다. 상기 합성용 키트에는 상술하는 조건에서 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인의 합성을 간이하게 실시할 수 있도록, 각 성분이 필요에 따라 구분되어 구비될 수 있다. 또한, 상기 합성용 키트에는 필요에 따라 사용하는 완충액이 포함될 수도 있다. 또한, 상기 합성용 키트는 디히드로다이드제인의 합성을 간이하게 행하기 위해서 필요한 기구나 조작 메뉴얼을 포함할 수도 있다.
A-7. 디히드로다이드제인 합성 효소 조성물
본 발명은, 또한 E1 폴리펩티드를 포함하는 디히드로다이드제인 합성 효소 조성물을 제공한다. 상기 효소 조성물은 E1 폴리펩티드를 이용한 디히드로다이드제인의 제조 방법에서 디히드로다이드제인 합성 효소로서 바람직하게 사용된다.
상기 효소 조성물은 조(粗)정제 상태의 E1 폴리펩티드일 수도 있고, 또한 조정제 또는 정제된 E1 폴리펩티드를 적당한 담체에 배합한 것일 수도 있다.
상기 효소 조성물에 있어서, E1 폴리펩티드의 배합 비율에 대해서는 상기 디히드로다이드제인의 제조 방법에서 디히드로다이드제인 합성 효소로서 사용할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는, 상기 효소 조성물의 총량당 E1 폴리펩티드가 0.001 내지 20.0 중량％, 바람직하게는 0.005 내지 5.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1.0 중량％가 예시된다.
상기 효소 조성물에는, E1 폴리펩티드의 보효소로서 작용하는 NADPH 및/또는 NADH를 포함할 수도 있다. 상기 효소 조성물에 NADPH 및/또는 NADH를 배합하는 경우, 상기 NADPH 및/또는 NADH의 배합 비율에 대해서는 특별히 제한되지 않지만, 상기 효소 조성물당 0.0005 내지 25.0 중량％, 바람직하게는 0.005 내지 5.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 2.5 중량％가 예시된다.
더욱 바람직한 일 실시 형태에 있어서 상기 효소 조성물은 Mn2+및/또는 Fe2+를 포함한다. 상기 효소 조성물에 Mn2+및/또는 Fe2+의 금속 이온을 포함하는 경우, 금속 이온의 배합 비율은 E1 폴리펩티드의 디히드로다이드제인 합성 효소 활성을 부할할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. Fe2+의 배합 비율은 상기 조성물당, 바람직하게는 2 mM 이상이고, 보다 바람직하게는 2 mM 내지 100 mM이고, 더욱 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM이다. Mn2+의 배합 비율은 상기 조성물당, 바람직하게는 0.2 μM 이상이고, 보다 바람직하게는 0.2 μM 내지 100 mM이고, 더욱 바람직하게는 1.0 μM 내지 40 mM 배합된다.
또한, 상기 효소 조성물에는 E1 폴리펩티드 외에, 상기 폴리펩티드의 안정성을 향상시키기 위해서 아황산염, 아스코르브산, α-토코페롤, 시스테인 등의 항산화제를 포함할 수도 있다. 또한, 상기 효소 조성물의 보존성을 담보하기 위해서, 필요에 따라서 파라옥시벤조산에스테르류, 클로로부탄올, 벤질알코올, 2-페닐에틸알코올, 데히드로아세트산, 소르브산 등의 보존제를 첨가할 수도 있다.
A-8. 상기 재조합 세포를 이용한 디히드로다이드제인의 제조 방법
본 발명은 E1 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포를 이용한 디히드로다이드제인의 제조 방법을 제공한다. 즉, 상기 제조 방법에서는, 상기 재조합 세포를 다이드제인에 작용시킴으로써 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킨다.
본 제조 방법에 채용되는 반응은 상기 재조합 세포가 생존할 수 있으며, 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킬 수 있는 환경하에서 실시된다.
구체적으로는, 상기 재조합 세포가 생육 가능한 배지 중에 상기 재조합 세포 및 다이드제인을 적당량 첨가하여 배양을 행함으로써 실시된다.
본 제조 방법에서 사용되는 배지는 재조합 세포의 숙주 세포로서 채용한 세포의 종류에 따라서 관용되는 각종의 것을 적절하게 선택 이용된다.
또한, 상기 배지에는, 필요에 따라서 PMSF, EDTA 등의 프로테아제 저해제를 적당량 첨가할 수도 있다. 또한, 상기 폴리펩티드가 혐기성균 유래인 것을 고려하면, DTT, 2ME, DET, 히드로아황산나트륨 등의 환원제를 적당량 첨가할 수도 있다. 또한, 상기 재조합 세포를 이용하는 경우, NADPH 및/또는 NADH의 첨가는 필수가 아니지만, 필요에 따라서 배지 중에 NADPH 및/또는 NADH를 첨가할 수도 있다. 또한, 상기 배지에는 Mn2+및/또는 Fe2+를 첨가할 수도 있다.
본 제조 방법은, 구체적으로는 다이드제인을 0.001 내지 1 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.5 중량％을 포함하는 배지에 상기 재조합 세포를 접종하여 생육 가능 온도 조건하에서 6 내지 30 시간, 바람직하게는 7 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 7 내지 18 시간 인큐베이션함으로써 실시된다.
또한, 본 발명은 디히드로다이드제인을 합성하기 위한 혼합 원료로서, (Aiv) 상기 재조합 세포 및 (Aiii) 다이드제인을 함유하는 디히드로다이드제인 합성 원료 조성물을 제공한다. 상기 합성 원료 조성물을 상술하는 조건에서 배양함으로써, 상기 합성 원료 조성물 중의 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킬 수 있다. 상기 합성 원료 조성물은 상기 디히드로다이드제인의 제조에 있어서 반응 개시시의 원료 혼합물에 상당하는 것이고, 상기 합성 원료 조성물에서의 상기 재조합 세포 및 다이드제인의 농도, 및 상기 합성 원료 조성물에 배합 가능한 다른 성분 등에 대해서도, 상기 제조 방법에 채용되는 조건 등과 동일하다.
또한, 본 발명은 디히드로다이드제인을 합성하기 위한 키트로서, (Aiv) 상기 재조합 세포 및 (Aiii) 다이드제인을 함유하는 디히드로다이드제인 합성용 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 디히드로다이드제인을 합성하기 위한 키트로서, (Aiv) 상기 재조합 세포, (Aiii) 다이드제인, 및 (Aiv) Mn2+및/또는 Fe2+를 함유하는 디히드로다이드제인 합성용 키트를 제공한다. 상기 합성용 키트에는 상술하는 조건에서 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인의 합성을 간이하게 실시할 수 있도록, 상기 재조합 세포와 다이드제인이 필요에 따라서 구분되어 구비될 수 있다. 또한, 상기 합성용 키트에는 필요에 따라서 완충액이나 배지가 포함될 수도 있다. 또한, 상기 합성용 키트는 디히드로다이드제인의 합성을 간이하게 행하기 위해서 필요한 기구나 조작 메뉴얼을 포함할 수도 있다.
또한, 상기 합성용 키트에 포함되는 상기 재조합 세포는 공지된 방법으로 보존된 것일 수도 있다. 재조합 세포를 보존하는 기술은 공지되어 있으며, 예를 들면 디메틸포름아미드 등에 재조합 세포를 넣어 동결 건조기에서 앰플이 진공 상태가 되도록 처리한 후, 4 내지 25 ℃에서 보존하는 방법 등을 들 수 있다. 이 외에도, 10 ％ 글리세롤 첨가 보존 배지에 균체를 현탁시키고, 이것을 전용 앰플에 넣어 액체 질소 탱크(-150 내지 -196 ℃)에서 보관하는 액체 질소법을 들 수 있다.
A-9. 상기 폴리펩티드에 결합성을 갖는 항체
본 발명은, 또한 E1 폴리펩티드에 결합성을 갖는 항체(IgG 항체)를 제공한다.
모노클로날 항체는 종래법에 따라서 제조된다. 구체적으로는, 할로우와 레인의 문헌[Harlow, H. and Lane, D.), 「항체: 실험실 메뉴얼」 중, 콜드 스프링 하버 랩(Cold Spring Harbor Lab), New York, 139 내지 240 페이지(1988)]에 기재된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
또한, 폴리클로날 항체에 대해서도 종래법에 따라서 제조된다. 구체적으로는 세포 공학 실험 프로토콜(동경 대학 의과학 연구소 제암(制癌) 연구부편, 1992년, 155 내지 173 페이지) 등에 기재된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
폴리클로날 IgG 항체 및 모노클로날 IgG 항체는 모두 통상적인 황산암모늄 침전법 및 프로테인 A 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다.
A-10. 상기 폴리펩티드를 검출 또는 측정하는 면역학적 방법
또한, 본 발명은 상기 항체를 이용하여 E1 폴리펩티드를 검출 또는 측정하는 면역학적 방법을 제공한다. 구체적으로는, 상기 면역학적 방법은 상기 항체를 피검 시료에 접촉시킴으로써 실시된다. 즉, 상기 항체를 피검 시료에 접촉시킴으로써, 피검 시료 중에 E1 폴리펩티드가 존재하는 경우에는 상기 항체와 E1 폴리펩티드가 특이적으로 결합한다. 이어서, E1 폴리펩티드에 결합한 상기 항체를 검출하고, 필요에 따라서 이것을 정량함으로써 피검 시료 중의 상기 폴리펩티드를 검출 또는 측정할 수 있다.
여기서 피검 시료란, E1 폴리펩티드의 검출 또는 측정 대상이 되는 시료이다. E1 폴리펩티드는 세균성 원핵 세포 내에 발견되는 것으로 예측되기 때문에, 세균성 원핵 세포 내에 존재하는 E1 폴리펩티드의 검출 또는 측정 목적으로 상기 면역학적 방법은 바람직하다. 또한, 세포 내에 존재하는 E1 폴리펩티드의 검출 또는 측정을 행하는 경우에는, 상기 세포에 대하여 파쇄 처리를 행한 것, 또는 상기 파쇄 처리 후에 단백질의 정제 처리를 행한 것을 피검 시료로서 사용할 수 있다.
항체를 이용한 면역학적 방법에 의해서 목적하는 폴리펩티드를 검출 또는 측정하는 수법은 공지되어 있고, 당업자라면 면역학적 방법에서의 적당한 각종 조건에 대해서는 적절하게 설정 가능하다. 예를 들면, 방사 면역 분석법, ELISA법 등을 채용하여 적당한 조건을 적절하게 설정할 수 있다.
또한, 본 발명은 E1 폴리펩티드를 검출 또는 측정하기 위한 키트로서, 상기 항체를 함유하는 면역학적 검출용 키트를 제공한다. 상기 검출용 키트에는 필요에 따라서 E1 폴리펩티드가 표준품으로서 포함될 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트에는 상술하는 조건에서 E1 폴리펩티드의 검출을 간이하게 실시할 수 있도록, 그 외에 사용되는 시약 등이 필요에 따라서 구비될 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트는 E1 폴리펩티드의 검출을 간이하게 행하기 위해서 필요한 기구나 조작 메뉴얼을 포함할 수도 있다.
A-11. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 검출 또는 측정하는 방법
또한, 본 발명은 E1 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 구체적으로는 E1 폴리뉴클레오티드에 결합하는 프로브를 피검 시료와 접촉시킴으로써 실시된다. 즉, 상기 프로브를 피검 시료에 접촉시킴으로써, 피검 시료 중에 E1 폴리뉴클레오티드가 존재하는 경우에는 상기 프로브와 E1 폴리뉴클레오티드가 혼성화된다. 이어서, 이 2본쇄의 형성 유무를 검출하고, 필요에 따라서 이것을 정량함으로써 피검 시료 중의 E1 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 측정할 수 있다.
여기서 피검 시료란, E1 폴리뉴클레오티드의 검출 또는 측정 대상이 되는 시료이다. E1 폴리뉴클레오티드는 세균성 원핵 세포 내에 발견되는 것이 예측되기 때문에, 세균성 원핵 세포 내에 존재하는 E1 폴리뉴클레오티드의 검출 또는 측정 목적으로 상기 방법은 바람직하다. 또한, 세포 내에 존재하는 E1 폴리뉴클레오티드의 검출 또는 측정을 행하는 경우에는, 상기 세포에 대하여 파쇄 처리를 행한 것, 또는 상기 파쇄 처리 후에 핵산의 정제 처리를 행한 것을 피검 시료로서 사용할 수 있다.
또한, 상기 방법에 사용되는 프로브로서는, 상기 폴리뉴클레오티드에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것이 사용된다. 여기서 엄격한 조건이란, 프로브 또는 프라이머로서 이용되는 통상적인 조건을 들 수 있지만, 구체적으로는 상기 A-2. 섹션에 나타내는 조건이 예시된다.
상기 프로브는 E1 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열(예를 들면, 서열 번호 4, 5 또는 6에 기재된 뉴클레오티드 서열)에 관한 정보를 기초로 하여 화학 합성한 것일 수도 있고, 또한 이미 취득된 E1 폴리뉴클레오티드나 그의 단편으로 이루어지는 것일 수도 있다. 또한, 상기 프로브는 통상 표지한 프로브를 이용하지만, 비표지일 수도 있다. 또한, 상기 프로브를 PCR용 프라이머(센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머)로서 사용하는 경우, 그 길이에 대해서는 약 10 내지 40 뉴클레오티드 정도, 특히 20 내지 30 뉴클레오티드 정도가 바람직하게 예시된다.
상기 방법은 상기 프로브를 이용하여 상기 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출하는 방법으로서는, 예를 들면 플라크 혼성화, 콜로니 혼성화, 서던 블롯법, 노던 블롯법, PCR법 등을 들 수 있지만, 감도의 관점에서는, 상기 프로브를 프라이머로서 이용한 PCR법에 의해 E1 폴리뉴클레오티드 또는 그의 일부를 증폭시키는 방법이 바람직하게 채용된다.
PCR법으로서는, 예를 들면 RT-PCR법이 예시되지만, 상기 분야에서 이용되는 각종 변법을 적응할 수 있다. PCR법을 이용하여 E1 폴리뉴클레오티드의 존재와 그의 양을 정량하는 것도 가능하다. 상기 방법으로서는, MSSA법과 같은 경합적 정량법(문헌[Kinoshita, M., et al., CCA, 228, 83 내지 90 (1994)]) 또는 1본쇄 DNA의 고차 구조 변화에 따른 이동도 변화를 이용한 돌연 변이 검출법으로서 알려지는 PCR-SSCP법(문헌[Orita, M., et al., Genomics, 5, 874-879 (1989)])을 예시할 수 있다.
또한, 본 발명은 E1 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 측정하기 위한 키트로서, 상기 프로브를 함유하는 E1 폴리뉴클레오티드 검출용 키트를 제공한다. 상기 검출용 키트에는 상술하는 조건에서 E1 폴리뉴클레오티드의 검출을 간이하게 실시할 수 있도록, 상기 프로브 이외에 사용되는 시약 등이 필요에 따라서 구비될 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트는 E1 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 동정하기 위한 키트로서 사용할 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트로서는, 정밀도가 높은 검출을 가능하게 한다는 관점에서, 바람직하게는 PCR에 의한 검출을 행하기 위한 키트를 들 수 있다.
B. 테트라다이드제인 합성 효소
B-1. 폴리펩티드
본 발명은 디히드로다이드제인을 기질로서 이용하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 폴리펩티드로서, 이하의 (Ba) 내지 (Bc)의 폴리펩티드(이하, 상기 폴리펩티드를 「E2 폴리펩티드」라고 표기하는 경우도 있음)를 제공한다:
(Ba) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Bb) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Bc) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
상기 (Bb)의 폴리펩티드에 있어서 「하나 또는 복수」의 범위는, 상기 폴리펩티드가 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 것을 한도로 하여 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 보다 바람직하게는 1 내지 15개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 4개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개, 특히 더 바람직하게는 1 또는 2개를 들 수 있다.
이러한 (Bb)의 폴리펩티드의 구체예로서는, 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 및 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열은, 2개의 아미노산 서열이 치환되어 있고, N 말단에 24 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열이 부가되어 있다. 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열과 20개의 아미노산이 치환되어 있고, 1개의 아미노산이 결실되어 있다. 서열 번호 8에 기재되는 아미노산 서열은 박테로이데스ㆍ오바투스 E-23-15주(FERM BP-6435호) 유래의 E2 효소에 상당한다. 서열 번호 9에 기재되는 아미노산 서열은 스트렙토코커스ㆍ콘스텔라투스 A6G-225주(FERM BP-6437호) 유래의 E2 효소에 상당한다.
상기 (Bb)의 폴리펩티드에서의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 부가는 상기 A-1. 섹션에 기재되는 E1 폴리펩티드에서의 치환, 결실, 삽입 또는 부가에 준하여 행해질 수 있다. (Bb)의 폴리펩티드에서의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 부가는 폴리펩티드의 고차 구조에 크게 영향을 주지 않는 영역이나 테트라히드로다이드제인 합성 효소로서의 활성 중심에 저해적 영향을 주지 않는 영역에서 행해지는 것이 바람직하다. 그와 같은 영역으로서는, 예를 들면 서열 번호 7, 8 및 9에 기재된 아미노산 서열 사이에서 보존성이 낮은 영역 및 그의 근변, 또는 N 말단 영역 또는 C 말단 영역을 들 수 있다. 구체적으로는 서열 번호 7에 기재되는 아미노산 서열에 있어서, 제7번째의 발린, 제8번째의 프롤린, 제26번째의 발린, 제36번째의 류신, 제46번째의 아르기닌, 제94번째의 아스파라긴산, 제101번째의 글루탐산, 제126번째의 글리신, 제137번째의 이소류신, 제156번째의 글루타민, 제157번째의 리신, 159번째의 아스파라긴산, 제160번째, 제171번째의 알라닌, 제185번째의 시스테인, 제221위번째의 세린, 제233번째의 알라닌, 제241번째의 발린, 제258번째의 세린, 제266번째의 이소류신 및 제286번째의 발린, 및 이들 아미노산의 근변 영역을 들 수 있다. 상기 「근변 영역」이란, 테트라히드로다이드제인 합성 효소 활성에 영향을 주지 않는 범위에서 상기 특정 위치의 아미노산을 기점으로 하여 전후 5개 이내의 아미노산, 바람직하게는 전후 4개 이내의 아미노산, 보다 바람직하게는 전후 3개 이내의 아미노산, 더욱 바람직하게는 전후 2개 이내의 아미노산, 특히 바람직하게는 전후 1개의 아미노산이다.
서열 번호 7에 기재되는 아미노산 서열에 있어서, 제38번째 내지 45번째의 아미노산으로 이루어지는 서열은 NADPH 결합 도메인에 상당한다고 생각된다. 따라서, 상기 도메인의 기능이 저해되지 않는 한, 상기 서열에서 임의의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가될 수도 있지만, 바람직하게는 제38번째의 트레오닌, 제39번째의 글리신, 제43번째의 글리신 및 제45번째의 글리신은 변이되어 있지 않은 것이 바람직하다. 상기 서열에서 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 경우에는, 바람직하게는 4개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 3개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 2개 이하의 아미노산, 특히 바람직하게는 1개의 아미노산에 대하여 행해져 있는 것이 바람직하다.
서열 번호 7에 기재되는 아미노산 서열에 있어서, 제115번째 내지 제118번째의 아미노산으로 이루어지는 서열은 SDR 패밀리 중에 보존성이 높은 모티브에 상당한다고 생각된다. 상기 서열에서 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가가 행해지는 경우에는, 바람직하게는 3개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 2개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산에 대하여 이루어진다. 상기 서열에 있어서는 아미노산의 변이가 행해지지 않는 것이 가장 바람직하다.
서열 번호 7에 기재되는 아미노산 서열에 있어서 제168번째의 세린, 제182번째의 히스티딘, 제186번째의 리신은 E2 효소의 활성 중심에 관여하고 있다고 생각된다. 따라서, 상기 효소 활성을 저해하지 않는 한, 상기 3개의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환할 수 있지만, 이들 아미노산에 대해서는 변이가 행해져 있지 않는 것이 바람직하다.
서열 번호 7에 기재되는 아미노산 서열에 있어서, 제212번째 내지 217번째의 아미노산으로 이루어지는 서열은 보인자(補因子)와의 결합에 관여한다고 생각된다. 따라서, 상기 기능을 저해하지 않는 한, 상기 서열에서 임의의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가될 수도 있지만, 바람직하게는 제212번째의 프롤린, 제213번째의 글리신 및 제217번째의 트레오닌은 변이되어 있지 않다. 상기 서열에서 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되는 경우에는, 바람직하게는 3개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 2개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산에 대하여 행해져 있다. 특히 바람직하게는 상기 서열에서 아미노산의 변이가 행해져 있지 않다. 상기와 같은 기능이 상정되는 아미노산 서열 영역을 나타내는 얼라인먼트를 도 28에 나타낸다.
상기 (Bc)의 폴리펩티드에 있어서, 아미노산의 동일성은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 예를 들면 60 ％ 이상일 수 있지만, 통상 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 특히 더 바람직하게는 99 ％ 이상인 것이 바람직하다.
상기 (Bc)의 폴리펩티드의 구체예로서는, 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 및 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열의 동일성은 99.3 ％이고, 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열의 동일성은 93.0 ％이다(Blast2). 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, (Bc) 폴리펩티드는 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대하여 바람직하게는 93.0 ％ 이상, 보다 바람직하게는 99.3 ％ 이상의 동일성을 갖는다.
또한, 상기 (Bb) 및 (Bc)의 폴리펩티드에 있어서, 「디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성」은 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 즉, 하기 조성의 기질 용액 중에, 확인 대상이 되는 폴리펩티드를 0.001 mg/mL가 되도록 첨가하여 37 ℃에서 2 시간 인큐베이션하고, 그 후 용액 중에 테트라히드로다이드제인의 유무를 확인한다. 인큐베이션 후의 용액에 테트라히드로다이드제인의 존재가 확인된 경우, 그 폴리펩티드는 「디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성」을 가지고 있다고 판정된다.
기질 용액의 조성
0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)
1 mM PMSF(페닐메틸술포닐플루오라이드)
2 mM 디티오트레이톨
5 mM 히드로아황산나트륨
2 mM NADPH
2 mM NADH
40 μM 디히드로다이드제인
효소 특성
E2 폴리펩티드는 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 효소 활성을 갖는다. 따라서, E2 폴리펩티드는 E2 효소라고도 불린다. E2 효소는 보효소로서 NADPH 또는 NADH를 필요로 한다. E2 효소의 최적 온도는 37 ℃ 부근이고, 최적 pH는 4.5이다. E2 효소는 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성할 뿐만 아니라 그의 역반응, 즉, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 것도 가능하다.
E2 폴리펩티드는 상기 E1 펩티드와 동일하게 서열 번호 10, 11 또는 12에 기재된 뉴클레오티드 서열 정보를 이용하여 유전자 공학적 수법으로 얻을 수 있다. 또한, 서열 번호 7, 8 또는 9에 기재된 아미노산 서열 정보에 기초하여 화학 합성법에 의해서 얻을 수도 있다. 또한, E2 폴리펩티드 생산능을 갖는 미생물로부터 단리 정제함으로써 얻는 것도 가능하다. 이들 방법은 상기 A-1. 섹션의 기재에 준하여 행할 수 있다.
E2 폴리펩티드 생산능을 갖는 미생물은 목적량의 디히드로다이드제인, 또한 다이드제인을 함유하는 배지에서 배양할 수도 있다. 이 경우에도, E2 폴리펩티드 생산능을 갖는 미생물로부터 E2 폴리펩티드를 생산시킬 수 있다.
E2 폴리펩티드는 단량체로서 존재할 수도 있지만, 테트라히드로다이드제인 합성능을 갖는 한, 2량체 또는 그 이상의 다량체로서 존재할 수도 있다. 또한, E2 폴리펩티드는 안정성을 향상시킬 목적 등으로, 필요에 따라서 폴리에틸렌글리콜 또는 당쇄를 부가 수식된 것일 수도 있다.
E2 폴리펩티드는 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인으로 변환시키는 촉매적 역할을 행할 수 있다. 상기 테트라히드로다이드제인은 또한 후술하는 에쿠올 합성 효소에 의해서 에쿠올로 변환된다. 에쿠올은 생체 내에서 다양한 생리 작용을 발휘하는 것으로 생각되고, 그 의미에서 에쿠올의 합성 원료를 제공할 수 있는 E2 폴리펩티드는 중요하다고 말할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 상기 (Ba) 내지 (Bc)의 폴리펩티드를 포함하는 테트라히드로다이드제인 합성 효소를 제공한다.
B-2. 폴리뉴클레오티드
본 발명은, 또한 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(이하, 상기 폴리뉴클레오티드를 「E2 폴리뉴클레오티드」라고 표기하는 경우도 있음)를 제공한다. 구체적으로는, E2 폴리뉴클레오티드로서 이하의 (Bd) 내지 (Bf)의 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
(Bd) 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Be) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Bf) 상기 (Bd) 또는 (Be)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열은 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열에 상당한다. 서열 번호 8의 아미노산 서열은 서열 번호 11에 기재된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열에 상당한다. 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열은 서열 번호 12에 기재된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열에 상당한다.
상기 (Bf) 폴리뉴클레오티드에 관한 「엄격한 조건하에서 혼성화한다」는 것은, 상기 A-2.에 기재된 「엄격한 조건하에서 혼성화한다」는 것과 동일한 의미이다. (Bf)의 폴리뉴클레오티드의 구체예로서는, 서열 번호 11에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 12에 기재된 뉴클레오티드 서열을 들 수 있다. 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열과 서열 번호 11에 기재된 뉴클레오티드 서열의 염기 서열의 상동성은 99.7 ％이고, 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열과 서열 번호 12에 기재된 뉴클레오티드 서열의 염기 서열의 상동성은 91.0 ％이다(Blast2). 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, (Bf)의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대하여 91.0 ％ 이상의 상당성을 가지고, 보다 바람직하게는 99.7 ％ 이상의 상당성을 갖는다.
상기 (Bf)의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 「디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성」은 상기 (Bb) 또는 (Bc)의 폴리펩티드의 경우와 동일한 방법으로 확인된다.
E2 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 10, 11 또는 12에 기재된 서열 정보에 기초하여 화학적 합성법 또는 유전자 공학적 수법에 의해서 제조ㆍ취득하는 것이 가능하다. 구체적인 수법으로서는, 상기 E1 폴리뉴클레오티드에 관한 A-2. 섹션에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 그와 같은 방법은 필요에 따라서 수정ㆍ변경할 수 있다.
E2 폴리뉴클레오티드의 cDNA의 기원으로서는, E2 폴리뉴클레오티드를 발현하는 미생물이면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는 에쿠올 생산능을 갖는 미생물, 바람직하게는 에쿠올 생산능을 갖는 유산균, 박테로이데스속에 속하는 균 및 스트렙토코커스속에 속하는 균, 더욱 바람직하게는 에쿠올 생산능을 갖는 락토코커스ㆍ가르비에, 박테로이데스ㆍ오바투스 및 스트렙토코커스ㆍ콘스텔라투스, 특히 바람직하게는 에쿠올 생산능을 갖는 분변 유래의 락토코커스ㆍ가르비에, 특히 에쿠올 생산능을 갖는 분변 유래의 락토코커스ㆍ가르비에인 락토코커스 20-92주(FERM BP-10036호; 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁), 박테로이데스ㆍ오바투스 E-23-15주(FERM BP-6435호; 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁), 스트렙토코커스ㆍ콘스텔라투스 A6G-225주(FERM BP-6437호; 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라기껭 츠꾸바시 히가시 1쪼메 1반 1고)에 기탁)가 예시된다.
통상적인 유전자 공학적 수법을 이용하여 E2 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써, 상기 폴리뉴클레오티드의 산물(즉, 상기 폴리펩티드)를 용이하게 대량으로 안정적으로 제조할 수 있다. 종래 에쿠올 생산균에 대해서는 취급이 곤란한 혐기성 균주밖에 발견되지 않지만, E2 폴리뉴클레오티드의 단리에 성공함으로써 종래의 에쿠올 생산균을 사용하지 않고도 에쿠올의 공업적 생산으로의 길이 열린다.
B-3. 발현 벡터
본 발명의 발현 벡터는 E2 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 E2 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, E1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 동일하게 일반적으로 숙주 세포와의 관계로부터 적절하게 선택된다. 구체적인 숙주 세포로서는, 상기 A-3. 섹션에 기재된 것을 사용할 수 있다.
B-4. 재조합 세포
본 발명은 상기 E2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 의해서 형질 전환된 재조합 세포(형질 전환체)를 제공한다. 재조합 세포에 사용되는 숙주 세포로서는, 상기 A-4. 섹션에 기재된 것을 특별히 제한없이 사용할 수 있다. 또한, 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법에 대해서는, 상기 A-4. 섹션의 기재에 따라서 행할 수 있다.
상기 재조합 세포는 테트라히드로다이드제인 변환 효소인 E2 폴리펩티드를 생산할 수 있기 때문에, 테트라히드로다이드제인 변환 효소의 제조를 위해서 이용할 수 있고, 또한 세포 상태 그대로 테트라히드로다이드제인의 제조에 이용할 수도 있다.
B-5. 재조합 세포를 이용한 폴리펩티드의 제조
E2 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포를 배양하고, 배양물로부터 E2 폴리펩티드를 회수함으로써 E2 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 배양은 상기 A-5. 섹션의 기재에 준하여 행할 수 있다.
B-6. E2 폴리펩티드를 이용한 테트라히드로다이드제인의 제조
본 발명은 E2 폴리펩티드를 이용한 테트라히드로다이드제인의 제조 방법을 제공한다. 즉, 상기 제조 방법에서는 E2 폴리펩티드를 NADPH 및/또는 NADH의 존재하에서 디히드로다이드제인에 작용시킴으로써 디히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로 변환시킨다.
본 제조 방법에 채용되는 반응은 상기 A-6. 섹션에 기재된 것과 같은 적당한 완충액 중에서 행할 수 있다.
본 제조 방법에 채용되는 반응은 예를 들면 반응 개시시에 완충액(반응 개시시의 원료 혼합물) 중에서 각 성분을 하기의 농도 범위를 만족시키도록 첨가하고, 상기 E2 폴리펩티드, 디히드로다이드제인 등의 원료 및 테트라히드로다이드제인 등의 생성물이 변질ㆍ불활성화되지 않는 온도 조건에서 0.5 내지 10 시간, 바람직하게는 1 내지 6 시간, 더욱 바람직하게는 2 내지 4 시간 인큐베이션함으로써 실시된다. 이러한 온도 조건이면 반응 온도는 한정되지 않지만, 예를 들면 0 ℃ 이하로 설정할 때는, 이들 반응 온도에서 동결되지 않는 완충액 등이 이용된다. 반응 온도는 바람직하게는 0 내지 45 ℃, 더욱 바람직하게는 0 내지 37 ℃가 예시된다. 또한, 테트라히드로다이드제인에는 시스형 및 트랜스형이 존재하지만, 상기 반응 온도나 시간 등의 조건을 변경함으로써 시스형과 트랜스형의 생성을 대조군하는 것도 가능하다. 예를 들면, 반응 온도 0 ℃로서 시스형 및 트랜스형이 혼재한 테트라히드로다이드제인을 생성시키는 것이 가능하고, 37 ℃로 하여 트랜스형을 우선하여 생성시키는 것이 가능하다.
상기 제조 방법에서의 각 성분의 농도 범위는 이하와 같다.
E2 폴리펩티드가 0.0001 내지 1.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.01 중량％;
디히드로다이드제인이 0.0001 내지 10.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％; 및 NADPH 및/또는 NADH가 0.01 내지 5 중량％, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량％.
또한, 본 발명은 테트라히드로다이드제인을 합성하기 위한 혼합 원료로서, (Bi) E2 폴리펩티드, (Bii) NADPH 및/또는 NADH, 및 (Biii) 디히드로다이드제인을 함유하는 테트라히드로다이드제인 합성 원료 조성물을 제공한다. 상기 합성 원료 조성물을 상술하는 조건에서 인큐베이션함으로써, 상기 합성 원료 조성물 중의 디히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로 변환시킬 수 있다. 상기 합성 원료 조성물은 상기 테트라히드로다이드제인의 제조에 있어서 반응 개시시의 원료 혼합물에 상당하는 것이고, 상기 합성 원료 조성물에서의 E2 폴리펩티드의 배합 농도, NADPH 및/또는 NADH의 배합 농도, 디히드로다이드제인의 배합 농도, 및 상기 합성 원료 조성물에 배합 가능한 다른 성분 등에 대해서도, 상기 제조 방법에 채용되는 반응계(반응 개시시의 원료 혼합 용액)의 경우와 동일하다.
또한, 본 발명은 테트라히드로다이드제인을 합성하기 위한 키트로서, (Bi) E2 폴리펩티드, (Bii) NADPH 및/또는 NADH, 및 (Biii) 디히드로다이드제인을 함유하는 테트라히드로다이드제인 합성용 키트를 제공한다. 상기 합성용 키트에는 상술하는 조건에서 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인의 합성을 간이하게 실시할 수 있도록, 각 성분이 필요에 따라서 구분되어 구비될 수 있다. 또한, 상기 합성용 키트에는 필요에 따라서 사용하는 완충액이 포함될 수도 있다. 또한, 상기 합성용 키트는 테트라히드로다이드제인의 합성을 간이하게 행하기 위해서 필요한 기구나 조작 메뉴얼을 포함할 수도 있다.
B-7. 테트라히드로다이드제인 합성 효소 조성물
본 발명은, 또한 E2 폴리펩티드를 포함하는 테트라히드로다이드제인 합성 효소 조성물을 제공한다. 상기 효소 조성물은 E2 폴리펩티드를 이용한 테트라히드로다이드제인의 제조 방법에서 테트라히드로다이드제인 합성 효소로서 바람직하게 사용된다.
상기 효소 조성물은 조정제 상태의 E2 폴리펩티드일 수도 있고, 또한 조정제 또는 정제된 E2 폴리펩티드를 적당한 담체에 배합한 것일 수도 있다. 상기 담체는 E2 폴리펩티드의 활성에 악영향을 주지 않기 때문에 적당량 배합된다.
상기 효소 조성물에서 E2 폴리펩티드의 배합 비율에 대해서는, 상기 테트라히드로다이드제인의 제조 방법에서 테트라히드로다이드제인 합성 효소로서 사용할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는 상기 효소 조성물의 총량당, E2 폴리펩티드가 0.001 내지 20.0 중량％, 바람직하게는 0.005 내지 5.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1.0 중량％가 예시된다.
상기 효소 조성물에는, E2 폴리펩티드의 보효소로서 작용하는 NADPH 및/또는 NADH를 포함할 수도 있다. 상기 효소 조성물에 NADPH 및/또는 NADH를 배합하는 경우, 상기 NADPH 및/또는 NADH의 배합 비율에 대해서는 특별히 제한되지 않지만, 상기 효소 조성물당 0.005 내지 50.0 중량％, 바람직하게는 0.05 내지 10.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 5.0 중량％가 예시된다.
또한, 상기 효소 조성물에는 E2 폴리펩티드 외에, 상기 폴리펩티드의 안정성을 향상시키기 위해서 및/또는 보존성을 담보하기 위해서 상기 A-7. 섹션에 기재된 각종 항산화제나 보존제를 첨가할 수도 있다.
B-8. 상기 재조합 세포를 이용한 테트라히드로다이드제인의 제조 방법
본 발명은 E2 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포를 이용한 테트라히드로다이드제인의 제조 방법을 제공한다. 즉, 상기 제조 방법에서는 상기 재조합 세포를 디히드로다이드제인에 작용시킴으로써 디히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로 변환시킨다.
본 제조 방법에 채용되는 반응은 상기 재조합 세포가 생존할 수 있으며, 디히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로 변환시킬 수 있는 환경하에서 실시된다.
구체적으로는, 상기 재조합 세포가 생육 가능한 배지 중에 상기 재조합 세포 및 디히드로다이드제인을 적당량 첨가하여 배양을 행함으로써 실시된다.
본 제조 방법에서 사용되는 배지는 재조합 세포의 숙주 세포로서 채용한 세포의 종류에 따라서 관용되는 각종의 것을 적절하게 선택 이용된다.
또한, 상기 배지에는, 필요에 따라서 PMSF, EDTA 등의 프로테아제 저해제를 적당량 첨가할 수도 있다. 또한, 상기 폴리펩티드가 혐기성균 유래인 것을 고려하면, DTT, 2ME, DET, 히드로아황산나트륨 등의 환원제를 적당량 첨가할 수도 있다. 또한, 상기 재조합 세포를 이용하는 경우, NADPH 및/또는 NADH의 첨가는 필수가 아니지만, 필요에 따라서 배지 중에 NADPH 및/또는 NADH를 첨가할 수도 있다.
본 제조 방법은, 구체적으로는 디히드로다이드제인을 0.001 내지 1 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 중량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.1 중량％을 포함하는 배지에 상기 재조합 세포를 접종하여 생육 가능 온도 조건하에서 7 내지 30 시간, 바람직하게는 15 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 17 내지 20 시간 인큐베이션함으로써 실시된다. 여기서, 생육 가능 온도 조건은 특별히 한정되지 않고, 상기 「B-6. E2 폴리펩티드를 이용한 테트라히드로다이드제인의 제조」와 동일한 온도에서 실시할 수 있다.
또한, 본 발명은 테트라히드로다이드제인을 합성하기 위한 혼합 원료로서, (Biv) 상기 재조합 세포 및 (Biii) 디히드로다이드제인을 함유하는 테트라히드로다이드제인 합성 원료 조성물을 제공한다. 상기 합성 원료 조성물을 상술하는 조건에서 배양함으로써, 상기 합성 원료 조성물 중의 디히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로 변환시킬 수 있다. 상기 합성 원료 조성물은 상기 테트라히드로다이드제인의 제조에 있어서 반응 개시시의 원료 혼합물에 상당하는 것이고, 상기 합성 원료 조성물에서의 상기 재조합 세포 및 디히드로다이드제인의 농도, 및 상기 합성 원료 조성물에 배합 가능한 다른 성분 등에 대해서도, 상기 제조 방법에 채용되는 조건 등과 동일하다.
또한, 본 발명은 테트라히드로다이드제인을 합성하기 위한 키트로서, (Biv) 상기 재조합 세포 및 (Biii) 디히드로다이드제인을 함유하는 테트라히드로다이드제인 합성용 키트를 제공한다. 상기 합성용 키트에는 상술하는 조건에서 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인의 합성을 간이하게 실시할 수 있도록, 상기 재조합 세포와 디히드로다이드제인이 필요에 따라서 구분되어 구비될 수 있다. 또한, 상기 합성용 키트에는 필요에 따라서 완충액이나 배지가 포함될 수도 있다. 또한, 상기 합성용 키트는 테트라히드로다이드제인의 합성을 간이하게 행하기 위해서 필요한 기구나 조작 메뉴얼을 포함할 수도 있다.
또한, 상기 합성용 키트에 포함되는 상기 재조합 세포는 공지된 방법으로 보존된 것일 수도 있다. 재조합 세포를 보존하는 기술은 공지되어 있으며, 예를 들면 디메틸포름아미드 등에 재조합 세포를 넣어 동결 건조기에서 앰플이 진공 상태가 되도록 처리한 후, 4 내지 25 ℃에서 보존하는 방법 등을 들 수 있다. 이 외에도, 10 ％ 글리세롤 첨가 보존 배지에 균체를 현탁시키고, 이것을 전용 앰플에 넣어 액체 질소 탱크(-150 내지 -196 ℃)에서 보관하는 액체 질소법을 들 수 있다.
B-9. 상기 폴리펩티드에 결합성을 갖는 항체
본 발명은, 또한 E2 폴리펩티드에 결합성을 갖는 항체(IgG 항체)를 제공한다.
모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체는 종래법에 따라서 제조된다. 구체적으로는 상기 A-9. 섹션에 기재된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
B-10. 상기 폴리펩티드를 검출 또는 측정하는 면역학적 방법
또한, 본 발명은 상기 항체를 이용하여 E2 폴리펩티드를 검출 또는 측정하는 면역학적 방법을 제공한다. 구체적으로는, 상기 면역학적 방법은 상기 A-10. 섹션에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.
본 발명은 E2 폴리펩티드를 검출 또는 측정하기 위한 키트로서, 상기 항체를 함유하는 면역학적 검출용 키트를 제공한다. 상기 검출용 키트에는 필요에 따라서 E2 폴리펩티드가 표준품으로서 포함될 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트에는 상술하는 조건에서 E2 폴리펩티드의 검출을 간이하게 실시할 수 있도록, 그 외에 사용되는 시약 등이 필요에 따라서 구비될 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트는 E2 폴리펩티드의 검출을 간이하게 행하기 위해서 필요한 기구나 조작 메뉴얼을 포함할 수도 있다.
B-11. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 검출 또는 측정하는 방법
또한, 본 발명은 E2 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 구체적으로는 E2 폴리뉴클레오티드에 결합하는 프로브를 피검 시료와 접촉시킴으로써 실시되고, 상기 A-11. 섹션에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.
또한, 본 발명은 E2 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 측정하기 위한 키트로서, 상기 프로브를 함유하는 E2 폴리뉴클레오티드 검출용 키트를 제공한다. 상기 검출용 키트에는 상술하는 조건에서 E2 폴리뉴클레오티드의 검출을 간이하게 실시할 수 있도록, 상기 프로브 이외에 사용되는 시약 등이 필요에 따라서 구비될 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트는, E2 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 동정하기 위한 키트로서 사용할 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트로서는, 정밀도가 높은 검출을 가능하게 한다는 관점에서, 바람직하게는 PCR에 의한 검출을 행하기 위한 키트를 들 수 있다.
C. 에쿠올 합성 효소
C-1. 폴리펩티드
본 발명은 테트라히드로다이드제인을 기질로서 이용하여 에쿠올을 합성하는 폴리펩티드로서 이하의 (Ca) 내지 (Cc)의 폴리펩티드(이하, 상기 폴리펩티드를 「E3 폴리펩티드」라고 표기하는 경우도 있음)를 제공한다:
(Ca) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Cb) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Cc) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
상기 (Cb)의 폴리펩티드에 있어서 「하나 또는 복수」의 범위는, 상기 폴리펩티드가 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 것을 한도로 하여 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 1 내지 200개, 바람직하게는 1 내지 150개, 보다 바람직하게는 1 내지 100개, 보다 바람직하게는 1 내지 50개, 보다 바람직하게는 1 내지 45개, 보다 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 30개, 보다 바람직하게는 1 내지 15개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 4개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개, 특히 더 바람직하게는 1 또는 2개를 들 수 있다.
이러한 (Cb)의 폴리펩티드의 구체예로서는, 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 및 서열 번호 15에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열은, 2개의 아미노산이 치환되어 있다. 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 비교하여, 서열 번호 15에 기재된 아미노산 서열은 아미노산 42개가 치환되어 있고, C 말단에 1개의 아미노산(글루탐산)이 부가되어 있다. 서열 번호 14에 기재되는 아미노산 서열은 박테로이데스ㆍ오바투스 E-23-15주(FERM BP-6435호) 유래의 E3 효소에 상당한다. 서열 번호 15에 기재되는 아미노산 서열은 스트렙토코커스ㆍ콘스텔라투스 A6G-225주(FERM BP-6437호) 유래의 E3 효소에 상당한다.
상기 (Cb)의 폴리펩티드에 있어서의 「아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가」는 상기 A-1. 섹션에 기재되는 E1 펩티드에서의 치환, 결실, 삽입 또는 부가에 준하여 행해질 수 있다. 상기 (Cb)의 폴리펩티드에서의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 부가에 대해서는, 폴리펩티드의 고차 구조에 크게 영향을 주지 않는 영역이나 에쿠올 합성 효소로서의 활성 중심에 영향을 주지 않는 영역에서 행해지는 것이 바람직하다. 그와 같은 영역으로서는, 예를 들면 서열 번호 13, 14 및 15에 기재된 아미노산 서열 사이에서 보존성이 낮은 영역 및 그의 근변, 및 N 말단 영역 또는 C 말단 영역을 들 수 있다. 구체적으로는 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 제3번째의 글루탐산, 제28번째의 아르기닌, 제29번째의 글루탐산, 제32번째의 아르기닌, 제61번째의 아스파라긴, 제80번째의 이소류신, 제92번째의 아스파라긴, 제112번째의 아스파라긴산, 제119번째의 알라닌, 제129번째의 아스파라긴, 제172번째의 아스파라긴산, 제174번째의 알라닌, 제204번째의 세린, 제206번째의 글루탐산, 제223번째의 트레오닌, 제230번째의 발린, 제244번째의 프롤린, 제246번째의 티로신, 제280번째의 트레오닌, 제282번째의 아르기닌, 제285번째의 알라닌, 제307번째의 발린, 제322번째의 알라닌, 제347번째의 글루탐산, 제359번째의 글리신, 제360번째의 세린, 제366번째의 알라닌, 제367번째의 류신, 제368번째의 이소류신, 제372번째의 발린, 제373번째의 아스파라긴산, 제374번째의 트레오닌, 제377번째의 알라닌, 제380번째의 알라닌, 제381번째의 아스파라긴산, 제399번째의 글루타민, 제403번째의 프롤린, 제404번째의 메티오닌, 제405번째의 발린, 제406번째의 글루탐산, 제407번째의 글리신, 제426번째의 아르기닌, 제434번째의 발린, 제436번째의 알라닌, 제438번째의 티로신 및 제440번째의 알라닌, 및 이들 아미노산의 근변 영역을 들 수 있다. 상기 「근변 영역」이란, 에쿠올 합성 효소 활성을 저해하지 않는 범위에서 상기 특정 위치의 아미노산을 기점으로 하여, 전후 5개 이내의 아미노산, 바람직하게는 전후 4개의 아미노산, 보다 바람직하게는 전후 3개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 전후 2개의 아미노산, 특히 바람직하게는 전후 1개의 아미노산이다. 상기 보존성이 낮은 영역 및 그의 근변으로서, 바람직하게는 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 있어서 제25번째 내지 제35번째에 상당하는 영역, 제170번째 내지 177번째에 상당하는 영역, 제201번째 내지 제208번째에 상당하는 영역, 242번째 내지 248번째에 상당하는 영역, 제276번째 내지 제289번째에 상당하는 영역, 제355번째 내지 제385번째에 상당하는 영역, 제396번째 내지 제409번째에 상당하는 영역 및 제431번째 내지 제443번째에 상당하는 영역을 들 수 있다.
서열 번호 13에 기재되는 아미노산 서열에 있어서, 제14번째의 아미노산 내지 제19번째의 아미노산으로 이루어지는 서열은 FAD 결합 도메인에 상당한다고 생각된다. 따라서, 상기 도메인의 기능을 저해하지 않는 한, 상기 서열에서 임의의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가될 수도 있지만, 바람직하게는 제14번째의 글리신, 제16번째의 글리신 및 제19번째의 글리신은 변이되어 있지 않다. 상기 서열에서 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있는 경우에는, 바람직하게는 3개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 2개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산에 대하여 행해지고, 가장 바람직하게는 변이는 행해져 있지 않다.
도 29에 서열 번호 13, 14 및 15에 기재된 아미노산 서열의 얼라인먼트를 나타낸다.
상기 (Cc)의 폴리펩티드에 있어서, 아미노산의 동일성은 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 대하여, 예를 들면 60 ％ 이상일 수 있지만, 통상 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 특히 더 바람직하게는 99 ％ 이상인 것이 바람직하다.
상기 (Cc)의 폴리펩티드의 구체예로서는, 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 및 서열 번호 15에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열의 동일성은 99.6 ％이고, 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열과 서열 번호 15에 기재된 아미노산 서열의 동일성은 90.9 ％이다(Blast2). 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, (Cc) 폴리펩티드는 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열에 대하여 바람직하게는 90.9 ％ 이상, 보다 바람직하게는 99.6 ％ 이상의 동일성을 갖는다.
상기 (Cb) 및 (Cc)의 폴리펩티드에 있어서, 「테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성」은 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 즉, 하기 조성의 기질 용액 중에, 확인 대상이 되는 폴리펩티드를 0.001 mg/mL가 되도록 첨가하여 37 ℃에서 2 시간 인큐베이션하고, 그 후 용액 중에 에쿠올의 유무를 확인한다. 인큐베이션 후의 용액에 에쿠올의 존재가 확인된 경우, 그 폴리펩티드는 「테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성」을 가지고 있다고 판정된다.
기질 용액의 조성
0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)
1 mM PMSF(페닐메틸술포닐플루오라이드)
2 mM 디티오트레이톨
5 mM 히드로아황산나트륨
40 μM 테트라히드로다이드제인
효소 특성
E3 폴리펩티드는 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 효소 활성을 갖는다. 따라서, E3 폴리펩티드는 E3 효소라고도 불린다. E3 효소의 최적 온도는 약 23 내지 37 ℃이고, 최적 pH는 4.5이다. E3 효소는 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성할 뿐만 아니라 그의 역반응, 즉, 에쿠올을 원료로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 것도 가능하다.
E3 폴리펩티드는 E1 펩티드나 E2 펩티드와 동일하게 서열 번호 16, 17 또는 18에 기재된 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여 유전자 공학적 수법에 의해서 얻을 수 있다. 또한, 서열 번호 13, 14 또는 15에 기재된 아미노산 서열 정보에 기초하여 화학 합성법에 의해서 얻을 수도 있다. 또한, E3 폴리펩티드 생산능을 갖는 미생물로부터 단리 정제함으로써 얻을 수 있다. 이들 수법은 상기 A-1. 섹션의 기재에 따라서 행할 수 있다.
E3 폴리펩티드 생산능을 갖는 미생물은 목적량의 테트라히드로다이드제인을 함유하는 배지에서 배양할 수도 있다. 이 경우에도, E3 폴리펩티드 생산능을 갖는 미생물로부터 E3 폴리펩티드를 생산시킬 수 있다.
또한, E3 폴리펩티드는 단량체로서 존재할 수도 있지만, 에쿠올 합성능을 갖는 한, 2량체 또는 그 이상의 다량체로서 존재할 수도 있다. 또한, E3 폴리펩티드는 안정성을 향상시킬 목적 등으로, 필요에 따라서 폴리에틸렌글리콜 또는 당쇄를 부가 수식된 것일 수도 있다.
E3 폴리펩티드는 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올로 변환시키는 촉매적 역할을 행할 수 있다. 에쿠올은 생체 내에서 각종 생리 작용을 발휘하는 것으로 생각되고, 그 의미에서 에쿠올을 제공할 수 있는 E3 폴리펩티드는 중요하다고 말할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 상기 (Ca) 내지 (Cc)의 폴리펩티드를 포함하는 에쿠올 합성 효소를 제공한다.
C-2. 폴리뉴클레오티드
본 발명은, 또한 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(이하, 상기 폴리뉴클레오티드를 「E3 폴리뉴클레오티드」라고 표기하는 경우도 있음)를 제공한다. 구체적으로는, E3 폴리뉴클레오티드로서 이하의 (Cd) 내지 (Cf)의 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
(Cd) 서열 번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Ce) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Cf) 상기 (Cd) 또는 (Ce)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열은 서열 번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열에 상당한다. 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열은 서열 번호 17에 기재된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열에 상당한다. 서열 번호 15에 기재된 아미노산 서열은 서열 번호 18에 기재된 뉴클레오티드 서열이 코딩하는 아미노산 서열에 상당한다.
상기 (Cf) 폴리뉴클레오티드에 관한 「엄격한 조건하에서 혼성화한다」는 것은, 상기 A-2. 섹션에 기재된 「엄격한 조건하에서 혼성화한다」는 것과 동일한 의미이다. (Cf)의 폴리뉴클레오티드의 구체예로서는, 서열 번호 17에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 서열 번호 18에 기재된 뉴클레오티드 서열을 들 수 있다. 서열 번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열과 서열 번호 17에 기재된 뉴클레오티드 서열의 염기 서열의 상동성은 99.8 ％이고, 서열 번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열과 서열 번호 18에 기재된 뉴클레오티드 서열의 상동성은 85.2 ％이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, (Cf)의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대하여 85.2 ％ 이상의 상당성을 가지고, 보다 바람직하게는 99.8 ％ 이상의 상당성을 갖는다.
또한, 상기 (Cf)의 폴리뉴클레오티드에 있어서 「테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성」은 상기 (Cb) 또는 (Cc)의 폴리펩티드의 경우와 동일한 방법으로 확인된다.
E3 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 16, 17 또는 18의 서열 정보에 기초하여 화학적 DNA 합성법 또는 유전자 공학적 수법에 의해 제조ㆍ취득하는 것이 가능하다. 구체적 수법으로서는, 상기 A-2. 섹션에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
E3 폴리뉴클레오티드의 cDNA의 기원으로서는, E3 폴리뉴클레오티드를 발현하는 미생물이면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는 에쿠올 생산능을 갖는 미생물, 바람직하게는 에쿠올 생산능을 갖는 유산균, 박테로이데스속에 속하는 균 및 스트렙토코커스속에 속하는 균, 더욱 바람직하게는 에쿠올 생산능을 갖는 락토코커스ㆍ가르비에, 박테로이데스ㆍ오바투스 및 스트렙토코커스ㆍ콘스텔라투스, 특히 바람직하게는 에쿠올 생산능을 갖는 분변 유래의 락토코커스ㆍ가르비에, 특히 에쿠올 생산능을 갖는 분변 유래의 락토코커스ㆍ가르비에인 락토코커스 20-92주(FERM BP-10036호; 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁), 박테로이데스ㆍ오바투스 E-23-15주(FERM BP-6435호; 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁), 스트렙토코커스ㆍ콘스텔라투스 A6G-225주(FERM BP-6437호; 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본 이바라기껭 츠꾸바시 히가시 1쪼메 1반 1고)에 기탁)가 예시된다.
통상적인 유전자 공학적 수법을 이용하여 E3 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써, 상기 폴리뉴클레오티드의 산물(즉, 상기 폴리펩티드)을 용이하게 대량으로 안정적으로 제조할 수 있다. 종래 에쿠올 생산균에 대해서는 취급이 곤란한 혐기성 균주밖에 발견되지 않지만, E3 폴리뉴클레오티드의 단리에 성공함에 따라서 종래의 에쿠올 생산균을 사용하지 않고도 에쿠올의 공업적 생산으로의 길이 열린다.
C-3. 발현 벡터
본 발명의 발현 벡터는 E3 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 E3 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, E1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 동일하게 일반적으로 숙주 세포와의 관계로부터 적절하게 선택된다. 구체적인 숙주 세포로서는, 상기 A-3. 섹션에 기재된 것을 사용할 수 있다.
C-4. 재조합 세포
본 발명은 상기 E3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 의해서 형질 전환된 재조합 세포(형질 전환체)를 제공한다. 재조합 세포에 사용되는 숙주 세포로서는, 상기 A-4. 섹션에 기재되는 것을 특별히 제한없도록 할 수 있다. 또한, 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법에 대해서는, 상기 A-4. 섹션의 기재에 따라서 행할 수 있다.
상기 재조합 세포는 에쿠올 변환 효소인 E3 폴리펩티드를 생산할 수 있기 때문에, 에쿠올 변환 효소의 제조를 위해 이용할 수 있고, 또한 세포 상태 그대로 에쿠올의 제조에 이용할 수도 있다.
C-5. 재조합 세포를 이용한 폴리펩티드의 제조
E3 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포를 배양하고, 배양물로부터 E3 폴리펩티드를 회수함으로써 E3 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 배양은 상기 A-5. 섹션의 기재에 따라서 행할 수 있다.
C-6. E3 폴리펩티드를 이용한 에쿠올의 제조
본 발명은 E3 폴리펩티드를 이용한 에쿠올의 제조 방법을 제공한다. 즉, 상기 제조 방법에서는, E3 폴리펩티드를 테트라히드로다이드제인에 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 에쿠올으로 변환시킨다.
본 제조 방법에 채용되는 반응은 적당한 완충액 중에서 행할 수 있다. 구체적으로는, 상기 A-6. 섹션에 기재되는 완충액을 사용할 수 있다.
본 제조 방법에 채용되는 반응은 예를 들면 반응 개시시에 완충액(반응 개시시의 원료 혼합물) 중에서 각 성분을 하기의 농도 범위를 만족시키도록 첨가하고, 상기 E3 폴리펩티드, 테트라히드로다이드제인 등의 원료, 및 에쿠올 등의 생성물이 변질ㆍ불활성화되지 않는 온도 조건에서 0.5 내지 10 시간, 바람직하게는 1 내지 6 시간, 더욱 바람직하게는 2 내지 4 시간 인큐베이션함으로써 실시된다. 이러한 온도 조건이면 반응 온도는 한정되지 않지만, 예를 들면 0 ℃ 이하로 설정할 때는, 이들 반응 온도에서 동결되지 않는 완충액 등이 이용된다. 반응 온도는 바람직하게는 0 내지 45 ℃, 더욱 바람직하게는 0 내지 37 ℃가 예시된다.
상기 E3 폴리펩티드가 0.0001 내지 1.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.01 중량％;
테트라히드로다이드제인이 0.0001 내지 10.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％.
또한, 본 발명은 에쿠올을 합성하기 위한 혼합 원료로서, (Ci) E3 폴리펩티드 및 (Cii) 테트라히드로다이드제인을 함유하는 에쿠올 합성 원료 조성물을 제공한다. 상기 합성 원료 조성물을 상술하는 조건에서 인큐베이션함으로써, 상기 합성 원료 조성물 중의 테트라히드로다이드제인을 에쿠올로 변환시킬 수 있다. 상기 합성 원료 조성물은 상기 에쿠올의 제조에 있어서 반응 개시시의 원료 혼합물에 상당하는 것이고, 상기 합성 원료 조성물에서의 E3 폴리펩티드의 배합 농도, 테트라히드로다이드제인의 배합 농도, 및 상기 합성 원료 조성물에 배합 가능한 다른 성분 등에 대해서도, 상기 제조 방법에 채용되는 반응계(반응 개시시의 원료 혼합 용액)의 경우와 동일하다.
또한, 본 발명은 에쿠올을 합성하기 위한 키트로서, (Ci) E3 폴리펩티드 및 (Cii) 테트라히드로다이드제인을 함유하는 에쿠올 합성용 키트를 제공한다. 상기 합성용 키트에는 상술하는 조건에서 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올의 합성을 간이하게 실시할 수 있도록, 각 성분이 필요에 따라서 구분되어 구비될 수 있다. 또한, 상기 합성용 키트에는 필요에 따라서 사용하는 완충액이 포함될 수도 있다. 또한, 상기 합성용 키트는 에쿠올의 합성을 간이하게 행하기 위해서 필요한 기구나 조작 메뉴얼을 포함할 수도 있다.
C-7. 에쿠올 합성 효소 조성물
본 발명은, 또한 E3 폴리펩티드를 포함하는 에쿠올 합성 효소 조성물을 제공한다. 상기 효소 조성물은 E3 폴리펩티드를 이용한 에쿠올의 제조 방법에서 에쿠올 합성 효소로서 바람직하게 사용된다.
상기 효소 조성물은 조정제 상태의 E3 폴리펩티드일 수도 있고, 또한 조정제 또는 정제된 E3 폴리펩티드를 적당한 담체에 배합한 것일 수도 있다. 상기 담체는 E3 폴리펩티드의 활성에 악영향을 주지 않는 것으로 적당량 배합된다.
상기 효소 조성물에서 E3 폴리펩티드의 배합 비율에 대해서는, 상기 에쿠올의 제조 방법에서 에쿠올 합성 효소로서 사용할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로는, 상기 효소 조성물의 총량당 E3 폴리펩티드가 0.001 내지 20.0 중량％, 바람직하게는 0.005 내지 5.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1.0 중량％가 예시된다.
또한, 상기 효소 조성물에는 E3 폴리펩티드 외에, 상기 폴리펩티드의 안정성을 향상시키기 위해서 및/또는 보존성을 담보하기 위해서, 상기 A-7. 섹션에 기재된 각종 항산화제나 보존제를 첨가할 수도 있다.
C-8. 상기 재조합 세포를 이용한 에쿠올의 제조 방법
본 발명은 E3 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포를 이용한 에쿠올의 제조 방법을 제공한다. 즉, 상기 제조 방법에서는, 상기 재조합 세포를 테트라히드로다이드제인에 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 에쿠올으로 변환시킨다.
본 제조 방법에 채용되는 반응은 상기 재조합 세포가 생존할 수 있으며, 테트라히드로다이드제인을 에쿠올로 변환시킬 수 있는 환경하에서 실시된다.
구체적으로는, 상기 재조합 세포가 생육 가능한 배지 중에 상기 재조합 세포 및 테트라히드로다이드제인을 적당량 첨가하여 배양을 행함으로써 실시된다.
본 제조 방법에서 사용되는 배지는 재조합 세포의 숙주 세포로서 채용한 세포의 종류에 따라서 관용되는 각종의 것을 적절하게 선택 이용된다.
또한, 상기 배지에는, 필요에 따라서 PMSF, EDTA 등의 프로테아제 저해제를 적당량 첨가할 수도 있다. 또한, 상기 폴리펩티드가 혐기성균 유래인 것을 고려하면, DTT, 2ME, DET, 히드로아황산나트륨 등의 환원제를 적당량 첨가할 수도 있다. 또한, 상기 재조합 세포를 이용하는 경우, NADPH 및/또는 NADH의 첨가는 필수가 아니지만, 필요에 따라서 배지 중에 NADPH 및/또는 NADH를 첨가할 수도 있다.
본 제조 방법은 구체적으로는 테트라히드로다이드제인을 0.001 내지 1 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 중량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.1 중량％을 포함하는 배지에 상기 재조합 세포를 접종하여 생육 가능 온도 조건하에서 7 내지 30 시간, 바람직하게는 15 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 17 내지 20 시간 인큐베이션함으로써 실시된다. 여기서, 생육 가능 온도 조건은 특별히 한정되지 않고, 상기 C-6. 섹션에 기재된 온도와 동일한 온도에서 실시할 수 있다.
또한, 본 발명은 에쿠올을 합성하기 위한 혼합 원료로서, (Ciii) 상기 재조합 세포 및 (Cii) 테트라히드로다이드제인을 함유하는 에쿠올 합성 원료 조성물을 제공한다. 상기 합성 원료 조성물을 상술하는 조건에서 배양함으로써, 상기 합성 원료 조성물 중의 테트라히드로다이드제인을 에쿠올로 변환시킬 수 있다. 상기 합성 원료 조성물은 상기 에쿠올의 제조에 있어서 반응 개시시의 원료 혼합물에 상당하는 것이고, 상기 합성 원료 조성물에서의 상기 재조합 세포 및 테트라히드로다이드제인의 농도, 및 상기 합성 원료 조성물에 배합 가능한 다른 성분 등에 대해서도, 상기 제조 방법에 채용되는 조건 등과 동일하다.
또한, 본 발명은 에쿠올을 합성하기 위한 키트로서, (Ciii) 상기 재조합 세포 및 (Cii) 테트라히드로다이드제인을 함유하는 에쿠올 합성용 키트를 제공한다. 상기 합성용 키트에는 상술하는 조건에서 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올의 합성을 간이하게 실시할 수 있도록, 상기 재조합 세포와 테트라히드로다이드제인이 필요에 따라서 구분되어 구비될 수 있다. 또한, 상기 합성용 키트에는 필요에 따라서 완충액이나 배지가 포함될 수도 있다. 또한, 상기 합성용 키트는 에쿠올의 합성을 간이하게 행하기 위해서 필요한 기구나 조작 메뉴얼을 포함할 수도 있다.
또한, 상기 합성용 키트에 포함되는 상기 재조합 세포는 공지된 방법으로 보존된 것일 수도 있다. 재조합 세포를 보존하는 기술은 공지되어 있으며, 예를 들면 디메틸포름아미드 등에 재조합 세포를 넣어 동결 건조기에서 앰플이 진공 상태가 되도록 처리한 후, 4 내지 25 ℃에서 보존하는 방법 등을 들 수 있다. 이 외에도, 10 ％ 글리세롤 첨가 보존 배지에 균체를 현탁시키고, 이것을 전용 앰플에 넣어 액체 질소 탱크(-150 내지 -196 ℃)에서 보관하는 액체 질소법을 들 수 있다.
C-9. 상기 폴리펩티드에 결합성을 갖는 항체
본 발명은, 또한 E3 폴리펩티드에 결합성을 갖는 항체(IgG 항체)를 제공한다.
모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체는 종래법에 따라서 제조된다. 구체적으로는, 상기 A-9. 섹션에 기재된 방법에 따라서 제조할 수 있다.
C-10. 상기 폴리펩티드를 검출 또는 측정하는 면역학적 방법
또한, 본 발명은 상기 항체를 이용하여 E3 폴리펩티드를 검출 또는 측정하는 면역학적 방법을 제공한다. 구체적으로는, 상기 면역학적 방법은 상기 A-10. 섹션에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.
본 발명은 E3 폴리펩티드를 검출 또는 측정하기 위한 키트로서, 상기 항체를 함유하는 면역학적 검출용 키트를 제공한다. 상기 검출용 키트에는 필요에 따라서 E3 폴리펩티드가 표준품으로서 포함될 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트에는 상술하는 조건에서 E3 폴리펩티드의 검출을 간이하게 실시할 수 있도록, 그 외에 사용되는 시약 등이 필요에 따라서 구비될 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트는 E3 폴리펩티드의 검출을 간이하게 행하기 위해서 필요한 기구나 조작 메뉴얼을 포함할 수도 있다.
C-11. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 검출 또는 측정 방법
본 발명은 E3 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 구체적으로는 E3 폴리뉴클레오티드에 결합하는 프로브를 피검 시료와 접촉시킴으로써 실시되고, 상기 A-11. 섹션에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다.
또한, 본 발명은 E3 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 측정하기 위한 키트로서, 상기 프로브를 함유하는 E3 폴리뉴클레오티드 검출용 키트를 제공한다. 상기 검출용 키트에는 상술하는 조건에서 E3 폴리뉴클레오티드의 검출을 간이하게 실시할 수 있도록, 상기 프로브 이외에 사용되는 시약 등이 필요에 따라서 구비될 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트는 E3 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 동정하기 위한 키트로서 사용할 수도 있다. 또한, 상기 검출용 키트로서는, 정밀도가 높은 검출을 가능하게 한다는 관점에서, 바람직하게는 PCR에 의한 검출을 행하기 위한 키트를 들 수 있다.
D. E1 내지 E3 효소를 사용한 에쿠올 또는 그의 중간체의 제조 방법
D-I-1. 제1 공정 및 제2 공정을 포함하는 테트라히드로다이드제인의 제조 방법
본 발명은 이하의 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을 생성하는 제1 공정, 및 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 생성하는 제2 공정을 포함하는 테트라히드로다이드제인의 제조 방법(이하, 상기 제조 방법을 「제1 제조 방법」이라고 표기하는 경우도 있음)을 제공한다.
(제1 공정) 다이드제인에 이하의 (Aa) 내지 (Ac) 중 어느 하나인 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 및 NADPH 및/또는 NADH를 작용시킴으로써 디히드로다이드제인을 생성하는 공정:
(Aa) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Ab) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Ac) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
(제2 공정) 디히드로다이드제인에 이하의 (Ba) 내지 (Bc) 중 어느 하나인 폴리펩티드(이하, 상기 폴리펩티드를 「E2 폴리펩티드」라고 표기하는 경우도 있음)로 이루어지는 효소, 및 NADPH 및/또는 NADH를 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 생성하는 공정:
(Ba) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Bb) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Bc) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
본 발명의 제1 제조 방법에서는 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을, 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
제1 공정
제1 공정에서는, E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 NADPH 및/또는 NADH의 존재하에서 다이드제인에 작용시킴으로써 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킨다. 제1 공정에 채용되는 반응은 상기 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 다이드제인 및 NADPH 및/또는 NADH를 함유하는 용액 중에서 상기 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 다이드제인 등의 원료 및 디히드로다이드제인 등의 생성물이 변질ㆍ불활성화되지 않는 온도 조건 및 시간 인큐베이션함으로써 실시된다. 구체적으로는, 상기 A-6. 섹션에 기재된 조건에 따라서 실시할 수 있다.
상기 제1 공정과 후술하는 제2 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우에는, 제1 및 제2 공정을 둘다 효율적으로 실시하는 관점에서, 채용되는 반응은 반응 개시시의 반응계(반응 개시시의 원료 혼합물)에서 각 성분을 하기의 농도 범위를 만족시키도록 원료 혼합물을 제조하고, 이것을 15 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 내지 40 ℃, 더욱 바람직하게는 30 내지 38 ℃의 온도 조건에서 0.5 내지 10 시간, 바람직하게는 1 내지 6 시간, 더욱 바람직하게는 2 내지 4 시간 인큐베이션함으로써 실시된다:
E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 0.0001 내지 1.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.01 중량％;
다이드제인이 0.0001 내지 10.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％; 및
NADPH/또는 NADH가 0.01 내지 5 중량％, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량％.
제1 공정에서 기질로서 사용되는 다이드제인의 유래는 한정되지 않는다. 예를 들면 시판되는 다이드제인을 사용할 수도 있고, 적절하게 생성 또는 합성한 다이드제인을 사용할 수도 있다.
또한, 예를 들면 제1 공정에서 디히드로다이드제인을 생성하기 위한 혼합 원료로서, (Ai) E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소, (Aii) NADPH 및/또는 NADH, 및 (Aiii) 다이드제인을 함유하는 디히드로다이드제인 합성 원료 조성물을 사용할 수도 있다. 상기 합성 원료 조성물을 상술하는 조건에서 인큐베이션함으로써, 상기 합성 원료 조성물 중의 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킬 수 있다. 상기 합성 원료 조성물은 상기 A-6. 및 A-7. 섹션에서 보다 자세히 설명된다.
제2 공정
제2 공정에서는, E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 NADPH 및/또는 NADH의 존재하에서 디히드로다이드제인에 작용시킴으로써 디히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로 변환시킨다.
제2 공정에 채용되는 반응은 예를 들면 상기 E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 디히드로다이드제인 및 NADPH 및/또는 NADH를 함유하는 용액 중에서 상기 E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 디히드로다이드제인 등의 원료 및 테트라히드로다이드제인 등의 생성물이 변질ㆍ불활성화되지 않는 온도 조건 및 시간 인큐베이션함으로써 실시된다. 구체적으로는, 상기 B-6. 섹션에 기재된 조건에 따라서 실시할 수 있다.
테트라히드로다이드제인에는 시스형 및 트랜스형이 존재하지만, 상기 반응 온도나 시간 등의 조건을 변경함으로써 시스형과 트랜스형의 생성을 대조군하는 것도 가능하다. 예를 들면, 반응 온도 0 ℃로 하여 시스형 및 트랜스형이 혼재한 테트라히드로다이드제인을 생성시키는 것이 가능하고, 37 ℃로 하여 트랜스형을 우선하여 생성시키는 것이 가능하다.
또한, 상술한 제1 공정과 제2 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우에는, 제1 및 제2 공정을 둘다 효율적으로 실시하는 관점에서, 채용되는 반응은 상기 「제1 공정」에 기재된, 제1 공정과 제2 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우의 조건에서 양자(兩者)를 인큐베이션함으로써 실시된다. 이 경우, E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 디히드로다이드제인, 및 NADPH 및/또는 NADH의 농도는 이하와 같이 설정할 수 있다:
E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 0.0001 내지 1.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.01 중량％;
디히드로다이드제인이 0.0001 내지 10.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％; 및
NADPH 및/또는 NADH가 0.01 내지 5 중량％, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량％.
단, 제1 공정과 제2 공정을 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소 및 E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 공존하에서 행하는 경우에는, E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 사용한 디히드로다이드제인의 생성 반응을 효율적으로 실시하는 관점에서, NADPH가 필수이다. 이 경우, NADPH의 농도는 상기 「제1 공정」에 기재된, 제1 공정과 제2 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우의 조건에 기초하여 결정된다. 또한, NADPH와 병용되는 NADH의 농도는 0.01 내지 5 중량％, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량％로 설정된다.
제2 공정에서도 기질로서 사용되는 디히드로다이드제인의 유래는 한정되지 않는다.
예를 들면, 제1 공정에서 다이드제인으로부터 생성된 디히드로다이드제인을 제2 공정에서의 기질로서 사용할 수도 있다. 이 경우, 상기 디히드로다이드제인으로서는, 제1 공정에서 생성된 디히드로다이드제인을 함유하는 용액 그대로일 수도 있고, 조정제된 것일 수도 있으며, 정제된 것일 수도 있다.
또한, 예를 들면 시판되는 디히드로다이드제인을 사용할 수도 있고, 적절하게 합성한 디히드로다이드제인을 사용할 수도 있다.
또한, 제2 공정에서 테트라히드로다이드제인을 합성하기 위한 혼합 원료로서, (Bi) E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소, (Bii) NADPH 및/또는 NADH, 및 (Biii) 디히드로다이드제인을 함유하는 테트라히드로다이드제인 합성 원료 조성물을 사용할 수도 있다. 상기 합성 원료 조성물을 상술하는 조건에서 인큐베이션함으로써, 상기 합성 원료 조성물 중의 디히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로 변환시킬 수 있다. 상기 구성 원료 조성물에 관한 설명은 상기 B-6. 및 A-7. 섹션에서 보다 자세히 설명된다.
제2 공정에서는, 제1 공정에서 다이드제인으로부터 생성된 디히드로다이드제인이 제2 공정에서의 기질로서 바람직하게 사용되고, 시판되는 디히드로다이드제인, 상기 합성 원료 조성물, 상기 효소 조성물 등이 병용될 수도 있다.
E1 폴리펩티드 및 E2 폴리펩티드
본 발명의 제1 제조 방법에서는, 상기 A-1.에 기재된 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소 및 상기 B-1.에 기재된 E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 사용된다.
D-I-2. 제1 제조 방법에 의해 제조된 테트라히드로다이드제인을 함유하는 생성물
본 발명은 제1 공정 및 제2 공정을 포함하는 테트라히드로다이드제인의 제조 방법(제1 제조 방법)에 의해 제조된 테트라히드로다이드제인을 함유하는 생성물을 제공한다.
상술한 대로 본 발명의 제1 제조 방법에서는 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을, 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 제조할 수 있다.
이로부터, 본 발명의 제1 제조 방법에 의해 제조된 테트라히드로다이드제인을 함유하는 생성물에는, 테트라히드로다이드제인 뿐만 아니라 디히드로다이드제인, 다이드제인이 더 함유되는 경우도 있다.
또한, 본 발명의 생성물은 제1 제조 방법에 의해 얻어지는 용액 그대로일 수도 있고, 상기 용액으로부터 테트라히드로다이드제인 등이 조정제된 것일 수도 있고, 더 정제된 것일 수도 있다.
본 발명의 생성물은 음식품, 화장료, 의약품 등에 배합할 수 있고, 또한 기질로서 사용할 수도 있다.
D-I-3. 제2 공정 및 제3 공정을 포함하는 에쿠올의 제조 방법
본 발명은 이하의 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 생성하는 제2 공정, 및 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 생성하는 제3 공정을 포함하는 에쿠올의 제조 방법(이하, 상기 제조 방법을 「제2 제조 방법」이라고 표기하는 경우도 있음)을 제공한다.
(제2 공정) 디히드로다이드제인에 이하의 (Ba) 내지 (Bc) 중 어느 하나인 폴리펩티드(이하, 상기 폴리펩티드를 「E2 폴리펩티드」라고 표기하는 경우도 있음)로 이루어지는 효소, 및 NADPH 및/또는 NADH를 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 생성하는 공정:
(Ba) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Bb) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Bc) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
(제3 공정) 테트라히드로다이드제인에 이하의 (Ca) 내지 (Cc) 중 어느 하나인 폴리펩티드(이하, 상기 폴리펩티드를 「E3 폴리펩티드」라고 표기하는 경우도 있음)로 이루어지는 효소를 작용시킴으로써 에쿠올을 제조하는 공정,
(Ca) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드;
(Cb) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드;
(Cc) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 대하여 60 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
본 발명의 제2 제조 방법에서는 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을, 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
제2 공정
본 발명의 제2 제조 방법에 함유되는 제2 공정은 상술한 제1 제조 방법에 함유되는 제2 공정과 동일하게 설명된다.
또한, 제2 공정과 후술하는 제3 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우에는, 제2 및 제3 공정을 둘다 효율적으로 실시하는 관점에서, 채용되는 반응은 반응 개시시의 반응계(반응 개시시의 원료 혼합물)에서 각 성분을 하기의 농도 범위를 만족시키도록 원료 혼합물을 제조하고, 이것을 15 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 내지 40 ℃, 더욱 바람직하게는 30 내지 38 ℃의 온도 조건에서 0.5 내지 10 시간, 바람직하게는 1 내지 6 시간, 더욱 바람직하게는 2 내지 4 시간 인큐베이션함으로써 실시된다:
E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 0.0001 내지 1.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.01 중량％;
디히드로다이드제인이 0.0001 내지 10.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％; 및
NADPH 및/또는 NADH가 0.01 내지 5 중량％, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량％.
제3 공정
제3 공정에서는, E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 테트라히드로다이드제인에 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 에쿠올으로 변환시킨다.
제3 공정에 채용되는 반응은 상기 E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 테트라히드로다이드제인을 함유하는 용액 중에서 상기 E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 테트라히드로다이드제인 등의 원료 및 에쿠올 등의 생성물이 변질ㆍ불활성화되지 않는 온도 조건 및 시간 인큐베이션함으로써 실시된다. 구체적으로는, 상기 A-6. 섹션에 기재된 조건에 따라서 상기 반응을 행할 수 있다.
상술한 제2 공정과 제3 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우에는, 제2 및 제3 공정을 둘다 효율적으로 실시하는 관점에서, 채용되는 반응은 상기 「제2 공정」에 기재된, 제2 공정과 제3 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우의 조건에서 양자를 인큐베이션함으로써 실시된다. 이 경우, E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 테트라히드로다이드제인, 및 NADPH 및/또는 NADH의 농도는 이하와 같이 설정할 수 있다:
E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 0.0001 내지 1.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.01 중량％;
테트라히드로다이드제인이 0.0001 내지 10.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％; 및
NADPH 및/또는 NADH가 0.01 내지 5 중량％, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량％.
제3 공정에서도, 기질로서 사용되는 테트라히드로다이드제인의 유래는 한정되지 않는다.
예를 들면, 제2 공정에서 디히드로다이드제인으로부터 생성된 테트라히드로다이드제인을 제3 공정에서의 기질로서 사용할 수도 있다. 이 경우, 상기 테트라히드로다이드제인으로서는, 제2 공정에서 생성된 테트라히드로다이드제인을 함유하는 용액 그대로일 수도 있고, 조정제된 것일 수도 있으며 정제된 것일 수도 있다.
또한, 예를 들면 시판되는 테트라히드로다이드제인을 사용할 수도 있고, 적절하게 합성한 테트라히드로다이드제인을 사용할 수도 있다.
또한, 제3 공정에서 에쿠올을 합성하기 위한 혼합 원료로서, (Ci) E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소 및 (Cii) 테트라히드로다이드제인을 함유하는 에쿠올 합성 원료 조성물을 사용할 수도 있다. 상기 합성 원료 조성물을 상술하는 조건에서 인큐베이션함으로써, 상기 합성 원료 조성물 중의 테트라히드로다이드제인을 에쿠올로 변환시킬 수 있다. 상기 합성 원료 조성물의 설명은 상기 C-6. 및 C-7. 섹션에서 보다 자세히 설명된다.
제3 공정에서는, 제2 공정에서 디히드로다이드제인으로부터 생성된 테트라히드로다이드제인이 제3 공정에서의 기질로서 바람직하게 사용되고, 시판되는 테트라히드로다이드제인, 상기 합성 원료 조성물, 상기 효소 조성물 등이 병용될 수도 있다.
E2 폴리펩티드 및 E3 폴리펩티드
본 발명의 제2 제조 방법에서는, 상기 B-1. 섹션에 기재된 E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소 및 상기 C-1. 섹션에 기재된 E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 사용된다.
D-I-4. 제2 제조 방법에 의해 제조된 에쿠올을 함유하는 생성물
본 발명은 제2 공정 및 제3 공정을 포함하는 에쿠올의 제조 방법(제2 제조 방법)에 의해 제조된 에쿠올을 함유하는 생성물을 제공한다.
상술한 대로 본 발명의 제2 제조 방법에서는 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
이로부터, 본 발명의 제2 제조 방법에 의해 제조된 에쿠올을 함유하는 생성물에는 에쿠올뿐만 아니라 테트라히드로다이드제인, 또한 디히드로다이드제인이 함유되는 경우도 있다.
또한, 본 발명의 생성물은 제2 제조 방법에 의해 얻어지는 용액 그대로일 수도 있고, 상기 용액으로부터 에쿠올 등이 조정제된 것일 수도 있고, 더 정제된 것일 수도 있다.
본 발명의 생성물은 음식품, 화장료, 의약품 등에 배합할 수 있고, 또한 기질로서 사용할 수도 있다.
D-I-5. 제1 공정 내지 제3 공정을 포함하는 에쿠올의 제조 방법
본 발명은 상기 제1 공정, 제2 공정 및 제3 공정을 포함하는 에쿠올의 제조 방법(이하, 상기 제조 방법을 「제3 제조 방법」이라고 표기하는 경우도 있음)을 제공한다.
본 발명의 제3 제조 방법에서는 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을, 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
제1 공정
본 발명의 제3 제조 방법에 함유되는 제1 공정에서는, E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 NADPH 및/또는 NADH의 존재하에서 다이드제인에 작용시킴으로써 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킨다. 본 발명의 제3 제조 방법에 함유되는 제1 공정은 상술한 제1 공정과 동일하게 설명된다.
또한, 제1 공정 및 제2 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우, 제1 공정 및 제3 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우, 또는 제1 공정 내지 제3 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우에는, 이들 공정을 효율적으로 실시하는 관점에서 채용되는 반응은 상기 「제1 공정」에 기재된, 제1 공정 및 제2 공정 등을 동일한 조건에서 실시하는 경우에 기초하는 조건ㆍ각 농도에서 인큐베이션함으로써 실시된다.
제2 공정
본 발명의 제3 제조 방법에 함유되는 제2 공정에서는, E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 NADPH 및/또는 NADH의 존재하에서 디히드로다이드제인에 작용시킴으로써 디히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로 변환시킨다. 제2 공정은 상술한 제2 공정과 동일하게 설명된다.
또한, 상기 제1 공정 및 제2 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우 또는 제1 공정 내지 제3 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우에는, 각 공정을 효율적으로 실시하는 관점에서, 채용되는 반응은 상기 「제2 공정」에 기재된, 제1 공정 및 제2 공정 등을 동일한 조건에서 실시하는 경우에 기초하는 조건ㆍ각 농도에서 인큐베이션함으로써 실시된다.
또한, 제1 공정 및 제2 공정을 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소 및 E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 공존하에서 행하는 경우, 또는 제1 공정 내지 제3 공정을 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소, E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소 및 E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 공존하에서 행하는 경우에도, 상기 「제2 공정」 등에 기재된, E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소 및 E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 공존하에서 행하는 경우의 조건ㆍ각 농도에서 인큐베이션함으로써 실시된다.
또한, 제2 공정 및 제3 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우에는, 각 공정을 효율적으로 실시하는 관점에서, 채용되는 반응은 상기 「제2 공정」에 기재된, 제2 공정 및 제3 공정 등을 동일한 조건에서 실시하는 경우에 기초하는 조건ㆍ각 농도에서 인큐베이션함으로써 실시된다.
제3 공정
본 발명의 제3 제조 방법에 함유되는 제3 공정에서는, E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 테트라히드로다이드제인에 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 에쿠올으로 변환시킨다. 제3 공정은 상술한 제3 공정과 동일하게 설명된다.
또한, 상기 제1 공정 및 제3 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우 또는 제1 공정 내지 제3 공정을 동일한 조건에서 실시하는 경우에는, 각 공정을 효율적으로 실시하는 관점에서, 채용되는 반응은 상기 「제1 공정」에 기재된, 제1 공정 및 제2 공정 등을 동일한 조건에서 실시하는 경우의 조건에서 인큐베이션함으로써 실시된다. 이 경우, E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 테트라히드로다이드제인, 및 NADPH 및/또는 NADH의 농도는 이하와 같이 설정할 수 있다:
E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 0.0001 내지 1.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.01 중량％;
테트라히드로다이드제인이 0.0001 내지 10.0 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％; 및
NADPH 및/또는 NADH가 0.01 내지 5 중량％, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량％.
단, 제1 공정 및 제3 공정을 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소 및 E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 공존하에서 행하는 경우, 또는 제1 공정 내지 제3 공정을 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소, E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소 및 E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 공존하에서 행하는 경우에는, 상술한 바와 같이 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 사용한 디히드로다이드제인의 생성 반응을 효율적으로 실시하는 관점에서, NADPH가 필수이다. 이 경우, NADPH의 농도는 상기 「제1 공정」에 기재된, 제1 공정 및 제2 공정 등을 동일한 조건에서 실시하는 경우의 조건에 기초하여 결정된다. 또한, NADPH와 병용되는 NADH의 농도는 상기 「제2 공정」에 기재된, E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소 및 E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 공존하에서 행하는 경우의 조건, 및 상기 「제2 공정」에 기재된, 제2 공정 및 제3 공정 등을 동일한 조건에서 실시하는 경우의 조건에 기초하여 결정된다.
E1 내지 E3 폴리펩티드
본 발명의 제3 제조 방법에서는, 상기 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소, E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소 및 E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 사용된다. E1 내지 E3 폴리펩티드는 상술한 바와 동일하게 설명된다.
D-I-6. 제3 제조 방법에 의해 제조된 에쿠올을 함유하는 생성물
본 발명은 제1 공정 내지 제3 공정을 포함하는 에쿠올의 제조 방법(제3 제조 방법)에 의해 제조된 에쿠올을 함유하는 생성물을 제공한다.
상술한 대로 본 발명의 제3 제조 방법에서는 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을, 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을, 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
이로부터, 본 발명의 제3 제조 방법에 의해 제조된 에쿠올을 함유하는 생성물에는 에쿠올뿐만 아니라 테트라히드로다이드제인, 디히드로다이드제인, 다이드제인이 함유되는 경우도 있다.
또한, 본 발명의 생성물은 제3 제조 방법에 의해 얻어지는 용액 그대로일 수도 있고, 상기 용액으로부터 에쿠올 등이 조정제된 것일 수도 있고, 더 정제된 것일 수도 있다.
본 발명의 생성물은 음식품, 화장료, 의약품 등에 배합할 수 있고, 또한 기질로서 사용할 수도 있다.
D-I-7. 제4 공정 내지 제6 공정 중 적어도 2개의 공정을 포함하는 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조 방법
본 발명은, 이하의 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을 생성하는 제4 공정, 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 생성하는 제5 공정, 및 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 생성하는 제6 공정 중 적어도 2개의 공정을 포함하는 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조 방법(이하, 상기 제조 방법을 「제4 제조 방법」이라고 표기하는 경우도 있음)을 제공한다.
(제4 공정) (Ad) 내지 (Af) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드(이하, 상기 폴리뉴클레오티드를 「E1 폴리뉴클레오티드」라고 표기하는 경우도 있음)를 갖는 재조합 세포를 다이드제인에 작용시킴으로써 디히드로다이드제인을 생성시키는 공정:
(Ad) 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Ae) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Af) 상기 (Ad) 또는 (Ae)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(제5 공정) (Bd) 내지 (Bf) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드(이하, 상기 폴리뉴클레오티드를 「E2 폴리뉴클레오티드」라고 표기하는 경우도 있음)를 갖는 재조합 세포를 디히드로다이드제인에 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 생성시키는 공정:
(Bd) 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Be) 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Bf) 상기 (Bd) 또는 (Be)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(제6 공정) (Cd) 내지 (Cf) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드(이하, 상기 폴리뉴클레오티드를 「E3 폴리뉴클레오티드」라고 표기하는 경우도 있음)를 갖는 재조합 세포를, 테트라히드로다이드제인에 작용시킴으로써 에쿠올을 생성시키는 공정:
(Cd) 서열 번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(Ce) 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(Cf) 상기 (Cd) 또는 (Ce)의 폴리뉴클레오티드 상보쇄에 대하여 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 제4 제조 방법에서는, 제4 내지 6 공정의 각종 조합에 따라서 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올 제조할 수 있다.
본 발명의 제4 제조 방법은 상술한 대로 제4 공정, 제5 공정 및 제6 공정 중 적어도 2개의 공정을 포함한다.
예를 들면, 본 발명의 제4 제조 방법이 제4 공정 및 제5 공정의 2 공정을 포함하고 제6 공정을 포함하지 않는 경우, 본 발명의 제4 제조 방법에서는 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을, 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 제조할 수 있다.
또한, 예를 들면 본 발명의 제4 제조 방법이 제5 공정 및 제6 공정의 2 공정을 포함하고 제4 공정을 포함하지 않는 경우, 본 발명의 제4 제조 방법에서는 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을, 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
본 발명의 제4 제조 방법이 제4 내지 6 공정의 3 공정을 포함하는 경우, 본 발명의 제4 제조 방법에서는 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을, 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을, 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
본 발명의 제4 제조 방법에서 사용되는 재조합 세포는 하나의 세포 내에 (Ad) 내지 (Af), (Bd) 내지 (Bf) 및 (Cd) 내지 (Cf)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드를 가질 수도 있고, 상기 군으로부터 선택되는 2종 이상의 폴리뉴클레오티드를 가질 수도 있다.
예를 들면, 하나의 세포가 (Ad) 내지 (Af)로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드와 (Bd) 내지 (Bf)로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드의 2종을 갖는 경우, 이 재조합 세포를 이용함으로써 제4 공정 및 제5 공정을 1종류의 재조합 세포에 의해 실시할 수 있다.
또한, 예를 들면 하나의 세포가, (Ad) 내지 (Af)로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드와 (Bd) 내지 (Bf)로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드와 (Cd) 내지 (Cf)로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드의 3종을 갖는 경우, 이 재조합 세포를 이용함으로써 제4 공정 내지 제6 공정을 1종류의 재조합 세포에 의해 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 제4 제조 방법에서는, 예를 들면 상술한 바와 같은, (Ad) 내지 (Af)로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드와 (Bd) 내지 (Bf)로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드의 합계 2종을 갖는 재조합 세포와, (Cd) 내지 (Cf)로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 이용함으로써도 제4 공정 내지 제6 공정을 실시할 수 있다.
동일하게, 예를 들면 본 발명의 제4 제조 방법에서는, (Ad) 내지 (Af)로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드와 (Cd) 내지 (Cf)로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드의 합계 2종을 갖는 재조합 세포와, (Bd) 내지 (Bf)로부터 선택되는 1종의 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 이용함으로써도 제4 공정 내지 제6 공정을 실시할 수 있다.
제4 공정
제4 공정에서는, 상기 A-2. 섹션에 기재된 E1 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 다이드제인에 작용시킴으로써 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킨다.
제4 공정에 채용되는 반응은 상기 제1 공정과 동일한 조건에서 행할 수 있다. 구체적으로는, 다이드제인을 0.001 내지 1 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 1 중량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.5 중량％을 포함하는 배지에 상기 재조합 세포를 접종하여 생육 가능 온도 조건하에서 6 내지 30 시간, 바람직하게는 7 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 7 내지 18 시간 인큐베이션함으로써 실시된다. 여기서, 생육 가능 온도 조건은 특별히 한정되지 않고, 상기 「제1 공정」과 동일한 온도에서 실시할 수 있다.
제4 공정에서 사용되는 재조합 세포
제4 공정에서 사용되는 재조합 세포는 E1 폴리뉴클레오티드를 가지고, E1 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 한 제한되지 않는다. 구체적으로는, 상기 A-4. 섹션에 기재된 재조합 세포를 사용할 수 있다.
E1 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 이용한 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 제조
E1 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포를 배양하고, 세포 및/또는 배양물로부터 E1 폴리펩티드를 회수함으로써, E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 제조할 수 있다. 구체적으로는, 상기 A-5. 섹션에 기재된 조건에 따라서 상기 재조합 세포를 배양함으로써 E1 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
제5 공정
제5 공정에서는, 상기 B-2. 섹션에 기재된 E2 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 디히드로다이드제인에 작용시킴으로써 디히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로 변환시킨다.
제5 공정에 채용되는 반응은 상기 제2 공정과 동일한 조건에서 행할 수 있다. 구체적으로는, 디히드로다이드제인을 0.001 내지 1 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 중량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.1 중량％을 포함하는 배지에 상기 재조합 세포를 접종하여 생육 가능 온도 조건하에서 7 내지 30 시간, 바람직하게는 15 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 17 내지 20 시간 인큐베이션함으로써 실시된다. 여기서, 생육 가능 온도 조건은 특별히 한정되지 않고, 상기 「제2 공정」과 동일한 온도에서 실시할 수 있다.
제5 공정에서 사용되는 재조합 세포
제5 공정에서 사용되는 재조합 세포는 상기 B-2. 섹션에 기재된 E2 폴리뉴클레오티드를 가지고, E2 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 한 제한되지 않는다. 구체적으로는, 상기 B-4. 섹션에 기재된 재조합 세포를 사용할 수 있다.
E2 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 이용한 E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 제조
E2 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포를 배양하고, 세포 및/또는 배양물로부터 E2 폴리펩티드를 회수함으로써, E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 제조할 수 있다.
또한, E2 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포의 배양, 배양에 이용되는 배지, E2 폴리펩티드의 분리ㆍ정제는, 상기 「E1 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 이용한 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 제조」와 동일하게 하여 실시할 수 있다.
제6 공정
제6 공정에서는, 상기 C-2. 섹션에 기재된 E3 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를, 테트라히드로다이드제인에 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 에쿠올으로 변환시킨다.
제6 공정에 채용되는 반응은 상기 제3 공정과 동일한 조건에서 행할 수 있다. 예를 들면, 테트라히드로다이드제인을 0.001 내지 1 중량％, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 중량％, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.1 중량％을 포함하는 배지에 상기 재조합 세포를 접종하여 생육 가능 온도 조건하에서 7 내지 30 시간, 바람직하게는 15 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 17 내지 20 시간 인큐베이션함으로써 실시된다. 여기서, 생육 가능 온도 조건은 특별히 한정되지 않고, 상기 「제3 공정」과 동일한 온도에서 실시할 수 있다.
제6 공정에서 기질로서 사용되는 테트라히드로다이드제인의 유래는 한정되지 않는다.
예를 들면, 제5 공정에서 디히드로다이드제인으로부터 생성된 테트라히드로다이드제인을 제6 공정에서의 기질로서 사용할 수도 있다. 이 경우, 상기 테트라히드로다이드제인으로서는, 제5 공정에서 생성된 테트라히드로다이드제인을 함유하는 용액 그대로일 수도 있고, 조정제된 것일 수도 있으며 정제된 것일 수도 있다.
또한, 예를 들면 시판되는 테트라히드로다이드제인을 사용할 수도 있고, 적절하게 합성한 테트라히드로다이드제인을 사용할 수도 있다.
또한, 예를 들면 제6 공정에서 에쿠올을 합성하기 위한 혼합 원료로서, E3 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포 및 테트라히드로다이드제인을 함유하는 에쿠올 합성 원료 조성물을 사용할 수도 있다. 상기 합성 원료 조성물을 상술하는 조건에서 배양함으로써 상기 합성 원료 조성물 중의 테트라히드로다이드제인을 에쿠올로 변환시킬 수 있다. 상기 합성 원료 조성물에서의 상기 재조합 세포 및 테트라히드로다이드제인의 농도, 및 상기 합성 원료 조성물에 배합 가능한 다른 성분 등, 또한 반응 조건은 상술한 바와 동일하게 설명된다.
바람직하게는 제5 공정에서 디히드로다이드제인으로부터 생성된 테트라히드로다이드제인을 제5 공정에서의 기질로서 사용되고, 시판되는 테트라히드로다이드제인이나 상기 합성 원료 조성물 등이 병용될 수도 있다.
제6 공정에서 사용되는 재조합 세포
제6 공정에서 사용되는 재조합 세포는 상기 C-2. 섹션에 기재된 E3 폴리뉴클레오티드를 가지고, E3 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 한 제한되지 않는다. 구체적으로는, 상기 C-4. 섹션에 기재된 재조합 세포를 사용할 수 있다.
E3 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 이용한 E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 제조
E3 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포를 배양하고, 세포 및/또는 배양물로부터 E3 폴리펩티드를 회수함으로써, E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 제조할 수 있다.
또한, E3 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 세포의 배양, 배양에 이용되는 배지, E3 폴리펩티드의 분리ㆍ정제는, 상기 「E1 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 이용한 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 제조」와 동일하게 하여 실시할 수 있다.
E1 내지 E3 폴리뉴클레오티드
본 발명의 제4 제조 방법에서는, E1 내지 E3 폴리뉴클레오티드 중 적어도 1종이 사용된다. 이들 폴리뉴클레오티드는 각각 상기 A-2., B-2. 및 C-2. 섹션에 설명되는 것이다.
D-I-8. 제4 제조 방법에 의해 제조된 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올을 함유하는 생성물
본 발명은 제4 제조 방법에 의해 제조된 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올을 함유하는 생성물을 제공한다.
상술한 대로 본 발명의 제4 제조 방법에서는 제4 내지 6 공정의 각종 조합에 따라서 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올을 제조할 수 있다.
이 때문에, 본 발명의 제4 제조 방법에 의해 제조된 생성물에는 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올이 함유된다.
또한, 본 발명의 생성물은 제4 제조 방법에 의해 얻어지는 용액 그대로일 수도 있고, 상기 용액으로부터 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올이 조정제된 것일 수도 있고, 더 정제된 것일 수도 있다.
본 발명의 생성물은 음식품, 화장료, 의약품 등에 배합할 수 있고, 또한 기질로서 사용할 수도 있다.
D-II-1. 제1 반응조 내지 제3 반응조 중 적어도 1개의 반응조를 구비하는 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조 장치
본 발명은 이하의 제1 반응조 내지 제3 반응조 중 적어도 1개의 반응조를 구비하는 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조 장치(이하, 「제1 제조 장치」라고 표기하는 경우도 있음)를 제공한다.
(제1 반응조) (Aa) 내지 (Ac) 중 어느 하나인 폴리펩티드(즉, E1 폴리펩티드)로 이루어지는 효소가 고정되어 있는 반응 수단(이하, 이것을 「반응 수단 1」이라고 표기하는 경우도 있음)을 가지고, 상기 폴리펩티드를 이용하여 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 상기 반응조 내의 다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음;
(제2 반응조) (Ba) 내지 (Bc) 중 어느 하나인 폴리펩티드(즉, E2 폴리펩티드)로 이루어지는 효소가 고정되어 있는 반응 수단(이하, 이것을 「반응 수단 2」라고 표기하는 경우도 있음)을 가지고, 상기 폴리펩티드를 이용하여 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 상기 반응조 내의 디히드로다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음;
(제3 반응조) (Ca) 내지 (Cc) 중 어느 하나인 폴리펩티드(즉, E3 폴리펩티드)로 이루어지는 효소가 고정되어 있는 반응 수단(이하, 이것을 「반응 수단 3」이라고 표기하는 경우도 있음)을 가지고, 상기 폴리펩티드를 이용하여 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 상기 반응조 내의 테트라히드로다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음.
본 발명의 제1 제조 장치에서는, 제1 반응조 내지 제3 반응조의 각종 조합에 따라서 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올을 제조할 수 있다.
본 발명의 제1 제조 장치는 제1 반응조, 제2 반응조 및 제3 반응조 중 적어도 1개의 반응조를 구비한다.
예를 들면, 본 발명의 제1 제조 장치가 제1 반응조를 구비하고, 제2 반응조 및 제3 반응조를 구비하지 않는 경우, 본 발명의 제1 제조 장치를 사용함으로써 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을 제조할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 제1 제조 장치가 제2 반응조를 구비하고, 제1 반응조 및 제3 반응조를 구비하지 않는 경우, 본 발명의 제1 제조 장치를 사용함으로써 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 제조할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 제1 제조 장치가 제3 반응조를 구비하고, 제1 반응조 및 제2 반응조를 구비하지 않는 경우, 본 발명의 제1 제조 장치를 사용함으로써 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
또한, 예를 들면 본 발명의 제1 제조 장치가 제1 반응조 및 제2 반응조의 2개의 반응조를 구비하고, 제3 반응조를 구비하지 않는 경우, 본 발명의 제1 제조 장치를 사용함으로써 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을, 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 제조할 수 있다.
또한, 예를 들면 본 발명의 제1 제조 장치가 제2 반응조 및 제3 반응조의 2개의 반응조를 구비하고, 제1 반응조를 구비하지 않는 경우, 본 발명의 제1 제조 장치를 사용함으로써 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을, 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
또한, 예를 들면 본 발명의 제1 제조 장치가 제1 반응조 내지 제3 반응조의 3개의 반응조를 구비하는 경우, 본 발명의 제1 제조 장치를 사용함으로써 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을, 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을, 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 제1 제조 장치에서는, 반응 수단 1 내지 3 중 적어도 2개의 수단이 하나의 반응조에 함께 존재할 수도 있다.
예를 들면, 반응 수단 1 및 2가 하나의 반응조에 함께 존재하는 경우에는, 제1 반응조 및 제2 반응조에서의 각각의 반응을 하나의 반응조 내에서 실시할 수 있다. 또한, 예를 들면 반응 수단 1 내지 3이 하나의 반응조에 함께 존재하는 경우에는, 제1 반응조 내지 제3 반응조에서의 각각의 반응을 하나의 반응조 내에서 실시할 수 있다.
이들 반응 수단은 반응조에서 원하는 효과를 발휘할 수 있는 한, 반응조에의 배치 수단은 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 제1 제조 장치에서는, 상기 제조 장치가 반응 수단 1 내지 3 중 적어도 2개의 수단을 가지며, 다른 복수의 반응조를 갖는 경우에는, 이들 반응층은 공급 수단을 통해 접속되어 있다.
예를 들면, 본 발명의 제1 제조 장치가 제1 반응조 및 제2 반응조를 구비하고, 제3 반응조를 구비하지 않으며, 제1 반응조 및 제2 반응조가 각각 독립되고, 제1 반응조 내에는 반응 수단 1이, 제2 반응조 내에는 반응 수단 2가 배치되어 있는 경우, 상기 제1 반응조 및 제2 반응조는 제1 반응조에서 생성된 디히드로다이드제인을 함유하는 생성물을 제2 반응조에 공급하기 위한 공급 수단을 통해 접속되어 있다.
또한, 예를 들면 본 발명의 제1 제조 장치가 반응 수단 1 및 2를 하나의 반응조에 구비하고, 반응 수단 3을 다른 반응조에 구비하는 경우, 반응 수단 1 및 2가 배치된 반응조와 반응 수단 3이 배치된 반응조는, 반응 수단 1 및 2가 배치된 반응조에서 생성된 생성물을 반응 수단 3이 배치된 반응조에 공급하기 위한 공급 수단을 통해 접속되어 있다.
여기서, 생성물은 얻어진 용액 상태일 수도 있고, 디히드로다이드제인 등이 조정제된 것일 수도 있고, 더 정제된 것일 수도 있다.
반응조
본 발명의 제1 제조 장치에서 사용되는 제1 반응조 내지 제3 반응조의 형상, 크기, 소재 등은 상기 반응 수단을 가질 수 있고, 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조가 바람직하게 실시되는 한 제한되지 않는다.
반응 수단
본 발명의 제1 제조 장치에서 사용되는 반응 수단 1 내지 3은 각각의 반응 수단이 갖는 상기 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 고정되어 있고, 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조에 바람직하게 적용할 수 있는 한 제한되지 않는다.
각 반응 수단에 고정되는 각 폴리펩티드로 이루어지는 효소는 조정제 상태일 수도 있고, 정제된 것일 수도 있다. 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 반응 수단에의 고정화는 종래 공지된 기술에 따라서 실시된다.
예를 들면, 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 담체에 고정되어 있는 경우, 상기 담체는 각 폴리펩티드로 이루어지는 효소가 갖는 원하는 활성의 발휘를 방해하지 않는 한 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 담체로서는, 상기 폴리펩티드로 이루어지는 효소와 공유 결합에 의해 결합할 수 있는 아미노기, 카르복실기, 수산기 등의 관능기를 갖는 것, 또한 상기 폴리펩티드로 이루어지는 효소와 링커를 통해 접속시킬 수 있는 것 등이 예시된다. 담체의 형상도 한정되지 않는다. 이러한 담체, 관능기, 링커 등은 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 담체에 고정시키는 종래 공지된 기술에 따라서 적절하게 선택된다. 또한, 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 담체에의 고정화도 종래 공지된 기술에 따라서 실시된다.
공급 수단
본 발명의 제1 제조 장치에서 사용되는 공급 수단은 본 발명의 제1 제조 장치에서 사용될 수 있는 다른 반응조를 상기 공급 수단을 통해 접속시킬 수 있고, 본 발명의 제1 제조 장치에서 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올을 제조할 수 있는 한 제한되지 않는다. 상기 공급 수단은 종래 공지된 기술에 따라서 적절하게 선택된다.
E1 내지 E3 폴리펩티드
본 발명의 제1 제조 장치에서 사용되는 E1 내지 E3 폴리펩티드는 상술한 바와 동일하게 설명된다.
제1 반응조에서의 디히드로다이드제인의 제조
제1 반응조에서는, 반응 수단 1에 고정된 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 NADPH 및/또는 NADH의 존재하에서 다이드제인에 작용시킴으로써 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킨다. E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소는 E1 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 보효소로서 작용하는 NADPH 및/또는 NADH와 함께 반응 수단에 고정될 수도 있다. 제1 반응조에서의 반응은 상술한 「제1 공정」에 기초하여 실시된다.
제2 반응조에서의 테트라히드로다이드제인의 제조
제2 반응조에서는, 반응 수단 2에 고정된 E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 NADPH 및/또는 NADH의 존재하에서 디히드로다이드제인에 작용시킴으로써 디히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로 변환시킨다. E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소는 E2 폴리펩티드로 이루어지는 효소의 보효소로서 작용하는 NADPH 및/또는 NADH와 함께, 반응 수단에 고정될 수도 있다. 제2 반응조에서의 반응은 상술한 「제2 공정」에 기초하여 실시된다.
제3 반응조에서의 에쿠올 제조
제3 반응조에서는, 반응 수단 3에 고정된 E3 폴리펩티드로 이루어지는 효소를 테트라히드로다이드제인에 작용시킴으로써, 테트라히드로다이드제인을 에쿠올으로 변환시킨다. 제3 반응조에서의 반응은 상술한 「제3 공정」에 기초하여 실시된다.
D-II-2. 제4 반응조 내지 제6 반응조 중 적어도 1개의 반응조를 구비하는 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조 장치
본 발명은 이하의 제4 반응조 내지 제6 반응조 중 적어도 1개의 반응조를 구비하는 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조 장치(이하, 「제2 제조 장치」라고 표기하는 경우도 있음)를 제공한다.
(제4 반응조) (Ad) 내지 (Af) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드(즉, E1 폴리뉴클레오티드)를 갖는 재조합 세포가 고정되어 있는 반응 수단(「이하, 이것을 반응 수단 4라 표기하는 경우도 있음」)을 가지고, 상기 반응 수단을 이용하여 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 반응조 내의 다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음;
(제5 반응조) (Bd) 내지 (Bf) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드(즉, E2 폴리뉴클레오티드)를 갖는 재조합 세포가 고정되어 있는 반응 수단(「이하, 이것을 반응 수단 5라 표기하는 경우도 있음」)을 가지고, 상기 반응 수단을 이용하여 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 반응조 내의 디히드로다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음;
(제6 반응조) (Cd) 내지 (Cf) 중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드(즉, E3 폴리뉴클레오티드)를 갖는 재조합 세포가 고정되어 있는 반응 수단(「이하, 이것을 반응 수단 6이라 표기하는 경우도 있음」)을 가지고, 상기 반응 수단을 이용하여 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조하기 위한 반응조, 여기서 상기 반응 수단은 반응조 내의 테트라히드로다이드제인과 접촉할 수 있도록 배치되어 있음.
본 발명의 제2 제조 장치에서는, 제4 반응조 내지 제6 반응조의 각종 조합에 따라서 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올을 제조할 수 있다.
본 발명의 제2 제조 장치는 제4 반응조, 제5 반응조 및 제6 반응조 중 적어도 1개의 반응조를 구비한다.
예를 들면, 본 발명의 제2 제조 장치가 제4 반응조를 구비하고, 제5 반응조 및 제6 반응조를 구비하지 않는 경우, 본 발명의 제2 제조 장치를 사용함으로써 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을 제조할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 제2 제조 장치가 제5 반응조를 구비하고, 제4 반응조 및 제6 반응조를 구비하지 않는 경우, 본 발명의 제2 제조 장치를 사용함으로써 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 제조할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 제2 제조 장치가 제6 반응조를 구비하고, 제4 반응조 및 제5 반응조를 구비하지 않는 경우, 본 발명의 제2 제조 장치를 사용함으로써 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
또한, 예를 들면 본 발명의 제2 제조 장치가 제4 반응조 및 제5 반응조의 2개의 반응조를 구비하고, 제6 반응조를 구비하지 않는 경우, 본 발명의 제2 제조 장치를 사용함으로써 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을, 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을 제조할 수 있다.
또한, 예를 들면 본 발명의 제2 제조 장치가 제5 반응조 및 제6 반응조의 2개의 반응조를 구비하고, 제4 반응조를 구비하지 않는 경우, 본 발명의 제2 제조 장치를 사용함으로써 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을, 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
또한, 예를 들면 본 발명의 제2 제조 장치가 제4 반응조 내지 제6 반응조의 3개의 반응조를 구비하는 경우, 본 발명의 제2 제조 장치를 사용함으로써 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인을, 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인을, 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 제2 제조 장치에서는, 반응 수단 4 내지 6 중 적어도 2개의 수단이 하나의 반응조에 함께 존재할 수도 있다.
예를 들면, 반응 수단 4 및 5가 하나의 반응조에 함께 존재하는 경우에는, 제4 반응조 및 제5 반응조에서의 각각의 반응을 하나의 반응조 내에서 실시할 수 있다. 또한, 예를 들면 반응 수단 4 내지 6이 하나의 반응조에 함께 존재하는 경우에는, 상기 제4 반응조 내지 제6 반응조에서의 각각의 반응을 하나의 반응조 내에서 실시할 수 있다.
이들 반응 수단은 반응조에서 원하는 효과를 발휘할 수 있는 한, 반응조에의 배치 수단은 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 제2 제조 장치에서는, 상기 제조 장치가 반응 수단 4 내지 6 중 적어도 2개의 수단을 가지며, 다른 복수의 반응조를 갖는 경우에는, 상기 반응은 상기 다른 반응조와 공급 수단을 통해 접속되어 있다.
예를 들면, 본 발명의 제2 제조 장치가 제4 반응조 및 제5 반응조를 구비하고, 제6 반응조를 구비하지 않으며, 제4 반응조 및 제5 반응조가 각각 독립되고, 제4 반응조 내에는 반응 수단 4가 제5 반응조 내에는 반응 수단 5가 배치되어 있는 경우, 상기 제4 반응조 및 제5 반응조는 제4 반응조에서 생성된 디히드로다이드제인을 함유하는 생성물을 제5 반응조에 공급하기 위한 공급 수단을 통해 접속되어 있다.
또한, 예를 들면 본 발명의 제2 제조 장치가 반응 수단 4 및 5를 하나의 반응조에 구비하고, 반응 수단 6을 다른 반응조에 구비하는 경우, 반응 수단 4 및 5가 배치된 반응조와 반응 수단 6이 배치된 반응조는, 반응 수단 4 및 5가 배치된 반응조에서 생성된 생성물을 반응 수단 6이 배치된 반응조에 공급하기 위한 공급 수단을 통해 접속되어 있다.
여기서, 생성물은 얻어진 용액 상태일 수도 있고, 디히드로다이드제인 등이 조정제된 것일 수도 있고, 더 정제된 것일 수도 있다.
반응조
본 발명의 제2 제조 장치에서 사용되는 제4 반응조 내지 제6 반응조의 형상, 크기, 소재 등은 상기 반응 수단을 가질 수 있고, 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조가 바람직하게 실시되는 한 제한되지 않는다.
반응 수단
본 발명의 제2 제조 장치에서 사용되는 반응 수단 4 내지 6은 각각의 반응 수단이 갖는 상기 재조합 세포가 고정되어 있고, 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조에 바람직하게 적용할 수 있는 한 제한되지 않는다.
재조합 세포의 반응 수단에의 고정화는 각 재조합 세포가 갖는 원하는 효과의 발휘를 방해하지 않는 한 제한되지 않고, 종래 공지된 기술에 따라서 실시된다. 또한, 재조합 세포는 반응 수단에서 세포를 배양할 수 있거나 또는 배양된 상태에 있을 수도 있다. 여기서 적용되는 재조합 세포의 배양 조건은 상술한 「제4 공정」, 「제5 공정」 및 「제6 공정」 등의 기재에 기초하여 각각 설정된다.
공급 수단
본 발명의 제2 제조 장치에서 사용되는 공급 수단은 본 발명의 제2 제조 장치에서 사용될 수 있는 다른 반응조를 상기 공급 수단을 통해 접속시킬 수 있고, 본 발명의 제2 제조 장치에서 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올을 제조할 수 있는 한 제한되지 않는다. 상기 공급 수단은 종래 공지된 기술에 따라서 적절하게 선택된다.
재조합 세포
본 발명의 제2 제조 장치에서 사용되는 재조합 세포는 상술한 「제4 공정에서 사용되는 재조합 세포」, 「제5 공정에서 사용되는 재조합 세포」 및 「제6 공정에서 사용되는 재조합 세포」 등의 기재와 동일하게 설명된다.
E1 내지 E3 폴리뉴클레오티드
본 발명의 제2 제조 장치에서 사용되는 E1 내지 E3 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 동일하게 설명된다.
제4 반응조에서의 디히드로다이드제인의 제조
제4 반응조에서는, 반응 수단 4에 고정된 E1 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 이용하여 다이드제인을 디히드로다이드제인으로 변환시킨다. 제4 반응조에서의 반응은 상술한 「제4 공정」 등의 기재에 기초하여 실시된다.
제5 반응조에서의 테트라히드로다이드제인의 제조
제5 반응조에서는, 반응 수단 5에 고정된 E2 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 이용하여 디히드로다이드제인을 테트라히드로다이드제인으로 변환시킨다. 제5 반응조에서의 반응은 상술한 「제5 공정」 등의 기재에 기초하여 실시된다.
제6 반응조에서의 에쿠올 제조
제6 반응조에서는, 반응 수단 6에 고정된 E3 폴리뉴클레오티드를 갖는 재조합 세포를 이용하여 테트라히드로다이드제인을 에쿠올으로 변환시킨다. 제6 반응조에서의 반응은 상술한 「제6 공정」 등의 기재에 기초하여 실시된다.
D-II-3. 제1 반응조 내지 제3 반응조 중 적어도 1개의 반응조, 및 제4 반응조 내지 제6 반응조 중 적어도 1개의 반응조를 구비하는 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조 장치
본 발명은 상술한 제1 반응조 내지 제3 반응조 중 적어도 1개의 반응조, 및 제4 반응조 내지 제6 반응조 중 적어도 1개의 반응조를 구비하는 디히드로다이드제인, 테트라히드로다이드제인 및/또는 에쿠올의 제조 장치(이하, 「제3 제조 장치」라고 표기하는 경우도 있음)를 제공한다.
제3 제조 장치에서의 각 반응조, 각 반응 수단의 조합은 상술한 제1 및 제2 제조 장치와 동일하게 설명된다. 또한, 제3 제조 장치에서 사용되는 반응조, 반응 수단, 폴리뉴클레오티드, 재조합 세포 및 각 반응조에서의 반응도 상술한 제1 및 제2 제조 장치와 동일하게 설명된다.
<실시예>
실시예 A
참고예 A1
락토코커스 20-92주(FERM BP-10036호)를 다이드제인 함유 증식용 액체 배지(다이드제인을 10 μg/mL가 되는 양으로 변법 GAM 브로쓰 배지(닛스이 세이야꾸 가부시끼가이샤)에 첨가한 것)에 접종하여 혐기적 조건하(BBL 개스 팩 시스템(BBL Gas Pack systems)를 사용), 37 ℃에서 7 내지 18 시간 적절하게 배양하였다. 배양 후, 원심 분리에 의해 집균하여 냉동 보존하고, 이하의 실시예에 사용하였다.
실시예 A1 균체 파쇄물의 원심 상청 중에서의 디히드로다이드제인 생합성 활성의 존재 확인, 및 NADPH 의존성의 확인
보존되어 있는 동결 균체(67 mL 분량, 2개)를 융해 후 8,000 rpm, 4 ℃, 10 분간 원심 분리하고, 펠렛을 이하의 시험에 적용하였다. 펠렛을 1 mM PMSF(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤) 및 2 mM DTT(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤), 5 mM 히드로아황산나트륨(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)을 함유하는 0.1 M 인산칼륨 용액 2 mL에 현탁시켰다. 현탁액을 미리 0.1 mm 지르코니아/실리카 비드(바이오스펙 프로덕츠, 인크.(BioSpec Products, Inc.))를 넣어 둔 2 ml 용량 스크류 캡 부착 튜브(가부시끼가이샤 어시스트 제조) 2개로 옮기고, 패스트프렙(FastPrep)(등록 상표) FP100A(써모 일렉트론 코포레이션(Thermo ELECTRON CORPORATION))에서 균체를 파쇄하여(6500 rpm 10 초 빙냉을 8회) 균체 파쇄액을 얻었다. 얻어진 균체 파쇄액을 약 10,000 rpm, 4 ℃에서 10 분간 원심하여 원심 상청을 얻고, 원심 상청을 1 mM PMSF 및 2 mM DTT, 5 mM 히드로아황산나트륨을 함유하는 0.1 M 인산칼륨 용액으로 4.5 mL로 희석하고, 이것을 효소원으로 하였다.
하기 조성의 효소 반응액을 제조하고, 37 ℃에서 2 시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 얻어진 효소 반응 생성물에 3 mL의 아세트산에틸을 첨가하여 추출 처리를 행한 후, 건고하여 HPLC 분석에 적용하였다. HPLC 분석의 표준 용액은 다이드제인(프나코시 가부시끼가이샤), 에쿠올(프나코시 가부시끼가이샤), 디히드로다이드제인(트렌드 리서치 케미컬사)의 혼합 용액(각 2 μg/mL)을 이용하였다.
효소 반응액 조성
Figure 112010048098509-pct00001
결과를 도 1에 나타내었다. 이 결과로부터, 균체 파쇄물의 원심 상청에는 디히드로다이드제인 생합성 활성이 존재하는 것이 확인되었다. 또한, 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인으로의 변환 반응은 보효소 NADPH에 의존성을 나타내는 것이 확인되었다.
실시예 A2 디히드로다이드제인 합성 효소의 정제
배양병당 67 ml의 변법 GAM 브로쓰 배지(닛스이 세이야꾸 가부시끼가이샤)에서 18 시간 배양한 락토코커스 20-92주 균체 9개를 원심 후, 2 mM DTT(1,4-디티오트레이톨, 머크(Merck)), 5 mM 히드로아황산나트륨(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤) 및 프로테아제 저해제(컴플리트 프로테아제 저해제 칵테일 EDTA-무함유, 로쉐 다이그노스틱스(Roche Diagnostics))를 함유하는 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7에 현탁시켰다. 현탁액을 0.1 mm 지르코니아/실리카 비드(바이오스펙 프로덕츠, 인크.)를 넣은 2 ml 용량 스크류 캡 부착 튜브(가부시끼가이샤 어시스트 제조) 3개로 옮기고, 패스트프렙(등록 상표) FP100A(써모 일렉트론 코포레이션)에서 균체를 파쇄하고(6500 rpm, 20 초를 4회), 파쇄액을 원심하여 상청을 얻었다. 또한, 배양병당 200 ml의 동일한 액체 배지에서 18 시간 배양한 락토코커스 20-92주 균체 8개를 동일하게 균체 파쇄 후에 원심하여 8개분의 상청을 얻었다.
정제에는 1 mM PMSF(페닐메틸술포닐플루오라이드, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)), 2 mM DTT 및 5 mM 히드로아황산나트륨을 함유하는 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7(이하, 「Buffer A」라고 표기함)을 이용하였다. 얻어진 균체의 파쇄 상청을 등량의 2 M 황산암모늄을 포함하는 Buffer A와 혼합하고, 부틸 세파로스 4 패스트 플로우(Butyl Sepharose 4 Fast Flow)(겔은 1개당 약 0.3 ml, GE 헬쓰 케어)를 채우고, 1 M 황산암모늄을 포함하는 Buffer A로 평형화한 마이크로바이오 스핀 칼럼(11개, 바이오ㆍ라드 래보러토리즈)에 적용하였다. 1 M 황산암모늄을 포함하는 Buffer A로 세정 후, 0.75 ml의 0.5 M 황산암모늄을 포함하는 Buffer A를 2회 흐르게 한 후, Buffer A를 0.75 ml, 이어서 0.5 ml 첨가하여 디히드로다이드제인 합성 활성을 갖는 분획을 용출시켰다. 상기 Buffer A를 0.75 ml를 첨가하여 얻어진 용출액을 용출액 I, 상기 0.5 ml를 첨가하여 얻어진 용출액을 용출액 II라 한다.
용출액 I 0.75 ml에는 0.3 ml, 용출액 II 0.5 ml에는 0.2 ml의 3.4 M 황산암모늄을 포함하는 Buffer A를 각각 첨가한 후에, 이들을 혼합하고, 이것을 1 M 황산암모늄을 포함하는 용리액으로 평형화한 TSKgel Ether-5PW 칼럼(도소)을 이용한 HPLC에 적용하였다. 혼합액 0.5 ml를 2 내지 9회 칼럼에 주입 후, 유속 0.1 ml/분으로 1 M 황산암모늄을 포함하는 용리액(용리액 B)으로 세정하고, 그 후 용리액 B와 용리액 A의 혼합 비율을 바꿈으로써, 15 분간으로 직선적으로 0 M 황산암모늄(용리액 A)으로 만드는 프로그램을 실행하였다. 효소 활성은 약 0.6 M 내지 0.35 M 황산암모늄의 용출 분획에서 확인되고, 합계로 약 3.5 ml의 용출액을 얻었다. HPLC의 조건을 이하에 나타내었다. 단백질의 흡수로서 280 nm의 흡수를 측정하였다.
칼럼: TSKgel Ether-5PW
유속: 샘플 적용시 0.05 내지 0.1 ml/분, 용출시 0.1 ml/분
용리액 A: 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7/2 mM DTT/2.5 mM 히드로아황산나트륨/1 ％ 2-프로판올
용리액 B: 1 M 황산암모늄을 포함하는 용리액 A
효소 활성이 확인된 용출 분획의 용출액을 Buffer A로 희석하고, 이것을 Buffer A로 평형화한 2'5' ADP 세파로스 4B(겔은 약 0.3 ml, GE 헬쓰 케어)를 채운 마이크로바이오 스핀 칼럼에 적용하였다. Buffer A에 의한 칼럼 세정 후, 20 mM NADPH를 포함하는 pH 7.5 의 Buffer A 조성액 0.7 ml, 이어서 0.6 ml로 디히드로다이드제인 합성 활성을 갖는 분획을 용출시켰다.
얻어진 용출액을 pH 7.5의 용리액 C로 평형화한 Mono Q 칼럼(GE 헬쓰 케어)을 이용한 HPLC에 적용하였다. 유속 0.1 ml/분으로 용리액 C를 칼럼에 송액하고, 세정 후, 용리액 C와 용리액 D의 혼합 비율을 바꿈으로써, 32.5 분간 직선적으로 0.65 M NaCl로 만드는 프로그램을 실행하였다. HPLC의 조건을 이하에 나타내었다. 단백질의 흡수로서 280 nm의 흡수를 측정하였다.
칼럼: Mono Q PC 1.6/5
용리액 C: 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7.5/3 mM DTT/2.5 mM 히드로아황산나트륨/1 ％ 2-프로판올
용리액 D: 1 M NaCl을 포함하는 용리액 C
효소 활성은 0.4 내지 0.46 M NaCl 분획(프랙션 No. 28 내지 30)에서 확인되었다.
이렇게 하여 실시한 Mono Q HPLC의 결과와 효소 활성을 도 2에 나타내었다. 또한, 도 3에 환원 조건하에서의 프랙션 No. 27 내지 31의 SDS-PAGE 결과를 나타내었다. 이 결과, 디히드로다이드제인 합성 활성이 있는 프랙션에, 환원 조건하에서 70 kDa의 밴드가 확인되었다.
실시예 A3 N 말단 아미노산 서열의 결정
70 μl의 Mono Q HPLC에서 얻은 디히드로다이드제인 합성 활성이 있는 프랙션, No. 29에, 30 μl의 0.1 ％ 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하여 100 μl로 하였다.
10 μl의 메탄올로 ProSorb 카트리지(어플라이드 바이오시스템즈 재팬)의 PVDF막을 적시고, 계속해서 앞서 혼합한 액을 첨가하였다. ProSorb 필터(어플라이드 바이오시스템즈 재팬)를 이용하여 흡수 후, 막을 건조시키고, 멤브레인용 펀치(어플라이드 바이오시스템즈 재팬)를 이용하여 막을 잘라내었다. 상기 막을 20 ％ 메탄올수로 5회 세정하여 건조시켰다. 이 막을 프로테인 시퀀서(어플라이드 바이오시스템, 프로사이즈 494 cLC)로 N 말단 아미노산 서열 분석을 행하여, 다음에 나타내는 22 잔기의 연속된 아미노산 서열을 얻었다.
Met Lys Asn Lys Phe Tyr Pro Lys Thr Phe Glu Arg Gly Tyr Ile Gly Asn Leu Glu Val Glu Asn(서열 번호 19)
실시예 A4 내부 아미노산 서열의 결정
디히드로다이드제인 합성 활성을 나타내는 효소 단백질을 소화 효소로 단편화하여 펩티드로 하였다. 펩티드의 N 말단 아미노산 서열 분석을 행하여 내부 아미노산 서열 정보를 얻었다.
(1) 시료의 제조
배양병당 200 ml의 변법 GAM 브로쓰 배지(닛스이 세이야꾸 가부시끼가이샤)에서 18 시간 배양한 락토코커스 20-92주 균체 3개를 원심 후, 2 mM DTT(1,4-디티오트레이톨, 머크), 5 mM 히드로아황산나트륨(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤) 및 프로테아제 저해제(컴플리트 프로테아제 저해제 칵테일 EDTA-무함유, 로쉐 다이그노스틱스)를 함유하는 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7에 현탁시켰다. 현탁액을 0.1 mm 지르코니아/실리카 비드(바이오스펙 프로덕츠, 인크.)를 넣은 2 ml 용량 스크류 캡 부착 튜브(어시스트) 3개로 옮기고, 패스트프렙(등록 상표) FP100A(써모 일렉트론 코포레이션)로 균체를 파쇄하고(6500 rpm, 20 초를 4회), 파쇄액을 원심하여 상청을 얻었다.
이후의 조작에는 1 mM PMSF(페닐메틸술포닐플루오라이드, 시그마 알드리치), 2 mM DTT 및 5 mM 히드로아황산나트륨을 함유하는 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7(이하, 「Buffer A」라고 표기함)을 이용하였다. 균체의 파쇄 상청을 등량의 2 M 황산암모늄을 포함하는 Buffer A와 혼합하고, 부틸 세파로스 4 패스트 플로우(겔은 1개당 약 0.3 ml, GE 헬쓰 케어)를 채우고, 1 M 황산암모늄을 포함하는 Buffer A로 평형화한 마이크로바이오 스핀 칼럼(3개, 바이오ㆍ라드 래보러토리즈)에 적용하였다. 1 M 황산암모늄을 포함하는 Buffer A로 세정 후, 0.75 ml의 0.5 M 황산암모늄을 포함하는 Buffer A를 2회 흐르게 한 후, 0.75 ml의 Buffer A를 2회 첨가하여 디히드로다이드제인 합성 활성을 갖는 분획을 용출시켰다.
2'5' ADP 세파로스 4B(ADP Sepharose 4B)를 채운 마이크로바이오 스핀 칼럼 1개를 Buffer A로 평형화하고, 앞서 용출된 용액 1.5 ml를 첨가하였다. 0.75 ml의 Buffer A로 5회 세정 후, 20 mM NADPH를 포함하는 Buffer A 0.75 ml, 이어서 0.45 ml로 용출시켰다. 용출액을 혼합하여 미량용 원심 농축 튜브(나노셉 10K 오메가(NANOSEP 10K OMEGA), 폴 라이프 사이언시스(Pall Life Sciences))에서 5 μl까지 탈염 농축시켰다.
농축액과 2-머캅토에탄올을 포함하는 2배 농도의 SDS-PAGE용 샘플 완충을 이용하여 회수한 액을 혼합하고, 90 ℃에서 7 분간 가열 처리한 후, 라에물리(Laemmuli)법에 따라서 SDS-PAGE를 행하였다. 전기 영동의 겔판은 슈퍼셉 HG 10 내지 20 ％(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)를 이용하였다. 콜로이달 블루(Colloidal Blue)(인비트로젠(Invitrogen)) 염색하여 밀리 Q수로 탈색 후, 약 70 kDa에 영동된 밴드를 잘라내었다. 대조군으로서 단백질을 영동하지 않은 부분으로부터 동등한 분자량 위치 및 크기의 겔편을 잘라내고, 이후 동일하게 처리하였다. 또한, 별도로 동일한 조작으로 균체를 처리하고, SDS-PAGE 후 PVDF막에 전사한 동일한 위치의 밴드를 이용하여 N 말단 아미노산 서열 분석을 행하고, Mono Q HPLC 프랙션 No.29에서 얻은 서열과 일치하는 것을 확인하였다.
(2) 환원 카르복사미드메틸화와 효소 소화
잘라낸 겔편은 세단하고, 50 ％ 아세토니트릴 수용액을 이용하여 탈색한 후 아세토니트릴로 탈수시켜 원심 농축기(스피드벡(SpeedVac) A160, 사반트(Savant))에서 건조시켰다. 55 mM 의 DTT를 포함하는 100 mM 중탄산암모늄 수용액을 첨가하여 56 ℃에서 1 시간 환원시켰다. DTT 용액을 제거하고, 100 mM의 요오도아세트아미드를 포함하는 100 mM 중탄산암모늄 수용액을 첨가하여 차광하에 실온에서 30 분간 서서히 진탕하고, 카르복사미드메틸화 처리를 행하였다. 반응 시약을 제거 후, 50 ％ 아세토니트릴 수용액, 아세토니트릴, 100 mM 중탄산암모늄 수용액 및 아세토니트릴의 순서로 세정하고, 겔을 원심 농축기에서 건조시켰다. 2 μg의 아크로모박터 프로테아제(Achromobacter protease) I(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)을 포함하는 0.02 ％ 트윈(Tween) 20 함유 20 mM 트리스염산 완충액 pH 9를 첨가하여 37 ℃에서 7 시간 소화시켰다. 원심 상청을 다른 튜브로 옮기고, 겔에 60 ％ 아세토니트릴-0.1 ％ TFA 수용액을 첨가하여 30 ℃에서 20 분간 가온 후, 10 분간 볼텍싱하는 조작을 3회 행하여 단편화된 펩티드를 추출하였다. 모은 상청액은 Ultrafree-MC(0.22 μm, 아미콘(Amicon))를 이용하여 여과한 후, 원심 농축시켰다.
(3) 펩티드 맵핑
역상 HPLC를 행하고, 효소 소화 후의 펩티드를 분리하였다.
칼럼: μRPC C2/C18 SC2.1/10(GE 헬쓰 케어 바이오사이언스)
유속: 0.1 ml/분
용리액 E: 0.05 ％ TFA
용리액 F: 90 ％ 아세토니트릴/0.04 ％ TFA
용출 프로그램: 0 분 5 ％F
3 분 5 ％F
43 분 65 ％F
48 분 100 ％F
68 분 100 ％F
프랙션: 30 μl
검출: 215 nm
또한, 예를 들면 상기 「0 분 5 ％B」는, 용출 0 시간일 때에는 용리액 E가 95 ％, 용리액 F가 5 ％ 함유된 용리액을 사용한 것을 나타내었다.
(4) 내부 아미노산 서열 분석
대조군의 크로마토그램과의 비교에 의해, 디히드로다이드제인 합성 활성을 나타내는 효소 단백질 유래의 펩티드 피크를 선택하고, 프로테인 시퀀서(어플라이드 바이오시스템, 프로사이즈(Procise) 492 HT)로 N 말단 아미노산 서열 분석을 하였다. 역상 HPLC에서 분리 개시 후, 20.6 분부터 용출되기 시작한 피크의 아미노산 서열(이하, 펩티드 1이라 함)은 다음과 같았다.
PheAspGluProValTyrProGlnAlaGlu(서열 번호 20)
22.1 분부터 용출되기 시작한 피크의 아미노산 서열(이하, 펩티드 2라 함)은 다음과 같았다.
AlaSerArgMetValMetAspAlaValHisGluGlyTyrIleAlaGly(서열 번호 21)
26.6 분부터 용출되기 시작한 피크는 비특이적으로 절단된 펩티드이지만, 다음에 나타내는 바와 같이 상기 효소 단백질의 N 말단으로부터 13잔기째의 글리신을 N 말단으로 하는 펩티드였다(이하의 아미노산 서열을 펩티드 3이라 함).
GlyTyrIleGlyAsnLeuGluValGluAsnArgAlaIleArgMetProMet(서열 번호 22)
도 4에 실시예 A4에서 펩티드 맵핑을 행한 결과 및 각 피크에 대응하는 펩티드의 아미노산 서열을 나타내었다.
피크 1(20.6 분)
피크 2(22.1 분)
피크 3(26.6 분)
실시예 A5 정제 폴리펩티드의 N 말단 및 부분 아미노산 서열로부터의 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 증폭
상기 실시예 A3 및 A4에서 얻어진 N 말단 및 부분 아미노산 서열을 기초로 Degenerative-프라이머를 설계, 제조하고, 락토코커스 20-92주의 게놈 DNA를 주형으로 Degenerative-PCR을 행함으로써 디히드로다이드제인 합성 효소를 코딩하는 유전자의 증폭을 시도하였다.
(1) 락토코커스 20-92주로부터의 게놈 DNA의 정제
변법 GAM 브로쓰 배지(닛스이 세이야꾸 가부시끼가이샤) 40 mL에서 혐기 배양한 락토코커스 20-92주를 5000 rpm, 4 ℃, 10 분간으로 원심하고, 배지를 경사분리함으로써 제거하고, 균체를 모았다. 모은 균체는 즉시 QIAGEN Genomic DNA Buffer Set(퀴아젠)의 B1 용액 11 mL(200 μg/mL RNase를 함유)에 현탁시키고, 또한 300 μl의 리소자임 용액(100 mg/mL), 500 μl의 QIAGEN Proteinase K solution(퀴아젠)을 첨가하여 37 ℃, 16 시간 인큐베이션하였다. 이어서, B2 용액 4 mL 첨가하여 수회 전도 혼화한 후, 50 ℃, 3 시간 인큐베이션하였다.
이어서, 5000 rpm, 4 ℃, 10 분간 원심하고, 상청을 QBT 용액으로 평형화한 QIAGEN Genomic-tip 500/G(퀴아젠) 칼럼에 통과시켜 게놈 DNA를 칼럼에 흡착시켰다. 30 mL의 QC 용액으로 2회 칼럼을 세정 후, 15 mL의 QF로 칼럼으로부터 게놈 DNA를 용출시키고, 10.5 mL의 이소프로판올을 첨가하여 염석시켰다. 실 형상으로 석출된 게놈 DNA만을 1.5 mL 용량 마이크로튜브에 채용하고, 75 ％ 에탄올로 세정하여 풍건시킨 후, 250 μl의 TE 용액(0.4 μg/μl)으로 용해시켰다. 이렇게 해서 얻어진 게놈 DNA 용액은 농도를 측정 후, TE 용액으로 40 ng/μl로 제조하고, PCR의 주형으로서 사용하였다.
(2) Degenerative-프라이머의 설계, 제조
Degenerative-프라이머의 설계에서는 축퇴수(number of degeneracy)를 작게 하기 위해서, 5'측의 서열은 락토코커스 가르비에의 코돈 사용 정보(Codon Usage Database http://www.kazusa.or.jp/codon/)에 기초하여 각 아미노산에서 가장 출현 빈도가 높은 코돈을 채용하였다. 3'측은 혼합 염기를 이용함으로써 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자와의 미스 매치가 발생하지 않도록 연구하였다.
실시예 A3에서 결정한 N 말단 서열: MKNKFYPKTFERGYIGNLEVEN을 기초로 이하의 Degenerative-프라이머를 설계, 제조하고, Degenerative-PCR에 사용하였다.
E1-N-terminal-31: TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGA(서열 번호 23)
(단, 서열 번호 23에서 위치 11 및 14의 「N」은 이노신을 나타내고, 위치 20 및 26의 「N」은 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 나타내었다.)
E1-N-terminal-37: TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGARRGNGG(서열 번호 24)
(단, 서열 번호 24에서 위치 11, 14, 20 및 26의 「N」은 이노신을 나타내고, 위치 35의 「N」은 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 나타내었다.)
E1-N-terminal-F32: ATGAAGAATAAGTTTTAYCCNAARACNTTYGA(서열 번호 25)
(단, 서열 번호 25에서 위치 21 및 27의 「N」은 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 나타내었다.)
또한, 실시예 A4에서 결정한 내부 서열 펩티드 2: ASRMVMDAVHEGYIAG를 기초로 이하의 Degenerative-프라이머를 설계, 제조하고, Degenerative-PCR에 사용하였다.
E1-internal-RP1: CCTGCAATATAACCTTCATGTACNGCRTCCATNACCAT(서열 번호 26)
(단, 서열 번호 26에서 위치 24 및 33의 「N」은 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민을 나타내었다.)
또한, 본 실시예에서 프라이머로서 사용한 올리고 DNA는 전부 시그마 알드리치 재팬에서 제조하였다.
(3) Degenerative-PCR에 의한 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 증폭
상기 Degenerative-프라이머를 이용하여 Degenerative-PCR에 의한 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 증폭을 시도하였다.
Degenerative-PCR에 이용한 Degenerative-프라이머의 조합을 이하에 나타내었다.
[1] E1-N-terminal-31과 E1-internal-RP1
[2] E1-N-terminal-37과 E1-internal-RP1
[3] E1-N-terminal-F32와 E1-internal-RP1
Degenerative PCR에 의한 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 증폭은 Ex-Taq DNA 폴리머라제(다카라 바이오 가부시끼가이샤)를 사용하여 증폭 프로그램:
95 ℃ 2 분, (95 ℃ 45 초, 38 ℃ 내지 54 ℃ 30 초, 72 ℃ 2 분)×50 사이클, 72 ℃ 3 분으로 행하였다. Degenerative-프라이머의 게놈 DNA에 대한 미스 매치를 고려하여 어닐링의 온도는 38 ℃부터 4 ℃씩 54 ℃까지의 5 단계로 행하였다. PCR 반응 종료 후, PCR 산물에 1/10량의 10×Dye를 첨가하고, 6 μl를 0.8 ％의 아가로스 겔로 전기 영동하였다. 본 실시예에서의 아가로스 전기 영동에서는 에티듐브로마이드에 의한 염색으로 행하고, 분자량 마커에는 λ/StyI(가부시끼가이샤 닛본 진), 100 bp 래더(ladder)(도요 보세끼 가부시끼가이샤)를 사용하였다.
Degenerative-PCR 산물의 전기 영동의 결과를 도 5에 나타내었다. 본 실시예 내 (3)에서 나타낸 [3]의 Degenerative-프라이머의 조합(E1-N-terminal-F32와 E1-internal-RP1)에서 모든 어닐링 온도에서 약 1.9 kb의 DNA 단편의 증폭을 확인하였다. 그 중에서도 가장 증폭된 것은 어닐링 온도 54 ℃였다.
(4) 증폭된 DNA 단편의 염기 서열 결정
증폭된 약 1.9 kb의 DNA 단편(어닐링 온도 54 ℃)을 아가로스 겔로부터 잘라내고, Gel-Extraction kit(퀴아젠)를 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA 단편은 pT7-블루 클로닝 벡터(Blue Cloning Vector)(노바젠(Novagen))에 삽입하고, 염기 서열을 결정하였다.
얻어진 DNA 염기 서열은 DNA 시퀀스-어셈블 소프트웨어 SEQUENCHER(진 코즈 인크(Gene Codes Inc), USA)을 사용하여 해석하였다. 그 결과, 실시예 A4에서 결정한 펩티드 1 및 3의 아미노산 서열에 상당하는 염기 서열이 존재하였다.
실시예 A6 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 전체 염기 서열 결정
실시예 A5에서 얻어진 1.9 kb의 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 서열을 결정하고, 전체 염기 서열을 결정하기 위해서 락토코커스 20-92주의 게놈 DNA 라이브러리를 주형으로 cDNA 말단 서열의 급속 증폭(5'-, 3'-RACE(cDNA 말단 급속 증폭; rapid amplification of cDNA ends))을 행하였다.
(1) 게놈 DNA 라이브러리의 제조
실시예 A5에서 정제한 락토코커스 20-92주의 게놈 DNA를 제한 효소(BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, SacI, SalI, Sau3AI, XhoI)(모두 다카라 바이오 가부시끼가이샤)에 의해 37 ℃, 16 시간 소화시킴으로써 단편화하고, 페놀ㆍ클로로포름 처리 후, 에탄올 침전으로 정제하였다. 정제한 게놈 DNA 단편은 미리 상당하는 제한 효소로 절단 처리하고, 쉬림프 알칼리 포스파타제(Shrimp Alkaline Phosphatase)(다카라 바이오 가부시끼가이샤) 처리에 의해 탈인산화해 둔 pUC19 클로닝 벡터에 TaKaRa Ligation kit var.2.1(다카라 바이오 가부시끼가이샤)을 이용하여 라이게이션하고, 게놈 DNA 라이브러리를 제조하였다.
(2) cDNA 말단 서열의 급속 증폭(5'-RACE, 3'-RACE)
게놈 DNA 라이브러리(라이게이션 반응액)를 멸균수로 20배 희석하고, 1 μl를 주형으로 사용하여 cDNA 말단 서열의 급속 증폭(5'-RACE, 3'-RACE)에 의한 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 서열 증폭을 시도하였다.
(2-1) 사용 프라이머
5'-RACE, 3'-RACE에 각각 이용한 프라이머의 조합을 이하에 나타내었다.
(2-1-1) 5'-RACE
First-PCR: E1-RACE-N-P1과 pUC19-FP-1, E1-RACE-N-P1과 pUC19-RP-1
Nested-PCR: E1-RACE-N-P2와 pUC19-FP-2, E1-RACE-N-P2와 pUC19-RP-2
(2-1-2) 3'-RACE
First-PCR: E1-RACE-RP2-1과 pUC19-FP-1, E1-RACE-RP2-1과 pUC19-RP-1
Nested-PCR: E1-RACE-RP2-2와 pUC19-FP-2, E1-RACE-RP2-2와 pUC19-RP-2
(2-1-3) 사용 프라이머의 서열
5'-RACE, 3'-RACE에 각각 이용한 프라이머의 서열을 이하에 나타내었다.
벡터측 프라이머:
pUC19-FP-1: ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG(서열 번호 27)
pUC19-RP-1: AGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGC(서열 번호 28)
pUC19-FP-2: ATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGG(서열 번호 29)
pUC19-RP-2: CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG(서열 번호 30)
디히드로다이드제인 합성 효소 유전자측 프라이머
E1-RACE-N-P1: ATGCGGATCGCTCGGTTCTCGACCTCTAGGTTAC(서열 번호 31)
E1-RACE-RP2-1: ATCGAGGAGAAGTGCGAGGACGTCAGGGTCATC(서열 번호 32)
E1-RACE-N-P2: TTCTCGACCTCTAGGTTACCGATGTAGCCGC(서열 번호 33)
E1-RACE-RP2-2: ACGTCAGGGTCATCGGCATCGGCGACTGCAAG(서열 번호 34)
또한, 본 실시예에서 프라이머로서 사용한 올리고 DNA는 전부 시그마 알드리치 재팬에서 제조하였다.
(2-2) 5'-RACE 및 3'-RACE에 의한 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 서열 증폭
5'-RACE, 3'-RACE에는 Ex-Taq DNA 폴리머라제(다카라 바이오 가부시끼가이샤)를 사용하여 First-PCR 및 Nested-PCR을 동일한 증폭 프로그램:
95 ℃ 2 분, (95 ℃ 45 초, 60 ℃ 30 초, 72 ℃ 1 분)×30 사이클, 72 ℃ 3 분으로 행하였다. First-PCR에서는 주형으로 제조 방법을 상기 기재한 게놈 DNA 희석액 1 μl(40 ng)를 사용하고, Nested-PCR에는 0.5 μl의 First-PCR 산물을 사용하였다.
Nested-PCR 반응 종료 후, PCR 산물에 1/10 양의 10×일을 첨가하고, 5 μl를 0.8 ％의 아가로스 겔로 전기 영동하여, 5'-RACE에서는 약 1.2 kb(SacI), 약 1.0 kb(Sau3AI), 3'-RACE에서는 약 0.6 kb(SacI), 0.3 kb(KpnI)의 DNA 단편의 증폭을 확인하였다.
본 실시예에서의 아가로스 전기 영동에서는 에티듐브로마이드(가부시끼가이샤 닛본 진)에 의한 염색으로 행하고, 분자량 마커에는 λ/StyI(가부시끼가이샤 닛본 진), 100 bp 래더(도요 보세끼 가부시끼가이샤)를 사용하였다.
증폭된 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 잘라내고, Gel-Extraction kit(퀴아젠)를 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA 단편은 증폭에 사용한 프라이머를 사용한 다이렉트 시퀀스에 의해 염기 서열을 결정하였다. 그 결과, 5'-RACE에서는 상기 약 1.2 kb(SacI), 약 1.0 kb(Sau3AI), 3'-RACE에서는 약 0.6 kb(SacI)의 DNA 단편이 디히드로다이세인 합성 효소 유전자의 서열이었다.
(3) 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 전체 염기 서열 결정
실시예 A5에서 나타낸 Degenerative-PCR 및 본 실시예 내 (2)에 나타낸 cDNA 말단 서열의 급속 증폭에 의해 얻어진 DNA 염기 서열을 DNA 시퀀스-어셈블 소프트웨어 SEQUENCHER(진 코즈 인크, USA)을 사용하여 어셈블 해석을 행하였다. 그 결과, 3548 bp의 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자 주변의 게놈 구조를 결정하고, 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자는 1935 뉴클레오티드, 644 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드인 것이 판명되었다.
염기 서열로부터 결정된 전체 아미노산 서열과 아미노산 시퀀스로부터 판명된 부분 아미노산 서열의 대조를 행한 결과, 아미노산 시퀀스로부터 판명된 부분 아미노산 서열이 모두 염기 서열로부터 결정된 전체 아미노산 서열에 귀속시킬 수 있었다.
(4) 코딩 영역의 염기 서열 확인
본 실시예 내 (3)에서 얻어진 서열에는 PCR에서의 증폭시에, DNA 폴리머라제의 염기 취입 에러에 의한 클론 사이에서 염기가 다른 개소가 다수 보였다. 그 때문에, 첫번째 가닥(First strand) cDNA를 주형으로 하여 고충실도(High-Fidelity) DNA-폴리머라제인 이지-A(R)-하이-피델러티 PCR 클로닝 엔자임(Easy-A(R)High-Fidelity PCR Cloning Enzyme)(스트라타젠(Stratagene))을 사용한 PCR에 의해, 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 코딩 영역을 포함한 영역(2368 bp)을 증폭시켰다.
사용한 증폭 프라이머를 이하에 나타내었다.
E1-conf-NP: TGCCGGTGCAATGGCTGACATCATGTTCAACCTG(서열 번호 35)
E1-conf-CP: TCCTCCATCGTTCCTCCAATCAGTAAGACACGCG(서열 번호 36)
얻어진 DNA 단편은 Gel-Extraction kit(퀴아젠)를 이용하여 정제하고, 다이렉트 시퀀스에 의해 서열의 확인, 최종 결정을 행하였다.
실시예 A7 증식 배양액 중에의 다이드제인의 첨가에 의한 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 발현 유도
실시예 A1에서 나타낸 바와 같이 락토코커스 20-92주의 증식용 배양액에 기질인 다이드제인을 첨가한 경우, 배양된 균체는 디히드로다이드제인 합성 활성을 갖는다. 이로부터 증식 배양액 중에의 다이드제인의 첨가에 의해 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 전사가 유도되고, 또한 단백질로 번역되는 것이 추측되기 때문에, 다이드제인을 첨가한 배지 및 첨가하지 않은 배지에서 각각 배양한 락토코커스 20-92주 균체 유래의 cDNA를 제조하고, RT-PCR을 행함으로써 증식 배양액 중에의 다이드제인의 첨가에 의해 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 발현이 유도되는가 아닌가에 대하여 검토하였다.
(1) 락토코커스 20-92주로부터의 전체 RNA의 추출, 정제
락토코커스 20-92주로부터의 전체 RNA의 추출, 정제는 이하의 방법으로 행하였다.
4 ℃에서 밀봉 보존해 둔 락토코커스 20-92주를 다이드제인(프나코시 가부시끼가이샤) 10 mg/L를 포함하는 또는 포함하지 않는 변법 GAM 브로쓰 배지에서 37 ℃, 8 시간 혐기 배양을 행한 후, 배양액 25 mL를 50 mL 용량의 튜브에 옮기고, 3500 rpm, 4 ℃, 10 분간 원심하고, 배지를 경사분리함으로써 제거하여 집균하였다. 모은 균체는 재빠르게 액체 질소로 동결시키고, 이어서 TRIzol 용액(인비트로젠) 1 ml를 이용하여 메뉴얼에 따라서 전체 RNA를 추출, 정제하였다. 정제한 전체 RNA는 DNase I(인비트로젠) 처리를 행함으로써, 혼입되어 있는 게놈 DNA를 제거하여 첫번째 가닥 cDNA의 합성에 사용하였다.
(2) 전체 RNA로부터의 첫번째 가닥 cDNA의 합성
DNaseI 처리를 실시한 전체 RNA 2 μg으로 수퍼스크립트(SuperScript)(등록 상표) 퍼스트-스트랜드 신세시스 시스템 포 RT-PCR(First-Strand Synthesis System for RT-PCR)(인비트로젠)을 이용하여 첫번째 가닥 cDNA(역전사물)를 합성하였다. DNA 합성을 위한 신장 프라이머에는 부속된 랜덤 헥사머 믹스를 이용하여 메뉴얼에 따라서 첫번째 가닥 cDNA의 합성을 행하였다. 또한, 첫번째 가닥 cDNA의 합성에 이용한 DNase I 처리 종료된 전체 RNA에의 게놈 DNA의 혼입이 없는 것을 확인하기 위해서, 역전사를 행하지 않는 반응도 함께 행하였다. RT-PCR의 주형으로는 최종 반응액을 사용하였다.
상기에서 제조한 최종 반응액은 이하의 4 종류이다.
1. 다이드제인 첨가 배지에서 배양한 균체 유래 전체 RNA의 역전사물(DZN(+)RT(+))
2. 다이드제인 무첨가 배지에서 배양한 균체 유래 전체 RNA의 역전사물(DZN(­)RT(+))
3. 다이드제인 첨가 배지에서 배양한 균체 유래 전체 RNA의 무역전사물(DZN(+)RT(­))
4. 다이드제인 무첨가 배지에서 배양한 균체 유래 전체 RNA 무역전사물(DZN(­)RT(­))
(3) RT-PCR에 의한 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 발현 확인
본 실시예 내 (2)에서 나타낸 4 종류의 최종 반응물을 주형으로 하여 RT-PCR을 행함으로써, 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자를 증폭시켜 발현량을 비교하였다. 대조군 유전자로서 16S-리보솜 RNA 서열을 채용하고, 아울러 RT-PCR을 행하였다.
RT-PCR의 증폭 조건 및 각각의 유전자 증폭에 사용한 프라이머 서열을 이하에 나타내었다.
RT-PCR에는 Ex-Taq DNA 폴리머라제(다카라 바이오 가부시끼가이샤)를 사용하여 증폭 프로그램:
95 ℃ 2 분, (95 ℃ 30 초, 56 ℃ 20 초, 72 ℃ 30 초)×30 사이클, 72 ℃ 2 분으로 행하였다. 주형에는 본 실시예 내 (2)의 최종 반응액 1 μl를 사용하였다.
본 실시예의 RT-PCR에 사용한 프라이머 서열 및 증폭시키는 DNA 단편의 크기를 이하에 나타내었다.
디히드로다이드제인 합성 효소: 239 bp
E1-FP: CTACATCGGTAACCTAGAGGTCG(서열 번호 37)
E1-RP: CCGTGCTGCTTGATGGTCTTTGC(서열 번호 38)
16S-리보솜 RNA 서열: 326 bp
Gar-16S-Ribo-FP: TGCGTAGATATATGGAGGAAC(서열 번호 39)
Gar-16S-Ribo-RP: CTTATCTCTAAGGATAGCACG(서열 번호 40)
또한, 16S-리보솜 RNA 서열의 증폭에 이용한 프라이머는 미국 생물 공학 정보 센터(National Center of Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)가 제공하고 있는 염기 서열 데이터 베이스(GenBank) 내의 락토코커스 가르비에 균주(Lactococcus garvieae strain) FLG12 16S 리보솜 RNA 유전자, 부분 서열(Accesion No.AF352163-66)의 서열을 기초로 제조하였다.
PCR 산물에 1/10 양의 10×일을 첨가하고, 5 μl를 1.5 ％의 아가로스 겔로 전기 영동하여 각각의 유전자 증폭을 관찰하였다.
본 실시예에서의 아가로스 전기 영동에서는 에티듐브로마이드(가부시끼가이샤 닛본 진)에 의한 염색으로 행하고, 분자량 마커에는 λ/StyI(가부시끼가이샤 닛본 진), 100 bp 래더(도요 보세끼 가부시끼가이샤)를 사용하였다.
결과를 도 6에 나타내었다.
디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 RT-PCR에 의한 증폭 결과로부터 분명한 바와 같이, 주형으로 다이드제인 첨가 배지에서 배양한 균체 유래의 역전사물을 사용한 경우에만, 상기 유전자가 양호한 효율로 발현된 것이 관찰되었다. 대조군으로서 증폭시킨 16S-리보솜 RNA 서열은 배지 중에의 다이드제인의 첨가 유무에 관계없이 동등한 발현이 관찰되었다. 또한, 무역전사물에서는 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자 및 16S-리보솜 RNA 서열 모두 상기 유전자가 증폭되지 않은 점에서, 첫번째 가닥 cDNA의 합성에 이용한 DNase I 처리 종료된 전체 RNA로의 게놈 DNA의 혼입이 없는 것이 확인되었다. 이상의 점으로부터, 배지로의 다이드제인의 첨가에 의해, 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자의 mRNA 발현이 유도되는 것이 확인되었다.
실시예 A8 대장균을 이용한 재조합 E1 폴리펩티드의 발현 및 그의 디히드로다이드제인 합성 활성의 확인
대장균을 이용한 재조합 단백질 발현 시스템인 pET 시스템을 이용하여 E1 폴리펩티드를 발현시키고, 그 디히드로다이드제인 합성 활성을 확인하였다.
(1) E1 폴리펩티드 발현 벡터의 제조
E1 폴리펩티드 발현 벡터(pET21-E1-His)를 제조할 목적으로 PCR에 의해 E1 뉴클레오티드의 오픈ㆍ리딩ㆍ프레임 영역의 DNA를 증폭시켰다.
실시예 A6에서 결정한 E1 뉴클레오티드 서열을 기초로 하기의 증폭 프라이머를 제조하였다.
exp.E1 pet F Nde: AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA(서열 번호: 41)
exp.E1 pet His: AATCGAATTCCTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT(서열 번호: 42)
상기 증폭 프라이머: exp.E1 pet F Nde, exp.E1 pet His에는 pET21a(노바젠)에 삽입하기 위해서, 각각 제한 효소 NdeI 절단 부위, EcoRI 절단 부위 서열을 포함한다.
상기 프라이머를 각 5 pmol, dNTP 각 5 nmol, 실시예 A5에서 정제한 락토코커스 20-92주의 게놈 DNA 40 ng , KOD-plus DNA 폴리머라제용 10×완충액(도요 보세끼 가부시끼가이샤) 2.5 μl, KOD-Plus DNA 폴리머라제 0.3 유닛(도요 보세끼 가부시끼가이샤)을 포함하는 25 μl의 반응액을 이용하고, 증폭 프로그램: 95 ℃ 3 분,(94 ℃ 30 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 2 분)×30 사이클, 68 ℃ 7 분으로 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드ㆍ바이오시스템)을 이용하여 행하였다. PCR 반응액의 일부를 아가로스 겔 전기 영동에 의해 해석한 결과, 예상되는 크기의 밴드를 검출할 수 있었다. PCR 산물 전량을 QIAGEN PCR Purification kit(퀴아젠)로 회수하였다.
회수한 DNA 단편을 제한 효소 NdeI 및 EcoRI로 절단 후, 아가로스 겔 전기 영동을 행하여 목적으로 하는 밴드 부분을 잘라내고, Qiagen Gel Extraction kit(퀴아젠)에 의해 정제, 회수하였다. 얻어진 DNA 단편은 NdeI 및 EcoRI로 소화시킨 pET21a와 DNA Ligation Kit ver.2.1(다카라 바이오 가부시끼가이샤)을 이용하여 16 ℃, 밤새 라이게이션한 후, 라이게이션 반응액을 이용하여 대장균 JM109주(다카라 바이오 가부시끼가이샤)를 형질 전환하였다.
형질 전환체를 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지 아가(GIBCO) 플레이트 상에서 37 ℃, 밤새 생육시켜 콜로니를 얻었다. 얻어진 싱글 콜로니는 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지(GIBCO) 3 mL에서 밤새 배양한 후, 플라스미드 자동 추출기 PI-100(KURABO)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다.
플라스미드에 삽입한 DNA의 염기 서열을 다이(dye) 터미네이터법에 의해 시퀀스를 행하여, 목적대로 정확하게 E1 뉴클레오티드가 삽입되어 있음을 확인하고, pET21-E1-His를 얻었다. 본 실시예에서의 DNA 시퀀스는 DNA 시퀀서 ABI3700(어플라이드ㆍ바이오시스템)을 이용하여 행하였다.
(2) 대장균 내에서의 재조합체의 제조 및 E1 폴리펩티드의 발현 및 확인
재조합 E1 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드 pET21-E1-His와 pET21a(음성 대조군)를 이용하여 대장균 BL21(DE3)주(노바젠)를 형질 전환하였다. 형질 전환체는 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지 아가(agar) 플레이트 상에서 37 ℃, 밤새 생육시켜 싱글 콜로니를 얻었다.
상기 대장균 BL21(DE3) 형질 전환체 각각을 암피실린 50 μg/ml를 포함하는 3 mL의 액체 LB 배지로 밤새 37 ℃에서 배양하였다. 그 배양액 0.5 mL를 동일한 농도의 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지 50 mL 첨가하고, 3 시간(OD 630 nm가 약 0.4가 될 때까지) 전배양하고, 종료 농도가 1 mM가 되도록 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드)(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)를 첨가하고, 또한 37 ℃에서 4 시간 배양을 행하였다.
배양 종료 후, 균체를 Avanti HP25(벡크만 코울터)에서 원심 분리(6000 rpm 4 ℃ 15 분)에 의해 집균하였다. 이후의 조작은 얼음 상에서 행하였다. 원심 상청(배지)을 제거한 후, 1 mM PMSF, 2 mM DTT, 5 mM 히드로아황산나트륨을 포함하는 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7.0(KPB-PDH) 1 mL에 현탁시키고, 미리 0.7 mL 용량의 지르코니아-실리카 비드(바이오스펙 프로덕츠, 인크.) 및 KPB-PDH 400 μl를 넣어 둔 2 mL 용량 어시스트 튜브에 넣고, 패스트프렙(R)(써모 일렉트론 코포레이션)을 이용하여 6500 rpm, 20 초간 처리-3 분간 빙냉을 2회 반복함으로써 균체를 파쇄하여 균체 파쇄액을 얻었다.
대장균 내에서의 재조합 E1 폴리펩티드의 발현 확인은 SDS-폴리아크릴아미드-겔 전기 영동(SDS-PAGE)으로 행하였다.
상기 균체 파쇄액 10 μl에 5×샘플 완충액(125 mM 트리스-HCl(pH 6.5)/25 ％ 글리세롤/5 ％ SDS/5 ％ 2-머캅토에탄올/BPB 0.5 ％)을 2.5 μl 첨가하여 98 ℃ 5 분간 가열 변성 후, 빙냉시키고, 그 중 5 μl를 SDS-PAGE로 영동하였다. SDS­PAGE에는 시판되는 겔판(SuperSepTM5-20 ％(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤))을 사용하고, 염색은 퀵 CBB(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)로 행하였다. 분자량 마커에는 프리스테인드 XL-래더 브로드 레인지(Prestained XL-Ladder Broad range)(가부시끼가이샤 아프로사이언스)를 사용하였다.
SDS-PAGE 결과를 도 7에 나타내었다. pET21-E1-His 형질 전환체 유래의 균체 파쇄액으로 분자량 약 70 kDa의 재조합 E1 폴리펩티드가 확인되었다.
(3) 재조합체로부터 얻어진 E1 폴리펩티드의 디히드로다이드제인 합성 활성의 확인
본 실시예 내 (2)에서 얻은 균체 파쇄액을 효소원으로 하여 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인으로의 변환 활성을 측정하고, 발현시킨 재조합 E1 폴리펩티드에 그의 활성을 확인하였다.
본 실시예에서의 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인으로의 변환 활성의 측정은 이하의 방법으로 행하였다.
하기 조성의 효소 반응액을 제조하고, 37 ℃에서 2 시간 인큐베이션하였다.
효소 반응액 조성
Figure 112010048098509-pct00002
인큐베이션 후, 얻어진 효소 반응액에 3 mL의 아세트산에틸을 첨가하여 추출 처리를 행하고, 건고시킨 후, 이동층(용리액)으로 용해시켰다. 용해물을 HPLC 분석함으로써 효소 반응액 중의 다이드제인 및 디히드로다이드제인의 함량을 측정하였다.
HPLC 분석 결과를 도 8에 나타내었다. 재조합 E1 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드 pET21-E1-His의 형질 전환체 유래의 균 파쇄액에서는 효소 반응액에 첨가한 다이드제인(기질)이 디히드로다이드제인으로 변환되는 것이 관찰되었다. 음성 대조군인 pET21a 형질 전환체에서는 효소 반응액 중에 디히드로다이드제인은 검출되지 않았다.
이상의 점으로부터 재조합 E1 폴리펩티드가 다이드제인으로부터의 디히드로다이드제인 합성 활성을 갖는 것이 확인되었다.
(실시예 B)
참고예 B1 시스-테트라히드로다이드제인 및 트랜스-테트라히드로다이드제인의 합성
시스-테트라히드로다이드제인 및 트랜스-테트라히드로다이드제인을 이하의 플로우에 따라서 제조하였다. 또한, 이하, 화합물의 표기에 대하여 하기의 약기를 사용한다.
화합물 1(다이드제인): 4',7-디히드록시이소플라본
화합물 2: 4',7-디아세톡시이소플라본
화합물 3: 4',7-디아세톡시이소플라반-4-온
화합물 4: 시스-4',7-디아세톡시이소플라반-4-올
화합물 5: 트랜스-4',7-디아세톡시이소플라반-4-올
화합물 6: 시스-테트라히드로다이드제인
화합물 7: 트랜스-테트라히드로다이드제인
Figure 112010048098509-pct00003
화합물 2의 합성
다이드제인(화합물 1) 500 mg(1.97 mmol)의 피리딘(5 mL) 용액에 무수 아세트산 0.76 mL(8.0 mmol)을 첨가하여 60 ℃에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 소량의 메탄올을 첨가한 후에 3 N 염산 중에 부었다. 물로 희석한 후에 석출된 고체를 여과 분리하고, 이것을 수세하였다. 얻어진 고체를 실온에서 풍건하여 백색 분말상의 화합물 2 609 mg(1.80 mmol, 91 ％ 수율)을 얻었다.
Figure 112010048098509-pct00004
화합물 3의 합성
화합물 2 400 mg(1.18 mmol) 및 10 ％ 팔라듐-탄소(함수품, 약 50 중량％) 150 mg의 메탄올(6 mL)-아세트산에틸(6 mL) 현탁액을 수소 분위기하에 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 셀라이트 여과하고, 잔사를 아세트산에틸로 세정하였다. 여과액을 농축하여 얻어진 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(실리카 겔: 디클로로메탄/아세트산에틸=100/0 - 19/1)로 정제하고, 백색 분말상의 화합물 3 312 mg(0.917 mmol, 78 ％ 수율)을 얻었다.
Figure 112010048098509-pct00005
화합물 4 및 화합물 5의 합성
화합물 3 100 mg(0.294 mmol)의 메탄올(1 mL)-디클로로메탄(1 mL) 용액에 0 ℃에서 수소화붕소나트륨 11 mg(0.29 mmol)을 첨가하여 0 ℃에서 30 분 교반하였다. 반응액에 1 N 염산 2 mL, 물 50 ml를 순서대로 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 중조수, 포화 식염수의 순서대로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 증류 제거하여 얻어진 잔사를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(실리카 겔: 디클로로메탄/아세트산에틸=19/1-3/1)로 정제하였다. 얻어진 디아스테레오머 혼합물을 중압 컬럼 크로마토그래피(야마젠 제조 울트라팩 SI-40B: n-헥산/아세트산에틸=3/2)로 정제하여 무색 침상의 화합물 4 44 mg(0.13 mmol, 44 ％ 수율) 및 무색 침상의 화합물 5 26 mg(75 mmol, 26 ％ 수율)을 얻었다.
Figure 112010048098509-pct00006
화합물 6의 합성
화합물 4 116 mg(0.339 mmol)의 메탄올(4 mL) 용액에 나트륨메톡시드 55 mg(1.0 mmol)을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 이온 교환 수지(다우 엑스 50×8W, 암모늄 폼)를 첨가하여 중화시킨 후에, 수지를 여과 제거하였다. 여과액을 농축시켜 얻어진 고체를 메탄올로 세정하고, 백색 분말상의 화합물 6 62 mg(0.24 mmol, 71 ％ 수율)을 얻었다.
Figure 112010048098509-pct00007
화합물 7의 합성
화합물 5 84 mg(0.25 mmol)의 메탄올(2 mL) 현탁액에 1 N 수산화나트륨 0.73 mL(0.73 mmol)를 첨가하고, 실온에서 2.5 시간 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄물을 첨가하여 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 중조수, 포화 식염수의 순서대로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 증류 제거하여 백색 분말상의 화합물 7 64 mg(0.25 mmol, 정량적 수율)을 얻었다.
Figure 112010048098509-pct00008
참고예 B2
락토코커스 20-92주(FERM BP-10036호)를 다이드제인 함유 증식용 액체 배지에 접종하여 혐기적 조건하에 37 ℃에서 7 내지 24 시간 배양하였다. 배양 후, 원심 분리에 의해 집균하여 냉동 보존하고, 이하의 실시예에 사용하였다.
실시예 B1
테트라히드로다이드제인 생성의 확인 이하의 시험을 행하여, 테트라히드로다이드제인이 에쿠올 생합성의 중간 대사물인 것을 확인하였다.
(1) 균 파쇄물의 제조
-80 ℃에서 보존한 락토코커스 20-92주 균체를 재빠르게 융해, 탭핑으로 현탁시키고, 8000 rpm×5 분, 4 ℃에서 원심 분리 VC-960(다이테크 가부시끼가이샤(제조))하였다. 상청을 제거한 후에, 0.1 M 인산칼륨 완충액/1 mM PMSF(Phenyl Methane Sulfonyl Fluoride)/2 mM DTT(디티오트레이톨)/5 mM 히드로아황산나트륨(pH 7.0)를 첨가하여 균 현탁액을 얻었다. 이어서, 미리 지르코니아-실리카 비드[0.1 mm 1 lb(와켄야꾸 가부시끼가이샤(제조))를 약 0.8 mL 용량 넣어 둔 2 ml 튜브에 균 현탁액을 넣고, 또한 0.1 M 인산칼륨 완충액/1 mM PMSF/2 mM DTT/5 mM 히드로아황산나트륨(pH 7.0)을 첨가하여 튜브를 거의 가득 채웠다. 이어서, 튜브의 뚜껑을 덮고, 빙냉시키면서 패스트프렙TM-FP100A(써모 일렉트론 코포레이션(제조))를 이용하여 6500 rpm×20 초-빙냉의 조작을 합계 4회 반복하여 파쇄 처리를 행하였다. 이렇게 하여 얻어진 균 파쇄물을 효소원으로서 효소 반응을 행하였다.
(2) 효소 반응
상기 (1)의 균 파쇄물을 0.1 ml 포함하는 하기 조성의 효소 반응액 1 ml를 제조하고, 37 ℃에서 2 시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 얻어진 효소 반응 생성물에 3 mL의 아세트산에틸을 첨가하여 추출 처리를 행한 후, 건고시켜 HPLC 분석에 적용하였다.
효소 반응액 조성
0.1 M 인산칼륨 완충액/1 mM PMSF/2 mM DTT/5 mM 히드로아황산나트륨(pH 7.0)
2 mM NADPH
2 mM NADH
10 μg/mL 디히드로다이드제인 또는 테트라히드로다이드제인
(3) 효소 반응에 의한 디히드로다이드제인으로부터의 테트라히드로다이드제인의 생성
기질에 디히드로다이드제인을 이용하고, 균 파쇄물을 효소원으로 하여 얻어진 효소 반응 생성물의 HPLC 분석 결과를 도 9에 나타내었다. 또한, 상기 참고예 1에서 합성한 테트라히드로다이드제인의 HPLC 분석을 도 9에 함께 나타내었다. 이 결과로부터, 기질에 디히드로다이드제인을 이용하고, 균 파쇄물을 효소원으로 하여 얻어진 효소 반응 생성물에는, 트랜스-테트라히드로다이드제인의 유지 시간에 일치하는 유지 시간을 갖는 중간체의 존재가 확인되고, 트랜스-테트라히드로다이드제인이 생성된 것이 확인되었다.
(4) 효소 반응에 의한 테트라히드로다이드제인으로부터의 에쿠올 생성
기질에 시스-테트라히드로다이드제인 또는 트랜스-테트라히드로다이드제인을 이용하고, 균 파쇄물을 효소원으로 하여 얻어진 효소 반응 생성물의 HPLC 분석 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10으로부터 분명한 바와 같이, 모든 화합물에서 에쿠올이 생성되고, 테트라히드로다이드제인은 시스형 및 트랜스형을 막론하고 에쿠올 생합성 과정에서 기질로서 이용되는 것이 판명되었다.
실시예 B2 균체 파쇄물의 원심 상청 중에서의 테트라히드로다이드제인 생합성 활성의 존재 확인, 및 NADH 또는 NADPH 의존성 확인
보존되어 있는 동결 균체를 융해 후 5000×G, 4 ℃, 15 분간 원심 분리하고, 펠렛을 이하의 시험에 적용하였다. 펠렛(습중량 2.7 g)을, 1 mM PMSF 및 5 mM 히드로아황산나트륨을 함유하는 0.1 M 인산일칼륨 용액 10 ml에 현탁시키고, 37 ℃에서 5 분간 예열한 후, 리소자임을 습중량 1 g당 100 mg/습중량이 되도록 첨가하고, 37 ℃에서 1.5 시간 반응시켰다. 이어서, 얻어진 반응액에 등량의 0.1 M 인산이칼륨 용액을 첨가한 후, 또한 지르코니아-실리카 비드 3 ml 용량을 첨가하여 볼텍스 믹서에서 격렬하게 교반하고, 또한 초음파 처리기(브랜슨 소니피어 셀 디스럽터(Branson Sonifier Cell Disruptor) 200)에서 균체 파쇄하였다(5 분 처리 2 분 휴게의 사이클을 3회). 얻어진 균체 파쇄액을 약 10,000×G에서 15 분간 원심하여 원심 상청을 얻고, 이것을 효소원으로 하였다.
하기 조성의 효소 반응액을 제조하고, 37 ℃에서 2 시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 얻어진 효소 반응 생성물에 5 mL의 아세트산에틸을 첨가하여 추출 처리를 행한 후, 건고시켜 HPLC 분석에 적용하였다.
효소 반응액 조성
Figure 112010048098509-pct00009
결과를 도 11에 나타내었다. 이 결과로부터, 균체 파쇄물의 원심 상청에는 테트라히드로다이드제인 생합성 활성이 존재하는 것이 확인되었다. 또한, 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인으로의 변환 반응은 보효소 NADH 또는 NADPH에 의존성을 나타내지만, NADPH쪽이 훨씬 그 의존성이 높은 것이 확인되었다.
실시예 B3 테트라히드로다이드제인 합성 효소의 정제
배양병당 67 ml의 다이드제인 함유 증식용 액체 배지에서 20 시간 배양한 락토코커스 20-92주 균체 10개분을 원심 후 1 mM PMSF(페닐메틸술포닐플루오라이드) 및 4 mM DTT(디티오트레이톨)를 함유하는 0.02 M 인산칼륨 완충액 pH 7(이하, 「Buffer A」라고 표기함)에 현탁시키고, 프렌치 프레스(SLM INSTRUMENTS INC)로 균체를 파쇄하고(1800 psi에서 6회), 파쇄액을 원심하여 상청액을 얻었다. 또한, 배양병당 200 ml의 액체 배지에서 18 시간 배양한 락토코커스 20-92주 균체 5개분을 동일하게 프렌치 프레스에 적용시켜 균체 파쇄 후에 원심하여 상청을 얻었다. 전자 및 후자의 원심 상청을 각각 38 ml 및 47 ml를 혼합하고, 그 혼합액의 82 ml를 미리 Buffer A로 평형화시켜 둔 Red-Sepharose(약 7 ml)에 적용하였다. 이어서, 150 ml의 Buffer A로 Red-Sepharose를 세정한 후, 10 mM의 NADPH를 포함하는 Buffer A로 용출시켰다(20 ml/프랙션). 각 프랙션을 효소원으로서 이용하고, 실시예 B2에 나타내는 효소 반응 조건(보효소로서 NADPH를 사용)과 동일한 조건에서 테트라히드로다이드제인 생합성 활성에 대하여 측정하고, 활성 분획으로서 프랙션 No.1 내지 5를 얻었다.
테트라히드로다이드제인 생합성 활성을 갖는 프랙션 No.1 내지 5를 아미콘 울트라 센트리푸걸(Amicon Ultra Centrifugal) UFC801024(MW Cut: 10,000)를 이용하여 한외 여과 농축시키고, 농축액 약 2.1 ml를 얻었다. 농축액은 3 분할하여 각각 등량의 3 M 황산암모늄을 포함하는 Buffer A와 혼합한 후, TSKgel Phenyl-5PW(도소 가부시끼가이샤)를 이용한 HPLC에 적용하였다. HPLC의 조건을 이하에 나타내었다. 단백질의 흡수로서, 280 nm의 흡수를 측정하였다.
칼럼: TSKgel Phenyl-5PW
유속: 1 ml/분
프랙션: 2 ml/2 분/프랙션
용리액 A: 0.02 M 인산칼륨 완충액 pH 7/1 mM DTT/2.5 mM 히드로아황산나트륨/0.5 ％ isoPrOH
용리액 B: 1 M 황산암모늄을 포함하는 용리액 A
용출 프로그램: 시간(분) (용리액 B)/(용리액 A+용리액 B)
0 1
5 1
25 0
45 0
이 HPLC의 결과, 테트라히드로다이드제인 합성 활성을 갖는 프랙션은 15번째 이후(프랙션 No.15 이후, 유지 시간 30 분 이후)에 광범위하게 확인되었지만, HPLC의 프랙션 No.19 내지 22를 혼합하여 한외 여과 농축[아미콘 울트라 센트리푸걸 UFC801024(MW Cut: 10,000)]시켰다. 얻어진 농축액 약 130 μl 중의 100 μl를 이하의 조건하에서 TSKgel G2000SWXL(도소 가부시끼가이샤)을 이용한 겔 여과 HPLC에 적용하였다.
칼럼: TSKgel G2000SWXL
유속: 0.6 ml/분
프랙션: 1.2 ml/2 분/프랙션
용리액: 0.05 M 인산칼륨 완충액 pH 7/1 mM DTT/2.5 mM 히드로아황산나트륨/1 ％ isoPrOH/0.3 M NaCl
겔 여과 HPLC의 결과를 도 12에 나타내었다. 또한, 도 13에 환원 조건하에서의 각 프랙션의 SDS-PAGE 결과를 나타내었다. 이 결과, 테트라히드로다이드제인 합성 활성을 나타내는 주(注) 프랙션인 프랙션 No.7에, 환원 조건하에서 28 kDa 및 32 kDa의 밴드가 확인되었다.
실시예 B4 테트라히드로다이드제인 합성 효소의 아미노산 서열 해석
상기 실시예 3에서 얻어진 테트라히드로다이드제인 합성 활성을 갖는 프랙션(프랙션 No.7)을 샘플로 하여 MS 분석을 하였다. 구체적으로는, 샘플을 SDS-PAGE에서 분리하고, 밴드를 잘라내었다. 잘라낸 밴드를 겔 내 환원 알킬화하고, 트립신으로 겔 내 소화시켰다. 이어서, 트립신 소화 펩티드를 회수ㆍ정제하여 LC-MS에서 분석하였다. LC-MS 분석에 의해 취득된 데이터에 대하여 MS 분석 지원 소프트웨어인 PEAKSTM(인포콤 가부시끼가이샤)을 이용한 데 노보(de novo) 시퀀싱을 행함으로써, 펩티드의 아미노산 서열을 계산ㆍ추정하였다. 상세한 방법 등에 대해서는 이하와 같았다.
(1) 실험 재료
본 시험에서는 SuperSep HG 10/20 ％(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤), 플라밍고 겔 스테이닝 키트(Flamingo gel staining kit)(바이오-라드(Bio-Rad)), TCEP(트리스[2-카르복시에틸]포스핀)(피어스), 분자량 마커(가부시끼가이샤 아프로사이언스), DTT(Calbiochem), 요오도아세트아미드(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤), 아세토니트릴(간토 가가꾸 가부시끼가이샤), 트립신(Promega), TFA(피어스), 중탄산암모늄(Sigma), 암모니아수(머크 가부시끼가이샤), 포름산(간토 가가꾸 가부시끼가이샤), Empore Cation-SR Disk(스미또모 쓰리엠 가부시끼가이샤), MonoCap 농축 칼럼(GL 사이언스 가부시끼가이샤), MonoCap for Nano Flow 0.1X150 mm(GL 사이언스 가부시끼가이샤), FortisTip(에이엠알 가부시끼가이샤), 스피드벡 콘센트레이터(SpeedVac Concentrator)(사반트), HTS-PAL 오토샘플러(CTC-Analytics), Chorus220(CTC-Analytics), QSTAR Pulsar i(어플라이드 바이오시스템), PEAKSTM 소프트웨어(인포콤 가부시끼가이샤)를 사용하였다.
(2) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동
상기 실시예 B3에서 얻어진, 테트라히드로다이드제인 합성 활성을 갖는 프랙션(프랙션 No.7) 20 μl에 100 mM TCEP를 1 μl 첨가하여 70 ℃에서 10 분 환원 처리를 행하였다. 샘플을 SuperSep HG에 전량 적용하고, 통상법에 따라서 SDS-PAGE를 행하였다. 영동 후에 Flamingo Gel staining kit(바이오-라드)로 염색하였다(도 14 참조). 염색 후에 확인된 밴드 LG1 및 LG2를 각각 잘라내어 1 mm변(角) 정도로 재단하였다. 잘라낸 겔을 100 mM 중탄산암모늄 용액으로 세정 후, 아세토니트릴로 탈수하고, 스피드벡 콘센트레이터에서 건조 고화시켰다.
(3) 겔 내 트립신 소화
건조시킨 겔편에 DTT 용액(100 mM 중탄산암모늄 중의 1.54 mg/ml)을 첨가하여 55 ℃에서 45 분간 인큐베이션하고, 환원 처리를 실시하였다. DTT 용액을 버리고, 요오도아세트아미드 용액(100 mM 중탄산암모늄 중의 10.1 mg/ml)을 첨가하여 실온 차광 조건하에서 30 분간 인큐베이션하였다. 용액을 버리고, 겔편을 50 ％ 아세토니트릴 용액, 100 ％ 아세토니트릴 용액, 100 mM 중탄산암모늄 용액, 100 ％ 아세토니트릴 용액으로 순차 세정하여 스피드벡 콘센트레이터에서 건조 고화시켰다. 건조시킨 겔편에 트립신 용액(50 mM 중탄산암모늄 중의 12.5 μg/ml)을 소량 첨가하고, 얼음 상에서 45 분간 침투시켰다. 침투 후에 여분의 트립신 용액을 제거하고, 겔편이 잠기는 정도의 50 mM 중탄산암모늄 용액을 첨가하여 37 ℃에서 16 시간 반응시켰다.
(4) 질량 분석에 의한 아미노산 서열 해석
트립신 소화 펩티드를 회수하고, Empore Cation-SR Disk를 피펫 칩에 채운 간이 칼럼으로 전처리 정제하였다. 트립신 소화 펩티드의 회수는 0.1 ％ TFA/90 ％ 아세토니트릴 용액으로 세정 회수하였다. 간이 칼럼의 조작은 평형화 0.1 ％ TFA/2 ％ 아세토니트릴 용액, 샘플 흡착, 칼럼 세정 0.1 ％ TFA/90 ％ 아세토니트릴 용액, 샘플 용출 5 ％ 암모니아/30 ％ 아세토니트릴 용액의 순서대로 행하고, 용출시킨 소화 펩티드를 스피드벡 콘센트레이터에서 건조 농축시켰다. 소화 펩티드 용액에 TFA를 첨가하여 pH 3 부근이 되도록 조정하고, 오토샘플러 HTS-PAL에 세팅하였다. HTS-PAL에 세팅한 샘플을, LC-MS용 인젝터-밸브에 있는 샘플 농축 칼럼에 로딩하고, 온 칼럼 세정을 행하였다. 농축 칼럼의 샘플을 nanoHPLC-Chorus220에 의해 분석 칼럼에서 분리하고, 분석 칼럼에 세팅한 FortisTip에서 이온화하여 QSTAR Pulsar i에서 분석하였다. LC-MS 분석 조건은 다음과 같았다.
LC부 Chorus220; A 용매: 0.1 ％ 포름산/2 ％ 아세토니트릴, B 용매: 0.1 ％ 포름산/90 ％ 아세토니트릴, 유속=300 nl/분, 농도 구배 5 ％ A-65 ％B/20 분, MS; NanoESI Positive mode, Information dependent acquisition mode; (m/z=400 내지 1400, Over25counts, Charge state=2 내지 4) 4 experiments/1 cycle Experiment 1; (TOF-MS, m/z=400 내지 1400, Accumulation time=1 초), Experiment 2 내지 4; (Positive Product Ion, m/z=100 내지 1400, Accumulation time=2 초)
밴드 LG1, LG2(도 14 참조) 각각에 대하여 LC-MS에서 취득한 데이터를 PEAKSTM 소프트웨어로 데 노보 시퀀싱을 행함으로써, 소화 펩티드의 아미노산 서열을 추정하였다.
실시예 B5 디히드로다이드제인 합성(E1) 효소 유전자의 주변 게놈 DNA 서열의 해석
(1) Inverse-PCR용 게놈 DNA 라이브러리의 제조
실시예 A5에서 정제한 락토코커스 20-92주(FERM BP-10036호)의 게놈 DNA를 이하에 나타내는 제한 효소(BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, SacI, SalI, Sau3AI, XhoI)(모두 다카라 바이오 가부시끼가이샤)에 의해 37 ℃, 16 시간 소화시킴으로써 단편화하고, 페놀ㆍ클로로포름 처리 후, 에탄올 침전으로 정제하였다. 정제한 게놈 DNA 단편은 TaKaRa Ligation kit var.2.1(다카라 바이오 가부시끼가이샤)을 이용하여 셀프-라이게이션하였다. 각 라이게이션 용액을 멸균수로 10배 희석함으로써 Inverse-PCR용 게놈 DNA 라이브러리를 제조하였다.
(2) Inverse-PCR
상기 (1)에 기재된 Inverse-PCR용 게놈 DNA 라이브러리 1 μl(40 ng 상당)를 주형으로 사용하고, Inverse-PCR에 의해 E1 폴리뉴클레오티드 주변 상류 및 하류 영역의 게놈 DNA의 증폭을 시도하였다. 상류측 영역 증가의 Inverse-PCR에는 PstI, XhoI로 처리한 것을, 하류측 영역 증가의 Inverse-PCR에는 HindIII, PstI, SacI, XhoI로 처리한 것을 각각 주형 DNA로서 사용하였다. Inverse-PCR에는 TaKaRa LA Taq(다카라 바이오 가부시끼가이샤)를 사용하였다. First-PCR은 1×PCR Buffer(Mg2+free), 프라이머 각 0.5 nM, dNTP 각 0.5 mM, MgCl2 2.5 mM, TaKaRa LA Taq 0.2 U를 포함하는 20 μl의 반응액을 이용하고, 게놈 DNA 라이브러리 희석액 1 μl(40 ng)를 주형으로 사용하고, 이하의 증폭 프로그램: 98 ℃ 1 분, (95 ℃ 10 초, 62 ℃ 10 초, 68 ℃ 10 분)×35 사이클, 68 ℃ 15 분으로 행하였다. 또한, 계속해서 Nested-PCR을 First-PCR 산물 0.5 μl를 주형으로 1×PCR Buffer(Mg2+free), 프라이머 각 0.5 nM, dNTP 각 0.5 mM, MgCl2 2.5 mM, TaKaRa LA Taq 0.3 U를 포함하는 30 μl의 반응액을 이용하고, 이하의 증폭 프로그램: 98 ℃ 1 분, (95 ℃ 10 초, 62 ℃ 10 초, 68 ℃ 10 분)×30 사이클, 68 ℃ 15 분으로 행하였다.
(2-1) 사용 프라이머
Inverse-PCR에 이용한 프라이머의 조합을 이하에 나타내었다.
(2-1-1) 상류측
First-PCR: RACE-N-P3-1과 E1-Bub-N-P1
Nested-PCR: RACE-N-P3-2와 E1-Bub-N-P2
(2-1-2) 하류측
First-PCR: RACE-C-P3-1과 E1-Bub-C-P1
Nested-PCR: RACE-C-P3-2와 E1-Bub-C-P2
(2-2) 사용 프라이머의 서열
상류측 및 하류측의 Inverse-PCR 각각에 이용한 프라이머의 서열을 이하에 나타내었다.
상류측의 증폭 프라이머 서열
RACE-N-P3-1: ATGGAGATAGTGCCGCTGGCAAGGCAACGGCAC(서열 번호: 43)
RACE-N-P3-2: TCAACGAAGACTCGATTTGAGCGAGAGGCGAGG(서열 번호: 44)
E1-Bub-N-P1: ACGGTGGAACCGGCATCGTGTTCATGGACAAC(서열 번호: 45)
E1-Bub-N-P2: GCGTGACCCAGTTCCACCATGTCGGACTGTC(서열 번호: 46)
하류측의 증폭 프라이머 서열
RACE-C-P3-1: GACATCCCGTTCGAGCGCAGGATCACCCATGAG(서열 번호: 47)
RACE-C-P3-2: AGGATCACCCATGAGCGCATCGCTATCATGGAC(서열 번호: 48)
E1-Bub-C-P1: CATCGCTCTTGCAGTCGTTGTCCAGGAAGTCC(서열 번호: 49)
E1-Bub-C-P2: TTGTCCAGGAAGTCCATCGCGTACACGACGGAG(서열 번호: 50)
또한, 본 실시예에서 증폭 프라이머로서 사용한 올리고 DNA는 전부 시그마ㆍ알드리치ㆍ재팬에서 합성하였다.
(3) Inverse-PCR로부터 증폭된 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자 주변 게놈 DNA 단편의 정제 및 염기 서열 결정
본 실시예(2)에서 실시한 Nested-PCR 산물에 1/10 양의 10×일을 첨가하고, 5 μl를 0.8 ％의 아가로스 겔로 전기 영동하고, 상류측 영역에서 0.5 kb(PstI), 3.5 kb(XhoI)의 DNA 단편의 증폭을, 하류측 영역에서 1 kb(HindIII), 1 kb(SacI), 2.5 kb(XhoI)의 DNA 단편의 증폭을 확인하였다. 본 실시예에서의 아가로스 전기 영동에서는 에티듐브로마이드(가부시끼가이샤 닛본 진)에 의한 염색을 행하고, 분자량 마커에는 λ/StyI(가부시끼가이샤 닛본 진), 100 bp 래더(도요보 가부시끼가이샤)를 사용하였다. 증폭된 DNA 단편을 아가로스 겔로부터 잘라내고, QIAGEN Gel-Extraction kit(퀴아젠)를 이용하여 정제하였다. 정제한 DNA 단편은 증폭에 사용한 프라이머를 사용한 다이렉트 시퀀스 및 워킹(walking)법에 의해 그의 염기 서열을 결정하였다.
(4) 게놈 서열의 해석 및 ORF(Open Reading Frame)의 예측
본 실시예(3)에서 얻어진 DNA 서열을 시퀀스-어셈블 소프트웨어 SEQUENCHER(진 코즈 인크, USA)를 사용하여 어셈블 해석을 행하고, 또한 ORF의 예측을 행하였다. 그 결과, E1 효소 유전자를 포함한 주변 게놈 영역 6685 bp의 서열을 결정하였다. 해석 결과로부터 얻어진 디히드로다이드제인 합성 효소 유전자 주변의 게놈 구조의 개략도를 도 15에 나타내었다. ORF 예측의 결과, E1 효소 유전자의 상류에 3개(이들 중 하나는 N 말단 미동정), 하류에 1개의 ORF를 발견하였다. 발견한 ORF는 디히드로다이드제인 합성 효소로부터 상류를 향해서 Upstream(US)1, US2, US3, 하류를 향해서 Downstream(DS)1이라 하였다.
실시예 B6 LC-MS 분석에 의한 소화 펩티드 서열과 게놈 서열의 대조
상기 실시예 B4에서 얻어진 추정 아미노산 서열을 상기 실시예 B5에서 결정한 디히드로다이드제인 합성(E1) 효소 유전자의 주변 게놈 DNA 서열 데이터와 대조하였다. 그 결과, 주로 LG2로부터 얻어진 몇개의 서열이 ORF-US2 뉴클레오티드 서열로부터 추정되는 폴리펩티드의 서열에 일치하였다. 이상의 점으로부터 ORF-US2 폴리펩티드가 테트라히드로다이드제인 합성 효소일 가능성이 시사되었다. 이하에 ORF-US2 폴리펩티드와 일치된 소화 펩티드 서열을 나타내었다. 또한, 도 16a, 16b, 16c에 LC-MS에서 취득한 데이터를 나타내었다.
Figure 112010048098509-pct00010
상기에서 m/z는 질량 전하비, z는 전하수, Mass는 펩티드의 질량, 펩티드는 추정 아미노산 서열을 기재하였다. 스코어는 PEAKS 소프트웨어 상에서 산출되는 서열 계산의 확실성을 스코어값(100 ％가 최상값)으로 표시하였다. 또한, 이소류신(I)과 류신(L)은 분자량이 동일하여 구별이 불가하기 때문에, 상기 ORF-US2 폴리펩티드와 일치된 소화 펩티드 서열에서는 쌍방 모두 X로 표시하였다.
실시예 B7 무세포계 단백질 합성 시스템을 이용한 ORF-US2 폴리펩티드의 합성 및 그 테트라히드로다이드제인 합성 활성의 확인
ORF-US2 폴리펩티드를 무세포계 단백질 합성 시스템(PURESYSTEM Classic II mini(포스트 게놈 연구소))을 이용하여 합성하고, 그 테트라히드로다이드제인 합성 활성을 확인하였다.
(1) 주형 DNA의 제조
2 단계 PCR에 의해, 무세포계 단백질 합성에 이용한 ORF-US2 폴리뉴클레오티드주형 DNA를 제조하였다.
(1-1) 사용 프라이머
ORF-US2용 주형 DNA 제조를 위한 PCR에 사용한 프라이머를 이하에 나타내었다.
E2-invitroTS-FP1: ACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCACAGGAAGTCAAAGTCC(서열 번호: 57)
E2-invitroTS-RP: CTAGACCTCGATCTCGCCCTGCATGCCG(서열 번호: 58)
Universal-Primer: GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA(서열 번호: 59)
E2-invitroTS-FP1 및 E2-invitroTS-RP는 실시예 B5에서 결정한 ORF-US2 뉴클레오티드 서열을 기초로 시그마 알드리치 재팬에서 합성하였다. 또한, Universal-Primer은 PURESYSTEM Classic II mini(포스트 게놈 연구소)에 부속된 것을 사용하였다.
(1-2) 2 단계 PCR에 의한 주형 DNA의 제조
ORF-US2 폴리펩티드의 합성에 이용한 주형 DNA는 메뉴얼에 따라서 2 단계 PCR로 제조하였다. 본 실시예에서의 PCR에는 DNA-폴리머라제에 이지-A(등록 상표)-하이-피델러티 PCR 클로닝 엔자임(스트라타진), PCR 장치는 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드ㆍ바이오시스템)을 이용하였다.
1단계째 PCR은 락토코커스 20-92주의 게놈 DNA를 주형으로 본 실시예(1-1)에 상기한 프라이머: E2-invitroTS-FP1과 E2-invitroTS-RP에서 ORF-US2 뉴클레오티드를 증폭시켰다. 얻어진 PCR 산물(ORF-US2 뉴클레오티드)을 주형으로 Universal- Primer와 E2-invitroTS-RP에서 2 단계째 PCR을 행하였다. PCR 산물 300 μl(50 μl×6개)은 PCR-Purification kit(퀴아젠)로 정제하고, 주형 DNA(ORF-US2 폴리펩티드 합성용 주형 DNA)로서 ORF-US2 폴리펩티드의 합성에 이용하였다. 1단계째 및 2 단계째의 PCR은 이하의 조건에서 행하였다.
1단계째: 증폭 프라이머 각 10 pmol, dNTP 각 2.5 pmol, 락토코커스 20-92주 유래 게놈 DNA 40 ng, Easy-A용 완충액(스트라타진), 이지-A(등록 상표)-하이-피델러티 PCR 클로닝 엔자임 2U(스트라타진)를 포함하는 50 μl의 반응액을 이용하고, 이하의 증폭 프로그램: 95 ℃ 2 분 (95 ℃ 45 초, 58 ℃ 20 초, 72 ℃ 1 분)×30 사이클, 72 ℃ 3 분으로 행하였다.
2 단계째: 증폭 프라이머 각 10 pmol, dNTP 각 2.5 pmol, 1단계째의 PCR 반응액 0.5 μl, Easy-A용 완충액, 이지-A(등록 상표)-하이-피델러티 PCR 클로닝 엔자임 2U를 포함하는 50 μl의 반응액을 이용하고, 이하의 증폭 프로그램: 95 ℃ 2 분 (95 ℃ 45 초, 45 ℃ 20 초, 72 ℃ 1 분)×5 사이클, (95 ℃ 45 초, 60 ℃ 20 초, 72 ℃ 1 분)×25 사이클 72 ℃ 3 분으로 행하였다.
(2) ORF-US2 폴리펩티드의 무세포계 단백질 합성 및 그의 테트라히드로다이드제인 합성 활성의 확인
-80 ℃ 보존해 둔 PURESYSTEM Classic II min,i의 A액 25 μl와 B액 10 μl를 얼음 상에서 융해 후, 혼합하고, 여기에 2 단계 PCR에서 제조한 ORF-US2 폴리펩티드 합성용 주형 DNA(개시 코돈의 5`측 상류에 T 7-프로모터 서열 및 리보솜 결합 서열을 가짐)를 0.6 μg(60 ng/μl를 10 μl) 첨가하고, 또한 멸균수를 첨가하여 계 50 μl로 하여 37 ℃, 90 분간 인큐베이션함으로써 목적하는 폴리펩티드를 합성하였다. 이 시스템을 이용한 단백질 합성의 포지티브 대조군에는 PURESYSTEM Classic II mini에 부속된 디히드로엽산 리덕타제(DHFR) 합성용 주형 DNA를 0.5 μg(0.2 μg/μl를 2 μl) 이용하였다. 음성 대조군에는 주형이 되는 DNA는 첨가하지 않고, 멸균수만을 사용하였다. 활성 측정은 상기 반응액 40 μl를 이하의 조성의 효소 반응용 버퍼에 첨가하고, 37 ℃, 6 시간 인큐베이션하여 반응 종료 후, 효소 반응액을 3 mL의 아세트산에틸로 추출, 건고하여 영동 버퍼로 용해시키고, HPLC 분석에 의해 효소 반응액 중의 테트라히드로다이드제인을 측정하였다.
효소 반응용 버퍼 조성
0.1 M 인산칼륨 완충액/1 mM PMSF/2 mM DTT/5 mM 히드로아황산나트륨(pH 7.0)
2 mM NADPH
2 mM NADH
10 μg/mL 디히드로다이드제인
또한, 상기 히드로엽산 리덕타제(DHFR) 합성용 주형 DNA를 이용한 경우에는, 상기 DNA를 기초로 하여 단백질이 양호하게 발현되었지만, 주형이 되는 DNA를 첨가하지 않는 경우에는, 단백질은 발현되지 않았다. 이로부터, 상기 실험은 적절하게 행해진 것으로 판단되었다.
결과를 도 17에 나타내었다. ORF-US2 폴리펩티드를 발현시킨 반응액에서는 반응 6 시간 후의 샘플에서 약 6.7 분의 위치에 테트라히드로다이드제인의 피크가 보였다. 그러나, 단백질 합성 없음(NC), 디히드로엽산 리덕타제 발현(DHFR) 반응액에서는 테트라히드로다이드제인의 피크는 확인되지 않았다. 또한, ORF-US2 폴리펩티드를 발현시킨 반응액에서는 테트라히드로다이드제인의 생합성에 따른 디히드로다이드제인(기질)의 감소가 보였지만 단백질 합성 없음(NC), 디히드로엽산 리덕타제 발현(DHFR) 반응액에서는 그 디히드로다이드제인의 감소는 확인되지 않았다. 이상의 점으로부터 ORF-US2 폴리펩티드가 디히드로다이드제인으로부터의 테트라히드로다이드제인 생합 활성을 갖는 것이 확인되었다. 즉, ORF-US2 폴리펩티드는 상기 E2 폴리펩티드에 상당한다고 말할 수 있다.
실시예 B8 대장균을 이용한 재조합 ORF-US2 폴리펩티드의 발현 및 그의 테트라히드로다이드제인 합성 활성의 확인
대장균을 이용한 재조합 단백질 발현 시스템인 pET 시스템을 이용하여 ORF-US2 폴리펩티드를 발현시키고, 그 테트라히드로다이드제인 합성 활성을 확인하였다.
(1) ORF-US2 폴리펩티드 발현 벡터의 제조
ORF-US2 폴리펩티드 발현 벡터(pET21-US2)를 제조할 목적으로 PCR에 의해 ORF-US2 폴리펩티드의 오픈ㆍ리딩ㆍ프레임 영역의 DNA를 증폭시켰다.
실시예 B5에서 결정한 ORF-US2 폴리펩티드 서열을 기초로 하기의 증폭 프라이머를 제조하였다.
exp.US2 pet F Nde: TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC(서열 번호: 60)
exp.US2 pet: AATCGAATTCCTAGACCTCGATCTCGCCCTGC(서열 번호: 61)
상기 증폭 프라이머: exp.US2 pet F Nde, exp.US2 pet에는 pET21a(노바젠)에 삽입하기 위해서, 각각 제한 효소 NdeI 절단 부위, EcoRI 절단 부위 서열을 포함한다.
상기 프라이머를 각 5 pmol, dNTP 각 5 nmol, 락토코커스 20-92주의 게놈 DNA 40 ng, KOD-plus DNA 폴리머라제용 10×완충액(도요보) 2.5 μl, KOD-Plus DNA 폴리머라제 0.3 유닛(도요보)을 포함하는 25 μl의 반응액을 이용하고, 증폭 프로그램: 95 ℃ 3 분,(94 ℃ 30 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 1 분)×30 사이클, 68 ℃ 7 분으로 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드ㆍ바이오시스템)을 이용하여 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응액의 일부를 아가로스 겔 전기 영동에 의해 해석한 결과, 예상되는 크기의 밴드를 검출할 수 있었다. PCR 산물 전량을 QIAGEN PCR Purification kit(퀴아젠)에서 회수하였다.
회수한 DNA 단편을 제한 효소 NdeI 및 EcoRI로 절단 후, 아가로스 겔 전기 영동을 행하여 목적으로 하는 밴드 부분을 잘라내고, Qiagen Gel Extraction kit(퀴아젠)에 의해 정제, 회수하였다. 얻어진 DNA 단편은 NdeI 및 EcoRI로 소화시킨 pET21a와 DNA Ligation Kit ver.2.1(다카라 바이오)을 이용하여 16 ℃, 밤새 라이게이션한 후, 라이게이션 반응액을 이용하여 대장균 JM109주(다카라 바이오)를 형질 전환하였다.
형질 전환체는 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지 아가(GIBCO) 플레이트 상에서 37 ℃, 밤새 생육시켜 콜로니를 얻었다. 얻어진 싱글 콜로니는 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지(GIBCO) 3 mL에서 밤새 배양한 후, 플라스미드 자동 추출기 PI-100(KURABO)을 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다.
플라스미드에 삽입한 DNA의 염기 서열을 다이 터미네이터법에 의해 시퀀스를 행하여, 목적대로 정확하게 ORF-US2 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있음을 확인하였다. 본 실시예에서의 DNA 시퀀스는 DNA 시퀀서 ABI3700(어플라이드ㆍ바이오시스템)을 이용하여 행하였다.
(2) 대장균 내에서의 재조합 ORF-US2 폴리펩티드의 발현 및 확인
재조합 ORF-US2 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드 pET21-US2와 pET21a(음성 대조군)를 이용하여 대장균 BL21(DE3)주(노바젠)를 형질 전환하였다. 형질 전환체는 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지 아가 플레이트 상에서 37 ℃ 밤새 생육시켜 싱글 콜로니를 얻었다.
상기 대장균 BL21(DE3) 형질 전환체 각각을 암피실린 50 μg/ml를 포함하는 3 mL의 액체 LB 배지로 밤새 37 ℃에서 배양을 행하였다. 그 배양액 0.5 mL를 동일한 농도의 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지 50 mL 첨가하고, 3 시간(OD 630 nm가 약 0.4가 될 때까지) 전배양하고, 종료 농도가 1 mM이 되도록 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드)(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)를 첨가하고, 또한 37 ℃에서 4 시간 배양을 행하였다.
배양 종료 후, 균체를 Avanti HP25(벡크만 코울터)에서 원심 분리(6000 rpm 4 ℃ 15 분)에 의해 집균하였다. 이후의 조작은 얼음 상에서 행하였다. 원심 상청(배지)을 제거한 후, 1 mM PMSF, 2 mM DTT, 5 mM 히드로아황산나트륨을 포함하는 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7.0(KPB-PDH)1 mL에 현탁시키고, 미리 0.7 mL 용량의 지르코니아-실리카 비드(바이오스펙 프로덕츠, 인크.) 및 KPB-PDH 400 μl를 넣어 둔 2 mL 용량 어시스트 튜브에 넣고, 패스트프렙(R)(써모 일렉트론 코포레이션)을 이용하여 6500 rpm, 20 초간 처리-3 분간 빙냉을 2회 반복함으로써, 균체를 파쇄하여 균체 파쇄액을 얻었다.
대장균 내에서의 재조합 ORF-US2 폴리펩티드의 발현 확인은 SDS-폴리아크릴아미드-겔 전기 영동(SDS-PAGE)으로 행하였다.
상기 균체 파쇄액 20 μl에 5×샘플 완충액(125 mM 트리스-HCl(pH 6.5)/25 ％ 글리세롤/5 ％ SDS/5 ％ 2-머캅토에탄올/BPB 0.5 ％)을 5 μl 첨가하여 98 ℃ 5 분간 가열 변성 후, 빙냉시키고, 그 중 10 μl를 SDS-PAGE에서 영동하였다. SDS-PAGE에는 시판되는 겔판(SuperSepTM5-20 ％(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤))을 사용하고, 염색은 퀵 CBB(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)로 행하였다. 분자량 마커에는 프리스테인드 XL-래더 브로드 레인지(가부시끼가이샤 아프로사이언스)를 사용하였다.
SDS-PAGE 결과를 도 18에 나타내었다. pET21-US2형질 전환체 유래의 균체 파쇄액으로 분자량 약 29 kDa의 재조합 폴리펩티드가 확인되었다.
(3) 재조합 ORF-US2 폴리펩티드의 디히드로다이드제인 합성 활성의 확인
본 실시예 내 (2)에서 얻은 균체 파쇄액을 효소원으로 하여 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인으로의 변환 활성을 측정하고, 발현시킨 재조합 ORF-US2 폴리펩티드로 그의 활성을 확인하였다.
본 실시예에서의 디히드로다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인으로의 변환 활성의 측정은 이하의 방법으로 행하였다.
하기 조성의 효소 반응액을 제조하고, 0 ℃에서 2 시간 인큐베이션하였다.
효소 반응액 조성
Figure 112010048098509-pct00011
인큐베이션 후, 얻어진 효소 반응액에 3 mL의 아세트산에틸을 첨가하여 추출 처리를 행하고, 건고시킨 후, 이동층(용리액)으로 용해시켰다. 용해물을 HPLC 분석함으로써 효소 반응액 중의 디히드로다이드제인 및 시스-, 트랜스-테트라히드로다이드제인의 함량을 측정하였다.
HPLC 분석 결과를 도 19에 나타내었다. 재조합 ORF-US2 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드 pET21-US2의 형질 전환체 유래의 균 파쇄액에서는, 효소 반응액에 첨가한 디히드로다이드제인(기질)이 시스-테트라히드로다이드제인(c-THD) 및 트랜스-테트라히드로다이드제인(t-THD)으로 변환되는 것이 관찰되었다. 음성 대조군인 pET21a 형질 전환체에서는 효소 반응액 중에 테트라히드로다이드제인은 검출되지 않았다.
이상의 점에서 재조합 ORF-US2 폴리펩티드가 디히드로다이드제인으로부터의 테트라히드로다이드제인 합성 활성을 갖는 것이 확인되었다. 즉, 재조합 ORF-US2 폴리펩티드는 상기 E2 폴리펩티드에 상당한다고 할 수 있다.
실시예 C
실시예 C1 균체의 테트라히드로다이드제인으로부터의 에쿠올 생합성 활성의 확인
락토코커스 20-92주(FERM BP-10036호)를, 테트라히드로다이드제인 함유 증식용 액체 배지(시스- 또는 트랜스-테트라히드로다이드제인(자사에서 유기 합성: 참고예 B1 참조)을 10 μg/mL가 되는 양으로 첨가한 변법 GAM 브로쓰 배지(닛스이 세이야꾸 가부시끼가이샤))에 접종하고, 혐기적 조건하(BBL Gas Pack systems를 사용) 37 ℃에서 18 시간 배양하였다. 배양 종료 후, 즉시 배양액 1 ml를 덮개가 부착된 유리제 원침관에 분취하고, 3 mL의 아세트산에틸을 첨가하여 추출 처리를 행한 후, 건고시켜 HPLC 분석을 하였다. HPLC 분석의 표준 용액에는 다이드제인(프나코시 가부시끼가이샤), 에쿠올(프나코시 가부시끼가이샤), 디히드로다이드제인(트렌드 리서치 케미컬사), 시스-테트라히드로다이드제인, 트랜스-테트라히드로다이드제인(모두 자사에서 화학 합성)의 혼합 용액(각 2 μg/mL)을 이용하였다.
결과를 도 20에 나타내었다. 도 20으로부터 분명한 바와 같이 락토코커스 20-92주는 시스- 및 트랜스-테트라히드로다이드제인 둘다로부터 에쿠올을 생합성하는 활성을 갖는 것이 확인되었다(도 20 중, 하). 또한, 도면 중에서는 다이드제인은 DZN, 디히드로다이드제인은 DD, 시스-테트라히드로다이드제인은 c-THD, 트랜스-테트라히드로다이드제인은 t-THD, 에쿠올은 EQL의 약어로 나타내었다.
실시예 C2 대장균을 이용한 재조합 단백질 발현 시스템을 이용한 에쿠올 합성 효소의 탐색 및 그의 동정
대장균을 이용한 재조합 단백질 발현 시스템인 pET 시스템(노바젠)을 이용하여, 실시예 B5에서 결정한 디히드로다이드제인 합성(E1) 효소 유전자 주변 게놈 DNA 서열 상에 동정한 3개의 ORF 폴리뉴클레오티드(ORF-US3, US1, DS1)에 대응하는 폴리펩티드를 대장균 내에서 각각 발현시키고, 그 테트라히드로다이드제인으로부터의 에쿠올로의 변환을 촉매하는 활성을 조사함으로써 에쿠올 합성(E3) 효소의 탐색을 행하였다.
(1) ORF 폴리펩티드 발현 벡터의 제조
각 ORF 폴리펩티드(ORF-US3, US1, DS1)의 발현 벡터를 제조할 목적으로 PCR에 의해 각각의 오픈ㆍ리딩ㆍ프레임 영역의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키고, pET21a 벡터(노바젠)에 삽입하였다.
(1-1) 증폭 프라이머
실시예 B5에서 결정한 디히드로다이드제인 합성 효소(E1) 주변 게놈 서열을 기초로 하기의 증폭 프라이머를 제조하였다.
ORF-US3 폴리펩티드
exp.US3 F: TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG(서열 번호: 62)
exp.US3 R: CCGCAAGCTTCTACATAGTGGAGATCGCGTGG(서열 번호: 63)
ORF-US1 폴리펩티드
exp.US1 F: TATACATATGTTCAAGGGTCCACAGGGC(서열 번호: 64)
exp.US1 R: GCTCGAATTCTTAGTGCTGCTGTGCCTTTTCAG(서열 번호: 65)
ORF-DS1 폴리펩티드
exp.DS1 F: ATATACATATGCAGGATATGGACTTCATGG(서열 번호: 66)
exp.DS1 R: GCTCGAATTCTCATAGTGACATCAGCGCTCCC(서열 번호: 67)
상기 증폭 프라이머: exp.US3 F, exp.US1 F, exp.DS1 F에는 pET21a(노바젠)에 삽입하기 위해서 제한 효소 NdeI 절단 부위 서열을, exp.US3 R에는 HindIII 절단 부위 서열을, exp.US1 R, exp.DS1 R에는 EcoRI 절단 부위 서열을 포함한다.
(1-2) 각 ORF 폴리뉴클레오티드의 증폭
상기한 증폭 프라이머를 각 5 pmol, dNTP 각 5 nmol, 실시예 A5에서 정제한 락토코커스 20-92주의 게놈 DNA 40 ng , KOD-plus DNA 폴리머라제용 10×완충액(도요 보세끼 가부시끼가이샤) 2.5 μl, KOD-Plus DNA 폴리머라제 0.3 유닛(도요 보세끼 가부시끼가이샤)을 포함하는 25 μl의 반응액을 이용하고, 증폭 프로그램: 95 ℃ 3 분,(94 ℃ 30 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 2 분)×30 사이클, 68 ℃ 7 분으로 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드ㆍ바이오시스템)을 이용하여 PCR을 행하였다. PCR 반응액의 일부를 아가로스 겔 전기 영동한 결과, 각각에 예상되는 크기의 밴드를 검출할 수 있었다. PCR 산물 전량을 QIAGEN PCR Purification kit(퀴아젠)에서 회수하였다.
(1-3) ORF 폴리펩티드 발현 벡터의 제조
(1-2)에서 회수한 ORF-US3 폴리뉴클레오티드 단편을 제한 효소 NdeI 및 HindIII로, ORF-US1 및 ORF-DS1 폴리뉴클레오티드 단편을 NdeI 및 EcoRI로 절단 후, 아가로스 겔 전기 영동을 행하여 목적으로 하는 밴드 부분을 잘라내고, Qiagen Gel Extraction kit(퀴아젠)에 의해 정제, 회수하였다. 얻어진 폴리뉴클레오티드 단편은 DNA Ligation Kit ver.2.1(다카라 바이오 가부시끼가이샤)을 이용하여 NdeI 및 HindIII 또는 EcoRI로 소화시킨 pET21a와 16 ℃, 밤새 라이게이션한 후, 라이게이션 반응액을 이용하여 대장균 JM109주(다카라 바이오 가부시끼가이샤)를 통상법으로 형질 전환하였다. 이렇게 하여 얻은 형질 전환체를 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지 아가(GIBCO) 플레이트 상에서 37 ℃, 밤새 생육시켜 콜로니를 형성시켰다. 얻어진 싱글 콜로니를 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지(GIBCO) 3 mL에서 밤새 배양한 후, 플라스미드 자동 추출기 PI-100(KURABO)을 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다.
플라스미드에 삽입한 DNA의 염기 서열을 다이 터미네이터법에 의해 시퀀스를 행하여, 목적대로 정확하게 각 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있음을 확인하고, pET-US3, pET-US1, pET-DS1을 얻었다. 본 실시예에서의 DNA 시퀀스는 DNA 시퀀서 ABI3700(어플라이드ㆍ바이오시스템)을 이용하여 행하였다.
(2) 대장균 내에서 각 재조합 폴리펩티드의 발현
(2-1) 대장균 BL21 형질 전환체의 제조
재조합 ORF 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드 pET-US3, pET-US1, pET-DS1과 pET21a(음성 대조군)를 이용하여 대장균 BL21(DE3)주(노바젠)을 통상법으로 형질 전환하였다. 형질 전환체는 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지 아가 플레이트 상에서 37 ℃, 밤새 생육시켜 싱글 콜로니를 얻었다.
(2-2) 재조합 폴리펩티드의 발현 유도
상기 대장균 BL21(DE3) 형질 전환체 각각을 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 3 mL의 액체 LB 배지로 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 그 배양액 0.5 ml를 동일한 농도의 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지 50 mL에 첨가하고, 3 시간(OD 630 nm이 약 0.4 내지 0.7이 될 때까지) 전배양하여 종료 농도가 1 mM이 되도록 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드)(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)를 첨가하고, 또한 37 ℃에서 4 시간 배양하여 대장균 내에서의 재조합 폴리펩티드의 발현 유도를 행하였다.
(2-3) 균체 파쇄액의 제조
상기 (2-2)에서의 발현 유도 종료 후, 균체를 Avanti HP25(벡크만 코울터(beckman coulter))로 원심 분리(6000 rpm 4 ℃ 15 분)에 의해 집균하였다. 이후의 조작은 얼음 상에서 행하였다. 원심 상청(배지)을 제거한 후, 1 mM PMSF, 2 mM DTT, 5 mM 히드로아황산나트륨을 포함하는 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7.0(이후 KPB-PDH라고 함) 1 mL에 현탁시키고, 미리 0.7 mL 용량의 지르코니아-실리카 비드(바이오스펙 프로덕츠, 인크.) 및 KPB-PDH 400 μl를 넣어 둔 2 mL 용량 어시스트 튜브에 넣고, 패스트프렙(R)(써모 일렉트론 코포레이션)을 이용하여 6500 rpm, 20 초간 처리-3 분간 빙냉을 2회 반복함으로써, 균체를 파쇄하여 균체 파쇄액을 얻었다.
(2-4) SDS-폴리아크릴아미드-겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의한 재조합 폴리펩티드의 발현 확인
대장균 내에서의 각 재조합 ORF 폴리펩티드의 발현 확인은 SDS-PAGE에서 행하였다. (2-3)에 기재한 균체 파쇄액 20 μl에 5×샘플 완충액(125 mM 트리스-HCl(pH 6.5)/25 ％ 글리세롤/5 ％ SDS/5 ％ 2-머캅토에탄올/BPB 0.5 ％)을 5 μl 첨가하여 98 ℃ 5 분간 가열 변성 후, 빙냉시키고, 그 중 4 μl를 SDS-PAGE에서 영동하였다. SDS-PAGE에는 시판되는 겔판(SuperSepTM5-20 ％(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤))를 사용하고, 염색은 퀵 CBB(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)로 행하였다. 분자량 마커에는 프리스테인드 XL-래더 브로드 레인지(가부시끼가이샤 아프로사이언스)를 사용하였다. SDS-PAGE 결과를 도 21에 나타내었다. PET-US3, pET-DS1 형질 전환체 유래의 균체 파쇄액 각각에 있어서 분자량 약 52 kDa, 50 kDa의 재조합 ORF-US3 및 ORF-DS1 폴리펩티드의 발현이 확인되었다. PET-US1 형질 전환체 유래의 균체 파쇄액에서는 재조합 ORF-US1 폴리펩티드의 발현은 확인할 수 없었다.
실시예 C3 재조합 ORF 폴리펩티드의 에쿠올 합성 활성의 측정
실시예 C2에서 얻은 각 형질 전환체균 파쇄액을 효소원으로 하여 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올로의 변환 활성을 측정하였다. 본 실시예에서의 테트라히드로다이드제인으로부터 에쿠올로의 변환 활성의 측정은 이하의 방법으로 행하였다.
하기 조성의 효소 반응액을 제조하고, 37 ℃에서 1 시간 인큐베이션하였다.
효소 반응액 조성
Figure 112010048098509-pct00012
인큐베이션 후, 얻어진 효소 반응액에 3 mL의 아세트산에틸을 첨가하여 추출 처리를 행하고, 건고시킨 후, 이동층(용리액)으로 용해시켰다. 용해물을 HPLC 분석함으로써 효소 반응액 중의 디히드로다이드제인, 시스-테트라히드로다이드제인, 트랜스-테트라히드로다이드제인, 에쿠올의 함량을 측정하였다. HPLC 분석에서의 표준 용액에는 다이드제인(프나코시 가부시끼가이샤), 에쿠올(프나코시 가부시끼가이샤), 디히드로다이드제인(트렌드 리서치 케미컬사), 시스-테트라히드로다이드제인, 트랜스-테트라히드로다이드제인(모두 자사에서 화학 합성)의 혼합 용액(각 2 μg/mL)을 이용하였다.
HPLC 분석 결과, 재조합 ORF-US3 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드 pET-US3의 형질 전환체 유래의 균 파쇄액에서는, 효소 반응액에 첨가한 테트라히드로다이드제인은 에쿠올로 변환되는 것이 관찰되었다(도 22). 또한, 에쿠올 생합성 경로에 있어서 테트라히드로다이드제인의 전구 물질인 디히드로다이드제인으로의 변환 활성도 겸비하는 것이 확인되었다(도 22). pET-US1, pET-DS1 형질 전환체 및 음성 대조군인 pET21a 형질 전환체에서는 효소 반응액 중에 테트라히드로다이드제인 이외에는 검출되지 않았다. 또한, 도면 중에서는 다이드제인은 DZN, 디히드로다이드제인은 DD, 시스-테트라히드로다이드제인은 c-THD, 트랜스-테트라히드로다이드제인은 t-THD, 에쿠올은 EQL의 약어로 나타내었다.
이상의 점으로부터 ORF-US3 폴리펩티드가 테트라히드로다이드제인으로부터의 에쿠올 생합 활성을 갖는 것이 확인되었다. 즉, ORF-US3 폴리펩티드는 상기 E3 폴리펩티드에 상당한다고 할 수 있다.
실시예 D
실시예 D1 대장균을 이용한 재조합 His-태그 부착 에쿠올 생산 관련 효소의 발현 및 정제
대장균을 이용한 재조합 단백질 발현 시스템인 pET 시스템(노바젠)을 이용하여, His-태그 부착 에쿠올 생산 관련 효소[디히드로다이드제인 합성 효소(E1), 테트라히드로다이드제인 합성 효소(E2), 에쿠올 합성 효소(E3)]를 발현시키고, His-태그 부착 단백질 정제용(Ni) 칼럼을 이용하여 어피니티 정제를 행하였다.
(1) His-태그 부착 효소 발현 벡터의 제조
각 효소(E1, E2, E3)의 발현 벡터를 제조할 목적으로 PCR에 의해 각각의 오픈ㆍ리딩ㆍ프레임 영역의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키고, pET21a 벡터(노바젠)에 삽입하였다.
(1-1) 증폭 프라이머
실시예 B5에서 결정한 디히드로다이드제인 합성 효소(E1) 주변 게놈 서열을 기초로 하기의 증폭 프라이머를 제조하였다.
His-태그 부착 E1 효소
exp.E1 pet F Nde: AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA(서열 번호: 41)
exp.E1 pet His: AATCGAATTCGTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT(서열 번호: 42)
His-태그 부착 E2 효소
exp.US2 pet F Nde: TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC(서열 번호: 60)
exp.E2 pet His: AATCGAATTCGAGACCTCGATCTCGCCCTGC(서열 번호: 68)
His-태그 부착 E3 효소
exp.US3 F: TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG(서열 번호: 62)
exp.E3 R His: CCGCAAGCTTGTACATAGTGGAGATCGCGTGG(서열 번호: 69)
상기 증폭 프라이머: exp.E1 pet F Nde, exp.US2 pet F, exp.US3 F에는 pET21a(노바젠)에 삽입하기 위해서 제한 효소 NdeI 절단 부위 서열을, exp.E1 pet His, exp.E2 pet His에는 EcoRI 절단 부위 서열을, exp.E3 R His에는 HindIII 절단 부위 서열을 포함한다.
(1-2) 각 His-태그 부착 효소 폴리뉴클레오티드의 증폭
상기한 증폭 프라이머를 각 5 pmol과 dNTP를 각 5 nmol과 실시예 A5에서 정제한 락토코커스 20-92주(FERM BP-10036호)의 게놈 DNA 40 ng , KOD-plus DNA 폴리머라제용 10×완충액(도요 보세끼 가부시끼가이샤) 2.5 μl, KOD-Plus DNA 폴리머라제 0.3 유닛(도요 보세끼 가부시끼가이샤)을 포함하는 25 μl의 반응액을 이용하고, 증폭 프로그램: 95 ℃ 3 분, (94 ℃ 30 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 2 분)×30 사이클, 68 ℃ 7 분으로 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드ㆍ바이오시스템)을 이용하여 PCR을 행하였다. PCR 반응액의 일부를 아가로스 겔 전기 영동한 결과, 각각에 예상되는 크기의 밴드를 검출할 수 있었다. PCR 산물 전량을 QIAGEN PCR Purification kit(퀴아젠)에서 회수하였다.
(1-3) His-태그 부착 효소 폴리펩티드 발현 벡터의 제조
(1-2)에서 회수한 각 His-태그 부착 효소 폴리뉴클레오티드 단편을 제한 효소 NdeI 및 EcoRI로 절단 후, 아가로스 겔 전기 영동을 행하여 목적으로 하는 밴드 부분을 잘라내고, Qiagen Gel Extraction kit(퀴아젠)에 의해 정제, 회수하였다. 얻어진 폴리뉴클레오티드 단편은 DNA Ligation Kit ver.2.1(다카라 바이오 가부시끼가이샤)을 이용하여 NdeI 및 EcoRI로 소화시킨 pET21a와 16 ℃에서 밤새 라이게이션한 후, 라이게이션 반응액을 이용하여 대장균 JM109주(다카라 바이오 가부시끼가이샤)를 통상법으로 형질 전환하였다. 이렇게 하여 얻은 형질 전환체를, 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지 아가(GIBCO) 플레이트 상에서 37 ℃, 밤새 생육시켜 콜로니를 형성시켰다. 얻어진 싱글 콜로니를, 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지(GIBCO) 3 mL에서 밤새 배양한 후, 플라스미드 자동 추출기 PI-100(KURABO)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다.
플라스미드에 삽입한 DNA의 염기 서열을 다이 터미네이터법에 의해 시퀀스를 행하여, 목적대로 정확하게 각 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있음을 확인하고, pET-E1-His, pET-E2-His, pET-E3-His를 얻었다. 본 실시예에서의 DNA 시퀀스는 DNA 시퀀서 ABI3700(어플라이드ㆍ바이오시스템)을 이용하여 행하였다.
(2) 대장균 내에서의 각 재조합 His-태그 부착 효소 폴리펩티드의 발현 및 어피니티 정제
(2-1) 대장균 BL21 형질 전환체의 제조
His-태그 부착 효소 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드 pET-E1-His, pET-E2-His, pET-E3-His를 이용하여 대장균 BL21(DE3)주(노바젠)를 통상법으로 형질 전환하였다. 형질 전환체는 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 LB 배지 아가 플레이트 상에서 37 ℃, 밤새 생육시켜 싱글 콜로니를 얻었다.
(2-2) 재조합 His-태그 부착 E1 및 E2 효소 폴리펩티드의 정제
(2-2-1) 대장균 배양 및 재조합 His-태그 부착 E1 및 E2 효소 폴리펩티드의 발현 유도
상기 pET-E1-His 또는 pET-E2-His에 의한 대장균 BL21(DE3) 형질 전환체 각각을 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 10 mL의 액체 LB 배지로 밤새 37 ℃에서 배양하였다. 그 배양액 7.5 mL를 동일한 농도의 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지 150 mL 첨가하고, 37 ℃에서 2 시간(OD 600 nm이 약 0.5가 될 때까지) 전배양하고, 종료 농도가 0.5 mM이 되도록 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드)(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)를 첨가하고, 또한 약한 진탕 조건하에서 30 ℃, 4 시간 배양하여 대장균 내에서의 재조합 His-태그 부착 E1 및 E2 효소 폴리펩티드의 발현 유도를 행하였다.
(2-2-2) 균 라이제이트(lysate)의 제조
상기 (2-2)에서의 발현 유도 종료 후, 균체를 Avanti HP25(벡크만 코울터)로 원심 분리(6000 rpm 4 ℃ 10 분)에 의해 집균하고, 재조합 His-태그 부착 E1 및 E2 효소 폴리펩티드 발현 대장균을 각각 습중량으로서 0.66 g 및 0.73 g을 얻었다. 얻은 균체는 Bugbuster protein Extraction solution(노바젠)이 균체 습중량 1 g당 15 mL가 되도록 첨가하고, 피펫으로 온화하게 현탁시키고, 또한 리소자임(SIGMA)을 2000 units/mL, 벤조나제(Benzonase)(노바젠)를 25 units(1 μl)/mL가 되도록 첨가하였다. 그 후, 로테이터(RT-50: 다이테크)를 이용하여 30 분간 실온에서 천천히 교반하고, 균 라이제이트 A를 얻었다. 또한, 균 라이제이트 A를 Avanti HP25(벡크만 코울터)로 원심 분리(8000 rpm 4 ℃ 15 분)에 의해, 그의 상청인 균 라이제이트 B를 얻었다.
(2-2-3) 재조합 His 태그 부착 E1 및 E2 효소 폴리펩티드의 어피니티 정제
His-태그 부착 단백질 정제용 칼럼에는 His GraviTrap(GE 헬쓰 케어 바이오사이언스)를 이용하여 취급 설명서에 기재되어 있는 절차에 따라서, 일부 변경한 방법으로 His-태그 부착 E1 및 E2 효소 폴리펩티드의 어피니티 정제를 행하였다. 즉, His GraviTrap를 빙냉시킨 10 mL의 결합 버퍼로 평형화한 후, (2-2-2)에서 제조한 균 라이제이트 B를 전량 부어 넣고, 자연 낙하시켜 목적하는 His-태그 부착 E1 또는 E2 효소를 His GraviTrap에 흡착시켰다. 그 후, His GraviTrap를 빙냉시킨 10 mL의 세정 버퍼로 2회 세정한 후, 빙냉해 둔 3 mL의 용출 버퍼로 목적하는 His-태그 부착 E1 및 E2 효소를 His GraviTrap로부터 용출시켰다. 용출액에 DTT[디티오트레이톨](와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)을 종료 농도가 3 mM이 되도록 첨가한 후, 300 μl씩 마이크로튜브에 소분(小分)하였다. 이들의 일부를 이용하여 각각의 용출액의 E1 효소 활성 및 E2 효소 활성을 확인하고, 용출액은 효소 실험에 사용할 때까지 4 ℃에서 보존하였다.
본 정제에서 사용한 결합 버퍼, 세정 버퍼, 용출 버퍼의 조성은 이하와 같았다.
결합 버퍼: 20 mM 트리스-HCl, 20 mM 이미다졸(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤), 0.5 M NaCl(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤), 1 mM DTT[디티오트레이톨](와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤), 1 mM PMSF[페닐메틸술포닐플루오라이드](와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)
세정 버퍼: 20 mM 트리스-HCl, 60 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 1 mM DTT[디티오트레이톨], 1 mM PMSF[페닐메틸술포닐플루오라이드]
용출 버퍼: 20 mM 트리스-HCl 500 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 1 mM DTT[디티오트레이톨], 1 mM PMSF[페닐메틸술포닐플루오라이드]
(2-3) 재조합 His-태그 부착 E3 효소 폴리펩티드의 정제
(2-3-1) 대장균 배양 및 재조합 His-태그 부착 E3 효소 폴리펩티드의 발현 유도
상기 (2-1)에 기재된 pET-E3-His에 의한 대장균 BL21(DE3) 형질 전환체를 암피실린(50 μg/mL)을 포함하는 50 mL의 액체 LB 배지로 밤새 37 ℃에서 배양을 행하였다. 그 배양액 20 mL를 동일한 농도의 암피실린을 포함하는 액체 LB 배지 1 L에 첨가하고, 37 ℃에서 3 시간(OD 660 nm이 약 0.4가 될 때까지) 전배양하였다. 종료 농도가 0.5 mM이 되도록 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드)(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)를 첨가하고, 37 ℃에서 4 시간 진탕 배양하여 대장균 내에서의 재조합 His-태그 부착 E3 효소 폴리펩티드의 발현 유도를 행하였다. 발현 유도를 행한 대장균을 Avanti HP25(벡크만 코울터)로 원심 분리(6000 rpm 4 ℃ 10 분)하여 집균하였다. 균체를 1 mM PMSF(페닐메틸술포닐플루오라이드) 2 mM DTT(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤) 5 mM 히드로아황산나트륨(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤)를 함유하는 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7.0(이후 버퍼 A라 함)을 25 ml 첨가하여 현탁시키고, 원심 분리(6000 rpm 4 ℃ 10 분) 후 그대로의 상태에서 -80 ℃로 보존하였다.
(2-3-2) 균 라이제이트의 제조
상기 (2-3-1)에서 보존한 균체를 융해 후, 원심(10,000 x g 15 분)시키고, 새로운 버퍼 A를 25 ml 첨가하여 현탁시켰다. 그 현탁액을 패스트프렙(R)(써모 일렉트론 코포레이션)을 이용하여 6500 rpm, 20 초간 처리-3 분간 빙냉을 3회 반복함으로써 균체를 파쇄하였다. 얻어진 균체 파쇄액을 원심(10000×g, 15 분)하고, 그의 상청을 분리하여 균 라이제이트를 얻었다.
(2-3-3) 재조합 His 태그 부착 E3 효소 폴리펩티드의 어피니티 정제
상기 (2-3-3)에서 얻은 균 라이제이트 4 ml를 이하에 나타내는 정제 조건에 의해 His-태그 융합 단백질 정제용 칼럼인 HisTrap HP(GE 헬쓰 케어 바이오사이언스)에 적용시켜 재조합 His 태그 부착 E3 효소의 정제를 행하였다. 단백질의 측정은 280 nm의 흡수에 의하였다. 또한, 프랙션 콜렉터에 의한 분획은 여과없이 그대로 통과한 분획의 280 nm에서의 흡수가 베이스 라인으로 저하된 후에 개시하였다.
유속: 1 ml/분
프랙션: 2 ml/2 분/프랙션
용리액 A: 0.1 M 인산칼륨 완충액 pH 7/0.5 M NaCl/1 ％ isoPrOH
용리액 B: 0.5 M 이미다졸을 포함하는 용리액 A
용출 프로그램: 시간(분) (용리액 B)/(용리액 A+용리액 B)
0 0.05
5 0.05
25 0.5
30 1
35 1
37 0.05
이 결과, E3 합성 활성은 프랙션 No.7 내지 9에서 확인되었다. 복수의 정제에 의해서 얻어진 활성 프랙션을 모은 후, 또한 8 ％가 되도록 글리세린을 첨가하여 -28 ℃로 보존하고, 사용시 융해시켜 실험에 적용하였다.
실시예 D2 재조합 His-태그 부착 E1 및 E2 효소를 이용한 다이드제인으로부터의 테트라히드로다이드제인 합성
상기 실시예 D1의 (2-2-3)에서 얻은 재조합 His-태그 부착 E1 효소 및 E2 효소를 효소원으로 하여 하기 조성의 효소 반응액을 제조하고, 37 ℃에서 2 시간 반응시킴으로써 다이드제인으로부터 테트라히드로다이드제인의 합성을 행하였다. 또한, 동시에 효소원으로서 재조합 His-태그 부착 E1, E2 효소 각각을 단독으로 이용한 반응도 행하였다.
효소 반응액 조성
Figure 112010048098509-pct00013
인큐베이션 후, 얻어진 효소 반응액에 3 mL의 아세트산에틸(와코 준야꾸)를 첨가하여 추출 처리를 행하고, 건고시킨 후, 이동층(용리액)으로 용해시켰다. 용해물을 HPLC 분석함으로써 효소 반응액 중의 시스- 및 트랜스-테트라히드로다이드제인을 측정하였다. HPLC 분석의 표준 용액은 다이드제인(프나코시), 에쿠올(프나코시), 디히드로다이드제인(트렌드 리서치 케미컬사), 시스-테트라히드로다이드제인(참고예 B1), 트랜스-테트라히드로다이드제인(참고예 B1)의 혼합 용액(각 2 μg/mL)을 이용하였다.
HPLC 분석 결과를 도 23에 나타내었다. 효소원에 재조합 His-태그 부착 E1 효소 및 E2 효소의 혼합을 사용한 경우, 그 생성물에 시스- 및 트랜스-테트라히드로다이드제인을 확인하였다. 그러나, 효소원에 재조합 His-태그 부착 E1 효소 또는 재조합 His-태그 부착 E2 효소 단독으로 사용한 경우에는, 그 생성물에 시스- 및 트랜스테트라히드로다이드제인은 확인할 수 없었다.
실시예 D3 재조합 His-태그 부착 E2 및 E3 효소를 이용한 디히드로다이드제인으로부터의 에쿠올 합성
상기 실시예 D1의 (2-2-3) 및 (2-3-3)에서 얻은 재조합 His-태그 부착 E2 및 E3 효소를 효소원으로 하여 하기 조성의 효소 반응액을 제조하고, 37 ℃에서 2 시간 반응시킴으로써 디히드로다이드제인으로부터 에쿠올의 합성을 행하였다. 또한, 동시에 효소원으로서 재조합 His-태그 부착 E2 효소 및 E3 효소 각각을 단독으로 이용한 반응도 행하였다.
효소 반응액 조성
Figure 112010048098509-pct00014
인큐베이션 후, 얻어진 효소 반응액에 3 mL의 아세트산에틸(와코 준야꾸)를 첨가하여 추출 처리를 행하고, 건고시킨 후, 이동층(용리액)으로 용해시켰다. 용해물을 HPLC 분석함으로써 효소 반응액 중의 에쿠올을 측정하였다.
HPLC 분석 결과를 도 24에 나타내었다. 효소원에 재조합 His-태그 부착 E2, E3 효소 혼합을 사용한 경우, 그 생성물에 에쿠올을 확인하였다. 그러나, 효소원에 재조합 His-태그 부착 E2 효소 또는 재조합 His-태그 부착 E3 효소를 단독으로 사용한 경우에는, 그 생성물에 에쿠올은 확인할 수 없었다.
실시예 D4 재조합 His-태그 부착 E1 효소, E2 효소 및 E3 효소를 이용한 다이드제인으로부터의 에쿠올 합성
상기 실시예 D1의 (2-2-3) 및 (2-3-3)에서 얻은 재조합 His-태그 부착 E1 효소, E2 효소 및 E3 효소를 효소원으로 하여 하기 조성의 효소 반응액을 제조하고, 37 ℃에서 2 시간 반응시킴으로써 다이드제인으로부터 에쿠올의 합성을 행하였다. 또한, 동시에 효소원으로서 재조합 His-태그 부착 E1 효소, E2 효소, 및 E3 효소를 각각 단독으로 이용한 반응도 행하였다.
효소 반응액 조성
Figure 112010048098509-pct00015
인큐베이션 후, 얻어진 효소 반응액에 3 mL의 아세트산에틸(와코 준야꾸)를 첨가하여 추출 처리를 행하고, 건고시킨 후, 이동층(용리액)으로 용해시켰다. 용해물을 HPLC 분석함으로써 효소 반응액 중의 에쿠올을 측정하였다.
HPLC 분석 결과를 도 25에 나타내었다. 효소원에 각각의 재조합 His-태그 부착 효소 단독으로 사용한 경우, 그 생성물에 에쿠올은 확인할 수 없었다. 그러나, 효소원에 재조합 His-태그 부착 E1 효소, E2 효소 및 E3 효소 혼합을 사용한 경우에는, 그 생성물에 에쿠올이 확인되었다.
실시예 E His-태그 부착 재조합 E1 효소의 디히드로다이드제인 합성 활성에 대한 금속 이온의 영향
Ni-세파로스에서 정제한 대장균 발현 His-태그 부착 재조합 E1 효소(E1-His)를 효소원으로 하여, 다이드제인으로부터 디히드로다이드제인으로의 변환 활성에 대한 금속 이온의 영향을 검토하였다. 각종 금속(MnCl2ㆍ2H2O, FeSO4ㆍ7H2O, CaCl2ㆍ2H2O, Zn(CH3COO)2ㆍ2H2O, CoSO4ㆍ7H2O, MgSO4ㆍ7H2O, NiSO4ㆍ6H2O)을 증류수로 100 mM이 되도록 용해시켜 실험에 적용하였다. 활성의 측정은 하기 조성의 효소 반응액을 제조하고, 37 ℃에서 1 시간 인큐베이션하여 행하였다.
효소 반응액 조성
Figure 112010048098509-pct00016
인큐베이션 후, 얻어진 효소 반응액에 3 mL의 아세트산에틸을 첨가하여 추출 처리를 행하고, 건고시킨 후, 이동층(용리액)으로 용해시킨 후, 용해물을 HPLC 분석함으로써 효소 반응액 중의 다이드제인, 디히드로다이드제인의 함량을 측정하였다. 실험 결과, Mn2+, Fe2+에 활성 촉진 작용이 있음이 확인되었다(도 26).
<도면의 간단한 설명>
도 1은 실시예 A1에서의 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 도 1 중, 위에 나타내는 3개의 크로마토그래프는 대조군(보효소 미첨가), 보효소로서 NADH를 첨가, 보효소로서 NADPH를 첨가한 경우에 얻어진 효소 반응 생성물의 HPLC 분석 결과이다. 또한, 도 1 중, 아래에 나타내는 막대 그래프는 대조군(보효소 미첨가), 보효소로서 NADH를 첨가, 보효소로서 NADPH를 첨가한 경우에 디히드로다이드제인에 상당하는 피크 면적을 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 A2에서 실시한 Mono Q HPLC 결과를 도 2 중 위에, 각 프랙션에서의 디히드로다이드제인 합성 효소의 활성을 도 2 중 아래에 나타낸다. 효소 활성은 다이드제인을 기질로 하여 생성된 디히드로다이드제인의 피크 면적을 나타낸다.
도 3은 실시예 A2에서 실시한 SDS-PAGE 결과를 도 3 중의 좌측에, 각 프랙션에서의 디히드로다이드제인 합성 효소의 활성을 도 3 중의 우측에 나타낸다. 효소 활성은 다이드제인을 기질로 하여 생성된 디히드로다이드제인의 피크 면적을 나타낸다. SDS-PAGE에는 시판되는 겔판(SuperSepTM10-20 ％(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤))를 사용하였다.
도 4는 실시예 A4에서의 펩티드 맵핑을 행한 결과 및 각 피크에 대응하는 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 4 중, 위에 나타내는 HPCL 분석 차트 내에 나타내는 화살표 ▼의 번호는 각각 1: FDEPVYPQAE, 2: ASRMVMDAVHEGYIAG, 3: GYIGNLEVENRAIRMPM으로 표시되는 펩티드를 나타낸다.
도 5는 실시예 A5에서 실시한 Denerative-PCR 산물의 아가로스 전기 영동의 결과를 나타낸다. (1) E1-N-terminal-31과 E1-internal-RP1, (2) E1-N-terminal-37과 E1-internal-RP1, (3) E1-N-terminal-F32와 E1-internal-RP1, 마커 M1: λ/Styl, M2: 100 bp 래더
도 6은 실시예 A7에서 실시한 RT-PCR 산물의 아가로스 전기 영동 결과를 나타낸다. 위의 도면은 디히드로다이드제인 합성 효소이고, 아래 도면은 리보솜 RNA이다.
도 7은 실시예 A8에서 실시한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 A8에서 실시한 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 위의 도면은 대조군, 한가운데 도면은 pET-E1-His, 아래 도면은 pET21a를 나타낸다.
도 9는 실시예 1에서의 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 도 9 중에서 위의 차트는 시스-테트라히드로다이드제인(REF-000312)의 HPLC 분석 결과; 가운데 차트는 기질로 디히드로다이드제인을 이용하고, 균 파쇄물을 효소원으로 하여 얻어진 효소 반응 생성물의 HPLC 분석 결과; 아래 차트는 트랜스-테트라히드로다이드제인(REF-000313)의 HPLC 분석 결과를 각각 나타낸다.
도 10은 실시예 B1에서의 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 도 10 중에서 위의 2개 차트는 기질로 시스-테트라히드로다이드제인(REF-000312)을 이용하고, 균 파쇄물을 효소원으로 하여 얻어진 효소 반응 생성물의 HPLC 분석 결과; 아래의 2개 차트는 기질로 트랜스-테트라히드로다이드제인(REF-000313)을 이용하고, 균 파쇄물을 효소원으로 하여 얻어진 효소 반응 생성물의 HPLC 분석 결과를 각각 나타낸다.
도 11은 실시예 B2에서의 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 도 11 중에서 위에 나타내는 3개의 차트는 대조군(보효소 미첨가), 보효소로서 NADH를 첨가, 보효소로서 NADPH를 첨가한 경우에 얻어진 효소 반응 생성물의 HPLC 분석 결과이다. 또한, 도 11 중에서 아래에 나타내는 막대 그래프는 대조군(보효소 미첨가), 보효소로서 NADH를 첨가, 보효소로서 NADPH를 첨가한 경우에 테트라히드로다이드제인에 상당하는 피크 면적을 나타내는 도면이다.
도 12는 실시예 B3에서의 겔 여과 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 도 12 중, 위의 그래프는 표준 단백질의 겔 여과 HPLC 분석 결과; 가운데 그래프는 각 프랙션의 효소 활성을 생성된 테트라히드로다이드제인에 상당하는 피크 면적으로서 나타낸 것; 아래 그래프는 각 프랙션의 단백질에 상당하는 흡수(280 nm) 강도를 나타낸다.
도 13은 실시예 B3에서 SDS-PAGE를 행한 결과를 나타낸다.
도 14는 실시예 B4에서 SDS-PAGE를 행한 결과를 나타낸다.
도 15는 실시예 B5에서 결정한 디히드로다이드제인 합성(E1) 효소 유전자 주변 게놈 구조의 모식도를 나타낸다.
도 16a는 실시예 B6에서 LC-MS 분석으로 취득한 데이터 및 그로부터 추정되는 소화 펩티드의 아미노산 서열의 일례를 나타낸다. 도 16a 중에서 L로 표시되는 아미노산 잔기는 명세서 내에서 X로 표시되는 아미노산 잔기와 동일하다. 위의 도면은 펩티드: TPGVAASVADEXK에 대한 것이다. 아래 도면은 펩티드: MPGAPVFGK에 대한 것이다.
도 16b는 실시예 B6에서 LC-MS 분석으로 취득한 데이터 및 그로부터 추정되는 소화 펩티드의 아미노산 서열의 일례를 나타낸다. 도 16b 중에서 L로 표시되는 아미노산 잔기는 명세서 내에서 X로 표시되는 아미노산 잔기와 동일하다. 위의 도면은 펩티드: KXXXTGTTK에 대한 것이다. 아래 도면은 VTQEXXCAHGAFVCGSGR에 대한 것이다.
도 16c는 실시예 B6에서 LC-MS 분석으로 취득한 데이터 및 그로부터 추정되는 소화 펩티드의 아미노산 서열의 일례(WXSPEESVGQR)를 나타낸다. 도 16c 중에서 L로 표시되는 아미노산 잔기는 명세서 내에서 X로 표시되는 아미노산 잔기와 동일하다.
도 17은 실시예 B7에서의 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 도 17 중에서 위의 좌측 2개 차트는 기질로 디히드로다이드제인을 이용하고, ORF-US2 폴리펩티드를 발현시킨 반응액을 효소원으로 하여 얻어진 효소 반응 생성물의 HPLC 분석 결과(ORF-US2); 위의 우측 2개 차트는 단백질 합성시키지 않은 반응액을 효소원으로 하여 얻어진 효소 반응 생성물의 HPLC 분석 결과(NC)를 나타낸다. 또한, 도 17 중에서 아래에 나타내는 막대 그래프는 NC(단백질 합성 없음), DHFR(디히드로엽산 리덕타제 발현 반응액), ORF-US2(ORF-US2 폴리펩티드 발현 반응액)를 효소원으로 하여 효소 반응을 행한 경우에서의 효소 반응 중의 DD(디히드로다이드제인) 및 THD(테트라히드로다이드제인)에 상당하는 피크 면적을 나타내는 도면이다.
도 18은 실시예 B8에서 SDS-PAGE를 행한 결과를 나타낸다.
도 19는 실시예 B8에서의 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 도 19 중에서 위의 2개 차트의 상단은 기질로 디히드로다이드제인을 이용하고, 재조합 ORF-US2 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드 pET21-US2의 형질 전환체 유래의 균 파쇄액을 효소원으로 하여 얻어진 효소 반응 생성물의 HPLC 분석 결과(pET21-US2)를 나타낸다. 도 19 중에서 위의 2개 차트의 하단은 기질로 디히드로다이드제인을 이용하고, 음성 대조군인 pET21a 형질 전환체 유래의 균 파쇄액을 효소원으로 하여 얻어진 효소 반응 생성물의 HPLC 분석 결과(pET21a)를 나타낸다. 또한, 도 19 중에서 아래에 나타내는 막대 그래프는 ORF-US2 폴리펩티드를 발현시킨 반응액 또는 pET21a 형질 전환체 유래의 균 파쇄액을 효소원으로서 효소 반응을 행한 경우에서의 효소 반응 중의 디히드로다이드제인(DD) 및 시스-(c-THD) 및 트랜스-테트라히드로다이드제인(t-THD)에 상당하는 피크 면적을 나타내는 도면이다.
도 20은 실시예 C1에서의 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
도 21은 실시예 C2에서 실시한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 22는 실시예 C3에서 실시한 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 위의 도면은 스탠다드(표준), 한가운데 도면은 pET-US3, 아래 도면은 pET21a에 대한 것이다.
도 23은 실시예 D2에서 실시한 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 최상도는 스탠다드(표준), 위로부터 2번째 도면은 E1 및 E2, 위로부터 3번째 도면은 E1, 가장 아래 도면은 E2에 대한 것이다.
도 24는 실시예 D3에서 실시한 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 최상도는 스탠다드(표준), 위로부터 2번째 도면은 E2 및 E3, 위로부터 3번째 도면은 E2, 가장 아래 도면은 E3에 대한 것이다.
도 25는 실시예 D4에서 실시한 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 최상도는 스탠다드(표준), 위로부터 2번째 도면은 E1, E2 및 E3, 위로부터 3번째 도면은 E1, 위로부터 4번째 도면은 E2, 가장 아래 도면은 E3에 대한 것이다.
도 26은 E1 효소에 대한 금속 이온의 영향을 나타낸다.
도 27은 서열 번호 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열의 얼라인먼트를 나타낸다.
도 28은 서열 번호 7, 8 및 9에 기재된 아미노산 서열의 얼라인먼트를 나타낸다.
도 29는 서열 번호 13, 14 및 15에 기재된 아미노산 서열의 얼라인먼트를 나타낸다.
<서열 목록 프리 텍스트>
서열 번호 23은 프라이머 E1-N-terminal-31의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 24는 프라이머 E1-N-terminal-37의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 25는 프라이머 E1-N-terminal-F32의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 26은 프라이머 E1-internal-RP1의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 27은 프라이머 pUC19-FP-1의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 28은 프라이머 pUC19-RP-1의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 29는 프라이머 pUC19-FP-2의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 30은 프라이머 pUC19-RP-2의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 31은 프라이머 E1-RACE-N-P1의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 32는 프라이머 E1-RACE-RP2-1의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 33은 프라이머 E1-RACE-N-P2의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 34는 프라이머 E1-RACE-RP2-2의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 35는 프라이머 E1-conf-NP의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 36은 프라이머 E1-conf-CP의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 37은 프라이머 E1-FP의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 38은 프라이머 E1-RP의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 39는 프라이머 Gar-16S-Ribo-FP의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 40은 프라이머 Gar-16S-Ribo-RP의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 41은 프라이머 exp.E1 pet F Nde의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 42는 프라이머 exp.E1 pet His의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 43은 프라이머 RACE-N-P3-1의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 44는 프라이머 RACE-N-P3-2의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 45는 프라이머 E1-Bub-N-P1의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 46은 프라이머 E1-Bub-N-P2의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 47은 프라이머 RACE-C-P3-1의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 48은 프라이머 RACE-C-P3-2의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 49는 프라이머 E1-Bub-C-P1의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 50은 프라이머 E1-Bub-C-P2의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 57은 프라이머 E2-invitroTS-FP의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 58은 프라이머 E2-invitroTS-RP의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 59는 프라이머 Universal-Primer의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 60은 프라이머 exp.US2 pet F Nde의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 61은 프라이머 exp. US2 pet의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 62는 프라이머 exp.US3 F의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 63은 프라이머 exp.US3 R의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 64는 프라이머 exp.US1 F의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 65는 프라이머 exp.US1 R의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 66은 프라이머 exp.DS1 F의 염기 서열을 나타낸다.
서열 번호 67은 프라이머 exp.DS1 R의 염기 서열을 나타낸다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 치환체로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
  2. 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 치환체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 생성하는 활성을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드.
  3. 테트라히드로다이드제인에 대하여 제1항에 기재된 폴리펩티드를 작용시키는 공정을 포함하는 에쿠올의 제조 방법.
  4. 제2항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 갖는 발현 벡터.
  5. 제4항에 기재된 발현 벡터에 의해서 형질 전환된 재조합 세포.
  6. 제5항에 기재된 세포를 배양하고, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 얻는 공정을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  7. 제1항에 기재된 폴리펩티드, 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 에쿠올 합성 효소 조성물.
  8. 제5항에 기재된 세포; 및
    테트라히드로다이드제인
    을 함유하는 것을 특징으로 하는 에쿠올 합성 원료 조성물.
  9. 제1항에 기재된 폴리펩티드, 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드; 및
    테트라히드로다이드제인
    을 포함하는 에쿠올 합성용 키트.
  10. 제5항에 기재된 세포; 및
    테트라히드로다이드제인
    을 포함하는 에쿠올 합성용 키트.
  11. 이하의 (제2 공정) 및 (제3 공정)을 포함하는 에쿠올의 제조 방법:
    (제2 공정) 디히드로다이드제인에 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 치환체로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 및 NADPH, NADH, 또는 이들 둘 다를 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 생성하는 공정;
    (제3 공정) 테트라히드로다이드제인에 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 치환체로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 및 NADPH, NADH, 또는 이들 둘 다를 작용시킴으로써 에쿠올을 제조하는 공정.
  12. 이하의 (제1 공정) 내지 (제3 공정)을 포함하는 에쿠올의 제조 방법:
    (제1 공정) 다이드제인에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 치환체로 이루어지며, 다이드제인을 기질로 하여 디히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 및 NADPH, NADH, 또는 이들 둘 다를 작용시킴으로써 디히드로다이드제인을 생성하는 공정;
    (제2 공정) 디히드로다이드제인에 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 치환체로 이루어지며, 디히드로다이드제인을 기질로 하여 테트라히드로다이드제인을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 및 NADPH, NADH, 또는 이들 둘 다를 작용시킴으로써 테트라히드로다이드제인을 생성하는 공정;
    (제3 공정) 테트라히드로다이드제인에 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 치환체로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 효소, 및 NADPH, NADH, 또는 이들 둘 다를 작용시킴으로써 에쿠올을 제조하는 공정.
  13. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 14 또는 15에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 것인 폴리펩티드.
  14. 서열 번호 13에 기재된 아미노산 서열에 대하여 90.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 테트라히드로다이드제인을 기질로 하여 에쿠올을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
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