PT2228441E - Enzima envolvida na síntese de equol - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ENZIMA ENVOLVIDA NA SÍNTESE DE EQUOL Âmbito técnico A presente invenção tem por objecto um polipéptido que tem actividade para sintetizar equol, utilizando, como substrato, tetra-hidrodaidzeina, assim como, um poli- nucleótido que codifica este polipéptido. A presente invenção ainda tem por objecto um processo para a produção de equol utilizando o polipéptido anterior e um aparelho de produção utilizado no processo. A presente invenção também tem por objecto as técnicas que dizem respeito ao processo. Técnica anterior

Crê-se que os derivados de isoflavona possuem várias actividades fisiológicas e farmacológicas. Por esta razão, utilizam-se os derivados de isoflavona como matéria para alimentos e produtos farmacêuticos. Como os estudos não cobrem as funções dos derivados de isoflavona, tem havido relatos de que a actividade dos derivados de isoflavona semelhante ao estrogénio não é, como se acreditava convencionalmente, devida à acção dos próprios derivados de isoflavona, mas é devida à forte actividade semelhante aos estrogénios observada no corpo e que é exibida pelo equol, que é absorvido nos intestinos depois de ter sido libertado dos vários tipos de bactérias intestinais que metabolizam (biossintetizam) os derivados de isoflavona para produzir equol. Nos seres humanos, nem todos os indivíduos têm capacidade para produzir equol nos intestinos e essa capacidade de produção de equol varia de indivíduo para indivíduo. Por exemplo, alguns indivíduos podem não ter 1 bactérias que produzam equol nos intestinos, enquanto outros podem ter essas bactérias, mas apenas com uma capacidade limitada para produzir equol.

De acordo com isto, seria benéfico, em países com populações idosas, tal como o Japão, fazer uma utilização eficaz do equol no corpo, particularmente tendo em consideração distúrbios crónicos, tais como, a osteoporose que afecta os mais velhos. Uma vez que as bactérias que produzem o equol não se encontram em todos os indivíduos, há necessidade de encontrar um material que sintetize equol e que permita uma produção artificial eficiente de equol.

Nestas circunstâncias, é muito importante, em termos de providenciar material que sintetize equol, identificar e utilizar enzimas envolvidas na via da biossíntese do equol. Contudo, não há informação disponível respeitante à produção de enzimas ou à catálise de alguns dos produtos intermédios envolvidos nesta via biossintética. De acordo com isto, é desejável a identificação de enzimas associadas com a síntese desses produtos intermédios.

Documento de patentes 1: JP-A-2006-296434 Descrição da invenção Problema técnico

Constitui um objecto da presente invenção providenciar uma enzima associada com a síntese de equol. Especificamente, a presente invenção tem por objecto providenciar um polipéptido que tenha actividade para sintetizar equol utilizando, como substrato, tetra-hidrodaidzeína. A presente invenção também tem por objecto providenciar um 2 polinucleótido que codifica esse polipéptido e técnicas que dizem respeito à síntese de equol utilizando esse polipéptido.

Constitui outro objecto da presente invenção um processo para a produção de produtos intermédios, tai como, di-hidrodaidzeína e tetra-hidrodaidzeína gerados na produção de equol a partir de daidzeína e um processo para a produção de equol utilizando os produtos intermédios obtidos. A presente invenção também tem por objecto providenciar um aparelho de produção para ser utilizado na sua produção.

Solução técnica

Os requerentes da presente invenção realizaram intensos estudos para resolver os problemas anteriores e isolaram, com sucesso, a partir de bactérias intestinais que produzem equol, uma enzima capaz de sintetizar di-hidrodaidzeína, uma enzima capaz de sintetizar tetra-hidrodaidzeína e uma enzima capaz de sintetizar equol, utilizadas como materiais iniciais na síntese de equol e revelaram as estruturas destas enzimas. Além disso, os requerentes realizaram mais estudos e tiveram sucesso na produção artificial de di-hidrodaidzeína, tetra-hidrodaidzeína e equol, utilizando as enzimas anteriores. A presente invenção foi realizada com base noutros estudos que se apoiaram nestas verificações.

Especificamente, descreve-se o seguinte:

Item AI. Um polipéptido seleccionado a partir de: (Aa) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1; 3 (Ab) um pol ipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° . 1 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos e tendo actividade para sintetizar di-hidrodaidzeína utilizando como substrato a daidzeina; e (Ac) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 e tendo actividade para sintetizar di-hidrodaidzeína utilizando, como substrato, a daidzeina.

Item A2. Um polinucleótido seleccionado a partir de: (Ad) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 4; (Ae) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1; e (Af) um polinucleótido que híbrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Ad) ou (Ae) e que codifica um polipéptido que tem actividade para sintetizar di-hidrodaidzeína utilizando, como substrato, a daidzeina.

Item A3. Um vector de expressão que inclui o polinucleótido do item A2.

Item A4. Uma célula recombinante transformada com o vector de expressão do item A3.

Item A5. Uma célula recombinante, de acordo com o item A4, em que a célula recombinante é uma célula procariótica bacteriana. 4

Item A6. Uma célula recombinante, de acordo com o item A5, em que a célula procariótica bacteriana pertence ao género Lactococcus.

Item A7. Um processo para a produção de um polipéptido, que compreende a cultura da célula de qualquer um dos itens A4 até A6, para se obter um polipéptido que tenha actividade para sintetizar di-hidrodaidzeína, utilizando, como substrato, a daidzeina.

Item A8. Um polipéptido obtido pelo processo do item A7.

Item A9. Um processo para a produção de di-hidrodaidzeína, compreendendo o polipéptido do item AI ou do item A8 e NADPH e/ou NADH, actuando sobre daidzeina.

Item AIO. Um processo para a produção de di-hidrodaidzeína, compreendendo a célula de qualquer um dos itens A4 até A6, actuando sobre daidzeina.

Item All. Um anticorpo tendo afinidade para o polipéptido do item Al ou o polipéptido codificado pelo polinucleótido do item A2.

Item A12. Um processo imunológico para detectar ou medir o polipéptido do item Al ou o polipéptido codificado pelo polinucleótido do item A2, compreendendo o processo ter um anticorpo do item All em contacto com uma amostra de ensaio.

Item A13. Um processo, de acordo com o item A12, em que o polipéptido a ser detectado ou medido existe numa célula procariótica bacteriana.

Item A14. Uma sonda com uma sequência de nucleótidos capazes de hibridar, em condições severas, com um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Al ou com o polinucleótido do item A2.

Item A15. Um iniciador tendo uma sequência de nucleótidos capazes de hibridar, em condições severas, com um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Al ou com o polinucleótido do item A2. 5

Item A16. Um processo para a detecção ou a medição de um polinucleótido que codifica o polipéptido do item AI ou o polinucleótido do item A2, utilizando a sonda do item A14.

Item A17. Um processo de acordo com o item A16, em que o polipéptido que se pretende detectar ou medir existe numa célula procariótica bacteriana.

Item A18. Um processo, de acordo com o item A16, compreendendo a amplificação por RCP do todo ou de uma parte de um polinucleótido que codifica o polipéptido do item AI ou o polinucleótido do item A2.

Item A19. Uma composição enzimática que sintetiza di-hidrodaidzeina, contendo o polipéptido do item Al ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item A2.

Item A20. Uma composição, de acordo com o item A19, compreendo ainda NADPH e/ou NADH.

Item A21. Uma composição de síntese da di-hidro-daidzeína, compreendendo: (Ai) o polipéptido do item Al ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item A2; (Aii) NADPH e/ou NADH; e (Aiii) daidzeína.

Item A22. Uma composição de síntese de di-hidro-daidzeína, compreendendo: (Aiv) a célula, de acordo com um qualquer dos itens A4 até A6; e (Aiii) daidzeína.

Item A23. Um estojo de síntese de di-hidrodaidzeína, compreendendo: 6 (Ai) o polipéptido do item AI ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item A2; (Aii) NADPH e/ou NADH; e (Aiii) daidzeina.

Item A24. Um estojo de sintese de di-hidrodaidzeina, compreendendo: (Aiv) a célula, de acordo com um qualquer dos itens A4 até A6; e (Aiii) daidzeina.

Item A25. Um estojo de medição imunológica para a medição do polipéptido do item Al ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item A2, contendo o estojo pelo menos o anticorpo do item All.

Item A26. Um estojo de RCP para a detecção de um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Al ou o polinucleótido do item A2, contendo o estojo de RCP pelo menos o iniciador do item A15.

Item A27. Um estojo, de acordo com o item A26, em que o estojo se destina à identificação de uma célula contendo um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Al ou o polinucleótido do item A2.

Item A28. Um estojo de RCP, de acordo com o item A27, em que o estojo se destina a RCP.

Item A29. Uma enzima de sintese de di-hidrodaidzeina, que consiste no polipéptido do item Al.

Item Bl. Um polipéptido seleccionado entre: (Ba) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7; 7 (Bb) um pol ipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° . 7 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeína utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeína; e (Bc) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7, e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeína utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeina.

Item B2. Um polinucleótido seleccionado a partir de: (Bd) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 10; (Be) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7; e (Bf) um polinucleótido que híbrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Bd) ou (Be) e que codifica um polipéptido que tem uma actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeína utilizando como substrato a di-hidrodaidzeina.

Item B4. Uma célula recombinante transformada com o vector de expressão do item B3.

Item B5. Uma célula recombinante, de acordo com o item B4, em que a célula recombinante é uma célula procariótica bacteriana.

Item B6. Uma célula recombinante, de acordo com o item B5, em que a célula procariótica bacteriana pertence ao género Lactococcus.

Item B7. Um processo para a produção de um polipéptido, que compreende a cultura da célula de qualquer um dos itens Β4 até B6, para se obter um polipéptido que tenha actividade para formar tetra-hidrodaidzeína, utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeina.

Item B8. Um polipéptido obtido pelo processo do item B7.

Item B9. Um processo para a produção de tetra-hidrodaidzeína, compreendendo o polipéptido do item BI ou do item B8 e NADPH e/ou NADH, actuando sobre di-hidrodaidzeína.

Item B10. Um processo para a produção de tetra-hidrodaidzeína, compreendendo a célula de qualquer um dos itens B4 até B6, actuando sobre di-hidrodaidzeína.

Item Bll. Um anticorpo tendo afinidade com o polipéptido do item BI ou o polipéptido codificado pelo polinucleótido do item B2.

Item B12. Um processo imunológico para detectar ou medir o polipéptido do item BI ou o polipéptido codificado pelo polinucleótido do item B2, compreendendo o processo ter um anticorpo do item Bll em contacto com uma amostra de ensaio.

Item BI3. Um processo, de acordo com o item B12, em que o polipéptido a ser detectado ou medido existe numa célula procariótica bacteriana.

Item B14. Uma sonda com uma sequência de nucleótidos capazes de hibridar, em condições severas, com um polinucleótido que codifica o polipéptido do item BI ou com o polinucleótido do item B2.

Item B15. Um iniciador tendo uma sequência de nucleótidos capazes de hibridar, em condições severas, com um polinucleótido que codifica o polipéptido do item BI ou com o polinucleótido do item B2.

Item B16. Um processo para a detecção ou a medição de um polinucleótido que codifica o polipéptido do item BI ou o polinucleótido do item B2, utilizando a sonda do item B14.

Item B17. Um processo, de acordo com o item B16, em que o polipéptido que se pretende detectar ou medir existe numa célula procariótica bacteriana. 9

Item B18. Um processo, de acordo com o item B16, compreendendo a amplificação por RCP do todo ou de uma parte de um polinucleótido que codifica o polipéptido do item BI ou o polinucleótido do item B2.

Item B19. Uma tetra-hidrodaidzeina que sintetiza uma composição enzimática, contendo o polipéptido do item BI ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item B2.

Item B20. Uma composição, de acordo com o item B19, compreendo ainda NADPH e/ou NADH.

Item B21. Uma composição da sintese da tetra- hidrodaidzeina, compreendendo: (Bi) o polipéptido do item BI ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item B2; (Bii) NADPH e/ou NADH; e (Biii) di-hidrodaidzeina.

Item B22. Uma composição da sintese de tetra- hidrodaidzeina, compreendendo: (Biv) a célula, de acordo com um qualquer dos itens B4 até B6; e (Biii) di-hidrodaidzeina.

Item B23. Um estojo de síntese de tetra-hidrodaidzeina, compreendendo: (Bi) o polipéptido do item BI ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item B2; (Bii) NADPH e/ou NADH; e (Biii) di-hidrodaidzeina. 10

Item B24. Um estojo de síntese de tetra-hidrodaidzeína, compreendendo: (Biv) a célula, de acordo com um qualquer dos itens B4 até B6; e (Biii) di-hidrodaidzeína.

Item B25. Um estojo de medição imunológica para a medição do polipéptido do item Bl ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item B2, contendo o estojo pelo menos o anticorpo do item Bll.

Item B2 6. Um estojo de RCP para a detecção de um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Bl ou o polinucleótido do item B2, o estojo de RCP contendo pelo menos o iniciador do item B15.

Item B27. Um estojo, de acordo com o item B26, em que o estojo se destina à identificação de uma célula contendo um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Bl ou o polinucleótido do item B2.

Item B28. Um estojo de RCP, de acordo com o item B27, em que o estojo se destina a RCP.

Item B29. Uma enzima de síntese de tetra-hidrodaidzeína, que consiste no polipéptido do item Bl.

Item Cl. Um polipéptido seleccionado entre: (Ca) um polipéptido aminoácidos da SEQ ID que consiste N°. 13; na sequência de (Cb) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos e tendo actividade para sintetizar equol utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína; e (Cc) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade da 11 sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13, e tendo actividade para sintetizar equol utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína.

Item C2. Um polinucleótido seleccionado a partir de: (Cd) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 16; (Ce) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13; e (Cf) um polinucleótido que hibrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Cd) ou (Ce) e que codifica um polipéptido que tem uma actividade para sintetizar equol utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína.

Item C3. Um vector de expressão que inclui o polinucleótido do item C2.

Item C4. Uma célula recombinante transformada com o vector de expressão do item C3.

Item C5. Uma célula recombinante, de acordo com o item C4, em que a célula recombinante é uma célula procariótica bacteriana.

Item C6. Uma célula recombinante, de acordo com o item C5, em que a célula procariótica bacteriana pertence ao género Lactococcus.

Item C7 . Um processo para a produção de um polipéptido, que compreende a cultura da célula de qualquer um dos itens C4 até C6, para se obter um polipéptido que tenha actividade para formar equol, utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína .

Item C8. Um polipéptido obtido pelo processo do item C7. 12

Item C9. Um processo para a produção de equol, compreendendo o polipéptido do item Cl ou do item C8 e NADPH e/ou NADH actuando sobre tetra-hidrodaidzeina.

Item CIO. Um processo para a produção de equol, compreendendo a célula de qualquer um dos itens C4 até C6 actuando sobre tetra-hidrodaidzeina.

Item Cll. Um anticorpo tendo afinidade para o polipéptido do item Cl ou o polipéptido codificado pelo polinucleótido do item C2.

Item C12. Um processo imunológico para detectar ou medir o polipéptido do item Cl ou o polipéptido codificado pelo polinucleótido do item C2, compreendendo o processo ter um anticorpo do item Cll em contacto com uma amostra de ensaio.

Item C13. Um processo, de acordo com o item C12, em que o polipéptido a ser detectado ou medido existe numa célula procariótica bacteriana.

Item C14. Uma sonda com uma sequência de nucleótidos capazes de hibridar, em condições severas, com um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Cl ou com o polinucleótido do item C2.

Item C15. Um iniciador tendo uma sequência de nucleótidos capazes de hibridar, em condições severas, com um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Cl ou com o polinucleótido do item C2.

Item Cl6. Um processo para a detecção ou a medição de um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Cl ou o polinucleótido do item C2, utilizando a sonda do item C14.

Item C17. Um processo, de acordo com o item C16, em que o polipéptido que se pretende detectar ou medir existe numa célula procariótica bacteriana.

Item C18. Um processo, de acordo com o item C16, compreendendo a amplificação por RCP do todo ou de uma parte de um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Cl ou o polinucleótido do item C2. 13

Item C19. Um equol que sintetiza uma composição enzimática, contendo o polipéptido do item Cl ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item C2.

Item C20. Uma composição da síntese de equol, compreendendo: (Ci) o polipéptido do item Cl ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item C2; e (Cii) tetra-hidrodaidzeína.

Item C21. Uma composição da síntese de equol, compreendendo: (Ciii) a célula, de acordo com um qualquer dos itens C4 até C6; e (Cii) tetra-hidrodaidzeína.

Item C22. Um estojo de síntese de equol, compreendendo: (Ci) o polipéptido do item Cl ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item C2; e (Cii) tetra-hidrodaidzeína.

Item C23. Um estojo de síntese de equol, compreendendo: (Ciii) a célula, de acordo com um qualquer dos itens C4 até C6; e (Cii) tetra-hidrodaidzeína.

Item C24. Um estojo de medição imunológica para a medição do polipéptido do item Cl ou um polipéptido codificado pelo polinucleótido do item C2, contendo o estojo pelo menos o anticorpo do item Cll. 14

Item C25. Um estoj o de RCP para a detecção de um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Cl OU 0 polinucleótido do item C2, o estojo de RCP contendo pelo menos o iniciador do item C15.

Item C26. Um estojo, de acordo com o item C25, em que o estojo se destina à identificação de uma célula contendo um polinucleótido que codifica o polipéptido do item Cl ou o polinucleótido do item C2.

Item C27. Um estojo, de acordo com o item C26, em que o estojo se destina a RCP.

Item C28. Uma enzima de síntese de equol, que consiste no polipéptido do item Cl.

Item Dl. Um processo para a produção de tetra-hidrodaidzeína compreendendo a primeira etapa e segunda etapa que se seguem; a primeira etapa compreende a etapa de ter uma enzima que consiste num dos polipéptidos (Aa) a (Ac) que se seguem e NADPH e/ou NADH actuando sobre daidzeína, produzindo assim di-hidrodaidzeína, (Aa) um polipéptido aminoácidos da SEQ ID que consiste N° . 1; na sequência de (Ab) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo actividade para sintetizar di-hidrodaidzeína utilizando como substrato a daidzeína; e (Ac) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 e tendo actividade para sintetizar di-hidrodaidzeína, utilizando como substrato a daidzeína, compreendendo a segunda etapa uma etapa em que se tem uma enzima que consiste num dos polipéptidos (Ba) a (Bc) que se 15 seguem e NADPH e/ou NADH actuando sobre di-hidrodaidzeína, produzindo assim tetra- hidrodaidzeina, (Ba) um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7; (Bb) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeína utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína; e (Bc) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina, utilizando como substrato a di-hidrodaidzeina.

Item D2. Um produto contendo tetra-hidrodaidzeina, produzido pelo processo de acordo com o item Dl.

Item D3. Um processo para a produção de equol compreendendo a segunda etapa e terceira etapa que se seguem; a segunda etapa compreende a etapa de ter uma enzima que consiste num dos polipéptidos (Ba) a (Bc) que se seguem e NADPH e/ou NADH actuando sobre di-hidrodaidzeina, produzindo assim tetra-hidrodaidzeina, (Ba) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7; (Bb) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo actividade para sintetizar 16 tetra-hidrodaidzeína utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína; e (Bc) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeína, utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína, compreendendo a terceira etapa uma etapa em que se tem uma enzima que consiste num dos polipéptidos (Ca) a (Cc) que se seguem, actuando sobre tetra-hidrodaidzeína, produzindo assim equol; (Ca) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° . 13; (Cb) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N °. 13 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e tendo actividade para sintetizar equol utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína; e (Cc) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos 60 % ou mais de identidade com sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13 e tendo actividade para sintetizar equol utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína.

Item D4. Um produto contendo equol, produzido pelo processo de acordo com o item D3.

Item D5. Um processo para a produção de equol compreendendo as etapas um a três.

Item D6. Um produto contendo equol, produzido pelo processo de acordo com o item D5.

Item D7. Um vector de expressão tendo, pelo menos, um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em (Ad) a (Af) , (3d) a (Bf) e (Cd) a (Cf) que se seguem, 17 (Ad) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 4; (Ae) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° . 1; (Af) um polinucleótido que híbrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Ad) ou (Ae) e que codifica um polipéptido com uma actividade para sintetizar a di-hidrodaidzeína, utilizando como substrato a daidzeína; (Bd) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 10; (Be) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° . 7; (Bf) um polinucleótido que hibrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Bd) ou (Be) e que codifica um polipéptido com uma actividade para sintetizar a tetra-hidrodaidzeína, utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína; (Cd) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 16; (Ce) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13; e (Cf) um polinucleótido que hibrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Cd) ou (Ce) e que codifica um polipéptido com uma actividade para sintetizar o equol, utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína.

Item D8. Uma célula recombinante transformada com o vector de expressão do item 7. 18

Item D9. Uma célula recombinante, de acordo com o item 8, em que a célula recombinante é uma célula procariótica bacteriana.

Item D10. Uma célula recombinante, de acordo com o item 9, em que a célula procariótica bacteriana pertence ao género Lactococcus.

Item Dll. Um processo para a produção de di-hidrodaidzeína, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol, compreendendo, pelo menos, duas etapas das etapas quatro a seis que se seguem, a etapa quatro compreende uma etapa que tem uma célula recombinante compreendendo um dos polinucleótidos (Ad) a (Af) que se seguem, actuando sobre daidzeina, produzindo assim di-hidrodaidzeina, (Ad) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 4; (Ae) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1; e (Af) um polinucleótido que híbrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Ad) ou (Ae) e que codifica um polipéptido com uma actividade para sintetizar a di-hidrodaidzeína utilizando como substrato a daidzeina, a etapa cinco compreende uma etapa que tem uma célula recombinante compreendendo um dos polinucleótidos (Bd) a (Bf) que se seguem, actuando sobre di-hidrodaidzeína, produzindo assim tetra-hidrodaidzeina; (Bd) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 10; (Be) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7; e 19 (Bf) um polinucleótido que híbrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Bd) ou (Be) e que codifica um polipéptido com uma actividade para sintetizar a tetra-hidrodaidzeína, utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína, a etapa seis compreende uma etapa que tem uma célula recombinante compreendendo um dos polinucleótidos (Cd) a (Cf) que se seguem, actuando sobre tetra-hidrodaidzeína, produzindo assim equol; (Cd) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 16; (Ce) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13; e (Cf) um polinucleótido que híbrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Cd) ou (Ce) e que codifica um polipéptido com uma actividade para sintetizar o equol, utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína, em que pelo menos dois dos polinucleótidos seleccionam-se no grupo que consiste em (Ad) a (Af) , (Bd) a (Bf) e (Cd) a (Cf) e podem existir numa única célula recombinante.

Item D12. Uma célula recombinante de acordo com o item 11, em que a célula recombinante é uma célula procariótica bacteriana.

Item D13. Uma célula recombinante de acordo com o item 12, em que a célula procariótica bacteriana pertence ao género Lactococcus.

Item D14. Um produto contendo di-hidrodaidzeína, tetra-hidrodaidzeína, e/ou equol, produzidos por qualquer um dos processos de acordo com o itens Dll a D13.

Item D15. Um dispositivo para produzir di- hidrodaidzeína, tetra-hidrodaidzeína, e/ou equol, 20 compreendendo pelo menos um dos primeiros a terceiros reactores que se seguem, o primeiro reactor tem meios de reacção em que uma enzima que consiste num dos polipéptidos (Aa) a (Ac) é imobilizada, sendo o reactor utilizado para a produção de di-hidrodaidzeina a partir de daidzeina utilizando a enzima, estando os meios da reacção dispostos numa posição que permite o contacto com daidzeina; o segundo reactor tem meios de reacção em que uma enzima que consiste num dos polipéptidos (Ba) a (Bc) é imobilizada, sendo o reactor utilizado para a produção de tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeina utilizando a enzima, estando os meios da reacção dispostos numa posição que permite o contacto com di-hidrodaidzeina; e o terceiro reactor tem meios de reacção em que uma enzima que consiste num dos polipéptidos (Ca) a (Cc) é imobilizada, sendo o reactor utilizado para a produção de equol a partir de tetra-hidrodaidzeina utilizando a enzima, estando os meios da reacção dispostos numa posição que permite o contacto com tetra-hidrodaidzeina.

Item Dl 6. Um dispositivo para produzir di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeina, e/ou equol, compreendendo pelo menos um dos quartos a sextos reactores que se seguem, o quarto reactor tem meios de reacção em que uma célula recombinante que consiste num dos polinucleótidos (Ad) a (Af) é imobilizada, sendo o reactor utilizado para a produção de di-hidrodaidzeina a partir de daidzeina utilizando os meios de reacção, estando os meios da reacção dispostos numa posição que permite o contacto com daidzeina; o quinto reactor tem meios de reacção em que uma célula recombinante que consiste num dos polinucleótidos (Bd) a (Bf) é imobilizada, sendo o reactor utilizado para a produção de tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeina utilizando os meios de reacção, estando os meios da reacção dispostos numa posição que permite o contacto com di-hidrodaidzeina; e 21 o sexto reactor tem meios de reacção em que uma célula recombinante que consiste num dos polinucleótidos (Cd) a (Cf) é imobilizada, sendo o reactor utilizado para a produção de equol a partir de tetra-hidrodaidzeína utilizando os meios de reacção, estando os meios da reacção dispostos numa posição que permite o contacto com tetra-hidrodaidzeína.

Efeitos da presente invenção A presente invenção tem por objecto polipéptidos capazes de: (1) sintetizar di-hidrodaidzeína utilizando como substrato a daidzeína, (2) sintetizar tetra-hidrodaidzeína utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína, e (3) sintetizar equol utilizando, como substrato, a tetra-hidrodaidzeína. Assim, a presente invenção é útil para a síntese industrial de di-hidrodaidzeína e/ou tetra-hidrodaidzeína, que são produtos intermédios gerados na produção de equol a partir de daidzeína, assim como a síntese industrial de equol. A presente invenção vai abrir a porta à produção industrial de equol, sem utilizar estirpes bacterianas anaeróbicas que são de difícil manuseamento e que são tradicionalmente utilizadas para a produção de equol.

Melhor prática para realizar a presente invenção A seguir, todas as abreviaturas utilizadas para representar o nome das substâncias, incluindo aminoácidos, polipéptidos, sequências de bases e ácidos nucleicos, seguem a nomenclatura especificada pela IUPAC-IUB (IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)), o Guideline for Drafting Specifications contendo as sequências de bases de dados ou as sequências de aminoácidos (Instituto de Patentes do Japão) e outros símbolos convencionais normalmente utilizados neste domínio. 22 A seguir descreve-se a presente invenção com detalhe. A: Enzima de síntese da di-hidrodaidzeína

Esta secção descreve em detalhe uma enzima de síntese da di-hidrodaidzeína (daqui para a frente referida como enzima El) . Salvo indicação em contrário, a explicação geral da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína aplica-se à enzima da síntese de tetra-hidrodaidzeína e à enzima de síntese de equol, que vão ser descritas depois. A-l. Polipéptido A presente invenção tem por objecto um polipéptido (daqui para a frente referido como "polipéptido El") para a síntese de di-hidrodaidzeína, utilizando, como substrato, a daidzeína. Especificamente, a presente invenção tem por objecto: (Aa) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1; por exemplo, o intervalo vai de 1 a 250, preferencialmente, de 1 a 200, mais preferencialmente, de 1 a 150, mais preferencialmente, de 1 a 100, mais preferencialmente, de 1 a 50, mais preferencialmente, de 1 a 30, mais preferencialmente, de 1 a 15, mais preferencialmente, de 1 a 5, mais preferencialmente, de 1 a 4, ainda mais preferencialmente, de 1 a 3 e, particularmente preferido, 1 ou 2. (Ab) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos e tendo actividade para sintetizar di-hidro-daidzeína utilizando, como substrato, a daidzeína; e 23 (Ac) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°. 1 e tendo actividade para sintetizar di-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a daidzeina.

No polipéptido (Ab), o intervalo de "um ou mais aminoácidos" não está particularmente limitado desde que o polipéptido tenha actividade para sintetizar di-hidro-daidzeína utilizando, como substrato, a daidzeina. Exemplos do polipéptido (Ab) incluem um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 2 e um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 3. Comparada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 2 contém três aminoácidos substituídos. Comparada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1, a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 3 contém dez aminoácidos substituídos. A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 2 corresponde ao polipéptido da enzima EI para a estirpe E-23-15 de Bacteroides ovatus (FERM BP-6435) . A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 3 corresponde ao polipéptido da enzima EI da estirpe A6G-225 de Streptococcus constellatus (FERM BP-6437).

Além disso, o tipo da substituição de aminoácidos no polipéptido (Ab) não está particularmente limitado. Contudo, do ponto de vista da prevenção da alteração fenotípica no polipéptido, é preferível que a substituição seja feita entre aminoácidos análogos. Os aminoácidos análogos podem ser classificados como se segue.

Aminoácidos aromáticos: Fen, Trp, Tir Aminoácidos alifáticos: Ala, Leu, Ile, Vai Aminoácidos polares: Gin, Asn 24

Aminoácidos básicos: Lis, Arg, His Aminoácidos ácidos: Glu, Asp

Aminoácidos com um grupo hidroxilo: Ser, Tre Aminoácidos com uma cadeia lateral curta: Gli, Ala, Ser, Tre, Met

No polipéptido (Ab), é preferível que a substituição, eliminação, inserção ou adição de aminoácidos ocorra em regiões em que a alteração dos aminoácidos não tenha grandes efeitos nas estruturas de ordem superior do polipéptido ou em que a alteração não afecta adversamente o centro activo da enzima que sintetiza di-hidrodaidzeina. Exemplos dessas regiões incluem regiões pouco conservadas entre as sequências de aminoácidos das SEQ ID N°s. 1, 2 e 3 e na sua vizinhança e na região do terminal N ou na região do terminal C. Exemplos específicos incluem leucina na posição 45, asparagina na posição 80, valina na posição 167, ácido aspártico na posição 231, isoleucina na posição 233, arginina na posição 435, ácido aspártico na posição 459, valina na posição 462, arginina na posição 528, serina na posição 540, isoleucina na posição 639, na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 e nas regiões adjacentes destes aminoácidos. A "região adjacente" significa uma região em que a actividade da enzima de síntese de di-hidrodaidzeina não é afectada. Exemplos incluem as que estão dentro dos cinco aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, preferencialmente, dentro dos quatro aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, mais preferencialmente, dentro dos três aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, ainda mais preferencialmente, dentro dos dois aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados, particularmente preferido, dentro de um aminoácido de um dos aminoácidos exemplificados. 25

Na sequência dos aminoácidos da SEQ ID N°. 1, considera-se que a sequência dos aminoácidos nas posições 112 a 116 corresponde ao dominio de ligação de NADPH. Dado que as funções do dominio de NADPH não estão inibidas, pode haver substituições, eliminações, inserções ou adições de aminoácidos na sequência dos cinco aminoácidos. Na referida sequência, o número de aminoácidos mutados, preferencialmente, não é superior a três, mais preferencialmente, não é superior a dois e, ainda mais preferencialmente, é de um. 0 que é mais preferido é não haver mutação na sequência de aminoácidos. Particularmente, preferencialmente não há substituições, eliminações, inserções ou adições de aminoácidos nas posições 112, 115 e 116.

Também se considera que a histidina na posição 260 na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 está associada ao sítio de libertação do protão. De acordo com isto, como as funções do sítio de libertação do protão não estão inibidas, a referida histidina pode ser substituída por outro aminoácido mas, preferencialmente, não é substituída.

Considera-se que a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1, a sequência dos aminoácidos nas posições 343 a 363 corresponde ao elemento de aglutinação de Fe-S. Como as funções do elemento não estão inibidas, pode haver substituição, eliminação, inserção ou adição de um aminoácido arbitrário na sequência. Contudo, prefere-se que as cisteínas, nas posições 343, 396, 350 e 363, não estejam mutadas. Quando a sequência tem uma ou mais substituições de aminoácidos em posições diferentes dos referidos três aminoácidos, é preferível que o número de aminoácidos substituídos não seja superior a quatro, mais preferencialmente, não seja superior a três, ainda mais 26 preferencialmente, não seja superior a dois e, particularmente preferido, seja de um. 0 mais preferido é que não haja substituição, eliminação, inserção ou adição de aminoácidos na sequência.

Na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1, a sequência dos aminoácidos nas posições 390 a 413 é considerada como correspondendo ao dominio de ligação de FAD. De acordo com isto, como as funções do dominio não estão inibidas, pode haver substituição, eliminação, inserção ou adição de um aminoácido arbitrário na sequência. Contudo, prefere-se que as glicinas nas posições 390, 392 e 395 não estejam mutadas. Quando a sequência tem uma ou mais substituições, eliminações, inserções ou adições de aminoácidos, o número de aminoácidos mutados, preferencialmente, não é superior a quatro, mais preferencialmente, não é superior a três, ainda mais preferencialmente, não é superior a dois e, particularmente preferido é de um. O mais preferido é que não haja mutação na sequência de aminoácidos.

Na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1, a sequência dos aminoácidos nas posições 512 a 540 é considerada como correspondendo ao domínio de ligação de FAD. De acordo com isto, como as funções do domínio não estão inibidas, pode haver substituição, eliminação, inserção ou adição de um aminoácido arbitrário na sequência. Contudo, prefere-se que as glicinas nas posições 512, 514 e 517 não estejam mutadas. Quando a sequência tem uma ou mais substituições, eliminações, inserções ou adições de aminoácidos, o número de aminoácidos mutados, preferencialmente, não é superior a quatro, mais preferencialmente, não é superior a três, ainda mais preferencialmente, não é superior a dois e, particularmente preferido é que seja de um. O mais preferido é que não haja mutação na sequência de aminoácidos. 27

Num alinhamento, que indica as regiões das sequências de aminoácidos com possíveis funções, tal como as descritas antes, está ilustrado na fig. 27. A substituição, eliminação, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos numa sequência específica de aminoácidos é possível por meio de técnicas conhecidas.

No polipéptido (Ac), a sequência de aminoácidos tem, por exemplo, 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1. Contudo, é preferível que essa sequência de aminoácidos tenha geralmente 80 % ou mais, preferencialmente, 85 % ou mais, mais preferencialmente, 90 % ou mais, ainda preferencialmente, 95 % ou mais, ainda mais preferencialmente, 98 % ou mais e, particularmente preferido, 99 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1.

Especif icamente, o polipéptido (Ac) pode ser um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 2 ou um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 3. A identidade de aminoácidos entre a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 e a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 2 é de 99,5 % (Blast2). A identidade de aminoácidos entre a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 e a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 3 é de 98,6 % (Blast2) . De acordo com isto, preferencialmente, o polipéptido (Ac) contém uma sequência de aminoácidos com 98,6 % ou mais e, mais preferencialmente, 99,5 % de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° . 1. A identidade da sequência de aminoácidos pode ser calculada utilizando ferramentas de análise, tais como, por 28 exemplo, FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH ou outros tipos de programas informáticos disponíveis quer comercialmente ou através de linhas de telecomunicações (internet). Especificamente, uma pesquisa por BLAST é geralmente realizada nas condições iniciais que se seguem para calcular a identidade (%) da sequência de aminoácidos. BLAST 2.1 avançado:

Programa: blastp Valor esperado: 10 Filtros: todos desligados Matriz: BLOSUM62

Valor da existência do intervalo: 11 (por defeito)

Valor do intervalo por residuo: 1 (por defeito) Rácio lambda: 0,85 (por defeito)

Outros parâmetros: (por defeito)

No que respeita aos polipéptidos (Ab) e (Ac), a actividade para sintetizar di-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a daidzeina, pode ser confirmada como se segue. Em primeiro lugar, adiciona-se um polipéptido de interesse a uma solução de substrato da composição que se segue, a uma concentração de 0,001 mg/mL. Depois, faz-se a incubação da solução, a 37 °C, durante 2 horas, para verificar a presença ou a ausência de di-hidrodaidzeina na solução. A presença de di-hidrodaidzeina na solução, após incubação, é utilizada como um indicador da actividade do polipéptido para sintetizar di-hidrodaidzeina, utilizando, como substrato, a daidzeina.

Composição da solução de substrato

Tampão de fosfato de potássio 0,1 M 29

PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) 1 mM

Ditiotreitol 2 mM

Hidrossulfito de sódio 5 mM

NADPH ou NADH 2 mM

Daidzeína 40 μΜ pH 7,0

Propriedades da enzima

Dado que o polipéptido EI tem uma actividade enzimática para sintetizar di-hidrodaidzeína utilizando como substrato a daidzeina, o polipéptido EI também é referido como enzima El. A enzima El é activada pela presença de um agente redutor, tal como, Na2S2<D4 e iões metálicos, tais como, Fe2+ e Mn2+. Além disso, a enzima El requer NADPH ou NADH como co-enzima. A temperatura óptima da enzima El está na vizinhança de 30 °C e o pH óptimo é de 7,0. A enzima El não pode sintetizar apenas di-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a daidzeina, mas também sintetiza daidzeina a partir de di-hidrodaidzeina, como uma reacção inversa. O polipéptido El pode ser produzido por técnicas de engenharia genética que vão ser descritas a seguir ou por isolamento e purificação a partir de microrganismos capazes de o produzir. Além disso, podem utilizar-se processos comuns na síntese química para produzir o polipéptido El com base na informação da sequência de aminoácidos das SEQ ID N°s. 1, 2 ou 3. Esses processos de síntese química incluem processos comuns de síntese de péptidos em fase líquida ou em fase sólida. A seguir descreve-se um processo para o isolamento e a purificação do polipéptido El a partir de um microrganismo 30 capaz de produzir o polipéptido El. Em primeiro lugar, faz-se o desmantelamento das células de um microrganismo capaz de produzir o polipéptido El, para se obter um extracto impuro do microrganismo. Aqui, as células podem ser desmanteladas por processos utilizados em processos comuns de desmantelamento de células, tais como, desmantelamento utilizando uma prensa francesa, um moinho de células e outros equipamentos de rompimento e equipamento de ultra-sons numa solução hipotónica. 0 extracto impuro pode ser complementado com um tampão apropriado. Quando o polipéptido El é armazenado anaerobicamente, é desejável adicionar um agente de redução apropriado ao extracto impuro para manter o polipéptido El activo. Para melhorar a pureza, o extracto impuro pode ainda ser purificado por processos, tais como, precipitação com sulfato de amónio, precipitação com um dissolvente orgânico utilizando etanol ou similar e precipitação isoeléctrica. Pode então obter-se uma fracção contendo o polipéptido El submetendo o extracto impuro a processos, tais como, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de filtração com gel, cromatografia hidrofóbica, cromatografia por afinidade de vários tipos, cromatografia de fase inversa e cromatografia em coluna de hidroxiapatite. Estes processos de cromatografia podem utilizar uma coluna aberta ou pode-se utilizar CLAR, conforme necessário. A pureza da fracção, incluindo o polipéptido El, pode ser facilmente estimada por visualização através de electroforese e, particularmente, através de EGPA-SDS. A confirmação do polipéptido El também é possível por análise da sequência de aminoácidos, por espectrometria de massa utilizando um espectrómetro de massa, tal como, EM MALDI-TOF, EM ESI Q-TOF e EM MALDI Q-TOF e, por exemplo, impressão digital da massa de péptido. 31

Aqui, o microrganismo capaz de produzir o polipéptido EI é posto em cultura, preferencialmente num meio contendo a quantidade desejada de daidzeina (por exemplo, mas não se limitando a um meio contendo pelo menos 0,01 yg/mL de daidzeina) em termos de produção eficiente do polipéptido El. O polipéptido El pode ser monomérico ou dimérico ou polimérico, desde que sintetize di-hidrodaidzeina. Além disso, para melhorar a estabilidade e outras características, o polipéptido El pode ser modificado, conforme necessário, por adição de polietileno-glicol de uma cadeia de açúcar. O polipéptido El pode servir como catalisador que converte a daidzeina (um substrato) em di-hidrodaidzeina. A di-hidrodaidzeina é ainda convertida em equol por meio da enzima de síntese de tetra-hidrodaidzeína e a enzima de síntese de equol conforme se descreve a seguir. Crê-se que o equol exiba várias actividades fisiológicas no corpo. Por este motivo, o polipéptido El, capaz de providenciar o material para a síntese de equol, é considerado importante. A-2. Polinucleótido A presente invenção também tem por objecto um polinucleótido (daqui para a frente também referido como "polinucleótido El"), que codifica um polipéptido que tem actividade para sintetizar di-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a daidzeina. Especificamente, a presente invenção tem por objecto: (Ad) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 4; (Ae) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1; e 32 (Af) um polinucleótido que híbrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Ad) ou (Ae) e que codifica um polipéptido que tem actividade para sintetizar di-hidrodaidzeína, utilizando, como substrato, a daidzeína. A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 corresponde à sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 4. A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 2 corresponde à sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 5. A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 3 corresponde à sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 6.

No que respeita ao polinucleótido (Af), a expressão "híbrida em condições severas" descreve a hibridação entre dois fragmentos de polinucleótidos, em condições normais de hibridação, tais como, as descritas por Sambrook et al., em Molecular Cloning: A laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Mais especificamente, "condições severas" significa uma hibridação em 6,0 x SSC, a cerca de 45 °C e uma lavagem com 2,0 x SSC, a 50 °C. Exemplos do polinucleótido (Af) incluem a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 5 e a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 6. O "polinucleótido que híbrida em condições severas" geralmente tem um nível de identidade superior com a sequência de nucleótidos do polinucleótido utilizado como sonda. A identidade é, por exemplo, de 60 % ou mais, preferencialmente, 70 % ou mais, mais preferencialmente, 80 % ou mais, ainda preferencialmente, 90 % ou mais, ainda mais preferencialmente, 95 % ou mais e, particularmente preferido, é que seja de 98 % ou mais. A identidade da sequência de 33 nucleótidos pode ser calculada utilizando ferramentas de análise, tais como, por exemplo, FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH ou outros tipos de programas informáticos disponíveis quer comercialmente ou através de linhas de telecomunicações (internet). Especificamente, um programa de pesquisa BLAST é geralmente feito nas condições iniciais para calcular a identidade (%) da sequência de nucleótidos. BLAST 2.1 avançado:

Programa: blastn

Parâmetros: por defeito A homologia da sequência de bases entre a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 4 e a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 5 é de 99,6 % (Blast2). A homologia da sequência de base entre a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 4 e a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 6 é de 97,6 % (Blast2). De acordo com isto, preferencialmente, um polinucleótido (Af) compreende uma sequência de bases com 97,6 % de homologia e, mais preferencialmente, 99,6 % de homologia com a sequência de bases da SEQ ID N°. 4.

No que respeita ao polinucleótido (Af), a "actividade para sintetizar di-hidrodaidzeína, utilizando como substrato a daidzeína" pode ser confirmada pelo processo utilizado para os polipéptidos (Ab) e (Ac). 0 polinucleótido EI pode ser produzido ou obtido por processos de síntese química de ADN, com base na informação da sequência das SEQ ID N°s. 4, 5 e 6. Geralmente, o polinucleótido EI pode ser facilmente produzido ou obtido por técnicas comuns de engenharia genética (ver, por exemplo, Molecular Cloning 2a Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press 34 (1989) ; e Zoku Seikagaku Jikken Kouza, Gene Kennkyu-hou I, II, III, the Japanese Biochemical Society (1986)).

Um exemplo desses processos de síntese química de ADN é um processo de síntese em fase sólida, utilizando o processo de fosforamidite, que pode utilizar um auto-sintetizador.

Num exemplo específico de técnicas comuns de engenharia genética, prepara-se uma biblioteca de ADNc por um processo normal a partir de uma fonte apropriada que expressa o polinucleótido EI e a biblioteca é rastreada para os clones desejados utilizando uma sonda apropriada ou um anticorpo específico do polinucleótido EI (ver, por exemplo, Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)) . A fonte de ADNc não está particularmente limitada desde que seja um organismo que expressa o polinucleótido El. Exemplos específicos incluem microrganismos capazes de produzir equol, preferencialmente, bactérias de ácido láctico, bactérias pertencentes ao género de Bacteroides e Streptococcus capazes de produzir equol, mais preferencialmente, Lactococcus garvieae, Bacteroides ovatus e Streptococcus constellatus capazes de produzir equol, ainda preferencialmente, Lactococcus garvieae fecal capaz de produzir equol e, particularmente preferido é a estirpe 20-92 de Lactococcus, a estirpe E-23-15 de Bacteroides ovatus, a estirpe A6G-225 de Streptococcus constellatus (FERM BP-10036, FERM BP-6435 e FERM BP-6437, respectivamente; depositadas no Organismo Internacional de Depósito de Patentes, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão), estirpes de Lactococcus garvieae fecal capazes de produzir equol. 35

Podem utilizar-se processos comuns para os procedimentos que incluem a separação do ARN total, a separação e a purificação de ARNm e a preparação e a clonagem de ADNc. 0 processo de rastreio da biblioteca de ADNc para um polinucleótido da presente invenção não está particularmente limitado e pode-se utilizar um processo comum. Por exemplo, os polipéptidos produzidos a partir de ADNc podem ser rastreados por selecção dos clones de ADNc correspondentes, por meio de um rastreio imunológico utilizando um anticorpo especifico do polipéptido. Além disso, pode-se fazer o rastreio por técnicas de hibridação, tais como, hibridação de placas e hibridação de colónias, que utilizam sondas que se ligam especificamente às sequências-alvo de nucleótidos. Além disso, pode-se utilizar uma combinação destas diferentes técnicas.

Geralmente, a sonda pode ser, por exemplo, ADN quimicamente sintetizado obtido com base na informação respeitante à sequência de nucleótidos do polinucleótido EI (por exemplo, a sequência de nucleótidos das SEQ ID N°. 4, 5 ou 6). Além disso, a sonda utilizada para o rastreio pode ser um iniciador directo e/ou um iniciador inverso concebidos com base na informação da sequência de bases de um polinucleótido da presente invenção. 0 polinucleótido EI pode ser obtido de forma apropriada por um processo de RCP (Science, 130, 1350 (1985) ) ou por variantes do processo de RCP, tal como um processo de amplificação de ADN ou de ARN. Qualquer dificuldade no rastreio da biblioteca para ADNc de comprimento completo pode ser circunscrita utilizando técnicas apropriadas, tal como, o processo RACE (Rapid amplification of cDNA ends, Experimental Medicine, 12(6), 35 (1994)); e, particularmente, o processo 5'-RACE (M.A. Frohman, et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 36 8, 8998 (1988)). 0 processo RACE e o processo 5'-RACE são úteis para a obtenção do polipéptido EI a partir de eucariotos.

Os iniciadores utilizados para o processo de RCP podem ser concebidos apropriadamente com base na informação da sequência do polinucleótido El. Esses iniciadores podem ser sintetizados por um processo normal. Tal como se fez notar antes, o isolamento e a purificação de fragmentos de ADN ou de ARN amplificados podem ser realizados por um processo comum, tal como, electroforese em gel e hibridação. 0 polinucleótido El facilmente permite a produção em massa estável do produto de polinucleótido (o polipéptido), utilizando técnicas comuns de engenharia genética. 0 isolamento com sucesso do polinucleótido El irá abrir a porta para a produção industrial de equol sem utilizar as estirpes bacterianas anaeróbicas difíceis de manusear, utilizadas tradicionalmente para a produção de equol. A-3. Vector de expressão 0 vector de expressão da presente invenção não está particularmente limitado desde que inclua o polinucleótido El e seja capaz de expressar o polinucleótido El. Geralmente selecciona-se, de forma apropriada, de acordo com o tipo de célula hospedeira.

Quando a célula hospedeira é uma célula procariótica, o vector de expressão pode ser, por exemplo, um vector de expressão de plasmido, replicável na célula hospedeira, preparado por adição de promotores e uma sequência de bases de SD (Shine-Dalgarno) a montante do polinucleótido, para provocar a expressão do polinucleótido. Um exemplo específico 37 é um plasmido de expressão que utiliza um promotor PL, um promotor T7 e um promotor lac. Outros exemplos de vectores de expressão bacteriana preferidos incluem o plasmido pKK233-2 e o plasmido pKK233-3, utilizando um promotor tac ou um promotor trc. Estes exemplos não são limitativos e outras estirpes bacterianas e vectores conhecidos podem também ser utilizados.

Quando a célula hospedeira é uma célula eucariótica, o vector de expressão pode incluir, geralmente, promotores a montante do polinucleótido a ser expresso e outras sequências especificas incluindo um sitio de combinação de ARN, um sitio de poliadenilação e uma sequência de terminação da transcrição. 0 vector de expressão pode ainda incluir uma origem de replicação. Há um certo número de vectores eucarióticos conhecidos, úteis para a inserção do polinucleótido. Exemplos desses vectores eucarióticos apropriados incluem pCD e pCMV. Outros exemplos incluem pMSG e pSVL, que utilizam o promotor tardio MMTV ou SV40, conforme necessário. Estes são exemplos não são limitativos e pode-se utilizar também vários eucariotos e vectores conhecidos. A-4. Célula recombinante A presente invenção tem por objecto uma célula recombinante (transformante) transformada com um vector de expressão que inclui o polinucleótido El. A célula hospedeira utilizada para a célula recombinante pode ser uma célula procariótica ou uma célula eucariótica.

Exemplos apropriados de células hospedeiras procarióticas incluem: células procarióticas bacterianas do género Lactococcus, tais como, bactérias de ácido láctico; e 38 células procarióticas bacterianas tais como, por exemplo, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Streptococcus e Staphylococcus, que podem crescer em condições aeróbicas.

Exemplos de uma célula hospedeira eucariótica incluem: microrganismos eucarióticos, tais como, levedura e Aspergillus; células de insectos, tais como, Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; e células de animais e de plantas, tais como, células L, células de OHC, células COS, células HeLa, células C127, células BALB/c3T3 (incluindo estirpes mutantes a que falta a redutase de di-hidrofolato ou a cinase de timidina), células BHK21, células HEK293, células de melanoma de Bowes e oócitos. 0 processo utilizado para introduzir o vector de expressão na célula hospedeira não está particularmente limitado e pode-se utilizar uma variedade de processos comuns. Por exemplo, o vector de expressão pode ser introduzido na célula hospedeira de acordo com os processos de muitos manuais normativos de laboratório incluindo, por exemplo, Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986, e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Exemplos específicos incluem a transfecção com fosfato de cálcio, a transfecção mediada por DEAE-dextrano, a transfecção, a micro-injecção, a transfecção mediada por lípidos catiónicos, a electroporação, a transdução, a carga de raspagem, a introdução balística e a infecção.

Como a célula recombinante é capaz de produzir polipéptido EI (uma enzima que converte a di-hidrodaidzeina), pode ser utilizada para produzir uma enzima que converte a 39 di-hidrodaidzeína. A célula recombinante também pode ser utilizada para produzir a di-hidrodaidzeína numa forma de célula. A-5. Produção de polipéptido utilizando uma célula recombinante 0 polipéptido EI pode ser produzido por cultura de uma célula recombinante na qual se introduz um polinucleótido EI e se recolhe o polipéptido EI da célula e da cultura. A cultura pode ser uma subcultura ou uma cultura em lotes utilizando um meio apropriado para o hospedeiro. As células podem ser postas em cultura até se obter uma quantidade adequada do polipéptido El, utilizando o nível do polipéptido El dentro e fora das células recombinantes como um índice. 0 meio de cultura pode ser selecionado, de forma apropriada, a partir de um meio comum, de acordo com o tipo de célula hospedeira utilizada. A cultura pode ser incubada em condições de crescimento apropriado para a célula hospedeira. 0 polipéptido El resultante pode ser eventualmente separado e purificado por vários tipos de técnicas de separação utilizando as propriedades físicas e químicas do polipéptido El (ver, por exemplo, Biochemistry Data Book II, pp. 1175-1259, Ia ed., Ia impressão, 23 de Junho de 1980, Tokyo Kagaku Dozen Co., Ltd.; Biochemistry, 25 (25), 8274 (1986); e Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)). Especificamente, o polipéptido El pode ser separado e purificado, por exemplo, como no "processo para o isolamento e a purificação do polipéptido El a partir de microrganismos 40 capazes de produzir o polipéptido El", descrito na secção A-1, sob o titulo "polipéptido". A-6. Produção de di-hidrodaidzeína utilizando o polipéptido El A presente invenção tem por objecto um processo para a produção de di-hidrodaidzeina utilizando o polipéptido El. No processo de produção, a daidzeina pode ser convertida em di-hidrodaidzeina fazendo o polipéptido El actuar sobre daidzeina, na presença de NADPH e/ou NADH. Preferencialmente, a daidzeina pode ser convertida em di-hidrodaidzeina fazendo actuar o polipéptido El sobre a daidzeina, na presença de NADPH.

Dada o que a actividade da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína do polipéptido El é activada pela presença de Mn2+ e Fe2+, o péptido El, preferencialmente, é um polipéptido El que actua sobre a daidzeina na presença de Mn2+ e/ou de Fe2+. A concentração de Mn2+ e/ou de Fe2+ na solução reaccional não está particularmente limitada desde que a actividade enzimática do polipéptido El possa ser activada. A concentração de Fe2+ é, preferencialmente, de 2 mM ou mais, mais preferencialmente, de 2 mM a 100 mM, mais preferencialmente, de 10 mM a 40 mM. A concentração de Mn2+ é, preferencialmente, de 0,2 μΜ ou mais, mais preferencialmente, de 0,2 μΜ a 100 mM e, ainda mais preferencialmente, de 1,0 μΜ a 40 mM. A reacção utilizada no processo de produção pode ser realizada num tampão apropriado. Exemplos desses tampões apropriados incluem tampão de fosfato, tampão de carbonato, tampão de acetato, tampão de Tris e tampão de borato. A condição do pH da reacção pode ser selecionada, 41 apropriadamente, de modo a não inactivar a actividade enzimática desejada do polipéptido El. Por exemplo, a reacção pode ser realizada num intervalo de pH, preferencialmente, de 5,0 a 10,0 e, mais preferencialmente, de 6,0 a 8,0.

Na reacção, pode-se adicionar, se necessário, uma quantidade apropriada de inibidor de protease, tal como PMSF ou EDTA. Além disso, considerando que o polipéptido deriva de bactérias anaeróbicas, pode-se também adicionar uma quantidade apropriada de agente redutor, tal como, DTT, 2ME, DET e Na2S204. A reacção utilizada no processo de produção realiza-se em condições tais como, por exemplo, adiciona-se cada componente ao meio em concentrações que variam conforme se mostra a seguir, no inicio da reacção, de modo a preparar uma mistura. Faz-se a incubação da mistura durante 0,5 a 10 horas, preferencialmente, 1 a 6 horas e, mais preferencialmente, 2 a 4 horas, a temperaturas de 20 a 45 °C, preferencialmente, 25 a 40 °C e, mais preferencialmente, 30 a 38 °C. A concentração inicial de cada um dos componentes é a seguinte: o teor do polipéptido é de 0,0001 a 1, 0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,01 % em peso; o teor de daidzeina é de 0,0001 a 10,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 1,0 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso; o teor de NADPH e/ou de NADH é de 0,01 a 5 % em peso, preferencialmente, de 0/ 05 a 1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0/1 a 0/5 % em peso. 42 de A presente invenção também tem por objecto uma mistura material para a sintese de di-hidrodaidzeina, especificamente, uma composição para a sintese de di-hidrodaidzeina incluindo (Ai) o polipéptido El, (Aii) NADPH e/ou NADH e (Aiii) a daidzeina. Adicionalmente, a presente invenção tem por objecto uma mistura de material para a síntese de di-hidrodaidzeina, especificamente, uma composição de um material para a síntese de di-hidrodaidzeina incluindo (Ai) o polipéptido El, (Aii) NADPH e/ou NADH, (Aiii) a daidzeina e (Aiv) Mn2+ e/ou Fe2+. Pela incubação da composição, nas condições mencionadas antes, a daidzeina contida na composição pode ser convertida em di-hidro-daidzeína. A composição do material de síntese corresponde à mistura de material mencionada antes, utilizada para iniciar a reacção para produzir di-hidrodaidzeina. Além disso, as concentrações do polipéptido El, NADPH e/ou NADH e daidzeina na composição e a dos outros componentes que podem ser associados à composição do material inicial de síntese são utilizadas essencialmente como no sistema de reacção (uma mistura de materiais iniciais no início da reacção) no processo de produção mencionado antes. A presente invenção também tem por objecto um estojo para a síntese de di-hidrodaidzeina, especificamente, um estojo para a síntese de di-hidrodaidzeina incluindo (Ai) o polipéptido El, (Aii) NADPH e/ou NADH, e (Aiii) daidzeina. Adicionalmente, a presente invenção tem por objecto um estojo para a síntese de di-hidrodaidzeina, especificamente, um estojo para a síntese de di-hidrodaidzeina incluindo (Ai) o polipéptido El, (Aii) NADPH e/ou NADH, (Aiii) daidzeina e (Aiv) Mn2+ e/ou Fe2+. Os componentes podem eventualmente estar armazenados separadamente no estojo de síntese de modo a permitir uma síntese apropriada de di-hidrodaidzeina a partir de daidzeina, nas condições anteriores. 0 estojo de síntese 43 pode incluir ainda um tampão, conforme necessário. 0 estojo de sintese pode também incluir quaisquer ferramentas necessárias ou manuais de operação que ajudem a realizar a sintese da di-hidrodaidzeina. A-7. Composição da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína A presente invenção também tem por objecto uma composição enzimática para a síntese de di-hidrodaidzeína incluindo o polipéptido EI. A composição enzimática pode ser utilizada apropriadamente como uma enzima de síntese de di-hidrodaidzeína no processo de produção de di-hidrodaidzeína utilizando o polipéptido El. A composição enzimática pode ser um polipéptido El impuro purificado ou a composição enzimática pode ser um polipéptido El impuro purificado formulado com um suporte apropriado. A proporção de polipéptido El na composição enzimática não está particularmente limitada desde que a composição possa ser utilizada como uma enzima que sintetiza a di-hidrodaidzeína, no processo de produção da di-hidrodaidzeína. Especificamente, o teor de polipéptido El é, por exemplo, de 0,001 a 20,0 % em peso, preferencialmente, de 0,005 a 5,0 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,01 a 1,0 % em peso, em relação ao peso total da composição enzimática. A composição enzimática pode incluir NADPH e/ou NADH, que actua como uma co-enzima do polipéptido El. Quando contida na composição enzimática, a proporção de NADPH e/ou NADH, embora não esteja particularmente limitada, é de 0,0005 a 25,0 % em peso, preferencialmente, de 0,005 a 5,0 % em peso 44 e, mais preferencialmente, de 0,01 a 2,5 % em peso, em relação ao peso total da composição enzimática.

Além disso, preferencialmente, a composição enzimática pode incluir Mn2+ e/ou Fe2+. Quando contida na composição enzimática, a proporção de Mn2+ e/ou Fe2+ não está particularmente limitada desde que a actividade enzimática de síntese de di-hidrodaidzeína do polipéptido EI possa ser activada. A proporção de Fe2+ é, preferencialmente, de 2 mM ou mais, mais preferencialmente, de 2 mM a 100 mM e ainda mais preferencialmente, de 10 mM a 40 mM, em relação ao peso total da composição. A proporção de Mn2+ é, preferencialmente, 0,2 μΜ ou mais, mais preferencialmente, 0,2 μΜ a 100 mM e, ainda mais preferencialmente, 1,0 μΜ a 40 mM, em relação ao peso total da composição.

Para melhorar a estabilidade do polipéptido, a composição enzimática deve incluir ainda antioxidantes, tais como, sulfito, ácido ascórbico, α-tocoferol e cisteína, para além do polipéptido El. Além disso, para assegurar que a enzima fica preservada na composição, a composição enzimática pode incluir conservantes, tais como, p-hidroxibenzoatos, clorobutanol, álcool benzílico, álcool 2-feniletílico, ácido desidroacético e ácido sórbico, conforme necessário. A-8. Processo de produção de di-hidrodaidzeína utilizando células recombinantes A presente invenção tem por objecto um processo de produção de di-hidrodaidzeína utilizando células recombinantes incluindo o polinucleótido El. Especificamente, no processo de produção, a daidzeína é convertida em di-hidrodaidzeína, por meio da acção da célula recombinante sobre a daidzeína. 45 A reacção utilizada no processo de produção realiza-se em condições que permitem que a célula recombinante sobreviva e a daidzeina seja convertida em di-hidrodaidzeina.

Especificamente, adicionam-se quantidades apropriadas de células recombinantes e de daidzeina e faz-se a cultura num meio que permite o crescimento das células recombinantes. 0 meio utilizado no processo de produção selecciona-se apropriadamente entre os vários tipos de meios convencionais, de acordo com o tipo de células utilizadas como células recombinantes hospedeiras. 0 meio pode ser complementado com quantidades apropriadas de inibidores de protease, tais como, PMSF e EDTA, se for necessário, além disso, considerando que o polipéptido deriva de bactérias anaeróbicas, podem também ser adicionadas quantidades apropriadas de agentes redutores, tais como, DTT, 2ME, DET e Na2S2C>4. Quando se utiliza a célula recombinante, o meio pode ser complementado com NADPH e/ou NADH conforme necessário, embora não seja essencial. Além disso, o meio pode ser complementado com Mn2+ e/ou Fe2+.

Especificamente, realiza-se o processo de produção como se segue. Em primeiro lugar, inoculam-se as células recombinantes em meio contendo de 0,001 a 1 % em peso, preferencialmente, de 0,01 a 1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,01 a 0,5 % em peso de daidzeina e faz-se a incubação da cultura em condições de temperatura permissiveis, durante 6 a 30 horas, preferencialmente, de 7 a 24 horas e, mais preferencialmente, de 7 a 18 horas. A presente invenção também tem por objecto uma mistura de materiais para a síntese de di-hidrodaidzeina, 46 especificamente, uma composição de material de sintese de di-hidrodaidzeína contendo (Aiv) a célula recombinante e (Aiii) daidzeina. Por meio da cultura da composição da material de sintese, nas condições mencionadas antes, a di-hidrodaidzeina na composição pode ser convertida em di-hidrodaidzeina. A composição corresponde à mistura de material inicial mencionada antes utilizada para iniciar a reacção para produzir di-hidrodaidzeina. Além disso, as concentrações da célula recombinante e da daidzeina na composição e outros componentes que podem ser adicionados à composição de material de inicial de sintese, são essencialmente as das condições utilizadas nos processos de produção anteriores. A presente invenção também tem por objecto um estojo para a sintese de di-hidrodaidzeina, especificamente, um estojo de sintese de di-hidrodaidzeina incluindo (Aiv) a célula recombinante e (Aiii) daidzeina. Adicionalmente, a presente invenção tem por objecto um estojo para a sintese de di-hidrodaidzeina, especificamente, um estojo para a sintese de di-hidrodaidzeina incluindo (Aiv) a célula recombinante, (Aiii) daidzeina e (Aiv) Mn2+ e/ou Fe2+. 0 estojo de sintese pode incluir a célula recombinante e a daidzeina separadamente, se necessário, de modo a permitir, de forma conveniente, a sintese a partir da daidzeina, nas condições mencionadas antes. 0 estojo de sintese pode ainda incluir um tampão ou um meio, conforme necessário. 0 estojo de sintese pode também incluir quaisquer ferramentas necessárias ou manuais de operação que ajudem a realizar a sintese da di-hidrodaidzeina .

As células recombinantes incluídas no estojo de síntese podem ser conservadas por processos conhecidos. Há um certo número de técnicas de preservação de células recombinantes que são conhecidas. Por exemplo, há um processo em que as 47 células recombinantes são preservadas de 4 a 25 °C depois de terem sido tratadas com um agente de liofilização para fazer o vácuo na ampola de armazenagem das células recombinantes no seio de um dissolvente, tal como, dimetilformamida. Outro exemplo é um processo que utiliza azoto liquido, em que as células são suspensas num meio de conservação complementado com glicerol a 10 % e são então armazenadas numa ampola especifica e mantidas num tanque de azoto liquido (de -150 a - 196 °C). A-9. Anticorpo com afinidade para o polipéptido A presente invenção também tem por objecto um anticorpo (um anticorpo IgG) com afinidade com o polipéptido El. O anticorpo monoclonal pode ser preparado por um processo normal. Especificamente, pode-se utilizar o processo descrito por Harlow, H. e Lane, D. em Antibody: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., New York, pp. 139-240 (1988) . O anticorpo policlonal também pode ser preparado por um processo comum. Especificamente, pode-se utilizar o processo descrito por, por exemplo, em Cell Engineering Experiment Protocol, Department of Oncology, The Institute of Medicai Science, The University of Tokyo, 1992, pp. 155-173. 0 anticorpo policlonal IgG e o anticorpo monoclonal IgG podem ser purificados por processos comuns, tais como, um processo de precipitação em amónio e ácido sulfúrico e uma cromatografia em proteina A. 48 A-10. Processo imunológico para a detecção e a medição do polipéptido A presente invenção também tem por objecto um processo imunológico para a detecção ou a medição do polipéptido EI utilizando o anticorpo. Especificamente, o processo imunológico é realizado fazendo o anticorpo contactar com uma amostra de ensaio. Mais especificamente, o polipéptido, na amostra de ensaio, pode ser detectado ou medido como se segue. Em primeiro lugar, faz-se o anticorpo contactar com uma amostra de ensaio para verificar a presença do polipéptido EI na amostra de ensaio. Se estiver presente, o anticorpo liga-se especificamente ao polipéptido El. Depois, o anticorpo ligado ao polipéptido El é detectado e, eventualmente, quantificado. A amostra de ensaio aqui referida é uma amostra utilizada para a detecção ou a medição do polipéptido El. Como se espera que o polipéptido El exista em células procarióticas bacterianas, o processo imunológico é apropriado para a detecção e a medição do polipéptido El que resida nas células procarióticas bacterianas. Na detecção e medição do polipéptido El na célula, pode preparar-se a amostra de ensaio a partir de células desagregadas ou células submetidas a uma purificação de proteínas após a desagregação.

As técnicas para detectar ou medir um polipéptido-alvo pelo processo imunológico, utilizando o anticorpo, são conhecidas e será óbvio para um especialista na matéria fixar de forma apropriada várias condições adequadas para o processo imunológico. Por exemplo, pode utilizar-se, nas condições fixadas de forma apropriada, processos, tais como, radio-imuno-ensaio e ensaio por ELISA. 49 A presente invenção também tem por objecto um estojo de detecção imunológica que inclui o anticorpo utilizado para a detecção ou a mediação do polipéptido El. 0 estojo de detecção pode também incluir, se necessário, um padrão do polipéptido El. 0 estojo de detecção pode ainda incluir, se necessário, reagentes adicionais que facilitam uma detecção fácil do polipéptido El nas condições anteriores. 0 estojo de detecção pode também incluir quaisquer ferramentas ou manuais de operação necessários que facilitem uma detecção fácil do polipéptido El. A-ll. Processo para a detecção ou a medição de polinucleótidos que codificam o polipéptido A presente invenção também tem por objecto um processo para a detecção ou a medição do polinucleótido El. Especificamente, o processo realiza-se fazendo com que uma sonda de ligação ao polinucleótido El contacte com uma amostra de ensaio. Para ser mais especifico, o polinucleótido El na amostra de ensaio pode ser detectado ou medido como se segue. Em primeiro lugar, faz-se a sonda contactar com uma amostra de ensaio para hibridar com a amostra de ensaio, o que ocorre quando um polinucleótido El está presente na amostra de ensaio. Depois, detecta-se a presença ou a ausência da hélice dupla e, se a hélice dupla estiver presente, eventualmente é quantificada. A amostra de ensaio aqui referida é uma amostra utilizada para a detecção ou a medição do polinucleótido El. Como se espera que o polinucleótido El exista em células procarióticas bacterianas, o processo é apropriado para a detecção e a medição do polinucleótido El que resida nas células procarióticas bacterianas. Na detecção e na medição do polinucleótido El na célula, pode preparar-se a amostra de 50 ensaio a partir de células desagregadas ou células submetidas a uma purificação com ácido nucleico após a desagregação. A sonda utilizada no processo tem uma sequência de nucleótidos que pode hibridar com o polinucleótido em condições severas. Tal como se utiliza aqui, "condições severas" descreve, por exemplo, condições comuns a sondas e a iniciadores e, especificamente, as condições descritas antes na secção A-2. A sonda pode ser sintetizada quimicamente com base na informação referente à sequência de nucleótidos do polinucleótido EI (por exemplo, a sequência de nucleótidos das SEQ ID N°. 4, 5 ou 6) ou pode ser um polinucleótido EI produzido previamente ou um fragmento do polinucleótido El. A sonda pode ser marcada ou não marcada, embora se utilizem normalmente sondas marcadas. Além disso, quando se utiliza a sonda como um iniciador de RCP (um iniciador directo ou um iniciador inverso), o comprimento da sonda é, por exemplo, de cerca de 10 a 40 nucleótidos e, preferencialmente, de cerca de 20 a 30 nucleótidos.

Exemplos de processos que detectam especificamente o polinucleótido incluem: hibridação em placa, hibridação em colónias, análise de "Southern blotting", análise de "Northern blot" e o processo de RCP. Do ponto de vista da sensibilidade, é preferível utilizar um processo de RCP que utiliza as sondas como iniciadores para amplificar parte ou todo o polinucleótido El. O processo de RCP pode ser, por exemplo, um processo de RCP-TI ou vários tipos de variantes destes processos utilizados na técnica. O processo de RCP pode ser utilizado para ensaiar a presença e a quantidade do polinucleótido El. 51

Exemplo desses processos de RCP incluem um ensaio comparativo, tal como, MSSA (Kinoshita, M., et al., CCA, 228, 83-90 (1994)) e o processo de RCP-SSCP, que é um processo conhecido para detectar mutações com base nas alterações da mobilidade no ADN de hélice única, devidas às diferentes estruturas de ordem superior (Orita, M., et al·, Genomics, 5, 874-879 (1989)). A presente invenção também por objecto um estojo para detectar ou medir o polinucleótido El, especificamente um estojo de detecção do polinucleótido El que inclui a sonda. Para facilitar a detecção do polinucleótido El, nas condições mencionadas antes, o estojo de detecção pode incluir ainda reagentes adicionais ou similares, se necessário, para além da sonda. Além disso, o estojo de detecção pode ser utilizado para identificar células que contenham o polinucleótido El. Do ponto de vista de permitir uma detecção precisa, o estojo de detecção pode ser fornecido, preferencialmente, como um estojo para a realização da detecção utilizando uma RCP. B: Enzima de síntese da tetra-hidrodaidzeína B-l. Polipéptido A presente invenção tem por objecto um polipéptido (daqui para a frente referido como "polipéptido E2") para a síntese de tetra-hidrodaidzeína, utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeína. Especificamente, a presente invenção tem por objecto: (Ba) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7; (Bb) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 com a substituição, 52 eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeína utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeína; e (Bc) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°. 7 e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeina.

No polipéptido (Bb), o intervalo de "um ou mais aminoácidos" não está particularmente limitado desde que o polipéptido tenha actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeina. Por exemplo, o intervalo é de 1 a 50, preferencialmente, de 1 a 30, mais preferencialmente, de 1 a 15, mais preferencialmente, de 1 a 5, ainda preferencialmente, de 1 a 4, ainda mais preferencialmente, de 1 a 3 e, particularmente preferido, de 1 ou 2.

Exemplos do polipéptido (Bb) incluem um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 e um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9. Comparada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7, a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 contém dois aminoácidos substituídos e uma sequência de aminoácidos com 24 aminoácidos no terminal N. Comparada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7, a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9 contém 20 aminoácidos substituídos e perde um aminoácido. A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 corresponde ao polipéptido da enzima E2 da estirpe E-23-15 de Bacteroides ovatus (FERM BP-6435). A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°, 9 corresponde ao polipéptido da enzima E2 da estirpe A6G-225 de Streptococcus constellatus (FERM BP-6437). 53

No polipéptido (Bb) , a substituição, eliminação, inserção ou adição de aminoácidos pode ser feita como uma substituição, eliminação, inserção ou adição normais de aminoácidos no polipéptido El, descritas na secção A-l. E preferível que a substituição, eliminação, inserção ou adição do aminoácido no polipéptido (Bb) ocorra em regiões em que a alteração do aminoácido não tenha grandes efeitos nas estruturas de ordem superior do polipéptido ou em que a alteração não afecte adversamente o centro activo da enzima que sintetiza tetra-hidrodaidzeina. Exemplos dessas regiões incluem regiões pouco conservadas entre as sequências de aminoácidos das SEQ ID N°s. 7, 8 e 9 e na sua vizinhança e na região do terminal N ou na região do terminal C. Exemplos específicos incluem valina na posição 7, prolina na posição 8, valina na posição 26, leucina na posição 36, arginina na posição 46, ácido aspártico na posição 94, ácido glutâmico na posição 101, glicina na posição 126, isoleucina na posição 137, glutamina na posição 156, lisina na posição 157, ácido aspártico na posição 159, alanina nas posições 160 e 171, cisteina na posição 185, serina na posição 221, alanina na posição 233, valina na posição 241, serina na posição 258, isoleucina na posição 266 e valina na posição 286, na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7; e regiões adjacentes destes aminoácidos. A "região adjacente" significa uma região em que a actividade da enzima de síntese de tetra-hidrodaidzeina não é afectada. Exemplos das referidas regiões incluem as que estão dentro dos cinco aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados antes, preferencialmente, dentro dos quatro aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados antes, mais preferencialmente, dentro dos três aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados antes, ainda mais preferencialmente, dentro dos dois aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados antes, particularmente preferido, 54 dentro de um aminoácido de um dos aminoácidos exemplificados antes.

Na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7, a sequência dos aminoácidos nas posições 38 a 45 é considerada como correspondendo ao dominio de ligação de NADPH. De acordo com isto, desde que as funções do dominio não estejam inibidas, pode haver substituições, eliminações, inserções ou adições de um aminoácido arbitrário, na sequência. Contudo, prefere-se que não sejam mutadas a treonina na posição 38, a glicina na posição 39, a glicina na posição 43 e a glicina na posição 45. Quando a sequência contém uma ou mais substituições, eliminações, inserções ou adições de aminoácidos, o número de aminoácidos mutados, preferencialmente, não é superior a quatro, mais preferencialmente, não é superior a três, ainda mais preferencialmente, não é superior a dois e, mais preferencialmente, é que seja de um.

Na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7, a sequência dos aminoácidos nas posições 115 a 118 é considerada como correspondendo à familia SDR entre os elementos altamente conservados. Quando a sequência tem uma ou mais substituições, eliminações, inserções ou adições de aminoácidos na sequência, o número de aminoácidos mutados, preferencialmente, não é superior a três, mais preferencialmente, não é superior a dois e, ainda mais preferencialmente, é de um. 0 mais preferido é que não haja nenhuma mutação na sequência.

Na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7, considera-se que serina na posição 168, histidina na posição 182 e lisina na posição 186 estão associadas com o centro de actividade da enzima E2. De acordo com isto, desde que a actividade enzimática não esteja inibida, podem substituir-se 55 três aminoácidos arbitrários por outros aminoácidos. Contudo, é preferível que estes aminoácidos não sejam mutados.

Na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7, a sequência dos aminoácidos nas posições 212 a 217 é considerada como estando associada com a ligação a co-factores. De acordo com isto, desde que a função não esteja inibida, pode haver substituição, eliminação, inserção ou adição de um amino-ácido arbitrário na sequência. Contudo, prefere-se que não sejam mutadas a prolina na posição 212, a glicina na posição 213 e a treonina na posição 217. Quando a sequência tem uma ou mais substituições, eliminações, inserções ou adições de aminoácidos, o número de aminoácidos mutados, preferencialmente, não é superior a três, mais preferencialmente, não é superior a dois e, ainda mais preferencialmente, é de um. Particularmente preferido é que não haja mutação na sequência. Num alinhamento, que indica as regiões das sequências de aminoácidos com possíveis funções, tal como as descritas antes, está ilustrado na fig. 28.

No polipéptido (Bc), a sequência de aminoácidos tem, por exemplo, 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7. Contudo, é preferível que essa sequência de aminoácidos tenha geralmente 80 % ou mais, preferencialmente, 85 % ou mais, mais preferencialmente, 90 % ou mais, ainda preferencialmente, 95 % ou mais, ainda mais preferencialmente, 98 % ou mais e, particularmente preferido, 99 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7.

Especif icamente, o polipéptido (Bc) pode ser um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 ou um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9. A identidade de aminoácidos 56 entre a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 e a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 é de 99,3 % (Blast2). A identidade de aminoácidos entre a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 e a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°, 9 é de 93,0 % (Blast2). De acordo com isto, numa modalidade preferida da presente invenção, o polipéptido (Bc) contém uma sequência de aminoácidos com 93,0 % ou mais e, mais preferencialmente, 99,3 % de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7.

No que respeita aos polipéptidos (Bb) e (Bc), a actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeína utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeina pode ser confirmada como se segue. Em primeiro lugar, adiciona-se um polipéptido de interesse a uma solução de substrato da composição que se segue, a uma concentração de 0,001 mg/mL. Depois, faz-se a incubação da solução a 37 °C, durante 2 horas, para verificar a presença ou a ausência de tetra-hidrodaidzeína na solução. A presença de tetra-hidrodaidzeína na solução, após incubação, é utilizada como um indicador da actividade do polipéptido para sintetizar tetra-hidrodaidzeína, utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeina.

Composição da solução de substrato

Tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0)

PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) 1 mM

Ditiotreitol 2 mM

Hidrossulfito de sódio 5 mM

NADPH 2 mM

NADH 2 mM

Di-hidrodaidzeina 40 μΜ 57

Propriedades da enzima

Dado que o polipéptido E2 tem uma actividade enzimática para sintetizar tetra-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeina, o polipéptido E2 também é referido como enzima E2. A enzima E2 requer NADPH ou NADH como co-enzima. A temperatura óptima da enzima E2 está na vizinhança de 37 °C e o pH óptimo é de 4,5. A enzima E2 pode sintetizar não só tetra-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeína, mas também sintetiza di-hidrodaidzeina a partir de tetra-hidrodaidzeina, como uma reacção inversa.

De forma semelhante ao polipéptido El, o polipéptido E2 pode ser produzido por técnicas de engenharia genética com base na informação da sequência de nucleótidos das SEQ ID N°. 10, 11 ou 12. Além disso, podem utilizar-se processos comuns na sintese química para produzir o polipéptido E2, com base na informação da sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 7, 8 ou 9. O polipéptido E2 pode também ser produzido por isolamento e purificação a partir de microrganismos capazes de o produzir. Estes processos podem ser realizados de acordo com a descrição na secção A-l anterior. O microrganismo capaz de produzir o polipéptido E2 pode ser posto em cultura num meio contendo uma quantidade desejada de di-hidrodaidzeina e, adicionalmente, o polipéptido E2 pode também ser produzido desta forma em microrganismos capazes de produzir o polipéptido E2. O polipéptido E2 pode ser monomérico ou dimérico ou polimérico, desde que sintetize tetra-hidrodaidzeina. Além disso, para melhorar a estabilidade e outras características, 58 o polipéptido Ε2 pode ser modificado, conforme necessário, por adição de polietileno-glicol ou de uma cadeia de açúcar. 0 polipéptido E2 pode servir como um catalisador que converte a di-hidrodaidzeína (um substrato) em tetra-hidro-daidzeína. A tetra-hidrodaidzeína é ainda convertida em equol por meio da enzima de sintese de equol conforme se descreve a seguir. Crê-se que o equol exibe várias actividades fisiológicas no corpo. Por este motivo, o polipéptido E2 capaz de providenciar o material para a sintese de equol, é considerado importante. A presente invenção tem por isso por objectivo uma enzima que sintetiza tetra-hidrodaidzeína incluindo qualquer um dos polipéptidos de (Ba) a (Bc). B-2. Polinucleótido A presente invenção também tem por objecto um polinucleótido (daqui para a frente também referido como "polinucleótido E2"), que codifica um polipéptido que tem uma actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeína utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína. Especificamente, a presente invenção tem por objecto: (Bd) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 10; (Be) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7; e (Bf) um polinucleótido que híbrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Bd) ou (Be) e que codifica um polipéptido que tem actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeína, utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeína. 59 A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 corresponde à sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 10. A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 corresponde à sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 11. A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 9 corresponde à sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 12.

No que respeita ao polinucleótido (Bf), a expressão "híbrida em condições severas" é sinónima da expressão "híbrida em condições severas" referida na secção A-2. Exemplos de polinucleótidos (Bf) incluem a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 11 e a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 12. A homologia da sequência de bases entre a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 10 e a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 11 é de 99,7 % (Blast2) . A homologia da sequência de bases entre a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 10 e a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 12 é de 91,0 % (Blast2) . De acordo com isto, numa modalidade preferida da presente invenção, um polinucleótido (Bf) compreende uma sequência de bases com 91,0 % de homologia e, mais preferencialmente, 99,7 % de homologia com a sequência de bases da SEQ ID N°. 10.

No que respeita ao polinucleótido (Bf), a "actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina, utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína" pode ser confirmada pelo mesmo processo utilizado para os polipéptidos (Bb) e (Bc). O polinucleótido E2 pode ser produzido ou obtido por processos de síntese química ou por técnicas de engenharia genética, com base na informação da sequência das SEQ ID N°s. 10, 11 e 12. Especificamente, podem utilizar-se os processos 60 descritos na secção A-2 para o polinucleótido El. 0 processo pode ser modificado ou alterado, se necessário. A fonte de ADNc do polinucleótido E2 não está particularmente limitada desde que seja um microrganismo que expressa o polinucleótido E2. Exemplos específicos incluem microrganismos capazes de produzir equol, preferencialmente, bactérias de ácido láctico, bactérias pertencentes aos géneros Bacteroides e Streptococcus capazes de produzirem equol, mais preferencialmente, Lactococcus garvieae, Bacteroides ovatus e Streptococcus constellatus capazes de produzirem equol, ainda preferencialmente, Lactococcus garvieae fecal capaz de produzir equol e, particularmente preferida é a estirpe 20-92 de Lactococcus, a estirpe E-23-15 de Bacteroides ovatus, a estirpe A6G-225 de Streptococcus constellatus (FERM BP-10036, FERM BP-6435 e FERM BP-6437, respectivamente; depositadas no Organismo Internacional de Depósito de Patentes, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão), estirpes de Lactococcus garvieae fecal capazes de produzirem equol. A expressão do polinucleótido E2, utilizando técnicas comuns de engenharia genética, permite facilmente a produção em massa e estável do produto polinucleotídico (o polipéptido). O isolamento, com sucesso, do polinucleótido E2 irá abrir a porta para a produção industrial de equol sem utilizar as estirpes bacterianas anaeróbicas difíceis de manusear, utilizadas tradicionalmente para a produção de equol. 61 B-3. Vector de expressão 0 vector de expressão da presente invenção não está particularmente limitado desde que inclua o polinucleótido E2 e é capaz de expressar o polinucleótido E2. Geralmente, selecciona-se de forma apropriada, de acordo com o tipo de célula hospedeira, semelhante ao vector de expressão que inclui o polinucleótido El. Especificamente, pode-se utilizar a célula hospedeira descrita na secção A-3. B-4. Célula recombinante A presente invenção tem por objecto uma célula recombinante (transformante) transformada com um vector de expressão que inclui o polinucleótido E2. A célula hospedeira utilizada para célula recombinante pode ser uma das descritas na secção A-4, sem limitação. Além disso, pode-se introduzir o vector de expressão na célula hospedeira pelo processo descrito na secção A-4.

Como a célula recombinante é capaz de produzir o polipéptido E2 (uma enzima que converte a tetra-hidrodaidzeína) , pode ser utilizada para produzir uma enzima que converte a tetra-hidrodaidzeina. A célula recombinante também pode ser utilizada para produzir a tetra-hidrodaidzeina numa forma de célula. B-5. Produção de polipéptido utilizando uma célula recombinante 0 polipéptido E2 pode ser produzido por cultura de uma célula recombinante na qual se introduz um polinucleótido E2 e se recolhe o polipéptido E2 da célula e da cultura. As 62 células recombinantes podem ser postas em cultura de acordo com a descrição da secção A-5. B-6. Produção de tetra-hidrodaidzeína utilizando o poli-péptido E2 A presente invenção tem por objecto um processo para a produção de tetra-hidrodaidzeína utilizando o polipéptido E2. No processo de produção, a di-hidrodaidzeína pode ser convertida em tetra-hidrodaidzeína fazendo o polipéptido E2 actuar sobre di-hidrodaidzeína, na presença de NADPH e/ou NADH. A reacção utilizada no processo de produção pode ser realizada num tampão apropriado tal como um dos tampões descritos na secção A-6. A reacção utilizada no processo de produção realiza-se em condições tais que, por exemplo, adiciona-se cada componente ao meio com as concentrações do intervalo que se mostra a seguir, no início da reacção, de modo a preparar uma mistura. Faz-se a incubação da mistura durante 0,5 a 10 horas, preferencialmente, 1 a 6 horas e, mais preferencialmente, 2 a 4 horas, a temperaturas que não alteram nem inactivam os materiais iniciais, incluindo o polipéptido E2 e di-hidrodaidzeína e o produto, incluindo a tetra-hidrodaidzeína. A temperatura da reacção não está particularmente limitada. Por exemplo, quando a temperatura da reacção é 0 °C ou menos, a reacção utiliza, por exemplo, um tampão que não congela a essas temperaturas de reacção. A temperatura da reacção é, por exemplo, preferencialmente, de 0 a 45 °C e, mais preferencialmente, de 0 a 37 °C. No que respeita à tetra-hidrodaidzeína, o composto existe quer na forma eis quer na forma trans. Contudo, a formação das 63 configurações cis e trans podem ser controladas fazendo variar as condições da reacção, tais como, a temperatura da reacção e o tempo de reacção. Por exemplo, pode-se produzir uma mistura de tetra-hidrodaidzeinas cis e trans fixando a temperatura da reacção em 0 °C ou a reacção pode ser controlada para favorecer a forma trans fixando a temperatura de reacção em 37 °C. A concentração de cada um dos componentes no processo de produção anterior é a seguinte. 0 teor de polipéptido E2 é de 0,0001 a 1,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0, 001 a 0,01 % em peso; e o teor de di-hidrodaidzeina é de 0,0001 a 10,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 1,0 % em peso e, mais preferencialmente, de 0, 001 a 0,1 % em peso; e o teor de NADPH e/ou de NADH é de 0,01 a 5 % em peso, preferencialmente, de 0,05 a 1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,1 a 0,5 % em peso. A presente invenção também tem por objecto uma mistura de material para a sintese de tetra-hidrodaidzeina, especificamente, uma composição para a sintese de tetra-hidrodaidzeina incluindo (Bi) o polipéptido E2, (Bii) NADPH e/ou NADH e (Biii) di-hidrodaidzeina. Por incubação da composição, nas condições mencionadas antes, a di-hidrodaidzeina contida na composição do material inicial da sintese pode ser convertida em tetra-hidrodaidzeina. A composição corresponde à mistura do material inicial mencionada antes, utilizada para iniciar a reacção para produzir tetra-hidrodaidzeina. Além disso, as concentrações do polipéptido E2, de NADPH e/ou de NADH e a di-hidrodaidzeina na composição e os outros componentes que podem ser 64 associados à composição do material inicial de síntese são utilizadas essencialmente como no sistema de reacção (uma mistura de materiais iniciais no início da reacção) no processo de produção mencionado antes. A presente invenção também tem por objecto um estojo para a síntese de tetra-hidrodaidzeína, especificamente, um estojo para a síntese de tetra-hidrodaidzeína incluindo (Bi) o polipéptido E2, (Bii) NADPH e/ou NADH e (Biii) a di-hidro-daidzeína. 0 estojo de síntese pode incluir os componentes em compartimentos, conforme necessário, de modo a permitir que se faça, de forma conveniente, a síntese de tetra-hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeína a partir das condições anteriores. 0 estojo de síntese pode ainda incluir, se necessário, um tampão. 0 estojo de síntese pode também incluir quaisquer ferramentas ou manuais de operação necessários para ajudar a realizar a síntese de tetra-hidrodaidzeína. B-7. Composição da enzima de síntese de tetra-hidrodaidzeína A presente invenção também tem por objecto uma composição enzimática para a síntese de tetra-hidrodaidzeína incluindo o polipéptido E2. A composição enzimática pode ser utilizada apropriadamente como uma enzima de síntese de tetra-hidrodaidzeína no processo de produção de tetra-hidrodaidzeína utilizando o polipéptido E2. A composição enzimática pode ser um polipéptido E2 impuro purificado ou a composição enzimática pode ser um polipéptido E2 impuro purificado ou um polipéptido E2 purificado formulado com um suporte apropriado. 0 suporte não tem qualquer efeito adverso sobre a actividade do polipéptido E2 e é utilizado numa quantidade apropriada. 65 A proporção de polipéptido E2 na composição enzimática não está particularmente limitada desde que a composição possa ser utilizada como uma enzima que sintetiza a tetra-hidrodaidzeína, no processo de produção da tetra-hidro-daidzeína. Especificamente, o teor de polipéptido E2 é, por exemplo, de 0,001 a 20,0 % em peso, preferencialmente, 0,005 a 5,0 % em peso e, mais preferencialmente, 0,01 a 1,0 % em peso, em relação ao peso total da composição enzimática. A composição enzimática pode incluir NADPH e/ou NADH, que actua como uma co-enzima do polipéptido E2. Quando contida na composição enzimática, a proporção de NADPH e/ou NADH, embora não esteja particularmente limitada, é de 0,005 a 50,0 % em peso, preferencialmente, de 0,05 a 10,0 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,1 a 5,0 % em peso, em relação ao peso total da composição enzimática.

Para melhorar a estabilidade do polipéptido e/ou para assegurar a conservação da composição enzimática, a composição enzimática deve incluir vários antioxidantes e conservantes descritos na secção A-7, para além do polipéptido E2. B-8. Processo de produção de tetra-hidrodaidzeína utilizando células recombinantes A presente invenção tem por objecto um processo de produção de tetra-hidrodaidzeína utilizando células recombinantes incluindo o polinucleótido E2. Especificamente, no processo de produção, a di-hidrodaidzeína é convertida em tetra-hidrodaidzeína, por meio da acção da célula recombinante sobre a di-hidrodaidzeína. 66 A reacção utilizada no processo de produção realiza-se em condições que permitem que a célula recombinante sobreviva e a di-hidrodaidzeina seja convertida em tetra-hidro-daidzeína.

Especificamente, adicionam-se quantidades apropriadas de células recombinantes e de di-hidrodaidzeina e faz-se a cultura num meio que permite o crescimento das células recombinantes. 0 meio utilizado no processo de produção selecciona-se, apropriadamente, entre vários tipos de meios convencionais, de acordo com o tipo de células utilizadas como células recombinantes hospedeiras. 0 meio pode ser complementado com quantidades apropriadas de inibidores de protease, tais como, PMSF e EDTA, se for necessário. Além disso, considerando que o polipéptido deriva de bactérias anaeróbicas, podem também ser adicionadas quantidades apropriadas de agentes redutores, tais como, DTT, 2ME, DET e Na2S204. Quando se utiliza a célula recombinante, o meio pode ser complementado com NADPH e/ou NADH, conforme necessário, embora não seja essencial.

Especificamente, realiza-se o processo de produção como se segue. Em primeiro lugar, inoculam-se as células recombinantes em meio contendo de 0,001 a 1 2-± 15 em peso, preferencialmente, de 0,01 a LO O % em peso e, mais preferencialmente, de 0,01 a 0,1 % em peso de di- hidrodaidzeina e faz-se a incubação da cultura, em condições de temperatura permissiveis, durante 7 a 30 horas, preferencialmente, 15 a 24 horas e, mais preferencialmente, 17 a 20 horas. As condições de temperatura permissiveis não estão particularmente limitadas e são praticamente as da 67 secção B-6 anterior, sob o titulo "Produção de tetra-hidrodaidzeina utilizando o polipéptido E2". A presente invenção também tem por objecto uma mistura de materiais para a síntese de tetra-hidrodaidzeína, especificamente, uma composição de material de síntese de tetra-hidrodaidzeína contendo (Biv) a célula recombinante e (Biii) di-hidrodaidzeína. Por meio da cultura da composição, nas condições mencionadas antes, a di-hidrodaidzeína na composição pode ser convertida em tetra-hidrodaidzeína. A composição corresponde à mistura de material inicial mencionada antes utilizada para iniciar a reacção para produzir tetra-hidrodaidzeína. Além disso, as concentrações da célula recombinante e de di-hidrodaidzeína na composição do material inicial de síntese e outros componentes podem ser adicionados à composição de material de inicial de síntese, estão essencialmente nas condições utilizadas nos processos de produção anteriores. A presente invenção também tem por objecto um estojo para a síntese de tetra-hidrodaidzeína, especificamente, um estojo de síntese de tetra-hidrodaidzeína incluindo (Biv) a célula recombinante e (Biii) di-hidrodaidzeína. 0 estojo de síntese pode incluir a célula recombinante e di-hidrodaidzeína separadamente, se necessário, de modo a permitir, de forma conveniente, a síntese de tetra-hidrodaidzeína a partir da di-hidrodaidzeína, nas condições mencionadas antes. 0 estojo de síntese pode ainda incluir um tampão ou um meio, conforme necessário. 0 estojo de síntese pode também incluir quaisquer ferramentas ou manuais de operação necessários que ajudem a realizar a síntese da tetra-hidrodaidzeína.

As células recombinantes incluídas no estojo de síntese podem ser conservadas por processos conhecidos. Há um certo 68 número de técnicas conhecidas de preservação de células recombinantes. Por exemplo, há um processo em que as células recombinantes são preservadas entre 4 e 25 °C, depois de terem sido tratadas com um agente de liofilização para fazer o vácuo na ampola de armazenagem das células recombinantes no seio de um dissolvente, tal como, dimetilformamida. Outro exemplo é um processo que utiliza azoto liquido, em que as células são suspensas num meio de conservação complementado com glicerol a 10 %, que é então armazenado numa ampola especifica e mantido num tanque de azoto liquido (de -150 a - 196 °C). B-9. Anticorpo com afinidade para o polipéptido A presente invenção também tem por objecto um anticorpo (um anticorpo IgG) com afinidade com o polipéptido E2. 0 anticorpo monoclonal e o anticorpo policlonal podem ser preparados por um processo comum. Especificamente, estes anticorpos podem ser preparados pelos processos descritos na secção A-9. B-10. Processo imunológico para a detecção ou a medição do polipéptido A presente invenção também tem por objecto um processo imunológico para a detecção ou a medição do polipéptido E2 utilizando o anticorpo. Especificamente, o processo imunológico pode ser realizado de acordo com o processo descrito na secção A-10. A presente invenção também tem por objecto um estojo de detecção imunológica que inclui o anticorpo utilizado para a detecção ou a mediação do polipéptido E2. O estojo de 69 detecção pode também incluir um padrão do polipéptido E2, se necessário. 0 estojo de detecção pode ainda incluir, se necessário, reagentes adicionais que facilitam uma detecção fácil do polipéptido E2, nas condições anteriores. 0 estojo de detecção pode também incluir quaisquer ferramentas ou manuais de operação necessários que facilitem uma detecção fácil do polipéptido E2. B-ll. Processo para a detecção ou a medição de polinucleótidos que codificam o polipéptido A presente invenção também tem por objecto um processo para a detecção ou a medição do polinucleótido E2. Especificamente, o processo realiza-se fazendo com que uma sonda de ligação ao polinucleótido E2 contacte com uma amostra de ensaio, de acordo com o processo descrito na secção A-ll. A presente invenção também por objecto um estojo para detectar ou medir o polinucleótido E2, especificamente um estojo de detecção do polinucleótido E2 que inclui a sonda. Para facilitar a detecção do polinucleótido E2, nas condições mencionadas antes, o estojo de detecção pode incluir ainda reagentes adicionais ou similares, se necessário, para além da sonda. Além disso, o estojo de detecção pode ser utilizado para identificar células que contenham o polinucleótido E2. Do ponto de vista de permitir uma detecção precisa, o estojo de detecção pode ser fornecido, preferencialmente, como um estojo para a realização da detecção utilizando uma RCP. 70 C:

Enzima de síntese de eguol C-l. Polipéptido A presente invenção tem por objecto um polipéptido (daqui para a frente referido como "polipéptido E3") para a síntese de equol, utilizando como substrato a tetra-hidro-daidzeína. Especificamente, a presente invenção tem por obj ecto: sequência de (Ca) um polipéptido que consiste na aminoácidos da SEQ ID N°. 13; sequência de substituição, um ou mais (Cb) um polipéptido que consiste na aminoácidos da SEQ ID N°. 13 com a eliminação, inserção e/ou adição de aminoácidos e tendo actividade para sintetizar equol utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína; e (Cc) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°. 13 e tendo actividade para sintetizar equol utilizando, como substrato, a tetra-hidrodaidzeína.

No polipéptido (Cb), o intervalo de "um ou mais aminoácidos" não está particularmente limitado, desde que o polipéptido tenha actividade para sintetizar equol utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína. Por exemplo, o intervalo é de 1 a 200, preferencialmente, de 1 a 150, mais preferencialmente, de 1 a 100, mais preferencialmente, de 1 a 50, mais preferencialmente, de 1 a 45, mais preferencialmente, de 1 a 40, mais preferencialmente, de 1 a 30, mais preferencialmente, de 1 a 15, mais preferencialmente, de 1 a 5, ainda preferencialmente, de 1 a 71 4 e, particularmente preferido, de 1 a 3, sendo particularmente preferido 1 ou 2.

Exemplos do polipéptido (Cb) incluem um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 14 ou um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 15. Comparada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13, a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 14 contém dois aminoácidos substituídos. Comparada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13, a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 15 contém 42 aminoácidos substituídos e um aminoácido adicional (ácido glutâmico no terminal C). A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 14 corresponde ao polipéptido da enzima E3 da estirpe E-23-15 de Bacteroides ovatus (FERM BP-6435). A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 15 corresponde ao polipéptido da enzima E3 da estirpe A6G-225 de Streptococcus constellatus (FERM BP-6437).

No polipéptido (Cb), a "substituição, eliminação, inserção ou adição de aminoácidos" pode ser feita como uma substituição, eliminação, inserção ou adição de aminoácidos no polipéptido El, conforme descrito na secção A-l. É preferível que a substituição, eliminação, inserção ou adição do aminoácido no polipéptido (Cb) ocorra em regiões em que a alteração do aminoácido não tenha grandes efeitos nas estruturas de ordem superior do polipéptido ou em que a alteração não afecte o centro activo da enzima que sintetiza equol. Exemplos dessas regiões incluem regiões pouco conservadas entre as sequências de aminoácidos das SEQ ID N°s. 13, 14 e 15 e na sua vizinhança e na região do terminal N ou na região do terminal C. Exemplos específicos incluem ácido glutâmico na posição 3, arginina na posição 28, ácido glutâmico na posição 29, arginina na posição 32, asparagina na posição 61, isoleucina na posição 80, asparagina na 72 posição 92, ácido aspártico na posição 112, alanina na posição 119, asparagina na posição 129, ácido aspártico na posição 172, alanina na posição 174, serina na posição 204, ácido glutâmico na posição 206, treonina na posição 223, valina na posição 230, prolina na posição 244, tirosina na posição 246, treonina na posição 280, arginina na posição 282, alanina na posição 285, valina na posição 307, alanina na posição 322, ácido glutâmico na posição 347, glicina na posição 359, serina na posição 360, alanina na posição 366, leucina na posição 367, isoleucina na posição 368, valina na posição 372, ácido aspártico na posição 373, treonina na posição 374, alanina na posição 377, alanina na posição 380, ácido aspártico na posição 381, glutamina na posição 399, prolina na posição 403, metionina na posição 404, valina na posição 405, ácido glutâmico na posição 406, glicina na posição 407, arginina na posição 426, valina na posição 434, alanina na posição 436, tirosina na posição 438 e alanina na posição 440, na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13; e regiões adjacentes destes aminoácidos. A "região adjacente" significa uma região em que a actividade da enzima de síntese de equol não é afectada. Exemplos das referidas regiões incluem as que estão dentro dos cinco aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados antes, preferencialmente, dentro dos quatro aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados antes, mais preferencialmente, dentro dos três aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados antes, ainda mais preferencialmente, dentro dos dois aminoácidos de um dos aminoácidos exemplificados antes, particularmente preferido, dentro de um aminoácido de um dos aminoácidos exemplificados antes. Exemplos preferidos das regiões que estão pouco preservadas e das suas vizinhanças incluem a região correspondente às posições 25 a 35, a região correspondente às posições 170 a 177, a região correspondente às posições 201 a 208, a região correspondente às posições 242 a 248, a 73 região correspondente às posições 276 a 289, a região correspondente às posições 355 a 385, a região correspondente às posições 396 a 409 e a região correspondente às posições 431 a 443, na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13.

Na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13, considera-se que a sequência que vai desde o aminoácido na posição 14 até ao aminoácido na posição 19 corresponde ao dominio de ligação de FAD. De acordo com isto, desde que as funções do domínio não sejam inibidas, pode haver substituições, eliminações, inserções ou adições de um aminoácido arbitrário, na sequência. Contudo, prefere-se que a glicina na posição 14, a glicina na posição 16 e a glicina na posição 19 não sejam mutadas. Na substituição, eliminação, inserção ou adição de aminoácidos na sequência, o número de aminoácidos mutados, preferencialmente, não é superior a 3, mais preferencialmente, não é superior a 2, ainda mais preferencialmente, é que seja 1. Mais preferencialmente, é que não haja mutação na sequência. A figura 29 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°s. 13, 14 e 15.

No polipéptido (Cc), a sequência de aminoácidos tem, por exemplo, 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13. Contudo, é preferível que essa sequência de aminoácidos tenha, geralmente, 80 % ou mais, preferencialmente, 85 % ou mais, mais preferencialmente, 90 % ou mais, ainda preferencialmente, 95 % ou mais, ainda mais preferencialmente, 98 % ou mais e, particularmente preferido, 99 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13. 74

Especif icamente, o polipéptido (Cc) pode ser um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 14 ou um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 15. A identidade de aminoácidos entre a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13 e a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 14 é de 99,6 % (Blast2). A identidade de aminoácidos entre a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13 e a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 15 é de 90,9 % (Blast2). De acordo com isto, numa modalidade preferida da presente invenção, o polipéptido (Bc) contém uma sequência de aminoácidos com 90,9 % ou mais e, mais preferencialmente, 99, 6 % de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13.

No que respeita aos polipéptidos (Cb) e (Cc), a actividade para sintetizar equol, utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeina, pode ser confirmada como se seque. Em primeiro lugar, adiciona-se um polipéptido de interesse a uma solução de substrato da composição que se segue, a uma concentração de 0,001 mg/mL. Depois, faz-se a incubação da solução a 37 °C, durante 2 horas, para verificar a presença ou a ausência de equol na solução. A presença de equol na solução, após incubação, é utilizada como um indicador da actividade do polipéptido para sintetizar equol, utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeina.

Composição da solução de substrato

Tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) 1 mM Ditiotreitol 2 mM Hidrossulfito de sódio 5 mM Di-hidrodaidzeina 40 μΜ 75

Propriedades da enzima

Dado que o polipéptido E3 tem uma actividade enzimática para sintetizar equol utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína, o polipéptido E3 também é referido como enzima E3. A temperatura óptima da enzima E3 está na vizinhança de cerca de 23 a 37 °C e o pH óptimo é de 4,5. A enzima E3 pode sintetizar tetra-hidrodaidzeína a partir de equol.

De forma semelhante ao polipéptido EI e o polipéptido E2, o polipéptido E3 pode ser produzido por técnicas de engenharia genética com base na informação da sequência de nucleótidos das SEQ ID N°. 16, 17 ou 18. Além disso, podem utilizar-se processos comuns na síntese química para produzir o polipéptido E3, com base na informação da sequência de aminoácidos das SEQ ID N°. 13, 14 ou 15. 0 polipéptido E3 pode também ser produzido por isolamento e purificação a partir de microrganismos capazes de o produzir. Estes processos podem ser realizados de acordo com a descrição na secção A-l anterior. 0 microrganismo capaz de produzir o polipéptido E3 pode ser posto em cultura num meio contendo uma quantidade desejada de tetra-hidrodaidzeína. 0 polipéptido E3 pode também ser produzido desta forma em microrganismos capazes de produzirem o polipéptido E3. 0 polipéptido E2 pode ser monomérico ou dimérico ou polimérico, desde que sintetize tetra-hidrodaidzeína. Além disso, para melhorar a estabilidade e outras características, o polipéptido E3 pode ser modificado, conforme necessário, por adição de polietileno-glicol ou de uma cadeia de açúcar. 76 0 polipéptido Ε3 pode servir como um catalisador que converte a tetra-hidrodaidzeina (um substrato) em equol. Crê-se que equol exiba várias actividades fisiolóqicas no corpo. Por este motivo, o polipéptido E3 capaz de providenciar o equol, é considerado importante. Por isso, a presente invenção tem por objecto uma enzima que sintetiza equol, incluindo qualquer um dos polipéptidos de (Ca) a (Cc). C-2. Polinucleótido A presente invenção também tem por objecto um polinucleótido (daqui para a frente também referido como "polinucleótido E3"), que codifica um polipéptido que tem uma actividade para sintetizar equol utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeina. Especificamente, a presente invenção tem por objecto: (Cd) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 16; (Ce) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13; e (Cf) um polinucleótido que hibrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Cd) ou (Ce) e que codifica um polipéptido que tem actividade para sintetizar equol, utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeina. A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13 corresponde à sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 16. A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 14 corresponde à sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 17. A sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 15 corresponde à 77 sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 18.

No que respeita ao polinucleótido (Cf) , a expressão "híbrida em condições severas" é sinónima da expressão "híbrida em condições severas" referida na secção A-2. Exemplos de polinucleótidos (Cf) incluem a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 17 e a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 18. A homologia da sequência de bases entre a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 16 e a sequência de nucleótidos da SEQ ID N °. 17 é de 99,8 % (Blast2). A homologia da sequência de nucleótidos da SEQ ID N° . 16 e a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 18 é de 85,2 % (Blast2). De acordo com isto, numa modalidade preferida da presente invenção, um polinucleótido (Cf) compreende uma sequência de bases com 85,2 % de homologia e, mais preferencialmente, 99, 8 % de homologia com a sequência de bases da SEQ ID N°. 16.

No que respeita ao polinucleótido (Cf), a "actividade para sintetizar equol, utilizando como substrato a tetra-hidrodaidzeína" pode ser confirmada pelo processo utilizado para os polipéptidos (Cb) e (Cc). 0 polinucleótido E3 pode ser produzido ou obtido por processos de síntese química do ADN ou por técnicas de engenharia genética, com base na informação da sequência das SEQ ID N°s. 16, 17 ou 18. Especificamente, podem utilizar-se os processos descritos na secção A-2 para o polinucleótido EI. A fonte de ADNc do polinucleótido E3 não está particularmente limitada desde que seja um microrganismo que expresse o polinucleótido E3. Exemplos específicos incluem 78 microrganismos capazes de produzir equol, preferencialmente, bactérias de ácido láctico, bactérias pertencentes aos géneros Bacteroides e Streptococcus capazes de produzir equol, mais preferencialmente, Lactococcus garvieae, Bacteroides ovatus e Streptococcus constellatus capazes de produzir equol, ainda preferencialmente, Lactococcus garvieae fecal capaz de produzir equol e, particularmente preferido, é a estirpe 20-92 de Lactococcus, a estirpe E-23-15 de Bacteroides ovatus e a estirpe A6G-225 de Streptococcus constellatus (FERM BP-10036, FERM BP-6435 e FERM BP-6437, respectivamente; depositadas no Organismo Internacional de Depósito de Patentes, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão), estirpes de Lactococcus garvieae fecal capazes de produzir equol. A expressão do polinucleótido E3 utilizando técnicas comuns de engenharia genética permite facilmente a produção em massa e estável do produto polinucleotídico (o poli-péptido). O isolamento, com sucesso, do polinucleótido E3, por meio da presente invenção, irá abrir a porta para a produção industrial de equol, sem utilizar as estirpes bacterianas anaeróbicas, difíceis de manusear, utilizadas tradicionalmente para a produção de equol. C-3. Vector de expressão O vector de expressão da presente invenção não está particularmente limitado desde que inclua o polinucleótido E3 e seja capaz de expressar o polinucleótido E3. Geralmente, selecciona-se de forma apropriada de acordo com o tipo de célula hospedeira, semelhante ao vector de expressão que incluiu o polinucleótido El. Especificamente, pode-se utilizar a célula hospedeira descrita na secção A-3. 79 C-4. Célula recombinante A presente invenção tem por objecto uma célula recombinante (transformante) transformada com um vector de expressão que inclui o polinucleótido E3. A célula hospedeira utilizada para a célula recombinante pode ser qualquer uma das descritas na secção A-4. Além disso, pode-se introduzir o vector de expressão na célula hospedeira pelo processo descrito na secção A-4.

Como a célula recombinante é capaz de produzir o polipéptido E3 (uma enzima que converte em equol), pode ser utilizada para produzir uma enzima que converte equol. A célula recombinante também pode ser utilizada para produzir equol sob a forma de célula. C-5. Produção de polipéptido utilizando uma célula recombinante 0 polipéptido E3 pode ser produzido por cultura de uma célula recombinante na qual se introduz um polinucleótido E3 e se recolhe o polipéptido E3 da célula e da cultura. As células recombinantes podem ser postas em cultura de acordo com a descrição da secção A-5. C-6. Produção de equol utilizando o polipéptido E3 A presente invenção tem por objecto um processo para a produção de equol utilizando o polipéptido E3. No processo de produção, a tetra-hidrodaidzeína pode ser convertida em equol fazendo o polipéptido E3 actuar sobre tetra-hidrodaidzeína. 80 A reacção utilizada no processo de produção pode ser realizada num tampão apropriado. Especificamente, podem ser utilizados os tampões descritos na secção A-6. A reacção utilizada no processo de produção realiza-se em condições tais que, por exemplo, adiciona-se cada componente ao meio em concentrações que varia conforme se mostra a seguir no inicio da reacção, de modo a preparar uma mistura. Faz-se a incubação da mistura durante 0,5 a 10 horas, preferencialmente, 1 a 6 horas e, mais preferencialmente, 2 a 4 horas, a temperaturas que não se alteram nem inactivam os materiais iniciais, incluindo o polipéptido E3 e tetra-hidrodaidzeina e o produto, incluindo o equol. A temperatura da reacção não está particularmente limitada. Por exemplo, quando a temperatura da reacção é de 0 °C ou menos, a reacção utiliza, por exemplo, um tampão que não congela a essas temperaturas de reacção. A temperatura da reacção é, por exemplo, preferencialmente, de 0 a 45 °C e, mais preferencialmente, de 0 a 37 °C. 0 teor de polipéptido E3 é de 0,0001 a 1,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,01 % em peso; e o teor de tetra-hidrodaidzeina é de 0,0001 a 10,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 1,0 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso. A presente invenção também tem por objecto uma mistura de material para a sintese de equol, especificamente, uma composição para a sintese de equol incluindo (Ci) o polipéptido E3 e (Cii) tetra-hidrodaidzeina. Por incubação da composição, nas condições mencionadas antes, a tetra-hidrodaidzeina contida na composição do material inicial da sintese pode ser convertida em equol. A composição 81 corresponde à mistura do material inicial mencionada antes, utilizada para iniciar a reacção para produzir equol. Além disso, as concentrações do polipéptido E3 e de tetra-hidrodaidzeína na composição e os outros componentes que podem ser associados à composição do material inicial de sintese são utilizadas essencialmente como no sistema de reacção (uma mistura de materiais iniciais no inicio da reacção) no processo de produção mencionado antes. A presente invenção também tem por objecto um estojo para a sintese de equol, especificamente, um estojo para a sintese de equol incluindo (Ci) o polipéptido E3 e (Cii) tetra-hidrodaidzeina. 0 estojo de sintese pode incluir os componentes em compartimentos, conforme necessário, de modo a permitir que se faça, de forma conveniente, a sintese de equol a partir de tetra-hidrodaidzeina, nas condições anteriores. 0 estojo de sintese pode ainda incluir, se necessário, um tampão. 0 estojo de síntese pode também incluir quaisquer ferramentas ou manuais de operação necessários para ajudar a realizar a síntese de equol. C-7. Composição da enzima de síntese de equol A presente invenção também tem por objecto uma composição enzimática para a síntese de equol incluindo o polipéptido E3. A composição enzimática pode ser utilizada apropriadamente como uma enzima de síntese de equol no processo de produção de equol utilizando o polipéptido E3. A composição enzimática pode ser um polipéptido E3 impuro purificado ou a composição enzimática pode ser um polipéptido E3 impuro purificado ou um polipéptido E3 purificado formulado com um suporte apropriado. 0 suporte não 82 tem qualquer efeito adverso na actividade do polipéptido E3 e é utilizado numa quantidade apropriada. A proporção de polipéptido E3 na composição enzimática não está particularmente limitada desde que a composição possa ser utilizada como uma enzima que sintetiza o equol, no processo de produção de equol. Especificamente, o teor de polipéptido E3 é, por exemplo, de 0,001 a 20,0 % em peso, preferencialmente, de 0,005 a 5,0 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,01 a 1,0 % em peso, em relação ao peso total da composição enzimática.

Para melhorar a estabilidade do polipéptido e/ou para assequrar a conservação da composição enzimática, a composição enzimática deve incluir vários antioxidantes e conservantes descritos na secção A-7, para além do polipéptido E3. C-8. Processo de produção de equol utilizando células recombinantes A presente invenção tem por objecto um processo de produção de equol utilizando células recombinantes incluindo o polinucleótido E3. Especificamente, no processo de produção, a tetra-hidrodaidzeina é convertida em equol por meio da acção da célula recombinante sobre a tetra-hidrodaidzeina para a converter. A reacção utilizada no processo de produção realiza-se em condições que permitem que a célula recombinante sobreviva e a tetra-hidrodaidzeina seja convertida em equol.

Especificamente, adicionam-se quantidades apropriadas de células recombinantes e de tetra-hidrodaidzeina e faz-se a 83 cultura num meio que permite o crescimento das células recombinantes. 0 meio utilizado no processo de produção selecciona-se, apropriadamente, entre vários tipos de meios convencionais, de acordo com o tipo de células utilizadas como células recombinantes hospedeiras. 0 meio pode ser complementado com quantidades apropriadas de inibidores de protease, tais como, PMSF e EDTA, se for necessário. Além disso, considerando que o polipéptido deriva de bactérias anaeróbicas, podem também ser adicionadas quantidades apropriadas de agentes redutores, tais como, DTT, 2ME, DET e Na2S204. Quando se utiliza a célula recombinante, o meio pode ser complementado com NADPH e/ou NADH, conforme necessário, embora não seja essencial.

Especificamente, realiza-se o processo de produção como se segue. Em primeiro lugar, inoculam-se as células recombinantes em meio contendo de 0,001 a 1 % em peso, preferencialmente , de 0,01 a 0,5 % em peso e, mais preferencialmente , de 0,01 a 0,1 % em peso de tetra- hidrodaidzeína e faz-se a incubação da cultura, em condições de temperatura permissiveis, durante 7 a 30 horas, preferencialmente , de 15 a 24 horas e, mais preferencialmente, de 17 a 20 horas. As condições de temperatura permissiveis não estão aqui particularmente limitadas e são praticamente as da secção C-6 anterior. A presente invenção também tem por objecto uma mistura de materiais para a síntese de equol, especificamente, uma composição de material para a síntese de equol contendo (Ciii) a célula recombinante e (Cii) tetra-hidrodaidzeína. Por meio da cultura da composição, nas condições mencionadas 84 na composição, pode ser antes, a tetra-hidrodaidzeína, convertida em equol. A composição corresponde à mistura de material inicial anterior, usada para iniciar a reacção para produzir equol. Além disso, as concentrações da célula recombinante e de tetra-hidrodaidzeina, na composição, e as dos outros componentes que podem ser adicionados à composição, são essencialmente as mesmas das condições utilizadas nos processos de produção anteriores. A presente invenção também tem por objecto um estojo para a sintese de equol, especificamente, um estojo para a sintese de equol incluindo (Ciii) a célula recombinante e (Cii) tetra-hidrodaidzeina. 0 estojo de sintese pode incluir a célula recombinante e a tetra-hidrodaidzeína em compartimentos, se necessário, de modo a permitir, de forma conveniente, a síntese de equol a partir da tetra- hidrodaidzeína nas condições mencionadas antes. 0 estojo de síntese pode ainda incluir um tampão ou um meio, conforme necessário. 0 estojo de síntese pode também incluir quaisquer ferramentas ou manuais de operação necessários que ajudem a realizar a síntese de equol.

As células recombinantes incluídas no estojo de síntese podem ser conservadas por processos conhecidos. Há um certo número de técnicas conhecidas de preservação de células recombinantes. Por exemplo, há um processo em que as células recombinantes são preservadas de 4 a 25 °C, depois de terem sido tratadas com um agente de liofilização para fazer o vácuo na ampola de armazenagem das células recombinantes no seio de um dissolvente, tal como, dimetilformamida. Outro exemplo é um processo que utiliza azoto líquido, em que as células são suspensas num meio de conservação complementado com glicerol a 10 %, que é então armazenado numa ampola 85 específica e mantido num tanque de azoto líquido (de -150 a - 196 °C). C-9. Anticorpo com afinidade para o polipéptido A presente invenção também tem por objecto um anticorpo (um anticorpo IgG) com afinidade com o polipéptido E3. O anticorpo monoclonal e o anticorpo policlonal podem ser preparados por um processo comum. Especificamente, estes anticorpos podem ser preparados pelos processos descritos na secção A-9. C-10. Processo imunológico para a detecção e a medição do polipéptido A presente invenção também tem por objecto um processo imunológico para a detecção ou a medição do polipéptido E3 utilizando o anticorpo. Especificamente, o processo imunológico é realizado de acordo com o processo descrito na secção A-10. A presente invenção também tem por objecto um estojo de detecção imunológica que inclui o anticorpo utilizado para a detecção ou a mediação do polipéptido E3. O estojo de detecção pode também incluir um padrão do polipéptido E3, se necessário. O estojo de detecção pode ainda incluir, se necessário, reagentes adicionais que facilitam uma detecção fácil do polipéptido E3 nas condições anteriores. O estojo de detecção pode também incluir quaisquer ferramentas ou manuais de operação necessários que facilitem uma detecção fácil do polipéptido E3. 86 C—11. Processo para a detecção ou a medição de polinucleótidos que codificam o polipéptido A presente invenção também tem por objecto um processo para a detecção ou a medição do polinucleótido E3. Especificamente, o processo realiza-se fazendo com que uma sonda de ligação ao polinucleótido E3 contacte com uma amostra de ensaio, de acordo com o processo descrito na secção A-ll. A presente invenção também por objecto um estojo para detectar ou medir o polinucleótido E3, especificamente um estojo de detecção do polinucleótido E3 que inclui a sonda. Para facilitar a detecção do polinucleótido E3, nas condições mencionadas antes, o estojo de detecção pode incluir ainda reagentes adicionais ou similares, se necessário, para além da sonda. Além disso, o estojo de detecção pode ser utilizado para identificar células que contenham o polinucleótido E3. Do ponto de vista de permitir uma detecção precisa, o estojo de detecção pode ser fornecido, preferencialmente, como um estojo para a realização da detecção utilizando uma RCP. D. Processo para a produção de equol utilizando as enzimas El - E3 ou produtos intermédios delas D-I-l. Processo para a produção de tetra-hidrodaidzeina compreendendo uma primeira etapa e uma segunda etapa A presente invenção tem por objecto um processo para a produção de tetra-hidrodaidzeina compreendendo a primeira etapa e a segunda etapa que se seguem (daqui para a frente, este processo será ocasionalmente referido como o "primeiro processo de produção"). A primeira etapa produz di- 87 hidrodaidzeína a partir de daidzeína. A segunda etapa produz tetra-hidrodaidzeína a parir de di-hidrodaidzeina. A primeira etapa compreende uma etapa em que se faz com que uma enzima que consiste num dos polipéptidos (Aa) a (Ac) que se seguem e NADPH e/ou NADH actuam sobre a daidzeina, para assim produzirem a di-hidrodaidzeína. (Aa) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID \—1 0 (Ab) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos e tendo actividade para sintetizar di- hidrodaidzeina utilizando como substrato a daidzeina. (Ac) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 e tendo actividade para sintetizar di-hidrodaidzeina utilizando como substrato a daidzeina. A segunda etapa compreende uma etapa em que se faz com que a enzima, que consiste num dos polipéptidos (Ba) a (Bc) que se seguem e NADPH e/ou NADH, actuam sobre a di-hidrodaidzeina, para assim produzirem a tetra-hidrodaidzeína. (Ba) um polipéptido que consiste aminoácidos da SEQ ID N°. 7. (Bb) um polipéptido que consiste aminoácidos da SEQ ID N°. 7 com como substrato, na sequência de na sequência de a substituição, de um ou mais sintetizar tetra-a di- eliminação, inserção e/ou adição aminoácidos e tendo actividade para hidrodaidzeina utilizando, hidrodaidzeina. (Bc) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeína utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeína. O primeiro processo de produção da presente invenção permite a produção de tetra-hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeína e equol a partir de tetra-hidrodaidzeína.

Primeira etapa

Na primeira etapa, a daidzeína é convertida em di-hidro-daidzeína fazendo actuar uma enzima, que consiste no polipéptido El, sobre daidzeína, na presença de NADPH e/ou de NADH. A reacção na primeira etapa realizada, através da incubação numa solução contendo uma enzima que consiste no polipéptido El, na daidzeína e em NADPH e/ou NADH, a temperaturas que não alterem nem inactivem os materiais iniciais, incluindo o polipéptido e a daidzeína e o produto, incluindo a di-hidrodaidzeína; nomeadamente, as condições estão detalhadas na secção A-6 anterior.

Quando a primeira etapa e a segunda etapa descritas mais adiante forem realizadas nas mesmas condições, a reacção realiza-se em condições tais que os componentes satisfazem os intervalos de concentração, conforme se mostra a seguir, num sistema de reacção, no início da reacção (numa mistura de materiais iniciais no início da reacção) e depois a mistura é incubada, durante 0,5 a 10 horas, preferencialmente, 1 a 6 horas e, mais preferencialmente, 2 a 4 horas, a 15 a 45 °C, preferencialmente, de 25 a 40 °C e, mais preferencialmente, de 30 a 38 °C. Com este arranjo, realiza-se com eficácia tanto a primeira como a segunda etapas. O teor de enzima que 89 consiste no polipéptido EI é de 0,0001 a 1,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,01 % em peso. 0 teor de daidzeina é de 0,0001 a 10,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 1,0 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso. O teor de NADPH e/ou de NADH é de 0,01 a 5 % em peso, preferencialmente, de 0,05 a 1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,1 a 0,5 % em peso. A fonte de daidzeina utilizada, como substrato, na primeira etapa, não está limitada. Por exemplo, podem utilizar-se as daidzeinas comercialmente disponíveis ou as daidzeínas produzidas ou sintetizadas através de processos apropriados.

Além disso, por exemplo, pode-se utilizar uma composição de material de síntese de di-hidrodaidzeína contendo (Ai) uma enzima que consiste no polipéptido El; (Aii) NADPH e/ou NADH; e (Aiii) daidzeina, sob a forma de uma mistura de materiais iniciais para a produção de di-hidrodaidzeina na primeira etapa. Por incubação, a composição, nas condições anteriores, a daidzeina na composição é convertida em di-hidrodaidzeina. A composição está especificamente descrita nas secções A-6 e A-7 anteriores.

Segunda etapa

Na segunda etapa, a di-hidrodaidzeina é convertida em tetra-hidrodaidzeina fazendo actuar uma enzima, que consiste no polipéptido E2, sobre di-hidrodaidzeina, na presença de NADPH e/ou NADH. A reacção, na segunda etapa realizada, através da incubação numa solução contendo uma enzima, que consiste no 90 polipéptido E2, di-hidrodaidzeína e NADPH e/ou NADH, a temperaturas que não alterem nem inactivem os materiais iniciais, incluindo a enzima que consiste no polipéptido E2 e a di-hidrodaidzeína e o produto, incluindo tetra-hidrodaidzeína; nomeadamente, as condições estão detalhadas na secção B-6 anterior.

No que respeita à tetra-hidrodaidzeína, o composto existe quer na forma cis quer na forma trans. A formação das configurações cis e trans pode ser controlada fazendo variar as condições da reacção, tais como, a temperatura da reacção e o tempo de reacção. Por exemplo, pode-se produzir uma mistura de tetra-hidrodaidzeína cis e trans fixando a temperatura da reacção em 0 °C ou a reacção pode ser controlada para favorecer a forma trans fixando a temperatura de reacção em 37 °C.

Quando a primeira etapa e a segunda etapa forem realizadas nas mesmas condições, a reacção realiza-se através da incubação, nas condições mencionadas antes, para realizar a primeira etapa e a segunda etapa, nas mesmas condições que estão detalhadas e explicadas antes para a primeira etapa. Com este arranjo, realiza-se com eficácia tanto a primeira como a segunda etapas. Neste caso, os teores da enzima consistindo em polipéptido E2, a di-hidrodaidzeína e NADPH e/ou NADH são ajustados como se segue: o teor de enzima que consiste no polipéptido E2 é de 0,0001 a 1,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,01 % em peso; o teor de di-hidrodaidzeína é de 0,0001 a 10,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 1,0 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso; e 91 o teor de NADPH e/ou de NADH é de 0,01 a 5 % em peso, preferencialmente, de 0,05 a 1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,1 a 0,5 % em peso.

Contudo, quando se realiza na presença da enzima que consiste no polipéptido EI ou a enzima que consiste no polipéptido E2, a primeira etapa e a segunda etapa requerem o uso de NADPH para aumentar a eficácia na reacção de produção de di-hidrodaidzeina. A concentração de NADPH determina-se com base nas condições mencionadas antes para realizar a primeira etapa e a segunda etapa, nas mesmas condições que estão detalhadas na explicação anterior da primeira etapa. A concentração de NADH, que se utiliza com NADPH é de 0,01 a 5 % em peso, preferencialmente, de 0,05 a 1 % em peso, mais preferencialmente, de 0,1 a 0,5 % em peso. A fonte de di-hidrodaidzeina, utilizada como substrato na segunda etapa, não está limitada.

Por exemplo, a di-hidrodaidzeína produzida na primeira etapa, a partir de daidzeina, pode ser utilizada como um substrato para a segunda etapa. A di-hidrodaidzeina é utilizada quer sob a forma de solução contendo di-hidrodaidzeina, tal como foi produzida na primeira etapa, ou num estado grosseiramente refinado ou num estado apropriadamente refinado.

Também se pode utilizar di-hidrodaidzeínas disponíveis comercialmente ou di-hidrodaidzeínas sintetizadas através de processos apropriados.

Além disso, pode-se utilizar uma composição de material de síntese de tetra-hidrodaidzeína contendo (Bi) uma enzima que consiste no polipéptido E2; (Bii) NADPH e/ou NADH; e 92 (Biii) di-hidrodaidzeína, sob a forma de uma mistura de materiais iniciais, na produção de tetra-hidrodaidzeina, na segunda etapa. Por meio da incubação da composição, nas condições anteriores, a di-hidrodaidzeina é convertida em tetra-hidrodaidzeina. A composição de síntese está especificamente descrita nas secções A-6 e A-7 anteriores.

Na segunda etapa, é preferível utilizar di-hidrodaidzeína, produzida na primeira etapa, utilizando como substrato a daidzeína; contudo, a di-hidrodaidzeína disponível comercialmente, a composição de material inicial de síntese, a composição da enzima, etc., podem misturar-se com a di-hidrodaidzeína produzida na primeira etapa.

Polipéptido EI e polipéptido E2 0 primeiro processo de produção da presente invenção utiliza a enzima que consiste no polipéptido El, tal como foi descrito em detalhe na secção A-l anterior e a enzima que consiste no polipéptido E2, tal como foi descrito em detalhe na secção B-l anterior. D-I-2. Produto contendo tetra-hidrodaidzeina, produzido pelo primeiro processo de produção A presente invenção tem por objecto um produto contendo tetra-hidrodaidzeina, produzido pelo processo anterior e compreendendo uma primeira etapa e uma segunda etapa (primeiro processo de produção).

Tal como descrito antes, o primeiro processo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeína a partir de daidzeína e de tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeína. 93

De acordo com isto, o produto produzido pelo primeiro processo de produção da presente invenção contém não apenas tetra-hidrodaidzeina, mas também di-hidrodaidzeina e/ou daidzeina. 0 produto da presente invenção pode ser utilizado sob a forma de uma solução, conforme produzida no primeiro processo de produção ou pode ser um produto de tetra-hidrodaidzeina obtido por uma solução grosseiramente refinada ou uma solução apropriadamente refinada. 0 produto da presente invenção pode ser incorporado em alimentos, bebidas ou materiais ou produtos de beleza, produtos medicinais, etc., ou pode ser utilizado como um substrato. D-I-3. Processo de produção de eguol compreendendo a segunda etapa e a terceira etapa A presente invenção tem por objecto um processo para a produção de equol compreendendo a segunda etapa e a terceira etapa que se seguem (daqui para a frente, este processo é ocasionalmente referido como um "segundo processo de produção"). A segunda produz tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeina. A terceira etapa produz equol a partir de tetra-hidrodaidzeina. A segunda etapa compreende uma etapa em que se faz actuar uma enzima, que consiste em um dos polipéptidos (Ba) a (Bc) e NADPH e/ou NADH, sobre di-hidrodaidzeina, produzindo assim tetra-hidrodaidzeina. (Ba) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7. 94 (Bb) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais amino ácidos e tendo actividade para sintetizar tetra-hidro-daidzeina utilizando como substrato a di-hidrodaidzeina. (Bc) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeína. A terceira etapa compreende uma etapa em que se faz actuar uma enzima, que consiste em um dos polipéptidos (Ca) a (Cc), sobre tetra-hidrodaidzeina, produzindo assim equol. (Ca) um polipéptido aminoácidos da SEQ ID que N° . 13 consiste na sequência de (Cb) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 13 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos e tendo actividade para sintetizar equol utilizando tetra-hidrodaidzeina como um substrato. (Cc) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13 e tendo actividade para sintetizar equol utilizando tetra-hidrodaidzeina como um substrato. O segundo processo de produção da presente invenção permite a produção de tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodadzeína e equol a partir de tetra-hidrodaidzeina. 95

Segunda etapa A segunda etapa do segundo processo de produção da presente invenção é igual à segunda etapa do primeiro processo de produção.

Quando a segunda etapa e a terceira etapa descrita a seguir se realizam nas mesmas condições, a reacção realiza-se em condições tais que os componentes satisfazem os intervalos de concentração que se seguem, num sistema de reacção, no inicio da reacção (numa mistura de materiais iniciais no inicio da reacção) e depois a mistura é incubada, durante 0,5 a 10 horas, preferencialmente, de 1 a 6 horas e, mais preferencialmente, de 2 a 4 horas, a 15 a 45 °C, preferencialmente, a 25 a 40 °C e, mais preferencialmente, a 30 a 38 °C. Com este arranjo, realiza-se eficientemente tanto a primeira como a segunda etapas. O teor de enzima que consiste no polipéptido E2 é de 0, 0001 a 1,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,01 % em peso. O teor de di-hidrodaidzeina é de 0,0001 a 10,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 1,0 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso. O teor de NADPH e/ou de NADH é de 0,01 a 5 % em peso, preferencialmente, de 0,05 a 1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,1 a 0,5 % em peso.

Terceira etapa A terceira etapa faz com que uma enzima que consiste no polipéptido E3 actue sobre tetra-hidrodaidzeína, convertendo assim a tetra-hidrodaidzeina em equol. 96 A reacção na terceira etapa realizada através da incubação numa solução contendo uma enzima que consiste no polipéptido E3 e tetra-hidrodaidzeína, a temperaturas que não alterem nem inactivem os materiais iniciais, incluindo a enzima que consiste no polipéptido E3 e a tetra-hidrodaidzeína e o produto, incluindo equol; nomeadamente, as condições estão detalhadas na secção A-6 anterior.

Quando se realizam a segunda etapa e a terceira etapa nas mesmas condições, a reacção realiza-se através da incubação, nas condições mencionadas antes, para realizar a segunda etapa e a terceira etapa nas mesmas condições que foram detalhadas antes na explicação anterior da segunda etapa. Com este arranjo, tanto a segunda como a terceira etapas são realizadas com eficácia. Neste caso, os teores da enzima que consiste no polipéptido E3, tetra-hidrodaidzeína e NADPH e/ou NADH são ajustados, tal como se segue: o teor da enzima que consiste no polipéptido E3 é de 0,0001 a 1,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,01 % em peso; o teor de tetra-hidrodaidzeína é de 0,0001 a 10,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 1,0 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso; e o teor de NADPH e/ou de NADH é de 0,01 a 5 % em peso, preferencialmente, de 0,05 a 1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,1 a 0,5 % em peso. A fonte de tetra-hidrodaidzeína utilizada como substrato na terceira etapa também não está limitada.

Por exemplo, a tetra-hidrodaidzeína produzida na segunda etapa, a partir de di-hidrodaidzeína, pode ser utilizada como 97 um substrato para a terceira etapa. A tetra-hidrodaidzeína é utilizada quer sob uma forma de solução contendo a tetra-hidrodaidzeína, tal como foi produzida na segunda etapa ou numa estado grosseiramente refinado ou num estado apropriadamente refinado.

As tetra-hidrodaidzeínas disponíveis comercialmente ou as tetra-hidrodaidzeínas sintetizadas através de processos apropriados podem também ser utilizadas.

Além disso, a composição de material de síntese da tetra-hidrodaidzeína contendo (Ci) uma enzima que consiste no polipéptido E3; e (Cii) tetra-hidrodaidzeína, pode ser utilizada como uma mistura dos materiais iniciais na produção de tetra-hidrodaidzeína na terceira etapa. Por meio da incubação da composição, nas condições anteriores, a tetra-hidrodaidzeína na composição é convertida em equol. A composição está descrita especificamente nas secções C-6 e ΟΙ anteriores.

Na terceira etapa, é preferível utilizar a tetra-hidrodaidzeína, produzida na segunda etapa utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína; contudo, também se pode misturar a tetra-hidrodaidzeína disponível comercialmente, a composição de material inicial de síntese, a composição enzimática, etc., com a tetra-hidrodaidzeína produzida na segunda etapa.

Polipéptido E2 e polipéptido E3 0 segundo processo de produção da presente invenção utiliza a enzima que consiste no polipéptido E2, tal como foi descrito em detalhe na secção B-l e a enzima que consiste no 98 polipéptido E3, tal como foi descrito em detalhe na secção B-1. p-I-4. Produto contendo equol, produzido pelo segundo processo de produção A presente invenção tem por objecto um produto contendo equol, produzido pelo processo anterior, compreendendo a segunda etapa e a terceira etapa (segundo processo de produção).

Tal como descrito antes, o segundo processo de produção da presente invenção permite a produção de tetra-hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeina e equol a partir de tetra-hidrodaidzeina.

De acordo com isto, o produto produzido pelo segundo processo de produção da presente invenção contém não apenas equol, mas também tetra-hidrodaidzeina e/ou di-hidrodaidzeina. 0 produto da presente invenção pode ser utilizado sob a forma de solução conforme produzido no segundo processo de produção ou pode ser um produto de equol obtido por meio de uma solução grosseira ou apropriadamente refinada. 0 produto da presente invenção pode ser incorporado em alimentos, bebidas, materiais de produtos de beleza, produtos medicinais, etc., ou pode ser utilizado como um substrato. 99 D-I-5. Processo de produção de equol compreendendo desde a primeira etapa até à terceira etapa A presente invenção tem por objecto um processo de produção de equol compreendendo a primeira etapa, a segunda etapa e a terceira etapa (daqui para a frente, este processo é ocasionalmente referido como "terceiro processo de produção"). 0 terceiro processo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeína a partir de daidzeina, tetra-hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeína e equol a partir de tetra-hidrodaidzeína.

Primeira etapa

Na primeira etapa do terceiro processo de produção da presente invenção, a daidzeina é convertida em di-hidrodaidzeína fazendo actuar uma enzima que consiste no polipéptido EI sobre daidzeina, na presença de NADPH e/ou de NADH. A primeira etapa do terceiro processo de produção da presente invenção é a mesma que a primeira etapa mencionada antes.

Quando a primeira etapa e a segunda etapa são realizadas nas mesmas condições, quando a primeira etapa e a terceira etapa são realizadas nas mesmas condições ou quando da primeira etapa à terceira etapa são realizadas nas mesmas condições, a reacção realiza-se através da incubação, nas condições/concentrações mencionadas antes, para a realização da primeira etapa e da segunda etapa, nas mesmas condições, que estão detalhadas na explicação anterior da primeira etapa. Com este arranjo, tanto a primeira como a segunda etapas são realizadas com eficiência. 100

Segunda etapa

Na segunda etapa do terceiro processo de produção da presente invenção, a di-hidrodaidzeina é convertida em tetra-hidrodaidzeína fazendo actuar uma enzima, que consiste no polipéptido E2, sobre di-hidrodaidzeina, na presença de NADPH e/ou de NADH. A segunda etapa do terceiro processo de produção da presente invenção é a mesma que a segunda etapa mencionada antes.

Quando a primeira etapa e a segunda etapa são realizadas nas mesmas condições ou quando da primeira etapa à terceira etapa são realizadas nas mesmas condições, a reacção realiza-se através da incubação, nas condições/concentrações mencionadas antes, para a realização da primeira etapa e da segunda etapa, nas mesmas condições, que estão detalhadas na explicação anterior da segunda etapa. Com este arranjo, tanto a primeira como a segunda etapa são realizadas com eficiência.

Além disso, quando a primeira etapa e a segunda etapa são realizadas na presença da enzima que consiste no polipéptido EI e da enzima que consiste no polipéptido E2 ou quando da primeira etapa à terceira etapa são realizadas na presença da enzima que consiste no polipéptido El, da enzima que consiste no polipéptido E2 e da enzima que consiste no polipéptido E3, a reacção é realizada através da incubação na presença da enzima que consiste no polipéptido El e da enzima que consiste no polipéptido E2, nas condições/concentrações mencionadas antes, que estão detalhadas na explicação, por exemplo da segunda etapa.

Quando a segunda etapa e a terceira etapa forem realizadas nas mesmas condições, a reacção realiza-se através 101 da incubação, nas condições/concentrações mencionadas antes, para a realização da segunda etapa e da terceira etapa, nas mesmas condições, que estão detalhadas na explicação anterior da segunda etapa. Com este arranjo, tanto a segunda como a terceira etapa são realizadas com eficiência.

Terceira etapa

Na terceira etapa do terceiro processo de produção da presente invenção, a tetra-hidrodaidzeina é convertida em equol fazendo actuar uma enzima, que consiste no polipéptido E3, sobre tetra-hidrodaidzeina, na presença de NADPH e/ou de NADH, convertendo assim a tetra-hidrodaidzeina em equol. A terceira etapa do terceiro processo de produção da presente invenção é a mesma que a mencionada antes para a terceira etapa.

Quando primeira etapa e a terceira etapa forem realizadas nas mesmas condições ou quando da primeira etapa à terceira etapa forem realizadas nas mesmas condições, a reacção realiza-se através da incubação, nas condições mencionadas antes, para a realização da primeira etapa e da segunda etapa, nas mesmas condições, que estão detalhadas na explicação anterior da primeira etapa. Com este arranjo, tanto a primeira como a segunda etapa são realizadas com eficiência. Neste caso, os teores da enzima que consiste no polipéptido E3, da tetra-hidrodaidzeina e de NADPH e/ou de NADH são ajustados como se segue: o teor da enzima que consiste no polipéptido E3 é de 0,0001 a 1,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,01 % em peso; 102 o teor de tetra-hidrodaidzeína é de 0,0001 a 10,0 % em peso, preferencialmente, de 0,001 a 1,0 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,001 a 0,1 % em peso; e o teor de NADPH e/ou de NADH é de 0,01 a 5 % em peso, preferencialmente, de 0,05 a 1 % em peso e, mais preferencialmente, de 0,1 a 0,5 % em peso.

Contudo, quando se realiza na presença da enzima que consiste no polipéptido EI e na enzima que consiste no polipéptido E3, a primeira etapa e a terceira etapa requerem a utilização de NADPH para aumentar a eficiência da reacção de produção de di-hidrodaidzeina utilizando a enzima que consiste no polipéptido El. Do mesmo modo, quando se realiza na presença da enzima que consiste no polipéptido El, a enzima que consiste no polipéptido E2 e a enzima que consiste no polipéptido E3, da primeira etapa à terceira etapa, exige-se a utilização de NADPH para aumentar a eficiência na reacção de produção de di-hidrodaidzeina, utilizando a enzima que consiste no polipéptido El. Neste caso, a concentração de NADPH é determinada com base nas condições mencionadas antes para a realização da primeira etapa e da segunda etapa, nas mesmas condições, que estão detalhadas na explicação anterior da primeira etapa. A concentração de NADH, que se utiliza com NADPH, é determinada com base nas condições mencionadas antes para a realização da reacção na presença de uma enzima que consiste no polipéptido El, a enzima que consiste no polipéptido E2, que estão detalhadas na explicação anterior da segunda etapa e nas condições mencionadas antes para a realização da segunda etapa e da terceira etapa, nas mesmas condições, que estão detalhadas na explicação anterior da segunda etapa. 103

Polipéptidos EI a E3 0 terceiro processo de produção da presente invenção utiliza a enzima que consiste no polipéptido El, a enzima que consiste no polipéptido E2 e a enzima que consiste no polipéptido E3. Os péptidos El a E3 são os mesmos que os descritos antes. D-I-6. Produto contendo equol, produzido pelo terceiro processo de produção A presente invenção tem por objecto um produto contendo equol, produzido pelo processo anterior compreendendo da primeira etapa à terceira etapa (terceiro processo de produção).

Tal como descrito antes, o terceiro processo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeína a partir de daidzeina, tetra-hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeína e equol a partir de tetra-hidrodaidzeína.

De acordo com isto, o produto produzido pelo terceiro processo de produção da presente invenção contém não só equol, mas também tetra-hidrodaidzeína, di-hidrodaidzeína e/ou daidzeina. 0 produto da presente invenção pode ser utilizado sob a forma de solução, conforme produzido no terceiro processo de produção ou pode ser um produto de tetra-hidrodaidzeína obtido de uma solução qrosseira ou de uma solução apropriadamente refinada. 0 produto da presente invenção pode ser incorporado em alimentos, bebidas, materiais para produtos de maquilhaqem, 104 produtos medicinais, etc., ou pode ser utilizado como um substrato. D-I-7. Processo para a produção de di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol, compreendendo pelo menos duas das quarta etapa à sexta etapa A presente invenção tem por objecto um processo para a produção de di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol, compreendendo pelo menos duas das quarta etapa à sexta etapa que se sequem (daqui para a frente, este processo será ocasionalmente referido como o "quarto processo de produção"). A quarte etapa produz di-hidrodaidzeina a partir de daidzeina. A quinta etapa produz tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeina e a sexta etapa produz equol a partir de tetra-hidrodaidzeina. A quarta etapa compreende uma etapa em que se faz actuar uma célula recombinante, que consiste num dos polinucleótidos (Ad) a (Af) que se seguem, sobre daidzeina, produzindo assim di-hidrodaidzeina. (Ad) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 4; (Ae) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1; e (Af) um polinucleótido que híbrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Ad) ou (Ae) e que codifica um polipéptido com actividade para sintetizar di-hidrodaidzeina utilizando como substrato a daidzeina. A quinta etapa compreende uma etapa em que se faz actuar uma célula recombinante, que consiste num dos polinucleótidos 105 (Bd) a (Bf) que se seguem, sobre di-hidrodaidzeína, produzindo assim tetra-hidrodaidzeina. (Bd) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 10; (Be) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7; e (Bf) um polinucleótido que híbrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Bd) ou (Be) e que codifica um polipéptido com actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína. A sexta etapa compreende uma etapa em que se faz actuar uma célula recombinante, que consiste num dos polinucleótidos (Cd) a (Cf) que se seguem, sobre tetra-hidrodaidzeina, produzindo assim equol. (Cd) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 16; (Ce) um polinucleótido que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13; e (Cf) um polinucleótido que híbrida, em condições severas, com a hélice complementar do polinucleótido (Cd) ou (Ce) e que codifica um polipéptido com actividade para sintetizar equol utilizando tetra-hidrodaidzeina como substrato. O quarto processo de produção da presente invenção produz di-hidrodaidzeína, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol combinando de forma apropriada da quarta à sexta etapas. 106 0 quarto processo de produção da presente invenção compreende pelo menos duas de quarta etapa, quinta etapa e sexta etapa.

Por exemplo, um quarto processo de produção da presente invenção compreende a quarta etapa e a quinta etapa e não compreende a sexta etapa e produz di-hidrodaidzeína a partir de daidzeina e tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidro-daidzeína.

Por exemplo, um quarto processo de produção da presente invenção que compreende a quinta etapa e a sexta etapa e não compreende a quarta etapa, produz tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeína e equol a partir de tetra-hidro-daidzeína. E, por exemplo, um quarto processo de produção da presente invenção compreende todas as etapas (quarta etapa, quinta etapa e sexta etapa) e produz di-hidrodaidzeína a partir de daidzeina, tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeína e equol a partir de tetra-hidrodaidzeina.

Cada célula recombinante utilizada para o quarto processo de produção da presente invenção pode conter um ou mais polinucleótidos seleccionados no grupo que consiste em (Ad) a (Af) , (Bd) a (Bf) e (Cd) a (Cf) .

Por exemplo, quando a célula contém dois polinucleótidos: um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em (Ad) a (Af) e um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em (Bd) a (Bf), a quarta etapa e a quinta etapa podem ser realizadas com esta célula, isto é, a quarta etapa e a quinta etapa podem ser realizadas com um tipo de célula recombinante. 107

Do mesmo modo, quando a célula contém três polinucleótidos: um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em (Ad) a (Af), um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em (Bd) a (Bf) e um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em (Cd) a (Cf), da quarta etapa à sexta etapa podem ser realizadas com esta célula, isto é, da quarta etapa à sexta etapa podem ser realizadas com um tipo de célula recombinante.

No quarto processo de produção da presente invenção, da quarta etapa à sexta etapa podem ser realizadas utilizando uma célula recombinante contendo dois polinucleótidos: um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em (Ad) a (Af) , um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em (Bd) a (Bf); e outra célula recombinante contendo um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em (Cd) a (Cf) .

Do mesmo modo, no quarto processo de produção da presente invenção, da quarta etapa à sexta etapa também podem ser realizadas utilizando uma célula recombinante contendo dois polinucleótidos: um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste emn (Ad) a (Af), um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em (Cd) a (Cf); e outra célula recombinante contendo um polinucleótido seleccionado no grupo que consiste em (Bd) a (Bf).

Quarta etapa

Na quarta etapa faz com que uma célula recombinante, portadora do polinucleótido El, conforme descrito em detalhe na secção A-2, actue sobre daidzeina, convertendo assim a daidzeina em di-hidrodaidzeina. 108 A reacção na quarta etapa pode ser realizada nas mesmas condições que as da primeira etapa. Mais especificamente, a célula recombinante é inoculada no meio de cultura contendo de 0,001 a 1 % em peso, preferencialmente, de 0,01 a 1 % em peso, mais preferencialmente, de 0,01 a 0,5 % em peso de daidzeina e incubada durante 6 a 30 horas, preferencialmente, 7 a 24 horas, mais preferencialmente, 7 a 18 horas, a temperaturas que permitam o crescimento das células. A temperatura não está limitada e pode ser a temperatura adoptada na primeira etapa. Célula recombinante utilizada na quarta etapa

Pode-se utilizar qualquer célula recombinante na quarta etapa desde que a célula contenha o polinucleótido EI e seja capaz de expressar o polinucleótido El. Pode-se utilizar nesta etapa as células recombinantes descritas em detalhe na secção A-4.

Produção da enzima que consiste no polipéptido El utilizando células recombinantes portadoras do polinucleótido El A enzima que consiste no polipéptido El pode ser produzida por cultura de células recombinantes depois da introdução do polinucleótido E2 e recolhendo o polipéptido El da cultura de células. Mais especificamente, o polipéptido El pode ser produzido por cultura das células recombinantes nas condições detalhadas na secção A-5.

Quinta etapa

Na quinta etapa faz-se com que uma célula recombinante, que tenha o polinucleótido E2, conforme detalhado na secção 109 B-2, actue sobre di-hidrodaidzeína, convertendo assim a di-hidrodaidzeína em tetra-hidrodaidzeína. A reacção na quinta etapa pode ser realizada nas mesmas condições que as da segunda etapa. Mais especificamente, a célula recombinante é inoculada no meio de cultura contendo de 0,001 a 1 % em peso, preferencialmente, de 0,01 a 0,5 % em peso, mais preferencialmente, de 0,01 a 0,1 % em peso de daidzeina e incubada durante 7 a 30 horas, preferencialmente, 15 a 24 horas, mais preferencialmente, 17 a 20 horas, a temperaturas que permitam o crescimento das células. A temperatura não está limitada e pode ser a temperatura adoptada na segunda etapa. Célula recombinante utilizada na quinta etapa

Pode-se utilizar qualquer célula recombinante na quinta etapa desde que a célula contenha o polinucleótido E2 descrito na secção B-2 e seja capaz de expressar o polinucleótido E2. Um exemplo é uma célula recombinante detalhada na secção B-4.

Produção da enzima que consiste no polipéptido E2 utilizando células recombinantes portadoras do polinucleótido E2 A enzima que consiste no polipéptido E2 pode ser produzida por cultura de células recombinantes depois da introdução do polinucleótido E2 e recolhendo o polipéptido E2 das células e/ou da cultura. 0 mesmo procedimento e as mesmas condições que as da secção da "produção da enzima que consiste no polipéptido EI utilizando células recombinantes com o polinucleótido El" podem ser utilizados para a incubação de células 110 recombinantes fornecidas com o polinucleótido E2, o meio de cultura e o isolamento/purificação dos polipéptidos E2.

Sexta etapa

Na sexta etapa faz-se com que uma célula recombinante, que tenha o polinucleótido E3, conforme detalhado na secção C-2, actue sobre tetra-hidrodaidzeina, convertendo assim a tetra-hidrodaidzeina em equol. A reacção na sexta etapa pode ser realizada nas mesmas condições que as da terceira etapa. Mais especificamente, a célula recombinante é inoculada no meio de cultura contendo de 0,001 a 1 % em peso, preferencialmente, de 0,01 a 0,5 % em peso, mais preferencialmente, de 0,01 a 0,1 % em peso de tetra-hidrodaidzeina e incubada durante 7 a 30 horas, preferencialmente, 15 a 24 horas, mais preferencialmente, 17 a 20 horas, a temperaturas que permitam o crescimento das células. A temperatura não está limitada e pode ser a temperatura adoptada na terceira etapa. A fonte de tetra-hidrodaidzeina utilizada como um substrato na sexta etapa também não está limitada.

Por exemplo, a tetra-hidrodaidzeina produzida na quinta etapa a partir de di-hidrodaidzeina, pode ser utilizada como um substrato para a sexta etapa. A tetra-hidrodaidzeina é utilizada quer sob a forma de solução contendo tetra-hidrodaidzeina, conforme produzida na quinta etapa ou num estado grosseiramente refinado ou num estado apropriadamente refinado. 111

Também podem ser utilizadas as tetra-hidrodaidzeinas disponíveis comercialmente ou as tetra-hidrodaidzeinas sintetizadas através de processos apropriados.

Além disso, pode-se utilizar uma composição de material de síntese de tetra-hidrodaidzeína contendo as células recombinantes que contêm o polinucleótido E3; e a tetra-hidrodaidzeína pode ser utilizada sob a forma de uma mistura de materiais iniciais na produção de tetra-hidrodaidzeína na sexta etapa. Por incubação da composição nas condições anteriores, a tetra-hidrodaidzeína na composição é convertida em equol. Aplicam-se as mesmas condições e restrições aplicadas antes para determinar as concentrações das células recombinantes e de tetra-hidrodaidzeína na composição, os outros ingredientes adicionados à composição, condições de reacção, etc.

Na sexta etapa, é preferível utilizar tetra-hidrodaidzeína produzida na quinta etapa utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína; contudo, pode misturar-se tetra-hidrodaidzeína disponível comercialmente, a composição do material inicial de síntese, a composição da enzima, etc., com a tetra-hidrodaidzeína produzida na quinta etapa. Célula recombinante utilizada na sexta etapa

Pode-se utilizar qualquer célula recombinante na sexta etapa, desde que a célula contenha o polinucleótido E2 descrito na secção C-2 e seja capaz de expressar o polinucleótido E3. Um exemplo é uma célula recombinante detalhada na secção C-4. 112

Produção da enzima que consiste no polipéptido E3 utilizando a célula recombinante que comporta o polinucleótido E3 A enzima que consiste no polipéptido E3 pode ser produzida por cultura da célula recombinante após a introdução do polinucleótido E3 e recolhendo o polipéptido E3 das células e/ou da cultura. 0 mesmo procedimento e as mesmas condições que da secção de "produção enzimática que consiste no polipéptido EI utilizando células recombinante comportando o polinucleótido El" podem ser utilizados para a incubação da célula recombinante fornecida com o polinucleótido E3, o meio de cultura e o isolamento/purificação do polipéptido E3.

Polinucleótidos El a E3 0 quarto processo de produção da presente invenção utiliza pelo menos um dos polinucleótidos El a E3, que estão detalhados nas secções A-2, B-2 e C-2 anteriores, respectivamente. D-I-8. Produto contendo di-hidrodaidzeína, tetra-hidro-daidzeína e/ou eguol, produzido pelo quarto processo de produção A presente invenção tem por objecto um produto contendo di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol, produzidos pelo quarto processo de produção descrito antes.

Tal como descrito antes, o quarto processo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol, combinando de forma apropriada da quarta até à sexta etapa. 113

De acordo com isto, o produto produzido pelo quarto processo de produção da presente invenção contém di-hidro-daidzeína, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol. 0 produto pode ser utilizado sob a forma de solução, conforme produzido no quarto processo de produção ou pode ser um produto de di-hidrodaidzeina, um produto de tetra-hidrodaidzeina ou um produto de equol obtido de uma solução purificada grosseiramente ou purificada apropriadamente. 0 produto pode ser incorporado em alimentos, bebidas ou materiais para produtos de maquilhagem, produtos medicinais, etc., ou pode ser utilizado como um substrato. D-II-1. Um dispositivo para produzir di-hidrodaidzeína, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol, fornecido com pelo menos um do primeiro reactor até ao terceiro reactor A presente invenção tem por objecto um dispositivo para a produção de di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol, fornecido com pelo menos um do primeiro reactor ao terceiro reactor (daqui para a frente, este dispositivo será ocasionalmente referido como "primeiro dispositivo de produção").

Primeiro reactor 0 primeiro reactor é um recipiente de reacção com meios de reacção (daqui para a frente, estes meios serão ocasionalmente referidos como "meios de reacção 1") em que uma enzima que consiste num dos polipéptidos (Aa) a (Ac) (polipéptidos El) é imobilizada. Este reactor é utilizado para a produção de di-hidrodaidzeina a partir de daidzeina utilizando o polipéptido. Neste reactor, os meios de reacção 114 estão dispostos numa posição que permitem o contacto com a daidzeina.

Segundo reactor 0 segundo reactor é um recipiente de reacção com meios de reacção (daqui para a frente, estes meios serão ocasionalmente referidos como "meios de reacção 2") em que uma enzima que consiste num dos polipéptidos (Ba) a (Bc) (polipéptidos E2) está imobilizada. Este reactor é utilizado para a produção de tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeína utilizando o polipéptido. No reactor, os meios de reacção estão dispostos numa posição que permite o contacto com a di-hidrodaidzeina.

Terceiro reactor 0 terceiro reactor é um recipiente de reacção com meios de reacção (daqui para a frente, estes meios serão ocasionalmente referidos como "meios de reacção 3") em que uma enzima que consiste num dos polipéptidos (Ca) a (Cc) (polipéptidos E3) é imobilizada. Este reactor é utilizado para a produção de equol a partir de tetra-hidrodaidzeina utilizando o polipéptido. No reactor, os meios de reacção estão dispostos numa posição que permitem o contacto com a tetra-hidrodaidzeina. 0 primeiro dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol combinando de forma apropriada desde o primeiro ao terceiro reactor. 115 0 primeiro dispositivo de produção da presente invenção tem pelo menos o primeiro reactor, o segundo reactor e o terceiro reactor.

Por exemplo, quando o primeiro dispositivo de produção da presente invenção tem o primeiro reactor e não tem o segundo reactor e o terceiro reactor, o primeiro dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeína a partir de daidzeina.

Por exemplo, quando o primeiro dispositivo de produção da presente invenção tem o segundo reactor e não tem o primeiro reactor e o terceiro reactor, o primeiro dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de tetra-hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeina.

Por exemplo, quando o primeiro dispositivo de produção da presente invenção tem o terceiro reactor e não tem o primeiro reactor e o segundo reactor, o primeiro dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de equol a partir de tetra-hidrodaidzeina.

Por exemplo, quando o primeiro dispositivo de produção da presente invenção tem o primeiro reactor e o segundo reactor e não tem o terceiro reactor, o primeiro dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeina a partir de daidzeina e tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeina.

Por exemplo, quando o primeiro dispositivo de produção da presente invenção tem o segundo reactor e o terceiro reactor e não tem o primeiro reactor, o primeiro dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de tetra- 116 hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeína e equol a partir de tetra-hidrodaidzeina.

Por exemplo, quando o primeiro dispositivo de produção da presente invenção tem o primeiro reactor, o segundo reactor e o terceiro reactor, o primeiro dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeína a partir de daidzeína, tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeina e equol a partir de tetra-hidrodaidzeina.

No primeiro dispositivo de produção da presente invenção, um único reactor pode ter dois dos meios de reacção 1 a 3.

Por exemplo, quando se fornecem os meios de reacção 1 e 2 num único reactor, as respectivas reacções realizadas no primeiro reactor e no segundo reactor podem ser feitas num recipiente de reacção. Além disso, por exemplo, quando os meios de reacção 1 a 3 são fornecidos num único reactor, as respectivas reacções realizadas no primeiro ao terceiro reactor podem ser realizadas num único reactor.

Na medida em que se assegura o efeito desejado, a forma de montar estas reacções significa que um reactor não está limitado.

Além disso, quando o primeiro dispositivo de produção da presente invenção tem pelo menos dois dos meios de reacção 1 a 3 e vários reactores diferentes, os reactores estão ligados por via dos meios fornecidos.

Por exemplo, quando o primeiro dispositivo de produção da presente invenção tem o primeiro reactor e o segundo 117 reactor e não tem o terceiro reactor, em que o primeiro reactor e o segundo reactor são unidades independentes e o primeiro reactor e o segundo reactor contêm os meios de reacção 1 e 2, respectivamente; o primeiro reactor e o segundo reactor estão ligados pelos meios fornecidos para carregar o produto de di-hidrodaidzeina produzido no primeiro reactor para o segundo reactor.

Além disso, por exemplo, quando o primeiro dispositivo de produção da presente invenção compreende os meios de reacção 1 e 2 num reactor e os meios de reacção 3 no outro reactor; o reactor contendo os meios de reacção 1 e 2 e o reactor contendo os meios de reacção 3 estão ligados por meio dos meios de carga para carregar o produto produzido no reactor contendo os meios de reacção 1 e 2, para o reactor contendo os meios de reacção 3. 0 produto pode estar sob a forma de solução conforme é produzido ou pode ser um produto de di-hidrodaidzeina, etc., obtido por uma solução purificada grosseiramente ou apropriadamente.

Reactor

As formas, dimensões, materiais, etc., desde o primeiro reactor ao terceiro reactor, providenciadas no primeiro dispositivo de produção da presente invenção não estão limitadas, desde que cada recipiente seja capaz de conter os meios de reacção e de produzir apropriadamente di-hidrodaidzeína, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol. 118

Meios de Reacção

Os meios de reacção 1 a 3 utilizados no primeiro dispositivo de produção da presente invenção não estão limitados, desde que contenham uma enzima respectivamente imobilizada e que sejam capazes de produzir apropriadamente di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeína e/ou equol. A respectiva enzima imobilizada em cada meio de reacção pode estar purificada grosseiramente ou apropriadamente (de uma forma pura) . A imobilização da enzima, que consiste num dos polipéptidos nos meios de reacção, é realizada utilizando um processo conhecido.

Por exemplo, quando a enzima é imobilizada num veiculo, o veiculo não está limitado desde que possa ser exibida a actividade desejada da enzima. Exemplos do veiculo incluem um veiculo com um grupo funcional que se pode ligar à enzima através de uma ligação covalente, tal como, os grupos amino, os grupos carboxilo ou os grupos hidroxilo; e um veiculo que se possa ligar à enzima que consiste num polipéptido, por via de um ligante. A forma do veiculo não está limitada. 0 veiculo, o grupo funcional e o ligante, etc., seleccionam-se, apropriadamente, de acordo com a técnica conhecida adoptada para a imobilização de uma enzima num veículo. A imobilização da enzima consiste no polipéptido no veiculo ser também produzido utilizando um processo conhecido.

Meios de carga

Os meios de carga providenciados no primeiro dispositivo de produção da presente invenção não estão limitados desde que sejam capazes de ligar vários reactores diferentes utilizados no primeiro dispositivo de produção da presente 119 invenção e capazes de produzir di-hidrodaidzeína, tetra hidrodaidzeina e/ou equol no primeiro dispositivo de produção da presente invenção. Os meios de carga são realizados por meios apropriados de acordo com tecnologias conhecidas e adequadas.

Polipéptidos EI a E3

Os polipéptidos EI a E3 utilizados no primeiro dispositivo de produção da presente invenção são os mesmos que foram referidos antes.

Produção de di-hidrodaidzeina no primeiro reactor

No primeiro reactor faz-se com que uma enzima, que consiste no polipéptido EI imobilizado nos meios de reacção 1, actue sobre daidzeina na presença de NADPH e/ou NADH, convertendo assim daidzeina em di-hidrodaidzeina. A enzima, que consiste no polipéptido El, pode ser imobilizada nos meios de reacção, em conjunto com NADPH e/ou NADH que serve como uma co-enzima da enzima que consiste no polipéptido El. A reacção no primeiro reactor realiza-se de acordo com o processo detalhado na explicação anterior da "primeira etapa".

Produção de tetra-hidrodaidzeina no segundo reactor

No segundo reactor faz-se com que uma enzima, que consiste no polipéptido E2, imobilizado nos meios de reacção 2, actue sobre di-hidrodaidzeina, na presença de NADPH e/ou NADH, convertendo assim di-hidrodaidzeina em tetra-hidrodaidzeina. A enzima que consiste no polipéptido E2 pode ser imobilizada nos meios de reacção em conjunto com NADPH e/ou NADH que servem como co-enzima da enzima que consiste no 120 polipéptido E2. A reacção no segundo reactor realiza-se de acordo com o processo detalhado na explicação anterior da "segunda etapa".

Produção de eguol no terceiro reactor

No terceiro reactor faz-se com que uma enzima, que consiste no polipéptido E3 imobilizado nos meios de reacção 3, actue sobre tetra-hidrodaidzeina, convertendo assim tetra-hidrodaidzeína em equol. A reacção no terceiro reactor realiza-se de acordo com o processo detalhado na explicação anterior da "terceira etapa". D-II-2. Um dispositivo para a produção de di-hidrodaidzeína, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol, compreendendo pelo menos um dos quatro ao sexto reactor A presente invenção tem por objecto um dispositivo para a produção de di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol, compreendendo pelo menos um dos quatro ao sexto reactores que se seguem (daqui para a frente, este dispositivo será ocasionalmente referido como "segundo dispositivo de produção").

Quarto reactor de reacção com meios de estes meios serão de reacção 4") em que num dos polinucleótidos está imobilizada. Este de di-hidrodaidzeina a polinucleótido. Neste 0 quarto reactor é um recipiente reacção (daqui para a frente, ocasionalmente referidos como "meios uma célula recombinante, que consiste de (Ad) a (Af) (polinucleótidos El) reactor é utilizado para a produção partir de daidzeina, utilizando o 121 reactor, os meios de reacção estão dispostos numa posição que permitem o contacto com daidzeina.

Quinto reactor 0 quinto reactor é um recipiente de reacção com meios de reacção (daqui para a frente, estes meios serão ocasionalmente referidos como "meios de reacção 5") em que uma célula recombinante, que consiste num dos polinucleótidos (Bd) a (Bf) (polinucleótidos E2) está imobilizada. Este reactor é utilizado para a produção de tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeina, utilizando o polinucleótido. Neste reactor, os meios de reacção estão dispostos numa posição que permitem o contacto com di-hidrodaidzeina.

Sexto reactor 0 sexto reactor é um recipiente de reacção com meios de reacção (daqui para a frente, estes meios serão ocasionalmente referidos como "meios de reacção 6") em que uma célula recombinante, que consiste num dos polinucleótidos (Cd) a (Cf) (polinucleótidos E3) está imobilizada. Este reactor é utilizado para a produção de equol a partir de tetra-hidrodaidzeina utilizando o polinucleótido. Neste reactor, os meios de reacção são dispostos numa posição que permitem o contacto com tetra-hidrodaidzeina. 0 segundo dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol por uma combinação apropriada dos quarto a sexto reactores. 122 0 segundo dispositivo de produção da presente invenção tem pelo menos um do quarto reactor, quinto reactor e sexto reactor.

Por exemplo, quando o segundo dispositivo de produção da presente invenção tem o quarto reactor e não tem o quinto reactor e o sexto reactor, o segundo dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeína a partir de daidzeína.

Por exemplo, quando o segundo dispositivo de produção da presente invenção tem o quinto reactor e não tem o quarto reactor e o sexto reactor, o segundo dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de tetra-hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeína.

Por exemplo, quando o segundo dispositivo de produção da presente invenção tem o sexto reactor e não tem o quarto reactor nem o quinto reactor, o segundo dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de equol a partir de tetra-hidrodaidzeína.

Por exemplo, quando o segundo dispositivo de produção da presente invenção tem o quarto reactor e o quinto reactor e não tem o sexto reactor, o segundo dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeína a partir de daidzeína e tetra-hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeína .

Por exemplo, quando o segundo dispositivo de produção da presente invenção tem o quinto reactor e o sexto reactor e não tem o quarto reactor, o segundo dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de tetra- 123 hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeína e equol a partir de tetra-hidrodaidzeina.

Por exemplo, quando o sequndo dispositivo de produção da presente invenção tem o quarto reactor, o quinto reactor e o sexto reactor, o sequndo dispositivo de produção da presente invenção permite a produção de di-hidrodaidzeína a partir de daidzeína, tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeína e equol a partir de tetra-hidrodaidzeina.

No segundo dispositivo de produção da presente invenção, um único reactor pode ter dois dos meios de reacção 4 a 6.

Por exemplo, quando se fornecem os meios de reacção 4 e 5 num único reactor, as respectivas reacções, realizadas no quarto reactor e no quinto reactor podem ser realizadas num reactor. Além disso, por exemplo, quando se fornecem os meios de reacção 4 a 6 num único reactor, as respectivas reacções, realizadas no quarto a sexto reactor podem ser realizadas num só reactor.

Na medida em que se assegurem os efeitos desejados, a forma de montagem destes meios de reacção nos reactores não está limitada.

Além disso, quando o segundo dispositivo de produção da presente invenção tem pelo menos dois dos meios de reacção 4 a 6 e vários reactores diferentes, os reactores estão ligados por meios de carga.

Por exemplo, quando o segundo dispositivo de produção da presente invenção tem o quarto reactor e o quinto reactor e não tem o sexto reactor, em que o quarto reactor e o quinto reactor são unidades independentes e o quarto reactor e o 124 quinto reactor contêm os meios de reacção 4 e 5, respectivamente; o quarto reactor e o quinto reactor estão ligados por via de meios de carga, para fazer a carga de um produto de di-hidrodaidzeina, produzido no quarto reactor para o quinto reactor.

Além disso, por exemplo, quando o segundo dispositivo de produção da presente invenção contém os meios de reacção 4 e 5 num reactor e os meios de reacção 6 noutro reactor; o reactor contendo os meios de reacção 4 e 5 e o reactor contendo os meios de reacção 6 estão ligados por via de meios de carga para carregar um produto produzido no reactor contendo os meios de reacção 4 e 5 para o reactor contendo os meios de reacção 6. 0 produto pode estar na forma de uma solução, conforme produzido ou pode ser um produto de di-hidrodaidzeina, etc., obtido por purificação grosseira ou apropriada da solução.

Reactor

As formas, dimensões, materiais, etc., do quarto reactor ao sexto reactor providenciados no segundo dispositivo de produção da presente invenção não estão limitados, desde que cada recipiente seja capaz de conter os meios de reacção e de produzir, apropriadamente, di-hidrodaidzeina, tetra-hidro-daidzeína e/ou equol.

Meios de reacção

Os meios de reacção 4 a 6 a serem utilizados no segundo dispositivo de produção da presente invenção não estão limitados desde que contenham uma célula recombinante imobilizada, respectivamente e sejam capazes de produzir 125 apropriadamente di-hidrodaidzeína, tetra-hidrodaidzeína e/ou equol. A imobilização da célula recombinante nos meios de reacção não está limitada desde que a desejada actividade da célula recombinante possa ser exibida e realizada utilizando um processo conhecido. A célula recombinante pode ser incubada nos meios de reacção. As condições para a incubação das células recombinantes são determinadas de acordo com as explicações anteriores da "quarta etapa", "quinta etapa" e "sexta etapa".

Meios de carga

Os meios de carga providenciados no segundo dispositivo de produção da presente invenção não estão limitados desde que sejam capazes de ligar vários reactores diferentes utilizados no segundo dispositivo de produção da presente invenção e capazes de produzir di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeína e/ou equol no segundo dispositivo de produção da presente invenção. Os meios de carga são realizados por meios apropriados de acordo com uma tecnologia apropriada conhecida. Células recombinantes

As células recombinantes utilizadas no segundo dispositivo de produção da presente invenção são as mesmas que estão detalhadas nas secções anteriores "células recombinantes utilizadas na quarta etapa", "células recombinantes utilizadas na quinta etapa" e "células recombinantes utilizadas na sexta etapa". 126

Polipéptidos El a E3

Os polinucleótidos El a E3 utilizados no segundo dispositivo de produção da presente invenção são os mesmos que os anteriores.

Produção de di-hidrodaidzeína no quarto reactor 0 quarto reactor converte daidzeina em di-hidrodaidzeina utilizando uma célula recombinante que consiste no polinucleótido El imobilizado nos meios de reacção 4. A reacção no quarto reactor realiza-se de acordo com o processo detalhado antes na explicação da "quarta etapa".

Produção de tetra-hidrodaidzeina no quinto reactor 0 quinto reactor converte di-hidrodaidzeina em tetra-hidrodaidzeina utilizando uma célula recombinante que consiste no polinucleótido E2 imobilizado nos meios de reacção 5. A reacção no quinto reactor realiza-se de acordo com o processo detalhado antes na explicação da "quinta etapa".

Produção de equol no sexto reactor 0 sexto reactor converte tetra-hidrodaidzeina em equol utilizando uma célula recombinante que consiste no polinucleótido E3 imobilizado nos meios de reacção 6. A reacção no sexto reactor realiza-se de acordo com o processo detalhado antes na explicação da "sexta etapa". 127 D-II-3. Dispositivo para a produção de di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeina e/ou eguol, compreendendo pelo menos um do primeiro ao terceiro reactores e pelo menos um do quarto ao sexto reactores A presente invenção tem por objecto um dispositivo para a produção de di-hidrodaidzeina, tetra-hidrodaidzeina e/ou equol, compreendendo pelo menos um do primeiro ao terceiro reactores e pelo menos um do quarto ao sexto reactores (daqui para a frente, este dispositivo será ocasionalmente referido como "terceiro dispositivo de produção").

As combinações dos reactores, dos meios de reacção no terceiro dispositivo de produção são feitas de acordo com as do primeiro e do segundo dispositivos de produção anteriores. Os reactores, os meios de reacção, os polinucleótidos, as células recombinantes e os processos de reacção nos reactores no terceiro dispositivo de produção são os mesmos que os dos primeiro e segundo dispositivos de produção referidos anteriormente.

Exemplos

Exemplo A

Exemplo de referência AI

Inoculou-se uma estirpe 20-93 de Lactococcus (FERM BP-10036) num meio liquido de amplificação contendo daidzeina (um meio de caldo GAM modificado (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.) em que se adicionou daidzeina numa quantidade de 10 yg/mL) e incubou-se a cultura, a 37 °C, durante as horas apropriadas, de 7 a 18 horas, em condições anaeróbicas (sistemas BBL Gas Pack) . Após a incubação, recolheram-se as 128 células por centrifugação e conservaram-se por criogenia, para serem utilizadas nos exemplos que se seguem.

Exemplo AI: Confirmação da actividade da biossíntese de di-hidrodaidzeina no sobrenadante centrifugado do material celular desagregado e confirmação da dependência de NADPH

Descongelaram-se as células congeladas (frasco de 67 mL x 2) e centrifugaram-se, a 4 °C, a 8 000 rpm, durante 10 minutos. Utilizou-se o agregado no ensaio que se segue. Em primeiro lugar, fez-se uma suspensão deste agregado em 2 mL de uma solução 0,1 M de fosfato de potássio contendo PMSF 1 mN (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), DTT 2 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e hidrossulfito de sódio 5 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Carregou-se a suspensão em dois tubos de 2 mL com tampas roscadas (Assist) e pré-complementou-se com pérolas de zircónio/silica 0,1 mM (BioSpec Products, Inc.). Desagregaram-se as células utilizando FastPrep® FP100A (Thermo ELECTRON CORPORATION) (6 500 rpm, 10 segundos, arrefecimento com gelo x 8) . Centrifugou-se o liquido resultante para se obter o sobrenadante. Centrifugou-se a suspensão das células desagregadas, a cerca de 10 000 rpm, a 4 °C, durante 10 minutos, para se obter um sobrenadante, que foi depois diluído com 4,5 mL de uma solução 0,1 M de fosfato de potássio contendo PMSF 1 mM, DTT 2 mM e hidrossulfito de sódio 5 mM. Utilizou-se como a fonte de enzimas.

Preparou-se uma mistura reaccional da enzima da composição anterior e incubou-se a mistura, a 37 °C, durante 2 horas. Após a incubação, adicionou-se 3 mL de acetato de etilo à mistura reaccional das enzimas para a extracção. Após secagem, dissolveu-se o extracto por meio de uma fase móvel (eluente). Analisou-se o produto dissolvido por CLAR. Como 129 solução-padrão para análise por CLAR, utilizou-se uma solução mista de daidzeina (2 yg/mL; Funakoshi Corporation), equol (2 yg/mL; Funakoshi Corporation), di-hidrodaidzeina (2 yg/mL; Toronto Research Chemicals Inc.)·

Composição da mistura reaccional enzimática

Sobrenadante de células desagregadas (fonte de enzimas): 250 pL Água esterilizada, NADH (100 mM) ou NADPH (100 mM): 5 pi

Di-hidrodaidzeina (1 mc/mL): 10 pL

Tampão de fosfato de potássio 0,1 M a pH 7/DTT 1 mM/ hidrossulfito de sódio 5 mM: 735 pL

Total: 1000 pL

Os resultados estão ilustrados na figura 1. Os resultados confirmaram a presença da actividade de biossintese de di-hidrodaidzeina no sobrenadante centrifugado do material de células desagregadas. Confirmou-se também que a conversão de daidzeina em di-hidrodaidzeina é dependente da co-enzima NADH.

Exemplo A2: Purificação da enzima de síntese da di-hidro-daidzeína

Incubaram-se células da estirpe 20-92 de Lactococcus, durante 18 horas, num meio de caldo de GAM modificado (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.), a 67 mL por frasco de incubação. As células da cultura de nove desses frascos foram centrifugadas e suspensas num tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7) contendo DTT 2 mM (1,4-ditiotreitol, Merck), hidrossulfito de sódio 5 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e inibidor de proteinase (cocktail completo de inibidor de proteinase isento de EDTA, Roche Diagnostics). Carregou-se a suspensão em três tubos de 2 mL com tampas roscadas (Assist) que continham previamente pérolas de zircónio/sílica 0,1 mM (BioSpec Products, Inc.). Desagregaram-se as células utilizando o FastPrep® FP100A (Thermo ELECTRON CORPORATION) 130 (6 500 rpm, 20 segundos x 4) . Centrifugou-se o líquido resultante, para se obter um sobrenadante. Incubaram-se as células da estirpe 20-92 de Lactococcus, durante 18 horas, no mesmo meio líquido, a 200 mL por frasco de incubação. As células da cultura de oito desses frascos foram centrifugadas, para se obter um sobrenadante equivalente a oito frascos.

Realizou-se a purificação utilizando um tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0) (daqui para a frente "tampão A") contendo PMSF 1 mM (fluoreto de fenilmetil-sulfonilo, Sigma Aldrich) , DTT 2 mM e hidrossulfito de sódio 5 mM. O sobrenadante das células desagregadas foi misturado com tampão A contendo a mesma quantidade de sulfato de amónio 2 M e colocou-se em micro-colunas bio spin (x 11, Bio-Red Laboratories, Inc.) cheias de sefarose de butilo 4, de fluxo rápido (o gel estava a cerca de 0,3 mL por frasco, GE Healthcare) e foi equilibrado com tampão A contendo sulfato de amónio 1 M. Depois de se lavar com tampão A contendo sulfato de amónio 1 M e das duas lavagens subsequentes com 0,75 mL de tampão A contendo sulfato de amónio 0,5 M, adicionou-se 0,75 mL e depois 0,5 mL de tampão A para eluir uma fracção que tinha actividade de síntese de di-hidro-daidzeína. Daqui para a frente, o produto eluído obtido pela adição de 0,75 mL de tampão A é referido como o produto eluído I e o produto eluído obtido pela adição de 0,5 mL de tampão A é referido como o produto eluído II.

Adicionou-se 0,3 mL e 0,2 mL de tampão A contendo sulfato de amónio 3,4 M ao produto eluído I (com 0,75 mL de tampão A) e ao produto eluído II (com 0,5 mL de tampão A), respectivamente. Depois, misturaram-se os dois produtos eluídos para serem submetidos a CLAR utilizando uma coluna de gel TSK éter-5PW (TOSOH) equilibrada com um eluente contendo 131 sulfato de amónio 1 M. Verteu-se 0,5 mL da solução da mistura na coluna, 2 a 9 vezes, seguido de lavagem a uma velocidade de fluxo de 0,1 mL/min, utilizando um eluente contendo sulfato de amónio 1 M (eluente B) . Depois, alterou-se a proporção da mistura entre o eluente B e o eluente A utilizando um programa de modo que a concentração de sulfato de amónio descesse linearmente até 0 M (eluente A) , em 15 minutos. Verificou-se que a actividade enzimática na posição de sulfato de amónio era de 0,6 M a 0,35 M e todo o produto eluido era de cerca de 3,5 mL. A seguir mostram-se as condições da CLAR. Observou-se a absorção da proteina a 280 nm.

Coluna: gel TSK éter-5PW

Velocidade do fluxo: 0,05 a 0,1 mL/min na amostra fornecida, 0,1 mL/min na eluição

Eluente A: tampão de fosfato de potássio 0,1 M

(pH 7,0)/2 mM DTT/hidrossulfito de sódio 2,5 mM/2-propanol a 1 %

Eluente B: eluente A contendo sulfato de amónio 1 M O produto eluido da posição de eluição em que se

verificou a actividade enzimática estava diluído com tampão A e o liquido diluído foi submetido a uma micro-coluna bio spin cheia com 2'5' ADP sefarose 4B (GE Healthcare; o gel era de cerca de 0,3 mL por frasco), equilibrada com tampão A. Após a lavagem da coluna com tampão A, eluiu-se a fracção com actividade de síntese de di-hidrodaidzeína com 0,7 mL e depois com 0,6 mL de um líquido com a composição do tampão A a pH 7,5 contendo NADPH 20 mM. O produto eluido obtido foi submetido a CLAR utilizando uma coluna Mono Q (GE Healthcare) equilibrada com eluente C (pH 7,5). O eluente C foi fornecido à coluna a uma velocidade 132 de fluxo =0,1 mL/min. Após a lavagem, a proporção na mistura entre o eluente C e o eluente D foi alterada para realizar um programa para linearizá-la para NaCl 0,65 M, durante 32,5 minutos. A seguir mostram-se as condições da CLAR. Observou-se a absorção da proteina a 280 nm.

Coluna: Mono Q PC 1,6/5

Eluente C: tampão de fosfato de potássio 0,1 Ma pH 7,5/DTT 3 mM/hidrossulfito de sódio 2,5 mM/2-propanol a 1 9- _L t)

Eluente D: eluente C contendo NaCl 1 M A actividade enzimática foi observada na fracção de NaCl de 0,4 a 0,46 M (fracções N°s. 28 a 30). A fig. 2 mostra o resultado da CLAR na coluna Mono Q e a actividade enzimática. A fig. 3 mostra o resultado da EGPA-SDS para as fracções N°s. 27 a 31. De acordo com estes resultados, observou-se uma banda de 70 kDa na fracção que tinha actividade de síntese de di-hidrodaidzeína, nas condições da reacção.

Exemplo A3: Determinação da sequência de aminoácidos de terminal N

Adicionou-se 30 pL de ácido trifluoroacético a 0,1 % (TFA) a 70 pL da fracção N°. 29 com actividade de síntese de di-hidrodaidzeína, obtida numa CLAR com uma coluna Mono Q (100 pL no total).

Humedeceu-se uma membrana de PVDF de um cartucho ProSorb (Applied Biosystems, Japão) , com 10 pL de metanol e adicionou-se o líquido da mistura anterior. Após a absorção de água utilizando, um ProSorb (Applied Biosystems, Japão), secou-se a membrana e depois cortou-se utilizando uma 133 perfuradora de membranas (Applied Biosystems, Japão). Lavou- se a membrana, cinco vezes, com metanol a 20 % e secou- se. Submeteu-se a membrana a uma análise da sequência de aminoácidos de terminal N utilizando um sequenciador de proteínas (Applied Biosystems, Procise 494cLC), verificando-se assim uma sequência continua de aminoácidos com os 22 resíduos que se seguem. Met Lis Asn Lis Fen Tir Pro Lis Tre Fen Glu Arg Gli Tir Ile Gli Asn Leu Glu Vai Glu Asn (SEQ ID N° . 19) .

Exemplo A4: Determinação da sequência de aminoácidos actividade de utilizando uma de aminoácidos sequência de A proteína da enzima que exibia uma síntese de di-hidrodaidzeína foi fragmentada enzima de digestão num péptido. A sequência interna foi verificada por análise da aminoácidos no terminal N do péptido. (1) Preparação da amostra

Incubaram-se células da estirpe 20-92 de Lactococcus, durante 18 horas, num meio de caldo de GAM modificado (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.), a 200 mL por frasco de cultura. Centrifugaram-se três estirpes das células da cultura e fez-se uma suspensão num tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0), contendo DTT 2 mM (1,4-ditiotreitol, Merck), hidrossulfito de sódio 5 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e inibidor de proteinase (um cocktail completo de inibidor de proteinase isento de EDTA, Roche Diagnostics) . Depois transferiu-se a suspensão para um tubo de 2 mL (Assist) que tinha uma tampa roscada e continha pérolas de zircónio/sílica 0,1 mM (BioSpec Products, Inc.). Desagregaram-se as células utilizando o FastPrep® FP100A (Thermo ELECTRON CORPORATION) (6 500 rpm, 20 segundos x 4). 134

Centrifugou-se o líquido resultante para se obter um sobrenadante.

No processo que se segue utilizou-se um tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7) (daqui para a frente "tampão A") contendo PMSF 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonilo, Sigma Aldrich) , DTT 2 mM e hidrossulfito de sódio 5 mM. Misturou-se o sobrenadante das células desagregadas com tampão A contendo uma quantidade equivalente de sulfato de amónio 2 M e colocaram-se em micro-colunas bio spin (x 3, Bio-Red Laboratories, Inc.) cheias com butil-sefarose 4 de fluxo rápido (o gel foi cerca de 0,3 mL por frasco, GE Healthcare), equilibrada com tampão A, contendo sulfato de amónio 1 M. Depois de se lavar com tampão A contendo sulfato de amónio 1 M e da subsequente lavagem, duas vezes, com 0,7 5 mL de tampão A, contendo sulfato de amónio 0,5 M, adicionou-se, duas vezes, 0,75 mL de tampão A para eluir uma fracção com actividade de síntese de di-hidrodaidzeína.

Equilibrou-se uma micro-coluna bio spin cheia com 2'5'ADP sefarose 4B, equilibrada com tampão A e depois adicionou-se 1,5 mL da solução eluída antes. Depois de se lavar, cinco vezes, com 0,75 mL de tampão A, realizou-se a eluição utilizando 0,75 mL e depois 0,45 mL de tampão A, contendo NADPH 20 mN. Misturaram-se os produtos eluídos e dessalinizaram-se e concentraram-se para 5 yL num tubo de concentração de micro-centrifugação (NANOSEP 10K OMEGA, Pall Life Sciences).

Misturou-se a solução concentrada com um tampão da amostra para EGPA-SDS duplamente concentrada, contendo 2-mercaptoetanol; e aqueceu-se a mistura, durante sete minutos, a 90 °C, antes de a submeter a EGPA-SDS, de acordo com o processo de Laemmuli. Utilizou-se a SuperSep HG a 10-20 % 135 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como a placa de gel de electroforese. Depois de se corar com azul coloidal (Invitrogen) e da subsequente descoloração com água Milli-Q, retirou-se uma banda de electroforese de 70 kDa. Como controlo, cortou-se gel equimolar e com uma dimensão equivalente da mesma porção numa tira em áreas de electroforese sem proteínas e tratou-se da mesma maneira. Tratou-se um outro grupo de células da mesma maneira e transferiram-se as células para uma membrana de PVDF depois da EGPA-SDS. Depois, submeteu-se uma banda, na mesma posição, à análise da sequência de aminoácidos de terminal N, de modo a confirmar a consistência com a sequência da fracção N°. 29 na CLAR em coluna Mono Q. (2) Geração de carboxamidometilo reduzido e digestão da enzima

Cortaram-se os géis retirados em bocados, descoraram-se utilizando uma solução aquosa a 50 % de acetonitrilo, desidrataram-se por meio de acetonitrilo e secaram-se com um espessante centrífugo (SpeedVac A160, Savant). Depois de se adicionar uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de amónio 100 mM, contendo DTT 55 mM, realizou-se a redução, durante uma hora, a 56 °C. Depois de se retirar a solução de DTT, adicionou-se uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de amónio 100 mM, contendo iodoacetamida 100 mM e bloqueou-se a mistura por meio da luz e agitou-se ligeiramente, durante 30 minutos para gerar carboxamidometilo. Depois da eliminação do reagente da reacção, lavou-se o gel sequencialmente com uma solução aquosa a 50 % de acetonitrilo, acetonitrilo, uma solução aquosa de hidrogeno-carbonato de amónio 100 mM e acetonitrilo, antes de se secar por meio de um espessante centrífugo. Adicionou-se tampão Tris-HCL 20 mM (pH 9), contendo 2 pg de protease I de Achromobacter (Wako Pure 136

Chemical Industries, Ltd.) e Tween 20 a 0,02 % e fez-se a digestão, a 37 °C, durante sete horas. Transferiu-se o sobrenadante centrifugado para outro tubo e misturou-se o gel com acetonitrilo a 60 % - solução aquosa de TFA a 0,1 % e agueceu-se, a 30 °C, durante 20 minutos. A mistura aquecida foi agitada em frascos, durante 10 minutos, 3 vezes, para se obter fragmentos do péptido. Recolheu-se o sobrenadante e filtrou-se utilizando Ultrafree-MC (0,22 ym, Amicon), seguido de concentração por centrifugação. (3) Mapeamento do péptido

Através da CLAR de fase inversa, isolou-se o péptido resultante da digestão feita com enzimas.

Coluna: yRPC C2/C18 SC2,1/10 (GE Healthcare Bio Science)

Velocidade do fluxo: 0,1 mL/min

Eluente E: TFA a 0,05 %

Eluente F: acetonitrilo a 90 %/TFA a 0,04 %

Programa de eluição: 0 minutos: F a 5 % 3 minutos: F a 5 % 43 minutos: F a 65 % 48 minutos: F a 100 % 68 minutos: F a 100 %

Fracção: 30 yL

Detecção: 215 nm

Por exemplo, "0 minutos de B a 5 %" indica a utilização de um eluente contendo o eluente E e o eluente F numa proporção de 95 % e 5 %, respectivamente, no momento 0 da eluição. (4) Análise da sequência interna de aminoácidos 137

Em comparação com o cromatograma de controlo, seleccionou-se um pico de péptido derivado da proteína enzimática exibindo actividade de síntese de di-hidrodaidzeína e realizou-se uma análise da sequência de aminoácidos de terminal N utilizando um sequenciador de proteínas (Applied Biosystems, Procise 492HT). Após o início da separação utilizando CLAR de fase inversa, começou-se a eluição aos 20,6 minutos. A seguir mostra-se a sequência de aminoácidos (daqui para a frente, péptido 1) do pico da eluição.

Fen Asp Glu Pro Vai Tir Pro Gin Ala Glu (SEQ ID N°. 20) A seguir mostra-se a sequência de aminoácidos (daqui para a frente, péptido 2) do pico da eluição que começou aos 22,1 minutos.

Ala Ser Arg Met Vai Met Asp Ala Vai His Glu Gli Tir Ile

Ala Gli (SEQ ID N°. 21) O pico da eluição que se iniciou aos 26,6 minutos era de um péptido que não tinha sido tratado especificamente de forma severa; contudo, como se mostra a seguir, o seu terminal N tinha glicina, isto é, o 13° resíduo a partir do terminal N da referida proteína da enzima (a sequência de aminoácidos que se segue é chamada a partir de agora péptido 3) .

Gli Tir Ile Gli Asn Leu Glu Vai Glu Asn Arg Ala Ile Arg

Met Pro Met (SEQ ID N°. 22) 138 A figura 4 mostra o resultado do mapeamento do péptido no exemplo A4 e as sequências de aminoácidos correspondendo aos respectivos picos.

Pico 1 (20,6 minutos)

Pico 2 (22,1 minutos)

Pico 3 (26,6 minutos)

Exemplo A5: Amplificação do gene da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína do terminal N e sequências parciais dos aminoácidos do péptido purificado

Com base nas sequências de aminoácidos parciais e do terminal N obtidas nos exemplos A3 e A4, concebeu-se e criou-se um iniciador degenerativo. Utilizando o ADN genómico da estirpe 20-92 de Lactococcus como matriz, tentou-se a amplificação do gene que codifica a enzima que sintetiza di-hidrodaidzeína por meio de RCP degenerativa. (1) Purificação do ADN genómico da estirpe 20-92 de Lactococcus

Fez-se uma incubação da estirpe 20-92 de Lactococcus em 40 mL de meio de cultura de um caldo GAM modificado (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.), em condições anaeróbicas e centrifugou-se, durante dez minutos, a 5 000 rpm, a 4 °C. Retirou-se o meio de cultura por decantação e recolheram-se as células bacterianas. As células foram imediatamente suspensas em 11 mL de uma solução BI (contendo 200 yg/mL de ARNase) no conjunto do tampão do ADN genómico da QIAGEN (Qiagen) e incubou-se, durante 16 horas, a 37 °C, depois de se ter misturado com 300 yL de uma solução de lisozima (100 mg/mL) e 500 yL de uma solução de proteinase K da QIAGEN (Qiagen). Em seguida, depois de se misturar várias vezes com 139 4 mL de uma solução de B2, incubou-se durante três horas, a 50 °C.

Centrifugou-se a cultura, durante dez minutos, a

5 000 rpm, a 4 °C. Verteu-se o sobrenadante numa coluna 500/G

Genomic-tip da QIAGEN (Qiagen) equilibrada com uma solução de QBT de modo que o ADN genómico aderisse à coluna. Depois de se lavar a coluna, duas vezes, com 30 mL de uma solução de QC, eluiu-se o ADN genómico da coluna utilizando 15 mL de QF; depois, adicionou-se 10,5 mL de isopropanol ao sal fora do ADN. Colocou-se então o ADN genómico semelhante ao precipitado num micro-tubo de 1,5 mL, lavou-se com etanol a 75 % e secou-se ao ar, antes de se dissolver em 250 pL de uma solução de TE (0,4 pg/pL). A concentração de ADN genómico assim obtida foi medida e depois ajustou-se a solução para 40 ng/pL por meio da adição de uma solução de TE. Esta solução de ADN foi utilizada como uma matriz para a RCP. (2) Concepção e produção de um iniciador degenerativo

Na concepção do iniciador degenerativo, para reduzir o grau de degenerescência, o codão que mais frequentemente se utiliza em cada aminoácido para a sequência com a extremidade 5', de acordo com informação sobre a utilização em codões (Codon Usage Database http://www.kazusa.or.jp/codon/) é o de Lactococcus garvieae. Depois, utilizou-se uma base mista para a sequência de terminal 3' para evitar um desemparelhamento com o gene das enzimas de síntese de di-hidrodaidzeína. O iniciador degenerativo que se segue foi concebido e criado com base na sequência de terminal N: MKNKFYPKTFERGYIGNLEVEN determinada no exemplo A3, para ser utilizada para a RCP degenerativa. 140

El-terminal N-31: TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGA (SEQ ID N°. 23) (Na SEQ ID N°. 23, "N" na 11a e na 14a posições representa inosina e "N" na 20a e na 26a posições representa adenina, guanina, citosina ou timina) El-terminal N-37: TGAAGAATAANT TNTAYCCNAARACNT TYGARRGNGG (SEQ ID N°. 24) (Na SEQ ID N°. 24, "N" nas 11a, 14a, 20a e 26a posições representa inosina e "N" na 35a posição representa adenina, guanina, citosina ou timina)

El-terminal N-F32: ATGAAGAATAAGTTTTAYCCNAARACNTTYGA (SEQ ID N°. 25) (Na SEQ ID N°. 25, "N" na 21a e na 27a posições representa adenina, guanina, citosina ou timina)

Além disso, concebeu-se e criou-se o iniciador degenerativo que se segue com base na sequência interna do péptido 2: ASRMVMDAVHEGYIAG determinada no exemplo A4, para ser utilizada para a RCP degenerativa.

El-interno-RPl: CCTGCAATATAACCTTCATGTACNGCRTCCATNACCAT (SEQ ID N°. 26) (Na SEQ ID N°. 26, "N" na 24a e na 33a posições representa adenina, guanina, citosina ou timina)

Todos os ADN dos oligoelementos utilizados como iniciadores no presente exemplo foram produzidos pela Sigma-Aldrich Japan K.K. 141 (3) Amplificação do genes da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína através de uma RCP degenerativa

Utilizando o iniciador degenerativo produzido, tentou-se a amplificação do gene da enzima de síntese de di-hidro- daidzeína por meio de uma RCP degenerativa. A seguir mostram-se as combinações dos iniciadores degenerativos utilizadas na RCP degenerativa. (i) El-terminal N-31 e El-interno-RPl (ii) El-terminal N-37 e El-interno-RPl (iii) El-terminal N-F32 e El-interno-RPl

Na amplificação dos genes da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína, através da RCP degenerativa, utilizou-se a polimerase de ADN Ex-Taq (Takara Bio Inc.). 0 programa de amplificação foi o seguinte: 95 °C, durante 2 min (95 °C, durante 45 seg; 38 °C a 54 °C, durante 30 seg; 72 °C, durante 2 min) x 50 ciclos e a 72 °C, durante 3 min. Tendo em consideração o desemparelhamento com o ADN do genoma do

iniciador degenerativo, realizou-se a hibridação em 5 etapas, começando a 38 °C, com um aumento de temperatura de 4 °C antes da adição de cada estádio, até a 54 °C. Depois da reacção de RCP, adicionou-se 1/10 de 10 x corante ao produto da RCP. Submeteu-se 6 yL do produto a electrof orese utilizando gel de agarose a 0,8 %. Na electrof orese com agarose no presente exemplo, a coloração realizou-se utilizando brometo de etídio; e λ/StiI (Nippongene Co. Ltd.) e utilizou-se uma malha de 100 pb (Toyobo Co. Ltd.) como marcadores de pesos moleculares. A figura 5 mostra o resultado da electroforese do produto proveniente da RCP degenerativa. Para a combinação 142 (El-terminal N-F32 e El-interno-RPl) do iniciador degenerativo (iii) em (3) do presente exemplo, observou-se uma amplificação de cerca de 1,9 kb no fragmento de ADN em todas as temperaturas de hibridação. 0 aumento mais significativo foi observado quando a temperatura de hibridação foi de 54 °C. (4) Determinação da sequência de base do fragmento de ADN amplificado 0 fragmento de ADN amplificado, de cerca de 1,9 kb (temperatura de hibridação = 54 °C) foi retirado do gel de agarose e purificado utilizando um estojo de extracção em gel (Qiagen). 0 fragmento de ADN purificado foi inserido num vector de clonagem pT7-Blue (Novagen) para determinar a sequência de base.

Ensaiou-se a sequência de base do ADN obtido utilizando o programa informático SEQUENCHER para preparar a sequência de ADN (Gene Codes Inc, USA) , com o resultado de que o fragmento de ADN continha as sequências de base dos aminoácidos dos péptidos 1 e 3 encontrados no exemplo A4.

Exemplo A6: Determinação de toda a sequência de bases do gene da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína

Para determinar as sequências da extremidade 5' e da extremidade 3' do gene da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína, de 1,9 kb, obtido no exemplo A5, de modo a terminar todas as sequências de bases, realizou-se a amplificação rápida da sequência terminal de ADNc (5'-, 3'- RACE) utilizando como matriz uma biblioteca de ADN genómico da estirpe 20-92 de Lactococcus. 143 (1) Produção da biblioteca de ADN genómico 0 ADN genómico da estirpe 20-92 de Lactococcus purificado no exemplo A5 foi fragmentado por meio de uma digestão de 16 horas, a 37 °C, utilizando as endonucleases de restrição (BamHI, EcoRI, HindIII, Kpnl, PstI, Saci, Sall, Sau3AI, Xhol: produtos da Takara Bio Inc.). Depois do tratamento com fenol/clorofórmio, purificou-se o fragmento por meio de uma sedimentação em etanol. Os fragmentos de ADN genómico purificados foram ligados com vectores de clonagem pUC19, que tinham sido previamente excisados por meio da endonuclease de restrição correspondente e desfosforilados por meio da fosfatase alcalina de Shrimp (Takara Bio Inc.), utilizando o estojo de ligação TaKaRa variante 2.1 (Takara Bio Inc.), produzindo assim uma biblioteca de ADN genómico. (2) Amplificação rápida da sequência do terminal de ADNc (5'-RACE, 3'-RACE)

Diluiu-se a biblioteca de ADN genómico (liquido reaccional de ligação), 20 vezes, com água esterilizada. A amplificação das sequências da extremidade 5' e da extremidade 3' do gene da enzima de síntese de di-hidro-daidzeína por meio de uma amplificação rápida das sequências de terminação do ADNc (5'-RACE, 3'-RACE) foi tentada utilizando uma matriz de 1 yL. (2-1) Iniciador A seguir indicam-se combinações de iniciadores utilizados para 5'-RACE, 3'-RACE, respectivamente. 144

(2-1-1) 5'-RACE

Primeira RCP: E1-RACE-N-P1 e pUCl9-FP-l, E1-RACE-N-P1 e pUCl9-RP-l RCP com iniciadores internos: E1-RACE-N-P2 e pUC19-FP-2, E1-RACE-N-P2 e pUC19-RP-2

(2-1-2) 3'-RACE

Primeira RCP: E1-RACE-RP2-1 e pUC19-FP-l, E1-RACE-RP2-1 e pUCl9-RP-l RCP com iniciadores internos: E1-RACE-RP2-2 e pUC19-FP-2, E1-RACE-RP2-2 e pUC19-RP-2 (2-1-3) Sequência do iniciador utilizado A seguir dão-se as sequências dos iniciadores utilizados para 5'-RACE, 3'-RACE, respectivamente.

Iniciadores para o vector: pUCl9-FP-l: ACACAGGAAACAGC TAT GAC CAT GAT TAC G (SEQ ID N° . 27) pUCl9-RP-l: AGCTGGCGAPAGGGGGATGTGCTGCAAGGC (SEQ ID N° . 28) pUCl9-FP-2: ATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGG (SEQ ID N° . 29) pUCl9-RP-2: CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG (SEQ ID N° . 30) Iniciadores para o gene da enzima de sintese de di- hidrodaidzeina

E1-RACE-N-P1: ATGCGGATCGCTCGGTTCTCGACCTCTAGGTTAC (SEQ ID N°. 31) E1-RACE-RP2-1: ATCGAGGAGAAGTGCGAGGACGTCAGGGTCATC (SEQ ID N°. 32) 145 E1-RACE-N-P2: TTCTCGACCTCTAGGTTACCGATGTAGCCGC (SEQ ID N° . 33)

E1-RACE-RP2-2: ACGTCAGGGTCATCGGCATCGGCGACTGCAAG (SEQ ID N°. 34)

Todos os ADN de oligoelementos utilizados como iniciadores no presente exemplo foram produzidos pela Sigma-Aldrich Japan K.K.

(2-2) Amplificação das sequências da extremidade 5' e da extremidade 3' do gene da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína utilizando 5'-RACE e 3'-RACE

Utilizou-se polimerase de ADN Ex-Taq (Takara Bio Inc.) para 5'-RACE, 3'-RACE. A primeira RCP e a RCP com iniciadores internos foram realizadas utilizando o mesmo programa de

amplificação: 95 ° C, durante 2 min, (95 ° C, durante 45 seg, 60 °C, durante 30 seg, 72 °C, durante 1 min) x 30 ciclos, 72 °C, durante 3 min. Na primeira RCP, utilizou- se 1 pL (40 ng) do líquido da diluição do ADN genómico preparado da forma mencionada antes, como matriz. Na RCP com iniciadores internos utilizou 0,5 pL do produto da primeira RCP.

Após a reacção de RCP com iniciadores internos, adicionou-se 1/10 de 10 x dia ao produto de RCP e 5 pL da mistura e submeteu-se a electroforese com gel de agarose a 0,8 %. A amplificação do fragmento de ADN observada foi de cerca de 1,2 kb (Saci) e de cerca de 1,0 kb (Sau3AI) na 5'-RACE, e cerca de 0,6 kb (Saci) e 0,3 kb (Kpnl) na 3'-RACE.

Na electroforese de agarose no presente exemplo, realizou-se a coloração utilizando brometo de etídio (Nippongene Co. Ltd.); e λ/StiI (Nippongene Co. Ltd.) e uma 146 rede de 100 pb (Toyobo Co. Ltd.) como marcadores do peso molecular.

Os fragmentos de ADN amplificados foram excisados do gel de agarose e purificados utilizando um estojo de extracção de gel (Qiagen) . As sequências de bases dos fragmentos de ADN purificados foram determinadas pela sequenciação directa utilizando os iniciadores utilizados para a amplificação, tendo como resultado que a sequência do gene da enzima de sintese de di-hidrodaidzeina foi observada nos fragmentos de ADN de cerca de 1,2 kb (Saci) e cerca de 1,0 kb (Sau3AI) na 5'-RACE e de cerca de 0,6 kb (Saci) na 3'-RACE. (3) Determinação de toda a sequência de bases do gene da enzima de sintese de di-hidrodaidzeina A sequência de bases de ADN obtida pela RCP degenerativa no exemplo A5 e a amplificação rápida da sequência de terminal do ADNc (2) do presente exemplo foram submetidas a um ensaio de união utilizando o programa informático de reunião de sequências de ADN SEQUENCHER (Gene Codes Inc, USA) . Como resultado, encontra-se a estrutura do genoma de 3548 pb na vizinhança do gene da enzima de sintese de di-hidrodaidzeina. Isto revelou que o gene da enzima de sintese de di-hidrodaidzeína era um polipéptido que consistia em 1 935 nucleótidos e 644 aminoácidos.

Todas as sequências de aminoácidos verificadas por meio destas sequências de bases e as sequências parciais de aminoácidos encontradas por meio da sequência de aminoácidos foram unidas, tendo como resultado todas as sequências parciais de aminoácidos encontradas por meio da sequência de aminoácidos atribuída a todas as sequências de aminoácidos encontradas por meio destas sequências de bases. 147 (4) Confirmação da sequência de base na região de revestimento

Na sequência obtida em (3) do presente exemplo, observaram-se muitas porções com os clones tendo bases inconsistentes causadas pela incorporação de erros das bases da polimerase de ADN após amplificação por RCP. Por isso, utilizando como matriz a primeira hélice de ADNc, amplificou-se a região (2 368 pb) contendo a região de codificação do gene da enzima de sintese de di-hidrodaidzeína através de RCP, utilizando a enzima de clonagem por RCP Easy-A®High-Fidelity (Stratagene), que era uma polimerase de ADN de alta fidelidade. A seguir dão-se os iniciadores de amplificação utilizados antes.

El-conf-NP:TGCCGGTGCAATGGCTGACATCATGTTCAACCTG (SEQ ID N°. 35)

El-conf-CP:TCCTCCATCGTTCCTCCAATCAGTAAGACACGCG (SEQ ID N°. 36) 0 fragmento de ADN obtido foi purificado utilizando um estojo de extracção em gel (Qiagen) e a confirmação e a determinação final da sequência foi feita utilizando uma sequência directa.

Exemplo A7: Indução da expressão do gene da enzima de sintese de di-hidrodaidzeina por adição de daidzeina à solução da cultura de amplificação

Tal como se mostra no exemplo Al, quando a daidzeina, que é um substrato, se adiciona à solução da cultura de amplificação da estirpe 20-92 de Lactococcus, as células da 148 cultura exibem actividade de síntese de di-hidrodaidzeína. Isto leva a assumir que a adição de daidzeína à solução de cultura de amplificação induz a transcrição do gene da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína e induz a tradução para a proteína. 0 ensaio que se segue foi realizado com base neste pressuposto. Fez-se a incubação de duas amostras de ADNc derivadas da estirpe 20-92 de Lactococcus num meio de cultura contendo daidzeína e numa meio de cultura sem daidzeína; foram submetidas a uma RCP-TI de modo a verificar se a expressão do gene da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína foi induzida pela adição de daidzeína à solução de cultura de amplificação. (1) Extracção de todo o ADN da estirpe 20-92 de Lactococcus

e purificação do ADN A extracção de todo o ADN da estirpe 20-92 de

Lactococcus e a purificação foram realizadas da seguinte forma.

Fez-se a incubação de uma estirpe 20-92 de Lactococcus, selada, mantida a 4 °C, durante oito horas, num meio de cultura de caldo de GAM modificado, que continha 10 mg/L de daidzeína (Funakoshi Co., Ltd.) ou não continha daidzeína, a 37 °C, em condições anaeróbicas. Transferiu-se 25 mL da solução de cultura para um tubo de 50 mL e centrifugou-se, durante dez minutos, a 3 500 rpm, a 4 °C. Retirou-se o meio de cultura por decantação e recolheram-se as células. As células recolhidas foram imediatamente congeladas por meio de azoto líquido. Depois, extraiu-se todo o ARN e purificou-se utilizando 1 mL de uma solução de TRIzol (Invitrogen), de acordo com as instruções. Todo o ARN purificado foi tratado por ADNase I (Invitrogen) para eliminar o ADN genómico e utilizou-se para a síntese do ADNc da primeira hélice. 149

(2) Síntese da primeira hélice de ADNc de todo o ARN A partir de 2 yg de todo o ARN assim tratado por meio de ADNase I, sintetizou-se a primeira hélice de ADNc (transcrição inversa) utilizando o sistema de síntese da primeira hélice Superscript® para RCP-TI (Invitrogen) . A síntese do ADNc da primeira hélice foi realizada utilizando uma mistura aleatória de hexâmeros num iniciador de extensão de acordo com as instruções. Além disso, para confirmar que todo o ARN tratado por ADNase I utilizado para a síntese do ADNc da primeira hélice não continha ADN genómico, realizou-se outra reacção, ao mesmo tempo, sem transcrição inversa. 0 líquido final da reacção foi utilizado como uma matriz para a RCP-TI. A seguir indicam-se os quatro tipos de líquidos da reacção final assim preparados. 1. Produto da transcrição inversa de todo o ARN derivado de células bacterianas incubadas num meio contendo daidzeína (DZN(+)TI(+)) 2. Produto da transcrição inversa de todo o ARN derivado de células bacterianas incubadas num meio sem daidzeína (DZN(-)TI ( + )) 3. Produto da transcrição não inversa de todo o ARN derivado de células bacterianas incubadas num meio contendo daidzeína (DZN(+)TI(-)) 4. Produto da transcrição não inversa de todo o ARN derivado de células bacterianas incubadas num meio sem daidzeína (DZN(-)TI(-)) 150

(3) Confirmação da expressão do gene da enzima de sintese de di-hidrodaidzeína utilizando RCP-TI

Amplificou-se o gene da enzima de sintese de di-hidrodaidzeína através de RCP-TI, utilizando os quatro produtos da reacção final conforme detalhado em (2), dos presentes exemplos, como matrizes. Compararam-se as quantidades de expressão entre si. Como controlo, realizou-se uma outra RCP-TI, ao mesmo tempo, utilizando como gene de controlo uma sequência de ARN da ribossoma 16S. A seguir indicam-se as condições de amplificação na RCP-TI e uma sequência de iniciador para cada amplificação de gene. Utilizou-se a polimerase de ADN Ex-Taq (Takara Bio Inc.) para a RCP-TI. 0 programa de amplificação foi o seguinte: 95 °C, durante 2 min, (95 °C, durante 30 seg, 56 °C, durante 20 seg, 72 °C, durante 30 seg) x 30 ciclos, 72 °C, durante 2 min. Como matriz, utilizou-se 1 pL de cada líquido final da reacção tal como indicado em (2) do presente exemplo. A seguir mostra-se uma sequência de iniciador, utilizada para a RCP-TI da presente invenção e a dimensão do fragmento de ADN a ser amplificado.

Enzima de síntese de di-hidrodaidzeína: 239 pb El-FP:CTACATCGGTAACCTAGAGGTCG (SEQ ID N°. 37)

El-RP:CCGTGCTGCTTGATGGTCTTTGC (SEQ ID N°. 38)

Sequência de ARN do ribossoma 16S: 326 pb

Gar-16S-Ribo-FP:TGCGTAGATATATGGAGGAAC (SEQ ID N°. 39)

Gar-16S-Ribo-RP:CTTATCTCTAAGGATAGCACG (SEQ ID N°. 40) O iniciador utilizado para a amplificação da sequência de ARN do ribossoma 16S foi criado com base na sequência do 151 gene ribossómico do ARN da estirpe FLG12 16S de Lactococcus garvieae, a sequência parcial (N°. de acesso AF352163-66) na base de dados de ADN (GenBank) fornecida pelo National Center of Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

Adicionou-se 1/10 de 10 x dia ao produto de RCP e submeteu-se 5 yL da mistura a electroforese com gel de agarose a 1,5 %. Observou-se a amplificação de cada fragmento de ADN.

Na electroforese em agarose do presente exemplo, realizou-se a coloração utilizando brometo de etidio (Nippongene Co. Ltd.); e λ/StyI (Nippongene Co. Ltd.) e uma rede de 100 pb (Toyobo Co. Ltd.) como marcadores de peso molecular. A figura 6 mostra os resultados.

Como é evidente dos resultados da amplificação do gene da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína através de RCP-TI, observou-se a expressão eficiente do gene apenas no produto de transcrição inversa de todo o ARN derivado das células bacterianas incubadas num meio com daidzeina. Observou-se o mesmo nivel de expressão na amplificação da sequência do ARN do ribossoma 16S utilizando-o como controlo, independentemente da incorporação de daidzeina. Além disso, dado que tanto o gene da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína, como a sequência de ARN da ribossoma 16S, não foram amplificados no produto de transcrição não inversa, confirmou-se que todo o ARN tratado por ADNase I utilizado para a síntese do ADNc da primeira hélice não continha ADN genómico. Estes resultados mostraram que a adição de daidzeina ao meio induziu a expressão de ARNm do gene da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína. 152

Exemplo A8: Expressão do polipéptido EI recombinante utilizando Escherichia coli e confirmação da actividade de síntese de di-hidrodaidzeína

Utilizou-se o sistema pET, um sistema de expressão de proteína recombinante utilizando Escherichia coli, para expressar o polipéptido EI e confirmou-se a sua actividade de síntese da di-hidrodaidzeína. (1) Preparação do vector de expressão do polipéptido El

Para preparar um vector de expressão do polipéptido El (pET21-El-His), amplificou-se o ADN na região do quadro de leitura aberta do nucleótido El por meio de RCP.

Prepararam-se os iniciadores de amplificação que se seguem com base na sequência de nucleótidos El determinada no exemplo A6. exp. El pet F Nde : AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA (SEQ ID N°. 41) exp. El pet His: AATCGAATTCCTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT (SEQ ID N° . 42)

Para a inserção em pET21a (Novagen), conceberam-se os iniciadores de amplificação exp. El pet F Nde e exp. El pet His para as sequências de restrição que incluem, respectivamente, Ndel e EcoRI.

Realizou-se uma reacção de RCP utilizando 25 pL de uma mistura reaccional contendo os iniciadores, 5 pmole de cada; dNTP, 5 nmole de cada; ADN genómico da estirpe 20-92 de Lactococcus purificada no exemplo A5, 40 ng; 10 x tampão para a polimerase de ADN KOD-plus (Toyobo Co., Ltd.), 2,5 pL; 153 polimerase de ADN KOD-Plus, 0,3 U (Toyobo Co., Ltd.).

Programa de amplificação: 95 °C, durante 3 min, (94 °C, durante 30 seg, 60 °C, durante 30 seg, 68 °C, durante 2 min) x 30 ciclos, 68 °C, durante 7 min. Dispositivo de RCP: sistema 9700 de RCP GeneAmp (Applied Biosystems). Analisando uma parte da mistura reaccional de RCP por electroforese em gel de agarose detectou-se uma banda com uma dimensão inesperada. Recolheu-se todo o produto de RCP por meio de um estojo de purificação de RCP QIAGEN (Qiagen).

Os fragmentos de ADN assim recolhidos foram cortados com as enzimas de restrição Ndel e EcoRI e submetidos a electroforese em gel de agarose. Depois, excisou-se uma porção contendo uma banda-alvo e purificou-se e recolheu-se com um estojo de extracção em gel da Qiagen (Qiagen). Após a recolha, ligaram-se os fragmentos de ADN, a 16 °C, durante a noite, com pET21a digerida com Ndel e EcoRI, utilizando um estojo de ligação de ADN ver. 2.1 (Takara Bio Inc.).

Utilizou-se depois a mistura de reacção ligada para transformação da estirpe JM109 de Escherichia coli (Takara Bio Inc.).

Fez-se uma cultura do transformante, a 37 °C, durante a noite, numa placa de agar com meio LB (GIBCO) contendo ampicilina (50 pg/mL). Fez-se uma cultura das colónias isoladas resultantes durante a noite, em 3 mL de meio LB (GIBCO) contendo ampicilina (50 pg/mL). Depois, extraiu-se o ADN do plasmido utilizando um auto-extractor de plasmidos PI-100 (KURABO). A sequência de bases do ADN inserido no plasmido foi sequenciada pelo processo do corante terminador. Isto confirmou a inserção, com sucesso, do polinucleótido El, conforme se pretendia. Assim, obteve-se pET21-El-His. Neste 154 exemplo, determinou-se a sequência de ADN utilizando um sequenciador de ADN ABI3700 (Applied Biosystems). (2) Reparação do polipéptido EI recombinante e expressão e confirmação do polipéptido EI recombinante em Escherichia coli

Utilizou-se o plasmido pET21-El-His e o plasmido pET21a (controlo negativo) de expressão do polipéptido EI recombinante para transformar a estirpe BL21 (DE3) de Escherichia coli (Novagen). Para se obter colónias isoladas fez-se uma cultura dos transformantes, durante a noite, a 37 °C, numa placa de agar com meio LB contendo ampicilina (50 pg/mL).

Cada transformante de BL21 (DE3) de E. coli foi posto em cultura, durante a noite, a 37 °C, em 3 mL de meio LB líquido contendo ampicilina (50 pg/mL). Depois, fez-se uma pré-cultura de 0,5 mL da cultura, durante 3 horas (até a DO a 630 nm se tornar cerca de 0,4) por meio da adição de 50 mL de meio LB líquido contendo a mesma concentração de ampicilina. Após ajustamento da concentração final para 1 mM por adição de IPTG (isopropil-p-tiogalactopiranósido; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), incubou-se ainda a cultura, a 37 °C, durante 4 horas.

Após a incubação, as células foram recolhidas por centrifugação (6 000 rpm, 4 °C, 15 min) utilizando um Avanti HP25 (Beckman Coulter). Realizaram-se os procedimentos subsequentes em gelo. Após a eliminação do sobrenadante (o meio) , fez-se a suspensão das células em 1 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0; KPB-PDH) contendo PMSF 1 mM, DTT 2 mM e hidrossulfito de sódio 5 mM. Depois colocou-se a suspensão de células num tubo da Assist de 2 mL, 155 carregado com 0,7 mL de pérolas de zircónio-sílica (BioSpec Products, Inc.) e 400 yL de KPB-PDH. Depois, desagregaram-se as células por meio de dois ciclos repetidos de 20 segundos, com um tratamento a 6 500 rpm e arrefecimento com gelo, durante 3 minutos, utilizando um FastPrep® (Thermo Electron Corporation). Como resultado, obteve-se uma suspensão das células desagregadas. A expressão do polipéptido EI recombinante em E. coli foi confirmada por electroforese em gel de poliacrilamida e SDS (EGPA-SDS).

Adicionou-se 2,5 yL de 5 x tampão de amostra (Tris-HCl 125 mM, (pH 6,5)/glicerol a 25 %/SDS a 5 %/2-mercaptoetanol a 5 %/SFB a 0,5%) a 10 yL da suspensão de células desagregadas.

Depois da desnaturação pelo calor , a co 0 C, durante 5 minutos, arrefeceu-se a suspensão em gelo e fez-se a electroforese de 5 yL por meio de EGPA- SDS. Realizou-se a EGPA-SDS com uma placa de gel disponível comercialmente (SuperSep® 5-20 %; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e

Quick CBB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para a coloração. Utilizou-se uma gama de valores da rede XL pré-corada (Apro Science) como marcador do peso molecular.

Os resultados da EGPA-SDS estão ilustrados na figura 7. Confirmou-se um polipéptido EI recombinante com um peso molecular de cerca de 70 kDa na suspensão de células desagregadas derivada do transformante pET21-El-His. 156 (3) Confirmação da actividade de síntese de di-hidro-daidzeina no polipéptido EI obtido das células recombinantes

Utilizou-se a suspensão de células desagregadas obtidas em (2) deste exemplo como uma fonte de enzimas para medir a conversão da actividade de daidzeina em di-hidrodaidzeina. Como resultado, confirmou-se a actividade no polipéptido EI recombinante expresso.

Neste exemplo, a medição da actividade de conversão de daidzeina em di-hidrodaidzeina foi realizada como se segue.

Preparou-se uma mistura reaccional enzimática cuja composição se dá a seguir e fez-se a incubação da mistura, a 37 °C, durante 2 horas.

Composição da mistura reaccional da enzima

Suspensão de células desagregadas (fonte de enzimas) : 100 pL NADH (100 mM) : 20 pL NADPH (100 mM): 20 pL Daidzeina (1 mg/mL): 5 pL KPB-PDH: 855 pL Total: 1000 pL Após a incubação, adicionou-se 3 mL de acetato de etilo à mistura reaccional enzimática para extracção Após a secagem, dissolveu-se o extracto ] por meio de uma fase móvel (eluente). Analisou-se o produto dissolvido por CLAR para medir os teores de daidzeina e de di-hidrodaidzeína na mistura reaccional das enzimas.

Os resultados da análise por CLAR estão ilustrados na figura 8. Na suspensão de células desagregadas, derivada do transformante do plasmido pET21-El-His que expressa o 157 polipéptido EI recombinante, a daidzeína (substrato) adicionada à mistura reaccional enzimática, foi convertida em di-hidrodaidzeina enquanto a di-hidrodaidzeina não foi detectada na mistura reaccional enzimática no transformante pET21a (controlo negativo).

Estes resultados mostram que o polipéptido EI recombinante tem actividade para sintetizar di-hidrodaidzeina a partir de daidzeina.

Exemplo B

Exemplo de referência BI

Sintese de cis-tetra-hidrodaidzeína e de trans-tetra-hidro-daidzeína

Produziu-se cis-tetra-hidrodaidzeína e trans-tetra-hidro-daidzeína de acordo com o fluxo de reacção que se segue. Os compostos são designados como se segue.

Composto Composto Composto Composto Composto Composto Composto 1 (daidzeína): 4',7-di-hidroxi-isoflavona 2: 47-diacetoxi-isoflavona 3: 4',7-diacetoxi-isoflavan-4-ona 4: cis-4',7-diacetoxi-isoflavan-4-ol 5: trans-4',7-diacetoxi-isoflavan-4-ol 6: cis-tetra-hidrodaidzeína 7: trans-tetra-hidrodaidzeína Fórmula 1 158 HOVT0’*

AfeO, py

AcQ ΥΎλ cjsafieiAS m

Oc°s O Ό, OAc H,. ÍQ% ^íC AcO^yO 'SÕÃc^MeW * vA^A.

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WO OH 4 0A« ΚΟ>!Γ,^ .o,

OH ho-^n,,0

AcO-y^Y®·^ INHaOH

MsQH ÕH ^''OAt Síntese do composto 2

Adicionou-se 0,76 mL (8,0 mmole) de anidrido acético a uma solução de piridina (5 mL), contendo 500 mg (1,97 mmole) de daidzeína (composto 1) e agitou-se a mistura, a 60 °C, durante 2 horas. Depois de se adicionar, durante 1 minuto, uma quantidade de metanol, transferiu-se a mistura reaccional para ácido clorídrico 3 N. Depois da diluição com água, filtrou-se o precipitado sólido resultante e lavou-se com água. Depois secou o sólido ao ar, à temperatura ambiente, para se obter 60 9 mg do composto 2, sob a forma de um pó branco (1,80 mmole, rendimento de 91 %). 2,33 (3H, s), J = 2,3 Hz) , = 8,8 Hz) .

Composto 2: RMN do 1H (250 MHz, CDC13) δ (ppm): 2,37 (3H, s), 7,13-7,22 (3H, m) , 7,32 (1H, d,

7,54-7, 63 (2H, m) , 8,01 (1H, s) , 8,33 (1H, d, J Síntese do composto 3 159

Agitou-se, à temperatura ambiente, durante 2 horas, em atmosfera de hidrogénio, uma suspensão de acetato de etilo (6 mL) em metanol (6 mL) , contendo 400 mg (1,18 mmole) do composto 2 e 150 mg de paládio em carbono a 10 % (hidratado, cerca de 50 % em peso) . Filtrou-se a mistura reaccional através de celite e lavaram-se os resíduos com acetato de etilo. Os resíduos obtidos por concentração do filtrado foram purificados por cromatografia em coluna de gel de sílica (gel de sílica: diclorometano/acetato de etilo = 100/0-19/1), para se obter 312 mg do composto 3, sob a forma de um pó branco (0,917 mmole, rendimento de 78 %) .

Composto 3: RMN do ΧΗ (250 MHz, CDCI3) δ (ppm): 2,29 (3H, s), 2,32 (3H, s), 3, 93-4,04 (1H, m) , 4, 60-4,75 (2H, m) , 6,76-6,84 (2H, m) , 7,04-7,13 (2H, m) , 7,27-7,35 (2H, m) , 7,93-8,01 (1H, m) . Síntese do composto 4 e do composto 5

Adicionou-se 11 mg (0,29 mmole) de boro-hidreto de sódio a uma solução de diclorometano (1 mL) , em metanol (1 mL) , contendo 100 mg (0,294 mmole) do composto 3, a 0 °C.

Após agitação da mistura reaccional, a 0 °C, durante 30 minutos, adicionou-se, sucessivamente, 2 mL de ácido clorídrico 1 N e 50 mL de água, seguido de extracção com acetato de etilo. Lavou-se, sucessivamente, a camada orgânica com bicarbonato de sódio saturado, água e salmoura saturada, seguido de secagem com sulfato de sódio anidro. Destilou-se o dissolvente e purificaram-se os resíduos resultantes por cromatografia em coluna de gel de sílica (gel de sílica: diclorometano/acetato de etilo = 19/1-3/1). Purificou-se a mistura diastereomérica resultante por meio de cromatografia em coluna a pressão média (Yamazen, Ultra Pack SI-40B: n-hexano/acetato de etilo = 3/2), para se obter 44 mg do 160 composto 4 acicular, incolor (0,13 mmole, rendimento de 44 %) e 26 mg do composto 5 acicular, incolor (75 mmole) , rendimento de 26 %).

Composto 4: RMN do 1H (250 MHz, CDC13) δ (ppm): 1,80 (1H, d, J = 4,0 Hz), 2,30 (3H, s) , 2,31 (3H, s) , 3,32 (1H, td, J = 3,5, 11,5 Hz), 4,32 (1H, ddd, J = 1,3, 3,5, 10,5 Hz), 4,59 (1H, dd, J = 10,5, 11,5 Hz), 4,76-4,83 (1H, m) , 6,64-6,73 (2H, m) , 7,06-7,14 (2H, m) , 7,27-7,35 (3H, m) .

Composto 5: RMN do 1H (250 MHz, CDC13) δ (ppm): 2,02 (1H, d, J = 5,5 Hz) , 2,29 (3H, s), 2,30 (3H, s) , 3 ,11· -3,24 (1H, m) , 4,26 (1H, dd, J = 9,0, 11,3 Hz), 4. 37 (1H, dd, J = 3,8, 11,3 Hz) , 4, 92 (1H , dd, J = 5,5, 7,8 Hz) , 6, 62 (1H, d, J = 2,3 Hz) , 6,72 (1H, dd, J = 2,3, 8,5 Hz) , 7 ,09-7, 12 (2H, m) , 7 ,21- 7,30 (2H, m) , 7,47 (1H, d, J = 8,5 Hz) e

Sintese do composto 6

Adicionou-se 55 mg (1,0 nmole) de metóxido de sódio a uma solução de metanol (4 mL), contendo 116 mg (0,339 mmole) do composto 4 e agitou-se a mistura, à temperatura ambiente, durante 2 horas. Neutralizou-se a mistura reaccional por meio da adição de uma resina permutadora de iões (DOWEX 50 x 8 W, sob a forma de amónio). Depois de se filtrar a resina, lavou-se o sólido obtido por concentração do filtrado com metanol, para se obter 62 mg do composto 6, sob a forma de um pó branco (0,24 mmole, rendimento de 71 %).

Composto 6: RMN do XH (250 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 3,03 (1H, td, J = = 3 ,3, 12,0 Hz) , 4,00-4, 15 (1H, m) , 4, 31-4 ,51 (2H, m, incluindo 4,39, dd, J = 10,3, 12,0 Hz), . 4, 96 (1H, d, J = 5, 8 Hz) , 6, 18 (1H, d, J = = 2,3 Hz) , 6, 32 (1H, dd, J = 2,3, 8,3 Hz) , 6, 69 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,00 (1H r d/ J = 8, 3 Hz), 7 ,09 (2H, d, J= 8,5 Hz), 9, 19 (1H, s largo), 9, 31 (1H, s largo) φ Síntese do composto 7 161

Adicionou-se 0,73 mL (0,73 mmole) de hidróxido de sódio 1 N a uma suspensão de metanol (2 mL) contendo 84 mg (0,25 mmole) do composto 5 e agitou-se a mistura, à temperatura ambiente, durante 2,5 horas. Depois, adicionou-se cloreto de amónio saturado e água à mistura reaccional, seguido da extracção com acetato de etilo. Lavou-se, sucessivamente, a camada orgânica com bicarbonato de sódio saturado, água e solução salina saturada, seguida da secagem com sulfato de sódio anidro. Pela destilação do dissolvente, obteve-se 64 mg do composto 7, sob a forma de um pó branco (0,25 mmole, rendimento quantitativo).

Composto 7: RMN do XH (250 MHz, DMSO-de) δ (ppm) : 2,82-2,96 (1H, m) , 4, 04-4,22 (2H, m) , 4,60 (1H, t, J = 7,0 Hz), 5,18 (1H, d, J = 7,0 Hz), 6,14 (1H, d, J = 2,3 Hz), 6,34 (1H, dd, J= 2,3, 8,5 Hz), 6,67 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,04 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,16 (1H, d, J = 8,5 Hz), 9,21 (1H, s) , 9,28 (1H, s) .

Exemplo de referência B2

Inoculou-se a estirpe 20-92 de Lactococcus (FERM BP-10036) num meio liquido de amplificação contendo daidzeina e incubou-se a cultura, a 37 °C, durante 7 a 24 horas, em condições anaeróbicas. Após a incubação, recolheram-se as células e preservaram-se por criogenia para serem utilizadas nos exemplos que se seguem.

Exemplo BI: Confirmação da produção de tetra-hidrodaidzeina

As experiências que se seguem foram realizadas para confirmar que a tetra-hidrodaidzeina é o produto intermédio da biossintese do equol. (1) Preparação de material celular desagregado 162

Descongelaram-se rapidamente células da estirpe 20-92 de Lactococcus, preservadas a -80 °C. Fez-se uma suspensão das células por vazamento e centrifugou-se a 4 °C (8 000 rpm x 5 min) utilizando uma centrifugadora VC-960 (Taitec). Depois de se eliminar o sobrenadante, adicionou-se tampão de fosfato de potássio 0,1 M/PMSF 1 mM (fluoreto de fenilmetano-sulfonilo)/DTT 2 mM (ditiotreitol)/hidrossulfito de sódio 5 mM (pH 7,0), para se obter uma suspensão das células. Colocou-se a suspensão das células num tubo de 2 mL preparado para incluir pérolas de zircónio-silica (cerca de 0,8 mL, 0,1 mm, 11b; Wakenyaku Co., Ltd.) e carregou-se o tubo com uma solução 0,1 M de fosfato de potássio/PMSF 1 mM/DTT 2 mM/hidrossulfito de sódio 5 mM (pH 7,0) para encher o tubo quase completamente. Para a desagregação, fechou-se o tubo e manteve-se em gelo e repetiu-se quatro vezes um ciclo de centrifugação a 6.500 rpm x 20 seg e arrefecimento com gelo utilizando FastPrep®-FPl00A (Thermo Electron Corporation). O material de células desagregadas resultante foi utilizado como uma fonte de enzimas numa reacção enzimática. (2) Reacção enzimática

Preparou-se 1 mL de uma mistura reaccional enzimática com a composição que se segue, contendo 0,1 mL do material celular desagregado obtido em (1) e fez-se a incubação da mistura, a 37 °C, durante 2 horas. Depois da incubação, adicionou-se 3 mL de acetato de etilo ao produto de reacção enzimática resultante para extracção. Secou-se o produto para preparar uma amostra para análise por CLAR.

Composição da mistura reaccional enzimática 163

Tampão de fosfato de potássio 0,1 M/PMSF 1 mM/DTT 2 mM/hidrossulfito de sódio 5 mM (pH 7,0)

NADPH 2 mM NADH 2 mM 10 yg/mL de di-hidrodaidzeina ou de tetra-hidrodaidzeina (3) Produção de tetra-hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeina por meio de uma reacção enzimática A figura 9 mostra os resultados das análises por CLAR do produto da reacção enzimática obtido utilizando como substrato a di-hidrodaidzeina e o material das células desagregadas como uma fonte de enzimas. A figura 9 também mostra os resultados das análises por CLAR da tetra-hidrodaidzeina sintetizada no exemplo de referência BI. Os resultados mostram que o produto de reacção enzimática obtido, utilizando como substrato di-hidrodaidzeina e o material celular desagregado como fonte enzimática, inclui um produto intermédio que tem um tempo de retenção correspondente ao tempo de retenção de trans-tetra-hidrodaidzeína, confirmando a produção de trans-tetra-hidrodaidzeína. (4) Produção de eguol a partir de tetra-hidrodaidzeína por reacção enzimática A figura 10 mostra os resultados da análise por CLAR do produto da reacção enzimática obtido utilizando cis-tetra-hidrodaidzeína ou trans-tetra-hidrodaidzeína como substrato e o material das células desagregadas como uma fonte enzimática. Como fica claro, da figura 10, o equol foi produzido a partir de ambos os compostos, o que mostra que a tetra-hidrodaidzeína é utilizada como substrato na 164 biossíntese do equol, tanto nas formas cis como nas formas trans.

Exemplo B2: Confirmação da actividade de biossíntese de tetra-hidrodaidzeina no sobrenadante centrifugado do material celular desagregado e confirmação da dependência de NADH ou NADPH

Descongelaram-se as células congeladas e centrifugaram-se, a 4 °C, durante 15 minutos (5 000 x G) . Utilizou-se o aglomerado no ensaio seguinte. Em primeiro lugar, fez-se uma suspensão do aglomerado (peso anidro de 2,7 g) em 10 mL de uma solução de fosfato de potássio 0,1 M, contendo PMSF 1 mM e hidrossulfito de sódio 5 mM. Depois de se pré-aquecer, a 37 °C, durante 5 minutos, adicionou-se lisozima numa quantidade de 100 mg por grama da massa de peletes (peso anidro) para provocar uma reacção, a 37 °C, durante 1,5 horas. Depois, adicionou-se, à mistura reaccional, uma quantidade equivalente de uma solução de fosfato dipotássico 0,1 M e agitou-se vigorosamente a mistura com um misturador de vórtice após a adição de pérolas de zircónio-silica (3 mL) . Depois, fez-se a desagregação das células com um aparelho de ultra-sons (aparelho desagregador de células por ultra-sons 200 da Branson) (3 ciclos de ultra-sons, durante 5 minutos e o resto durante 2 minutos). A suspensão das células desagregadas foi centrifugada a cerca de 10 000 x G, durante 15 minutos, para se obter um sobrenadante, que foi então utilizado como uma fonte de enzimas.

Preparou-se uma mistura reaccional enzimática da composição que se segue e incubou-se, a 37 °C, durante 2 horas. Após incubação, adicionou-se 5 mL de acetato de etilo ao produto da reacção das enzimas para extracção. Depois, 165 secou-se o produto para preparar a amostra para análise por CLAR.

Composição da mistura reaccional enzimática

Sobrenadante centrifugado de células desagregadas (fonte de enzimas): 250 pL

NADH (100 mM) ou NADPH (100 mM): 20 pL

Di-hidrodaidzeína (1 mg/mL): 10 pL

Tampão de fosfato de potássio 0,1 M a pH 7/DTT 1 mM/hldrossulfIto de sódio 5 mM: 720 pL Total: 1000 pL

Os resultados estão ilustrados na figura 11. Os resultados confirmaram a presença da actividade de biossintese de tetra-hidrodaidzeina no sobrenadante centrifugado do material celular desagregado. Também se confirmou que a conversão de di-hidrodaidzeina em tetra-hidro-daidzeína depende da co-enzima NADH e, muito mais fortemente, da co-enzima NADPH.

Exemplo B3: Purificação de tetra-hidrodaidzeina

Enzima de síntese

Fez-se uma incubação das células da estirpe 20-92 de Lactococcus, durante 20 horas, em 67 mL de um meio líquido de amplificação contendo daidzeína, contido num frasco de incubação. Fez-se a centrifugação das células da cultura de dez desses frascos e fez-se uma suspensão em tampão de fosfato de potássio 0,02 M (pH 7; daqui para a frente "tampão A") , contendo PMSF 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) e DTT 4 mM (ditiotreitol). As células foram desagregadas com uma prensa francesa (SLM Instruments Inc.), seis vezes, a 1 800 psi e centrifugou-se a suspensão de células desagregadas, para se obter um sobrenadante. Separadamente, fez-se a incubação de células da estirpe 20-92 de Lactococcus, durante 18 horas, em 200 mL de um meio líquido, 166 contido num frasco de incubação. As células da cultura de cinco desses frascos foram do mesmo modo desagregadas com uma prensa francesa e obteve-se um sobrenadante após centrifugação. Estes sobrenadantes, 38 mL e 47 mL, foram misturados e carregou-se 82 mL da mistura numa coluna de sefarose vermelha (cerca de 7 mL), equilibrada com tampão A. Após a lavagem da sefarose vermelha com 150 mL de tampão A, eluiu-se a mistura com tampão A contendo NADPH 10 mM (20 mL/fracção). Utilizou-se cada fracção como uma fonte enzimática e mediu-se a actividade de biossintese de tetra-hidrodaidzeína nas mesmas condições que as condições da reacção enzimática do exemplo B2 (utilizando NADPH como uma co-enzima). Como resultado, obtiveram-se fracções activas com os N°s. 1 a 5.

As fracções N°s. 1 a 5, tendo actividade de biossintese de tetra-hidrodaidzeina, foram concentradas por ultra-filtração utilizando a ultra-centrifugadora UFC801024 da Amicon (corte do PM: 10 000) para se obter um concentrado (cerca de 2,1 mL). Separou-se o concentrado em três porções e carregou-se para CLAR utilizando gel TSK e fenil-5PW (Tosoh) depois de se misturar cada porção com uma quantidade equivalente de tampão A, contendo sulfato de amónio 3 M. As condições da CLAR são as que se seguem. Fez-se o ensaio da proteína medindo a absorvência a 280 nm.

Coluna: gel TSK e fenil-5PW Velocidade de fluxo: 1 mL/min Fracção: 2 mL/2 min/fracção

Eluente A: tampão de fosfato de potássio 0,02 M, a pH 7/DTT 1 mM/hidrossulfito de sódio 2,5 mM/isoPrOH a 0,5 % Eluente B: eluente A contendo sulfato de amónio 1 M Programa de eluição: tempo (min) (eluente B)/(eluente A + eluente B) 167 1 ο 5 1 25 Ο 45 Ο

Os resultados da CLAR revelaram que a actividade de síntese de tetra-hidrodaidzeína está presente num vasto intervalo de fracções (fracção N°. 15 e fracções subsequentes, um tempo de retenção de 30 minutos e superior). Considerando este resultado, misturaram-se as fracções N°s. 19 a 22 da CLAR e concentraram-se por ultrafiltração (ultra-centrifugadora UFC801024 da Amicon; corte do PM: 10 000). De cerca de 130 pL do concentrado, retirou-se para a carga 100 pL para uma CLAR por filtração em gel, utilizando gel TSK G2000SWXL (Tosoh) , nas seguintes condições.

Coluna: gel TSK G2000SWXL Velocidade de fluxo: 0,6 mL/min Fracção: 1,2 mL/2 min/fracção

Eluente: tampão de fosfato de potássio 0,05 M, a pH 7/DTT 1 mM/hidrossulfito de sódio 2,5 mM/isoPrOH a 1 %/NaCl 0,3 M A figura 12 mostra os resultados da CLAR por filtração em gel. A figura 13 mostra os resultados da EGPA-SDS de cada fracção realizada, em condições de redução. Os resultados mostraram bandas de 28 kDa e de 32 kDa, em condições de redução, na fracção N°. 7, uma das principais fracções da actividade de síntese de tetra-hidrodaidzeína.

Exemplo B4: Análise da sequência de aminoácidos da enzima de síntese de tetra-hidrodaidzeína 168 A fracção (fracção N°. 7) com actividade de síntese de tetra-hidrodaidzeína obtida no exemplo B3 foi utilizada como amostra para análise por EM. Mais especificamente, a amostra foi separada por EGPA-SDS e excisaram-se as bandas. Reduziram-se as bandas excisadas por alquilação em gel e fez-se a sua digestão com tripsina em gel. Os péptidos digeridos com tripsina foram recolhidos e purificados por análise, por meio de CL-EM. Os dados adquiridos pelas análises de CL-EM foram analisados por uma nova sequenciação utilizando o programa informático de suporte da análise EM PEAKS® (Infocom) para calcular e estimar as sequências de aminoácidos dos péptidos. Especificamente, isto foi realizado de acordo com os procedimentos que se seguem. (1) Materiais experimentais A experiência utilizou os seguintes materiais:

SuperSep HG 10/20 % (Wako Pure Chemical Industries,

Ltd.); estojo de coloração de gel Flamingo (Bio-Rad); TCEP (tris[2-carboxietil]fosfina) (Pierce); marcador de peso molecular (Apro Science); DTT (Calbiochem); iodo-acetamida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); acetonitrilo (Kanto Kagaku); tripsina (Promega); TFA (Pierce); bicarbonato de amónio (Sigma); água amoniacal (Merck); ácido fórmico (Kanto Kagaku); disco de catião SR da Empore (Sumitomo 3M); coluna de concentração MonoCap (GL Science); MonoCap para um nano-fluxo de 0,1 x 150 mm (GL Science); FortisTip (AMR); concentrador SpeedVac (SAVANT); dispositivo de auto-amostragem HTS-PAL (CTC-Analytics); Chorus 220 (CTC-Analytics); QSTAR Pulsar i (Applied Biosystems); e programa informático PEAKS® (Infocom). 169

(2) Electroforese em gel de poliacrilamida-SDS

Adicionou-se 1 pL de TCEP 100 mM a 20 pL da fracção (fracção N°. 7) com actividade de sintese dq tetra-hidro- daidzeína obtida no exemplo B3. Após redução, a 70 °C, durante 10 minutos, aplicou-se toda a amostra a SuperSep HG, e realizou-se a EGPA-SDS pelo processo normal. Após a electroforese, corou-se o gel com um estojo de coloração de gel Flamingo (Bio-Rad) (ver figura 14) . Em seguida, as bandas LGl e LG2, que apareceram após a coloração, foram cortadas até a uma dimensão de cerca de 1 mm2. Lavaram-se os géis excisados com uma solução de bicarbonato de amónio 100 mM, desidrataram-se com acetonitrilo e secaram-se e solidificaram-se com um concentrador SpeedVac. (3) Digestão de tripsina em gel

Adicionou-se uma solução de DTT (1,54 mg/mL, em bicarbonato de amónio 100 mM) aos géis secos e fez-se a incubação da mistura, a 55 °C, durante 45 minutos, para provocar uma redução. Depois de se descarregar a solução de DTT, adicionou-se uma solução de iodoacetamida (10,1 mg/mL, em bicarbonato de amónio 100 mM) e fez-se a incubação da mistura, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, no escuro. Depois de se descarregar a solução, lavaram-se, sucessivamente, os géis com uma solução de acetonitrilo a 50 %, uma solução de acetonitrilo a 100 %, uma solução de bicarbonato de amónio 100 mM e uma solução de acetonitrilo a 100 %, seguido de secagem e solidificação com um concentrador SpeedVac. Depois, adicionou-se uma pequena quantidade de uma solução de tripsina (12,5 pg/mL, bicarbonato de amónio 50 mM) aos géis anidros, para impregnar os géis, durante 45 minutos, em gelo. Após a impregnação, retirou-se o excesso da solução de tripsina e adicionou-se uma solução de bicarbonato de 170 amónio 50 mM até os géis ficarem imersos. Depois, realizou-se uma reacção, a 37 °C, durante 16 horas. (4) Análise da sequência de aminoácidos por espectometria de massa

Recolheram-se os péptidos digeridos com tripsina e fez-se um pré-tratamento purificando os péptidos numa coluna simples cheia com um disco de catião SR da Empore na ponta da pipeta. Recolheram-se os péptidos digeridos com tripsina por lavagem com uma solução de TFA a 0,1 %/acetonitrilo a 90 %. Na coluna simples tratou-se primeiro a amostra por meio de uma solução equilibrada com TFA a 0,1 %/acetonitrilo a 2 %. Após a absorção da amostra, lavou-se a coluna com uma solução de TFA a 0,1 %/acetonitrilo a 90 % e fez-se a eluição da amostra com uma solução de amónia a 5 %/acetonitrilo a 30 %. Após a eluição, secaram-se os péptidos digeridos e concentraram-se com um concentrador SpeedVac. Ajustou-se o pH da solução de péptidos digeridos para cerca de 3 por meio da adição de TFA e fixou-se a amostra num dispositivo de auto-amostragem HTS-PAL. Fixou-se a amostra no HTS-PAL e depois lavou-se numa coluna, carregando numa coluna com uma concentração de amostra localizada na válvula injectora de CL-EM. À amostra na coluna de concentração foi separada com uma coluna analítica utilizando nanoCLAR-Chorus 220 e foi analisada com QSTAR Pulsar i após a ionização com o conjunto FortisTip na coluna analítica. As condições da análise CL-EM são as seguintes. LC Chorus220

Dissolvente A: ácido fórmico a 0,1 %/acetonitrilo a 2 % 171

Dissolvente B: ácido fórmico a 0,1 %/acetonitrilo a 90 % Velocidade de fluxo = 300 nL/min Gradiente Aa5%-Ba65 %/20 min

EM

Modo de NanoESI positivo, modo de aquisição dependente da informação (m/z = 400 a 1.400, acima de 25 contagens, estado de carga = 2 a 4); 4 experiências/1 ciclo: experiência 1 (TOF-EM, m/z = 400 a 1.400, tempo de acumulação = 1 seg) ; experiências 2 a 4 (ião positivo do produto, m/z = 100 a 1 400, tempo de acumulação = 2 seg).

Os dados adquiridos por CL-EM para cada uma das bandas LG1 e LG2 (ver figura 14) foi analisado por uma nova sequenciação utilizando o programa informático PEAKS® para estimar as sequências de aminoácidos dos péptidos digeridos.

Exemplo B5: Análise da sequência do ADN genómico periférico do gene (1) da enzima (El) da síntese de di-hidrodaidzeína

Preparação da biblioteca de ADN genómico por RCP inversa O ADN genómico da estirpe 20-92 de Lactococcus (FERM BP-10036) purificado de acordo com o exemplo A5 foi digerido com enzimas de restrição (BamHI, EcoRI, HindIII, Kpnl, PstI, Saci, Sall, Sau3AI, Xhol; todas disponíveis na Takara Bio), a 37 °C, durante 16 horas, para se obter fragmentos de ADN. Após o tratamento com fenol-clorofórmio, purificaram-se os fragmentos por precipitação em etanol. Os fragmentos de ADN genómico purificados auto-ligaram-se utilizando um estojo de ligação TaKaRa ver. 2.1 (Takara Bio). Diluíram-se cada solução de ligação, dez vezes, com água esterilizada para preparar uma biblioteca de ADN genómico por RCP inversa. 172 (2) RCP inversa

Utilizou-se como matriz 1 yL (equivalente a 40 ng) da biblioteca de ADN genómico para a RCP inversa obtida em (1), para amplificar as regiões a montante e a jusante do ADN genómico próximo do polinucleótido EI utilizando RCP inversa. Utilizaram-se fragmentos tratados com PstI e Xhol como ADN-matriz para amplificação por RCP inversa da região a montante. Para a amplificação, por RCP inversa, da região a jusante, utilizaram-se como matriz de ADN os fragmentos tratados com HindIII, PstI, Saci e Xhol. Utilizou-se TaKaRa LA Taq (Takara Bio) para a RCP inversa. A primeira RCP foi feita utilizando 20 yL de uma mistura reaccional contendo: 1 x tampão de RCP (isento de Mg2+) ; iniciadores, 0,5 nM de cada; dNTP, 0,5 mM de cada; MgCl2, 2,5 mM; e TaKaRa LA Taq, 0,2 U. Utilizou-se como matriz 1 yL (40 ng) de uma solução diluída da biblioteca de ADN genómico. Programa de amplificação: 98 °C, durante 1 min (95 °C, durante 10 seg, 62 °C, durante 10 seg, 68 °C, durante 10 min) x 35 ciclos, 68 °C, durante 15 min. Em seguida, a RCP com iniciadores internos foi realizada utilizando 0,5 yL do primeiro produto de RCP como matriz e 30 yL de uma mistura reaccional contendo: 1 x tampão de RCP (isento de Mg2+) ; iniciadores, 0,5 nM de cada; dNTP, 0,5 mM de cada; MgCl2, 2,5 mM; e TaKaRa LA Taq, 0,3 U. Programa de amplificação: 98 °C, durante 1 min, (95 °C, durante 10 seg, 62 °C, durante 10 seg, 68 °C, durante 10 min) x 30 ciclos, 68 °C, durante 15 min. (2-1) Iniciadores 173

Os conjuntos de iniciadores utilizados para RCP inversa foram os seguintes. (2-1-1) Lado a montante

Primeira RCP: RACE-N-P3-1 e El-Bub-N-Pl RCP com iniciadores internos: RACE-N-P3-2 e El-Bub-N-P2 (2-1-2) Lado a jusante

Primeira RCP: RACE-C-P3-1 e El-Bub-C-Pl RCP com iniciadores internos: RACE-C-P3-2 e El-Bub-C-P2 (2-2) Sequências de iniciadores

As sequências dos iniciadores utilizados para a amplificação dos lados a montante e a jusante, por RCP inversa, foram as seguintes.

Sequências de iniciadores para amplificação do lado a montante RACE-N-P3-1: ATGGAGATAGTGCCGCTGGCAAGGCAACGGCAC (SEQ ID N°. 43) RACE-N-P3-2: TCAACGAAGACTCGATTTGAGCGAGAGGCGAGG (SEQ ID N°. 44)

El-Bub-N-Pl: ACGGTGGAACCGGCATCGTGTTCATGGACAAC (SEQ ID N° . 45)

El-Bub-N-P2: GCGTGACCCAGTTCCACCATGTCGGACTGTC (SEQ ID N°. 46)

Sequências de iniciadores para amplificação do lado a jusante RACE-C-P3-1: GACATCCCGTTCGAGCGCAGGATCACCCATGAG (SEQ ID N°. 47) 174

RACE-C-P3-2: AGGATCACCCATGAGCGCATCGCTATCATGGAC (SEQ ID N°. 48)

El-Bub-C-Pl : CATCGCTCTTGCAGTCGTTGTCCAGGAAGTCC (SEQ ID N° . 49)

El-Bub-C-P2 : TTGTCCAGGAAGTCCATCGCGTACACGACGGAG (SEQ ID N° . 50)

Note-se que o ADN dos oligoelementos utilizados como iniciadores de amplificação, neste exemplo, foram sintetizados pela Sigma-Aldrich Japan. (3) Purificação e determinação da sequência de base dos fragmentos de ADN genómico periféricos, amplificados por RCP inversa, do gene da enzima que sintetiza di-hidrodaidzeina

Adicionou-se 10 x por dia, ao produto de RCP com iniciadores internos obtido em (2), uma quantidade de 1/10 do produto de RCP com iniciadores internos. Depois, fez-se a electrof orese de 5 yL em gel de agarose a 0,8 %. Isto confirmou a amplificação de fragmentos de ADN de 0,5 kb (PstI) e de 3,5 kb (Xhol) na região a montante e fragmentos de ADN de 1 kb (HindIII), 1 kb (Saci) e 2,5 kb (Xhol) na

região a jusante. Neste exemplo, a electroforese de agarose utilizou brometo de etidio (Nippon Gene) para a coloração e λ/StiI (Nippon Gene) e uma rede 100 pb (Toyobo) como marcadores do peso molecular. Os fragmentos de ADN amplificados foram excisados do gel de agarose e purificados utilizando um estojo de extracção de gel da QIAGEN (Qiagen). As sequências de base dos fragmentos de ADN purificados foram então determinadas pelo processo de sequenciação directa e o processo de andamento, utilizando os iniciadores utilizados para a amplificação. (4) Análise da sequência do genoma e estimativa do QLA (quadro de leitura aberta) 175

As sequências de ADN obtidas em (3) foram submetidas a uma análise de junção utilizando o programa informático de junção de sequências SEQUENCHER (Gene Codes Inc, USA) . Além disso, fez-se a estimativa dos QLA. A análise determinou a sequência de 6 685 pb na região periférica do genoma incluindo o gene da enzima El. A figura 15 ilustra esquematicamente a estrutura do genoma periférico analisado, incluindo o gene da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína. A estimativa do QLA encontrou três QLA a montante do gene da enzima El (o terminal N não identificado é um dos QLA) e um QLA no lado a jusante. Os QLA a montante foram designados por AM (a montante) 1, AM2 e AM3, por esta ordem, para além da enzima de síntese de di-hidrodaidzeína. 0 QLA a jusante foi designado por AJ (a j_usante) 1.

Exemplo B6: Colação das sequências de péptidos digeridas com a sequência do genoma por análise de CL-EM

As sequências de aminoácidos estimadas, obtidas no exemplo B4, foram coladas com os dados da sequência do ADN genómico periférico, do gene da enzima (El) de síntese de di-hidrodaidzeína determinada no exemplo B5. Como resultado, algumas das sequências obtidas primeiramente a partir da sequência de polipéptidos emparelhada com LG2, inferidas da sequência de nucleótidos de QLA-AM2. As sequências de péptidos digeridos que se emparelham com o polipéptido de QLA-AM2 estão ilustradas a seguir. As figuras 16-1, 16-2 e 16-3 mostram os dados obtidos por CL-EM.

Quadro 1 m/z z Massa Péptido Pontuação (%) 176

Quadro 1 m/z z Massa Péptido Pontuação (%) 629,348 2 1 256,682 TPGVAASVADEXK (SEQ ID N°. 51) 100, 0 452,256 2 902,497 MFGAPVFGK (SEQ ID N°. 52) 99, 8 487,847 2 973,680 KXXXTGTTK (SEQ ID N°. 53) 99, 8 654,670 3 1 960,988 VTQEXXCAHGAFVCGSGR (SEQ ID N°. 54) 99, 6 644,348 2 1 286,681 WXSPEESVGQR (SEQ ID N°. 55) 96, 8 449,795 2 897,576 AQEVKVPK (SEQ ID N°. 56) 74,9

No quadro anterior, m/z representa a proporção entre a massa e a carga, z o número de cargas, "massa" representa a massa do péptido e "péptido" é a sequência estimada de aminoácidos. As pontuações representam a percentagem correcta do cálculo de sequências realizado pelo programa informático PEAKS (sendo que 100 % representa a mais precisa) . Note-se que como a isoleucina (I) e a leucina (L) têm o mesmo peso molecular e não se distinguem, podem ser ambas assinaladas com um X nas sequências de péptidos digeridas que se emparelham com o polipéptido de QLA-AM2.

Exemplo B7 : Síntese do polipéptido de QLA-AM2 utilizando o sistema de síntese de proteínas acelular e fazendo a confirmação da actividade de síntese de tetra-hidrodaidzeína O polipéptido QLA-AM2 foi sintetizado utilizando um sistema de síntese de proteínas acelulares (PURESYSTEM Classic II mini; Post Genome Institute Co., Ltd.), e confirmou-se a actividade de síntese de tetra-hidrodaidzeína. (1) Preparação do ADN-matriz

Numa RCP em duas etapas, preparou-se o ADN-matriz do polinucleótido QLA-AM2 para a síntese de proteínas acelulares. 177 (1-1) Iniciadores

Os iniciadores utilizados para a RCP para preparar o ADN-matriz de QLA-AM2 foram os seguintes. E2-invitroTS-FPl: ACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCACAGGAAGTCAAAGTCC (SEQ ID N°. 57)

E2-invitroTS-RP: CTAGACCTCGATCTCGCCCTGCATGCCG (SEQ ID N°. 58)

Iniciador universal: GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTT TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA (SEQ ID N° . 59)

Sintetizou-se E2-invitroTS-FPl e E2-invitroTS-RP por meio da Sigma-Aldrich do Japão, com base na sequência de nucleótidos de QLA-AM2 determinada no exemplo B5. 0 iniciador universal foi obtido pela ligação clássica II mini PURESYSTEM (Post Genome Institute Co., Ltd.). (1-2) Preparação do ADN-matriz, por RCP, em duas fases 0 ADN-matriz utilizado para a síntese do polipéptido de QLA-AM2 foi preparado por meio de uma RCP em duas etapas, de acordo com os manuais. Neste exemplo, a RCP utilizou a enzima de clonagem de RCP Easy-A® High-Fidelity (polimerase de ADN, Stratagene) e o sistema 9700 de RCP GeneAmp (dispositivo de RCP, Applied Biosystems).

Na primeira RCP, o ADN genómico da estirpe 20-92 de Lactococcus foi utilizado como matriz para amplificar o nucleótido de QLA-AM2 utilizando os iniciadores E2-invitroTS-FPl e E2-invitroTS-RP, indicados em (1-1). O produto da RCP resultante (nucleótido de QLA-AM2) foi utilizado como matriz 178 para realizar a segunda RCP, utilizando o iniciador universal e E2-invitroTS-RP. Purificou-se 300 pL (50 pL x 6) do produto de RCP utilizando um estojo de purificação de RCP (Qiagen) e utilizou-se como ADN-matriz (ADN-matriz para a síntese do polipéptido de QLA-AM2) para sintetizar o polipéptido de QLA-AM2. A primeira e a segunda RCP foram realizadas nas seguintes condições.

Primeira RCP: Uma mistura reaccional de 50 pL contendo iniciadores de amplificação, 10 pmole de cada; dNTP, 2,5 pmole de cada; ADN genómico derivado da estirpe 20-92 de Lactococcus, 40 ng; tampão Easy-A (Stratagene); e enzima de clonagem de RCP Easy-A® High-Fidelity, 2U (Stratagene). Programa de amplificação: 95 °C, durante 2 min (95 °C, durante 45 seg, 58 °C, durante 20 seg, 72 °C, durante 1 min) x 30 ciclos, 72 °C, durante 3 min.

Segunda RCP: Uma mistura reaccional de 50 pL contendo iniciadores de amplificação, 10 pmole de cada; dNTP, 2,5 pmole de cada; primeira mistura reaccional de RCP, 0,5 pL; tampão Easy-A; e enzima de clonagem de RCP Easy-A® High-Fidelity, 2U. Programa de amplificação: 95 °C, durante 2 min, (95 °C, durante 45 seg, 45 °C, durante 20 seg, 72 °C, durante 1 min) x 5 ciclos, (95 °C, durante 45 seg, 60 °C, durante 20 seg, 72 °C, durante 1 min) x 25 ciclos, 72 °C, durante 3 min. (2) Síntese da proteína acelular do polipéptido de QLA-AM2 e confirmação da actividade de síntese de tetra-hidrodaidzeína

Descongelou-se 25 pL da solução A e 10 pL da solução B do PURESYSTEM Classic II mini, conservado a -80 °C, em gelo e misturou-se. Depois, adicionou-se 0,6 pg (60 ng/pL, 10 pL) de ADN-matriz de síntese do polipéptido de QLA-AM2 (incluindo uma sequência do promotor T7 e uma sequência de ligação de 179 ribossoma de 5' do codão de iniciação) preparada pela segunda RCP. Ajustou-se o volume total para 50 pL por meio da adição de água esterilizada e fez-se a incubação da mistura, a 37 °C, durante 90 minutos, para sintetizar um polipéptido- alvo. Como controlo positivo da sintese de proteína, utilizando este sistema, utilizou-se 0,5 pg (0,2 pg/pL, 2 pL) de ADN-matriz de síntese de di-hidrofolato-redutase (DHFR), fornecido como um apêndice do PURESYSTEM Classic II mini. Não se adicionou nenhum ADN-matriz ao controlo negativo e utilizou-se apenas água esterilizada. Para a medição da actividade, adicionou-se 40 pL da mistura reaccional a um tampão reaccional enzimático com a composição que se segue e fez-se a incubação da mistura, a 37 °C, durante 6 horas. Após a reacção, a mistura reaccional enzimática foi extraída com 3 mL de acetato de etilo. Secou-se o extracto e dissolveu-se em forese e analisou-se a tetra-hidrodaidzeína na mistura reaccional enzimática por meio de uma análise de CLAR.

Composição do tampão reaccional enzimático

Tampão de fosfato de potássio 0,1 M/PMSF 1 mM/DTT 2 mM/hidrossulfito de sódio 5 mM (pH 7,0)

NADPH 2 mM

NADH 2 mM 7,0 pg/mL de di-hidrodaidzeína

As amostras com o ADN-matriz de síntese de di-hidrof olato-redutase (DHFR) expressaram, com sucesso, a proteína, a partir do ADN, enquanto não se observou nenhuma expressão de proteína nas amostras sem ADN-matriz. Estes 180 resultados sugerem que a experiência foi, na verdade, apropriada.

Os resultados estão ilustrados na figura 17. A mistura reaccional que expressa o polipéptido de QLA-AM2 tem um pico para a tetra-hidrodaidzeina numa posição a cerca de 6,7 minutos, 6 horas após a reacção, enquanto não se observou nenhum pico de tetra-hidrodaidzeina na mistura reaccional sem síntese de proteína (NC) e na mistura reaccional que expressa di-hidrofolato-redutase (DHFR). Além disso, quando a mistura reaccional que expressa o polipéptido de QLA-AM2 tem um nível reduzido de di-hidrodaidzeína (substrato) devido à biossíntese de tetra-hidrodaidzeina, não se observou nenhuma redução de di-hidrodaidzeína na mistura reaccional que não tinha a síntese da proteína (NC) e na mistura reaccional que expressa di-hidrofolato-redutase (DHFR). Estes resultados mostram que o polipéptido de QLA-AM2 tem actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina a partir de di-hidrodaidzeína. Pode, por isso, dizer-se que o polipéptido de QLA-AM2 corresponde ao polipéptido E2.

Exemplo B8: Expressão do polipéptido recombinante de QLA-AM2 utilizando Escherichia coli e confirmação da actividade de síntese de tetra-hidrodaidzeina

Utilizou-se o sistema pET, um sistema de expressão da proteína recombinante utilizando Escherichia coli, para expressar o polipéptido de QLA-AM2 e confirmou-se a sua actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina. 181

(1) Preparação do vector de expressão do polipéptido de QLA AM2

Para preparar o vector de expressão do polipéptido de QLA-AM2 (pET21-AM2), amplificou-se o ADN na região do quadro de leitura aberta do polipéptido de QLA-AM2, por meio de RCP.

Os iniciadores de amplificação que se seguem foram preparados com base na sequência do polipéptido de QLA-AM2, determinada no exemplo B5.

exp.AM2 pet F Nde: TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC (SEQ ID NO : 60)

exp.AM2 pet: AATCGAATTCCTAGACCTCGATCTCGCCCTGC (SEQ ID N°. 61)

Para a inserção em pET21a (Novagen), conceberam-se os iniciadores de amplificação exp.AM2 pet F Nde e exp.AM2 pet, para incluir as sequências de restrição Ndel e EcoRI, respectivamente.

Realizou-se uma reacção de RCP utilizando 25 pL de uma mistura reaccional contendo os iniciadores, 5 pmole de cada; dNTP, 5 nmole de cada; ADN genómico da estirpe 20-92 de

Lactococcus, 40 ng; 10 x tampão para a polimerase de ADN KOD-plus (Toyobo) , 2,5 pL; polimerase de ADN KOD-Plus, 0,3 U (Toyobo).

Programa de amplificação: 95 °C, durante 3 min, (94 °C, durante 30 seg, 60 °C, durante 30 seg, 68 °C, durante 1 min) x 30 ciclos, 68 °C, durante 7 min. Dispositivo de RCP: sistema 9700 de RCP GeneAmp (Applied Biosystems). Analisando uma parte da mistura reaccional de RCP por electroforese em gel de agarose, detectou-se uma banda de uma dimensão 182 inesperada. Recolheu-se todo o produto da RCP por meio de um estojo de purificação da QIAGEN PAR (Qiagen).

Cortaram-se os fragmentos de ADN assim recolhidos com as enzimas de restrição Ndel e EcoRI e submeteram-se a uma electroforese em gel de agarose. Depois, excisou-se uma porção contendo a banda-alvo e purificou-se e recolheu-se com um estojo de extracção em gel da Qiagen (Qiagen) . Após a recolha, ligaram-se os fragmentos de ADN, a 16 °C, durante a noite, com pET21a digerido com Ndel e EcoRI, utilizando um estojo de ligação de ADN ver. 2.1 (Takara Bio) . Utilizou-se então a mistura reaccional ligada para transformar a estirpe JM109 de Escherichia coli (Takara Bio).

Fez-se uma cultura do transformante, a 37 °C, durante a noite, numa placa de agar com meio LB (GIBCO) , contendo ampicilina (50 yg/mL). Fez-se uma cultura das colónias simples resultantes, durante a noite, em 3 mL de meio LB (GIBCO), contendo ampicilina (50 yg/mL). Depois, extraiu-se o ADN do plasmido utilizando um auto-extractor de plasmido PI-100 (KURABO). A sequência de base do ADN inserido no plasmido foi sequenciada pelo processo do terminador de corante. Isto confirmou o sucesso da inserção do polinucleótido de QLA-AM2, conforme pretendido. Neste exemplo, determinou-se a sequência de ADN utilizando um sequenciador de ADN ABI3700 (Applied Biosystems). (2) Expressão e confirmação do polipéptido recombinante de QLA-AM2 em Escherichia coli

Utilizou-se recombinante de o plasmido de expressão do polipéptido QLA-AM2, pET21-AM2 e o plasmido pET21a 183 (controlo negativo) para transformar a estirpe BL21 (DE3) de Escherichia coli (Novagen). Para se obter as colónias simples fez-se uma cultura dos transformantes, durante a noite, a 37 °C, numa placa de agar com meio LB, contendo ampicilina (50 yg/mL).

Fez-se uma cultura de cada transformante de BL21 (DE3) de E. coli, durante a noite, a 37 °C, em 3 mL de meio liquido LB, contendo ampicilina (50 yg/mL). Depois, fez-se uma pré-cultura de 0,5 mL da cultura, durante 3 horas (até a DO a 630 nm se tornar cerca de 0,4), por meio da adição de 50 mL de meio liquido de LB contendo a mesma concentração de ampicilina. Depois de se ajustar a concentração final para 1 mM, por adição de IPTG (isopropil-p-tiogalactopiranósido; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a cultura foi incubada, a 37 °C, durante 4 horas.

Após a incubação, colheram-se as células por centrifugação (6.000 rpm, 4 °C, 15 min) utilizando um Avanti HP25 (Beckman Coulter). Realizaram-se os procedimentos subsequentes em gelo. Após a eliminação do sobrenadante (o meio), fez-se uma suspensão das células em 1 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0; KPB-PDH) , contendo PMSF 1 mM, DTT 2 mM e hidrossulfito de sódio 5 mM. Depois colocou-se a suspensão de células num tubo Assist de 2 mL, carregado com 0,7 mL de pérolas de zircónio-silica (BioSpec Products, Inc.) e 400 yL de KPB-PDH. Depois, as células foram desagregadas por meio de dois ciclos repetidos de 20 segundos, tratadas a 6 500 rpm e 3 minutos com arrefecimento com gelo, utilizando um FastPrep® (Thermo Electron Corporation). Como resultado, obteve-se uma suspensão de células desagregadas. 184 A expressão do polipéptido recombinante de QLA-AM2 em E. coli foi confirmada por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS (EGPA-SDS).

Adicionou-se 5 yL de 5 x tampão de amostra (Tris-HCl 125 mM (pH 6,5)/glicerol a 25 %/SDS a 5 %/2-mercaptoetanol a 5 %/BPB a 0,5 %) , a 20 pL da suspensão de células desagregadas. Após a desnaturação pelo calor, a 98 °C, durante 5 minutos, arrefeceu-se a suspensão com gelo e fez-se a electroforese de 10 pL por meio de EGPA-SDS. Realizou-se a EGPA-SDS com uma placa de gel comercialmente disponível (SuperSep® 5-20 %; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e Quick CBB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para a coloração. Utilizou-se uma vasta gama de XL-Ladder pré-corado (Apro Science) como marcador do peso molecular.

Os resultados da EGPA-SDS estão ilustrados na figura 18. Confirmou-se um polipéptido recombinante com um peso molecular de cerca de 29 kDa na suspensão de células desagregadas derivadas do transformante pET21-AM2. (3) Confirmação da actividade de síntese de di-hidro-daidzeína do polipéptido recombinante de QLA-AM2

Utilizou-se a suspensão de células desagregadas obtidas em (2) deste exemplo como a fonte de enzimas, para medir a actividade de conversão de di-hidrodaidzeina em tetra-hidro-daidzeína. Como resultado, confirmou-se a actividade no polipéptido recombinante de QLA-AM2 expresso.

Neste exemplo, a medição da actividade de conversão de di-hidrodaidzeína em tetra-hidrodaidzeína foi realizada como se segue. 185

Preparou-se uma mistura reaccional enzimática com a composição que se segue e fez-se a incubação da mistura, a 0 °C, durante 2 horas.

Composição da mistura reaccional enzimática

Suspensão de células desagregadas (fonte de enzimas): 100 pL

NADH (100 mM): 20 pL NADPH (100 mM): 20 pL Di-hidrodaidzeína (1 mg/mL): 5 pL KPB-PDH: 855 pL Total: 1000 pL

Após a incubação, adicionou-se 3 mL de acetato de etilo à mistura reaccional enzimática para a extracção. Após a secagem, dissolveu-se o extracto por meio de uma fase móvel (eluente). Analisou-se o produto dissolvido por CLAR para medir os teores de di-hidrodaidzeina e de cis- e trans-tetra-hidrodaidzeínas, na mistura reaccional enzimática.

Os resultados da análise por CLAR estão ilustrados na figura 19. Na suspensão de células desagregadas, derivadas do transformante do plasmido pET21-AM2, que expressa o polipéptido recombinante de QLA-AM2, a di-hidrodaidzeina (substrato) adicionada à mistura reaccional enzimática foi convertida em cis-tetra-hidrodaidzeína (c-THD) e trans-tetra-hidrodaidzeína (t-THD), enquanto não se detectou tetra-hidrodaidzeína na mistura reaccional enzimática no transformante de pET21a (controlo negativo).

Estes resultados mostram que o polipéptido recombinante de QLA-AM2 tem actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeína a partir de di-hidrodaidzeína. Por isso, pode-se dizer que o polipéptido recombinante de QLA-AM2 corresponde ao polipéptido E2. 186

Exemplo C

Exemplo Cl: Confirmação da actividade de biosslntese de equol por meio de células bacterianas a partir de tetra-hidro-daidzeína

Inoculou-se a estirpe 20-92 de Lactococcus (FERM BP-10036) num meio liquido de amplificação contendo tetra-hidro-daidzeina (um meio de caldo GAM modificado (NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) a que se adicionou cis- ou trans-tetra-hidrodaidzeina (sintetizada organicamente pela Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.: ver o exemplo de referência Bl) numa quantidade de 10 pg/mL) e fez-se a incubação da cultura, a 37 °C, durante 18 horas, em condições anaeróbicas (utilizando os sistemas Gas Pack da BBL) . Após a incubação, colocou-se imediatamente 1 mL da cultura no tubo de vidro com tampa de uma centrifugadora e adicionou-se 3 mL de acetato de etilo para extracção. Secou-se o produto para preparar uma amostra para análise por CLAR. Como solução-padrão para a análise por CLAR, utilizou-se uma solução mista de daidzeina (2 pg/mL; Funakoshi Corporation), equol (2 pg/mL; Funakoshi Corporation), di-hidrodaidzeina (2 pg/mL; Trend Research Chemicals Inc.); cis-tetra-hidrodaidzeina e trans-tetra-hidrodaidzeína (2 pg/mL; ambas sintetizadas quimicamente pela Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).

Os resultados estão ilustrados na figura 20. A figura 20 mostra que a estirpe 20-92 de Lactococcus 20-92 tem uma actividade para biossintetizar um equol a partir tanto de cis- como de trans-tetra-hidrodaidzeina (figura 20, gráficos médio e inferior). Note-se que, nas figuras, a daidzeina está abreviada como DZN, a di-hidrodaidzeina como DD, a cis-tetra- 187 hidrodaidzeína como c-THD, a traris-tetra-hidrodaidzeína como t-THD e o equol como EQL.

Exemplo C2: Pesquisa e identificação de enzimas de síntese de equol por meio de sistemas de expressão de proteínas recombinantes utilizando Escherichia coli

Utilizou-se o sistema pET (Novagen) , um sistema de expressão de proteínas recombinantes utilizando Escherichia coli, para expressar polipéptidos, cada um deles correspondendo a três polinucleótidos de QLA (QLA-AM3, AM1 e AJ1) identificados na sequência de ADN genómico periférico do gene da enzima (El), que sintetiza di-hidrodaidzeína determinada no exemplo B5, em Escherichia coli. A actividade para catalisar a conversão de equol, a partir de tetra-hidrodaidzeína, foi examinada para pesquisar a enzima (E3) da síntese de equol.

(1) Preparação do vector de expressão do polipéptido de QLA

Para preparar um vector de expressão de cada um dos polipéptidos de QLA (QLA-AM3, AM1 e AJ1), amplificou-se o polinucleótido na região do quadro de leitura aberta de cada polipéptido, por meio de RCP e inseriu-se no vector pET21a (Novagen). (1-1) Iniciador de amplificação

Os iniciadores de amplificação que se seguem foram preparados com base na sequência de ADN genómico periférico da enzima (El) de síntese de di-hidrodaidzeína determinada no exemplo B5.

Polipéptido de QLA-AM3 188 exp.ΑΜ3 F: TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG (SEQ ID N° . 62) exp.AM3 R: CCGCAAGCTTCTACATAGTGGAGATCGCGTGG QLA-AM (SEQ ID N°. 63)

Polipéptido de QLA-AM1 exp.AMl F: TATACATATGTTCAAGGGTCCACAGGGC (SEQ ID N° . 64) exp.AMl R: GCTCGAATTCTTAGTGCTGCTGTGCCTTTTCAG (SEQ ID N° . 65)

Polipéptido de QLA-AJ1 exp.AJl F: ATATACATATGCAGGATATGGACTTCATGG (SEQ ID N°. 66) exp.AJl R: GCTCGAATTCTCATAGTGACATCAGCGCTCCC (SEQ ID N°. 67)

Para a inserção em pET21a (Novagen), conceberam-se os iniciadores de amplificação exp.AM3 F, exp.AMl F e exp.AJl F para incluir a sequência de restrição de Ndel, exp.AM3 R para incluir a sequência de restrição de HindIII e exp.AMIR e exp.AJl R para incluir a sequência de restrição de EcoRI.

(1-2) Amplificação de cada polinucleótido de QLA

Realizou-se uma reacção de RCP utilizando 25 pL de uma mistura reaccional contendo os iniciadores, 5 pmole de cada; dNTP, 5 nmole de cada; ADN genómico da estirpe 20-92 de Lactccoccus purificada no exemplo A5, 40 ng; 10 x tampão para a polimerase de ADN KOD-plus (Toyobo Co., Ltd.), 2,5 pL; polimerase de ADN KOD-Plus, 0,3 U (Toyobo Co., Ltd.). Programa de amplificação: 95 °C, durante 3 min, (94 °C, durante 30 seg, 60 °C, durante 30 seg, 68 °C, durante 2 min) x 30 ciclos, 68 °C, durante 7 min. Dispositivo de RCP: 189 sistema 9700 de RCP GeneAmp (Applied Biosystems). Analisando uma parte da mistura reaccional de RCP por electroforese em gel de agarose detectou-se uma banda com uma dimensão inesperada para cada iniciador. Recolheu-se todo o produto da RCP por meio de um estojo de purificação de RCP da QIAGEN (Qiagen).

(1-3) Preparação do vector de expressão do polipéptido de QLA

Recolheram-se os fragmentos dos polinucleótidos de QLA- AM3 do processo (1-2) que se cortaram com as enzimas de restrição Ndel e HindIII e cortaram-se os fragmentos dos polinucleótidos de QLA-AM1 e QLA-AJ1 com as enzimas de restrição Ndel e EcoRI. Submeteram-se os fragmentos a electroforese em gel de agarose. Depois, excisou-se uma porção contendo a banda-alvo e purificou-se e recolheu-se o estojo de extracção em gel da Qiagen (Qiagen). Após a recolha, os fragmentos de polinucleótidos foram ligados, a 16 °C, durante a noite, com pET21a digerido com Ndel e HindIII ou EcoRI, utilizando um estojo de ligação de ADN ver. 2.1 (Takara Bio). A mistura reaccional ligada foi então utilizada para transformar a estirpe JM109 de Escherichia coli (Takara Bio) por um processo normal. Fez-se a cultura do transformante obtido, a 37 °C, durante a noite, numa placa de agar com meio LB (GIBCO) , contendo ampicilina (50 yg/mL) . As colónias simples resultantes foram postas em cultura, durante a noite, em 3 mL de meio LB (GIBCO) , contendo ampicilina (50 yg/mL). Depois, extraiu-se o ADN do plasmido utilizando um auto-extractor de plasmido PI-100 (KURABO). A sequência de base do ADN inserido no plasmido foi sequenciada pelo processo do terminador de corante. Isto confirmou a inserção, com sucesso, de cada polinucleótido, conforme pretendido. Assim, obteve-se pET-AM3, pET-AMl e pET- 190 AJ1. Neste exemplo, determinou-se a sequência de ADN utilizando um sequenciador de ADN ABI3700 (Applied Biosystems). (2) Expressão de cada polipéptido recombinante em Escherichia coli (2-1) Preparação do transformante de BL21 de Escherichia coli

Utilizaram-se os plasmidos de expressão do polipéptido recombinante de QLA pET-AM3, pET-AMl, pET-AJl e pET21a (controlo negativo) para transformar a estirpe BL21 de Escherichia coli (DE3) (Novagen) por um processo normal. Para se obter colónias simples, fez-se uma cultura dos transformantes, durante a noite, a 37 °C, com uma placa de agar de meio LB, contendo ampicilina (50 yg/mL). (2-2) Indução da expressão do polipéptido recombinante

Fez-se uma cultura de cada transformante de BL21 de E. coli (DE3) , durante a noite, a 37 °C, em 3 mL de meio liquido de LB, contendo ampicilina (50 pg/mL). Depois, fez-se uma pré-cultura de 0,5 mL da cultura, durante 3 horas (até a DO a 630 nm se tornar cerca de 0,4 a 0,7), por meio da adição de 50 mL de meio liquido de LB contendo a mesma concentração de ampicilina. Depois de se ajustar a concentração final para 1 mM, por meio da adição de IPTG (isopropil-p-tiogalacto-piranósido; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), incubou-se ainda a cultura, a 37 °C, durante 4 horas. Assim, induziu-se a expressão do polipéptido recombinante em Escherichia coli. (2-3) Preparação da suspensão de células desagregadas 191

Após a indução da expressão no processo (2-2), recolheram-se as células por centrifugação (6 000 rpm, 4 °C, 15 min) utilizando um Avanti HP25 (Beckman Coulter). Realizaram-se os procedimentos subsequentes em gelo. Após a remoção do sobrenadante (o meio), fez-se uma suspensão das células em 1 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,0; daqui para a frente abreviado como KPB-PDH), contendo PMSF 1 mM, DTT 2 mM, e hidrossulfito de sódio 5 mM. Depois, colocou-se a suspensão das células num tubo Assist 2 mL carregado com 0,7 mL de pérolas de zircónio-silica (BioSpec Products, Inc.) e 400 pL de KPB-PDH. Depois, desagregaram-se as células por meio de dois ciclos repetidos de 20 segundos, um tratamento a 6.500 rpm e 3 minutos de arrefecimento em gelo, utilizando um FastPrep® (Thermo Electron Corporation). Como resultado, obteve-se uma suspensão de células desagregadas. (2-4) Confirmação da expressão do polipéptido recombinante por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS (EGPA-SDS)

A expressão de cada polipéptido recombinante de QLA em E. coli foi confirmada por EGPA-SDS. Adicionou-se 5 pL de 5 x tampão da amostra (Tris-HCl 125 mM (pH 6,5)/glicerol a 25 %/SDS a 5 %/2-mercaptoetanol a 5 %/BPB a 0,5 %) a 20 pL da suspensão de células desagregadas obtida no processo (2-3). Após desnaturação pelo calor, a 98 °C, durante 5 minutos, arrefeceu-se a suspensão com gelo e realizou-se a electroforese de 4 pL por EGPA-SDS. A EGPA-SDS foi realizada com uma placa de gel disponível comercialmente (SuperSep® a 5-20 %; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), e Quick CBB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para coloração. A vasta gama de XL-Ladder pré-corada (Apro Science) foi utilizada como marcador de peso molecular. Os resultados da EGPA-SDS 192 estão ilustrados na figura 21. A expressão dos polipéptidos QLA-AM3 e QLA-AJ1 com pesos moleculares de cerca de 52 kDa e 50 kDa, foi confirmada na suspensão de células desagregadas derivadas os transformantes pET-AM3 e pET-AJl, respectivamente. Não se observou expressão do polipéptido recombinante de QLA-AM1 na suspensão de células desagregadas derivadas do transformante pET-AMl.

Exemplo C3: Medição da actividade de síntese de equol do polipéptido recombinante de QLA A suspensão de células desagregadas obtida no exemplo C2 foi utilizada como uma fonte de enzimas para medir a actividade de conversão de tetra-hidrodaidzeína em equol. Neste exemplo, a medição da actividade de conversão da tetra-hidrodaidzeína em equol foi realizada como se segue.

Preparou-se uma mistura reaccional enzimática com a composição que se segue e fez-se a incubação da mistura, a 37 °C, durante 1 hora.

Composição da mistura reaccional enzimática

Suspensão de células desagregadas (fonte de enzimas): 100 pL

NADH (100 mM): 20 pL NADPH (100 mM): 20 pL Cis-tetra-hidrodaidzeína (2 mg/mL): 5 pL Trans-tetra-hidrodaidzeína (2 mg/mL): 5 pL KPB-PDH: 850 pL Total: 1000 pL

Após a incubação, adicionou-se 3 mL de acetato de etilo à mistura reaccional enzimática para extracção. Após secagem, dissolveu-se o extracto por meio de uma fase móvel (eluente). Analisou-se o produto dissolvido por CLAR para medir os 193 teores de di-hidrodaidzeína, cis-tetra-hidrodaidzeína, trans- tetra-hidrodaidzeína e equol na mistura reaccional enzimática. Como solução- -padrão para análise por CLAR, utilizou-se uma solução mista de daidzeína (2 yg/mL; Funakoshi Corporation), equol (2 yg/mL; Funakoshi

Corporation), di-hidrodaidzeína (2 yg/mL; Trend Research Chemicals Inc.), cis-tetra-hidrodaidzeína e trans-tetra-hidrodaidzeína (2 yg/mL; ambas sintetizadas quimicamente pela Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)·

Como resultado da análise por CLAR, na suspensão de células desagregadas, derivadas do transformante do plasmido pET-AM3 que expressam o polipéptido recombinante de QLA-AM3, a tetra-hidrodaidzeína adicionada à mistura reaccional enzimática foi convertida em equol (figura 22). Adicionalmente confirmou-se a actividade de conversão em di-hidrodaidzeína, que é um percursor da tetra-hidrodaidzeína, durante a via de biossíntese do equol (figura 22) . Tal como para os transformantes de pET-AMl e pET-AJl e o transformante de pET21a (controlo negativo), detectou-se apenas a tetra-hidrodaidzeínana mistura reaccional enzimática. Note-se que, nas figuras, a daidzeína é abreviada como DZN, a di-hidrodaidzeína como DD, a cis-tetra-hidrodaidzeína como c-THD, a trans-tetra-hidrodaidzeína como t-THD e o equol como EQL.

Estes resultados mostram que o polipéptido de QLA-AM3 tem actividade para biossintetizar equol a partir de tetra-hidrodaidzeína. Pode-se dizer assim que o polipéptido recombinante de QLA-AM3 corresponde ao polipéptido E3.

Exemplo D 194

Exemplo Dl: Expressão e purificação da enzima recombinante relacionada com a produção de equol marcada com His, utilizando Escherichia coli

Utilizando um sistema pET (Novagen), que é um sistema de expressão de proteínas recombinantes, utilizando Escherichia coli, foram expressas três enzimas relacionadas com a produção de equol, com o marcador His: enzima (El) da síntese de di-hidrodaidzeína, enzima (E2) da síntese de tetra-hidro- daidzeína, enzima (E3) da síntese de equol, seguida da purificação por afinidade utilizando uma coluna de purificação (Ni) de proteína marcada com His. (1) Produção do vector de expressão da enzima marcado com His

Para produzir os vectores de expressão para as enzimas (El, E2, E3), amplificou-se um polinucleótido em cada região de quadro de leitura aberta, por meio de RCP e inseriu-se no vector pET21a (Novagen). (1-1) Iniciador de amplificação

Com base na sequência do genoma na vizinhança da enzima (El) de síntese de di-hidrodaidzeína, encontrada no exemplo B5, produziram-se os iniciadores de amplificação que se seguem.

Enzima El marcada com His exp.El pet F Nde: AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA (número da sequência: 41)

exp.El pet His: AATCGAATTCGTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT (número da sequência: 42) 195

Enzima E2 marcada com His exp.AM2 pet F Nde: TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC (número da sequência: 60) exp.E2 pet His: AATCGAATTCGAGACCTCGATCTCGCCCTGC (número da sequência: 68)

Enzima E3 marcada com His exp.AM3 F: TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG (número da sequência: 62) exp.E3 R His: CCGCAAGCTTGTACATAGTGGAGATCGCGTGG (número da sequência: 69)

Para inserção em pET21a (Novagen), os iniciadores de amplificação: exp.EI pet F Nde, exp.AM2 pet F, e exp.AM3 F foram concebidos para incluírem, cada um, uma sequência do sítio de clivagem da enzima de restrição Ndel; exp.El pet His e exp.E2 pet His foram concebidos para incluírem uma sequência do ciclo de clivagem de EcoRI; e exp.E3 R His foi concebido para incluir uma sequência do ciclo de clivagem de HindiII. (1-2) Amplificação dos polinucleótidos enzimáticos marcados com His

Realizou-se uma reacção de RCP utilizando 25 pL de uma mistura reaccional contendo os iniciadores, 5 pmole de cada; DNTP, 5 nmole de cada; ADN genómico da estirpe 20-92 de Lactococcus (FERM BP-10036), purificada no exemplo A5, 40 ng; 10 x tampão para a polimerase de ADN KOD-plus (Toyobo) , 2,5 pL; polimerase de ADN KOD-Plus (Toyobo) 0,3 U, utilizando um programa de amplificação: 95 °C, durante 3 min, (94 °C, durante 30 seg, 60 °C, durante 30 seg, 68 °C, durante 2 min) x 30 ciclos, 68 °C, durante 7 min (dispositivo de RCP: 196 sistema 9700 de RCP GeneAmp (Applied Biosystems)). Analisando uma parte da mistura reaccional de RCP por electroforese em gel de agarose detectou-se uma banda com uma dimensão inesperada. Recolheu-se todo o produto da RCP por meio de um estojo de purificação de RCP da QIAGEN (Qiagen). (1-3) Produção do vector de expressão do polipéptido da enzima marcada com His

Cortaram-se os fragmentos do polinucleótido da enzima marcada com His recolhidos em (1-2), com as enzimas de restrição Ndel e EcoRI e submeteram-se a electroforese em gel de agarose. Depois, excisou-se uma porção contendo a banda-alvo e purificou-se e recolheu-se com um estojo de extracção em gel da Qiagen (Qiagen) . Após a recolha, ligaram-se os fragmentos dos polinucleótidos, a 16 °C, durante a noite, com pET21a digerido com Ndel e EcoRI, utilizando um estojo de ligação de ADN ver. 2.1 (Takara Bio). Com a mistura de reacção ligada, realizou-se a transformação da estirpe JM109 de Escherichia coli (Takara Bio) num processo geral. O transformante assim obtido foi posto em cultura, a 37 °C, durante a noite, numa placa de agar de meio LB (GIBCO) contendo ampicilina (50 yg/mL). As colónias únicas resultantes foram postas em cultura, durante a noite, em 3 mL de um meio LB (GIBCO) contendo ampicilina (50 yg/mL). Depois, extraiu-se o ADN do plasmido utilizando um auto-extractor de plasmidos PI-100 (KURABO).

A sequência de bases do ADN inserido no plasmido foi sequenciada pelo processo do terminador de corante. Isto confirmou o sucesso da inserção do polinucleótido de URF-AM2 conforme pretendido. Obteve-se pET-El-His, pET-E2-His e pET-E3-His. Neste exemplo, determinou-se a sequência de ADN 197 utilizando um sequenciador de ADN ABI3700 (Applied Biosystems). (2) Expressão e purificação por afinidade de cada polipéptido de enzima recombinante, marcada com His, em Escherichia coli (2-1) Produção do transformante BL21 de Escherichia coli

Utilizando os plasmidos pET-El-His, pET-E2-His, pET-E3-His para a expressão do polipéptido de enzimas marcado com His, transformaram-se estirpes BL21 (DE3) de Escherichia coli (Novagen) utilizando um processo geral. Fez-se uma cultura dos transformantes, a 37 °C, durante a noite, em placas de agar com meio LB (GIBCO) contendo ampicilina (50 yg/mL), obtendo-se assim colónias simples. (2-2) Purificação de polipéptido das enzimas recombinantes El e E2 marcadas com His (2-2-1) Cultura de Escherichia coli e indução da expressão dos polipéptidos enzimáticos El e E2 recombinantes marcados com His

Cada um dos transformantes de BL21 (DE3) de E. coli transformados, respectivamente, por meio de pET-El-His e pET-E2-His, foram postos numa cultura, durante a noite, a 37 °C, em 10 mL de meio liquido de LB contendo ampicilina (50 yg/mL). Depois, fez-se uma pré-cultura de 7,5 mL da cultura, durante 2 horas (até a DO, a 600 nm, se tornar cerca de 0,5), por meio da adição de 150 mL de meio liquido LB contendo a mesma concentração de ampicilina. Depois de se ajustar a concentração final para 0,5 mM, por meio da adição de IPTG (isopropil^-tiogalactopiranósido; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), fez-se a incubação da cultura, a 30 °C, 198 durante 4 horas, ao mesmo tempo que se agitava suavemente, induzindo assim a expressão dos polipéptidos das enzimas recombinantes EI e E2, marcadas com His, em Escherichia coli. (2-2-2) Preparação do lisado

Após a indução da expressão em (2-2), centrifugou-se a cultura (6.000 rpm, 4 °C, durante 10 minutos), utilizando Avanti HP25 (beckman coulter) para recolher as células, obtendo-se assim os polipéptidos de enzimas recombinantes EI e E2 marcados His expressos em Escherichia coli, respectivamente nas quantidades de 0,66 g e 0,73 g. Adicionou-se uma solução de extracção de proteínas Bugbuster (Novagen) às células obtidas, numa quantidade de 15 mL por grama (peso líquido) da célula. Fez-se uma suspensão da mistura suavemente com uma pipeta e adicionou-se à suspensão lisozima (SIGMA) e benzonase (Novagen) nas quantidades de 2.000 unidades/mL, e 25 unidades (1 pL)/mL, respectivamente. Depois, agitou-se lentamente a mistura com um rotor (RT-50:Taitec), à temperatura ambiente, durante 30 minutos, obtendo-se assim um lisado (lisado A). Centrifugou-se o lisado A (8.000 rpm, 4 °C, durante 15 minutos) com Avanti HP25 (beckman coulter) para separar um sobrenadante (lisado B) . (2-2-3) Purificações por afinidade dos polipéptidos das enzimas EI e E2 marcadas com His

Utilizando uma His GraviTrap (GE Healthcare Bioscience) como coluna de purificação de proteínas marcadas com His, realizou-se a purificação por afinidade dos polipéptidos das enzimas EI e E2, marcadas com His, de acordo com o manual de instruções, excepto no caso de algumas modificações. Mais especificamente, equilibrou-se a coluna His GraviTrap com 10 199 mL de tampão de ligação, arrefecido em gelo e verteu-se todo o lisado B, preparado em (2-2-2), numa mistura, de tal modo que as enzimas-alvo EI e E2, marcadas com His, aderiram à coluna His GraviTrap por queda livre. Depois, limpou-se a coluna His GraviTrap, duas vezes, com 10 mL de solução tampão arrefecida com gelo, seguida da eluição das enzimas-alvo EI e E2 marcadas com His a partir da coluna His GraviTrap, utilizando 3 mL de tampão de eluição. Adicionou-se DTT (ditiotreitol: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ao produto eluido de tal modo que a concentração final ficou em 3 mM. Dividiu-se a mistura em microtubos de 300 pL. Examinou-se uma parte dos microtubos quanto às actividades enzimáticas de EI e às actividades enzimáticas de E2 nos respectivos produtos eluídos. Conservou-se o produto eluido a 4 °C, até ser utilizado para o ensaio das enzimas.

As composições do tampão de ligação, o tampão de limpeza e o tampão de eluição utilizados para a purificação, estão ilustrados a seguir.

Tampão de ligação: Tris-HCl 20 mM, imidazol 20 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), NaCl 0,5 M (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), DTT 1 mM (ditiotreitol: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), PMSF 1 mM (fluoreto de fenil-metilsulfonilo: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Tampão de limpeza: Tris-HCl 20 mM, imidazol 60 mM, NaCl 0,5 M, DTT 1 mM (ditiotreitol), PMSF 1 mM (fluoreto de fenil-metilsulfonilo).

Tampão de eluição: Tris-HCl 20 mM, imidazol 500 mM, NaCl 0,5 M, DTT 1 mM (ditiotreitol), PMSF 1 mM (fluoreto de fenil-metilsulfonilo) 200 (2-3) Purificação do polipéptido da enzima recombinante E3 marcada com His (2-3-1) Cultura de Escherichia coli e indução da expressão do polipéptido da enzima recombinante E3 marcada com His 0 transformante BL21 (DE3) de E. coli, transformado por pET-E3-His, foi posto em cultura, durante a noite, a 37 °C, em 50 mL num meio Liquido de LB contendo ampicilina (50 yg/mL). Depois, fez-se uma pré-cultura de 20 mL da cultura, durante 3 horas (até a DO a 600 nm se tornar cerca de 0,4) por meio da adição de 1 L de meio liquido de LB contendo a mesma concentração de ampicilina. Após o ajustamento da concentração final para 0,5 mM por meio da adição de IPTG (isopropil-p-tiogalactopiranósido; (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a cultura foi ainda novamente incubada, a 37 °C, durante 4 horas, ao mesmo tempo que se agitava, induzindo-se assim a expressão do polipéptido da enzima recombinante E3 marcado com His em Escherichia coli. Após a indução da expressão, centrifugou-se a cultura (6.000 rpm, 4 °C, durante 10 minutos) utilizando Avanti HP25 (beckman coulter) para recolher as células. Adicionou-se à suspensão tampão de fosfato de potássio 0,1 M contendo PMSF 1 mM (fluoreto de fenilmetilsulfonilo), DTT 2 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e hidrossulfito de sódio 5 mM (tampão A, daqui para a frente: pH 7,0). Após centrifugação (6.000 rpm, 4 °C, durante 10 minutos), manteve-se a cultura a -80 °C. (2-3-2) Preparação do lisado

Descongelou-se rapidamente as células conservadas a -80 °C e centrifugaram-se (10.000 x g, durante 15 min). Fez-se uma suspensão das células por meio da adição de 25 mL do 201 novo tampão A. Para a desagregação, as células foram então desagregadas por meio de três ciclos repetidos de 20 segundos, um tratamento a 6.500 rpm e um arrefecimento com gelo, durante 3 minutos, utilizando FastPrep® (Thermo Electron Corporation). O material celular desagregado resultante foi centrifugado (10.000 x g, durante 15 min) . Separou-se o sobrenadante para se obter um lisado. (2-3-3) Purificação por afinidade do polipéptido da enzima recombinante E3 marcada com His

Na coluna HisTrap HP (GE Healthcare Bioscience), que é uma coluna de purificação de proteínas de fusão marcadas com His, fez-se passar 4 mL do lisado obtido em (2-3-3), para purificar o polipéptido da enzima recombinante E3 marcada com His, nas condições de purificação que se seguem. Mediu-se a proteína com base na absorção a 280 nm. A fracção recolhida, utilizando um dispositivo de recolha de fracções, foi iniciada após a absorção, a 280 nm, na fracção que passou através da coluna diminuindo até ao valor inicial.

Velocidade do fluxo: 1 mL/min Fracção: fracção de 2 mL/2 min

Eluente A: tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7)/ NaCl 0,5 M/isoPrOH a 1 %

Eluente B: eluente A contendo imidazol 0,5 M

Programa de eluição: tempo (min) (eluente B)/(eluente A + eluente B) 202 0 0,05 5 0,05 25 LO O 30 1 35 1 37 0,05

Observou-se a actividade de síntese de E3 nas fracções N°s. 7 a 9. As fracções activas obtidas por várias purificações foram aglomeradas, misturaram-se com glicerina a uma taxa de 8 %, mantiveram-se a -28 °C e dissolveram-se, conforme necessário, para serem utilizados nas experiências.

Exemplo D2: Síntese de tetra-hidrodaidzeína a partir de daidzeína utilizando as enzimas recombinantes EI e E2 marcadas com His

Utilizando as enzimas recombinantes El e E2 marcadas com His, obtidas no processo (2-2-3) do exemplo Dl, como enzima-fonte, preparou-se uma mistura reaccional enzimática da composição indicada a seguir e fez-se reagir, a 37 °C, durante 2 horas, para sintetizar tetra-hidrodaidzeína a partir de daidzeína. Adicionalmente, realizaram-se reacções, ao mesmo tempo, utilizando separadamente as enzimas recombinantes El ou E2, marcadas com His, como fonte de enzimas.

Composição da mistura reaccional enzimática

Enzima recombinante El marcada com His: 20 pL Enzima recombinante E2 marcada com His: 20 pL NADH (100 mM): 20 pL NADPH (100 mM): 20 pL Daidzeína (2 mg/mL): 5 pL 203

915 pL

Tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7)/PMSF 1 mM/DTT 2 mM/hidrossulfito de sódio 5 mM:

Total: 1000 pL

Após a incubação, adicionou-se, à mistura reaccional obtida, 3 mL de acetato de etilo (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para extracção. Após a secagem, dissolveu-se o extracto por meio da fase móvel (eluente). Analisou-se o produto dissolvido por CLAR para medir os teores de cis- e trans-tetra-hidrodaidzeínas na mistura reaccional. Como solução-padrão para análise por CLAR, utilizou-se uma solução mista de daidzeina (2 pg/mL; Funakoshi Corporation), equol (2 pg/mL; Funakoshi Corporation), di-hidrodaidzeina (2 pg/mL; Trend Research Chemicals Inc.), cis-tetra-hidrodaidzeína (2 pg/mL; exemplo de referência Bl) e trans-tetra-hidrodaidzeina (2 pg/mL; exemplo de referência Bl). A figura 23 mostra o resultado da análise por CLAR. Quando se utiliza, como fonte de enzimas, a mistura das enzimas recombinantes El e E2 marcadas com His, confirma-se a presença de cis- e trans-tetra-hidrodaidzeínas no produto. Quando se utiliza, isoladamente, como fonte de enzimas, as enzimas recombinantes El ou E2 marcadas com His, contudo, não se confirma no produto a presença de cis- ou trans-tetra-hidrodaidzeínas .

Exemplo D3: Sintese de equol a partir de di-hidrodaidzeina utilizando as enzimas recombinantes E2 e E3 marcadas com His

Utilizando as enzimas recombinantes E2 e E3 marcadas com His obtidas nos processos (2-2-3) e (2-3-3) do exemplo Dl, como fonte de enzimas, preparou-se uma mistura reaccional enzimática da composição que se indica a seguir e fez-se reagir, a 37 °C, durante 2 horas, para sintetizar equol a 204 partir de di-hidrodaidzeína. Adicionalmente, realizaram-se, ao mesmo tempo, as reacções utilizando isoladamente as enzimas recombinantes EI ou E2 marcadas com His, como fonte de enzimas.

Composição da mistura reaccional enzimática

Enzima recombinante E2 marcada com His: 20 pL

Enzima recombinante E3 marcada com His: 20 pL

NADH (100 mM): 20 pL

NADPH (100 mM): 20 pL

Di-hidrodaidzeína (2 mg/mL): 5 pL

Tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7)/PMSF 1

915 pL mM/DTT 2 mM/hidrossulfito de sódio 5 mM:

Total: 1000 pL

Após a incubação, adicionou-se à mistura reaccional enzimática obtida 3 mL de acetato de etilo (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para extracção. Após a secagem, dissolveu-se o extracto por meio da fase móvel (eluente) . Analisou-se o produto dissolvido por CLAR para medir os teores de equol na mistura reaccional enzimática. A figura 24 mostra o resultado da análise por CLAR. Quando se utiliza, como fonte de enzimas, a mistura das enzimas recombinantes E2 e E3 marcadas com His, confirma-se a presença de equol no produto. Quando se utiliza como fonte de enzimas as enzimas recombinantes E2 ou E3 marcadas com His isoladamente, contudo, não se confirma no produto a presença de equol.

Exemplo D4: Sintese de equol a partir de daidzeina utilizando as enzimas recombinantes El, E2 e E3 marcadas com His 205

Utilizando as enzimas recombinantes El, E2 e E3 marcadas com His obtidas nos processos (2-2-3) e (2-3-3) do exemplo Dl, como fonte de enzimas, preparou-se uma mistura reaccional de enzimas com a composição que se indica a seguir e fez-se reagir, a 37 °C, durante 2 horas, para sintetizar equol a partir de daidzeina. Adicionalmente, realizaram-se, ao mesmo tempo, as reacções utilizando isoladamente as enzimas recombinantes El, E2 ou E2 marcadas com His, como fonte de enzimas.

Composição da mistura reaccional enzimática

2 0 pL 20 pL 2 0 pL 2 0 pL 2 0 pL 5 pL 895 pL 1000 pL

Enzima recombinante El marcada com His:

Enzima recombinante E2 marcada com His:

Enzima recombinante E3 marcada com His: NADH (100 mM): NADPH (100 mM):

Di-hidrodaidzeina (2 mg/mL):

Tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7)/PMSF 1 mM/DTT 2 mM/hidrossulfito de sódio 5 mM:

Total:

Após a incubação, adicionou-se, à mistura reaccional obtida, 3 mL de acetato de etilo (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para extracção. Após a secagem, dissolveu-se o extracto por meio da fase móvel (eluente). Analisou-se o produto dissolvido por CLAR para medir os teores de equol na mistura reaccional enzimática. A figura 25 mostra os resultados da análise por CLAR. Quando se utilizou, como fonte de enzimas, de uma forma isolada, as enzimas recombinantes El, E2 ou E3 marcadas com His, não se confirmou a presença de equol no produto. Quando se utilizou como fonte de enzimas a mistura das enzimas 206 recombinantes El, E2 e E3 marcadas com His, contudo, já se confirmou no produto a presença de equol.

Exemplo E: Influência de iões metálicos na actividade de síntese da di-hidrodaidzeina da enzima recombinante El marcada com His

Utilizando como fonte de enzimas a enzima recombinante El marcada com His (El-His), expressa em Escherichia coli, purificada por Ni-sefarose, examinou-se a influência de iões metálicos na actividade de conversão da daidzeína em di-hidrodaidzeina. Dissolveram-se vários metais (MnCl2*2H20, F2S04 · 7H20, CaCl2 * 2H20, Zn (CH3COO) 2 * 2H20, CoS04-7H20,

MgS04-7H20, NiS04-6H20) em água destilada, para se obter uma concentração de 100 mM. Utilizando a solução de iões metálicos, preparou-se uma mistura reaccional enzimática com a composição que se segue e fez-se reagir, a 37 °C, durante 2 horas, para medir a actividade.

Composição da mistura reaccional enzimática

Enzima recombinante El marcada com His: 20 pL NADH (100 mM): 10 pL NADPH (100 mM): 10 pL Daidzeína (1 mg/mL): 10 pL Solução de iões metálicos: 100 pL KPB-DH 0,2 M: 850 pL Total: 1.000 pL

Após a incubação, adicionou-se, à mistura reaccional enzimática obtida, 3 mL de acetato de etilo para extracção. Após a secagem, dissolveu-se o extracto por meio da fase móvel (eluente). Analisou-se o produto dissolvido por CLAR para medir os teores de daidzeína e de di-hidrodaidzeina na 207 mistura reaccional enzimática. Como resultado, confirmou-se que Mn2+ e Fe2+ estimularam a actividade (figura 26) .

Breve descrição dos desenhos A figura 1 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo AI. Três cromatógrafos na parte superior: produtos da reacção enzimática não utilizando co-enzima (controlo) e utilizando NADH e NADPH como co-enzimas. Gráfico de barras: as áreas dos picos correspondem à di-hidrodaidzeína no controlo (sem co-enzima) e nas amostras e utilizando NADH e NADPH como co-enzimas. A figura 2 mostra os resultados da CLAR em Mono Q no exemplo A2 (parte superior) e a actividade da enzima de sintese de di-hidrodaidzeína de cada fracção (parte inferior). A actividade enzimática é ilustrada como uma área de pico correspondente à di-hidrodaidzeina utilizando como substrato a daidzeina. A figura 3 mostra os resultados da EGPA-SDS no exemplo A2 (parte da esquerda) e a actividade da enzima de sintese de di-hidrodaidzeina de cada fracção (parte da direita). A actividade enzimática é ilustrada como uma área de pico correspondente à di-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a daidzeina. Utilizou-se, como placa de electroforese em gel, a SuperSep HG 10-20 % (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) . A figura 4 mostra os resultados do mapeamento do péptido no exemplo A4 e as sequências de aminoácidos dos péptidos que correspondem aos picos. Os números que se seguem às setas T no gráfico superior da análise por CLAR correspondem a 1: FDEPVYPQAE, 2: ASRMVMDAVHEGYIAG e 3: GYIGNLEVENRAIRMPM, respectivamente. A figura 5 mostra os resultados da electroforese em agarose do produto de RCP degenerativa do exemplo A5. 208 (1) El-terminal N-31 e El-interno-RPl, (2) El-terminal N-37 e El-interno-RPl, (3) El-terminal N-F32 e El-interno-RPl; marcador Ml: λ/Stil, M2: rede de 100 pb. A figura β mostra os resultados da electroforese em agarose do produto de RCP-TI do exemplo A7. Parte superior: di-hidrodaidzeina-sintase; parte inferior: ARN ribossómico. A figura 7 mostra os resultados da EGPA-SDS no exemplo A8 . A figura 8 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo A8. Parte superior: controlo; parte do meio: pET-El-His; parte inferior: pET21a. A figura 9 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo BI. Gráfico superior: cis-tetra-hidrodaidzeína (REF-000312); gráfico do meio: produto da reacção da enzima utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína e material celular desagregado como fonte de enzimas; gráfico inferior: trans-tetra-hidrodaidzeina (REF-000313). A figura 10 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo Bl. Dois gráficos superiores: produtos da reacção enzimática utilizando, como substrato, cis-tetra-hidrodaidzeína (REF-000312) e material de células desagregadas como fonte de enzimas; dois gráficos inferiores: produto da reacção enzimática utilizando trans-tetra-hidrodaidzeina (REF-000313) como substrato e material de células desagregadas como fonte de enzimas. A figura 11 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo B2. Três gráficos superiores: produtos da reacção enzimática não utilizando co-enzima (controlo) e utilizando NADH e NADPH como co-enzimas. Gráfico de barras: áreas de pico correspondendo à tetra-hidrodaidzeina no controlo (sem co-enzima) e nas amostras utilizando NADH e NADPH como co-enzimas. 209 A figura 12 mostra os resultados da análise por CLAR por filtração em gel no exemplo B3. Gráfico superior: resultados para a proteina-padrão; gráfico médio: actividade enzimática de cada fracção ilustrada como uma área de pico correspondente ao produto de tetra-hidrodaidzeina; gráfico inferior: intensidade de absorção (280 nm) correspondendo à proteína de cada fracção. A figura 13 mostra os resultados da EGPA-SDS no exemplo B3. A figura 14 mostra os resultados da EGPA-SDS no exemplo B4. A figura 15 mostra uma ilustração esquemática de uma estrutura de genoma periférico do gene da enzima (El) que sintetiza di-hidrodaidzeína determinado no exemplo B5. A figura 16-1 mostra os dados da análise por CL-EM e um exemplo de uma sequência de aminoácidos de péptidos digeridos, inferida dos dados CL-EM no exemplo B6; L, representa um resíduo de aminoácido indicado por X na descrição. A figura superior representa o péptido TPGVAASVADEXK e a figura inferior representa o péptido MPGAPVFGK. A figura 16-2 mostra os dados da análise por CL-EM e um exemplo de uma sequência de aminoácidos de péptidos digeridos, inferida dos dados CL-EM no exemplo B6; L, representa um resíduo de aminoácido indicado por X na descrição. A figura superior representa o péptido KXXXTGTTK e a figura inferior representa o péptido VTQEXXCAHGAFVCGSGR. A figura 16-3 mostra os dados da análise por CL-EM e um exemplo de uma sequência de aminoácidos de péptidos digeridos (WXSPEESVGQR), inferida dos dados CL-EM no 210 exemplo B6; L, representa um resíduo de aminoácido indicado por X na descrição. A figura 17 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo B7. Gráficos da parte superior esquerda: produto da reacção enzimática utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína e uma mistura reaccional que expressa o polipéptido de QLA-AM2 como fonte enzimática (QLA-AM2); gráficos da parte superior direita: produto da reacção enzimática utilizando uma mistura reaccional isenta de proteínas como fonte de proteína (NC). Gráfico de barras: áreas dos picos correspondendo à di-hidro- daidzeína (DD) e à tetra-hidrodaidzeína (THD) produzidas em reacções enzimáticas em NC (sem síntese de proteína) e em amostras utilizando DHFR (mistura reaccional que expressa di-hidrofolato-redutase) e QLA-AM2 (mistura reaccional que expressa o polipéptido de QLA-AM2) como fonte de enzimas. A figura 18 mostra os resultados da EGPA-SDS no exemplo B8. A figura 19 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo B8. Gráfico superior: produto da reacção enzimática, utilizando como substrato a di-hidro-daidzeína e uma suspensão de células desagregadas derivada do transformante do plasmido pET21-AM2 que expressa o polipéptido recombinante de QLA-AM2, como fonte de enzimas (pET21-AM2) ; gráfico inferior: produto da reacção enzimática, utilizando como substrato a di-hidrodaidzeína e uma suspensão de células desagregadas derivada do transformante (controlo negativo) como fonte de enzimas (pET21a). Gráfico de barras: áreas dos picos correspondendo a di-hidrodaidzeína (DD) e cis- (c-THD) e trans-tetra-hidrodaidzeinas (t-THD) produzidas por reacções enzimáticas em amostras utilizando suspensões de células desagregadas derivadas da mistura reaccional 211 que expressa o polipéptido de QLA-AM2 e o transformante pET21a como fonte de enzimas. A figura 20 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo Cl. A figura 21 mostra os resultados da EGPA-SDS no exemplo C2. A figura 22 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo C3. Parte superior: padrão; parte do meio: pET-AM3; parte inferior: pET21a. A figura 23 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo D2. Primeiro a partir do topo: padrão; segundo: EI e E2; terceiro: El; quarta parte: E2. A figura 24 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo D3. Primeiro a partir do topo: padrão; segundo: E2 e E3; terceiro: E2; quarto: E3. A figura 25 mostra os resultados da análise por CLAR no exemplo D4. Primeiro a partir do topo: padrão; segundo: El, E2 e E3; terceiro: El; quarto: E2; quinta parte: E3. A figura 26 mostra os efeitos dos iões metálicos na actividade enzimática de El. A figura 27 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°s. 1, 2 e 3. A figura 28 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°s. 7, 8 e 9. A figura 29 mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos das SEQ ID N°s. 13, 14 e 15.

Texto livre da lista de sequências SEQ ID N°. 23 é a sequência de base do iniciador El- terminal N-31. SEQ ID N°. 24 é a sequência de base do iniciador El- terminal N-37. 212 SEQ ID N° . 25 terminal N- F32 • SEQ ID N° . 26 interno -RP1 • SEQ ID N° . 27 é 1. SEQ ID N° . 28 é 1 . SEQ ID N° . 29 é 2 . SEQ ID N° . 30 é 2 . SEQ ID N° . 31 é N-Pl • SEQ ID N° . 32 é RP2- 1 . SEQ ID N° . 33 é N-P2 • SEQ ID N° . 34 é RP2- 2 . SEQ ID N° . 35 é NP. SEQ ID N° . 36 é CP. SEQ ID N° . 37 é SEQ ID N° . 38 é SEQ ID N° . 39 é Ribo -FP • SEQ ID N° . 40 é Ribo -RP • SEQ ID N° . 41 é pet F Nde . SEQ ID N° . 42 é pet His φ é a sequência de base do iniciador El-

do iniciador El- iniciador pUC19-FP- iniciador pUC19-RP- iniciador pUC19-FP- iniciador pUC19-RP- iniciador El-RACE- iniciador El-RACE- iniciador El-RACE- iniciador El-RACE- iniciador El-conf- iniciador El-conf- iniciador El-FP. iniciador El-RP. iniciador Gar-16S- iniciador Gar-16S- iniciador exp. EI iniciador exp. EI é a sequência de base a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do a sequência de base do 213 SEQ ID N°. P3-1 . 43 é a sequência de base do iniciador RACE-N- SEQ ID N°. P3-2 . 44 é a sequência de base do iniciador RACE-N- SEQ ID N°. PI . 45 é a sequência de base do iniciador El-Bub-N- SEQ ID N°. P2 . 46 é a sequência de base do iniciador El-Bub-N- SEQ ID N°. P3-1. 47 é a sequência de base do iniciador RACE-C- SEQ ID N°. P3-2 . 48 é a sequência de base do iniciador RACE-C- SEQ ID N°. PI . 49 é a sequência de base do iniciador El-Bub-C- SEQ ID N°. P2 . 50 é a sequência de base do iniciador El-Bub-C- SEQ ID N° . 57 é a sequência de base do iniciador E2- invitroTS-FP. SEQ ID N° . 58 é a sequência de base do iniciador E2- invitroTS-RP. SEQ ID N°. 59 é a sequência de base do iniciador universal. SEQ ID N°. pet F Nde. 60 é a sequência de base do iniciador exp.AM2 SEQ ID N°. pet. 61 é a sequência de base do iniciador exp. AM2 SEQ ID N°. F. 62 é a sequência de base do iniciador exp.AM3 SEQ ID N°. R. 63 é a sequência de base do iniciador exp.AM3 SEQ ID N°. F. 64 é a sequência de base do iniciador exp.AMl SEQ ID N°. 65 é a sequência de base do iniciador exp.AMl R. 214 SEQ ID N°. 66 é a sequência de base do iniciador exp.DSl F. SEQ ID N°. 67 é a sequência de base do iniciador exp.DSl R.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO. , LTD. <120> Enzimas relacionadas com a produção de equol <130> P08-130 <150> JP2007-336227 <151> 2007-12-27 <150> JP2008-054874 <151> 2008-3-5 <150> JP2008-080570 <151> 2008-3-26 <160> 69 <17 0> Patentln versão 3.4 <210> 1 <211> 644 <212> PRT <213> Lactococcus garvieae <4 0 0> 1 215

Ket Lys Asn Lys Phe Tyr Pro Lys Thr Phe Giu Art? Gly Tyr lie Gly I 5 10 * 15

Asn Leu Giu Vai Giu Asn Arg Ala lie Arg Met Pro Met Gly Thr Glu 25 30 Pro Ser Trp Ale Ser Leu Lys Ais Tyr 40 45 20 Leu Gly Asn Pro Asp Gly 35

Ser

Ala Giu Ala Ala Asp Gly Gly Thr Gly Ile Vai Phe Met Asp Asn Ala 50 55 60

Gly Vai Thr Gin Phe His sis Vai Gly Leu Ser Leu Ala Ser Asp Asn 65 70 75 80

Tyr Ile Gly Pro Met Ser Vai Leu Ala Lys Thr Ile Lys Gin His Gly 85 90 95

Ala lie Pro Gly Leu Gin lie Vai His Pro Gly Arg Asp Ala Ala Phe 100 105 * 110

Vai Arg Gly Asp Asp Leu lie Ser Ser Ser Arg Ile Gin Trp Giu Pro 115 120 125

Trp Tyr Glu Asn Gly Gly Ma Vai Pro Arg Glu Leu Thr Ile Giu Giu 130 135 140 216

He His Asp Phe vai Gly Tyr Phe 145 ISO Thr Ala siy Phe Glu 165 X1« Vai Asp Leu Ser Asa Phe Leu Ser Pro Arg ISO Gly Gly Ser Leu His Asn Arg Ala 195 200 A$p lie Lys Lys Lys Cys Pro Asn 210 215 Gly Ue Aí5p Ph>2 Glu Pro Asp Gly 225 230 Vai Ala Lys Met cys Glu Ala Ala 245 Trp Gly Ser His 260 Ala Glu Vai lie His Gly Ala Asn His Vai Glu Ala 275 280 Ser Ile Pro Thr Met Leu cys Gly 200 295 Glu Lys Leu Leu Glu Asp Gly vai 305 310 Prc Ala Leu Ala Asp Pro Het Trp 325 Pro Glu Asp ile Arg Pro Cys lie 340 Arg Gly Met Leu Ser Gly Gly vai 355 360 Leu Tyr Lys Phe Asp Glu Pro Vai 370 375

Gly Asp Cys Ala Leu Arg Ala Gin 155 160 Vai HiS Ala Ai a Cys Gly vai Leu 170 175 Asn Asn Thr Arg Asn Asp Met Tyr 185 190 Arg Phe Leu Leu Glu Vai Ile Arg 205 Leu Pro Leu Ala lie Arg Leu Ser 220 lie Thr ile Gltt Glu Thr Cys Glu 235 240 Gly Ala Asp Ala Ile Asn Ile Thr 250 255 Aso Ala Ala Gly Leu Leu Ser Lys 265 270 Ala Lys Met Ile Lys Asp Ala Vai 28 S Gly Ile Tyr Ser Pro Glu lie Gly 300 Cys ASp Phe lie Gly ile Gly Lys 315 320 Ala Lys Lys Ala Ala Glu Gly Arg 330 335 Gly Cys Gly vai Gly Cys His h&p 345 350 Vai Gin Cys AI a Val 365 Asn Ala Al <i Tyr Pro Gin Ala Glu Vai Pro Lys 380 217 hys Vai lis tle Ile Giy Ala Giy Pro Ala Gly Cys Glu Ala Alâ Ile 385 390 395 400 Thr Ala Lys Lys Cys Gly HÍS Asp Vai Thr Ile Tyr Glu Lys Arg Lys 405 410 415 1 le Gly Giy Vai Leu Lys Glu Ala Thr Vai Ser Asp Ser Lys Glu Asp 42Ô 425 430 Leu Gly Arg Leu Ile Thr n* Tyr Glu Thr Gin Leu Lys Lys Glu Giy 435 440 445 I.le Glu Vai Ile Tyr GÍU Glu Ala Thr Ala Asp Thr Val Val Ala Gly 450 45S 460 Gly Phe Asp Vai Ala Ile Vai Ala Cys Gly Ala Thr Vai Arg Asn Leu 465 470 475 480 Asn Ile As» Gly Gin ASp Asp Pr» Ser Vai val Tyr Ala Met Asp Phe 48$ 490 49$ Leu Asp Asn Asp Cys Lys Ser Asp Ara Asp Arg val val val val Gly 500 505 510 Giy Gly Ile Vai Giy Ala Glu Thr Ala Leu Ile Leu Ala Glu Glu Arg 515 520 52 S Gly Lys Asp Vai Th í: Ile Thr Thr Arg Ser Pro Glu Phe Phe Val Ser 530 535 540 218

Gly Vai Met Gly Ile Ala Tyr Met Vai Arg Leu Gly Met Ala Gly Vai 545 55 Õ 555 560

Thr Ile Lys P to Ser Thr 565

Gin Leu Vai Ala Vai 570

Lys Asp Gly Lys Ff o 575

Hat Phe Ala Gly Pro Arg Gly Leu Glu Thr Leu Asp vai Asp Gin Thr 580 585 590 lie Xle Ser ser Gly Phe Vai Pro Thr Phe Aea Gin Ph« Arg Ala Gin 505 600 605

Jle Glu Glu Lys Cys Glu Asp Vai Arg Vai Xle Gly Ile Gly Asp Cys 610 515 620

Lys Ala Ser Ara Met Vai Met Asp Ala Vai His Glu Gly Tyr íle Ala 625 630 635 640

Gly Cys Asa Leu

<210> 2 <211> 644 <212> PRT <213> Bacteroides ovatus <400> 2

Met Lys Asn Lys Phe Tyr Pro Lys Thr Phe Glu Arg Gly Tyr Xle Gly 1 5 10 15

Asn Leu Glu Vai Glu Asn 20

Leu Gly Asn Pro Asp Gly 35

Arg Ala Ile Arg Met Pro Met Gly Thr Glu 25 30

Ser Pro Ser Trp Ala Ser Phe Lys Ala Tyr 40 45

Ala Glu Ala Ala Asp Gly Gly Thr Gly lie vai Phe Het Asp Asn Ala 50 55 60

Gly Vai Thr Gin Phe His His Vai Gly Leu Ser Leu Ala Ser Asp Asn 65 70 75 80 219

Tyr Ile Gly Pro Met Ser Vai Leu Ala Lys Thr He Lys Gin His Gly 85 90 95

Ala Ile Pro Gly Leu Gin He Vai His Pro Gly Arg Asp Ala Ala Phe 100 105 Π0

Vai Arg Gly Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Arg Ile Gin Trp Glu Pro 115 120 125 'Trp Tyr Glu Asn Gly Gly Ala Vai Pro Arg Glu Leu Thr Ile Glu Glu 130 115 140

Ile His Asp Phe vai Gly Tyr Phe Gly Asp Cys Ala Leu Arg Ala Gin 145 150 155 160

Thr Ala Gly Phe Glu ile Vai Asp vai His Ala Ala Cys Gly vai Leu 165 170 175

Leu Ser Asn Phe Leu Ser Pro Arg Asn Asn Thr Arg Asn Asp Met Tyr 180 185 190

Gly Gly Set Leu His Asn Arg Ala Arg Phe Leu Leu Glu Vai He Arg 195 200 205

Asp Ile Lys Lys Lys 210

Pro Asn Leu Pro Leu Ala lie Arg Leu Ser 215 220

Gly Ilô 225

Phe Glu Pro Asp Gly Ile Thr Ile Glu Glu Thr Cys Glu 230 235 240

Vai Ala Lys Met Cys Glu Ala Ala Gly Ala Asp Ala He Asn Ile Thr 245 250 255

Trp Gly Ser His Ala Glu vai Ile Asn 260 265 i Ala Gly Leu Leu Ser Lys 270

His Gly Alá Asn His Vai Glu Alá Ala Lys Met He Lys Asp Ala Vai 275 280 285

Ser Ile Pro Thr Met Leu Cys Gly Gly Ile Tyr Ser Pro Glu He Gly; 290 295 300

Glu Lys Leu Leu Glu Asp í 305 310

Vai Cys Asp Phe Ile Gly Ile Gly Lys 315 320 220

Pro Ala Leu Ala Asa Pro Met ?rp Ala Lys Lys Ala Ala Giu Gly Arg 325 330 333

Pro Glu Asp lie Arg Pr© Cys Xl« Gly Cys Gly Vai Gly Cys His Asj 340 345 350

Arg Gly Met Leu Ser Gly Gly Vai Vai Gin Cys Ala Vai Asn Ala Ala 355 " 360 365

Tyr Lv« Phs Aso Glu Pro Vai Tyr Pro Gin Ala Glu Vai Pro Lvs 3?0 * 373 380

Lys Vai Ile 11« lie Gly Ala Gly Pro Ala Gly Cys Glu Ala Ala lie 305 390 395 400

Thr Ala Lys Lys Cys Gly Sis Asp Vai Thr lie Tyr Glu Cys Arg Lys 405 410 415

Ser Lys Glu Asd 430

Ile Gly Gly Vai Leu Lys Glu Ala Thr Vai Ser 420 * 425

Leu Gly Arg Leu Ile Thr Tyr Tyr Glu Thr Gin Leu Lys Lys Glu Gly 435 440 445

Ile Glu Vai Ile Tyr Glu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Vai Vai Ala Gly 450 455 460

Gly Phe Asp Vai Ala Ile Vai Ala Cys Gly Ala Thr Vai Arg Asn Leu 465 470 475 4S0

Asn lie Asp Gly Gin Asp Asp Pro Ser Vai Vai Tyr Ala Met Asp Phe 485 490 495

Leu Asp Asn Asp Cys Lys Ser Asp Ala Asp Arg Vai Vai Vai Vai Gly 500 505 510

Gly Gly Ile Vai Gly Ala Glu Thr Ala Leu Ile Leu Ala Glu Glu Arg 515 520 525

Gly Lys Asp vai Thr ile Thr Thr Arg Ser Pro Glu Phe Phe Vai Pro 530 535 5^0

Gly Vai Met Gly Ile Ala Tyr Met. Vai Arg Leu Gly Met Ala Gly vai 545 550 555 560 221

Thr Ile Lys Pro Ser Thr Gin Leu 565 Met Phe Ala Gly Pro Arg Gly Leu 580 Ile Ile Ser Ser Gly Phe Vai Pro 595 600 Ile Glu Glu Lys Cys Glu A$p Vai 610 615 Lys Ala Ser Arg Met Vai Met Asp 625 630

Vai Ala Vai lys Asp Gly Lys Pro 570 575

Glu Thr Leu Asp Vai Asp Gin Thr 585 590

Thr Fhe Asn Gin Phe Arg Ala Gin 605

Arg Vai Ile Gly lie Gly Asp Cys 620

Ala Vai His Glu Gly Tyr Leu Ala 635 640

Gly Cys Asn Leu

<210> 3 <211> 644 <212> PRT <213> Streptococcus constellatus <400> 3

Met Lys Asn Lys Phe Tyr Pro Lys Thr Phe Glu Arg Gly Tyr Ile Gly 15 10 15

Asn Leu Glu Vai Glu Asn Arg Ala Ile Arg Met Pro Met Gly Thr Glu 20 25 30

Leu Gly Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ser Trp Ala Ser Leu Lys Ala Tyr 35 40 45

Ala Glu Ala Ala Asp Gly Gly Thr Gly Ile Vai Phe Met Asp Asn Ala 50 55 60

Gly Vai Thr Gin Phe His His Vai Gly Leu Ser Leu Ala Ser Asp Lys 65 70 75 80

Tyr II® Gly Pro Met Ser Vai Leu Ala Lys Thr Ile Lys Gin His Gly 85 90 95 222

Ala lie Pro Gly Leu Glu Ue 100 Vai Arg Gly Asp Asp Leu Ue U5 Trp Tyr Glu Asn Gly Gly Ala 130 135 Ue KIs Asp Phe Vai Gly Tyr 145 150 Thr Ala Gly Phe Glu Ue Ue 165 Leu Ser Asn Phe Leu Ser Pro 180 Gly Gly Ser Leu His Asn Arg 195 Asp Ue Ly$ Lys Lys Cys Pro 210 215 Gly Ué Asp Phe Glu Pro Gly 225 230 Vai Ala Lys Met Cys Glu Ala 245 Trp Gly Ser His Ala Glu Vai 260 His Gly Ala Asn His Vai Glu ?75 A* ϊ V Ser Ue Pro Thr Met Leu Cys 200 255 Glu LyS Leu Leu Glu Asp Gly 305 310 Pro Ala Leu Ala Asp Pro Met

His Pro Gly Arg Asp Ala Ala Phe 105 ’ 110

Ser Ser Arg Ile Gin Trp Gin Pro 125

Pro Arg Glu Leu Thr lie Glu Glu 140

Gly Asp Cys Ala Leu Arg Ala Gin 155 160

Vai ais Ala Ala Cys Gly Vai leu Π0 175

Asa Asn Thr Arg Asa Asp Met Tyr 185 ISO

Arg Phe leu Leu Glu Vai Ue Arg 205

Leu pro Leu .Ala ile Arg Leu Ser 220

Ile Thr Vai Glu Glu Thr Cys Glu 235 240

Gly Ala Asp Ala Ile Asn Ue Thr 250 255

Asn Ala Aia Gly Leu Leu Ser Lys 265 270

Ala Lys Met Ue Lys Asp Ala Vai 285

Gly Ile Tyr Ser Pro Glu Ile Gly 300

Cys Asp Phe lie Gly Ue Gly Lys 315 320

Ala Lys Lys Ma Ala Glu Gly Arg 330 335 223 325

Fro Glu Asp Ile Arg Pro Cys n« Gly Cys Gly Vai Gly Cys His Asp 3 40 345 350 Arg Gly Met Leu Ser Gly Gly Vai Vai Gin Cys Ala Vai Asn Ala Ala 355 360 365 Leu Tyr Lys Phe Asp Glu Fro Vai Tyr Pro Glr» Ala Glu Vai Pro Lys 370 375 380 Lys Vai Ile Ile ile Gly Ala GXy Pro Ala Gly Cys Glu Ala Ala Ile 385 350 395 400 Thr Ala Lys Lys Cys Gly Hís Asp Vai Thr lie Tyr Glu hys Arg Lys 405 410 413 I le Gly Gly Vai Leu Lys Glu Ala Thr Vai Ser Asp Ser Lys Glu Asp 420 425 430 Leu Gly Tyr Leu li® Thr Tyr Tyr Glu Thr Gin Leu Lys Lys Glu Gly 435 4 40 445 Πβ Glu Val Ile Tyr Glu Glu Ala Thr Ara Ser Thr Vál Ala Ala Gly 450 455 460 61 y Phe A sp Vai Ala Ile Vai Ala Cys Gly Ala Thr vai Arg As π Leu 465 470 475 430 Asn Ile Asp Gly Gin Asp Asp Pro Ser Vai Vai Tyr Ala Met Asp Phe 485 490 495 Leu Asp Asn Asp Cys Lys Ser Asp Ala Asp Arg vai Vai Vai Vai Gly 500 505 510 Gly Gly Ile Vai Gly Ala Glu Thr Ala Leu Ile Leu Ala Glu Glu 61« 515 520 525 Gly Lys Asp Vai Thr ile Thr Thr Arg Ser Pro Glu Phe Phe Vai Pro 530 535 540 Gly Vai mt Gly I le Ala Tyr Met Vai Arg Leu Gly ?4et Ala Gly Vai 545 550 555 560 Th r m Lys Pro Ser Thr Gm Leu Vai Ala vai Lys ASp Gly Lys Pro 565 570 575 224

Mefc Phe Ala Gly Pro Arg G 5Ô0

Lau Glu 'Th r Leu Asp vai Asp Gin fhr 585

Xle Ile Ser Ser Gly Phe Vai Pro Yhr Phe Asn Gin Phe Atg Ala Gin 595 600 605 XXe Glu Glu Lys Cys Glu Asp Vai Arg Vai Ile Gly Ile Gly Asp Cys 610 615 620

Lys Ala Ser Arg Met Vai Met Asp Ala Vai His Glu Gly Tyr lie Ala 625 630 635 6^0

Gly Cys Asn Leu

<210> 4 <211> 1935 <212> ADN <213> Lactococcus garvieae <400> 4 aegaags&ca S9rfctct.âxcc gaaçacctfcc gagegcggct acatcggtaa cctagaggtc 60 gsgaaccgag cgatccgcat gccgsfcgggc accgagcsgg gcaacecgga cggcCetccc 120 sgetgçgcct ccctcaaggc gtacgctgag gctgccgaeg gt.ggaaccgg catcgtgtto 160 atggaeaacg ccggcgtgac ccagctccac cacgtcggae tgtccctqqc cagcgacaac 240 tac&tcggcc ccatgtccgt ectcgeaaag accatcaagc agcscgggge catccccggc 300 ctgcagatcg tccacecggg ccgcgaegtg gcgttcgtge gcggtgacga cctgatctcc 360 tcttcccgca tccagtggga gcccfcggtac gagsacggcg gcgctgttcc cçgcgagctc 420 accatcgsgg agatecacga cttcgccggt taetccggcg actgcgcacr ccgegcgcag 460 accgcgggct tegaaatcgt cgacgtccac geggcatgeg gcgtcctget gageaactte 540 ctctcgccgc gcaacaacac ccgcaatgac atgfcacggcg gaageetgca e&aecgcgcc 600 cgcfctcctgc tcgaggteat ccgcgacatc aagaagaagt gccccaacct cccgcfcggct 660 atecgactet; cççgeatega cttcgaaccg gacggcatca ccategagga gacctgcgag 720 225 gteefcc&sga tgtgegaggc agecggtgcg gacgccatca a ·::.ο tcacctg gggfcfccccafc 780 gçagaggtcs taaacgcggc cggcctgctc tccaagcaog gegcc&acea cgccgaggca 840 gegaagafcga tcaaggacgc tgttagcatc cccaccatgc tgcqcggcgg catctactec 900 ccegag&teg gegagasgcfc gctcgaggae qgc.gtctqc.g actfccatcgg eatc.ggcaag 980 cccgcgctcq ccgaccceafc gtgggecaag aaçgcagctg aggggcgtcc: tgaçgaçatc 1020 aggccefegca tcggttqcgg egtcggctgc catgaecgcg gcatgctctc cggcggegtc ioao gtccsgr.gcç ccgtcaacgc ggccctgtac aagttcgacg aacccgfccta cccgcaggct 1140 gaggttccca aga&çgtcat: eatcatcggc gc&ggccccg ctggctgcga ggctgccatc 1200 acegcgaaga agtgcggcca tgacgtcacc atctacgaga agcgcaagat: cggtggcgfc t 1260 etgaaggagg ctaccgtcfcc cgacagcaag gaggacctcg gcegcctcat cacetactac 1320 gagaçceagc tcaagaagça gggcatcgag gfccaCctacg açgaggccac tçcagac&cc 1330 gttqtagccç gcggcttcga cgtcgccatc gtcgcctgcg gcgecaccgt gcgcaaecte 1440 aacaccgacg gccaggacga cccctccgtc gtgfcacgcga fcggac6t:c~t gg&eaacgac 1500 tgcaagagcg afcgcegacag ggfccgtegfcfc gtcggcggtg gcatcgtggç tgçcgagaec 1560 gcgctqatcc ccgcggagga gcgçggeaag gãtgtcacca tcaccacccg cfcccccggag 1620 ttcttcgtct ccggcgtcat gggcatcgcc tacâtggttc gcctgggfcafc ggcggg&gfcc 1630 acgatcaagc cctccaccca gctcgtcgcc gtcaaggatg çcaagcccafc gttcgccggc 1740 ccccgcggcc tggagaccct ggacgfccgac cagacaatca tctcctctgg cttcgtcccg 1800 acc&tcaacc agt&ccgcge ccagatcgag gagaagtgcg aggacgfceag ggtcatcggc 1860 ateggegacfc gc&aggcctc eegeatggtc afcggacgetg tccaegaggg cfcacatcgct 1920 ggetgcaacc tgtag 1335

<210> 5 <211> 1935 <212> ADN <213> Bacteroides ovatus <400> 5 226 atgaagaaca agttctatcc gaagaccttc gagcgcggct acatcggeaa cctagaggtc 60 gagaaecgag cgatccgcat gecgatgggc accgagctgg geaacccgga cggctctccc 120 agctgggcct ccttcaaggc gtaegetgag gctgccgacg gtggaaccgg catcgtgttc 180 atggacaacg ccggcgtgac ccagttccac catgtcggac tgtccctggc cagegacaac 240 tacatcggec ccatgtccgt cctcgcaaag accatcaagc agcacggggc catceccggc 300 ctgcagatcg tccacccggg ccgcgacgcg gcgttcgtgc gcggtgacga cctgatctcc 360 tetlcecgca tccagtggga gccctggtac gagaacggcg gcgctgttcc ccgcgagctc 420 accatcgagg agatccacga cttcgtcggt tacttcggcg actgcgcact ccgcgcgcag 480 acegcgggct tcgaaatcgt cgacgtccac gcggcatgcg gcgtcctgct gagcaacttc 540 ctetcgccgc gcaacaacac ccgtaacgac atgtacggcg gaagcctgca caaccgcgcc 600 cgcttcctgc tcgaggtcat ccgcgacate aagaagaagt gccccaacct cccgctqgct 660 atccgactct ccggcatcga cttcgaaccg gacggcatca ceatcgagga gacetgcgag 720 gtcgccaaga tgtgcgaggc agccggtgcg gacgccatca aeatcacctg gggttcccat 780 gcagaggtca taaacgcggc eggcctgctc tecaagcacg gcgccaacca cgtcgaggca 840 gcgaagatgs tcaaçgacgc tgttagcatc cccaccatgc tgtgcggcgg catctactcc 900 cccgagatcg gcgaçaagct gctcgaggac ggcgtctgcg acttcatcgg catcggcaag 960 cccgcgctcg ccgaccccat gtgçgccaag aaggcagctg aggggcgtcc tgaggacatc 1020 aggccctgca tcggttgcgg cgtcggctgc catgaccgcg gcatgctctc cggeggcgtc 1080 gtccagtgcg ccgtcaacgc ggccctgtac aagttcgacg aacccgtcta cccgcaggct 1140 gaggttccca agaaggtcat catcatcggc gcaggcceeg ctggctgcga ggctgccatc 1200 accgcgaaga agtgcggcca tgacgtcacc atctaegaga agcgcaagat eggtggcgtt 1260 ctgaaggagg ctaccgtctc cgacagcaag gaggacctcg gccgcctcat eacctactac 1320 gagacceagc tcaagaagga gggcatcgag gtcatctacg aggaggccac tgcagacacc 1380 gttgtagccg gcggcttcga cgtcgccatc gtcgcctgcg gcgccaccgt gcgcaacctc 1440 aacatcgacg gccaggacga cccctccgtc gtgcacgcga tggacttcct ggaeaacgae 1500 tgcaagagcg atgccgacag ggtcgtcgtt gtcggcggtg gcatcgtggg cgccgagacc 1560 gcgctgatcc tcgcggagga gcggggcaag gatgtcacea tcaccacccg ctccccggag 1620 ttettcgtcc ccggcgtcat gggcatcgcc tacatggttc gcctgggtat ggçgggagtc 1680 acgatcaagc cctccaccca gctcgtcgcc gtcaaggacg geaagcccat gttcgccggc 1740 ccccgcggcc tggagaccct ggacgtcgac cagaeaatca tctcctctgg ettcgtcccg 1800 accttcaacc agttecgcgc ccagatcgag gagaagtgcg aggacgtcag ggtcatcggc 1860 atcggcgact ggctgcaacc gcaaggcctc tgtag ccgcatggtc atggacgctg tccacgaggg ctacctcget 1920 1935 227 <210> 6

<211> 1935 <212> ADN <213> Streptococcus constellatus <400> 6 atgaaaaata agttctafcec gaagaccttc gagcgcggct acatcggt«a cctagaggtc 60 gagaaccgag cgatccgca;: gccgatgggc aecgagctgg gcaacccgga cggcfcctccc 120 agctgggoct cccteaaggc gtãcgçcgag getgccgacg gcggfcaccgg catcgtgttc 180 âfcggacaacg ccggcgtgac ecagttccac catgtcggac fctfcccceggc cagcgacaag 240 tacsfccggce ccafcçtccgt ectcgctaag aecatcaage ageacggggç ca tceccggc 300 ctgcagatcg tceatccggg ccgcgaegeg gcgttcgfcgc gcggtgacga cctgatct.cc 360 teefccccgea tccagtggga gccctggtac gagaacggcg gcgctgttcc ccgcgagctc 420 accafccgagg ag&tccacga cttcgtcggt tacttcggcg actgcgeact ccgcgcgcag 400 accgcgggct tcgaaatcat cgaeçtecac gcggcatgcg gcg;;çctgçt gagcaaette 54 0 ctctcgccgc gc&aoà&eac eegcaaegac atgtacggcg gaagcctgca caaccgcget 600 cgcttcetgc tagaggtcat ccgcgacatc aagaagaagt gccccâàcct cccgc.tggct 660 atccgactet ccgggatcga tttcgagccg ggçggcafcca ccgtcgagga gacctgcgag 720 gtcgccaaga tgtgcgaggc agccggtgcg gacgccacca acatcacctg cçgttcccat 700 gcâçaggtca Kc&acgcggc cggcctgctc tccãâge&cg gcgccaacca cgtcgsggcã 840 gcgaagatga tcaaggaegc fcgtt&gcatc cccãccatgc tgtgcggcgg cater.actee 000 cccgaçatcg gcgagaagct gctcgaggac qgcgtctgcg actteategg catcggcaaç 860 ccagcgctcg et.gaccoc.at gfcgggccaag aaggcggctg aggggcgtcc tgaggacatc 1020 aggceetgca Ecggttgcgg cgtcggctgc eatgaecgcg gcatgctctc cggcggcgtc 1080 gtccagrgcg ccgtcaacgc ggccctgtac aagttcgacg agcccgxcta cccgcaggct 1140 gsggttccca agaaggttat catcafccggc gcaggí.cccg etggctgcga çgczgccãtc 1200 accgcgaaga agtgcggcea tg&eçtcace ataéacgaga agcgcaagat çggcggçgtt 1260 ctgaaggagg etacc.gtctc cg&càqcããg gaggacctcg gctacctcat c&ecbãctãc 1320 gagacccagc tcaagaagga gggcatcgag gtcatctacg aggaggccac tgcaagcacc 1380 gtfcgcagceg gcggcttcga cgtcgccatc gtcgcctgcg gcgccaccgt gecca&eetc 1440 228 aaeatcgacç gccaggacga cccctcogtc gtgtacgcga tggacttcct ggacaacgtac 1500 tgtaaçageg «cgecgacag ggtcgtcgtt gtcggcggcg gcatcgfcggg tgccgagacc 1560 gcgctgatcc fccgcggsgga gc&gggcaag gaegtcacc& tcactacccg ctccceggag 1620 ttcttcgtec ccggcgtcat gggtatcgcc taeafcggttc gccttggeat ggcgggcgtç 1680 acgatcaage cctccaccca gctcgtcgcc gtcaaggacg çcaagcceat gttcgccggt 1140 cçccgcggcc tggaçaecct ggacgfccgac cagaccatca tctcctctgg ctfccgtcccg 1800 accttcaacc agttccgcgc ccagafccgag gagaagfcgçg aggacgtcag çgtcatcggc 1860 atcggcgact gcaaggcctc ccgtatggtc atggscgctg tccaogagçg ctacatcget 1320 ggctgcaacc tgtag 1035

<210> 7 <211> 286 <212> PRT <213> Lactococcus garvieae <400> 7 229

Met Ala Gin Glu Vai Lys Vai Pr o Lys Met Pro Gly Ala Pro Vai Phe 15 10 15 |

Gly Lys Trp lis Ser Pro Glu Glu Ser Vai Gly Gin Arg Leu Lys Gly PO 25 30

Lys Lys Ile Leu Leu Thr Gly Thr Thx Lys Gly Vai Gly Arg Vai Thr! 35 40 45

Gin Glu Leu Leu Cvs Ala Bis Gly Ala Phe Vai Cys Giy Ser Gly Arg! 50 * 55 60 !

Thr Pro Gly V'al Ala Ala Ser V&X Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Giy 65 70 75 80'

Asp Ala Vai

Tyr Gin Ala Ala Gly Set Asp vai Asp Leu Ser Asp Tyj 85 90

Lys Lys Trp Vai Glu Glu Cys Ala Glu Leu Met Gly Gly lie Asp Vai 100 10$ 110

Vai Ile Asn Asm Ala Ser His Pro Gly Met Ala Pro Phe Gly Glu Met 115 120 125

Thr Pro Glu lie Trp Asn fyr Gly i ia Lys Asn Glu Leu Asp Leu vai 130 135 140

Tyr Asn Vai Cys Asn Cys Ala Trp Pro Tyr Leu Gin Lys Ala Asp Giy 145 150 155 160

Ala Ser Ile Ile Ile Thr Ser Ser Thr Vai Ala Leu Gin Gly Ser Asn 165 170 175

Ser Pro Gin Ala Cys His Ala Ala Cys Lys Gly Ala Cys Leu Ser Leu 180 185 190

Ala Arg Gin Leu Ala Ala Glu Gly Gly Pro Phe Gly Ile Arg Cys Asn 19$ 200 205

Ser Vai Thr Pro Gly Leu Vai Trp Thr Glu Ala Met Ser Asn lie Pro 210 215 220

Lys Glu Met Ala Ser Gly Leu Vai Ala Ala Gin Thr Thr Gin Gin Ala 225 230 235 240 230

Vai Asp ?ro Met Asp Ile Ala Tyr Ala Tyr leu Phe leu Ala Ser Asp 245 250 255 <51 u Ser Arg Gin lie Thir Ala Ala Asn Ile Bro Vai Asp Gly Gly Cys 260 265 2?δ

Ala Gly Ala Vai thr Gly Gly Met Gin Gly Glu lie Glu Vai 215 280 285

<210> 8 <211> 310 <212> PRT <213> Bacteroides ovatus <400> 8

Met Ser Pro Hí» Phe Ala Ser Gla Arç Trp Ala Ala Lys Glu Asp Gly i 5 10 Í5

Pro Arg GXn Gly Ly« Glu Pro Thr Met Ala Gin Glu Vai Lys Vai Pro 20 2S 30

Lys Met Pro Gly Ala Pro Vai Phe Gly Lys Trp Ile Ser Pro Glu Glu 35 40 45

Ser Vai Gly Gin Arg teu Lys Gly Lys Lys ile Leu Leu Thr Gly fhr 50 55 60 ?hr Lys Gly vai Gly Arg Vai Ihr Gin Glu Leu Leu Cys Ala Bis Gly 6S 70 ?5 80

Ala Phe Vai Cys Gly Ser Gly Arg Thr Pro Gly Vai Ala Ala Ser Vai 85 90 95

Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Gly Tyr Gin Ala Ala Gly Met Asp Vai 100 105 no

Asp Leu Ser Asp Tyr Asp Ala Vai Lys Lys Trp Vai Glu Glu Cys Ala 115 120 125 231 G ,ι υ LeU Met Giy Giy lie Asp Vai vai Ile Asn Asn Ala Ser His Pro 130 135 140 Giy Met Ala Pro Phe Giy Glu Met Thr Pro Glu He rrp Asn r Λ 1Γ Giy 145 150 155 160 Vai Lys As.n Csltí Leu Asp teu Va 1 Tyr Asn Vai Cys Asn Cys Ala Ttp 165 170 175 Pro Lo a Gin Lys Avia Asp Giy Ala Ser 1 le He Ile Thr Ser Ser 180 185 190 Th r Vai Giy Leu Gin Giy Ser Asn Se r Pro Gin Ala Cys His Ala Ala 195 200 205 Cys Ly s Giy Ala Cys Leu Ser Leu Ala Arg Gin Leu Ala Ala Glu Giy 210 215 220 Giy Pro Phe Giy lie Arg Cys Asn Ser Vai Thr Pro Giy Leu Vai Trp 225 230 Λ IS w ^ y 240 Th r. Glu Ala Met Ser Asn X le Pro Lys elu Met Ala Ser Giy Leu Vai 245 250 255 AI A Ala Gin Thr Thr Gin Gin Ala Vai Asp Pr o Met Asp Ile Ala Tyr 260 265 2?0 Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Arg Gin Ile Thr Ala Al-íâ 275 25Ô 255 Asn X le Pro vai Asp Giy Giy Cys Ala Giy Ala Vai Thr Giy Giy Met 290 295 300 Gin Giy Gin lie Glu Var 305 310

<210> 9 <211> 287 <212> PRT <213> Streptococcus constellatus <4 Ο Ο> 9 232

Met Ala Gin Glu Vai Lys Cys Ala Lys Met Pro Gly Ala Pro Vai Phe 1 5 10 15 Gly Lys Trp Ile Ser Pro Glu Glu Ser Ile Gly Gin Arg Leu Lys Gly 20 25 30 Lys Lys Ile Ile Leu Thr Gly Thr Thr Lys Gly Vai Gly Lys Vai Thr 35 40 45 Gin Glu Leu Leu Cys Ala Bis Gly Ala Phe Vai Cys Gly Ser Gly Arg 50 55 60 Thr Pro Gly Vai Ala Ala Ser Vai Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Gly 65 70 75 80 Tyr Gin Ala Ala Gly Met Asp Vai Asp Leu Ser Asp Tyr Glu Ala Vai 85 90 95 Lys Lys Trp vai Gin Glu Cys Ala Glu Leu Met Gly Gly Ile Asp Vai 100 105 110 Vai Ile Asn Asn Ala Ser His Pro Gly Met Ala Pro Phe Glu Glu Met 115 120 125 Thr Pro Glu Ile Trp Asn Tyr Gly ile Lys Asn Glu Leu Asp Leu Vai 130 135 140 Ty.r Asn Vai Cys Asn Cys Ala Trp Pro Tyr Leu Lys Glu Ala Glu Gly 145 150 155 160 Gly Ala Ser Ue Ile Ile Thr Ser S®r Thr Vai Gly Leu Gin Gly Thr 165 170 175 Asn Ser Pro Gin Ala Cys Hís Ala Ala Ala Lys Gly Ala Cys Leu Ser 180 185 190 Leu Ala Arg Gin Leu Ala Ala Glu Gly Gly Pro Phe Gly Ile Arg Cys 195 200 205 233

Asπ Ser Vai Thr Fro GXy Leu Vai Ttp Thr Glu Ala Met Ala Asn lie 210 215 220

Pré l<ys Glu Met Ala Ser Gly Leu Vai Gly Ala Gin Thr Thr Gin Gin 225 230 235 240

Ala Ile Àsp Pro Met Asp Ile Ala Tyr Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser 245 230 25$

Asp Glu Ala Arg Gin lie Thr Ala Ala Asn Leu Fro Vai Asp GXy Gly 260 205 2?0 Çys Ala Gly Ala Vai Thr Gly Gly Met Gin Gly Glu lie Glu Gly 27$ 280 285

<210> 10 <211> 861 <212> ADN <213> Lactococcus garvieae <4 0 0> 10 234 atggcacagg aagfccaaagfc ccccaagatg cccggcgcac. ecgtgttcgg caagtggatc 60 tcccecgagg agtocgtcgg ccagcgc.ctg aagggcaaga agatccfcgct ca.ccggcacc 120 aceaagggçg fccggcaggçt cacccaggag ctgctgtgcg cacasggcgc stscgtetge 189 ggefcecggcc geacsctóegg cqt.ggcagcc tccgtcgccg acg&gctgaa ggeeaagggc 249 taecaggeeg ceggcatgga cgfccgacctg tctgactacg acgccgfcgaa gaagtgggfct 390 gagçaçfcqcg ccgagcteat gggcqqcatc gacgtcgfcca tcaacaacgc gtcccacccc 3S0 ggcatggccc ccttcggcga gatgaccccg gaq&tetgga actacggcac caagâácgag 420 ctcgaccfccg tctacaacgt ctgeaacfcge gcatggecct acstgcagaa ggçagacggc 430 gcctccstca tcatcacctc ctccaccgtc gccctccagg gcagcaacfcc ecctcaggcc 540 tgfccacgctg ccfcgcaaggg cgcctgcctg tccctggccc gccagctcgc cgctgagggc 600 ggccccttog gcatccgctg caactccgfcc accccgggcc tggtctggac sgaggccatg 660 tccaacatcc ccaaggagat ggcaagcggc ctggtcgcag ccesgace&c ccageaggct 720 gtcgaceega tggacatcgc ctacçcctac ctgttcctgg catccgaoga gtcecgccag 780 atcaccgctg ccaacatccc cgfccgacggc ggctgcgccg gegctgtgac cggcggcatg 840 cagçgcgaga fccgaggtcta g 861

<210> 11 <211> 933 <212> ADN <213> Bacteroides ovatus <4 Ο 0> 11 atg&gcccgc atfctfcgcgag ccaaagatgg gctgcaaagg aagacggccc aagacaagga 60 aaggaaccaa ccatggcaee ggaagtcaaa gtcc.ccaaga fcgcccggcgc aeccgtgtte 120 ggcaagtgga tctcccccga çgagtccgtc ggccagcgce tgaagggcaa gasgatcGfcg 180 ctcaccgçca ccaccaaggg cgtcggcagg gtcácccagg agctgctgfcg cqc&c&cqqo 240 gccfctcgtct gcggetccgg ccgcaccccc ggcgtggcag cctccgtcgc cgacgagctg 300 aaggccããgg gctaccaggc cgccggcatg gacgtcgacc tgfcctgacfca cgscgccgtg 360 aagaagtggg ttgaggagtg cgccgagctc afcgggcggca tcgacgtcgt catcaacaac 420 gcgtcccacc ccggcatggc ccccttcggc gagatgaccc cggagatctg gaactacggc 480 gtcaagaacg agcfecgacct cgtctacaac gtctgcaact gcgcafcggcc cíacctgcag 540 235 600 aagçcagaeg gcgcctccat catcatcacc tcctccaccg tcggcctcca gggcagcaac tcccctcagg cctgccacgc tgcctgcaag ggcgcctgcc tgtccctggc ccgccagctc 660 gccçctgagg gcggcccctt cggcatccgc tgcaactccg tcaccccggg cctggtctgg 720 accgaggcca tgtccaacat ccccaaggag atggcaagcg gcctggtcgc agcccagacc 780 acccagcagg ctgtcgaccc gatggacatc çcctacgoot acctgttcct ggcatccgac 840 gagCcccgcc agatcaccgc tgccaacatc cccgtcgacg gcggccgcgc cggcgctgtg 900 accggcggca tgcagggcga gatcgaggtc taa 933

<210> 12 <211> 864 <212> ADN <213> Streptococcus constellatus <4 0 0> 12 afcggeacagg aagtcaaatg cgccaagatg cccggagcgc ccçtcttcgg caagtggate 60 agccCcgágg agtcgategg ccagcgcctc aágggcaága agatcattct caccggcaCc 120 actaaçggcg tcggcaaggc cacecaagag ctgctgtgcg eccacggcgc cttcgfcctgc ISO ggctccçgtc gtacccccgg cgtggcegct tccgtggccg aoçagcfcgaa ggccaaggge 240 fcaccaggccg eeggcatgga cgtcgacctg tccgactacg agcccgtgaa gasgtgggtc 300 eaaçagtçeg ccgagctcat gggcggcatc gacgtcgfcca tcaacaacgc ctcccacccg 360 ggcafcggccc ccttcgagga gatgaccccc gagafcctgga aetacggcat casgaacgag 420 ctcgacetgg tctacaacgfc gtgcaac tgc gcttggccgt acctgaagga agccgagggc 480 ggcgcttcca tcatcatcac ctcctecacc gteggcctcc agggcaccaa cnccccgcag 540 gcctgccacq ccgccgccaa gggcgcatçc ctgtccctgg cccgccagct ggcagctgsa 600 ggcggcccct tcggcatccg ctgcaaetcc gtcacccccg gcctggtgtg gaccgaggce 660 atggccaaoa tcccgaagga aatggcatcc ggcctggtcg gtgegcagac cacccagcag 720 gctatcgacc ccatggacat egcctaegct tacctcttcc tggcctccga tgaggctcgc 780 cagatcaccg cagcgaacct tcccgtcgac ggcggctgcg ccggcgctgt çaccggcgge 840 atgcagggcg agatcgaagg ctaa 864

<210> 13 <211> 486 <212> PRT 236 <213> Lactococcus garvieae <4 Ο 0> 13

Met Ala Glu Phe Asp Vai Glu Tyr Asp Leu Va 1 val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ala Ser Gly Lys Ser Ala Ala Leu Ile Ala Ala Arg Glu Gly Lys Arg ao 25 30 Vai Vai Vai Leu Glu Lys Met Pro Glu Thr Gly Gly Leu Ser Met Tyr 35 40 4$ Ala Glu Gly Thr Ala Ala Phe Glu Ser Ser Ile Gin Asn Glu Leu Gly 5 D 55 60 Thr Pro Arg Leu Ser Lys Tyr His Phe Pro Thr Lys Gin Glu Gly Ile 65 70 75 80 Glu Lys Phe Met Gly Tyr Ser His Glu Ara Ala Asn Tyr Asp Val Val 85 90' 95 Arg Ala Phe vai Glu Asn Ser Ala Glu Thr ile .Asp i le Tyr Arg Asp 100 105 110 Leu eiy Vai Vai Tyr Lys Ala Cys Asp Ile Ala Ala Glu Asp Asp Pro 115 120 125 Asn Glu Val Trp Thr Phe Bis Leu Pro Glu Gly Leu Gly Ala His Cys 130 135 140 Gin Glu Vai Leu Leu Asp Ala ile Gin i»ys Leu Asp Vai Asp Ile Phe 145 150 155 160 Thr Ser Thr Pro Ala Lys Glu Leu 11« lie Glu Asp Gly Ala Val Val 165 170 175 237

Gly Vai Vai Ala Glu Ser Asp Gly Glu Pro Leu Arg Val Gly Gly Lys 280 185 190 Ala vai i le Leu Ala Thr Gly Gly Met Gly Ser Ser Pro Glu Arg Ile 285 200 205 Phe Lys Tyr Ser frp Phe Ala Pro Ala Aia Tyr Asn Met Asn Thr Leu 220 215 220 Thr Pro Leu G2n Asn Val Gly Asp Gly £»au Asp Leu Ala Leu Ser Aia 225 2 3 D 235 240 Gly Ala Asp Pro Thr tyr lie Thr Thr Cys Pro lie Leu &Xe. Ala Gly 245 250 255 Gly Arg Asp Met Thr Met Asp Ser Gin Val Gly Gly Aia Gly Vai Asn 260 265 270 Pro Gly Vai Trp Ile Asn Lys Thr Gly Arg Arg Phe Ala Ala Gl U Ser 275 280 285 Vai Ala Glu Asn lie Gly Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Gly Lys Gin Pro 230 295 300 Gly Gly Val Val •Trp Ser Ile Leu Ser Gin Ala Asp He Asp Arg Leu 305 310 315 320 Vai Ala Glu Glv Ser Glu Ile Ala Xle Gly Glu Phe Vai Val Tyr His 325 330 335 Lys Pro Met Glu Arg Leu Pro Ile Glu Leu Glu Ala HiS Leu Glu Ser 340 345 350 Gly Leu Val Lys Lys Ala Gly Ser Phe Glu Glu Leu Ala Ala Leu He 355 360 365 Asp Vai Pro Val Aso Thr Phe Val Ala Thr Met Ala Asp Tyr Asn Glu 370 375 380 Ala Cya Glu Lys Gly Tyr Asp Asp Ala Phe Met Lys Lys Pro Gin Tyr 385 390 395 400 Leu Arg Pro Met Vai Glu Gly Pro Phe Tyr Ala Ile Pro Leu Ala Thr 405 410 415 238

Asn Met Gin 43C

Gly Thr Met 01 y Ser Ala Gly Gly 11« Arg 21« hm Gly 420 425

Vai Vai Asp Ala Asp Tyr Asn Ala lie Pro Gly Leu Tyr Ala Vai Gly 435 440 445

Leu Asp Ala Thr Gly Leu Tyr Gly Asp Ser Tyr Asn Hat Glu Vai Pro 450 455 4so

Gly Ala Ala Asn Gly ?ha Ala His Thr Ser Gly Arg Xle Ala Ala Arg 465 470 475 480 Hís Ala lie Ser Thr Met 485

<210> 14 <211> 486 <212> PRT <213> Bacteroides ovatus <4 0 0> 14

Met Ala Gin Phe Asp Vai Glu tyr Asp Leu Vai Vai Vai Gly Gly Gly i 5 10 15

Ala Ser Gly Lys Ser Ala Ala Lm 11« Ala Ala Arg Glu Gly Lys Arg 20 25 ' 30

Va.X Vai Vai Leu Glu Lys Met Pr© Glu Thr Gly Gly Leu Ser Met Tyr 35 40 45

Ala Glu Gly Thr Ala Ala Phe Glu Ser Ser lie Gin Asn Glu Leu Gly $0 55 60

Thr Pro Arg Leu Ser Lys Tyr His Phe Pr© Thr Lys Gin Glu Gly Xle 65 70 75 80

Glu Lys Phe Met Gly Tyr Ser His Glu Arg Ala Asn Tyr Asp Vai Vai 85 90 95

Arg Ala Phe Vai Giu Asn Ser Ala Glu Thr Xle Asp 11« Tyr Arg Asp 100 105 120 239

Leu Gly Vai Vai Tyr Lys Ala Cys Asp lie Ala Ala Glu Asp Asp Pro 115 120 125

Asn 01» Vai Trp Thr Phe Hís Leu Pro 01» Gly Leu Giy Ala Bis Cys 130 135 140

Gin Glu Vai Leu Leu Asp Ala lie Gin Lys Leu Asp Vai Asp Ile Phe 145 150 155 160

Thr Ser Thr Pro Ala Lys Glu Leu Ile lie Glu Glu Gly Ala Vai Vai 165 HO 135

Gly Vai Vai Ala Glu Ser Asp Gly Glu Pro Leu Arg Vai Gly Gly Lys 180 185 190

Ala Vai Ile Leu Ala Thr Giy Gly Met Giy Ser Ser Pro Glu Arg Ile 135 200 205

Phe Lys Tyr Ser Trp Phe Ala Pro Ala Ala Tyr Asn Met Asn Thr Leu 210 215 220

Thr Pro Leu Gin Asn Vai Gly Asp Gly Leu Asp Leu Ala Leu Ser Ala 225 230 235 240

Gly Ala Asp Pro Thr Tyr Ile Thr Thr Cys Pro lie Leu Ala Ala Gly 245 ' 250 255

Gly Arg Asp Met Thr Met Asp Ser Gin Vai Gly Gly Ala Gly Vai Asn 260 265 270

Pro Giy Vai Trp Ile Asn Lys Thr Gly Arg Arg Phe Ala Ala Glu Ser 275 280 285

Vai Ala Glu Asn. Ile Gly Asp Ile Giy Thr Tyr Tyr Giy Lys Gin Pro 290 295 300

Gly Gly Vai Vai Trp Ser Ile Leu Ser Gin Ala Asp Ile Asp Arg Leu 305 310 315 320

Vai Ala Glu Gly Ser Glu Ile Ala Ile Gly Glu Phe Vai Vai Tyr Bis 325 330 335

Lys Pro Met Glu Arg Leu Pro ile Glu Leu Glu Ala His Leu Glu Ser 340 345 350 240

Gly Leu Vai Lys Lys Ala Gly Ser 355 ' 360

Pb® Glu Glu Lsu Ala Ala Leu lie 365

Asp Vai Fro Vai Asp Thr 370

Fhe Vai Ala Thr Met Ala Asp Tyr Asn Glu 375 3S0

Ala Cys Glu Lys Gly Tyr Asp Asp Ala Phe Met lys Lys Pro Gin Tyr 385 390 395 400

Leu Arg P*ro Met Vai Glu Gly ?ro Tyr Ala II® Pro Leu Ala Thr 405 410 415

Gly Thr Met Gly Ser Aia Gly Gly Ile Arg II® Asn Gly Asn Hat Gin 420 425 430

Vai Val Asp Ala Asp Tyr Asn Ala lie Pr o Gly Leu fyr Ala Vai Gly 435 440 445

Leu Asp Aia Thr Gly leu Tyr Gly Asp Ser Tyr Asn Met Glu Val Pro 450 455 460

Gly Aia Ala Asn Gly Phe Aia His Thr Ser Gly Arg Ile Ala Ala Arg 465 470 475 480

His Ala lie Ser Thr Met 485

<210> 15 <211> 487 <212> PRT <213> Streptococcus constellatus <400> 15

Met Ala Glu Fhe Asp Val Glu Tyr Asp Leu Val val Val Gly Glv Gly 1 5 10 IS

Leu

Ala Ser Gly Lys Ser Ala Ala 20 lie Ala Ala Arg Ala Gly Lys Ser 25 30

Vai Val Val Leu Glu Lys Met 35

Oro Glu Thr Gly Gly Leu Ser Met Tyr 40 45 241

Ala Glu Gly Thr Ala Ala Phe Glu Ser Ser lie Gin Lys Glu Leu Gly 50 55 60

Thr Pro Arg leu Ser lys Tyr His Phe Pr o Thr Ly$ Gin Glu Gly Vai 6$ 70 75 &0

Glu Lys Phe Met Gly Tyr Ser His Gin Arg Ala Ser Tyr Aep Vai Vai 8$' 90 95

Arg Ala Phe Vai Glu Asn Ser Ala Glu Thr lie Asp lie Tyr Arg Glu 100 105 110 teu Gly Vai Vai Tyr Lys Thr Cys Asp lie Ala Ala Glu Asp Asp Pro 115 120 125

Ser Glu Vai Trp Thr Phe His leu Pro Glu Gly teu Gly Ala His Cys 130 135 140

Gin Glu Vai teu teu Asp Ala Ile Gin Lys teu Asp Vai Asp Ile Phe 145 150 155 160

Thr Ser Thr Pro Ala Lys Glu teu Ile Ile Glu Asp Gly Lys Vai Vai 165 170 175

Gly Vai Vai Ala Glu Ser Asp Gly Glu Pro Leu Arg Vai Gly Gly Lys ISO 185 190

Ala Vai Ile Leu Ala Thr Gly Gly Met Gly Ser Asn Pro Asp Arg Ile 195 200 205

Phe Lys Tyr Ser Trp Phe Ala Pro Ala Ala Tyr Asn Met Asn Vai Leu 210 215 220

Thr Pro teu Gin Asn Met Gly Asp 225 230

Gly Leu Asp teu Ala Leu Ser Ala 235 240

Gly Ala Asp Asp Thr Ala Ile Thr Thr Cys Pro Ile Leu Ala Ala 245 250 255

Gly Ala Gly Vai Asn 270

Gly Arg Asp Met Thr Met Asp Ser Gin Vai 260 265

Pro Gly Vai Trp Ile Asn Lys Ser 275 280 y Lys Arg Phe Cys Ala Glu Ser 205 242

Vai Ala Glu Ãsn llB Gly Asp Ile Gly Thr Tyx fyr Gly Lys Gin Pro 290 2$5 300 Gly Gly Ile vai Trp Ser Ue Leu Ser Gin Ala Asp ile Asp Arg Leu 305 310 315 320 Vai Ase Glu Gly Ser Glu Ile Ala Ile Gly Glu Phe vai Vai Tyr His ^ '3<: s3 330 335 Lys Pro Mefc Glu Arg Leu Pro Ile Glu Leu Asn Aia His Leu Glu Ser 340 345 350 Gly Leu Vai Lys Lys Ala Asp Cys Phe Glu GlU Leu Ala Glu Lys Hat 355 360 365 Asp Vai Pr o Ala Gly Aia Phe Vai Asp Thr Met Asn Ala Tyr Asn Glu 370 375 380 Ala Cys Glu Lys Gly Tyr Asp Asp Ala Phe PEet Lys Lys Pro Glu Tyr 385 390 395 400 Leu Ar g Ala Glu Thr Gin Aia Pro Phe Tyr Ala Ile Pro Leu Ala Thr 405 410 415 Gly Thr Het Gly Ser Ala Gly Gly Ile Lys Ile ASh: Gly Asn Met Gin 420 425 430 Vai Ile Asp Ser Asp Ala Asn Pro Ile Pro Gly Leu fyr Aia Vai Gly 435 440 445 Leu Asp Ala Thr Gly Leu Tyr G5y Asp Ser Tyr Asa Mst Glu Vai Pro 450 455 460 Gly Ala Ala Asa Gly Phe Ala His Thr Ser Gly Arg I Xe Ala Ala Arg 465 470 475 480 Bis Ala Leu Ser Thr Ket Glu

<210> 16 <211> 1461 <212> ADN 243 485 <213> Lactococcus garvieae <4 Ο 0> 16 atggcagaat tcgatgttga gtatgatctt gttgtcgttg gaggaggcgc ctctggaÃag 60 tctgcaçcgc tgatcgccgc ccgtgagggc aagcgcgtcg tggtgctcga gaagatgçcc 120 gsgsccggaq gcccctccat gtacgccgaa ggcaccgctg ccvtcgagtc ctctattcag 130 aacgagçteg gcaccccgeg tcttfcccaag taccacttcc cg&ccaíigs& ggsgggeatc 240 gagaagfetca tgggctac&g cc&tcagcgc gcgaactacg acgtcgtççg cgçtttçgtt 300 gagaactccg cagagãcc&t cgacatctac cgegaccteg gcgtcgfccta caaggccSgc 360' gacatcgccg cagaçgacça ccccaacgag gtctggacct tccâtctgcc cgagggectc 420 ggcgcccatt gccaçgaagt cctgctcgac gccatccaga agctcgacçt egae&fccttx 480 acctcçaccc ccgccaagça gcfccatcatc gaggacggcg ctgccgtcgg tgtcgfccgca 540 gagtctgacg çcgaçcccct gcgcgtcggc ggcaaggccg ttatcçtggc aaeeggcggc: 600 atggçctcca gcccggageg catcttcaag tacagctggt tcgcccccgc fcgcctacaac 660 ar.gaacaccc tcaceccgct gcagaacgtc ggcgacggcc tcg&cclcgc cctctcegcg 720 gqcçc&^acc ccacc-tacafc caccacctgc ecgafctcfccg cagcaggcgg ccgtg&cafcg 730 accátçgact cccaggtcgg cggcgcgggc gtca&ccccg gcgtgtggat caacaagacc 840 ggcaggcgct tcgcggccga gtccgttgcc gagaaçatcg gcgacafccgg sacctactac 990 ggcaagcagc ccggcggcgt ggtctggtcc atcctctccc aggçggacafc cgaccgtctg 960 gtggccg&gg gfctccgagafc egcgatcggc gagfcfccgtcg tgfcaccacsa gecgafcggag 1020 cgcefceecfca fccgagctcga ggctcatctc gagtccggcc tçgtgaagaa ggctggcagc 1030 ttcçaggsge fccqcagccct eattg&cgtg cctgtagaca ccttcgtcgc aactatggcc 1140 gsctacaacg aggcatgcga gaagggctac gacgacgcct ctatgaagaa gccccagtac 1200 ctcegecegá tggcogaggg fcçççfetctat gccatccctc tggctaccgg eaccatgggfc 1260 tccqctggcg gcacccgcat tâacggcâ&c dtgcaggtcg tcfacgccga ctacaacgcc 1.320 attcccggtc tctaçgcggt cggtctggac gccacgggtc tctaeggcga ttccr.acaac 1330 atggaggttc ccggcgcagc aaacggtttc gcccacacct ccggaçgcat cgccQoccgc 1440 eacgcgatct ccaotatgta g 1461

<210> 17 <211> 1461 <212> ADN <213> Bacteroides ovatus 244 <400> 17 atgçcac&at tcgatgttga gtatgatcfcfc gttgccgttg gaggaggcgc çfccfcggaaag 60 tcfcgcagegc tgategecge ccgfcgagggc aagcgcgtcg tggtgctcga gaagatgccc 120 gagaecggag gcctctccat gtacgccgaa gccaccgctg ccttcgagtc etetatteag no aaegagctcg gcaccccgcg tctttccaag ;;accac:tecc egaccaagea ggagggcatc 240 gagaagttca tgggctaeag ccatcagcgc gcgaactacg acgtcgtccg egetfctcgtt 200 gsgaaefcccg eagagaccac cgacatctac cgcgacctcg gcgícgtcfca caaggcctgc 360 gacatcgccg cagaggacga ccccaacgag gtctggacct tceatctgcc cgagggcctc 420 ggcgceeatt gccaggaagfc ccr.gctcgac gccatccaga agcr.cgacgt cgacafccf.tc 430 acctccaccc ccgccaagga gc':catcat:c gaggaaggcg çtgtcgtcgg tgtçgtçgca 540 gagtctgacg gcgagcccct gcgcgtcggc ggcaaggccg ttatcctggc aaccggcgçc 600 atgggetcca gcccggagcg catctfccaag tacagctggt tcgcccccgc tgcctacaac 660 .stgaacaecc tcacccogct geagaacgte ggegacggee tcgaeefccgc cctctccqcq 720 ggcçcagõcc ccacccacat çaccacctgc ccgattctcg cagcaggcgc ccgtgacatg 780 aeeatggsct cccaggtcgg cggcgcgggc gtcaaccccg gcgtgtggat caacaagacc 840 ggcaggcget fccçcggocga gtccgttgCc gagaaeatcg gegacafccgg aacctâctac 900 ggcaageagc ccggcggcgt ggÈctçgtcc àtCCZCtCCC sggcggacat cgaecgtetg 960 gtggccgagg gttccgsgat cgcgatcggc gagticgtçq tgtaccacaa gccgatggag 1020 cgcctcccta £cgagetoga ggctcatctc gagtccggcc tggcgaagaa çgcfcggcage 1080 ttcgaggagc tcçcagcect çatfcgaegtg cctgt&gaca ccttcgtcgc aaefeatggcc 1140 gactacaacg aggcatgcga gaagggct&e gacgacgccc ttatgaagaa çccccagtac 1200 ecccgcccça tggtcgaggg tcccfctctat gecatccctc tggcfcãccgg caccatgggt 4 íU 0 V* tcfcgctggcg gcatccgcat tsacggcaac sttgcaggtcg tcgacgcçga ctacaacgcc 1320 atteceggte tetacgcggt cggtctggac gccaegggtc fcctacggcga çtcctacaac 1330 atçcsggttc ccggcgcagc aaacggttfcç gcccacacct. ccggacgcat cgccgcccgc 1440 cacçcgatct ecact&tgta g 1461

<210> 18 <211> 1464 <212> ADN <213> Streptococcus constellatus <400> 18 245 aiggcfcgagt tcgatgttga gtacgacctg gtcgtcgtcg gcggcggcgc atccggcaag 6-0 tccçcggcct tgatcgcggc tcgcgccggc aagagcgtcg tcgtfcctcga gaagatgccc 120 gagacgggcg gcctgfcceat gtacgccgag gggaecgcgg cgttcg&gfcc ttccatteag 130 aagçaaçtcg gtaccccccg tctgagcaag tacc&tttcc ccaççaagca agagggcgtg 240 gagaagttca tgggatacag tcaccagcgc gcgagc.tacg segtggtgcg cgccttcgtg 300 gagââtfcccg ctg&gaecat ccacatctac cgcg&gctgg gcgfccgtcta caagacctgc 360 gacatcgceg cagaggacga teccagegag çtctggaect tccacctgcc cgagggcctc 420 ggcccccact gccaggaggt tctgcfccgac gccatccaga agctc.gacgt ggacateete 480 accfcccacgc ccgccaagga gctgattatc gaggacggca aggte.gtcgg cgfccgfcggcc 540 gagtccgacg gagsgccgct gçgçgfccggc ggeaaggccg tcatectcgc gaceggcggc 600 atgçgctcga aececgaecg catctteaag tacâgctggt tcgcceecge tgcctacaac 660 atqaacçttc tgaccccgct gcaçaaiatg ggcgacggce ntgatcfcggc cctgtccgca 720 ggcccagarg ácacggccat caccacctgc ecgafctttgg cggctggcgg eegtgacatg 730 accatggatt cccaggtcgg eggcgeaggc gtcaaccecg gegfcgtggat eaacaagtcc 840 ggçaagcgct tctgcgccga ateegtcgcc gagaacatçg gegacatcgg eacctaetae 900 ggçaagcagc ccggçggcat cgtgtggtcc atcctcfcccc agçecgacat cgaccgectg 960 gtcsacgagg gctecgaaafc cçccafccggc gagttcgtcg tgfcaccacaa çcccatggag 1020 egectaceca tcgagctc&a t.gcçcacctg gagtccggcc tggtcaagaa ggecgactgc 1080 ttcgaagagc tgçctgagaâ gatggacgtt cccgccggcg ccfctcgtaga eaccafcgaac 1140 gcctacaacg aggcgtgcga ga&gggct&c gacgacgcct tcatgaagaa geccgagtac 1200 ctgcgtgccg agacscaggc cccettctac gccateeeci; tggeaacggg eaecatgggc 1260 tctgccggcg gcate-aag&t caacggcaac atgcaggtca tcgattccga cgegaacccc 1320 atccccggcc tgtacgctgt gggcctggat gccaccggcc fcgtacggcga çtcctacaac 1380 atggaçgttc ccggcgccgc taacggcttt gcccacaccfc ccggccgcat tgcggcacgc 1440 c&egeccfcct ecacgafcgga qtm 1464

<210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Lactococcus garcieae <4 0 0> 19 246

Met Lys Asn Lys Phe Tyr Pro Lys Thr Phe Glu Arg Gly Tyr Ilô Gly 1 5 10 15 Asn Leu Glu Vai Glu Asn 20 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Lactococcus garcieae <4 0 0> 20 í?he Asp Glu Pro Vai Tyr Pro Gin Ala Glu 1 5 10 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Lactococcus garcieae <4 0 0> 21 Ala Ser Arg Met Vai Met Asp Ala Vai His Glu Gly Tyr 11 s Alá Gly 1 5 10 15 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Lactococcus garcieae <4 0 0> 22 aiy Tyr 11© Giy Asn Leu Glu Vai Giu Asn Arg Ais IX® Arg Met Pm 1 5 10 15

Met 247 <210> 23

<211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador El-terminal Ν-31 <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (11)..(11) <223> η significa inosina <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (14)..(14) <223> η significa inosina <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (20)..(20) ou timina <223> η significa adenina, guanina, citosii <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (26) . . (26) ou timina <223> n significa adenina, guanina, citosii <400> 23 tgaagaataa nttntayccn aaracnttyg a 31 <210> 24 <211> 37 248

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador El-terminal N-37 <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (11)..(11) <223> n significa inosina <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (14)..(19) <223> n significa inosina <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (20)..(20) <223> n significa inosina <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (26) . . (26) <223> n significa inosina <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (35)..(35) ou timina <223> n significa adenina, guanina, citosina <400> 24 tgaagaataa nttntayccn aaracnttyg arrgngg 37 249 <210> 25 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador El-terminal N-F32 <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (21) . . (21) <223> n significa adenina, guanina, citosina ou timina <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (27) .. (27) <223> n significa adenina, guanina, citosina ou timina <4 0 0> 25 atgaagaata agttttaycc naaracntty ga 32 <210> 26 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador El-interno-RPl <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (24) . . (29) <223> <22 0> n significa adenina, guanina, citosina ou timina 250 <221> Características diversas <222> (33) .. (33) <223> n significa adenina, guanina, citosina ou timina <4 0 0> 26 cctgcaatat aaccttcatg tacngcrtcc atnaccat 38 <210> 27 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador pUC19-FP-l <4 0 0> 27 acacaggaaa cagctatgac catgattacg 30 <210> 28 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador pUC19-RP-l <4 0 0> 28 agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc 30 <210> 29 <211> 30 <212> ADN <213> <22 0> Sequência artificial 251 <223> Iniciador pUC19-FP-2 <400> 29 atgattacgc caagcttgca tgcctgcagg 30 <210> 30 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador pUC19-RP-2 <4 0 0> 30 ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 30 <210> 31 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador E1-RACE-N-P1 <4 0 0> 31 atgcggatcg ctcggttctc gacctctagg ttac 34 <210> 32 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador E1-RACE-RP2-1 252 <4Ο0> 32 atcgaggaga agtgcgagga cgtcagggtc ate 33

<210> 33 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador E1-RACE-N-P2 <4 0 0> 33 ttctcgacct ctaggttacc gatgtagccg c 31

<210> 34 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador E1-RACE-RP2-2 <4 0 0> 34 acgtcagggt catcggcatc ggcgactgca ag 32

<210> 35 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador El-conf-NP <4 0 0> 35 253 tgccggtgca atggctgaca tcatgttcaa cctg 34

<210> 36 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador El-conf-CP <4 0 0> 36 tcctccatcg ttcctccaat cagtaagaca cgcg 34

<210> 37 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador El-FP <4 0 0> 37 ctacatcggt aacctagagg tcg 23 <210> 38 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador El-RP <400> 38 ccgtgctgct tgatggtctt tgc 23 254 <210> 39 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Gar-16S-Ribo-FP <4 0 0> 39 tgcgtagata tatggaggaa c 21 <210> 40 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador Gar-16S-Ribo-RP <4 0 0> 40 cttatctcta aggatagcac g 21 <210> 41 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador exp. EI pet F Nde <4 0 0> 41 agctcatatg aagaacaagt tctatccgaa <210> 42 255

<211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador exp. EI pet His <400> 42 aatcgaattc ctacaggttg cagccagcga tgt 33 <210> 43 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> RACE-N-P3- -1 <4 0 0> 43 atggagatag tgccgctggc aaggcaacgg cac 33 <210> 44 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> RACE-N-P3- -2 <4 0 0> 44 tcaacgaaga ctcgatttga gcgagaggcg agg 33 <210> 45 <211> 32 256

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> El-Bub-N-Pl <4 0 0> 45 acggtggaac cggcatcgtg ttcatggaca ac 32 <210> 46 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> El-Bub-N-P2 <4 0 0> 46 gcgtgaccca gttccaccat gtcggactgt c 31 <210> 47 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> RACE-C-P3-1 <4 0 0> 47 gacatcccgt tcgagcgcag gatcacccat gag 33

<210> 48 <211> 33 <212> ADN 257 <213> Sequência artificial <22 0> <223> RACE-C-P3-2 <400> 48 aggatcaccc atgagcgcat cgctatcatg gac 33 <210> 49 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> El-Bub-C-Pl <4 0 0> 49 catcgctctt gcagtcgttg tccaggaagt cc 32 <210> 50 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> El-Bub-C-P2 <4 0 0> 50 ttgtccagga agtccatcgc gtacacgacg gag 33

<210> 51 <211> 13 <212> PRT 258 <213> Lactococcus garvieae <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (12) . . (12) <223> Xaa significa isoleucina ou leucina <400> 51

Thr Pro Gly Vai hl» Ala $er Vai Ala Asp Oiu X&a 1 5 XO <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Lactococcus garvieae <4 0 0> 52

Het Pro Giy Ala Pro Vai Phe QXy Lys X <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Lactococcus garvieae <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (2) .. (4) <223> Xaa significa isoleucina ou leucina <400> 53

Lys Xaa Xaa Xaa Thr Gly Thr Thr Lys l' 5 259 <210> 54

<211> 18 <212> PRT <213> Lactococcus garvieae <22 0> <221> Características diversas <222> (5)..(6) <223> Xaa significa isoleucina ou leucina <400> 54

Vai Thr Gin Glu Xaa x< ia Cys Ala Bis Gly Ala Pi ie Vai Cys Gly Ser 1 5 10 15 Giy Arg <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Lactococcus garvieae ÍJi * <22 0> <221> Caracteristicas diversas <222> (2) .. (2) <223> Xaa significa isoleucina ou leucina <400> 55

Trp Xaa Ser Pco Glu Glu Ser Vai Gly Gin Arg 1 5 10 <210> 56 <211> 8 260 <212> PRT <213> Lactococcus garvieae <4Ο0> 56

Ai a Gin. Glu Vai Lys Vai Pr o Lys 1 5 <210> 57 <211> 44 <212> ADN Λ cn \—1 (N V Sequência artificial <22 0> <223> E2-invitroTS-FPl <4 0 0> 57 actttaagaa ggagatatac caatggcaca ggaagtcaaa gtcc 44

<210> 58 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> E2-invitroTS-RP <400> 58 ctagacctcg atctcgccct gcatgccg 28

<210> 59 <211> 85 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 261 <223> Iniciador universal <400> 59 gaaattaata cgactcaefca tagggacacc acaacggttt cectcfcagaa ataattttgt 60 ttaactttaa gaaggagaSa tacca 35 <210> 60 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> exp.AM2 pet F Nde <4 0 0> 60 tatacatatg gcacaggaag tcaaagtc 28 <210> 61 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> exp. AM2 pet <4 0 0> 61 aatcgaattc ctagacctcg atctcgccct gc 32 <210> 62 <211> 28 <212> ADN <213> <22 0> Sequência artificial 262 <223> Iniciador exp.AM3 F <4 0 0> 62 tatacatatg gcagaattcg atgttgag 28

<210> 63 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador exp.AM3 R <4 0 0> 63 ccgcaagctt ctacatagtg gagatcgcgt gg 32

<210> 64 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador exp. AM1 F <4 0 0> 64 tatacatatg ttcaagggtc cacagggc 28

<210> 65 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador exp.AMl R 263 <4Ο0> 65 gctcgaattc ttagtgctgc tgtgcctttt cag 33

<210> 66 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador exp.DSl F <4 0 0> 66 atatacatat gcaggatatg gacttcatgg 30

<210> 67 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador exp.DSl R <4 0 0> 67 gctcgaattc tcatagtgac atcagcgctc cc 32

<210> 68 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador exp.E2 pet His <4 0 0> 68 264 aatcgaattc gagacctcga tctcgccctg c 31 <210> 69 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador exp.E3 R H <4 0 0> 69 ccgcaagctt gtacatagtg gagatcgcgt gg 32

Lisboa, 12 de Agosto de 2013. 265

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido isolado, caracterizado pelo facto de se seleccionar entre: (Ca) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13; (Cb) um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 13 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de 1 a 200 aminoácidos e tendo actividade para sintetizar equol utilizando, como substrato, tetra-hidro-daidzeína; e (Cc) um polipéptido que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade da sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 13 e tendo actividade para sintetizar equol utilizando, como substrato, a tetra-hidrodaidzeina.
2. 2. Polinucleótido, caracterizado pelo facto de se seleccionar entre: (Cd) um polinucleótido que consiste na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 16; e (Ce) um polinucleótido que codifica um polipéptido, de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Vector de expressão caracterizado pelo facto de incluir o polinucleótido, de acordo com a reivindicação 2.
4. 4. Célula recombinante, caracterizada pelo facto de estar transformada com o vector de expressão, de acordo com a reivindicação 3. 1
5. 5. Processo para a produção de um polipéptido, caracterizado pelo facto de compreender a cultura da célula recombinante de acordo com a reivindicação 4, para se obter um polipéptido que tenha actividade para formar equol, utilizando como substrato tetra-hidro-daidzeína.
6. 6. Processo para a produção de equol, caracterizado pelo facto de compreender o polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 1 ou a célula recombinante de acordo com a reivindicação 4 a actuarem sobre a tetra-hidro-daidzeina.
7. 7. Processo para a produção de equol, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de compreender a segunda etapa e a terceira etapa que se seguem, a segunda etapa compreende uma etapa em que se faz actuar uma enzima, que consiste num dos polipéptidos isolados (Ba) a (Bc) que se seguem e NADPH e/ou NADH, sobre di-hidrodaidzeina produzindo assim tetra-hidro-daidzeína, (Ba) um polipéptido isolado que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7; (Bb) um polipéptido isolado que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de 1 a 50 aminoácidos e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeina; e (Bc) um polipéptido isolado que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, di-hidrodaidzeina, 2 a terceira etapa compreende uma etapa em que se tem o polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 1 e NADPH e/ou NADH a actuarem sobre a tetra-hidrodaidzeína, produzindo assim equol.
8. 8. Processo para a produção de equol, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de compreender a primeira etapa, a segunda etapa e a terceira etapa que se seguem, compreendendo a primeira etapa uma etapa em que se faz actuar uma enzima que consiste num dos polipéptidos isolados (Aa) a (Ac) que se seguem e NADPH e/ou NADH, sobre daidzeina, produzindo-se assim di-hidrodaidzeína, (Aa) um polipéptido isolado que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1; (Ab) um polipéptido isolado que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 com a substituição, eliminação, inserção e/ou adição de 1 a 250 aminoácidos e tendo actividade para sintetizar di-hidrodaidzeína utilizando, como substrato, a daidzeina; e (Ac) um polipéptido isolado que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 1 e tendo actividade para sintetizar di-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a daidzeina, compreendendo a segunda etapa uma etapa em que se faz actuar, sobre a di-hidrodaidzeina, uma enzima que consiste num dos polipéptidos isolados (Ba) a (Bc) que se seguem e NADPH e/ou NADH, produzindo-se assim tetra-hidrodaidzeína, (Ba) um polipéptido isolado que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7; (Bb) um polipéptido isolado que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 com a substituição, 3 eliminação, inserção e/ou adição de 1 a 50 aminoácidos e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeína; e (Bc) um polipéptido isolado que consiste numa sequência de aminoácidos com 60 % ou mais de identidade da sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 7 e tendo actividade para sintetizar tetra-hidrodaidzeina utilizando, como substrato, a di-hidrodaidzeína. compreendendo a terceira etapa uma etapa em que se tem o polipéptido isolado, de acordo com a reivindicação 1 e NADPH e/ou NADH, a actuar sobre a tetra-hidrodaidzeina, produzindo-se assim equol.
9. 9. Anticorpo, caracterizado pelo facto de ter afinidade com o polipéptido de acordo com a reivindicação 1.
10. 10. Composição enzimática para a síntese de equol, caracterizada pelo facto de conter o polipéptido, de acordo com a reivindicação 1.
11. 11. Estojo de síntese de equol, caracterizado pelo facto de compreender a célula recombinante, de acordo com a reivindicação 4 e tetra-hidrodaidzeina. Lisboa, 12 de Agosto de 2013. 4 Fig. 1 Di-hldrodaidzeina (DD) ε φ v TJ u «9 T3 ‘35 C 4¾ c 35 4? T3 $ ta 13 C -S C

    £ $5 4» T3 V Ti « ’S £ ώ

    »24 --'••γΐ ' í- ίΎ*' ^ 1 2 14 H 18 2 Ó Produção de dí-htdrodaidzeína {Área do Pico) teoccoo 1400000 1290000 HKJÕ000 800000 SOOOÕO 400000 200000

    tív á-' '* v i > f * , ^ V. ifl? ---------------—i—Wvi‘>?o^...T^- -r· prs* .x. ,v *>„ —í.^-r.T -. : 2 hr Ohr 2 hr Ohr 2 hr -V 24 Tempo de retenção {min) Vr1)·· ί7- ; '· :;> -xy.u .·; .•"'CtSLd'^ V ~! "- !*-.:· Va' KV? ' '· . -¾ -v^yj -.-V-» DSn^S^ãâ^íi· $· .5n&.$w 0 hr Controio NADH 0,5 mM NÂDPH 0.5 mfsl 1