TWI468516B - 與雌馬酚（ｅｑｕｏｌ）合成相關之酵素 - Google Patents

與雌馬酚（ｅｑｕｏｌ）合成相關之酵素

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TWI468516B
TWI468516B TW97150642A TW97150642A TWI468516B TW I468516 B TWI468516 B TW I468516B TW 97150642 A TW97150642 A TW 97150642A TW 97150642 A TW97150642 A TW 97150642A TW I468516 B TWI468516 B TW I468516B
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Yoshikazu Shimada
Setsuko Yasuda
Masayuki Takahashi
Takashi Hayashi
Norihiro Miyazawa
Yasuhiro Abiru
Tadaaki Ohtani
Ikutaro Sato
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Otsuka Pharma Co Ltd
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    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Description

與雌馬酚(EQUOL)合成相關之酵素 發明領域
本發明係有關於具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性的多胜肽、具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性的多胜肽、及具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性的多胜肽、以及可將這些多胜肽編碼之多核苷酸。本發明進一步係有關於使用上述多胜肽以產生二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮、及雌馬酚之方法、及用於該等方法中之製造設備。本發明亦提供有關於其等之技術。
 發明背景
咸信異黃酮衍生物具有各種生理及藥理活性。由於這個緣故，異黃酮衍生物係作為用於食品及藥劑之物質。由於研究揭露異黃酮衍生物之機能，已有報告表示如一般所認為之異黃酮衍生物的似雌激素活性並非由該等異黃酮衍生物本身之作用所產生，而是由在全身所發現之藉雌馬酚而表示之強烈似雌激素活性所產生，該雌馬酚係自各種可代謝(生物合成)該等異黃酮衍生物以產生雌馬酚之腸細菌釋放後被腸吸收。就人類而言，並非所有個體可在腸內產生雌馬酚，且此種可產生雌馬酚之能力隨不同的個體而不同。例如某些個體之腸內並無可產生雌馬酚之細菌，而其它個體可具有此等細菌，但是僅具可產生雌馬酚之有限能力。
因此，在具有老化人口之國家(諸如日本)中，尤其考慮到慢性病症，諸如侵襲老年人之骨疏鬆症，最好有效地利用體內之雌馬酚。考慮到並未能在所有個體體內發現可產生雌馬酚之細菌的事實，有需要找出一種能有效率地進行人工雌馬酚製造之雌馬酚合成物質。
在這些情況下，就提供雌馬酚合成物質而言。重要的是鑑定及使用涉及該雌馬酚生物合成路徑之酵素。然而，並未能獲得關於可產生或催化涉及該生物合成路徑之部份該等中間產物的酵素之資料。因此與此等中間產物之合成相關之酵素的鑑定為所欲。
專利文件1：JP-A-2006-296434
本發明之一目標為提供一與可作為雌馬酚合成之物質之二氫大豆黃酮的合成相關之酵素。更明確地，本發明之目的在於提供一具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性的多胜肽。本發明之目的亦在於提供一可將此種多胜肽編碼之多核苷酸與關於使用此種多胜肽之二氫大豆黃酮合成法的技術。
本發明之另一目標為提供一與可作為雌馬酚合成之物質之四氫大豆黃酮的合成相關之酵素。更明確地，本發明之目的在於提供一具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性的多胜肽。本發明之目的亦在於提供一可將此種多胜肽編碼之多核苷酸、及關於使用此種多胜肽之四氫大豆黃酮合成法的技術。
本發明之另一目標為提供一與雌馬酚合成相關之酵素。更明確地，本發明之目的在於提供一具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性的多胜肽。本發明之目的亦在於提供一可將此種多胜肽編碼之多核苷酸、及關於使用此種多胜肽之雌馬酚合成的技術。
本發明之另一目標為提供一用於產生中間產物，諸如在自大豆黃酮製備雌馬酚時所產生之二氫大豆黃酮及四氫大豆黃酮之方法、及一使用所獲得中間產物以製備雌馬酚之方法。本發明之目的亦在於提供可用於該製法之製造設備。
本發明之發明者已進行密集研究以解決上述問題，且成功地自產生雌馬酚之腸細菌離析可合成二氫大豆黃酮之酵素、可合成四氫大豆黃酮之酵素、及可合成雌馬酚之酵素(這些酵素可作為雌馬酚合成之起始物質)，且揭示這些酵素之結構。而且，本發明者已進行進一步的研究且使用上述酵素成功地進行二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮、及雌馬酚之人工製造。基於這些研究結果，可藉進一步研究而實現本發明。
更明確地，本發明之一方面係提供：
項目A1.一選自以下之多胜肽：(Aa)一由序列辨識編號(SEQ ID NO)：1之胺基酸序列所組成之多胜肽；(Ab)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：1的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性；及(Ac)一由與序列辨識編號：1之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性。
項目A2.一選自以下之多核苷酸：(Ad)一由序列辨識編號：4之核苷酸序列所組成之多核苷酸；(Ae)一可將由該序列辨識編號：1之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Af)一在嚴苛條件下可使用該多核苷酸(Ad)或(Ae)之互補鏈進行雜交且可將具有使用大豆黃酮作為基質以合成二氫大豆黃酮之活性的多胜肽編碼之多核苷酸。
項目A3.一包括項目A2之多核苷酸的表現性載劑。
項目A4.一經項目A3之表現性載體轉形的重組細胞。
項目A5.一根據項目A4之重組細胞，其中該重組細胞為一細菌原核性細胞。
項目A6.一根據項目A5之重組細胞，其中該細菌原核性細胞屬於乳酸球菌屬(Lactococcus )。
項目A7.一用於製備多胜肽之方法，其包括培養項目A4至A6中任一項之細胞以獲得具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性的多胜肽。
項目A8.一藉項目A7之方法而獲得之多胜肽。
項目A9.一用於製備二氫大豆黃酮之方法，其包括使項目A1或A8之多胜肽，與NADPH及/或NADH對大豆黃酮作用。
項目A10.一用於製備二氫大豆黃酮之方法，其包括使項目A4至A6中任一項之細胞室對大豆黃酮作用。
項目A11.一對項目A1之多胜肽或藉項目A2之多核苷酸而編碼之該多胜肽具親和力的抗體。
項目A12.一用於檢測或測定項目A1之多胜肽或藉項目A2之該多核苷酸而編碼之多胜肽的免疫學方法，該方法包括使項目A11之該抗體接觸一試驗試樣。
項目A13.一根據項目A12之方法，其中該欲經檢測或測定之多胜肽係存在於一細胞原核性細胞中。
項目A14.一探針，其具有可在嚴苛條件下以可將項目A1之該多胜肽編碼的多核苷酸或項目A2之該多核苷酸進行雜交反應的核苷酸序列。
項目A15.一引子，其具有可在嚴苛條件下以可將項目A1該多胜肽編碼之多核苷酸或項目A2之該多核苷酸進行雜交反應的核苷酸序列。
項目A16.一種使用項目A14之該探針以檢測或測定可將項目A1之該多胜肽編碼之多核苷酸或項目A2之多核苷酸的方法。
項目A17.一種根據項目A16之方法，其中該欲經檢測或測定之多胜肽係存在於一細菌原核性細胞中。
項目A18.一種根據項目A16之方法，其包括RCR擴增所有或部份可將項目A1之該多胜肽編碼之多核苷酸或項目A2之該多核苷酸。
項目A19.一種二氫大豆黃酮合成酵素組成物，其包含項目A1之該多胜肽或一藉項目A2之該多核苷酸而編碼之多胜肽。
項目A20.一種據項目A19之組成物，其進一步包含NADPH及/或NADH。
項目A21.一種二氫大豆黃酮合成組成物，其包含：(Ai)項目A1之該多胜肽或一藉項目A2之該多核苷酸而編碼之多胜肽；(Aii)NADPH及/或NADH；及(Aiii)大豆黃酮。
項目A22.一種二氫大豆黃酮合成組成物，其包含：(Aiv)項目A4至項目A6中任一項之細胞；及(Aiii)大豆黃酮。
項目A23.一種二氫大豆黃酮合成套組，其包含：(Ai)項目A1之該多胜肽或一藉項目A2之該多核苷酸而編碼之多胜肽；(Aii)NADPH及/或NADH；及(Aiii)大豆黃酮。
項目A24.一種二氫大豆黃酮合成套組，其包含：(Aiv)項目A4至A6中任一項之細胞；及(Aiii)大豆黃酮。
項目A25.一種用於測定項目A1之該多胜肽或一藉項目A2之該多核苷酸而編碼之多胜肽的免疫學測定套組。
該套組包含至少項目A11之該抗體。
項目A26.一種用於檢測可將項目A1之該多核苷酸編碼之多核苷酸或項目A2之該多核苷酸的PCR套組。
該PCR套組包含至少項目A15之該引子。
項目A27.一種根據項目A26之套組，其中該套組係用於鑑定含可將項目A1之該多胜肽編碼之多核苷酸或項目A2之該多核苷酸的細胞。
項目A28.一種根據項目A27之PCR套組，其中該套組係用於PCR。
項目A29.一種二氫大豆黃酮合成酵素，其係由項目A1之該多胜肽組成。
項目B1.一選自以下之多胜肽：(Ba)一由序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成的多胜肽；(Bb)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：7的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性；及(Bc)一由與序列辨識編號：7之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。
項目B2.一選自以下之多核苷酸：(Bd)一由序列辨識編號：10之核苷酸序列所組成的聚核苷酸；(Be)一可將由該序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成之多胜肽編號的多核苷酸；及(Bf)一可在嚴苛條件下以該多核苷酸(Bd)或(Be)之互補鏈進行雜交反應之多核苷酸，且其可將一具有使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性之多胜肽編碼。
項目B3.一包括項目A2之該多核苷酸的表現性載體。
項目B4.一經項目A3之該表現性載體轉形之重組細胞。
項目B5.一根據項目B4之重組細胞，其中該重組細胞為一細菌原核性細胞。
項目B6.一根據項目B5之重組細胞，其中該細菌原核性細胞屬於乳酸球菌屬。
項目B7.一種用於製備多胜肽之方法，其包括培養項目B4至B6中任一項之細胞以獲得具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以形成四氫大豆黃酮之活性的多胜肽。
項目B8.一藉項目B7之該方法而獲得之多胜肽。
項目B9.一種用於製備四氫大豆黃酮之方法，其包括使項目B1或B8之該多胜肽、及NADPH及/或NADH對二氫大豆黃酮作用。
項目B10.一種用於製備四氫大豆黃酮之方法，其包括使項目B4至B6中任一項之細胞對二氫大豆黃酮作用。
項目B11.一對項目B1之該多胜肽或藉項目B2之該多核苷酸而編碼之多胜肽具親和力的抗體。
項目B12.一種用於檢測或測定項目B1之該多胜肽或藉項目B2之該多核苷酸而編碼之多胜肽的免疫學方法。
該方法包括使項目B11之該抗體接觸一試驗試樣。
項目B13.一種根據項目B12之方法，其中該欲經檢測或測定之多胜肽係存在於一細菌原核性細胞中。
項目B14.一探針，其具有可在嚴苛條件下以可將項目B1之該多胜肽編碼的多核苷酸或項目B2之該多核苷酸進行雜交反應的核苷酸序列。
項目B15.一引子，其具有可在嚴苛條件下以可將項目B1之該多胜肽編碼之多核苷酸或項目B2之該多核苷酸進行雜交反應的核苷酸序列。
項目B16.一種使用項目B14之該探針以檢測或測定可將項目B1之該多胜肽編碼之多核苷酸或項目B2之該多核苷酸的方法。
項目B17.一種根據項目B16之方法，其中該欲經檢測或測定之多胜肽係存在於一細菌原核性細胞中。
項目B18.一種根據項目B16之方法，其包括PCR擴增所有或部份可將項目B1之該多胜肽編碼之多核苷酸或項目B2之該多核苷酸。
項目B19.一種四氫大豆黃酮合成酵素組成物，其包含項目B1之該多胜肽或藉項目B2之該多核苷酸而編碼之多胜肽。
項目B20.一種根據項目B19之組成物，其進一步包含NADPH及/或NADH。
項目B21.一種四氫大豆黃酮合成組成物，其包含：(Bi)項目B1之該多胜肽或一藉項目B2之該多核苷酸而編碼之多胜肽；(Bii)NADPH及/或NADH；及(Biii)二氫大豆黃酮。
項目B22.一種四氫大豆黃酮合成組成物，其包含：(Biv)項目B4至B6中任一項之細胞；及(Biii)二氫大豆黃酮。
項目B23.一種四氫大豆黃酮合成套組，其包括：(Bi)項目B1之該多胜肽或一藉項目B2之該多核苷酸而編碼之多胜肽。
(Bii)NADPH及/或NADH；及(Biii)二氫大豆黃酮。
項目B24.一種四氫大豆黃酮合成套組，其包含：(Biv)項目B4至B6中任一項之細胞；及(Biii)二氫大豆黃酮。
項目B.25一種用於測定項目B1之該多胜肽或藉項目B2之該多核苷酸而編碼之多胜肽的免疫學測定套組。
該套組包含至少項目B11之該抗體。
項目B26.一種用於檢測可將項目B1之該多胜肽編碼之多核苷酸或項目B2之該多核苷酸的PCR套組。
該PCR套組包含至少項目B15之該引子。
項目B27.一根據項目B26之套組，其中該套組係用於鑑定含有可將項目B1之該多胜肽編碼之多核苷酸或項目B2之該多核苷酸的細胞。
項目28.一種根據項目B27之PCR套組，其中該套組係用於PCR。
項目29.一種四氫大豆黃酮合成酵素，其係由項目B1之該多胜肽組成。
項目C1.一選自以下之多胜肽：(Ca)一由序列辨識編碼：13之胺基酸所組成的多胜肽；(Cb)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編碼：13的胺基酸所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性；及(Cc)一由與序列辨識編碼：13之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性。
項目C2.一選自以下之多核苷酸：(Cd)一由序列辨識編碼：16之核苷酸序列所組成的多核苷酸；(Ce)一可將由序列辨識編碼：13之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Cf)一可在嚴苛條件下以該多核苷酸(Cd)或(Ce)之互補鏈進行雜交反應的多核苷酸，且其可將具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性的多胜肽編碼。
項目C3.一包括項目C2之該多核苷酸的表現性載體。
項目C4.一經項目C3之該表現性載體轉形之重組細胞。
項目C5.一根據項目C4之重組細胞，其中該重組細胞為一細菌原核性細胞。
項目C6.一根據項目C5之重組細胞，其中該細菌原核性細胞屬於乳酸球菌屬。
項目C7.一種用於製備多胜肽之方法，其包括培養項目C4至C6中任一項之細胞以獲得具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以形成雌馬酚之活性的多胜肽。
項目C8.一藉項目C7之該方法而獲得之多胜肽。
項目C9.一種用於製備雌馬酚之方法，其包括使項目C1或C8之該多胜肽對四氫大豆黃酮作用。
項目C10.一種用於製備雌馬酚之方法，其包括使項目C4至C6中任一項之細胞對四氫大豆黃酮作用。
項目C11.一對項目C1之該多胜肽或藉項目C2之多核苷酸而編碼之多胜肽具親和力的抗體。
項目C12.一種用於檢測或測定項目C1之該多胜肽或藉項目C2之該多核苷酸而編碼之多胜肽的免疫學方法。
該方法包括使項目C11之該抗體接觸一試驗試樣。
項目C13.一種根據項目C12之方法，其中該欲經檢測或測定之多胜肽係存在於一細菌原核性細胞中。
項目C14.一探針，其具有可在嚴苛條件下以可將項目C1之該多胜肽編碼之多核苷酸或項目C2之該多核苷酸進行雜化反應的核苷酸序列。
項目C15.一引子，其具有可在嚴苛條件下以可將項目C1之該多胜肽編碼的多核苷酸或項目C2之該多核苷酸進行雜交反應的核苷酸序列。
項目C16.一種使用項目C14之該探針以檢測或測定可將項目C1之該多胜肽編碼的多核苷酸或項目C2之該多核苷酸的方法。
項目C17.一種根據項目C16之方法，其中該欲經檢測或測定之多胜肽係存在於一細菌原核性細胞中。
項目C18.一種根據項目C16之方法，其包括PCR擴增所有或部份可將項目C1之多胜肽的多核苷酸或項目C2之該多核苷酸。
項目C19.一種雌馬酚合成酵素組成物，其包含項目C1之該多胜肽或藉項目C2之該多核苷酸而編碼的多胜肽。
項目C20.一種雌馬酚合成組成物，其包含：(Ci)項目C1之該多胜肽或一藉項目C2之該多核苷酸而編碼的多胜肽；及(Cii)四氫大豆黃酮。
項目C21.一種雌馬酚合成組成物，其包含：(Ciii)項目C4至C6中任一項之細胞；及(Cii)四氫大豆黃酮。
項目C22.一種雌馬酚合成套組，其包含：(Ci)項目C1之該多胜肽或一藉項目C2之該多核苷酸而編碼的多胜肽；及(Cii)四氫大豆黃酮。
項目C23.一種雌馬酚合成套組，其包含：(Ciii)項目C4至C6中任一項之細胞；及(Cii)四氫大豆黃酮。
項目C24.一種用於測定項目C1之該多胜肽或一藉項目C2之該多核苷酸而編碼之多胜肽的免疫學測定套組。
該套組包含至少項目C11之該抗體。
項目C25.一種用於檢測可將項目C1之該多胜肽編碼之多核苷酸或項目C2之該多核苷酸的PCR套組。
該PCR套組包含至少項目C15之該引子。
項目C26.一種根據項目C25之套組，其中該套組係用於鑑定含有可將項目C1之該多胜肽編碼之多核苷酸或項目C2之該多核苷酸的細胞。
項目C27.一種根據項目C26之套組，其中該套組係用於PCR。
項目C28.一種雌馬酚合成酵素，其係由項目C1之該多胜肽組成。
項目D1.一種用於製備四氫大豆黃酮之方法，其包括以下第一步驟及第二步驟。第一步驟包括使由以下(Aa)至(Ac)多胜肽中任一種所組成之酵素、及NADPH及/或NADH對大豆黃酮作用以製備二氫大豆黃酮的步驟，(Aa)一由序列辨識編號(SEQ ID NO)：1之胺基酸序列所組成之多胜肽；(Ab)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：1的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性；及(Ac)一由與序列辨識編號：1之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性，第二步驟包括使由以下(Ba)至(Bc)多胜肽中任一種所組成之酵素與NADPH及/或NADH對二氫大豆黃酮作用以製備四氫大豆黃酮的步驟，(Ba)一由序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成的多胜肽；(Bb)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：7的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性；及(Bc)一由與序列辨識編號：7之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。
項目D2.一種含有四氫大豆黃酮之產物，其係藉根據項目D1之方法而製成。
項目D3.一種用於製備雌馬酚之方法，其包括以下第二步驟及第三步驟，第二步驟包括使由以下(Ba)至(Bc)多胜肽中任一種所組成之酵素與NADPH及/或NADH對二氫大豆黃酮作用以製備四氫大豆黃酮的步驟，(Ba)一由序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成的多胜肽；(Bb)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：7的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性；及(Bc)一由與序列辨識編號：7之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。第三步驟包括使由以下(Ca)至(Cc)多胜肽中之任一種所組成之酵素對四氫大豆黃酮作用以製備雌馬酚的步驟，(Ca)一由序列辨識編碼：13之胺基酸所組成的多胜肽；(Cb)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編碼：13的胺基酸所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性；及(Cc)一由與序列辨識編碼：13之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性。
項目D4.一種含有雌馬酚之產物，其係藉根據項目D3之方法而製成。
項目D5.一種用於製備雌馬酚之方法，其包括第一步驟至第三步驟。
項目D6.一種含有雌馬酚之產物，其係藉項目D5之方法而製成。
項目D7.一表現性載體，其具有至少一選自以下所組成之群組的多核苷酸；(Ad)至(Af)、(Bd)至(Bf)、及(Cd)至(Cf)。
(Ad)一由序列辨識編號：4之核苷酸序列所組成之多核苷酸；(Ae)一可將由該序列辨識編號：1之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Af)一在嚴苛條件下可使用該多核苷酸(Ad)或(Ae)之互補鏈進行雜交且可將具有使用大豆黃酮作為基質以合成二氫大豆黃酮之活性的多胜肽編碼之多核苷酸；(Bd)一由序列辨識編號：10之核苷酸序列所組成的聚核苷酸；(Be)一可將由該序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成之多胜肽編號的多核苷酸；及(Bf)一可在嚴苛條件下以該多核苷酸(Bd)或(Be)之互補鏈進行雜交反應之多核苷酸，且其可將一具有使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性之多胜肽編碼；(Cd)一由序列辨識編碼：16之核苷酸序列所組成的多核苷酸；(Ce)一可將由序列辨識編碼：13之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Cf)一可在嚴苛條件下以該多核苷酸(Cd)或(Ce)之互補鏈進行雜交反應的多核苷酸，且其可將具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性的多胜肽編碼。
項目D8.一經項目D7之該表現性載體而轉形之重組細胞。
項目D9.一根據項目D8之重組細胞，其中該重組細胞為細菌原核性細胞。
項目D10.一根據項目D9之重組細胞，其中該細菌原核性細胞屬於乳酸球菌屬。
項目D11.一種用於製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮、及/或雌馬酚之方法，其包括以下第四步驟至第六步驟中之至少兩種，第四步驟包括使一包含以下(Ad)至(Af)多核苷酸中之任一種的重組細胞對大豆黃酮作用以製備二氫大豆黃酮之步驟，(Ad)一由序列辨識編號：4之核苷酸序列所組成之多核苷酸；(Ae)一可將由該序列辨識編號：1之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Af)一在嚴苛條件下可使用該多核苷酸(Ad)或(Ae)之互補鏈進行雜交且可將具有使用大豆黃酮作為基質以合成二氫大豆黃酮之活性的多胜肽編碼之多核苷酸，第五步驟包括使一包含以下(Bd)至(Bf)多核苷酸中之任一種的雙重組細胞對二氫大豆黃酮作用以製備四氫大豆黃酮之步驟，(Bd)一由序列辨識編號：10之核苷酸序列所組成的聚核苷酸；(Be)一可將由該序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成之多胜肽編號的多核苷酸；及(Bf)一可在嚴苛條件下以該多核苷酸(Bd)或(Be)之互補鏈進行雜交反應之多核苷酸，且其可將一具有使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性之多胜肽編碼，第六步驟包括使一包含以下(Cd)至(Cf)多核苷酸中之任一種的重組細胞對四氫大豆黃酮作用以製備雌馬酚之步驟，(Cd)一由序列辨識編碼：16之核苷酸序列所組成的多核苷酸；(Ce)一可將由序列辨識編碼：13之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Cf)一可在嚴苛條件下以該多核苷酸(Cd)或(Ce)之互補鏈進行雜交反應的多核苷酸，且其可將具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性的多胜肽編碼，其中至少兩選自由(Ad)至(Af)、(Bd)至(Bf)、及(Cd)至(Cf)所組成之群組的多核苷酸可存在於一單一重組細胞中。
項目D12.一根據項目11之重組細胞，其中該重組細胞為細菌原核性細胞。
項目D13.一根據項目12之重組細胞，其中該細菌原核性細胞屬於乳酸球菌屬。
項目D14.一種含二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮、及/或雌馬酚之產物，其係藉根據項目D11至D13中任一項之方法而製成。
項目D15.一種用於製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮、及/或雌馬酚之裝置，其包含以下第一至第三反應容器中之至少一種，第一反應容器具有可將由(Aa)至(Ac)多胜肽中之任一種所組成之酵素固定之反應裝置，該反應容器係用於使用該酵素以自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮的步驟，該反應裝置係配置在可以與大豆黃酮接觸之位置；第二反應容器具有可將由(Ba)至(Bc)多胜肽中之任一種所組成之酵素固定之反應裝置，該反應容器係用於使用該酵素以自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮之步驟，該反應裝置係配置在可以與二氫大豆黃酮接觸之位置；及第三反應容器具有可將由(Ca)至(Cc)多胜肽中任一種所組成之酵素固定之反應裝置，該反應容器係用於使用該酵素以自四氫大豆黃酮製備雌馬酚之步驟，該反應裝置係配置在可以與四氫大豆黃酮接觸之位置。
項目D16.一種用於製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮、及/或雌馬酚之裝置，其包含以下第四至第六反應容器中之至少一種，第四反應容器具有可將一包含(Ad)至(Af)多核苷酸中之任一種的重組細胞固定之反應裝置，該反應容器係用於使用該反應裝置以自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮之步驟，該反應裝置係配置在可以與大豆黃酮接觸之位置；第五反應容器具有可將一包含(Bd)至(Bf)多核苷酸中之任一種的重組細胞固定之反應裝置，該反應容器係用於使用該反應裝置以自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮之步驟，該反應裝置係配置在可以與二氫大豆黃酮接觸之位置；且第六反應容器具有可將一包含(Cd)至(Cf)多核苷酸中之任一種的重組細胞固定之反應裝置，該反應容器係用於使用該反應裝置以自四氫大豆黃酮製備雌馬酚之步驟，該反應裝置係配置在可以與四氫大豆黃酮接觸之位置。
本發明提供具有以下功用之多胜肽：(1)可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮，(2)可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮，及(3)可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚。因此，本發明適用於二氫大豆黃酮及/或四氫大豆黃酮(其等係為自大豆黃酮製備雌馬酚時所產生之中間產物)之工業合成以及雌馬酚之工業合成。本發明提供不需使用習用於雌馬酚製備之難以處理的厭氣菌株即可進行雌馬酚之工業製備的方法。
 較佳實施例之詳細說明
在下文中，遵照藉IUPAC-IUB(IUPAC-IUB Communication on BioIogical Nomenclature,Eur. J. Biochem.,138:9(1984))而詳述之命名法、the Guideline for Drafting Specifications containing Base Sequence or Amino Acid Sequence(Japan Patent Office)、及常用於本領域之其它習知符號，所有縮寫係用以代表物質，其包括胺基酸、多胜肽、鹼基序列、及核酸之名稱。
下文詳細地描述本發明。
A：二氫大豆黃酮合成酵素
本段落詳細描述二氫大豆黃酮合成酵素(下文亦稱為E1酵素)。除非另有描述，該二氫大豆黃酮合成酵素之一般解釋適用於稍後所述之四氫大豆黃酮合成酵素及雌馬酚合成酵素。
A-1.多胜肽
本發明提供一用於使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮的方法，更詳細地，本發明係提供：(Aa)一由序列辨識編號(SEQ ID NO)：1之胺基酸序列所組成之多胜肽；(Ab)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：1的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性；及(Ac)一由與序列辨識編號：1之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性。
在多胜肽(Ab)中，該“一或多個胺基酸”之範圍並未特別受限，但其限制條件為該多胜肽具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性，例如該範圍為自1至250個，較佳1至200個、更佳1至150個、更佳1至100個、更佳1至50個、更佳1至30個、更佳1至15個、更佳1至5個、又較佳1至4個、又更佳1至3個、且更特佳1或2個。
(Ab)多胜肽之實例包括一由序列辨識編碼：2之胺基酸序列所組成之多胜肽及一由序列辨識編碼：3之胺基酸序列所組成之多胜肽。與序列辨識編碼：1之胺基酸序列比較，該序列辦編碼：2之胺基酸序列含有3個經取代胺基酸。與該序列辨識編碼：1之胺基酸序列比較，該序列辨識編碼：3之胺基酸序列含有10個經取代胺基酸。該序列辨識編碼：2之胺基酸序列相當於得自卵形類桿菌(Bacteroides ovatus )E-23-15菌株(FERM BP-6435)之E1酵素多胜肽。該序列辨識編碼：3之胺基酸序列相當於得自星狀鏈球菌(Streptococcus constellatus )A6G-225(FERM BP-6437)之E1酵素多胜肽。
此外，(Ab)多胜肽中之胺基酸取代類型並未特別受限。然而，就預防該多胜肽中之表型變化而言，較佳在類似的胺基酸之間進行取代。類似的胺基酸可如下分類。
芳香族胺基酸：Phe、Trp、Tyr
脂肪施胺基酸：Ala、Leu、Ile、Val
極性胺基酸：Gln、Asn
鹼性胺基酸：Lys、Arg、His
酸性胺基酸：Glu、Asp
具有羥基之胺基酸：Ser、Thr
具有短側鏈之胺基酸：Gly、Ala、Ser、Thr、Met
在(Ab)多胜肽中，該胺基酸取代、刪除、插入或加成反應較佳在其中該胺基酸變化對該多胜肽之較高序結構並無大影響或該變化不會不利地影響該二氫大豆黃酮合成酵素之活性中心的區域進行。此等區域之實例包括在該等序列辨識編碼：1、2、及3之胺基酸序列中之低保留區域及其鄰近區域、與N-末端區域或C-末端區域。特定實例包括在序列辨識編碼：1之胺基酸序列中之位置45之白胺酸、在位置80之天冬醯胺酸、在位置167之纈胺酸、在位置231之天冬胺酸、在位置233之異白胺酸、在位置435之精胺酸、在位置459之天冬胺酸、在位置462之纈胺酸、在位置528之精胺酸、在位置540之絲胺酸、在位置639之異白胺酸、及具有這些胺基酸之鄰近區域。該“鄰近區域”意指其中該二氫大豆黃酮合成酵素活性並未受影響之區域。實例包括在得自所例示胺基酸之一的5個胺基酸內之區域、較佳為在得自所例示胺基酸之一的4個胺基酸內之區域、更佳為在得自所例示胺基酸之一的3個胺基酸內之區域、又更佳為在得自所例示胺基酸之一的2個胺基酸內之區域、更特佳為在得自所例示胺基酸之一的1個胺基酸內之區域。
在該序列辨識編碼：1之胺基酸序列中，於位置112至116之該等胺基酸的序列被視為相當於NADPH結合域。只要該NADPH結合域之機能未受抑制，則在具有這5個胺基酸之序列內，胺基酸可能發生取代、刪除、插入或加成反應。在該序列中，經突變胺基酸數較佳不超過3、更佳不超過2、又更佳為1。最佳在該胺基酸序列中不發生突變。更詳細地，於位置112、115、及116之胺基酸較佳無取代、刪除、插入或加成反應。
在該序列辨識編碼：1之胺基酸序列中，於位置173至175之胺基酸的序列被視為相當的質子分程傳遞部位(proton relay site)。只要E1多胜肽具有二氫大豆黃酮活性，則在該序列中之胺基酸可能發生取代、刪除、插入或加成反應。當該序列具有一或多個胺基酸取代反應時，較佳為於位置173之半胱胺酸經麩酸取代、於位置174之甘胺酸經另一任意胺基酸取代、且於位置175之纈胺酸經酪胺酸取代。更佳為在該胺基酸序列中無胺基酸取代、刪除、插入或加成反應。
在該序列辨識編碼：1之胺基酸序列中之位置260的組胺酸亦被視為與該質子分程傳遞部位相關。因此，只要質子分程傳遞部份之機能未受抑制，則該組胺酸可經另一胺基酸取代，但較佳未經取代。
在該序列辨識編碼：1之胺基酸序列中，於位置343至363之胺基酸的序列被視為相當於Fe-S簇集性模序(cluster motif)。只要該模序之機能未受抑制，則在該序列中之一任意胺基酸可能發生取代、刪除、插入或加成反應。然而於位置343、346、350、及363之半胱胺酸較佳未突變。當該序列於不同於這3個胺基酸之位置具有一或多個胺基酸取代反應時，該等經取代胺基酸數較佳不超過4、更佳不超過3、又更佳不超過2、且更特佳為1。在該序列中最佳無胺基酸取代、刪除、插入或加成反應。
在該序列辨識編碼：1之胺基酸序列中，於位置390至413之胺基酸的序列被視為相當的FAD結合域。因此只要該域之機能未受抑制，則在該序列中之一任意胺基酸可能發生取代、刪除、插入或加成反應。然而於位置390、392、及395之甘胺酸較佳未經突變。當該序列具有一或多個胺基酸取代、刪除、插入或加成反應，則該等經突變胺基酸數較佳不超過4、更佳不超過3、又更佳不超過2、且更特佳為1。在該胺基酸序列中最佳無突變。
在該序列辨識編碼：1之胺基酸序列中，於位置512至540之胺基酸的序列亦被視為該FAD結合域。因此，只要該域之機能未受膠，在該序列中之一任意胺基酸可能發生取代、刪除、插入或加成反應。然而於位置512、514、及517之甘胺酸較佳未經突變。當該序列具有一或多個胺基酸取代、刪除、插入或加成反應，該等經突變胺基酸數較佳不超過4、更佳不超過3、又更佳不超過2、且更特佳為1。在該胺基酸序列中最佳無突變。序列辨識編碼：1、2及3之胺基酸序列的排列係示於第27圖中。該排列表示具有如上述之合適機能的區域。
在一特定胺基酸序列中之一或幾個胺基酸的取代、刪除、插入或加成反應係藉已知技術而進行。
在(Ac)多胜肽中，該胺基酸序列與序列辨識編碼：1之胺基酸序列的同一性為，例如60%或更高。然而，最好該胺基酸序列與序列辨識編碼：1之胺基酸序列的同一性通常為80%或更高、較佳85%或更高、更佳90%或更高、又較佳95%或更高、又更佳98%或更高、且更特佳99%或更高。
更明確地，(Ac)多胜肽可以是一由序列辨識編碼：2之胺基酸序列所組成之多胜肽、或一由序列辨識編碼：3之胺基酸序列所組成之多胜肽。該序列辨識編碼：1之胺基酸序列與序列辨識編碼：2之胺基酸序列的胺基酸同一性為99.5%(Blast 2)。該序列辨識編碼：1之胺基酸序列與序列辨識編碼：3之胺基酸序列的胺基酸同一性為98.6%(Blast 2)。因此，在本發明之一較佳實施例中，(Ac)多胜肽包含一與該序列辨識編碼：1之胺基酸序列的同一性為98.6%或更高且更佳99.5%之胺基酸序列。
可使用分析方法，諸如FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH，或市售或經由電信線路(網際網路)而獲得之其它軟體種類以計算該胺基酸序列之同一性。更詳細地，通常在以下初條件下進行BLAST查詢以計算該胺基酸序列之同一性(%)。
高級BLAST 2.1：
程式：blastp
預測值：10
濾器：全部關閉
基質：BLOSUM62
隙存在損失(Gap existence cost)：11(預設)
每一殘基隙損失(Per residue gap cost)：1(預設)
λ比(Lambda ratio)：0.85(預設)
其它參數(預設)
就多胜肽(Ab)及(Ac)而言，可如下確認該使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性。首先，添加相關多胜肽至濃度低於0.001毫克/毫升之該組成物的受質溶液內。然後於37℃下培育該溶液，費時2小時以檢查該溶液中二氫大豆黃酮之存在或不存在。培育後，該溶液中二氫大豆黃酮之存在係作為該多胜肽使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性的指標。
受質溶液之組成物
0.1M磷酸鉀緩衝劑
1mM PMSF(苯基甲基磺醯氯)
2mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol)
5mM NADPH或NADH
40μM大豆黃酮
pH 7.0
酵素性質
由於E1多胜肽具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之酵素活性，所以E1多胜肽亦稱為E1酵素。E1酵素係藉還原劑，諸如Na2 S2 O4 、及金屬離子，諸如Fe2+ 及Mn2+ 之存在而活化。此外，E1酵素需要NADPH及NADH作為輔酵素。該E1酵素之最佳溫度接近30℃，且最佳pH為7.0。E1酵素亦可自二氫大豆黃酮合成大豆黃酮。
可藉稍後描述之基因工程技術或藉自可產生E1多胜肽之微生物進行離析及純化而製備該E1多胜肽。此外，根據序列辨識編碼：1、2或3之胺基酸序列的資料，可使用一般化學合成方法以製備E1多胜肽。此等化學合成方法包括一般液相或固相胜肽合成方法。
下文描述一種自可產生E1多胜肽之微生物進行該E1多胜肽之離析及純化的方法。首先，係破壞可產生E1多胜肽之微生物的細胞以獲得該微生物之粗製萃取物。在這一點上，可藉用於一般細胞破裂程序之方法，諸如使用法蘭奇(French)方法、細胞磨機、及其它破壞機以進行破壞、及在低滲壓溶液內進行超音波處理而破壞該等細胞。該粗製萃取物可經合適緩衝劑增補。當E1多胜肽經厭氣性調整時，較佳添加合適還原劑至該粗製萃取物以保持該E1多胜肽活性。為了改善純度，可進一步藉以下方法，諸如硫酸銨沈澱作用、使用乙醇等進行之有機溶劑沈澱作用、及等電沈澱作用，而純化該粗製萃取物。然後可藉使該粗製萃取物進行以下方法。諸如離子交換層析法、凝膠過濾層析法、疏水層析法、各種親和力層析法、逆相層析法、及羥基磷灰石柱式層析法，而獲得含E1多胜肽之溶離份。這些層析法可使用空心柱或若必要可使用HPLC。可輕易地藉經由電泳且特別為經由SDS-PAGE之視算法而估計該含E1多胜肽之溶離份的純度。亦可藉，例如胺基酸序列之分析、使用質譜儀，諸如MALDI-TOF MS、ESI Q-TOF MS、及MALDI Q-TOF MS之質譜測定法、及胜肽質量指紋圖而確認E1多胜肽。
在這一點上，就有效率地製備E1多胜肽而言，較佳在含所欲量之大豆黃酮之培養基(例如但不限於含至少0.01微克/毫升大豆黃酮之培養基內培養該可產生E1多胜肽之微生物。
E1多胜肽可具單體性或二聚合性或聚合性，其限制條件為可合成二氫大豆黃酮。此外，為了改善安定性及其它特性，若必要可藉添加聚乙二醇或糖鏈而修飾E1多胜肽。
E1多胜肽可作為能使大豆黃酮(受質)轉化成二氫大豆黃酮之觸媒。可藉如下述之四氫大豆黃酮合成酵素及雌馬酚合成酵素而進一步使二氫大豆黃酮轉化成雌馬酚。咸信雌馬酚在體內具有各種生理活性。關於這點，可提供用於雌馬酚合成之物質的E1多胜肽被認為具重要性。
A-2.多核苷酸
本發明亦提供一可將具有使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性的多胜肽編碼之多核苷酸(下文亦稱為“E1多核苷酸”)。更明確地，本發明提供：(Ad)一由序列辨識編號：4之核苷酸序列所組成之多核苷酸；(Ae)一可將由該序列辨識編號：1之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Af)一在嚴苛條件下可使用該多核苷酸(Ad)或(Ae)之互補鏈進行雜交且可將具有使用大豆黃酮作為基質以合成二氫大豆黃酮之活性的多胜肽編碼之多核苷酸。
該序列辨識編碼：1之胺基酸序列相當於該藉序列辨識編碼：4之核苷酸序列而編碼之胺基酸序列。該序列辨識編碼：2之胺基酸序列相當於該藉序列辨識編碼：5之核苷酸序列而編碼之胺基酸序列。該序列辨識編碼：3之胺基酸序列相當於該藉序列辨識編碼：6之核苷酸序列而編碼之胺基酸序列。
就多核苷酸(Af)而言，該短語“在嚴苛條件下進行雜交反應”描述在如藉Sambrook等人在Molecular Cloning：A laboratory Manual(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA)中所述之一般雜交條件下，使兩多核苷酸片段進行雜交反應。更明確地，“嚴苛條件”意指於約45℃下在6.0×SSC中進行雜交反應並於50℃下以2.0×SSC進行清洗。(Af)多核苷酸之實例包括該序列辨識編碼：5之核苷酸序列及序列辨識編碼：6之核苷酸序列。
該“在嚴苛條件下可雜交之多核苷酸”與作為探針之該多核苷酸的核苷酸序列之同一性通常高於一定的程度。該同一性為，例如60%或更高、較佳70%或更高、更佳80%或更高、又較佳90%或更高、又更佳95%或更高、且更特佳98%或更高。可使用分析方法，諸如FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH、或市售或經由電信線路(網際網路)而獲得之其它軟體種類以計算該核苷酸序列之同一性。更詳細地，通常在以下初條件下進行BLAST查詢以計算該核苷酸序列之同一性(%)。
高級BLAST 2.1：
程式：blastn
參數：預設
該序列辨識編碼：4之核苷酸序列與序列辨識編碼：5之核苷酸序列的鹼基序列同源性為99.6%(Blast2)。該序列辨識編碼：4之核苷酸序列與序列辨識編碼：6之核苷酸序列的鹼基序列同源性為97.6(Blast2)。因此，在本發明一較佳實施例中，多核苷酸(Af)之鹼基序列與該序列辨識編碼：4之鹼基序列的同源性為97.6%且更佳為99.6%。
就多核苷酸(Af)而言，該“可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性”可藉該用於多胜肽(Ab)及(Ac)之方法而確認。
可根據序列辨識編碼：4、5、及6之序列信息，藉化學DNA合成法而製備或獲得E1多核苷酸。一般而言，可輕易藉常用基因工程技術(見，例如M olecular Cloning第2版，Cold Spring Harbor Lab. Press(1989)：及Zoku Seikagaku Jikken Kouza,Gene Kennkyu-hou I、II、III，the Japanese Biochemical Society(1986))而製備或獲得E1多核苷酸。
此等化學DNA合成法之一實例為使用亞磷胺方法之固相合成法，其可使用自體合成劑。
在常用基因工程技術之一特定實例中，係藉常用方法自可表現E1多核苷酸之合適來源製備cDNA基因庫，且使用對E1多核苷酸具專一性之合適探針或抗體以篩選該基因庫之所欲株系(見，例如Proc. Natl. Acad. Sci.,USA.,78,6613(1981)；Science,222,778(1983))。
該cDNA來源並未特別受限，但其限制條件為其係為一可表現E1多核苷酸之有機體。其特定實例包括可產生雌馬酚之微生物、較佳為可產生雌馬酚之屬於類桿菌屬及鏈球菌屬之細菌、更佳為可產生雌馬酚之格氏乳酸球菌(Lactococcus garvieae )、又較佳為可產生雌馬酚之糞便格氏乳酸球菌、卵形類桿菌、中間鏈球菌(Streptcoccus intermedius )、及星狀鏈球菌、且更特佳為可產生雌馬酚之乳酸球菌屬20-92菌株、卵形類桿菌屬E-23-15菌株、星狀鏈球菌A6G-225(分別為FERM BP-10036、FERM BP-6435、及FERM BP-6437；其等係經the International Patent Organism Depositary,National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,1-1-1 Higashi,Tsukuba,Ibaraki,Japan寄存)、糞便格氏乳酸球菌屬之菌株。
可使用常用方法以進行包括以下之程序：總RNA之分離、mRNA之分離與純化、及cDNA之製備與選殖。篩選該cDNA基因庫之本發明多核苷酸的方法並未特別受限，且可使用一種常用方法。例如可藉使用多胜肽專一性抗體所進行之免疫學篩選以選擇相應的cDNA株系而篩選自cDNA所產生之多胜肽。而且，可藉使用專一性結合至目標核苷酸序列之探針的雜交技術，諸如噬菌斑雜交反應及菌落雜交反應。此外，可使用這些不同技術之組合。
一般而言，該探針可以是，例如可根據關於E1多核苷酸之核苷酸序列(例如該序列辨識編碼：4、5或6之核苷酸序列)之信息所獲得之化學合成型DNA。此外，該用於篩選之探針可以是根據本發明之一多核苷酸之鹼基序列的信息所設計的訊息引子及/或反訊息引子。
最好可藉PCR方法(Science,130,1350(1985))或藉該PCR方法之變異。諸如DNA或RNA擴增方法而獲得E1多核苷酸。可藉使用合適技術，諸如RACE方法(Rapid amplification of cDNA ends,Experimental Medicine,12(6),35(1994))、及特別為5’-RACE方法(M.A. Frohman，等人，Proc. Natl. Acad. Sci.,USA.,8,8998(1988))而克服篩選該基因庫之全長cDNA的任何困難。該Race方法及5’-RACE方法適用於自真核細胞獲得E1多胜肽。
最好可根據E1多核苷酸之序列信息以設計該等用於PCR方法之引子。可藉常用方法而合成此等引子。如上述，可藉常用方法，諸如凝膠電泳及雜交反應而進行經擴增DNA或RNA片段之離析及純化。
使用常用基因工程技術，E1多核苷酸可輕易地大量並安定地製備該多核苷酸產物(該多胜肽)。不需要使用習用於雌馬酚製備之難以處理的厭氣菌菌株，藉本發明而成功地離析E1多核苷酸可提供用於雌馬酚之工業製備的方法。
A-3.表現性載體
本發明之表現性載體並未特別受限，但其限制條件為必需包括E1多核苷酸且可表現E1多核苷酸。一般而言，最好根據宿主細胞之類型而選擇。
當該宿主細胞為原核性細胞時，該表現性載體可以是，例如藉添加該多核苷酸上游之啟動子及一SD(Shine-Dalgarno)鹼基序列以導致該多核苷酸之表現性而製成之可在該宿主細胞內複製的表現性質體載體。一特定實例為使用PL 啟動子、T7啟動子、及lac啟動子之表現性質體。較佳之細菌表現性載體的其它實例包括使用tac啟動子或trc啟動子之質體pKK233-2及質體pKK233-3。這些為非限制性實例，且亦可使用其它已知細菌菌株及載體。
當該宿主細胞為真核性細胞時，該表現性載體可通常包括欲經表現之該多核苷酸上游的啟動子、及其它專一性序列，其包括一RNA接合部位、一聚腺苷酸化反應部位、及轉錄終止序列。該表現性載體可進一步包括複製起源。有許多適用於該多核苷酸之插入的已為吾人所熟知之真核性載體。此等合適的真核性載體之實例包括pCD及pCMV。其它實例包括若必要可利用MMTV或SV40最近的啟動子之pMSG及pSVL。有非限制性實例，且亦可使用各種已知原核細胞。
A-4.重組細胞
本發明提供一經表現性載體(其包括E1多核苷酸)轉形之重組細胞(轉形體)。
用於該重組細胞之宿主細胞可以是原核性細胞或真核性細胞。
原核性宿主細胞之合適實例包括：乳酸球菌屬，諸如乳酸菌之細菌原核性細胞；及可在需氧條件下成長之細菌原核性細胞，諸如大腸桿菌(Escherichia coli )、鏈黴菌屬(Strept omyces )、枯草桿菌(Bacillussubtilis )、鏈球菌屬(Streptococcus )、及葡萄球菌屬(Staphylococcus )。
真核性宿主細胞之實例包括：真核性微生物，諸如酵母菌及麴菌屬(Aspergillus )；昆蟲細胞，諸如蜂蠅屬(Drosophila )S2及夜蛾(Spodoptera )Sf9；及動物與植物細胞，諸如L細胞，CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、BALB/c3T3細胞(其包括缺乏二氫葉酸還原酶或胸腺核苷激酶之突變體菌株)、BHK21細胞、HEK293細胞、鮑滋(Bowes)黑色瘤細胞、及卵母細胞。
用以將該表現性載體導入宿主細胞內之方法並未特別受限且可使用多種常用方法。例如可根據許多標準實驗室手冊之方法，其包括，例如Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology, 1986、及Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989以將該表現性載體導入宿主細胞內。特定實例包括磷酸鈣轉移感染、經DEAE-葡萄聚糖媒介之轉移感染、基因轉應作用(transvection)、微量注射法、經陽離子性脂質媒介之轉移感染、電子穿孔法、轉導、刮削負載(scrape loading)、彈道式導入法、及感染。
由於該重組細胞可產生E1多胜肽(其係為一種二氫大豆黃酮轉化酵素)，所以其可用以製備二氫大豆黃酮轉化酵素。該重組細胞亦可用以製備呈細胞形式之二氫大豆黃酮。
A-5.使用重組細胞以製備多胜肽之方法
可藉培養E1多核苷酸所導入之重組細胞並自該細胞及培育物收集E1多胜肽。
該培養物可以是使用適於宿主之合適培育基的繼代培養物或批次培養物。使用該等重組細胞之內部及外部之E1多胜肽的含量作為指數，可培養該等細胞，直到獲得合適數量之E1多胜肽為止。
可根據所使用宿主類型，自常用培養基適當地選擇該培養基。可在適於該宿主細胞之合適生長條件下培育該培養物。
可利用E1多胜肽之物理及化學性質，藉各種分離技術而選擇性地分離並純化所形成E1胜肽(見，例如Biochemistry Data Book II,pp. 1175-1259,1st ed.,1st print,June 23,1980,Tokyo Kagaku Dozin Co.,Ltd.;Biochemistry,25(25),8274(1986)；及Eur. J. Biochem.,163,313(1987))。更明確地，可藉例如如在標題“多胜肽”之段落A-1中所述之“用於自可產生E1多胜肽之微生物進行E1多胜肽之離析及純化的方法”而分離並純化E1多胜肽。
A-6.使用E1多胜肽製備二氫大豆黃酮之方法
本發明提供一種使用E1多胜肽以製備二氫大豆黃酮之方法。在該製法中，可在NADPH及/或NADH存在下藉使E1多胜肽對大豆黃酮作用而使該大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮。較佳可在NADPH存在下藉使E1多胜肽對大豆黃酮作用而使該大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮。
由於E1多胜肽之該二氫大豆黃酮合成酵素活性係藉Mn2+ 及Fe2+ 存在而活化，所以E1胜肽較佳可以在Mn2+ 及/或Fe2+ 存在下，使E1多胜肽對大豆黃酮作用。該反應溶液中之Mn2+ 及/或Fe2+ 濃度並未特別受限，但其限制條件為該E1多胜肽之酵素活性可經活化，該Fe2+ 之濃度較佳為2mM或更高、更佳為2mM至100mM、更佳為10mM至40mM。該Mn2+ 之濃度較佳為0.2μM或更高、更佳為0.2μM至100μM且又更佳為1.0μM至40mM。
可在合適緩衝劑中進行用於該製法之反應。此等合適緩衝劑之實例包括磷酸鹽緩衝劑、碳酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、Tris緩衝劑、及硼酸鹽緩衝劑。最好選擇不會使該E1多胜肽之所欲酵素活性失活之反應的pH條件。例如可在較佳5.0至10.0且更佳6.0至8.0之pH範圍內進行該反應。
在該反應中，若必要可添加合適量之蛋白酶抑制劑，諸如PMSF或EDTA。此外，考慮到該等得自厭氣菌之多胜肽衍生物，亦可添加合適量之還原劑，諸如DTT、2ME、DET、及Na2S2O4 。
在，例如可以於該反應開始時，添加下示濃度範圍之各組份於培養基內以製備混合物的條件下，進行用於該製法之反應。於20至45℃、較佳25至40℃且更佳30至38℃之溫度下，培育該混合物，費時0.5至10小時、較佳1至6小時、且更佳2至4小時。各組份之初濃度如下：該多胜肽含量為0.0001至1.0重量%、較佳0.001至0.1重量%、且更佳0.001至0.01重量%；該大豆黃酮含量為0.0001至10.0重量%、較佳0.001至1.0重量%、且更佳0.001至0.1重量%；該NADPH及/或NADH含量為0.01至5重量%、較佳0,05至1重量%、且更佳0.1至0.5重量%。
本發明亦提供一用於合成二氫大豆黃酮之物質混合物、更明確地，一用於合成二氫大豆黃酮之組成物，其包括(Ai)E1多胜肽、(Aii)NADPH 及/或 NADH、及(Aiii)大豆黃酮之二氫大豆黃酮的組成物。此外，本發明提供一用於合成二氫大豆黃酮之物質混合物、更明確地，一包括(Ai)E1多胜肽、(Aii)NADPH 及/或 NADH、(Aiii)大豆黃酮、及(Aiv)Mn2+ 及/或Fe2+ 之二氫大豆黃酮合成物質組成物。經由在上述條件下培育該組成物，可以使該組成物所包含之大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮。該合成物質組成物相當於用於引發該產生二氫大豆黃酮之反應的上述物質混合物。此外，該組成物內之E1多胜肽、NADPH及/或NADH的濃度、及可添加至該合成起始物質組成物之其它組份本質上與用於上述製法之反應系統(一於反應開始時之起始物質的混合物)相同。
本發明亦提供一用於合成二氫大豆黃酮之套組，更明確地，一包括(Ai)E1多胜肽、(Aii)NADPH 及/或NADH、及(Aiii)大豆黃酮之二氫大豆黃酮合成套組。另外，本發明提供一用於合成二氫大豆黃酮之套組、更明確地，一包括(Ai)E1多胜肽、(Aii)NADPH及/或NADH、(Aiii)大豆黃酮、及(Aiv)Mn2+ 及/或Fe2+ 之二氫大豆黃酮合成套組。可選擇性將該等組份各別貯存在該合成套組內以方便地在前述條件下，自大豆黃酮合成二氫大豆黃酮。若必要該合成套組可進一步包括緩衝劑。該合成套組亦可包括有助於進行二氫大豆黃酮合成之任何必需工具或操作手冊。
A-7.二氫大豆黃酮合成酵素組成物
本發明亦提供一包括E1多胜肽之二氫大豆黃酮合成酵素組成物。該酵素組成物可合適地作為該使用E1多胜肽以製備二氫大豆黃酮之方法中的二氫大豆黃酮合成酵素。
該酵素組成物可以是一粗純化E1多胜肽、或該酵素組成物可以是一經合適載劑調配之粗純化或純化E1多胜肽。
該酵素組成物中之E1多胜肽的比例並未特別受限，但其限制條件為該組成物可作為該二氫大豆黃酮之製法中的二氫大豆黃酮合成酵素。更明確地，相對於該酵素組成物之總重，該E1多胜肽含量為，例如0.001至20.0重量%、較佳0.005至5.0重量%、且更佳0.01至1.0重量%。
該酵素組成物可包括NADPH及/或NADH，其等可作為E1多胜肽之輔酵素。當包含在該酵素組成物內時，NADPH及/或NADH之比例雖然並未特別受限，但是相對於該酵素組成物之總重，其等之含量為0.0005至25.0重量%、較佳0.005至5.0重量%、且更佳0.01至2.5重量%。
而且，在一較佳實施例中，該酵素組成物可包括Mn2+ 及/或Fe2+ 。當包含在該酵素組成物內時，Mn2+ 及/或Fe2+ 之比例並未特別受限，但其限制條件為該E1多胜肽之二氫大豆黃酮合成酵素活性可經活化。相對於該組成物之總重，該Fe2+ 之比例較佳為2mM或更高、更佳為2mM至100mM、且甚至更佳為10mM至40mM。相對於該組成物之總重，該Mn2+ 之比例較佳為0.2μM或更高、更佳為0.2μM至100mM、且甚至更佳為1.0μM至40mM。
為了改善該多胜肽之安定性除了E1多胜肽外該酵素組成物可進一步包括抗氧化劑，諸如亞硫酸鹽、抗壞血酸、α-生育酚、及半胱胺酸。此外，為了確保該酵素組成物之保藏性，若必要，該酵素組成物可包括防腐劑，諸如對-羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苄醇、2-苯基乙醇、去氫乙酸、及山梨酸。
A-8.使用重組細胞以製備二氫大豆黃酮之製法
本發明提供一種使用包括E1多核苷酸之重組細胞以製備二氫大豆黃酮之製法。更明確地，在該製法中，係藉使該重組細胞對大豆黃酮作用而使該大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮。
用於該製法中之反應係在可以使該重組細胞存活並使大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮之條件下進行。
更明確地，係添加合適量之重組細胞及大豆黃酮並在可以使該等重組細胞生長之培養基內進行培養。
根據作為該宿主重組細胞之細胞類型，用於該製法中之培養基最好選自各種習知培養基。
若必要，該培養基可經合適量之蛋白酶抑制劑，諸如PMSF及EDTA增補。此外，就得自厭氣菌之該等多胜肽衍生物而言，亦可添加合適量之還原劑，諸如DTT、2ME、DET、及Na2 S2 O4 。雖然非必要，但是當使用該重組細胞時，該培養基可經NADPH及/或NADH增補。而且，該培養基可經Mn2+ 及/或Fe2+ 增補。
更明確地，該製法之進行步驟如下。首先，係在含0.001至1重量%、較佳0.01至1重量%且更佳0.01至0.5重量%大豆黃酮之培養基內接種該等重組細胞，並在非強制性溫度條件下培育該培養物，費時6至30小時、較佳7至24小時、且更佳7至18小時。
本發明亦提供一用於合成二氫大豆黃酮之物質混合物，更明顯地，一含有(Aiv)該重組細胞及(Aiii)大豆黃酮之二氫大豆黃酮合成物質組成物。經由在上述條件下培養該合成物質組成物，該組成物內之大豆黃酮可轉化成二氫大豆黃酮。該組成物相當於用以引發該產生二氫大豆黃酮之反應的上述起始物質混合物。此外，該組成物中之重組細胞及大豆黃酮的濃度、及可添加至該合成起始物質組成物之其它組份本質上與用於前述製法中之條件相同。
本發明亦提供一用於合成二氫大豆黃酮之套組，更明確地，一包括(Aiv)該重組細胞及(Aiii)大豆黃酮之二氫大豆黃酮合成套組。另外，本發明提供一用於合成二氫大豆黃酮之套組，更明確地，一包括(Aiv)該重組細胞、(Aiii)大豆黃酮、及(Aiv)Mn2+ 及/或Fe2+ 之二氫大豆黃酮合成套組。若必要，該合成套組可各別包括該重組細胞及大豆黃酮以方便地在上述條件下自大豆黃酮合成二氫大豆黃酮。若必要，該合成套組可進一步包括緩衝劑或培養基。該合成套組亦可包括有助於進行二氫大豆黃酮合成之任何必需工具或操作手冊。
可藉已知方法而保存該合成套組所包含之重組細胞。有許多已知重組細胞保藏技術。例如有一種方法，其中係在經未凍乾器處置以排空貯存該等重組細胞在溶劑(諸如二甲基甲醯胺)中之溶液的安瓿後，於4至25℃下保存該等重組細胞。另一實例為液態氮方法，其中係使該等細胞懸浮在一經10%甘油增補之保藏培養基內，然後貯存在特定安瓿中並保持在液態氮槽內(於-150至-196℃)。
A-9.對該多胜肽具有親和力之抗體
本發明亦提供一對E1多胜肽具有親和力之抗體(IgG抗體)。
可藉常用方法而製備單株抗體，更明確地，可使用藉Harlow,H.及Lane,D.在Antibody:Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.,New York,pp. 139-240(1988)中所述之方法。
亦可藉常用方法而製備多株抗體。更明確地，可使用，例如Cell Engineering Experiment Protocol,Department of Oncology,The Institute of Medical Science,The University of Tokyo,1992,pp. 155-173中所述之方法。
可藉常用方法，諸如硫酸銨沈澱法、及蛋白質A層析法而純化該多株IgG抗體及單株IgG抗體。
A-10.用於檢測或測定該多胜肽之免疫學方法
本發明亦提供一使用該抗體以檢測或測定E1多胜肽之免疫學方法。明確地，係藉使該抗體接觸試驗試樣而進行該免疫學方法。更明確地，該試驗試樣中之多胜肽的檢測或測定步驟如下。首先，使該抗體接觸試驗試樣以檢查該試驗試樣中E1多胜肽之存在。若存在，則該抗體可專一性結合至E1多胜肽。接著，檢測該與E1多胜肽結合之抗體並可選擇性定量。
文中，該試驗試樣為用於檢測或測定E1多胜肽之試樣。由於已預期E1多胜肽可存在於細菌原核性細胞內，所以該免疫學方法適於檢測並測定存在於細菌原核性細胞中之E1多胜肽。在檢測並測定該細胞中之E1多胜肽時，可自己破壞之細胞或破壞後已進行蛋白質純化之細胞製備該試驗試樣。
藉該使用抗體之免疫學方法而檢測或測定標靶多胜肽的技術係已知且熟練的技術人員可輕易地適當設定適於該免疫學方法之各種條件。例如可在合適設定之條件下使用，諸如放射免疫測定法及ELISA。
本發明亦提供一用於檢測或測定E1多胜肽之包括該抗體的免疫檢測套組。若必要，該檢測套組亦可包括標準E1多胜肽。若必要，該檢測套組可進一步包括能在前述條件下促進E1多胜肽之容易檢測的另外試劑。該檢測套組亦可包括使E1多胜肽檢測變得更容易之任何必需工具或操作手冊。
A-11.用於檢測或測定可將該多胜肽編碼之多核苷酸的方法
本發明亦提供一種用於檢測或測定E1多核苷酸之方法。明確地，該方法係藉使一E1多核苷酸結合性探針接觸試驗試樣而進行。更詳細地，該試驗試樣中之E1多核苷酸的檢測或測定步驟如下。首先，當E1多核苷酸存在於試驗試樣中，使該探針接觸該試驗試樣以與該試驗試樣進行雜交反應。然後，檢測該雙股之存在或不存在，若存在，可選擇性定量。
文中，該試驗試樣為用於檢測或測定E1多核苷酸之試樣。由於已預期E1多核苷酸存在於細菌原核性細胞中，所以該方法適於檢測並測定存在於細菌原核性細胞內之E1多核苷酸。在檢測並測定該細胞內之E1多核苷酸時，可自經破壞之細胞或破壞後已進行核酸純化之細胞製備該試驗試樣。
用於該方法之探針具有可以在嚴苛條件下與該多核苷酸進行雜交反應之核苷酸序列。如文中使用，“嚴苛條件”描述，例如探針及引子共用之條件，且更明確地，在上文段落A-2中所述之條件。
該探針可根據關於該E1多核苷酸之核苷酸序列(例如序列辨識編碼：4、5或6之核苷酸序列)而化學性合成、或可以是先前製成之E1多核苷酸或E1多核苷酸片段。該探針可經標記或未經標記，但是通常使用標記探針。此外，當該探針係作為PCR引子(一種訊息引子或反訊息引子)時，該探針長度為，例如約10至40個核苷酸、且較佳約20至30個核苷酸。
可專一性檢測該多核苷酸之方法實例包括：噬菌斑雜交反應、菌落雜交反應、南方墨點法(Southern blotting)、北方墨點法(Northern blot)、及PCR方法。就靈敏度之觀點而言，較佳使用利用該等探針作為引子以擴增部份或所有E1多核苷酸之PCR方法。
該PCR方法可以是，例如RT-PCR方法或用於本項技藝之變異方法的各種類型。該PCR方法可用以測定E1多核苷酸之存在及數量。此等PCR方法之實例包括競爭性測定法，諸如MSSA(Kinoshita,M.,等人，CCA,228,83-90(1994))、及PCR-SSCP方法，其係為根據由於不同更高序結構而導致單股DNA之移動性改變以檢測突變的已知方法(Orita,M.,等人，Genomics,5,874-879(1989))。
本發明亦提供一用於檢測或測定E1多核苷酸之套組，更明確地，一包括該探針之E1多核苷酸檢測套組。為便於在上述條件下進行多核苷酸檢測，若必要，除了該探針外，該檢測套組可包括另外試劑等。此外，該檢測套組可用以鑑定含E1多核苷酸之細胞。自可精確地進行檢測之觀點而言，該檢測套組較佳可以以適於使用PCR進行檢測之套組形式提供。
B.四氫大豆黃酮合成酵素 B-1.多胜肽
本發明提供一用於使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之多胜肽(下文亦稱為“E2多胜肽”)。更明確地，本發明提供：(Ba)一由序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成的多胜肽；(Bb)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：7的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性；及(Bc)一由與序列辨識編號：7之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。
在多胜肽(Bb)中，該“一或多個胺基酸”並未特別受限，但其限制條件為該多胜肽具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。例如該範圍為自1至50個、較佳為1至30個、更佳為1至15個、更佳為1至5個、又較佳為1至4個、又更佳為1至3個、且更特佳為1或2個。
(Bb)多胜肽之實例包括一由序列辨識編碼：8之胺基酸序列所組成之多胜肽及一由序列辨識編碼：9之胺基酸序列所組成之多胜肽。與序列辨識編碼：7之胺基酸序列比較，該序列辨識編碼：8之胺基酸序列含有兩個經取代胺基酸及一於N末端具有24個胺基酸之胺基酸序列。與序列辨識編碼：7之胺基酸序列比較，該序列辨識編碼：9之胺基酸序列含有20個經取代胺基酸並損失一個胺基酸。該序列辨識編碼：8之胺基酸序列相當於得自卵形類桿菌E-23-15菌株(FERM BP-6345)之E2酵素多胜肽。該序列辨識編碼：9之胺基酸序列相當於得自星狀鏈球菌A6G-225(FERM BP-6437)之E2酵素多胜肽。
在(Bb)多胜肽中，該胺基酸取代、刪除、插入或加成反應可如同段落A-1中所述之E1多胜肽的胺基酸取代、刪除、插入或加成反應。該多胜肽(Bb)中之胺基酸取代、刪除、插入或加成反應較佳發生在其中該胺基酸之改變對該多胜肽之較高序結構並沒有大影響之區域或其中該改變不會不利影響四氫大豆黃酮合成酵素之活性中心的區域。此等區域之實例包括序列辨識編碼7、8、及9中之胺基酸序列的低保留區域及彼等之附近、與N-末端區域或C-末端區域。特定實例包括在序列辨識編碼：7之胺基酸序列中的位置7之纈胺酸、於位置8之脯胺酸、於位置26之纈胺酸、於位置36之白胺酸、於位置46之精胺酸、於位置94之天冬胺酸、於位置101之麩胺酸、於位置126之甘胺酸、於位置137之異白胺酸、於位置156之麩醯胺酸、於位置157之離胺酸、於位置159之天冬胺酸、於位置160及171之丙胺酸、於位置185之半胱胺酸、於位置221之絲胺酸、於位置233之丙胺酸、於位置241之纈胺酸、於位置258之絲胺酸、於位置266之異白胺酸、及於位置286之纈胺酸；及這些胺基酸之鄰接區域。該“鄰接區域”意指其中該四氫大豆黃酮合成酵素活性未受影響之區域。該等區域之實例包括在得自所例示胺基酸中任一種之5個胺基酸內的胺基酸、較佳在得自所例示胺基酸中任一種之4個胺基酸內的胺基酸、更佳在得自所例示胺基酸中任一種之3個胺基酸內的胺基酸、又更佳在得自所例示胺基酸中任一種之2個胺基酸內的胺基酸、且更特佳為得自所例示胺基酸中任一種之一個胺基酸。
在該序列辨識編碼：7之胺基酸序列中，於位置38至45之胺基酸序列被視為相當於NADPH結合域。因此，只要該結合域之機能未受抑制，該序列中之任一胺基酸可進行取代、刪除、插入或加成反應。然而較佳為於位置38之蘇胺酸、位置39之甘胺酸、位置43之甘胺酸、及位置45之甘胺酸未突變。當該序列含有一或多個胺基酸取代、刪除、插入或加成反應時，經突變胺基酸數較佳不超過4、更佳不超過3、又更佳不超過2、且最佳為1。
在該序列辨識編碼：7之胺基酸序列中，於位置115及118之胺基酸序列被視為相當於SDR族中經高度保留之模序。當該序列含有一或多個胺基酸取代、刪除、插入或加成反應時，經突變胺基酸數較佳不超過3、更佳不超過2、且又更佳為1。最佳為在該序列中無突變。
在該序列辨識編碼：7之胺基酸序列中，於位置168之絲胺酸、位置182之組胺酸、及於位置186之離胺酸被視為與E2酵素之活性中心相關。因此，只要該酵素活性未受抑制，這3種胺基酸可經其它任意胺基酸取代。然而這3種胺基酸較佳未突變。
在該序列辨識編碼：7之胺基酸序列中，於位置212至217之胺基酸序列被視為與輔因子相關。因此，只要該機能未受抑制，該序列中之任一胺基酸可進行取代、刪除、插入或加成反應。然而較佳為於位置212之脯胺酸、位置213之甘胺酸、及位置217之蘇胺酸未突變。當該序列含有一或多個胺基酸取代、刪除、插入或加成反應時，經突變胺基酸數較佳不超過3、更佳不超過2、且又更佳為1。更特佳為在該序列中無突變。
在多胜肽(Bc)中，該胺基酸序列與序列辨識編碼：7之胺基酸序列的同一性為，例如60%或更高。然而，最好為該胺基酸序列與序列辨識編碼：7之胺基酸序列的同一性通常為80%或更高、又較佳為95%或更高，又更佳為98%或更高、且更特佳為99%或更高。
第28圖表示可顯示具有如上述之可能機能的區域之排列。
更明確地，(Bc)多胜肽可以是一由序列辨識編碼：8之胺基酸所組成之多胜肽或一由序列辨識編碼：9之胺基酸序列所組成之多胜肽。該序列辨識編碼：7之胺基酸序列與序列辨識編碼：8之胺基酸序列的同一性為99.3%(Blast2)。該序列辨識編碼：7之胺基酸序列與序列辨識編碼：9之胺基酸序列的同一性為93.0%(Blast2)。因此，在本發明一較佳實施例中，(Bc)多胜肽包含一與該序列辨識編碼：7之胺基酸序列之同一性為93.0%或更高的胺基酸序列。
就多胜肽(Bb)及(Bc)而言，可如下確認該使用二氫大豆黃酮作為基質以合成四氫大豆黃酮之活性。首先，首以低於0.001毫克/毫升之濃度添加相關多胜肽至該組成物之受質溶液內。然後於37℃下培育該溶液，費時2小時以檢查該溶液內四氫大豆黃酮之存在或不存在。培育後，該溶液內四氫大豆黃酮之存在係作為該多胜肽使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性的指標。
受質溶液之組成物
0.1M磷酸鉀緩衝劑(pH7.0)
1mM PMSF(苯基甲基磺醯氯)
2mM　二硫蘇糖醇
5mM　亞硫酸氫鈉
2mM　NADPH
2mM　NADH
40μM　二氫大豆黃酮
酵素活性
由於E2多胜肽具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之酵素活性，所以E2多胜肽亦稱為E2酵素。E2酵素需要可作為輔酵素之NADPH或NADH。E2酵素之最佳溫度在37℃附近，且最佳pH為4.5。E2酵素亦可自四氫大豆黃酮合成二氫大豆黃酮。
與E1多胜肽類似，可根據序列辨識編碼：10、11或12之核苷酸序列的信息藉基因工程技術而製備E2多胜肽。此外，可根據序列辨識編碼：7、8或9之胺基酸序列的信息，使用常用化學合成方法以製備E2多胜肽。亦可藉使能產生E2多胜肽之微生物進行離析及純化而製備該E2多胜肽。可根據前文段落A-1中之說明文而進行這些方法。
可在含有所欲量之二氫大豆黃酮及附加使用之大豆黃酮之培養基內培養該可產生E2多胜肽的微生物。
E2多胜肽可具單體性或二聚合性或聚合性，但其限制條件為必需可合成四氫大豆黃酮。此外，為了改善安定性及其它特性，若必要可藉添加聚乙二醇或糖鏈而修飾E2多胜肽。
E2多胜肽可作為能將二氫大豆黃酮(受質)轉化成四氫大豆黃酮之觸媒。如下述，藉雌馬酚合成酵素(E3酵素)而進一步將四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚。咸信雌馬酚在體內具有各種生理活性。關於這方面，可提供雌馬酚之起始物質的E2多胜肽被認為具重要性。因此，本發明提供一包括多胜肽(Ba)至(Bc)中任一種的四氫大豆黃酮合成酵素。
B-2.多核苷酸
本發明亦提供一可將具有使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性的多胜肽編碼之多核苷酸(下文亦稱為“E2多核苷酸”)。更明確地，本發明提供：(Bd)一由序列辨識編號：10之核苷酸序列所組成的聚核苷酸；(Be)一可將由該序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成之多胜肽編號的多核苷酸；及(Bf)一可在嚴苛條件下以該多核苷酸(Bd)或(Be)之互補鏈進行雜交反應之多核苷酸，且其可將一具有使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性之多胜肽編碼。
該序列辨識編碼：7之胺基酸序列相當於藉序列辨識編碼：10之核苷酸序列而編碼之胺基酸序列。該序列辨識編碼：8之胺基酸序列相當於藉序列辨識編碼：11之核苷酸序列而編碼之胺基酸序列。該序列辨識編碼：9之胺基酸序列相當於藉序列辨識編碼：12之核苷酸序列而編碼之胺基酸序列。
就多核苷酸(Bf)而言，該短語“可在嚴苛條件下進行雜交反應”與段落A-2中之短語“可在嚴苛條件下進行雜交反應”同義。多核苷酸(Bf)之實例包括該序列辨識編碼：11之核苷酸序列及序列辨識編碼：12之核苷酸序列。該序列辨識編碼：10之核苷酸序列與序列辨識編碼：11之核苷酸序列的鹼基序列同源性為99.7%(Blast 2)。該序列辨識編碼：10之核苷酸序列與序列辨識編碼：12之核苷酸序列的鹼基序列同源性為91.0%(Blast 2)。因此，在本發明一較佳實施例中，多核苷酸(Bf)之鹼基序列與該序列辨識編碼：10之鹼基序列的同源性為91.0%且更佳為99.7%。
就多核苷酸(Bf)而言，可藉用於多胜肽(Bb)及(Bc)之相同方法而確認該“使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性”。
可根據序列辨識編碼：10、11或12之序列信息，藉化學合成方法或基因工程技術而製備或獲得E2多核苷酸。更明確地，可使用段落A-2中所述用於E1多核苷酸之方法。若必要，可修飾或改變該方法。
E2多核苷酸之cDNA來源並未特別受限，但其限制條件為必需是可表現E2多核苷酸之微生物。特定實例包括可產生雌馬酚之微生物、較佳為可產生雌馬酚之屬於類桿菌屬及鏈球菌屬之細菌、更佳為可產生雌馬酚之格氏乳酸球菌、又較佳為可產生雌馬酚之糞便格氏乳酸球菌、卵形類桿菌、中間鏈球菌、及星狀鏈球菌、且更特佳為可產生雌馬酚之乳酸球菌屬20-92菌株、卵形類桿菌屬E-23-15菌株、星狀鏈球菌A6G-225(分別為FERM BP-10036、FERM BP-6435、及FERM BP-6437；其等係經the InternationalPatent Organism Depositary,National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,1-1-1 Higashi,Tsukuba,Ibaraki,Japan寄存)、糞便格氏乳酸球菌屬之菌株。
使用常用基因工程技術表現E2多核苷酸之方法可大量且安定性地製備該多核苷酸產物(該多胜肽)。不需要使用習用於雌馬酚製備之難以處理的厭氣菌菌株，藉本發明而成功地離析E2多核苷酸可提供用於雌馬酚之工業製備的方法。
B -3.表現性載體
本發明之表現性載體並未特別受限，但其限制條件為必需包括E2多核苷酸且可表現E2多核苷酸。一般而言，類似該包括E1多核苷酸之表現性載體，最好根據宿主細胞之類型而選擇表現性載體。更明確地，可使用段落A-3中所述之宿主細胞。
B-4.重組細胞
本發明提供一經包括E2多核苷酸之表現性載體而轉形之重組細胞(轉形體)。用於該重組細胞之宿主細胞可以是段落A-4中所述之宿主細胞，但並未限制。此外，可藉段落A-4所述之方法而將該表現性載體導入該宿主細胞內。
由於該重組細胞可產生E2多胜肽(其係為一種四氫大豆黃酮轉化酵素)，所以其可用以製備四氫大豆黃酮轉化酵素。該重組細胞亦可用以製備呈細胞形式之四氫大豆黃酮。
B-5.使用重組細胞以製備多胜肽之方法
可藉培養重組細胞而製備E2多胜肽，其中係將E2多核苷酸導入並自該細胞及培養物收集E2多胜肽。可根據段落A-5之說明文而培養該等重組細胞。
B-6.使用E2多胜肽以製備四氫大豆黃酮之方法
本發明提供一種使用E2多胜肽以製備四氫大豆黃酮之方法。在該製備中，可在NADPH及/或NADH存在下，藉使E2多胜肽對二氫大豆黃酮作用而使二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮。
可在合適緩衝劑(諸如段落A-6中所述之緩衝劑)中進行用於該製法中之反應。
在可致使，例如各組份於反應開始時以下示之濃度範圍添加至培養基內以製備混合物的條件下，進行用於該製法中之反應。
該E2多胜肽含量為0.0001至1.0重量%、較佳為0.001至0.1重量%且更佳為0.001至0.01重量%。該二氫大豆黃酮含量為0.0001至10.0重量%、較佳為0.001至1.0重量%且更佳為0.001至0.1重量%。該NADPH及/或NADH含量為0.01至5重量%、較佳為0.05至1重量%且更佳為0.1至0.5重量%。
於不會改變該等起始物質，其包括該E2多胜肽與二氫大豆黃酮、及該產物(其包括四氫大豆黃酮)或使其等失活之溫度下培育該混合物，費時0.5至10小時、較佳1至6小時且更佳2至4小時。該反應溫度並未特別受限。例如當該反應溫度為0℃或更低時，該反應可使用，例如不會於此等反應溫度下凍結之緩衝劑。該反應溫度較佳為，例如0至45℃且更佳為0至37℃。就四氫大豆黃酮而言，該化合物可以呈順式或反式存在。然而，可藉改變反應條件，諸如反應溫度及反應時間而控制順式-及反式-構型之形成。例如可藉將該反應溫度設定於0℃下而製備順式-及反式。四氫大豆黃酮之混合物。或可藉將該反應溫度設定於37℃下而控制有利於該反式之反應。
本發明亦提供一用於合成四氫大豆黃酮之物質混合物。更明確地，一包括(Bi)E2多胜肽、(Bii)NADPH及/或NADH、與(Biii)二氫大豆黃酮之四氫大豆黃酮合成物質組成物。藉在上述條件下培育該組成物，可將該合成起始物質組成物所含之二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮。該組成物相當於用以引發該可產生四氫大豆黃酮之反應的上述起始物質混合物。此外，在該組成物內之E2多胜肽、NADPH及/或NADH、及二氫大豆黃酮之濃度、及可添加至該合成起始物質組成物之其它組份本質上與用於上述製法中之反應系統(於反應開始時之起始物質混合物)相同。
本發明亦提供一用於合成四氫大豆黃酮之套組，更詳細地，一包括(Bi)E2多胜肽、(Bii)NADPH 及/或NADH、及(Biii)二氫大豆黃酮之四氫大豆黃酮合成套組。若必要，該合成套組包括在分隔的空間內之組份以方便地在前述條件下自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮。若必要，該合成套組可進一步包括緩衝劑。該合成套組亦可包括有助於進行四氫大豆黃酮合成之任何必需工具或操作手冊。
B-7.四氫大豆黃酮合成酵素組成物
本發明亦提供一包括E2多胜肽之四氫大豆黃酮合成酵素組成物。該酵素組成物可合適地作為該使用E2多胜肽以製備四氫大豆黃酮之方法中的四氫大豆黃酮合成酵素。
該酵素組成物可以是粗純化E2多胜肽，或該酵素組成物可以是經合適載劑調製之粗純化或純化E2多胜肽。該載體對E2多胜肽之活性不具任何不利影響且係以合適量使用。
該酵素組成物中之E2多胜肽的比例並未特別受限，但其限制條件為該組成物可作為四氫大豆黃酮之製法中的四氫大豆黃酮合成酵素。更明確地，相對於該酵素組成物之總重，該E2多胜肽含量為，例如0.001至20.0重量%、較佳為0.005至5.0重量%且更佳為0.01至1.0重量%。
該酵素組成物可包括作為E2多胜肽之輔酵素的NADPH及/或NADH。當包含在該酵素組成物內時，雖然並未特別受限，但是相對於該酵素組成物之總重，該NADPH及/或NADH之比例為0.005至50.0重量%、較佳為0.05至10.0重量%且更佳為0.1至5.0重量%。
為了改善該多胜肽之安定性及/或為了確保該酵素組成物之保藏性，除了E2多胜肽外，該酵素組成物可進一步包括段落A-7中所述之各種抗氧化劑及防腐劑。
B-8.使用重組細胞以製備四氫大豆黃酮之方法
本發明提供一種使用包括E2多核苷酸之重組細胞以製備四氫大豆黃酮之方法。更明確地，在該製法中，係藉使該重組細胞對二氫大豆黃酮作用而使二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮。
在可以使該重組細胞存活並使二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮之條件下進行用於該製法中之反應。
更明確地，係添加合適量之重組細胞及二氫大豆黃酮並在可以使該等重組細胞成長之培養基內進行培養。
根據作為該宿主重組細胞之細胞類型，合適地自各種習知培養基選擇用於該製法中之培養基。
若必要，該培養基可經合適量之蛋白酶抑制劑，諸如PMSF及EDTA增補。此外，考慮到該多胜肽衍生自厭氣菌，亦可添加合適量之還原劑，諸如DTT、2ME、DET、及Na2 S2 O4 。當使用該重組細胞時，若必要，該培養基可經NADPH及/或NADH增補，但其並非絕對必要。
更明確地，該製法之進行步驟如下，首先在含0.001至1重量%、較佳0.01至0.5重量%且更佳0.01至0.1重量%二氫大豆黃酮之培養基內接種該等重組細胞，並在非強制性溫度條件下培育該培養物，費時7至30小時、較佳15至24小時且更佳17至20小時。文中，該等非強制性溫度條件並未特別受限，且本質上與標題為“使用E2多胜肽以製備四氫大豆黃酮之方法”的上文段落B-6中所述之溫度條件相同。
本發明亦提供一用於合成四氫大豆黃酮之物質混合物，更明確地，一含有(Biv)該重組細胞及(Biii)二氫大豆黃酮之四氫大豆黃酮合成物質組成物。藉在上述條件下培養該組成物，該組成物內之二氫大豆黃酮可轉化成四氫大豆黃酮。該組成物相當於用以引發該可產生四氫大豆黃酮之反應的前述起始物質混合物。此外，該合成起始物質組成物中之重組細胞及二氫大豆黃酮的濃度、及可添加至該合成起始物質組成物之其它組份本質上與用於前述製法中之條件相同。
本發明亦提供一用於合成四氫大豆黃酮之套組，更明確地，一包括(Biv)該重組細胞及(Biii)二氫大豆黃酮之四氫大豆黃酮合成套組。若必要，該合成套組可各別包括該重組細胞與二氫大豆黃酮以方便地在上述條件下自二氫大豆黃酮合成四氫大豆黃酮。若必要，該合成套組可另外包括緩衝劑或培養基。該合成套組亦可包括有助於進行四氫大豆黃酮合成之任何必需工具或操作手冊。
可藉已知方法而保存該合成套組所包含之重組細胞。有許多已知重組細胞保藏技術。例如有一種方法，其中係在經未凍乾器處置以排空貯存該等重組細胞在溶劑(諸如二甲基甲醯胺)中之溶液的安瓿後，於4至25℃下保存該等重組細胞。另一實例為液態氮方法，其中係使該等細胞懸浮在一經10%甘油增補之保藏培養基內，然後貯存在特定安瓿中並保持在液態氮槽內(於-150至-196℃)。
B-9.對該多胜肽具有親和力之抗體
本發明亦提供一對E2多胜肽具有親和力之抗體(IgG抗體)。
可藉常用方法而製備該單株抗體及多株抗體。更明確地，可藉段落A-9中所述之方法而製備這些抗體。
B.10.用於檢測或測定該多胜肽之免疫學方法
本發明亦提供一種使用該抗體以檢測或測定E2多胜肽之免疫學方法。更明確地，可根據段落A-10中所述之方法以進行該免疫學方法。
本發明亦提供一用於檢測或測定E2多胜肽之包括該抗體的免疫學檢測套組。若必要，該檢測套組亦可包括標準E2多胜肽。若必要，該檢測套組可進一步包括在前述條件下促進E2多胜肽之容易檢測的另外試劑。該檢測套組亦可包括可促進E2多胜肽之容易檢測的任何必需工具或操作手冊。
B-11.用於檢測或測定可將該多胜肽編碼之多核苷酸的方法
本發明亦提供一種用於檢測或測定E2多核苷酸之方法。更明確地，係根據段落A-11中所述之方法，藉使E2多核苷酸結合探針接觸試驗試樣而進行該方法。
本發明亦提供一用於檢測或測定E2多核苷酸之套組，更明確地，一包括該探針之E2多核苷酸檢測套組。為了便於在前述條件下進行E2多核苷酸檢測，若必要，除了該探針外，該檢測套組可包括另外試劑等。而且，該檢測套組可用以鑑定含有E2多核苷酸之細胞。自可進行精確檢測之觀點而言，該檢測套組較佳可以呈適於使用PCR進行檢測之套組形式提供。
C.雌馬酚合成酵素
C-1.多胜肽
本發明提供一用於使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之多胜肽(下文亦稱為“E3多胜肽”)。更明確地，本發明提供：(Ca)一由序列辨識編碼：13之胺基酸所組成的多胜肽；(Cb)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編碼：13的胺基酸所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性；及(Cc)一由與序列辨識編碼：13之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性。
在多胜肽(Cb)中，該“一或多個胺基酸”之範圍並未特別受限，但其限制條件為該多胜肽具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性。例如該範圍為1自200個、較佳為1至150個、更佳為1至100個、更佳為1至50個、更佳為1至45個、更佳為1至40個、更佳為1至30個、更佳為1至15個、更佳為1至5個、又較佳為1至4個、又更佳為1至3個、且更特佳為1或2個。
(Cb)多胜肽之實例包括一由序列辨識編碼：14之胺基酸序列所組成之多胜肽或一由序列辨識編碼：15之胺基酸序列所組成之多胜肽。與序列辨識編碼：13之胺基酸序列比較，該序列辨識編碼：14之胺基酸序列含有兩個經取代胺基酸。與序列辨識編碼：13之胺基酸序列比較，該序列辨識編碼：15之胺基酸序列含有42個經取代胺基酸及於N末端具有一個另外胺基酸(麩胺酸)。該序列辨識編碼：15之胺基酸序列相當於得自卵形類桿菌E-23-15菌株(FERMBP-6435)之E3酵素多胜肽。序列辨識編碼：16之胺基酸序列相當於得自星狀鏈球菌A6G-225(FERM BP-6437)之E3酵素多胜肽。
在(Cb)多胜肽中，該胺基酸取代、刪除、插入或加成反應可如同段落A-1中所述之E1多胜肽的胺基酸取代、刪除、插入或加成反應。該多胜肽(Cb)中之胺基酸取代、刪除、插入或加成反應較佳發生在其中胺基酸之改變對該多胜肽之較高序結構並沒有大影響之區域或其中該改變不會影響雌馬酚合成酵素之活性中心的區域。此等區域之實例包括在該序列辨識編碼：13之胺基酸序列中的位置3之麩胺酸、於位置28之精胺酸、於位置29之麩胺酸、於位置32之精胺酸、於位置61之天冬醯胺酸、於位置80之異白胺酸、於位置92之天冬醯胺酸、於位置112之天冬胺酸、位置119之丙胺酸、於位置129之天冬醯胺酸、於位置172之天冬胺酸、於位置174之丙胺酸、於位置204之絲胺酸、於位置206之麩胺酸、於位置223之蘇胺酸、於位置230之纈胺酸、於位置244之脯胺酸、於位置246之胸腺肽(thyrosin)、於位置280之蘇胺酸、於位置282之精胺酸、於位置285之丙胺酸、於位置307之纈胺酸、於位置322之丙胺酸、於位置347之麩胺酸、於位置359之甘胺酸、於位置360之絲胺酸、於位置366之丙胺酸、於位置367之白胺酸、於位置368之異白胺酸、於位置372之纈胺酸、於位置373之天冬胺酸、於位置374之蘇胺酸、於位置377之丙胺酸、於位置380之丙胺酸、於位置381之天冬胺酸、於位置399之麩醯胺酸、於位置403之脯胺酸、於位置404之甲硫胺酸、於位置405之脯胺酸、於位置406之麩胺酸、於位置407之甘胺酸、於位置426之精胺酸、於位置434之纈胺酸、於位置436之丙胺酸、於位置438之胸腺肽、及於位置440之丙胺酸；及這些胺基酸之鄰接區域。該“鄰接區域”意指其中該雌馬酚合成酵素活性未受影響之區域。該等區域之實例包括在得自所例示胺基酸中任一種5個胺基酸內的胺基酸、較佳在得自所例示胺基酸中任一種之4個胺基酸內的胺基酸、更佳在得自所例示胺基酸中任一種之3個胺基酸內的胺基酸、又更佳在得自所例示胺基酸中任一種之2個胺基酸內的胺基酸、且更佳為得自所例示胺基酸中任一種之一個胺基酸。
該等具有低可保藏性之區域及其等之鄰近區域的較佳實例包括在該序列辨識編碼：13之胺基酸序列中之以下區域：相當於位置25至35之區域、相當於位置25至35之區域、相當於位置170至177之區域、相當於位置201至208之區域、相當於位置242至248之區域、相當於位置276至289之區域、相當於位置355至385之區域、相當於位置396至409之位置、及相當於位置431至443之區域。
在該序列辨識編碼：13之胺基酸序列中，該範圍自於位置14之胺基酸至於位置19之胺基酸的序列被視為相當於FAD結合域。因此，只要該結構域之機能未受抑制，在該序列中之任一胺基酸可進行取代、刪除、插入及加成反應。然而較佳為於位置14之甘胺酸、於位置16之甘胺酸、及於位置19之甘胺酸皆未突變。在該序列之胺基酸取代、刪除、插入或加成反應中，經突變胺基酸數較佳不超過3、更佳不超過2、又更佳為1。該序列中最佳無突變。
第28圖表示序列辨識編碼：13、14及15之胺基酸序列的排列。
在(Cc)多胜肽中，該胺基酸序列與序列辨識編碼：13之胺基酸序列的同一性為，例如60%或更高。最好為該胺基酸序列與序列辨識編碼：13之胺基酸序列的同一性通常為80%或更高、較佳85%或更高、更佳90%或更高、又較佳95%或更高、又更佳98%或更高且更特佳99%或更高。
更明確，(Cc)多胜肽可以是一由序列辨識編碼：14之胺基酸序列所組成之多胜肽或一由序列辨識編碼：15之胺基酸序列所組成之多胜肽。該序列辨識編碼：13之胺基酸序列與序列辨識編碼：14之胺基酸序列的胺基酸同一性為99.6%(Blast 2)。該序列辨識編碼：13之胺基酸序列與序列辨識編碼：15之胺基酸序列的胺基酸同一性為90.9%(Blast 2)。因此，在本發明一較佳實施例中，(Bc)多胜肽之胺基酸序列與該序列辨識編碼：13之胺基酸序列的同一性為90.9%或更高且更佳為99.6%。
就多胜肽(Cb)及(Cc)而言，可如下確認使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性。首先以低於0.001毫克/毫升之濃度添加相關多胜肽至該組成物之受質溶液內。然後於37℃下培育該溶液。費時2小時以檢查該溶液中之雌馬酚存在或不存在。培育後，該溶液中雌馬酚之存在可作為該多胜肽使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性的指標。
基質溶液之組成物
0.1M　磷酸鉀緩衝劑(pH7.0)
1mM　PMSF(苯基甲基磺醯氟)
2mM　二硫蘇糖醇
5μM　亞硫酸氫鈉
酵素活性
由於E3多胜肽具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之酵素活性，所以E3多胜肽亦稱為E3酵素。該E3酵素之最佳溫度在約在23至37℃附近，且最佳pH為4.5。E3酵素亦可自雌馬酚合成四氫大豆黃酮。
與E1多胜肽及E2多胜肽類似，可根據序列辨識編碼：16、17或18之核苷酸序列的信息，藉基因工程而製備E3多胜肽。而且，可根據序列辨識編碼：13、14或15之胺基酸序列的信息，使用常用化學合成方法以製備E3多胜肽。亦可藉離析及純化而自可產生E3多胜肽之微生物製備該E3多胜肽。可根據前文段落A-1中之說明文以進行這些方法。
可在含所欲量之四氫大豆黃酮的培養基內培養該能產生E3多胜肽之微生物。亦可使用此種方法在可產生E3多胜肽之微生物製備E3多胜肽。
E2多胜肽可具單體性或二聚合性或聚合性，但其限制條件為必須可合成四氫大豆黃酮。此外，為了改善安定性及其它特性，若必要可藉添加聚乙二醇或糖鏈而修飾E3多胜肽。
E3多胜肽可作為能將四氫大豆黃酮(受質)轉化成雌馬酚之觸媒。咸信雌馬酚在體內具有各種生理活性。在這一點，可產生雌馬酚之E3多胜肽被視為具重要性。本發明因此提供一包括多胜肽(Ca)至(Cc)中任一種之雌馬酚合成酵素。
C-2.多核苷酸
本發明亦提供一可將具有使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性之多胜肽編碼的多核苷酸(下文亦稱為“E3多核苷酸”)。更明確地，本發明提供：(Cd)一由序列辨識編碼：16之核苷酸序列所組成的多核苷酸；(Ce)一可將由序列辨識編碼：13之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Cf)一可在嚴苛條件下以該多核苷酸(Cd)或(Ce)之互補鏈進行雜交反應的多核苷酸，且其可將具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性的多胜肽編碼。
該序列辨識編碼：13之胺基酸序列相當於藉序列辨識編碼：16之核苷酸而編碼之胺基酸序列。該序列辨識編碼：14之胺基酸序列相當於藉序列辨識編碼：17之核苷酸序列而編碼之胺基酸序列。該序列辨識編碼：15之胺基酸序列相當於藉序列辨識編碼：18之核苷酸序列而編碼之胺基酸序列。
就多核苷酸(Cf)而言，該短語“在嚴苛條件下可進行雜交反應”係與段落A-2中之短語“在嚴苛條件下可進行雜交反應”同義。多核苷酸(Cf)之實例包括序列辨識編碼：17之核苷酸序列及序列辨識編碼：18之核苷酸序列。該序列辨識編碼：16之核苷酸序列與序列辨識編碼：17之核苷酸序列的鹼基序列同源性為99.8%(B1ast 2)。該序列辨識編碼：16之核苷酸序列與序列辨識編碼：18之核苷酸序列的同源性為85.2%(B1ast 2)。因此，在本發明一較佳實施例中，多核苷酸(Cf)之鹼基序列與該序列辨識編碼：16之鹼基序列的同源性為85.2%、且更佳為99.8%。
就多核苷酸(Cf)而言，可藉用於多胜肽(Cb)及(Cc)之相同方法而確認該“使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性”。
可根據序列辨識編碼：16、17或18之序列信息，藉化學DNA合成方法或基因工程技術而製備或獲得E3多核苷酸。更明確地，可使用段落A-2中所述用於E1多核苷酸之方法。
該E3多核苷酸之cDNA來源並未特別受限，但其限制條件為必需為可表現E3多核苷酸之微生物。其特定實例包括可產雌馬酚之微生物較佳為可產生雌馬酚之屬於類桿菌屬及鏈球菌屬之細菌、更佳為可產生雌馬酚之格氏乳酸球菌、又較佳為可產生雌馬酚之糞便格氏乳酸球菌、卵形類桿菌、中間鏈球菌、及星狀鏈球菌、且更特佳為可產生雌馬酚之乳酸球菌屬20-92菌株、卵形類桿菌屬E-23-15菌株、星狀鏈球菌A6G-225(分別為FERM BP-10036、FERM BP-6435、及FERM BP-6437其等係經the International Patent Organism Depositary,National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,1-1-1 Higashi,Tsukuba,Ibaraki,Japan寄存)、糞便格氏乳酸球菌屬之菌株。
使用常用基因工程技術進行E3多核苷酸之表現可大量並安定地製備該多核苷酸產物(該多胜肽)。不需要使用習用於雌馬酚製備之難以處理的厭氣菌菌株，藉本發明而成功地離析E3多核苷酸可提供用於雌馬酚之工業製備的方法。
C-3.表現性載體
本發明之表現性載體並未特別受限，但其限制條件必須包括E3多核苷酸且可表現E3多核苷酸。一般而言，類似該包括E1多核苷酸之表現性載體，最好根據宿主細胞之類型而選擇表現性載體。更明確地，可使用段落A-3中所述之宿主細胞。
C-4.重組細胞
本發明提供一經包括E3多核苷酸之表現性載體而轉形之重組細胞(轉形體)。用於該重組細胞之宿主細胞可以是段落A-4中所述之任何宿主細胞。此外，可藉段落A-4中所述之方法而將該表現性載體導入宿主細胞內。
由於該重組細胞可產生E3多胜肽(其係為雌馬酚轉化酵素)，所以其可用以製備雌馬酚轉化酵素。該重組細胞亦可用以產生呈細胞形式之雌馬酚。
C-5.使用重組細胞以製備多胜肽之方法
可藉培養重組細胞而製備E3多胜肽，其中係導入E3多核苷酸並自該細胞及培養物收集E3多胜肽。可根據段落A-5之說明文以培養該等重組細胞。
C-6.使用E3多胜肽以製備雌馬酚之方法
本發明提供一種使用E3多胜肽以製備雌馬酚之方法。在製法中，可藉使E3多胜肽對四氫大豆黃酮作用而使四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚。
可在合適緩衝劑內進行用於該製法中之反應。更明確地，可使用段落A-6中所述之緩衝劑。
在可致使，例如各組份於反應開始時以下示之濃度範圍添加至培養基內以製備混合物的條件下，進行用於該製法中之反應。
該E3多胜肽含量為0.0001至1.0重量%、較佳為0.001至0.1重量%且更佳為0.001至0.01重量%。該四氫大豆黃酮含量為0.0001至10.0重量%、較佳為0.001至1.0重量%且更佳為0.001至0.1重量%。
於不會改變該等起始物質，其包括該E3多胜肽與四氫大豆黃酮、及該產物(其包括雌馬酚)或使其等失活之溫度下培育該混合物，費時0.5至10小時、較佳1至6小時且更佳2至4小時。該反應並未特別受限。例如當該反應溫度為0℃或更低時，該反應可使用，例如不會於此等反應溫度下凍結之緩衝劑。該反應溫度較佳為，例如0至45℃且更佳為0至37℃。
本發明亦提供一用於合成雌馬酚之物質混合物。更明確地，一包括(Ci)E3多胜肽、(Cii)四氫大豆黃酮之雌馬酚合成物質組成物。藉在上述條件下培育該組成物，可將該組成物所包含之四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚。該組成物相當於用以引發可產生雌馬酚之反應的上述起始物質混合物。而且，該組成物內之E3多胜肽、及四氫大豆黃酮的濃度、及可添加至該組成物之其它組份本質上與用於前述製法中之該反應系統(於反應開始時之起始物質混合物)相同。
本發明亦提供一用於合成雌馬酚之套組，更明確地，一包括(Ci)E3多胜肽、(Cii)四氫大豆黃酮之雌馬酚合成套組。若必要，該合成套組包括在分隔的空間內之組份以方便地在前述條件下自四氫大豆黃酮合成雌馬酚。若必要，該合成套組可進一步包括緩衝劑。該合成套組亦可包括有助於進行雌馬酚合成之任何必需工具或操作手冊。
C-7.雌馬酚合成酵素組成物
本發明亦提供一包括E3多胜肽之雌馬酚合成酵素組成物。該酵素組成物最好可作為使用E3多胜肽以製備雌馬酚之方法中的雌馬酚合成酵素。
該酵素組成物可以是粗純化E3多胜肽，或該酵素組成物可以是經合適載劑調製之粗純化或純化E3多胜肽。該載體對E3多胜肽之活性並無任何不利影響且係以合適量使用。
該酵素組成物中之E3多胜肽的比例並未特別受限，但其限制條件為該組成物可作為製備雌馬酚之方法中的雌馬酚合成酵素。更明確地，相對於該酵素組成物之總重，該E3多胜肽含量為，例如0.001至20.0重量%、較佳為0.005至5.0重量%且更佳為0.01至1.0重量%。
為了改善該多胜肽之安定性及/或確保該酵素組成物之保藏性，除了E3多胜肽外，該酵素組成物可進一步包括段落A-7中所述之各種抗氧化劑及防腐劑。
C-8.使用重組細胞以製備雌馬酚之方法
本發明提供一種使用包括E3多核苷酸之重組細胞以製備雌馬酚之方法。更明確地，在該製法中，係藉使該重組細胞對欲轉化之四氫大豆黃酮作用而使四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚。
可在能使該重組細胞存活並使四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚之環境內進行用於該製法中之反應。
更明確地，係添加合適量之重組細胞並在可以使該等重組細胞成長之培養基內進行培養。
根據作為該宿主重組細胞之細胞類型，合適地自各種習知培養基選擇用於該製法中之培養基。
若必要，該培養基可經合適量之蛋白酶抑制劑，諸如PMSF及EDTA增補。此外，考慮到該多胜肽衍生自厭氣菌，亦可添加合適量之還原劑，諸如DTT、2ME、DET、及Na2 S2 O4 。當使用該重組細胞時，若必要，該培養基可經NADPH及/或NADH增補，但其並非絕對必要。
更明確地，該製法之進行步驟如下。首先係在含有0.001至1重量%、較佳0.01至0.5重量%且更佳0.01至0.1重量%四氫大豆黃酮之培養基內接種該等重組細胞，並在非強制性溫度條件下培育該培養物，費時7至30小時、較佳15至24小時且更佳17至20小時。文中，該等非強制性溫度條件並未特別受限，且本質上與前述段落C-6中之條件相同。
本發明亦提供一用於合成雌馬酚之物質混合物，更明確地，一含有(Ciii)該重組細胞及(Cii)四氫大豆黃酮之雌馬酚合成物質組成物。藉在上述條件下培育該組成物，該組成物內之四氫大豆黃酮可轉化成雌馬酚。該組成物相當於用以引發產生雌馬酚之反應的前述起始物質。此外，該組成物內之重組細胞及四氫大豆黃酮的濃度、與可添加至該組成物之其它組份本質上與用於前述製法中之條件相同。
本發明亦提供一用於合成雌馬酚之套組，更明確地，一包括(Ciii)該重組細胞及(Cii)四氫大豆黃酮之雌馬酚合成套組。若必要，該合成套組可包括在分隔空間內之該重組細胞與四氫大豆黃酮以方便地在上述條件下自二氫大豆黃酮合成雌馬酚。若必要，該合成套組可進一步包括緩衝劑或培養基。該合成套組亦可包括有助於進行雌馬酚合成之任何必需工具或操作手冊。
可藉已知方法而保存該合成套組所包含之重組細胞。有許多已知重組細胞保藏技術。例如有一種方法，其中係在經未凍乾器處置以排空貯存該等重組細胞在溶劑(諸如二甲基甲醯胺)中之溶液的安瓿後，於4至25℃下保存該等重組細胞。另一實例為液態氮方法，其中係使該等細胞懸浮在一經10%甘油增補之保藏培養基內，然後貯存在特定安瓿中並保持在液態氮槽內(於-150至-196℃)。
C-9.對該多胜肽具有親和力之抗體
本發明亦提供一對E3多胜肽具有親和力之抗體(IgG抗體)。
可藉常用方法而製備該單株抗體及多株抗體。更明確地，可藉段落A-9中所述之方法而製備這些抗體。
C.10.用於檢測或測定該多胜肽之免疫學方法
本發明亦提供一種使用該抗體以檢測或測定E3多胜肽之免疫學方法。更明確地，可根據段落A-10中所述之方法以進行該免疫學方法。
本發明亦提供一用於檢測或測定E3多胜肽之包括該抗體之免疫學檢測套組。若必要，該檢測套組亦可包括標準E3多胜肽。若必要，該檢測套組可進一步包括可在上述條件下促進E3多胜肽之簡易檢測的另外試劑。該檢測套組亦可包括可促進E3多胜肽之簡易檢測的任何必需工具或操作手冊。
C-11.用於檢測或測定可將該多胜肽編碼之多核苷酸的方法
本發明亦提供一種用於檢測或測定E3多核苷酸之方法。更明確地，係根據段落A-11中所述之方法，藉使E3多核苷酸結合探針接觸試驗試樣而進行該方法。
本發明亦提供一用於檢測或測定E3多核苷酸之套組。更明確地，一包括該探針之E3多核苷酸檢測套組。為便於在前述條件下進行E3多核苷酸檢測，若必要，除了該探針外，該檢測套組可包括另外試劑等。此外，該檢測套組可用以鑑定含有E3多核苷酸之細胞。自可精確地進行檢測的觀點而言，該檢測套組較佳可以以適於使用PCR以進行檢測之套組形式提供。
D.使用E1-E3酵素或彼等之中間產物以製備雌馬酚的方法
D-I-1.包括第一步驟及第二步驟之用於製備四氫大豆黃酮的方法
本發明提供一種包括以下第一步驟及第二步驟之用於製備四氫大豆黃酮的方法(在下文中，本方法偶爾稱為“第一製法”)。第一步驟可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮。第二步驟可自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮。
第一步驟包括以下步驟：使由以下(Aa)至(Ac)多胜肽中之一種所組成之酵素、及NADPH及/或NADH對大豆黃酮作用以產生二氫大豆黃酮。
(Aa)一由序列辨識編碼：1之胺基酸序列所組成之多胜肽。
(Ab)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編碼：1的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。
(Ac)一由與序列辨識編碼：1之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。
第二步驟包括以下步驟：使由以下(Ba)至(Bc)多胜肽中之一重所組成之酵素、及NADPH及/或NADH對二氫大豆黃酮作用以產生四氫大豆黃酮。
(Ba)一由序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成的多胜肽。
(Bb)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：7的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。
(Bc)一由與序列辨識編號：7之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。
本發明之第一製法可自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮並自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
第一步驟
在第一步驟中，係在NADPH及/或NADH存在下。藉使用E1多胜肽所組成之酵素對大豆黃酮作用而使該大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮。於不會改變該等起始物質，其包括該多胜肽與大豆黃酮、及該產物(其包括二氫大豆黃酮)或使彼等失活之溫度下(亦即上文段落A-6中詳述之條件)，藉在含有由E1多胜肽、大豆黃酮、及NADPH及/或NADH所組成之酵素的溶液中培育而進行第一步驟中之該反應。
當於相同條件下進行第一步驟及下文描述之第二步驟，於可以使各該組份符合如下示在反應開始時在反應系統內之濃度範圍(於反應開始時在起始物質之混合物內之各該組份的濃度範圍)並可以於15至45℃、較佳25至40℃且更佳30至38℃之溫度下培育該混合物，費時0.5至10小時、較佳1至6小時且更佳2至4小時的條件下進行該反應。在此種安排下，能有效率地進行第一及第二步驟。
該由E1多胜肽所組成之酵素的含量為0.0001至1.0重量%、較佳為0.001至0.1重量%、且更佳為0.001至0.01重量%。該大豆黃酮含量為0.0001至10.0重量%、較佳為0.001至1.0重量%且更佳為0.001至0.1重量%。該NADPH及/或NADH含量為0.01至5重量%、較佳為0.05至1重量%且更佳為0.1至0.5重量%。作為第一步驟之受質的大豆黃酮來源並未受限。例如可使用市售大豆黃酮或經由合適方法而製成或合成之大豆黃酮。
此外，例如含(Ai)一由E1多胜肽所組成之酵素、(Aii)NADPH及/或NADH、及(Aiii)大豆黃酮之二氫大豆黃酮合成物質組成物可作為第一步驟中該二氫大豆黃酮之製法的起始物質混合物。藉在上述條件下培育該組成物，該組成物內之大豆黃酮可轉化成二氫大豆黃酮。該組成物係明確地描述在上述段落A-6及A-7中。
第二步驟
在第二步驟中，係在NADPH及/或NADH存在下，藉使由E2多胜肽所組成之酵素對二氫大豆黃酮作用而使二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮。
於不會改變該等起始物質，其包括由該多胜肽E2及二氫大豆黃酮所組成之酵素、及該產物(其包括四氫大豆黃酮)或使彼等失活之溫度下(亦即上文段落B-6中所詳述之條件)，經由在含有由E2多胜肽、二氫大豆黃酮、及NADPH及/或NADH所組成之酵素的溶液內培育而進行第二步驟中之該反應。
就四氫大豆黃酮而言，該化合物係以順式形式或反式形式存在。可藉改變反應條件，諸如反應溫度及反應時間而控制順式-及反式-構形之形成。例如可藉將反應溫度設定於0℃下或藉將反應溫度設定於37℃下而控制該反應以有利於反式形式之形成。
當在相同條件下進行第一步驟及第二步驟時，係在上文第一步驟之說明文中所詳述之用於在相同條件下進行第一步驟及第二步驟之上述條件下藉培育而進行該反應。在此種安排下，能有效率地進第一及第二步驟。
在該情況下，可如下調整該由E2多胜肽所組成之酵素、二氫大豆黃酮、與NADPH及/或NADH的含量。
該由E2多胜肽所組成之酵素的含量為0.0001至1.0重量%、較佳為0.001至0.1重量%且更佳為0.001至0.01重量%。該二氫大豆黃酮含量為0.0001至10.0重量%、較佳為0.001至1.0重量%且更佳為0.001至0.1重量%。該NADPH及/或NADH含量為0.01至5重量%、較佳為0.05至1重量%且更佳為0.1至0.5重量%。
然而，當欲在該由E1多胜肽所組成之酵素或由E2多胜肽所組成之酵素的存在下進行時，第一步驟及第二步驟需要使用NADPH以增加該產生二氫大豆黃酮之反應的效率。根據用於在上文第一步驟之說明文中所詳述的相同條件下進行第一步驟及第二步驟的上述條件以決定NADPH之濃度。與NADPH一起使用之NADH的濃度為0.01至5重量%、較佳為0.05至1重量%、更佳為0.1至0.5重量%。
作為第二步驟中之受質的二氫大豆黃酮來源並未受限。例如在第一步驟中自大豆黃酮所製成之二氫大豆黃酮可作為用於第二步驟之受質。該二氫大豆黃酮係以含如在第一步驟中所製成之二氫大豆黃酮的溶液形式使用或以粗略地精製態或合適地精製態使用。亦可使用市售二氫大豆黃酮或經由合適方法而合成之二氫大豆黃酮。
此外，含有(Bi)一由E2多胜肽所組成之酵素、(Bii)NADPH 及/或NADH、及(Biii)二氫大豆黃酮之四氫大豆黃酮合成物質組成物可作為第二步驟中之四氫大豆黃酮製法的起始物質混合物。藉在上述條件下培育該組成物。該組成物內之二氫大豆黃酮可轉化成四氫大豆黃酮。該合成組成物明確地描述在上文段落A-6及A-7內。
在第二步驟中，較佳使用在第一步驟中利用大豆黃酮作為受質所製成之二氫大豆黃酮；然而，可以使市售二氫大豆黃酮、該合成起始物質組成物、該酵素組成物等與第一步驟中所製成之二氫大豆黃酮混合。
E1多胜肽及E2多胜肽
本發明之第一製法使用該由如上文段落A-1中所詳述之E1多胜肽所組成之酵素、及該如上文段落B-1中所詳述之E2多胜肽所組成之酵素。
本發明提供一藉包括第一步驟及第二步驟之上述方法(第一製法)而製成之含四氫大豆黃酮的產物。如上述，本發明之第一製法可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮並自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮。因此，該藉本發明之第一製法而製成之產物不僅含有四氫大豆黃酮，而且含有二氫大豆黃酮及/或大豆黃酮。
本發明該產物可以以如在第一製法中所製成之溶液形式使用或可以是藉粗略地或合適地精製該溶液而獲得之四氫大豆黃酮產物。
本發明該產物可併入食品、飲料或化妝品產品材料、醫藥產品等中，或可作為受質。
D-I-3.包括第二步驟及第三步驟之雌馬酚製法
本發明提供一種包括以下第二步驟及第三步驟之用於製備雌馬酚的方法(下文中，本方法偶爾稱為“第二製法”)。第二步驟可自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮。第三步驟可自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
第二步驟包括以下步驟：使一由以下(Ba)至(Bc)多胜肽中之一種所組成之酵素、與NADPH及/或NADH對二氫大豆黃酮作用以產生四氫大豆黃酮。
(Ba)一由序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成的多胜肽。
(Bb)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：7的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。
(Bc)一由與序列辨識編號：7之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。
第三步驟包括以下步驟：使一由以下(Ca)至(Cc)多胜肽中之一種所組成的酵素對四氫大豆黃酮作用以產生雌馬酚。
(Ca)一由序列辨識編碼：13之胺基酸所組成的多胜肽。
(Cb)一由具有一或多個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編碼：13的胺基酸所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性。
(Cc)一由與序列辨識編碼：13之胺基酸序列的同一性為60%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性。
本發明之第二製法可自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
第二步驟
本發明之第二製法的第二步驟與第一製法的第二步驟相同。
當於相同條件下進行第二步驟及下文描述之第三步驟，於可以使各該組份符合如下示在反應開始時在反應系統內之濃度範圍(於反應開始時在起始物質之混合物內之各該組份的濃度範圍)並可以於15至45℃、較佳25至40℃且更佳30至38℃之溫度下培育該混合物，費時0.5至10小時、較佳1至6小時且更佳2至4小時的條件下進行該反應。在此種安排下，能有效率地進行第一及第二步驟。
該由E2多胜肽所組成之酵素的含量為0.0001至1.0重量%、較佳為0.001至0.1重量%且更佳為0.001至0.01重量%。該二氫大豆黃酮含量為0.0001至10.0重量%、較佳為0.001至1.0重量%且更佳為0.001至0.1重量%。該NADPH及/或NADH含量為0.01至5重量%、較佳為0.05至1重量%且更佳為0.1至0.5重量%。
第三步驟
第三步驟可以使由E3多胜肽所組成之酵素對四氫大豆黃酮作用以使四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚。
於不會改變該等起始物質，其包括該由多胜肽E3所組成之酵素與四氫大豆黃酮、及該產物(其包括雌馬酚)或使彼等失活的溫度下(亦即在上文段落A-6中所詳述之條件)，在含有由E3多胜肽所組成之酵素、及四氫大豆黃酮的溶液內藉培育而進行第三步驟中之該反應。
當在相同條件下進行第二步驟及第三步驟時，係在上文第二步驟之說明文中所詳述之用於在相同條件下進行第二步驟及第三步驟之上述條件下藉培育而進行該反應。在此種安排下，能有效地進行第二及第三步驟。
在該情況下，可如下調整該由E3多胜肽所組成之酵素、四氫大豆黃酮、與NADPH及/或NADH之含量。
該由E3多胜肽所組成之酵素的含量為0.0001至1.0重量%、較佳為0.001至0.1重量%且更佳為0.001至0.01重量%。該四氫大豆黃酮含量為0.0001至10.0重量%、較佳為0.001至1.0重量%且更佳為0.001重量%至0.1重量%，該NADPH及/或NADH含量為0.01至5重量%、較佳為0.05至1重量%且更佳為0.1至0.5重量%。
該作為第三步驟中之受質的四氫大豆黃酮來源亦未受限。例如在第二步驟中自二氫大豆黃酮所製成之四氫大豆黃酮可作為用於第三步驟之受質。該四氫大豆黃酮係以該含有如在第二步驟中所製成之四氫大豆黃酮的溶液形式使用或以粗略地精製態或合適地精製態使用。亦可使用市售四氫大豆黃酮或經由合適方法而合成之四氫大豆黃酮。
此外，含有(Ci)一由E3多胜肽所組成之酵素、及(Cii)四氫大豆黃酮之四氫大豆黃酮合成物質組成物可作為第三步驟中該四氫大豆黃酮之製法的起始物質之混合物。藉在上述條件下培育該組成物，使該組成物內之四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚。該組成物係明確地描述在上文段落C-6及C-7中。
在第三步驟中，較佳使用在第二步驟中使用二氫大豆黃酮作為受質所製成之四氫大豆黃酮；然而，可以使市售四氫大豆黃酮、該合成起始物質組成物、該酵素組成物等與第二步驟中所製成之四氫大豆黃酮混合。
E2多胜肽及E3多胜肽
本發明之第二製法使用一由上文段落B-1中所述之E2多胜肽所組成之酵素、及一由上文段落C-1中所述之E3多胜肽所組成之酵素。
D-I-4.藉第二製法而製成之含雌馬酚的產物
本發明提供一藉包括第二及第三步驟之上述方法(第二製法)而製成之含雌馬酚的產物。如上述，本發明之第二製法可自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮並自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
因此，該藉本發明之第二製法而製成的產物不僅含有雌馬酚，而且亦含有四氫大豆黃酮及/或二氫大豆黃酮。
本發明該產物可以以如第二製法中所製成之溶液形式使用或可以是一藉粗略地或合適地精製該溶液而獲得之雌馬酚產物。
本發明該產物可併入食品、飲料、化妝產品材料、醫藥產品等內或可作為基質。
D-I-5.包括第一步驟至第三步驟之雌馬酚製法
本發明提供一種包括第一步驟、第二步驟及第三步驟之雌馬酚製法(在下文中，本方法偶爾稱為“第三製法”)。本發明之第三製法可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮並自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
第一步驟
在本發明之第三製法的第一步驟中，係NADPH及/或NADH存在下藉使一由E1多胜肽所組成之酵素對大豆黃酮作用而使該大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮。本發明之第三製法的第一步驟與上述第一步驟相同。
當第一步驟及第二步驟在相同條件下進行時、當第一步驟及第三步驟在相同條件下進行時或當第一步驟至第三步驟在相同條件下進行時，係在上文第一步驟之說明文中所詳述之用於在相同條件下進行第一步驟及第二步驟的上述條件/濃度下藉培育而進行該反應。在此種安排下，能有效率地進行第一及第二步驟。
第二步驟
在本發明之第三製法的第二步驟中，係在NADPH及/或NADH存在下藉使一由E2多胜肽所組成之酵素對二氫大豆黃酮作用而使該二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮。本發明之第三製法的第二步驟與上述第二步驟相同。
當在相同條件下進行第一步驟及第二步驟時或當在相同條件下進行第一步驟至第三步驟時，係在上文第二步驟之說明文中所詳述之用於在相同條件下進行第一步驟及第二步驟的上述條件/濃度下藉培育而進行該反應。在此種安排下，能有效率地進行第一及第二步驟。
此外，當在該由E1多胜肽所組成之酵素及該由E2多胜肽所組成之酵素的存在下進行第一步驟及第二步驟時或當在該由E1多胜肽所組成之酵素、該由E2多胜肽所組成之酵素、及該由E3多胜肽所組成之酵素的存在下進行第一步驟至第三步驟時，係在，例如該第二步驟之說明文中所詳述之上述條件/濃度下，在該由E1多胜肽所組成之酵素及該由E2多胜肽所組成之酵素的存在下經由培育而進行該反應。
當在相同條件下進行第二步驟及第三步驟時，係在上文第二步驟之說明文中所詳述之用於在相同條件下進行第二步驟及第三步驟的上述條件/濃度下藉培育而進行該反應。在此種安排下，能有效率地進行第二及第三步驟。
第三步驟
在本發明之第三製法的第三步驟中，係在NADPH及/或NADH存在下藉使一由E3多胜肽所組成之酵素對四氫大豆黃酮作用而使該四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚。本發明之第三製法的第三步驟與上述第三步驟相同。
當在相同條件下進行第一步驟及第三步驟時或當在相同條件下進行第一步驟至第三步驟時，係在上文第一步驟之說明文中所詳述的用於在相同條件下進行第一步驟及第二步驟之上述條件下藉培育而進行該反應。在此種安排下，能有效地進行第一及第二步驟。
在該情況下，係如下調整該由E3多胜肽所組成之酵素、四氫大豆黃酮、與NADPH及/或NADH之含量。
該由E3多胜肽所組成之酵素的含量為0.0001至1.0重量%、較佳為0.001至0.1重量%且更佳為0.001至0.01重量%。該四氫大豆黃酮含量為0.0001至10.0重量%、較佳為0.001至1.0重量%且更佳為0.001至0.1重量%。該NADPH及/或NADH含量為0.01至5重量%、較佳為0.05至1重量%且更佳為0.1至0.5重量%。
然而，當欲在該由E1多胜肽所組成之酵素及該由E3多胜肽所組成之酵素的存在下進行時，第一步驟及第三步驟必需使用NADPH以增加使用該由E1多胜肽所組成之酵素進行產生二氫大豆黃酮之反應的效率。類似地，當欲在該由E1多胜肽所組成之酵素、該由E2多胜肽所組成之酵素、及該由E3多胜肽所組成之酵素的存在下進行時，第一步驟及第三步驟需要使用NADPH以增加使用該由E1多胜肽所組成之酵素進行產生二氫大豆黃酮之反應的效率。在該情況下，係根據在上文第一步驟之說明文中所詳述之用於在相同條件下進行第一步驟及第二步驟的上述條件以決定NADPH之濃度。根據在上文第二步驟之說明文中所詳述之用於在該由E1多胜肽所組成之酵素、該由E2多胜肽所組成之酵素的存在下進行反應的上述條件、及在上文第二步驟之說明文中所詳述的用於在相同條件下進行第二及第三步驟之上述條件以決定可以與NADPH一起使用之NADH濃度。
E1至E3多胜肽
本發明之第三製法可使用該由E1多胜肽所組成之酵素、該由E2多胜肽所組成之酵素、及該由E3多胜肽所組成之酵素。該等胜肽E1至E3與上述之彼等相同。
D-I-6.藉第三製法而製成之含雌馬酚的產物
本發明提供一種含雌馬酚之產物，其係藉包括第一步驟至第三步驟之上述方法(第三製法)而製成。如上述，本發明之第三製法可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮、自二氫大豆黃酮、並自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。因此，該藉本發明之第三製法而製成之產物不僅含有雌馬酚，亦含有四氫大豆黃酮、二氫大豆黃酮及/或大豆黃酮。
本發明該產物可以呈如在第三製法中所製成之溶液形式使用、或可以是藉粗略地或合適地精製該溶液而獲得之四氫大豆黃酮產物。
本發明該產物可併入食品、飲料或化妝產品物質、醫藥產物等中或可作為受質。
D-I-7.包括第四步驟至第六步驟之至少兩種的用於製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚之方法
本發明提供一種用於製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮、及/或雌馬酚之方法(在上文中，本方法偶爾稱為“第四製法”)，其包括以下第四步驟至第六步驟之至少兩種。第四步驟可自大豆黃酮產生二氫大豆黃酮。第五步驟可自二氫大豆黃酮產生四氫大豆黃酮，而第六步驟可自四氫大豆黃酮產生雌馬酚。
第四步驟包括以下步驟：使由以下(Ad)至(Af)多核苷酸中之一種所組成之重組細胞對大豆黃酮作用以產生二氫大豆黃酮。
(Ad)一由序列辨識編號：4之核苷酸序列所組成之多核苷酸；(Ae)一可將由該序列辨識編號：1之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Af)一在嚴苛條件下可使用該多核苷酸(Ad)或(Ae)之互補鏈進行雜交且可將具有使用大豆黃酮作為基質以合成二氫大豆黃酮之活性的多胜肽編碼之多核苷酸。
第五步驟包括以下步驟：使由以下(Bd)至(Bf)多核苷酸中之一種所組成之重組細胞對二氫大豆黃酮作用以製備四氫大豆黃酮。
(Bd)一由序列辨識編號：10之核苷酸序列所組成的聚核苷酸；(Be)一可將由該序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成之多胜肽編號的多核苷酸；及(Bf)一可在嚴苛條件下以該多核苷酸(Bd)或(Be)之互補鏈進行雜交反應之多核苷酸，且其可將一具有使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性之多胜肽編碼。
第六步驟包括以下步驟：使由以下(Cd)至(Cf)多核苷酸中之一種所組成之重組細胞對四氫大豆黃酮作用以製備雌馬酚。
(Cd)一由序列辨識編碼：16之核苷酸序列所組成的多核苷酸；(Ce)一可將由序列辨識編碼：13之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Cf)一可在嚴苛條件下以該多核苷酸(Cd)或(Ce)之互補鏈進行雜交反應的多核苷酸，且其可將具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性的多胜肽編碼。
本發明之第四製法可藉合適地合併第四至第六步驟而製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚。
本發明之第四製法包括第四步驟、第五步驟及第六步驟中之至少兩種。
例如包括第四步驟及第五步驟且未包括第六步驟之本發明的第四製法可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮並自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮；包括第五步驟及第六步驟且未包括第四步驟之本發明的第四製法可自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮並自四氫大豆黃酮製備雌馬酚；包括第四步驟、第五步驟及第六步驟全部之本發明的第四製法可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮、自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮並自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
用於本發明之第四製法的各重組細胞可含有一或多個選自由(Ad)至(Af)、(Bd)至(Bf)、及(Cd)至(Cf)所組成之群組的多核苷酸。
例如當該細胞含有下述兩多核苷酸時：一選自由(Ad)至(Af)所組成之群組的多核苷酸、及一選自由(Bd)至(Bf)所組成之群組的多核苷酸，則可使用該細胞以進行第四步驟至第六步驟，亦即可使用一種重組細胞以進行第四步驟及第五步驟。
類似地，當該細胞含有以下三個多核苷酸時：一選自由(Ad)至(Af)所組成之群組的多核苷酸、一選自由(Bd)至(Bf)所組成之群組的多核苷酸、及一選自由(Cd)至(Cf)所組成之群組的多核苷酸，則可使用該細胞以進行第四步驟至第六步驟，亦即可使用一種重組細胞以進行第四步驟至第六步驟。
在本發明之第四製法中，亦可使用一含有兩多核苷酸(一選自由(Ad)至(Af)所組成之群組的多核苷酸、及一選自由(Bd)至(Bf)所組成之群組的多核苷酸)之重組細胞、及另一含有一選自由(Cd)至(Cf)所組成之群組的多核苷酸之重組細胞以進行第四步驟至第六步驟。
類似地，在本發明之第四製法中，亦可使用一含有兩多核苷酸(一選自由(Ad)至(Af)所組成之群組的多核苷酸及一選自由(Cd)至(Cf)所組成之群組的多核苷酸)之重組細胞、及另一含有一選自由(Bd)至(Bf)所組成之群組之多核苷酸的重組細胞以進行第四步驟至第六步驟。
第四步驟
第四步驟可以使一具有如段落A-2中所詳述之E1多核苷酸的重組細胞對大豆黃酮作用以使該大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮。
可在與第一步驟相同之條件下進行第四步驟中之該反應。更明確地，在含有0.001至1重量%、較佳0.01至1重量%、更佳0.01至0.5重量%大豆黃酮之培養基內接種該重組細胞，並於可以使該重組細胞成長之溫度下，培育6至30小時、較佳7至24小時、更佳7至18小時。
該溫度並未受限且可以是第一步驟中所採用之溫度。
用於第四步驟中之重組細胞
任何重組細胞皆可用於第四步驟中，但其限制條件為該細胞必需含有E1多核苷酸且可表現E1多核苷酸。段落A-4中所詳述之重組細胞可用於該步驟中。
使用具有E1多核苷酸之重組細胞以製備由E1多胜肽所組成之酵素的方法
可藉E2多核苷酸導入後培育重組細胞並藉自該細胞培養物收集E1多胜肽而製備該由E1多胜肽所組成之酵素。更明確地，可藉在段落A-5中所詳述之條件下培育該重組細胞而製備E1多胜肽。
第五步驟
第五步驟可以使一具有如段落B-2中所詳述的E2多核苷酸之重組細胞對二氫大豆黃酮作用以使該二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮。
可在如第二步驟所述之相同條件下進行第五步驟中之該反應。更明確地，係在含0.001至1重量%、較佳0.01至0.5重量%、更佳0.01至0.1重量%大豆黃酮之培養基內接種該重組細胞並於可以使該細胞成長之溫度下培育7至30小時、較佳15至14小時、更佳17至20小時。
該溫度並未受限且可以是第二步驟中所採用之溫度。
用以第五步驟中之重組細胞
任何重組細胞皆可以用於第五步驟中，但其限制條件為該細胞含有B-2段落中所述之E2多核苷酸且可表現E2多核苷酸。一實例為段落B-4中所詳述之重組細胞。
使用具有E2多核苷酸之重組細胞以製備由E2多胜肽所成之酵素的方法
可藉E2多核苷酸導入後培育重組細胞並藉自該等細胞及/或培育物收集E2多胜肽而製備該由E2多胜肽所組成之酵素。
如該段落“使用具有E1多核苷酸之重組細胞以製備由E1多胜肽所組成之酵素的方法”中所述之相同方式及條件可用於經E2多核苷酸、培養基、及E2多胜肽之離析/純化所提供之重組細胞。
第六步驟
第六步驟可以使一具有如段落C-2中所詳述之E3多核苷酸的重組細胞對四氫大豆黃酮作用以使該四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚。
可在如第三步驟所述之相同條件下進行第六步驟中之該反應。更明確地，在含有0.001至1重量%、較佳0.01至0.5重量%、更佳0.01至0.1重量%四氫大豆黃酮之培養基內接種該重組細胞並於可以使該細胞成長之溫度下培育7至30小時、較佳15至24小時、更佳17至20小時。
該溫度並未受限且可以是第三步驟中所採用之溫度。
作為第六步驟中之受質的四氫大豆黃酮來源亦未受限。例如該在第一步驟中自二氫大豆黃酮所製成之四氫大豆黃酮可作為用於第六步驟之受質。該四氫大豆黃酮係以含有如在第一步驟中所製成之四氫大豆黃酮的溶液形式使用或以粗略地精製態或合適地精製態使用。亦可使用市售四氫大豆黃酮或經由合適方法而合成之四氫大豆黃酮。
此外，一含有包含E3多核苷酸之重組細胞、及四氫大豆黃酮的四氫大豆黃酮合成物質組成物可作為第六步驟中該四氫大豆黃酮之製法中的起始物質混合物。藉在上述條件下培育該組成物，該組成物內之四氫大豆黃酮可轉化成雌馬酚。可使用如上述之相同條件及限制以決定該組成物中之重組細胞與四氫大豆黃酮之濃度、添加至該組成物之其它成份、反應條件等。
在第六步驟中，較佳使用在第五步驟中利用二氫大豆黃酮作為受質所製成之四氫大豆黃酮；然而，可以使市售四氫大豆黃酮、該合成起始物質組成物、該酵素組成物等與第五步驟中所製成之四氫大豆黃酮混合。
用於第六步驟中之重組細胞
任何重組細胞皆可用於第六步驟中，但其限制為該細胞含有C-2段落中所述之E3多核苷酸且可表現E3多核苷酸。一實例為段落C-4中所詳述之重組細胞。
使用具有E3多核苷酸之重組細胞以製備由E3多胜肽所組成之酵素的製法
可藉E3多核苷酸導入後培育重組細胞並藉自該等細胞及/或培養物收集E3多胜肽而製備該由E3多胜肽所組成之酵素。
如該段落“使用具有E1多核苷酸之重組細胞之製備由E1多胜肽所組成之酵素的方法”中所述之相同方式及條件可用於培育經E3多核苷酸、培養基、及E3多胜肽之離析/純化所提供之重組細胞。
本發明之第四製法使用分別在上文段落A-2、B-2及C-2中所詳述之E1至E3多核苷酸中之至少一種。
D-I-8.藉第四製法而製成之含有二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚的產物
本發明提供一種藉前述第四製法而製成之含有二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚之產物。如上述，藉合適地合併第四至第六步驟，本發明第四製法可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮、自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮並自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
因此，該藉本發明之第四製法而製成之產物含有二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮、及/或雌馬酚。
本發明該產物可以呈如在第四製法中所製成之溶液的形式使用或可以是藉粗略地或合適地純化該溶液而獲得之二氫大豆黃酮產物、四氫大豆黃酮產物或雌馬酚產物。
本發明該產物可併入食品、飲料或化妝品產物材料、醫藥產物等內或可作為受質。
D-II-1.一設有第一反應容器至第三反應容器中至少一種的用於製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚之裝置
本發明提供一設有以下第一反應容器至第三反應容器中之至少一種的用於製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚之裝置(在下文中，本裝置偶爾稱為“第一製備裝置”)。
第一反應容器
第一反應容器為具有一可將由(Aa)至(Ac)多胜肽(El多胜肽)中之一種所組成之酵素固定的反應裝置(在下文中，本裝置偶爾稱為“反應裝置1”)之反應容器。本反應容器係用於使用該多胜肽自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮的方法。在本反應容器內，該反應裝置係配置在可以與大豆黃酮接觸之位置。
第二反應容器
第二反應容器為具有一可將由(Ba)至(Bc)多胜肽(E2多胜肽)中之一種所組成之酵素固定的反應裝置(在下文中，本裝置偶爾稱為“反應裝置2”)之反應容器。本反應容器係用於使用該多胜肽自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮的方法。在該反應容器內，該反應裝置係配置在可以與二氫大豆黃酮接觸之位置。
第三反應容器
第三反應容器為具有一可將(Ca)至(Cc)多胜肽(E3多胜肽)中之一種所組成的酵素固定的反應裝置(在下文中，本裝置偶爾稱為“反應裝置3”)之反應容器。本反應容器係用於使用該多胜肽自四氫大豆黃酮製備雌馬酚的方法。在該反應容器內，該反應裝置係配置在可以與四氫大豆黃酮接觸的位置。
本發明之第一製備裝置可藉合適地合併第一至第三反應容器而製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚。
本發明第一製備裝置具有第一反應容器、第二反應容器及第三反應容器中之至少一種。
例如當本發明之第一製備裝置具有第一反應容器且未具有第二反應容器及第三反應容器時，本發明之第一製備裝置可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮。
例如當本發明之第一製備裝置具有第二反應容器且未具有第一反應容器及第三反應容器時，本發明之第一製備裝置可自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮。
例如當本發明之第一製備裝置具有第三反應容器且未具有第一反應容器及第二反應容器時，本發明之第一製備裝置可自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
例如當本發明之第一製備裝置具有第一反應容器及第二反應容器具未具有第三反應容器時，本發明之第一製備裝置可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮並自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮。
例如當本發明之第一製備裝置具有第二反應容器及第三反應容器且未具有第一反應容器時，本發明之第一製備裝置可自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮並自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
例如當本發明之第一製備裝置具有第一反應容器、第二反應容器、及第三反應容器時，本發明之第一製備裝置可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮、自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮並自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
在本發明之第一製備裝置內，單一反應容器可具有該反應裝置1至3中之兩種。
例如當反應裝置1及2係提供在單一反應容器內時，可在一反應容器內進行在第一反應容器及第二反應容器內所進行之各該反應。此外，例如當該反應裝置1至3係提供在單一反應容內時，可在一反應容器內進行在第一至第三反應內所進行之各該反應。
就保證獲得所欲作用而言，將這些反應裝置安置在該反應容器之方法式並未受限。
此外，當本發明第一製備裝置具有該反應裝置1至3中至少兩種、及多個不同反應容器時，該等反應容器係經由一供應裝置而連接。
例如當本發明之第一製備裝置具有第一反應容器及第二反應容器且未具有第三反應容器時，其中該第一反應容器及第二反應容器為獨立單元且該第一反應容器及第二反應容器分別含有該反應裝置1及2；該第一反應容器及第二反應容器係經由用於將在該第一反應容器內所製成之二氫大豆黃酮供應至第二反應容器之供應裝置而連接。
此外，例如當本發明之第一製備裝置之一反應容器內包括該反應裝置1及2並在另一反應容器內包括該反應裝置3時，該含有反應裝置1及2之反應容器與該含有反應裝置3之反應容器係經由用於將在該含有反應裝置1及2之反應容器內所製成之產物供應至該含有反應裝置3之反應容器的供應裝置而連接。
該產物可以呈如所製成之溶液形式或可以是藉粗略地或合適地純化該溶液而獲得之二氫大豆黃酮產物等。
反應容器
提供在本發明之第一製備裝置內之該第一反應容器至第三反應容器的形狀、大小、材料等並未受限，但其限制條件為各容器可含有一反應裝置且可適當地製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚。
反 應裝置
欲用在本發明之第一製備裝置內之該反應裝置1至3並未受限，但其限制條件為彼等各含有一各別已固定之酵素且可適當地製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚。
在各反應裝置內經固定之各該酵素可經粗略地或合適地(完全地)純化。使用已知方法進行反應裝置內之由該等多胜肽中之一種所組成之酵素的固定化步驟。
例如當該酵素係在載體內經固定時，該載體並未受限，但其限制條件為可表現該酵素之所欲活性。該載體之實例包括具有可經由共價鍵而與該酵素鍵結之官能基，諸如胺基、羧基或羥基的載體；及可經由交聯劑而與由該多胜肽所組成之酵素連接之載體。該載體之形狀並未受限。可根據用於將酵素固定在該載體內之所採用的已知技術合適地選擇該載體、官能基、及交聯劑等。亦使用已知方法進行該載體內之由該多胜肽所組成之酵素的固定化步驟。
供應裝置
該提供在本發明之第一製備裝置內的供應裝置並未受限，但其限制條件為其可連接用在本發明之第一製備裝置內之多個不同反應容器且可在本發明之第一製備裝置內製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚。可根據合適已知技術藉合適裝置而構成該供應裝置。
E1至E3多胜肽
用於本發明之第一製備裝置內之E1至E3多胜肽與上文之E1至E3多胜肽相同。
在第一反應容器內製備二氫大豆黃酮之方法
第一反應容器可以在NADPH及/或NADH存在下，使由已固定在該反應裝置1內之E1多胜肽所組成之酵素為大豆黃酮作用以使該大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮、該由E1多胜肽所組成之酵素可以與作為該由E1多胜肽所組成之酵素的輔酵素之NADPH及/或NADH一起固定在該反應裝置內。可根據上文“第一步驟”之說明文中所詳述之方法進行第一反應容器內之該反應。
在 第二反應容器內製備四氫大豆黃酮之方法
第二反應容器可以在NADPH及/或NADH存在下，使由E2多胜肽所組成之酵素對二氫大豆黃酮作用以使該二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮。該由E2多胜肽所組成之酵素可以與作為該由E2多胜肽所組成之酵素的輔酵素之NADPH及/或NADH一起固定在該反應裝置內。可根據上文‘‘第二步驟”之說明文中所詳述之方法進行第二反應容器內之該反應。
在第三反應容器內製備雌馬酚之方法
第三反應容器可以使由已固定在該反應裝置3內之E3多胜肽所組成之酵素對四氫大豆黃酮作用以使該四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚。可根據上文“第三步驟”之說明文中所詳述之方法進行第三反應容器內之該反應。
D-II-2.一包括第四至第六反應容器中至少一種之用於製備
二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚之裝置本發明提供一包括以下第四至第六反應容器中之至少一種的用於製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚之裝置(在下文中，本裝置偶爾稱為“第二製備裝置”)。
第四反應容器
第四反應容器為具有一可將由(Ad)至(Af)多核苷酸(E1多核苷酸)中之一種所組成之重組細胞固定的反應裝置(在下文中，本裝置偶爾稱為“反應裝置4”)之反應容器。本反應容器係用於使用該多核苷酸自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮之方法。在該反應容器內，該反應裝置係配置在可以與大豆黃酮接觸之位置。
第五反應容器
第五反應容器為具有一可將(Bd)至(Bf)多核苷酸(E2多核苷酸)中之一種所組成之重組細胞固定的反應裝置(在下文中，本裝置偶爾稱為“反應裝置5”)之反應容器。本反應容器係用於使用該多核苷酸自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮之方法。在該反應容器內，該反應裝置係配置在可以與二氫大豆黃酮接觸之位置。
第六反應容器
第六反應容器為具有一可將由(Cd)至(Cf)多核苷酸(E3多核苷酸)中之一種所組成之重組細胞固定的反應裝置(在下文中，本裝置偶爾稱為“反應裝置6”)之反應容器。本反應容器係用於使用該多核苷酸自四氫大豆黃酮製備雌馬酚之方法。在該反應容器內，該反應裝置係配置在可以與四氫大豆黃酮接觸之位置。
本發明之第二製備裝置可藉合適地合併第二至第六反應容器而製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚。
本發明之第二製備裝置具有第四反應容器、第五反應容器及第六反應容器中之至少一種。
例如當本發明之第二製備裝置具有第四反應容器且未具有第五反應容器及第六反應容器時，本發明之第二製備裝置可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮。
例如當本發明之第二製備裝置具有第五反應容器且未具有第四反應容器及第六反應容器時，本發明之第二製備裝置可自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮。
例如當本發明之第二製備裝置具有第六反應容器且未具有第四反應容器及第五反應容器時，本發明之第二製備裝置可自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
例如當本發明之第二製備裝置具有第四反應容器及第五反應容器且未具有第六反應容器時，本發明之第二製備裝置可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮並自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮。
例如當本發明之第二製備裝置具有第五反應容器及第六反應容器且未具有第四反應容器時，本發明之第二製備裝置可自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮並自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
例如當本發明之第二製備裝置具有第四反應容器、第五反應容器、及第六反應容器時，本發明之第二製備裝置可自大豆黃酮製備二氫大豆黃酮、自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮並自四氫大豆黃酮製備雌馬酚。
在本發明之第二製備裝置中，單一反應容器可具有該反應裝置4至6之兩種。
例如當反應裝置4及5係提供在單一反應容器內時，可在一反應容器內進行在第四反應容器及第五反應容器中所進行之各該反應。此外，例如當該反應裝置4至6係提供在單一反應容器內時，可在一反應容器內進行在第四至第六反應容器內所進行之各該反應。
就保證獲得所欲作用而言，將這些反應裝置安裝在該反應容器的方式並未受限。
此外，當本發明之第二製備裝置具有該反應裝置4至6中至少2種、及多個不同反應容器時，該反應容器係經由一供應裝置而連接。
例如當本發明之第二製備裝置具有第四反應容器及第五反應容器且未具有第六反應容器時，其中該第四反應容器及第五反應容器為獨立單元且該第四反應容器及第五反應容器分別含有反應裝置4及5；該第四反應容器及第五反應容器係經由一用於將在第四反應容器中所製成之二氫大豆黃酮產物供應至第五反應容器之供應裝置而連接。
此外，例如當本發明之第二製備裝置之一反應容器包括該反應裝置4及5且在另一反應容器包括反應裝置6時，該含有反應裝置4及5之反應容器、與該含有反應裝置6之反應容器係經由一用於將該含有反應裝置4及5之反應容器中所製成之產物供應至該含有反應裝置6之反應容器的供應裝置而連接。
該產物可以呈如所製成之溶液形式或可以是藉粗略地或進適地純化該溶液而獲得之二氫大豆黃酮產物等。
反應容器
提供在本發明之第二製備裝置中之該第四反應容器至第六反應容器的形狀、大小、材料等並未受限，但其限制條件為各容器可含有一反應裝置且可合適地製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚。
反應裝置
欲用於本發明之第二製備裝置中之該反應裝置4至6並未受限，但其限制條件為其等各含有一各別已固定之重組細胞且可合適地製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚。
在該反應裝置內該重組細胞之固定化步驟並未受限，但其限制條件為可呈現該重組細胞之所欲活性且可使用已知方法進行。可在反應裝置內培育該重組細胞。可根據上文“第四步驟”、“第五步驟”、及“第六步驟”之說明文以決定該等重組細胞之培育條件。
供應裝置
該提供在本發明之第二製備裝置內的供應裝置並未受限，但其限制條件為其可連接用在本發明之第二製備裝置內之多個不同反應容器且可在本發明之第二製備裝置內製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚。可根據合適已知技術藉合適裝置而構成該供應裝置。
重組細胞
用於本發明之第二製備裝置中之該等重組細胞與上文段落“用於第四步驟中之重組細胞”、“用於第五步驟中之重組細胞”、及“用於第六步驟中之重組細胞”中所詳述之重組細胞相同。
E1至E3多胜肽
用於本發明之第二製備裝置中之E1至E3多核苷酸與上述E1至E3多核苷酸相同。
在第四反應容器中製備二氫大豆黃酮之方法
第四反應容器可使用由已固定在反應裝置4內之E1多核甘酸所組成之重組細胞將大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮。可根據上文“第四步驟”之說明文中所詳述的方法以進行第四反應容器中之該反應。
在第五反應容器中製備四氫大豆黃酮之方法
第五反應容器可使用由已固定在反應裝置5內之E2多核甘酸所組成之重組細胞將二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮。可根據上文“第五步驟”之說明文中所詳述之方法以進行第六反應容器中之該反應。
在 第六反應容器中製備雌馬酚之方法
第六反應容器可使用由已固定在反應裝置6中之E3多核甘酸所組戌之重組細胞將四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚。可根據上文“第六步驟”之說明文中所詳述之方法以進行第六反應容器中之該反應。
D-II-3.包括第一至第三反應容器中之至少一種、及第四至第六反應容器中之至少一種的用於製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚之裝置
本發明提供一包括第一至第三反應容器中之至少一種、及第四至第六反應容器之至少一種的用於製備二氫大豆黃酮、四氫大豆黃酮及/或雌馬酚之裝置(在下文中，本裝置偶爾稱為“第三製備裝置”)。
可根據上文第一及第二製備裝置所述以組合第三製備裝置中之該等反應容器、反應裝置。在第三製備裝置中之該等反應容器、反應裝置、多核苷酸、重組細胞、及該等反應容器內之反應過程與用於上文第一及第二製備裝置之彼等相同。
實例
實例A
參考例A1
在含大豆黃酮之擴增液體培養基(一其中已添加10微克/毫升之大豆黃酮的改良性GAM肉湯培養基(NissuiPharmaceutical Co. Ltd.))內接種乳酸球菌屬20-92菌株(FERM BP-10036)並於37℃在厭氣條件(BBL Gas Pack系統)下培育該培養物，費時最好自7至18小時。培育後，藉離心法而收集該等細胞並低溫保存以便用於下文之各實例中。
實例A1：在破裂細胞物質之經離心處理的上澄清液中進行二氫大豆黃酮生物合成活性之確認、及NADPH依存性之確認
將該等已經凍結細胞(67毫升瓶×2)解凍，並於4℃下以8,000rpm進行離心處理，費時10分鐘。該小粒係用於下文之試驗中。首先，使該小粒懸浮在2毫升之含1mM PMSF(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)、 2mM DTT(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)及5mM亞硫酸氫鈉(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)之0.1M磷酸鉀溶液內。將該懸浮液送至2個具有螺旋蓋(Assist)並經0.1mM氧化鋯/氧化矽小粒(BioSpec Products,Inc.)之2毫升管內。使用FP100A(Thermo ELECTRON CORPORATION(6500rpm，10秒、冰冷却×8)分裂該等細胞。使所形成液體經離心處理以獲得上澄清液。於4℃下以約10,000rpm進行該破裂細胞懸浮液之離心處理以獲得上澄清液，然後使其經含1mM PMSF、2mM DTT及5mM亞硫酸氫鈉之0.1M磷酸鉀溶液稀釋至4.5毫升。其可作為酵素源。
製備以下之組成物的酵素反應混合物並於37℃下培育該混合物，費時2小時，培育後，添加3毫升乙酸乙酯至該酵素反應混合物以進行萃取。乾燥後，藉流動相(溶離劑)而溶解萃取物。藉HPLC而分析該經溶解產物。作為用於HPLC分析之標準溶液，係使用具有大豆黃酮(2微克/毫升；Funakoshi Corporation)、雌馬酚(2微克/毫升；Funakoshi Corporation)、二氫大豆黃酮(2微克/毫升；Trend(Toronto?)Research Chemicals Inc.)之混合溶液。
酵素反應混合物之組成
破裂細胞之上澄清液(酵素源)：　250微升
無菌水、NADH(100mM)或NADPH(100mM)：　5微升
二氫大豆黃酮(1毫克/毫升)：　10微升
0.1M磷酸鉀緩衝劑pH 7/1 mM DTT/5mM 亞硫酸氫鈉：　735微升
總共：1,000微升
該等結果示於第1圖中。該等結果證實二氫大豆黃酮生物合成活性存在於該破裂細胞物質之經離心處理的上澄清液中。亦證實大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮之作用係取決於該輔酵素NADH。
實例2：二氫大豆黃酮合成酵素之純化
在每一培育瓶67毫升之改良性GAM肉湯培養基(NissuiPharmaceutical Co. Ltd.)內培育乳酸球菌屬20-92菌株細胞，費時18小時。離心處理得自9個此等瓶之經培養細胞並懸浮在含有2mM DTT(1,4-二硫蘇糖醇，Merck)、5mM亞硫酸氫鈉(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)及蛋白酶抑制劑(無EDTA之完全蛋白酶抑制劑，Roche Diagnostics)之0.1M磷酸鉀緩衝劑(pH7)內。將該懸浮液送至3個具有螺旋蓋(Assist)且已預先含有0.1mM氧化鋯/氧化矽小粒(BioSpec Products,Inc.)之2毫升管內。使用FP100A(Thermo ELECTRON CORPORATION)(6500rpm，20秒×4)破裂該等細胞。使所形成液體經離心處理以獲得上澄清液。
在每一培育瓶200毫升之相同液體培養基內培育乳酸球菌屬20-92菌株細菌，費時18小時。離心處理得自8個此等瓶之經培養細胞以獲得相當於8個瓶之上澄清液。
使用含有1mM PMSF(苯基甲基磺醯氯，Sigma Aldrich)、2mM DTT及5mM亞硫酸氫鈉之0.1M磷酸鉀緩衝劑(pH7.0)(下文中稱為“緩衝劑A”)以進行純化。使該等經破裂細胞之上澄清液與含有相同數量之2M硫酸銨的緩衝劑A混合並放在已裝填Butyl Sepharose 4 Fast Flow(該凝膠為每一瓶約0.3毫升，GE Healthcare)並經含1M硫酸銨之緩衝劑A平衡之Micro Bio旋轉柱(×11,Bio-Red Laboratories,Inc.)內。經含1M硫酸銨之緩衝劑A清洗，繼而經0.75毫升含0.5M硫酸銨之緩衝劑A沖洗兩次後，先後添加0.75毫升及0.5毫升緩衝劑A以溶析具有二氫大豆黃酮合成活性之溶離份。在下文中，藉添加0.75毫升緩衝劑A而獲得之該溶離液稱為溶離液I、而藉添加0.5毫升緩衝劑A而獲得之該溶離液稱為溶離液II。
分別添加0.3毫升及0.2毫升含3.4M硫酸銨之緩衝劑A至該溶離液I(使用0.75毫升緩衝劑A所製成)及溶離液II(使用0.5毫升緩衝劑A所製成)。然後，混合這兩種溶離液以便使用經含1M硫酸銨之溶離劑平衡之TSKgel Ether-5PW柱(TOSOH)以進行HPLC。將0.5毫升該混合溶液倒至該柱共2至9次，繼而使用含1M硫酸銨之溶離劑(溶離劑B)以0.1毫升/分鐘之流率進行清洗。其後，使用一程序列改變溶離劑B對溶離劑A之混合比率以使硫酸銨之濃度在15分鐘內線性降低至0M(溶離劑A)。在約0.6M至0.35M硫酸銨之溶析位置可發現該酵素活性，且總溶離液為約3.5毫升。下文表示該HPLC之條件。可發現280奈米之蛋白質吸收。
柱：TSKgel Ether-5PW
流率：以試樣供應計0.05至0.1毫升/分，以溶析計0.1毫升/分
溶離劑A：0.1M磷酸鉀緩衝劑(pH 7.0)/2mM DTT/2.5mM亞硫酸氫鈉/1%2-丙醇
溶離劑B：含1M硫酸銨之溶離劑A
以緩衝劑A稀釋可發現該酵素活性之溶析位置的溶離液並將該經稀釋液體送至已裝填2’5’ ADP Sepharose 4B(GE Healthcare；該凝膠為每一瓶約0.3毫升)並經緩衝劑A平衡之Micro Bio旋轉柱。以緩衝劑A清洗該柱後，先後以0.7毫升及0.6毫升含20mM NADPH之緩衝劑A組成物(pH 7.5)溶析具有該二氫大豆黃酮合成活性之溶離份。
使所獲得溶離液接受使用經溶離劑C(pH 7.5)平衡之Mono Q柱(GE Healthcare)所進行之HPLC。以0.1毫升/分之流率將溶離劑C送至該柱。清洗後，改變溶離劑C對溶離劑D之混合比率以進行一用於使其線性轉變成0.65M NaCl之程序，費時32.5分鐘。下文表示該HPLC之條件。可發現280奈米之蛋白質吸收。
柱：Mono Q PC 1.6/5
溶離劑C：0.1M磷酸鉀緩衝劑pH 7.5/3mM DTT/2.5mM亞硫酸氫鈉/1%2-丙酮
溶離劑D：含1M NaCl之溶離劑C
在0.4至0.46M NaCl溶離份(第28至30號溶離份)中發現該酵素活性。
第2圖表示Mono Q HPLC之結果及該酵素活性。第3圖表示用於第27至31號溶離份之SDS-PAGE的結果。根據這些結果，在還原狀態下具有二氫大豆黃酮合成活性之該溶離份中可發現70kDa譜帶。
實例A3：N末端胺基酸序列之測定
添加30微升之0.1%三氟乙酸(TFA)至70微升藉該Mono Q HPLC而獲得之具有二氫大豆黃酮合成活性的第29號溶離份(總共100微升)。
使ProSorb藥筒(Applied Biosystems Japan)之PVDF膜經10微升甲醇弄濕並添加上述混合液體。使用ProSorb濾器(Applied Biosystems Japan)吸收水後，乾燥該膜，然後使用膜打孔機切開該膜。使該膜經20%甲醇清洗5次，然後乾燥。使用蛋白質測序儀(Applied Biosystems,Procise 494cLC)進行該膜之N末端胺基酸序列分析以找出具有以下22個殘基之連續胺基酸序列。
Met Lys Asn Lys Phe Tyr Pro Lys Thr Phe Glu Arg Gly Tyr Ile Gly Asn Leu Glu Val Glu Asn(序列辨識編碼：19)
實例A4：胺基酸序列之測定
使用消化酵素使該具有二氫大豆黃酮合成活性之酵素蛋白質分裂成胜肽。藉分析該胜肽之N末端中的胺基酸序列而發現該內胺基酸序列。
(1)試樣之製法
在每一培養瓶200毫升之改良性GAM肉湯培養基(Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.)內培育乳酸球菌屬20-92菌株細菌，費時18小時。使該等經培養之3種細菌菌株經離心處理並懸浮在含有2mM DTT(1,4-二硫蘇糖醇，Merck)、5m M亞硫酸氫鈉(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)及蛋白酶抑制劑(無EDTA之完全蛋白酶抑制劑混合劑，Roche Diagnostics)之0.1M磷酸鉀緩衝劑(pH 7.0)中。然後將該懸浮液移至具有螺旋蓋並含有0.1mM氧化鋯/氧化矽小粒(BioSpec Products,Inc.)之2毫升試管(Assist)內。使用FP100A(Thermo ELECTRON CORPORATION)(6500rpm，20秒×4)破裂該等細胞。離心處理所形成液體。
含有1mM PMSF(苯基甲磺醯氟，Sigma Aldrich)、2mM DTT及5mM亞硫酸氫鈉之0.1M磷酸鉀緩衝劑(pH 7)(在下文中稱為“緩衝劑A”)係用於下述方法。使該等經破裂細胞之上澄清液與含有相同數量之2M硫酸銨的緩衝劑A混合並放在已裝填Butyl Sepharose 4 Fast Flow(該凝膠為每一瓶約0.3毫升，GE Healthcare)並經含1M硫酸銨之緩衝劑A平衡之Micro Bio旋轉柱(×3，Bio-Red Laboratories,Inc.)內。經含1M硫酸銨之緩衝劑A清洗，繼而經0.75毫升含0.5M硫酸銨之緩衝劑A沖洗兩次，兩次添加0.75毫升緩衝劑A以溶析具有二氫大豆黃酮合成活性之溶離份。在下文中，該藉添加0.75毫升緩衝劑A而獲得之溶離液稱為溶離液I，而該藉添加0.5毫升緩衝劑A而獲得之溶離液稱為溶離液II。
使已裝填2’5’ ADP Sepharose 4B之Micro Bio旋轉柱經緩衝劑A平衡，然後添加1.5毫升該先前經溶析之溶液。經0.75毫升緩衝劑A清洗5次後，先後使用0.75毫升及0.45毫升含20mM NADPH之緩衝劑以進行溶析。混合該等溶離液並除鹽，且在微量離心濃縮管(NANOSEP 10K OMEGA,Pall Life Sciences)中濃縮。
使該濃縮溶液與含2-巰基乙醇之雙濃縮SDS-PAGE試樣緩衝劑混合；並於90℃下加熱該混合物，費時7分鐘，然後根據Laemmuli方法以進行SDS-PAGE。使用The SuperSep HG 10-20%(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)作為電泳凝膠板。經Colloidal Blue(Invitrogen)染色並接著經Milli-Q水脫色後，刪去70kDa電泳條帶。作為對照物在無蛋白質電泳區中自相同部份將等莫耳且相等大小之凝膠切成一條狀物並以相同方式進行處理。以相同方式處理另一組細胞，並在進行SDS-PAGE後，將該等細胞移至PVDF膜。然後，使一在相同位置之條帶進行N末端胺基酸序列分析以確認符合該Mono Q HPLC中之第29號溶離份的序列。
(2)還原性羧醯胺甲基之產生及酵素切割
將經切除之凝膠切成斷片，使用50%乙腈水溶液脫色，藉乙腈而脫水並經離心增稠器(SpeedVac A160,Savant)乾燥。添加含55mM DTT之100mM碳酸氫銨水溶液後，於56℃下進行還原反應，費時一小時。移除DTT溶液後，添加含100mM碘乙醯胺之100mM碳酸氫銨水溶液，並溫和地搖動該藉光線而阻絕之混合物，費時30分鐘以產生羧醯胺甲基。移除該反應試劑後，連續以50%乙腈水溶液、乙腈、100mM碳酸氫銨水溶液、及乙腈清洗該凝膠，然後藉離心增稠器而乾燥。添加含2微克Achromobacter蛋白酶I(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)及0.02% Tween 20之20mM Tris-HCL緩衝劑並於37℃下進行切割，費時7小時。將該離心上澄清液移至另一試管並使該凝膠與60%乙腈-0.1%TFA水溶液混合且於30℃下加熱20分鐘。使該經加熱混合物經boltexed，費時10分鐘共3次以獲得胜肽片段。收集欲使用Ultrafree-MC(0.22微米，Amicon)進行過濾之上澄清液，繼而進行離心濃縮。
(3)胜肽繪圖
經由逆相HPLC，可離析得自該酵素切割之胜肽。
柱：μRPC C2/C18 SC2.1/10(GE Healthcare Bio Science)
流率：0.l毫升/分
溶離劑E：0.05% TFA
溶離劑F：90%乙腈/0.04% TFA
溶析程序：0分鐘：5% F
3分鐘：5% F
43分鐘：65% F
48分鐘：100% F
68分鐘：100% F
溶離份：30微升
檢測：215奈米
例如“0分鐘5% B”表示於該溶析步驟之時間0下分別使用含95%之溶離劑E及溶離劑F之溶離劑。
(4)內胺基酸序列分析
與該對照層析圖比較，選擇可顯示二氫大豆黃酮合成活性之經酵素-蛋白質-衍生之胜肽波峰並使用蛋白質測序儀(Applied Biosystems,Procise 492HT)進行N末端胺基酸序列分析。使用逆相HPLC進行分離後，於第20.6分鐘下開始溶析。下文表示該溶析尖峰之胺基酸序列(在下文中稱為胜肽1)。
Phe Asp Glu Pro Val Tyr Pro Gln Ala Glu(序列辨識編碼：20)下文表示於第22.1分鐘下開始之溶析之尖峰的胺基酸序列(在下文中稱為胜肽2)。
Ala Ser Arg Met Val Met Asp Ala Val His Glu Gly Tyr Ile Ala Gly(序列辨識編碼：21)
於第26.6分鐘下開始之溶析的尖峰為一非明確地精確之胜肽；然而，如下述，其N-末端具有甘胺酸，該甘胺酸為自該酵素蛋白質之N末端算起第13個殘基(在下文中，以下胺基酸序列稱為胜肽3)。
Gly Tyr Ile Gly Asn Leu Glu Val Glu Asn Arg Ala Ile Arg Met Pro Met(序列辨識編碼：22)
第4圖表示實例4A中之胜肽繪圖的結果、及相當於各該尖峰之胺基酸序列。
尖峰1(20.6分鐘)
尖峰2(22.1分鐘)
尖峰3(26.6分鐘)
實例A5：得自純化多胜肽之N末端及部份胺基酸序列之二氫大豆黃酮合成酵素基因的擴增
根據實例A3及A4所獲得之該N末端及部份胺基酸序列，設計並產生一變性引子。使用乳酸球菌屬20-92菌株之基因組DNA作為模板，可藉變性PCR而進行可將該二氫大豆黃酮合成酵素編碼之基因的擴增作用。
(1)自乳酸球菌屬20-92菌株進行基因組DNA之純化
於4℃下以5000rpm離心處理在厭氣條件下在40毫升改良性GAM肉湯培養基(Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.)內所培育之乳酸球菌20-92菌株，費時10分鐘。藉傾析而移除該培養基並收集該等細菌細胞。在QIAGEN Genomic DNA Buffer Set(Qiagen)中使該等細胞立即懸浮在11毫升B1溶液(其含有200微克/毫升之RNase)中並在與300微升溶菌酶(Lysozyme)溶液(100毫克/毫升)、及500微升QIAGEN蛋白酶K溶液(Qiagen)混合後，於37℃下培育16小時。然後，在與4毫升B2溶液混合並數次進行底遢轉(end-over-end)混合後，於50℃下進行3小時培育。
於4℃下以5000rpm離心處理該培養基，費時10分鐘。將該上澄清液注入經QBT溶液平衡之QIAGEN基因組的尖端500/G(Qiagen)柱內以使該基因組DNA黏附於該柱。以30毫升QC溶液清洗該柱共兩次後，使用15毫升QF自該柱溶析該基因組DNA；然後添加10.5毫升異丙醇以鹽析該DNA。將似沈澱線之基因組DNA放入1.5毫升微量試管內，經75%乙醇清洗並風乾，然後使其溶解在250微升TE溶液(0.4微克/微升)內。測定如此獲得之該基因組DNA溶液的濃度，然後藉添加TE溶液而將該溶液調整至40毫微克/微升。使用本DNA溶液作為PCR之模板。
(2)變性引子之設計及製備
在變性引子之設計時，為了降低變性值，根據格氏乳酸球菌屬之密碼子使用信息(Codon Usage Databasehttp://www.kazusa.or.jp/codon/ )，各胺基酸中之最常見的密碼子係用於該5’末端上之序列。此外，混合鹼係用於該3’末端之序列以避免與該二氫大豆黃酮合成酵素基因錯配。
根據在實例A3中所測定之該N末端序列：MKNKFYPKTFERGYIGNLEVEN以設計並產生欲用於變性PCR之以下變性引子。
E1-N-末端-31：TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGA (序列辨識編碼：23)
(在序列辨識編碼：23中，在第11及第14位置之“N”代表肌苷，而在第20至第26位置之“N”代表腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸嘧啶。)
E1-N-末端-37：TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGARRGNGG
(序列辨識編碼：24)
(在序列辨識編碼：24中，在第11、第14、第20及第26位置之“N”代表肌苷，而在第35位置之“N”代表腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸嘧啶。)
E1-N-末端-F32：ATGAAGAATAAGTTTTAYCCNAARACNTTYGA
(序列辨識編碼：25
(在序列辨識編碼：25中，在第21及第27位置之“N”代表腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸嘧啶。)
此外，根據在實例4A中所測定之該內序列胜肽2：ASRMVMDAVHEGYIAG以設計並產生欲用於變性PCR之以下變性引子。
E1-內-RP1：CCTGCAATATAACCTTCATGTACNGCRTCCATNACCAT
(序列辨識編碼：26)
(在序列辨識編碼：26中，在第24及第33位置之“N”代表腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或胸嘧啶。)
作為本實例之該等引子的所有寡DNA係藉Sigma-Aldrich Japan K.K.而製成。
(3)經由變性PCR而進行二氫大豆黃酮合成酵素基因之擴增
使用所製成之變性引子，藉變性PCR而進行二氫大豆黃酮合成酵素基因之擴增。
以下為用在該變性PCR中之變性引子的組合。
(i)E1-N-末端-31及E1-內-RP1
(ii)E1-N-末端-37及E1-內-RP1
(iii)E1-N-末端-F32及E1-內-RP1
在藉變性PCR而進行二氫大豆黃酮合成酵素之擴增時，使用Ex-Taq DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)。該擴增程序為：95℃，2分鐘(95℃，45秒：38℃至54℃，30秒；72℃，2分鐘)×50次循環、及72℃、3分鐘。考慮到與該變性引子之基因組DNA的錯配，該黏合作用(annealing)係以5階段進行，其係於38℃下開始，在進行各別一階段前增加4℃，直到達54℃為止。進行該PCR反應後，添加1/10之10×染料至該PCR產物。使用0.8%瓊脂糖凝膠使6微升該產物進行電泳。在本實例中之該瓊脂糖電泳法中，係使用溴化乙啶進行著色；並使用λ/StyI(Nippongene Co. Ltd.)及100bp梯狀物(Toyobo Co. Ltd.)作為分子量標誌物。
第5圖表示變性PCR產物之電泳結果。就在本實例之(3)中的該變性性引子(iii)之組合(E1-N-末端-F32及E1-內-RP1)而言，在該等黏合溫度之任一溫度中的DNA片段內發現約1.9kb擴增。當該黏合溫度為54℃時可發現最顯著的增加。
(4)經擴增DNA片段之鹼基序列的測定法
自該瓊脂糖凝膠刪去具約1.9kb之經擴增DNA片段(黏合溫度：54℃)並使用凝膠萃取(Gel-Extraction)套組(Qiagen)以進行純行。將該純化DNA片段插入pT7-藍色選殖載體(Blue Cloning Vector)(Novagen)內以測定鹼基序列。
使用DNA序列組裝軟體SEQUENCHER(Gene Codes Inc,USA)以分析所獲得DNA鹼基序列，結果為該DNA片段含有該相當於實例A4中所發現之胜肽1及3的胺基酸序列之鹼基序列。
實例A6：二氫大豆黃酮合成酵素基因之完整鹼基序列的測定
為了測定實例A5中所獲得之該1.9kb二氫大豆黃酮合成酵素基因的5’末端及3’末端之序列以確定該等完整鹼基序列，使用該乳酸球菌屬20-92菌株之基因組DNA基因庫作為模板以進行cDNA末端序列(5’-、3’-RACE)之快速擴增。
(1)基因組DNA基因庫之製備
使用限制核酸內切酶(BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、SalI、Sau3AI、XhoI：Takara Bio Inc.之產品)於37℃下經由16小時切割而分裂在實例A5中所純化之該乳酸球菌屬20-92菌株的基因組DNA。經酚/氯仿處理後，藉乙醇沿降作用而純化該片段。使用TaKaRa連接套組(Ligation kit)var.2.1(Takara Bio Inc.)使該等純化基因組DNA片段與先前藉相應的限制核酸內切酶而切除並藉蝦鹼性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase)(Takara Bio Inc.)而去磷酸化之pUC19選殖載體連接以產生一基因組DNA基因庫。
(2)cDNA末端序列(5’-RACE、3’-RACE)之快速擴增
使該基因組DNA基因庫(連接反應液體)經無菌水稀釋20倍。使用1微升模板進行藉cDNA末端序列(5’-RACE、3’-RACE)之快速擴增而擴增該二氫大豆黃酮合成酵素基因的5’末端及3’末端之序列。
(2-1)引子
以下為分別用於5’-RACE、3’-RACE之引子的組合。
(2-1-1)5’-RACE
第一-PCR：E1-RACE-N-P1及pUC19-FP-1、E1-RACE-N-P1及pUC19-RP-1
巢式-PCR：E1-RACE-N-P2及pUC19-FP-2、E1-RACE-N-P2及pUC19-RP-2
(2-1-2)3’-RACE
第一-PCR：E1-RACE-RP2-1及pUC19-FP-1、E1-RACE-RP2-1及pUC19-RP-1
巢式-PCR：E1-RACE-RP2-2及pUC19-FP-2、E1-RACE-RP2-2及pUC19-RP-2
(2-1-3)所使用引子之序列
以下為分別用於5’-RACE、3’-RACE之引子的序列。用於載體之引子：
pUC19-FP-1：ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG
(序列辨識編碼：27)
pUC19-RP-1：AGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGC
(序列辨識編碼：28)
pUC19-FP-2：ATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGG
(序列辨識編碼：29)
pUC19-RP-2：CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG
(序列辨識編碼：30)
用於二氫大豆黃酮合成酵素基因之引子
E1-RACE-N-P1：ATGCGGATCGCTCGGTTCTCGACCTCTAGGTTAC
(序列辨識編碼：31)
E1-RACE-RP2-1：ATCGAGGAGAAGTGCGAGGACGTCAGGGTCATC
(序列辨識編碼：32)
E1-RACE-N-P2：TTCTCGACCTCTAGGTTACCGATGTAGCCGC
(序列辨識編碼：33)
E1-RACE-RP2-2：ACGTCAGGGTCATCGGCATCGGCGACTGCAAG
(序列辨識編碼：34)
藉Sigma-Aldrich Japan K.K.而製備作為本實例中之該等引子的所有寡DNA。
(2-2)使用5’-RACE及3’-RACE進行該二氫大豆黃酮合成酵素基因之5’末端及3’末端之序列的擴增
Ex-Taq DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)係用於5’-RACE、3’-RACE。使用相同擴增程序：95℃ 2分鐘，(95℃ 45秒、60℃ 30秒、72℃ 1分鐘)×30次循環，72℃ 3分鐘以進行第一-PCR及巢式-PCR。在第一-PCR中，係使用在上述方式中所製成之1微升(40毫微克)該基因組DNA稀釋液體作為模板。在巢式-PCR中，係使用0.5微升第一-PCR產物。
進行該巢式-PCR反應後，添加10×天之1/10至該PCR產物並使5微升該混合物進行使用0.8%瓊脂糖凝膠之電泳。所發現該DNA片段之擴增在5’-RACE為約1.2kb(SacI)及約1.0kb(Sau3AI)、且在3’-RACE為約0.6kb(SacI)及0.3kb(KpnI)。
在本發明之該瓊脂糖電泳中，係使用溴化乙啶(Nippongene Co. Ltd.)以進行著色；並使用λ/StyI(Nippongene Co. Ltd.)及100bp梯形物(Toyobo Co. Ltd.)作為分子量標誌物。
自該瓊脂糖凝膠切除該等經擴增DNA片段且使用凝膠萃取套組(Qiagen)進行純化。使用該等用於該擴增作用之引子，藉該直接序列而測定純化DNA片段之鹼基序列，結果是在5’-RACE具有約1.2kb(SacI)及約1.0kb(Sau3AI)之DNA片段、及在3’-RACE具有約0.6kb(SacI)之DNA片段中可發現該二氫大豆黃酮合成酵素基因的序列。
(3)二氫大豆黃酮合成酵素基因之完整鹼基序列的測定
使用DNA序列組裝軟體SEQUENCHER(Gene Codes Inc,USA)使該藉實例A5中之該變性PCR及本實例之(2)中該cDNA末端序列的快速擴張而獲得之DNA鹼序列進行分析。因此，發現在該二氫大豆黃酮合成酵素基因附近之3548bp的基因組結構。其表示該二氫大豆黃酮合成酵素基因為一由1935個核苷酸及644個胺基酸所組成之多胜肽。
核對藉該等鹼序列而發現之完整胺基酸序列、及藉該胺基酸序列而發現之部份胺基酸序列，結果為所有藉該胺基酸序列而發現之部份胺基酸序列被認為是藉該等鹼基序列而發現之完整胺基酸序列。
(4)在該覆蓋區內進行鹼基序列之確認
在本實例之(3)中所獲得之該序列中，發現具有藉在PCR擴增時合併DNA聚合酶之鹼基錯誤差而獲得不一致的鹼基之株系的許多部份。因此，使用該第一菌株cDNA作為模板，可使用Easy-高精確PC R選殖酵素(High-FidelityPCR Cloning Enzyme)(Stratagene)，其係為高精確DNA-聚合酶，經由PCR而擴增含有該二氫大豆黃酮合成酵素基之密碼區的區域(2368bp)。
以下為如上文使用之擴增引子。
E1-conf-NP：TGCCGGTGCAATGGCTGACATCATGTTCAACCTG(序列辨識編碼：35)
E1-conf-CP：TCCTCCATCGTTCCTCCAATCAGTAAGACACGCG(序列辨識編碼：36)
使用凝膠萃取套組(Qiagen)純化所獲得DNA片段，並使用直接序列進行該序列之確認及最終測定。
實例A7：藉添加大豆黃酮至擴增培養物溶液而誘導二氫大豆黃酮合成酵素基因之表現性
如實例A1中所示，當添加大豆黃酮(其係為受質)至該乳酸球菌屬20-92菌株之擴增培養溶液時，該等經培養細胞顯示二氫大豆黃酮合成活性。其可獲得以下假定：添加大豆黃酮至該擴增培養溶液可誘發二氫大豆黃酮合成酵素基因之轉錄且可進一步使其轉譯成蛋白質。根據本假定以進行以下試驗。在含有大豆黃酮之培養基內及在不含有大豆黃酮之培養基內培育經乳酸球菌屬20-29菌株衍生物之cDNA的兩試樣；使其等進行RT-PCR以查明二氫大豆黃酮合成酵素基因之表現性是否藉添加該大豆黃酮入擴增培養溶液內而誘發。
(1)自乳酸球菌屬20-92菌株萃取完整DNA並純化該DNA
以下述方法自乳酸球菌屬20-92菌株萃取該完整DNA並純化。
於37℃在厭氣條件下，在含有10毫克/升大豆黃酮(Funakoshi Co.,Ltd.)或不含有大豆黃酮之改良性GAM肉湯培養基內培育於4℃下維持之經密封乳酸球菌20-92菌株。將25毫升該培養溶液移至50毫升試管並於4℃下以3500rpm離心處理10分鐘。藉傾析而移除該培養基且收集細胞。藉液態氮而立即凍結所收集細胞。然後，根據用法說明，使用1毫升TRIzol溶液(Invitrogen)萃取並純化該完整RNA。藉DNase I(Invitrogen)而處理經純化完整RNA以移除該基因組DNA並用於合成第一-菌株cDNA。
(2)自該完整RNA合成第一- 菌株cDNA之方法
使用適於RT-PCR之SuperScript第一-菌株合成系統(Invitrogen)自藉DNaseI所處理之2微克該完整RNA合成該第一-菌株cDNA(逆轉錄)。根據用法說明，使用任意六聚物(Random Hexamer)混合物作為伸長引子以進行該第一-菌株cDNA之合成。此外，為了確認用於第一-菌株cDNA合成之藉DNase而處理之該完整RNA不含有基因組DNA，在未進行逆轉錄下，於相同條件下進行另一反應。該最終反應液體係作為用於RT-PCR之模板。以下為如此製成之4種最終反應液體。
1.具有衍生自已培育在含大豆黃酮之培養基內之細菌細胞的完整RNA之逆轉錄產物(DZN(+)RT(+))
2.具有衍生自已培育在不含大豆黃酮之培養基內之細菌細胞的完整RNA之逆轉錄產物(DZN(-)RT(+))
3.具有衍生自已培育在含大豆黃酮之培養基內之細菌細胞的完整RNA之非逆轉錄產物(DZN(+)RT(-))
4.具有衍生自已培育在不含大豆黃酮之培養基內之細菌細胞的完整RNA之非逆轉錄產物(DZN(-)RT(-))
(3)使用RT-PCR確認二氫大豆黃酮合成酵素基因之表現性
使用如本實例之(2)中所詳述之4種最終反應產物作為模板，經由RT-PCR而擴增該二氫大豆黃酮合成酵素基因。比較彼此之表現性數量。作為對照物，係於相同時間下使用16S-核糖體RNA序列作為對照基因以進行另一RT-PCR。
以下為在RT-PCR中之擴增條件、及一用於各基因擴增之引子序列。Ex-Taq DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)係用於RT-PCR。該擴增程序為：95℃ 2分鐘，(95℃ 30秒、56℃ 20秒、72℃ 30秒)×30次循環，72℃2分鐘。作為模板，係使用如在本實例之(2)中的1微升各最終反應液體。
以下表示一用於本實例之該RT-PCR的引子序列、及欲擴增之該DNA片段的大小。
二氫大豆黃酮合成酵素：239bp
E1-FP：CTACATCGGTAACCTAGAGGTCG(序列辨識編碼：37)
E1-RP：CCGTGCTGCTTGATGGTCTTTGC(序列辨識編碼：38)
16S-核糖體RNA序列：326bp Gar-16S-Ribo-FP：TGCGTAGATATATGGAGGAAC(序列辨識編碼：39)
Gar-16S-Ribo-RP：CTTATCTCTAAGGATAGCACG(序列辨識編碼：40)
根據格氏乳酸球菌屬菌株FLG12 16S核糖體RNA基因之序列，其係為藉National Center of Biotechnology Information:http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/而提供DNA資料庫(GenBank)中之部份序列(登錄號第AF352163-66號)，產生用於16S-核糖體RNA序列之擴增的該引子。
添加1/10之10×天至該PCR產物並使5微升該混合物進行使用0.8%瓊脂糖凝膠之電泳。可發現各DNA片段之擴增。
在本實例中之該瓊脂糖電泳內，係使用溴化乙啶(Nippongene Co. Ltd.)進行著色；並使用γ/StyI (Nippongene Co. Ltd.)及100bp梯形物(Toyobo Co. Ltd.)作為分子量標誌物。
第6圖表示結果。
如自經由RT-PCR而擴增二氫大豆黃酮合成酵素基因之結果可知，僅在衍生自已在不含大豆黃酮之培養基內培養之細菌細胞的該完整RNA之逆轉錄產物中發現基因之高效率表現性。不管是否合併大豆黃酮，在作為對照物之16S-核糖體RNA序列之擴增中可發現相同表現性程度。此外，由於在非逆轉錄產物中該二氫大豆黃酮合成酵素基因及16S-核糖體RNA序列皆未擴增，所以已確認用於合成第一-菌株cDNA之藉DNase I而處理的該完整RNA並未含有基因組DNA。這些結果證明添加大豆黃酮至該培養基可誘發二氫大豆黃酮合成酵素基因之mRNA的表現性。
實例A8：使用大腸桿菌表現重組型E1多胜肽、及二氫大豆黃酮之確認
合成活性
使用pET系統，其係為利用大腸桿菌之重組型蛋白質表現系統，以表現E1多胜肽，並確認其二氫大豆黃酮合成活性。
(1)E1多胜肽表現載體之製法
為了製備E1多胜肽表現載體(pET21-E1-His)，藉PCR而擴增E1核苷酸之啟讀架構區域內之DNA。
根據實例A6中所測定之該E1核苷酸序列以製備下述擴增引子。
exp.E1 pet F Nde：AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA(序列辨識編碼：41)
exp.E1 pet His：AATCGAATTCCTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT(序列辨識編碼：42)
為了插入pET21a(Novagen)內，該等擴增引子exp.E1 pet F Nde及exp.E1 pet His經設計可分別包括NdeI及EcoRI限制序列。
使用25微升含有該等引子(各5pmol)、dNTP(各5nmol)、在實例A5中經純化之乳酸球菌屬20-92的基因組DNA、用於KOD-plusDNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)之10×緩衝劑(2.5微升)、及KOD-plus DNA聚合酶，0.3U(Toyobo Co.,Ltd.)之反應混合物進行PCR反應。擴增程序：95℃，費時3分鐘，(94℃，費時30秒，60℃，費時30秒、68℃，費時2分鐘)×30次循環，68℃，費時7分鐘。PCR裝置：GeneAmpPCR System 9700(Applied Biosystems)。藉瓊脂糖凝膠電泳檢測一預定大小之條帶而分析一部份該PCR反應混合物。藉QIAGEN PCR純化套組(Qiagen)而收集完整PCR產物。
以限制酵素NdeI及EcoRI切割如此收集之該等DNA片段並使其等進行瓊脂糖凝膠電泳。然後，切除含該標靶條件之部份並經Qiagen凝膠萃取套組(Qiagen)純化並收集。收集後，使用DNA連接套組ver.2.1(Takara Bio Inc.)於16℃下使該等DNA片段與經NdeI及EcoRI切割之pET21a連接，費時一夜。然後使用該經連接之反應混合物以將大腸桿菌JM109菌株(Takara Bio Inc.)轉形。
於37℃下在含安比西林(ampicillin)(50微克/毫升)之LB培養基瓊脂(GIBCO)平板上培養該轉形體，費時一夜。在含安比西林(50微克/毫升)之3毫升LB培養基(GIBCO)中培養所形成單一菌落，費時一夜。然後，使用質體自動萃取器PI-100(KURABO)萃取質體DNA。藉染料終止方法而將該質體內經插入DNA之鹼基序列定序。如所預計，其可確認E1多核苷酸之成功插入。因此，獲得pET21-E1-His。在本實例中，係使用DNA測序儀ABI3700(Applied Biosystems)測定該DNA序列。
(2)重組體之製備、及重組型E1多胜肽在大腸桿菌中之表現性及確認
使用重組型E1多胜肽表現之質體pET21-E1-His及質體pET21a(負對照物)以將大腸桿菌BL21(DE3)菌株(Novagen)轉形。為了獲得單一菌落，於37℃下在含安比西林(50微克/毫升)之LB培養基瓊脂平板上培養該等轉形體，費時一夜。
於37℃下在3毫升含有安比西林(50微克/毫升)之液體LB培養基內培養各大腸桿菌BL21(DE3)，費時一夜。然後，藉添加50毫升含相同濃度之安比西林的液體LB培養基而預培養0.5毫升該培養物，費時3小時(直到於630奈米之OD變成約0.4為止)。藉添加IPTG(異丙基-β-硫半乳哌喃糖苷；Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)而將該最終濃度調整至1mM後，進一步於37℃下培育該培養物，費時4小時。
培育後，使用Avanti HP25(Beckman Coulter)，藉離心法而收集該等細胞。在冰上進行後續程序。移除上澄清液(該培養基)後，使該等細胞懸浮在1毫升0.1M含有1mM PMSF、2mM DTT、及5mM亞硫酸氫鈉之磷酸鉀緩衝劑(pH7.0；KPB-PDH)。然後將該細胞懸浮液放入已裝填0.7毫升氧化鋯-氧化矽小粒(BioSpec Products,Inc.)及400微升KPB-PDH之2毫升輔助管內。接著藉使用(Thermo Electron Corporation)以20秒之兩重複循環、6,500rpm處置及3分鐘冰冷却而破裂該等細胞。
藉SDS-聚丙烯醯胺-凝膠電泳(SDS-PAGE)而確認重組型E1多胜肽在大腸桿菌中之表現性。
添加2.5微升之5×試樣緩衝劑(125mM Tris-HCl(pH6.5)/25%甘油/5% SDS/5% 2-巰基乙醇/BPB 0.5%)至10微升該經破裂細胞懸浮液。於98℃下熱變性後，冰冷却該懸浮液且藉SDS-PAGE而進行5微升之電泳處理。以市售凝膠平板(5-20%;Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、及用於染色之Quick CBB(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)進行SDS-PAGE。使用預經染色之XL-Ladder Broad range(Apro Science)作為分子量標誌物。
SDS-PAGE之結果示於第7圖中。在衍生自pET21-E1-His轉形體之該破裂細胞懸浮液中確認具有約70kDa之分子量的重組型E1多胜肽。
(3)得自重組體之E1多胜肽之二氫大豆黃酮合成活性的確認
使用在本實例之(2)中所獲得之破裂細胞懸浮液作為可測定自大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮之活性的酵素源。因此，可在該經表現之重組型E1多胜肽中確認該活性。
在本實例中，測定自大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮之活性的步驟如下。
製備具有下述組成之酵素反應混合物並於37℃下培育該混合物，費時2小時。
酵素反應混合物之組成
培育後，添加3毫升乙酸乙酯至該酵素反應混合物以進行萃取。乾燥後，藉流動相(溶離劑)而溶解該萃取物。藉HPLC而分析經溶解產物以測定該酵素反應混合物中之大豆黃酮及二氫大豆黃酮的含量。
HPLC分析之結果示於第8圖中，在衍生自可表現該重組型E1多胜肽之質體pET21-E1-His轉形體的破裂細胞懸浮液中，已添加至該酵素反應混合物之大豆黃酮(受質)轉化成二氫大豆黃酮，然而在pET21a轉形體(負對照物)中之該酵素反應混合物內並未發現二氫大豆黃酮。
這些結果證實重組型E1多胜肽具有可自大豆黃酮合成二氫大豆黃酮之活性。
實例B
參考例B1
順式-四氫大豆黃酮及反應式-四氫大豆黃酮之合成
根據以下反應流程圖製備順式-四氫大豆黃酮及反式-四氫大豆黃酮。該等化合物之命名如下：
化合物1(大豆黃酮)：4’,7-二羥基異黃酮
化合物2：4’,7-二乙醯氧基異黃酮
化合物3：4’,7-二乙醯氧基異黃-4-酮
化合物4：順式-4’,7-二乙醯氧基異黃-4-醇
化合物5：反式-4’,7-二乙醯氧基異黃-4-醇
化合物6：順式-四氫大豆黃酮
化合物7：反式-四氫大豆黃酮
化合物2之合成
添加0.76毫升(8.0毫莫耳)乙酸酐至含有500毫克(1.97毫莫耳)大豆黃酮(化合物1)之吡啶(5毫升)溶液內並於60℃下攪拌該混合物，費時2小時。添加極小量甲醇後，將該反應混合物移入3N鹽酸內。經水稀釋後，濾出所形成固定沈澱物並經水沖洗，然後於室溫下風乾該固體以獲得609毫克白色粉末狀化合物2(1.80毫莫耳，91%產率)。化合物2:1 H NMR(250MHz,CDCl3 )δ(ppm):2.33(3H,s)、2.37(3H,s)、7.13-7.22(3H,m)、7.32(1H,d,J=2.3Hz)、7.54-7.63(2H,m)、8.01(1H,s)、8.33(1H,d,J=8.8Hz)。
化合物3之合成
於2小時在氫氣氛下攪拌含有400毫克(1.18毫莫耳)化合物2及150毫克10%鈀-碳(無水，約50重量%)之甲醇(6毫克)-乙酸乙酯(6毫升)懸浮液，費時2小時。以賽力特矽藻土(Celite)過濾該反應混合物且以乙酸乙酯清洗殘留物。藉矽凝膠柱式層析法(矽凝膠：二氯甲烷/乙酸乙酯=100/0-19/1)而純化濃縮該濾液所獲得之殘留物以獲得312毫克白色粉末狀化合物3(0.917毫莫耳，78%產率)。化合物3:1 H NMR(250MHz,CDCl3 )δ(ppm):2.29(3H,s)、2.32(3H,s)、3.93-4.04(1H,m)、4.60-4.75(2H,m)、6.76-6.84(2H,m)、7.04-7.13(2H,m)、7.27-7.35(2H,m)、7.93-8.01(1H,m)。
化合物4及化合物5之合成
於0℃下添加11毫克(0.29毫莫耳)硼氫化鈉至含有100毫克(0.294毫莫耳)化合物3之甲醇(1毫升)-二氯甲烷(1毫升)溶液內。於0℃下攪拌該反應混合物，費時30分鐘後，連續添加2毫升1N鹽酸及50毫升水，繼而經乙酸乙酯萃取。連續以飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和鹽液清洗有機層，繼而經無水硫酸鈉乾燥。蒸餾出該溶劑並藉矽凝膠柱式層析法(矽凝膠：二氯甲烷/乙酸乙酯=19/1-3/1)而純化所形成殘留物。藉中壓柱式層析法(Yamazen,Ultra Pack SI-40B：正-己烷/乙酸乙酯=3/2)而純化所形成非對映異構物混合物以獲得44毫克無色針狀化合物5(75毫莫耳，26%產率)。化合物4：1 H NMR(250MHz,CDCl3 )δ(ppm):1.80(1H,d,J=4.0Hz)、2.30(3H,s)、2.31(3H,s)、3.32(1H,td,J=3.5,11.5Hz)、4.32(1H,ddd,J=1.3,3.5,10.5Hz)、4.59(1H,dd,J=10.5,11.5Hz)、4.76-4.83(1H,m)、6.64-6.73(2H,m)、7.06-7.14(2H,m)、7.27-7.35(3H,m)。化合物5：1 H NMR(250MHz,CDCl3 )δ(ppm):2.02(1H,d,J=5.5Hz)、2.29(3H,s)、2.30(3H,s)、3.11-3.24(1H,m)、4.26(1H,dd,J=9.0,11.3Hz)、4.37(1H,dd,J=3.8,11.3Hz)、4.92(1H,dd,J=5.5,7.8Hz)、6.62(1H,d,J=2.3Hz)、6.72(1H,dd,J=2.3,8.5Hz)、7.04-7.12(2H,m)、7.21-7.30(2H,m)、7.47(1H,d,J=8.5Hz)。
化合物6之合成
添加55毫克(1.0毫莫耳)甲氧鈉至含有116毫克(0.339毫莫耳)化合物4之甲醇(4毫升)溶液內並於室溫下攪拌該混合物，費時2小時。藉添加離子-交換樹脂(DOWEX 50×8W，銨形式)而中和該反應混合物。將該樹脂濾出後，使用甲醇清洗藉濃縮該濾液而獲得之固體以得到62毫克白色粉末狀化合物6(0.24毫莫耳，71%產率)。化合物6：1 H NMR(250MHz,DMSO-d6 )δ(ppm):3.03(1H,td,J=3.3,12.0Hz)、4.00-4.15(1H,m)、4.31-4.51(2H,m,including 4.39,dd,J=10.3,12.0 Hz)、4.96(1H,d,J=5.8Hz)、6.18(1H,d,J=2.3Hz)、6.32(1H,dd,J=2.3,8.3Hz)、6.69(2H,d,J=8.5Hz)、7.00(1H,d,J=8.3Hz)、7.09(2H,d,J=8.5Hz)、9.19(1H,br s)、9.31(1H,br s)。
化合物7之合成
添加0.73毫升(0.73毫莫耳)1N氫氧化鈉至含有84毫克(0.25毫莫耳)化合物5之甲醇(2毫升)懸浮液內，並於室溫下攪拌該混合物，費時2.5小時。然後，添加飽和氯化銨水溶液至該反應混合物，繼而經乙酸乙酯萃取。連續以飽和碳氫鈉水溶液及飽和鹽液清洗有機層，繼而經無水硫酸鈉乾燥。藉蒸餾出該溶劑，獲得64毫克白色粉末狀化合物7(0.25毫莫耳，定量產率)。化合物7：1 H NMR(250MHz,DMSO-d6 )δ(ppm):2.82-2.96(1H,m)、4.04-4.22(2H,m)、4.60(1H,t,J=7.0Hz)、5.18(1H,d,J=7.0Hz)、6.14(1H,d,J=2.3Hz)、6.34(1H,dd,J=2.3,8.5Hz)、6.67(2H,d,J=8.5Hz)、7.04(2H,d,J=8.5Hz)、7.16(1H,d,J=8.5Hz)、9.21(1H,s)、9.28(1H,s)。
參考例B2
在含大豆黃酮之擴增液體培養基內接種乳酸球菌屬20-92菌株(FERM BP-10036)，並於37℃在厭氣條件下培育該培養物，費時7至24小時。培育後，收集該等細胞，並低溫保存以便用於以下實例。
實例B1：四氫大豆黃酮製備之確認
進行以下實驗以確認四氫大豆黃酮為雌馬酚生物合成之中間產物。
(1)破裂細胞材料之製備
快速將於-80℃下保藏之該等乳酸球菌屬20-92菌株細菌解凍，藉輕敲而懸浮該等細胞並使用離心機VC-960(Taitec)，於4℃(8,000rpm×5分鐘)進行離心處理。移除上澄清液後，添加0.1M磷酸鉀緩衝劑/1mM PMSF(苯基甲磺醯氟)/2mMDTT(二硫蘇糖醇)/5mM亞硫酸氫鈉(pH7.0)以獲得細胞懸浮液。將該細胞懸浮液放入已預備包括氧化鋯-氧化矽小粒(約0.8毫升、0.1毫米、1磅；Wakenyaku Co.,Ltd.)之2毫升試管內，並將0.1M磷酸鉀溶液/1mM PMSF/2mM DTT/5mM亞硫酸氫鈉(pH7.0)填入以幾乎完全填滿該試管。為了進行破裂，閉合該試管且維持在冰上，其中係使用-FP100A(Thermo Electron Corporation)重複6,500rpm×20秒離心處理及冰冷却之循環。使用所形成破裂細胞材料作為酵素反應中之酵素源。
(2)酵素反應
製備含有0.1毫升在(1)中所獲得之破裂細胞材料之具有下述組成物的1毫升酵素反應混合物，並於37℃下培育該混合物，費時2小時。培育後，添加3毫升乙酸乙酯至所形成酵素反應產物以進行萃取。乾燥該產物以製備用於HPLC分析之試樣。
酵 素反應混合物之組成
0.1M磷酸鉀緩衝劑/1mM PMSF/2mM DTT/5mM亞硫酸氫鈉(pH7.0)
2mM NADPH
2mM NADH
10微克/毫升之二氫大豆黃酮或四氫大豆黃酮
(3)藉酵素反應而自二氫大豆黃酮製備四氫大豆黃酮之方法
第9圖表示藉使用二氫大豆黃酮作為受質、並使用該破裂細胞材料作為酵素源而獲得之酵素反應產物的HPLC分析結果。第9圖亦表示在參考例B1中所合成之四氫大豆黃酮的HPLC分析結果。該等結果顯示該藉使用二氫大豆黃酮作為受質並使用該破裂細胞材料作為酵素源而獲得之酵素反應產物包括一具有滯留時間相當於反式-四氫大豆黃酮之滯留時間的中間產物，其可確認反式-四氫大豆黃酮之產生。
(4)藉酵素反應而自四氫大豆黃酮製備雌馬酚之方法
第10圖表示藉使用順式-四氫大豆黃酮或反式-四氫大豆黃酮作為受質並使用該破裂細胞材料作為酵素而獲得之酵素反應產物的HPLC分析結果。如自第10圖可知，雌馬酚係自這兩種化合物製成，其顯示該順式-及反式-四氫大豆黃酮可作為雌馬酚生物合成之受質。
實例B2：在破裂細胞材料之經離心處理的上澄清液中確認四氫大豆黃酮生物合成活性、並進行NADH或NADPH依存性之確認
將該等冷凍細胞解凍並於4℃下離心處理15分鐘(5,000×G)。該小粒係用於下述試驗。首先，使該小粒(濕重2.7克)懸浮在含有1mM PMSF及5mM亞硫酸氫鈉之10毫升0.1M磷酸鉀溶液中。於37℃下預熱5分鐘後，以每克該小粒(濕重)之100毫克的數量添加溶酶體以於37℃下引起反應，費時1.5小時。然後，添加等量之0.1M磷酸二鉀溶液至該反應混合物，並在添加氧化鋯-氧化矽小粒(3毫升)後，以渦旋混合機激烈攪拌該混合物。然後以超音波處理機(Branson Sonifier Cell Disruptor 200)(5分鐘超音波處理及2分鐘靜止之3次循環)破裂該等細胞。以約10,000×G之速率離心處理該破裂細胞懸浮液，費時15分鐘以獲得上澄清液，其接著可作為酵素源。
製備具有下述組成之酵素反應混合物，並於37℃下培育2小時。培育後，添加5毫升乙酸乙酯至該酵素反應產物以進行萃取。然後，乾燥該產物以製備一用於HPLC分析之試樣。
酵素反應混合物之組成
結果示於第11圖中。該等結果證實該破裂細胞材料之經離心處理上澄清液中四氫大豆黃酮生物合成活性的存在。亦證實二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮之作用係取決於該輔酵素NADH且更強烈地取決於NADPH。
實例B3：四氫大豆黃酮合成酵素之純化
在培育瓶內之67毫升含大豆黃酮之擴增液體培養基中培育乳酸球菌屬20-92菌株細胞。離心處理得自10個此等培育瓶之經培養細胞並使其懸浮在含有1mM PMSF(苯基甲磺醯氟)及4mM DTT(二硫蘇糖醇)之0.02M磷酸鉀緩衝劑(pH7；下文稱為“緩衝劑A”)中。於 1,800psi下以French壓機(SLMInstruments Inc.)破裂該等細胞共6次並離心處理該破裂細胞懸浮液以獲得上澄清液。分別在一培育瓶內之200毫升液體培養基中培育乳酸球菌屬20-92菌株細菌，費時18小時。以同樣方法使得自5個此等培育瓶之經培養細胞經French壓機破製，並在離心處理後獲得上澄清液。混合這些上澄清液(38毫升及47毫升)並將82毫升該混合物饋至已藉緩衝劑A平衡之紅色-塞法羅斯糖(Sepharose)(約7毫升)。以緩衝劑A清洗該紅色-塞法羅斯糖後，以含10mM NADPH之緩衝劑A溶析該混合物(20毫升/溶離份)。各溶離份係作為酵素源，且在與實例B2之酵素反應條件(使用NADPH作為輔酵素)相同的條件下測定該四氫大豆黃酮生物活成活性。因此，獲得第1至5號活性溶離份。
藉使用Amicon Ultra Centrifugal UFC801024(MWCut:10,000)而進行超過濾以濃縮具有四氫大豆黃酮生物合成活性之第1至5號溶離份以獲得濃縮液(約2.1毫升)。將該濃縮液分離成3個部份並在各部份與等量含3M硫酸銨之緩衝劑A混合後，使用TSKgel Phenyl-5PW(Tosoh)將其等饋至HPLC。HPLC條件如下。藉測定於280奈米之吸光度而分析該蛋白質。
柱：TSKgel Phenyl-5PW
流率：1毫升/分鐘
溶離份：2毫升/2分鐘/溶離份
溶離劑A：0.02M磷酸鉀緩衝劑pH 7/1Mm DTT/2.5mM亞硫酸
氫鈉/0.5% isoPrOH
溶離劑B：含有1M硫酸銨之溶離劑A
溶析程序：時間(分鐘)(溶離劑B)/(溶離劑A+溶離劑B)
HPLC之結果顯示該四氫大豆黃酮合成活性存在於廣範圍之溶離份(第15號溶離份及後續溶離份，30分鐘及更長之滯留時間)。考慮到本結果，混合HPLC之第19至22號溶離份並藉超過濾(Amicon Ultra Centrifugal UFC801024；MW Cut：10,000)而濃縮。自約130微升該濃縮液，將其中100微升饋至在以下條件下使用TSKgel G2000SWXL(Tosoh)所進行之凝膠過濾HPLC。
柱：TSKgel G2000SWXL
流率：0.6毫升1分鐘
溶離份：1.2毫升/2分鐘/溶離份
溶離劑：0.05M磷酸鉀緩衝劑pH 7/1Mm DTT/2.5mM亞硫酸氫鈉/1% isoPrOH/0.3M NaCl
第12圖表示凝膠過濾HPLC之結果。第13圖表示在還原條件下進行各溶離份之SDS-PAGE的結果。該等結果顯示在還原條件下，在第7圖(其係為具有四氫大豆黃酮合成活性之主要溶離份)中之28kDa及32kDa條帶。
實例B4：四氫大豆黃酮合成酵素之胺基酸序列的分析
使用實例B3中所獲得之具有四氫大豆黃酮合成活性的該溶離份(第7號溶離份)作為一用於MS分析之試樣。更明確地，藉SDS-PAGE而分離該試樣並刪除該等條帶。藉在凝膠內進行烷化反應而還原該等經刪除條帶並在該凝膠內經胰蛋白酶切割。收集該等經胰蛋白酶切割之胜肽並純化以藉C-MS而進行分析。藉使MS分析承載軟體(Infocom)進行重新定序而分析藉LC-MS分析所獲得之數據以計算並估計該等胜肽之胺基酸序列。更明確地，根據以下程序進行該步驟。
(1)實驗材料
該實驗使用以下材料：SuperSep HG 10/20%(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.);Flamingo Gel染色套組(Bio-Rad)；TCEP(三[2-羧乙基]膦)(Pierce)；分子量標誌物(Apro Science)；DTT(Calbiochem)；碘乙醯胺(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)；乙腈(Kanto Kagaku)；胰蛋白酶(Promega)；TFA(Pierce)；碳酸氫銨(Sigma)；銨水(Merck)；甲酸(Kanto Kagaku)；Empore Cation-SR Disk(Sumitomo 3M)；MonoCap濃縮柱(GL Science)；用於Nano Flow之Mono Cap 0.1×150毫米(GL Science)；FortisTip(AMR)；SpeedVac濃縮器(SAVANT)；HTS-PAL自動取樣機(CTC-Analytics)；Chorus 220(CTC-Analytics)；QSTAR Pulsar i(Applied Biosystems)；及軟體(Infocom)。
(2)SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳
添加1微升100mM TCEP至20微升實例B3中所獲得之具有四氫大豆黃酮合成活性的該溶離份(第7號溶離份)。於70℃下還原10分鐘後，施加整個試樣至SuperSep HG，並藉常用方法而進行SDS-PAGE。電泳後，使該凝膠經Flamingo Gel染色套組(Bio-Rad)染色(見第14圖)。然後，將染色後才出現之條帶LG1及LG2各切成約1毫米2 之大小。以100mM碳酸氫銨溶液清洗經刪除凝膠，經乙腈脫水並乾燥，且經SpeedVac濃縮器固化。
(3)在凝膠內進行胰蛋白酶切割
添加DTT溶液(在100mM碳酸氫銨中1.54毫克/毫升)至該等乾燥凝膠並於55℃下培育該混合物，費時45分鐘以引起還原反應。棄置DTT溶液後，添加碘乙醯胺溶液(在100mM碳酸氫銨中10.1毫克/毫升)，並於室溫下在黑暗中培育該混合物，費時30分鐘。棄置該溶液後，連續以50%乙腈溶液，100%乙腈溶液、100m M碳酸氫銨溶液、及100%乙腈溶液清洗該等凝膠，繼而乾燥並經SpeedVac濃縮器固化。然後，添加少量胰蛋白酶溶液(在50mM碳酸氫銨中12.5微克/毫升)至該乾燥凝膠以在冰上浸漬該等凝膠，費時45分鐘。浸漬後，移除過量胰蛋白酶溶液，並添加50mM碳酸氫銨溶液，直到該等凝膠經浸沒為止。然後於37℃下進行反應，費時16小時。
(4)藉質譜測定法而分析胺基酸序列
收集該等經胰蛋白酶切割之胜肽，並藉使用於吸管尖已裝填Empore Cation-SR Disk之單柱而純化該等胜肽以進行預處理。藉使用0.1% TFA/90%乙腈溶液進行清洗以收集該等經胰蛋白酶切割之胜肽。在該單柱內，係首先藉已平衡之0.1% TFA/2%乙腈溶液處理該試樣。試樣吸附後，以0.1% TFA/90%乙腈溶液清洗該柱並以5%氨/30%乙腈溶液溶析該試樣。溶析後，乾燥該等經切割之胜肽並經SpeedVac濃縮器濃縮。藉添加TFA而將該經切割胜肽溶液之pH調整至約3且將該試樣放入自動取樣機HTS-PAL內。然後藉裝填入位於LC-MS注射器閥之試樣濃縮柱內而在該柱內清洗該已置於HTS-PAL內之試樣。以使用nanoHPLC-Chorus 220之分析柱分離該濃縮柱內之試樣並在經該分析內之FortisTip電離後，以QSTAR Pulsar i進行分析。LC-MS之條件如下。
LC Chorus 220
溶劑A：0.1%甲酸/2%乙腈
溶液B：0.1%甲酸/90%乙腈
流率=300毫微升/分鐘
梯度5%A-65%B/20分鐘MS
NanoESI正向模式、信息依存性獲取模式(m/z=400至1,400，超過25個計數，電荷態=2至4)；4次實驗/1次循環：實驗1(TOF-MS，m/z=400至1,400，蓄積時間=1秒)；實驗2至4(Positive Product Ion，m/z=100至1,400，蓄積時間=2秒)
藉使用PEAKS軟體重新定序而分析經由CL-MS所獲得之條帶LG1及LG2之各別數據以估計該等經切割胜肽之胺基酸序列。
實例B5：二氫大豆黃酮合成(E1)酵素基因之周邊基因組DNA序列的分析
(1)製備用於逆PCR之基因組DNA基因庫的方法
於37℃下以限制酵素(BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、SacI、SaII、Sau3AI、XhoI;其等全部得自Takara Bio)切割根據實例A5所純化之乳酸球菌屬20-92菌株(FERM BP-10036)之基因組DNA以獲得DNA片段。經酚-氯仿處置後，藉乙醇沈澱而純化該等片段。使用TaKaRa連接套組ver.2.1(Takara Bio)進行該等純化基因組DNA片段之自連接。使各連接溶液經無菌水稀釋10倍以製備用於逆PCR之基因組DNA基因庫。
(2)逆PCR
使用(i)中所獲得之用於逆PCR之該基因組DNA基因庫(1微升，相當於40毫微克)作為利用逆PCR以擴增接近E1多核苷酸之基因組DNA的上游及下游區域的模板。就擴增該下游區域之逆PCR而言，係使用經HindIII、PstI、SacI、及XhoI處理過之片段作為模板DNA。TaKaRa LA Taq(Takara Bio)係用於逆PCR。使用20微升反應混合物以進行第一PCR，該反應混合物含有1×PCR緩衝劑(無Mg2+ )；引子，各0.5nM；dNTP，各0.5mM；MgCl2 ，2.5mM；及TaKaRa LA Taq，0.2U。使用1微升(40毫微克)該基因組DNA基因庫之稀釋溶液作為模板。擴增程序：98℃，費時1分鐘、95℃，費時10秒、62℃，費時10秒、68℃，費時10分鐘)×35次循環、68℃，費15分鐘。使用0.5微升該第一PCR產物作為模板及30微升反應混合物進行後續巢式PCR，該反應混合物含有1×PCR緩衝劑(無Mg2+ )；引子，各0.5mM；dNTP，各0.5mM；MgCl2 ，2.5mM；及TaKaRa LA Taq，0.3U。擴增程序：98℃，費時1分鐘、(95℃，費時10秒、62℃，費時10秒、68℃，費時10分鐘)×30次循環、68℃，費時15分鐘。
(2-1)引子
用於逆PCR之引子組如下。
(2-1-1)上游側
第一-PCR：RACE-N-P3-1及E1-Bub-N-P1
巢式-PCR：RACE-N-P3-2及E1-Bub-N-P2
( 2-1-2)下游側
第一-PCR：RACE-C-P3-1及E1-Bub-C-P1
巢式-PCR：RACE-C-P3-2及E1-Bub-C-P2
(2-2)引子序列
用於藉逆PCR而擴增該等上游及下游側之引子的序列如下。
用於擴增該上游側之引子序列
RACE-N-P3-1：ATGGAGATAGTGCCGCTGGCAAGGCAACGGCAC(序列辨識編碼：43)
RACE-N-P3-2：TCAACGAAGACTCGATTTGAGCGAGAGGCGAGG(序列辨識編碼：44)
E1-Bub-N-P1：ACGGTGGAACCGGCATCGTGTTCATGGACAAC(序列辨識編碼：45)
1-Bub-N-P2：GCGTGACCCAGTTCCACCATGTCGGACTGTC(序列辨識編碼：46)
用於擴增該下游之引子序列RACE-C-P3-1：GACATCCCGTTCGAGCGCAGGATCACCCATGAG(序列辨識編碼：47)
RACE-C-P3-2：AGGATCACCCATGAGCGCATCGCTATCATGGAC(序列辨識編碼：48)
E1-Bub-C-P1：CATCGCTCTTGCAGTCGTTGTCCAGGAAGTCC(序列辨識編碼：49)
E1-Bub-C-P2：TTGTCCAGGAAGTCCATCGCGTACACGACGGAG(序列辨識編碼：50)
需注意在本實例中作為擴增引子之所有寡DNA係藉Sigma-Aldrich Japan而合成。
(3)該經逆PCR擴增之二氫大豆黃酮合戍酵素基因之周邊基因組DNA片段的純化及鹼基序列測定
以該巢式PCR產物之1/10用量添加10×天至(2)中所獲得之該巢式PCR產物。然後，在0.8%瓊脂糖凝膠上使5微升進行電泳。其確認該上游區域內0.5kb(PstI)及3.5kb(XhoI)DNA片段之擴增、及下游區內1kb(HindIII)、1kb(SacI)、與2.5kb(XhoI)DNA片段之擴增。在本實例中，該瓊脂糖電泳係使用溴化乙啶(Nippon Gene)進行染色，並使用λ/StyI(Nippon Gene)及100bp梯形物(Toyobo)作為分子量標誌物，自該瓊脂糖凝膠除去經擴增DNA片段並使用QIAGEN凝膠萃取套組(Qiagen)進行純化。然後使用用於擴增之該等引子，藉直接序列方法及步行方法(walking method)而測定經純化DNA片段之鹼基序列。
(4)基因組序列之分析及ORF(啟讀架構)之估計
使用該序列組裝軟體SEQUENCHER(Gene Codes Inc,USA)，使(3)中所獲得之DNA序列進行組裝分析。此外，進行ORF之估計。本分析可測定包括E1酵素基因之該周邊基因組區域內之6,685bp的序列。第15圖係以圖解闡明包括該二氫大豆黃酮合成酵素基因之經分析周邊基因組結構。ORF之估計發現E1酵素基因之3個ORF上游(在該等ORF之一中未經鑑定的N末端、及在下游側上之一個ORF。該二氫大豆黃酮合成酵素之上游ORF被命名為US(u ps tream)1、US2、及US3。該下游ORF被命名為DS(d owns tream)1。
實例B6：藉LC-MS分析而以基因組序列核對經切割胜肽序列
以實例B5中所測定之二氫大豆黃酮合成(E1)酵素基因的周邊基因DNA序列之資料核對實例B4中所獲得之該等經估計胺基酸序列。結果，主要自LG2所獲得之部份該等序列與合自該ORF-US2核苷酸序列所推斷之多胜肽序列相配。其表示ORF-US2多胜肽可以是該四氫大豆黃酮合成酵素的可能性。與ORF-US2多胜肽相配之該等經切割胜肽序列示於下文。第16-1、16-2、及16-3圖表示藉LC-MS而獲得之資料。
在上表內，m/z代表質荷比，z代表電荷數、質量代表該胜肽之質量，而胜肽代表該等胺基酸序列。得分代表藉PEAKSR 軟體而進行該序列計算之準確度%(100%為最準確)。需注意由於異白胺酸(I)及白胺酸(L)具有相同分子量且難以區分，所以其等皆由與ORF-US2多胜肽相配之該等經切割胜肽序列中之X表示。
實例B7：使用無細胞的蛋白質合成系統以合成ORF-US2多胜肽及四氫大豆黃酮合成活性之確認
使用無細胞的蛋白質合成系統(PURESYSTEM Classic II mini: Post Genome Institute Co., Ltd.)以合成ORF-US2多胜肽，並確認其四氫大豆黃酮合成活性。
(1)模板DNA之製備
藉雙步驟PCR，製備用於無細胞的蛋白質合成之ORF-US2多核苷酸模板DNA。
(1-1)引子
可製備ORF-US2模板DNA之用於PCR的引子如下。
E2-invitroTS-FP1：ACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCACAGGAAGTCAAAGTCC(序列辨識編碼：57)
E2-invitroTS-RP：CTAGACCTCGATCTCGCCCTGCATGCCG(序列辨識編碼：58)
通用引子(Universal-Primer)：GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA(序列辨識編碼：59)
E2-invitroTS-FP1及E2-invitroTS-RP係根據實例B5中所測定之ORF-US2核苷酸序列由Sigma-Aldrich Japan合成。該通用序列係得自PURESYSTEM Classic II mini(Post Genome Institute Co.,Ltd.)之附件。
(1-2)藉雙步驟PCR而製備橫板之方法
藉根據手冊之雙步驟PCR而製備用於合成ORF-US2多胜肽之該模板DNA。在本實例中，該PCR係使用E高精確PCR選殖酵素(DNA聚合酶，Stratagene)、及GeneAmp PCR System 9700(PCR裝置，Applied Biosystems)。
在該第一PCR中，係使用乳酸球菌屬20-92菌株之基因組DNA作為作用(1-1)中所予之該等引子E2-invitroTS-FP1及E2-invitroTS-RP以擴增ORF-US2核苷酸之模板。可使用所形成PCR產物(ORF-US2核苷酸)作為使用該通用引子及E2-invitroTS-RP以進行該第二PC R之模板。使用PCR-純化套組(Qiagen)以純化300微升(50微升×6)該PCR產物並作為模板DNA(用於ORF-US2多胜肽合成之模板DNA)以合成ORF-US2多胜肽。在以下條件下進行該第一及第二PCR。
第一PCR：50微升反應混合物，其含有擴增引子，各10pmol；dNTP，各2.5pmol；乳酸球菌屬20-92菌株所衍生之基因組DNA，40毫微克；Easy-A緩衝劑(Stratagene)；及高精確PCR選殖酵素，2U(Stratagene)。擴增程序：95℃，費時2分鐘(95℃，費時45秒、58℃，費時20分鐘、72℃，費時1分鐘)×30次循環、72℃，費時3分鐘。
第二PCR：50微升反應混合物，其含有擴增引子，各10pmol；dNTP，各2.5pmol；第一PCR反應混合物；0.5微升；Easy-A緩衝劑；及高精確PCR選殖酵素，2U。擴增程序：95℃，費時2分鐘、(95℃，費時45秒、45℃，費時20秒、72℃，費時1分鐘)×5次循環、(95℃，費時45秒、60℃，費時20秒、72℃，費時1分鐘)×25次循環、72℃，費時3分鐘。
(2)ORF-US2多胜肽之無細胞蛋白質合成及四氫大豆黃酮合成活性之確認
在泳上將於-80℃下保藏之PURESYSTEM Classic II mini的溶液A(25微升)及溶液B(10微升)解凍。然後，添加0.6微克(60毫微克/微升，10微升)藉該第二PCR而製成之ORF-US2多胜肽合成模板DNA(其包括該起始密碼子之T7-啟動子序列及核糖體結合序列5’上游)。藉添加無菌水而將總體積調整至50微升，且於37℃下培育該混合物，費時90分鐘以合成一標靶多胜肽。作為使用本系統之蛋白質合成的正對照物，係使用0.5微克(0.2微克/微升，2微升)以PURESYSTEM Classic II mini之附件提供的二氫葉酸還原酶(DHFR)合成模板DNA。在負對照物中並未添加模板DNA且僅添加無菌水。就活性測定而言，係添加40微升該反應混合物至具下述組成之酵素反應緩衝劑，且於37℃下培育該混合物，費時6小時。反應後，以3毫升乙酸乙酯萃取該酵素反應混合物。乾燥萃取物並溶解在漂移緩衝劑內，然後藉HPLC分析而檢測該酵素反應混合物內之四氫大豆黃酮。
酵素反應緩衝劑之組成
0.1M磷酸鉀緩衝劑/1mM PMSF/2mM DTT/5mM亞硫酸氫鈉(pH 7.0)。
2mM NADPH
2mM NADH
10微克/毫升二氫大豆黃酮
具有該二氫葉酸還原酶(DHFR)合成模板DNA之試樣可成功地表現得自該DNA之蛋白質，然而在不含模板DNA之試樣中並未發現蛋白質表現性。這些結果表示該實驗確實合適。
該等結果係示於第17圖內。該可表現ORF-US2多胜肽之反應混合物之四氫大豆黃酮的尖峰位於反應後6小時之6.7分鐘位置，然而在不含蛋白質合成(NC)之反應混合物及可表現二氫葉酸還原酶(DHFR)之反應混合物中並未發現四氫大豆黃酮尖峰。而且，雖然由於四氫大豆黃酮生物合成，該可表現ORF-US2多胜肽之反應混合物具有減少的二氫大豆黃酮(受質)含量，但是在該不含蛋白質合成(NC)之反應混合物及該可表現二氫葉酸還原酶(DHFR)之反應混合物中並未發現二氫大豆黃酮之減量。這些結果證實ORF-US2多胜肽具有可自二氫大豆黃酮合成四氫大豆黃酮之活性。因此可確定ORF-US2多胜肽相當於E2多胜肽。
實例B8：使用大腸桿菌表現重組型ORF-US2多胜肽、及四 氫大豆黃酮合成活性之確認
使用pET系統，其係為使用大腸桿菌之重組型蛋白質表現性系統，以表現ORF-US2多胜肽，且確認其四氫大豆黃酮合成活性。
(1)ORF-US2多胜肽表現性載體之製備
為了製備ORF-US2多胜肽表現性載體(pET21-US2)，在ORF-US2多胜肽之啟讀架構區域內之DNA係藉PCR而擴增。
以下擴增引子係根據實例B5中所測定之ORF-US2多胜肽序列而製成。
exp.US2 pet F Nde：TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC(序列辨識編碼：60)
exp.US2 pet：AATCGAATTCCTAGACCTCGATCTCGCCCTGC(序列辨識編碼：61)
為了插入pET21a(Novagen)內，該等擴增引子exp.US2 pet F Nde及exp.US2 pet經設計可分別包括NdeI及EcoRI限制序列。
使用25微升反應混合物進行PCR反應，該反應混合物含有該等引子，各5pmol；dNTP，各5nmol；乳酸球菌屬20-92菌株之基因組DNA，40毫微克；用於KOD-Plus DNA聚合酶(Toyobo)之10×緩衝劑，2.5微升；KOD-Plus DNA聚合酶，0.3U(Toyobo)。擴增程序：95℃，費時3分鐘、(94℃，費時30秒、60℃，費時30秒、68℃，費時1分鐘)×30次循環、68℃，費時7分鐘。PCR裝置：GeneAmpPCR System 9700(Applied Biosystems)。藉瓊脂糖凝膠電泳偵測一預定大小之條帶而分析該PCR反應混合物之一部份。藉QIAGEN PCR純化套組(Qiagen)而收集該完整PCR產物。
以限制酵素NdeI及EcoRI切割所收集之該等DNA片段並使其等進行瓊脂糖凝膠電泳。然後，切除一含有該標靶條帶之部份，並純化且經Qiagen凝膠萃取套組(Qiagen)收集。收集後，使用DNA連接套組ver.2.1(Takara Bio)，於16℃下以經NdeI及EcoRI切割之pET21a連接該等DNA片段，費時一夜。然後使用該經連接反應混合物以將大腸桿菌JM109菌株(Takara Bio)轉形。
於37℃下在含安比西林(50微克/毫升)之LB培養基瓊脂(GIBCO)平板上培養該轉形體，費時一夜。在含安比西林(50微克/毫升)之3毫升LB培養基(GIBCO)中培養所形成單一菌落，費時一夜。然後，使用質體自動萃取器PI-100(KURABO)萃取質體DNA。
藉該染劑終止子方法而將該質體內之插入DNA的鹼基序列定序。如所預期，其確認ORF-US2已成功插入。在本實例中，係使用DNA測序儀ABI3700(Applied Biosystems)以測定該DNA序列。
(2)在大腸桿菌中重組型ORF-US2多胜肽之表現性及確認
使用重組型ORF-US2多胜肽表現之質體pET21-US2及質體pET21a(負對照物)以將大腸桿菌BL21(DE3)菌株(Novagen)轉形。為了獲得單一菌落，於37℃下在含安比西林(50微克/毫升)之LB培養基瓊脂平板上培養該等轉形體，費時一夜。
於37℃下於含安比西林(50微克/毫升)之3毫升液體LB培養基內培養各大腸桿菌(DE3)轉形體、費時一夜。然後藉添加50毫升含相同濃度之安比西林的液體LB培養基而預培養0.5毫升該培養物，費時3小時(直到於630奈米之OD變成約0.4為止)。藉添加IPTG(異丙基-β-硫半乳哌喃糖苷；Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)而將最終濃度調整至1mM後，進一步於37℃下培育該培養物，費時4小時。
培育後，使用Avanti HP25(Beckman Coulter)藉離心法(6,000rpm，4℃，15分鐘)而收集該等細胞。在冰上進行後續程序。移除上澄清液(該培養基)後，使該等細胞懸浮在1毫升0.1M含有1mM PMSF、2mM DTT、及5mM亞硫酸氫鈉之磷酸鉀緩衝劑(pH7.0；KPB-PDH)內。然後將該細胞懸浮液放入已裝填0.7毫升氧化鋯-氧化矽小粒(BioSpec Products,Inc.)及400微升KPB-PDH之2毫升輔助管內。然後使用FastPrep(Thermo Electron Corporation)，藉20秒，6,500rpm處置及3分鐘冰冷却之兩重複循環而破裂該等細胞。結果，獲得經破裂細胞之懸浮液。
藉SDS-聚丙烯醯胺-凝膠電泳(SDS-PAGE)而確認重組型ORF-US2多胜肽在大腸桿菌中之表現性。
添加5微升之5×試樣緩衝劑(125mM Tris-HC1(pH 6.5)/25%甘油/5% SDS/5% 2-巰基乙醇/BPB 0.5%)至20微升該破裂細胞懸浮液。於98℃下熱變性，費時5分鐘後，冰冷却該懸浮液並藉SDS-PAGE而電泳10微升。以市售凝膠平板(SuperSep5-20%；Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、及用於染色之Quick CBB(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)進行SDS-PAGE。使用經預染之XL-Ladder Broad range(Apro Science)作為分子量標誌物。
SDS-PAGE之該等結果示於第18圖中。在衍生自pET21-US2轉形體之該破裂細胞懸浮液中可確認具有約29kDa分子量之重組型多胜肽。
(3)重組型ORF-US2多胜肽之二氫大豆黃酮合成活性的確認
使用本實例之(2)中所獲得之破裂細胞懸浮液作為酵素源以測定自二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮之轉化活性。結果，在該經表現之重組型ORF-US2多胜肽中可確認該活性。
在本實例中，測定自二氫大豆黃酮轉化成四氫大豆黃酮之轉化活性的步驟如下。
製備具有以下組成之酵素反應混合物，且於0℃下培育該混合物，費時2小時。
酵素反應混合物之組成
培育後，添加3毫升乙酸乙酯至該酵素反應混合物以進行萃取。乾燥後，藉流動相(溶離劑)而溶解萃取物。藉HPLC而分析該溶解產物以測定二氫大豆黃酮及順式-及反式-四氫大豆黃酮在該酵素反應混合物內之含量。
HPLC分析之該等結果示於第19圖內。在衍生自可表現該重組型ORF-US2多胜肽之質體pET21-US2轉形體的該破裂細胞懸浮液中，已添加至該酵素反應混合物之二氫大豆黃酮(受質)轉化成順式-四氫大豆黃酮(c-THD)及反式-四氫大豆黃酮(t-THD)，然而，在pET21a轉形體(負對照物)中之該酵素反應混合物內並未偵測到四氫大豆黃酮。
這些結果證實ORF-US2多胜肽具有可自二氫大豆黃酮合成四氫大豆黃酮之活性。因此可確定重組型ORF-US2多胜肽相當於E2多胜肽。
實例C
實例C1：自四氫大豆黃酮確認細菌細胞之雌馬酚生物合成活性
在含擴增液體培養基(順式-或反式-四氫大豆黃酮(藉Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd而有機性合成：見實施例B1)以10微克/毫升之數量所添加之改良性GAM肉羹培養(NISSUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.))內接種乳酸球菌屬20-92菌株(FERM BP-10036)並於37℃在厭氣條件(使用BBL Gas Pack Systems)下培育該培養物，費時18小時。培育後，立即將1毫升該培養物放入具有蓋子之玻璃離心管內並添加3毫升乙酸乙酯入其中以進行萃取。乾燥該產物以製備用於HPLC分析之試樣。作為用於HPLC之標準溶液，係使用含有大豆黃酮(2微克/毫升；Funakoshi Corporation)、雌馬酚(2微克/毫升；Funakoshi Corporation)、二氫大豆黃酮(2微克/毫升；Trend Research Chemicals Inc.)、順式-四氫大豆黃酮及反式-四氫大豆黃酮(2微克/毫升；其等皆由Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.化學性合成)之混合溶液。
該等結果係示於第20圖內，第20圖證明該乳酸球菌屬20-92具有可自順式及反式-四氫大豆黃酮(第20圖，中及下曲線圖)生物合成雌馬酚之活性。需注意在這些圖中，大豆黃酮之縮寫為DZN，二氫大豆黃酮之縮寫為DD，順式-四氫大豆黃酮之縮寫為c-THD，反式-四氫大豆黃酮之縮寫為t-THD，而雌馬酚之縮寫為EQL。
實例C2：藉使用大腸桿菌之重組型蛋白質表現性系統而搜尋並確認雌馬酚合成酵素
在大腸桿菌中使用該pET系統(Novagen)，其係為使用大腸桿菌之重組型蛋白質表現性系統，以表現各相當於在實例B5中所測定之二氫大豆黃酮合成(E1)酵素基因的周邊基因組DNA序列中所鑑定之3種ORF多核苷酸(ORF-US3、US1、及DS1)之多胜肽。檢查自四氫大豆黃酮催化雌馬酚轉化之活性以搜尋雌馬酚(E3)酵素。
(1)ORF多胜肽表現性載體之製備
為了製備各ORF多胜肽(ORF-US3、US1、及DS1)之表現性載體，在各胜肽之啟讀架構區域中之該多核苷酸係藉PCR而擴增且插入pET21a載體(Novagen)內。
(1-1)擴增引子
根據實例B5中所測定之二氫大豆黃酮合成酵素(E1)的周邊基因組DNA序列以製備以下擴增引子。
ORF-US3多胜肽
exp.US3 F：TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG(序列辨識編碼：62)
exp.US3 R：CCGCAAGCTTCTACATAGTGGAGATCGCGTGG ORF-US(序列辨識編碼：63)
ORF-US1多胜肽
exp.US1 F：TATACATATGTTCAAGGGTCCACAGGGC(序列辨識編碼：64)
exp.US1 R：GCTCGAATTCTTAGTGCTGCTGTGCCTTTTCAG(序列辨識編碼：65)
ORF-DS1多胜肽
exp.DS1 F：ATATACATATGCAGGATATGGACTTCATGG(序列辨識編碼：66)
exp.DS1 R：GCTCGAATTCTCATAGTGACATCAGCGCTCCC(序列辨識編碼：67)
為了插入pET21a(Novagen)內，該等擴增引子exp.US1 F、及exp.DS1 F經設計可包括NdeI限制序列，exp.US3 R可包括HindIII限制序列，而exp.US1 R及exp.DS1 R可包括EcoRI限制序列。
(1-2)各ORF多核苷酸之擴增
使用25微反應混合物進行PCR反應，該反應混合物含有該等引子，各5pmol；dNTP，各5nmol；實例A5中所純化之乳酸球菌屬20-92菌株的基因組DNA，40毫微克；用於KOD-Plus DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)之10×緩衝劑，2.5微升；KOD-Plus DNA聚合酶，0.3 U(Toyobo Co.,Ltd.)。擴增程序：95℃，費時3分鐘(94℃，費時30秒、60℃，費時30秒、68℃，費時2分鐘)×30次循環、68℃，費時7分鐘。PCR裝置：GeneAmp PCR系統9700(Applied Biosystems)。藉瓊脂糖凝膠電泳偵測用於各引子之具預計大小的條帶而分析該PCR反應混合物之一部份。藉QIAGEN PCR純化套組(Qiagen)而收集該完整PCR產物。
(1-3)ORF多胜肽表限性載體之製備
以限制酵素NdeI及 HindIII切割製法(1-2)中所收集之該等ORF-US3多核苷酸片段，並以限制酵素NdeI及 EcoRI切割ORF-US1及ORF-DS1多核苷酸片段。使該等片段進行瓊脂糖凝膠電泳。然後，切除含該標靶條帶之部份並經Qiagen凝膠萃取套組(Qiagen)純化且收集。收集後，於61℃下，使用DNA連接套組ver.2.1(Takara Bio)以經NdeI及HindIII或EcoRI切割之pET21a連接該等多核苷酸片段，費時一夜。然後使用該經連接反應混合物以習使用法將大腸桿菌JM109菌株(Takara Bio)轉形。於37℃下在含安比西林(50微克/毫升)之LB培養基瓊脂(GIBCO)平板上培養所獲得轉形體，費時一夜。在含安比西林(50微克/毫升)之3毫升LB培養基(GIBCO)內培養所形成單一菌落，費時一夜。然後，使用質體自動萃取機PI-100(KURABO)萃取質體DNA。
該質體內之經插入DNA的鹼基序列係藉染劑終止方法而定序。如所欲，其可確認各多核苷酸之成功插入。因此，獲得pET-US3、pET-US1、及pET-DS1。在本實例中，係使用DNA測序儀ABI3700(Applied Biosystems)測定該DNA序列。
(2)各重組型多胜肽在大腸桿菌中之表現性
(2-1)大腸桿菌BL21轉形體之製備
藉常用方法而使用重組型ORF多胜肽表現之質體pET-US3、pET-US1、pET-DS1、及pET21a(負對照物)以將大腸桿菌BL21(DE3)菌株轉形。為了獲得單一菌落，於37℃下在含安比西林(50微升/毫升)之LB培養基瓊脂平板上培養該等轉形體，費時一夜。
(2-2)重組型多胜肽表現性之誘發
於37℃下在3毫升含安比西林(50微克/毫升)之液體LB培養基內培養大腸桿菌BL21(DE3)。然後，藉添加50毫升含相同濃度之安比西林的液體LB培養基而預培養0.5毫升該培養物，費時3小時(直到於630奈米之OD變成約0.4至0.7為止)。藉添加IPTG(異丙基-β-硫半乳哌喃糖苷；Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)而將該最終濃度調整至1mM，進一步於37℃下培育該培養物，費時4小時。因此，誘發重組型多胜肽在大腸桿菌內之表現性。
(2-3)破裂細胞懸浮液之製備
在方法(2-2)中誘發表現性後，使用Avanti HP25 (Beckman Coulter)藉離心法(6,000rpm，4℃，15分鐘)而收集該等細胞。後續程序係在冰上進行。移除上澄清液(該培養基)後，使該等細胞懸浮在含1mM PMSF、2mM DTT、及5mM亞硫酸氫鈉之1毫升磷酸鉀緩衝劑(0.1M，pH7.0；下文中其縮寫為KPB-PDH)中。然後將該細胞懸浮液放入已裝填0.7毫升氧化鋯-氧化矽小粒(BioSpec Products,Inc.)及400微升KPB-PDH之2毫升輔助管內。然後使用FastPrepR (Thermo Electron Corporation)藉20秒、6,500rpm處置及3分鐘冰冷却之兩重複循環而破裂該等細胞。結果，獲得破裂細胞之懸浮液。
(2-4)藉SDS-聚丙烯醯胺-凝膠電泳(SDS-PAGE)而確認重組型多胜肽表現性
藉SDS-PAGE而確認各重組型多胜肽在大腸桿菌中之表現性。添加5微升之5×試樣緩衝劑(125mM Tris-HCl(pH 6.5)/25%甘油/5%SDS/5%2-巰基乙醇/BPB 0.5%)至20微升在方法(2-3)中所獲得之該破裂細胞懸浮液。於98℃熱變性後，冰冷却該懸浮液，並藉SDS-PAGE而電泳4微升。以市售凝膠平板(5-20%；Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、及用於染色之Quick CBB(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)進行SDS-PAGE。使用預染之XL-Ladder Broad range(Apro Science)作為分子量標誌物。SDS-PAGE之該等結果示於第21圖內。在分別衍生自pET-US3及pET-DS1轉形體之該等破裂細胞懸浮液內可確認具有分子量為約52kDa及50kDa之重組型ORF-US3及ORF-DS1多胜肽的表現性。在衍生自pET-US1轉形物之該破裂細胞懸浮液中未發現重組型ORF-US1多胜肽之表現性。
實例C3：重組型ORF多胜肽之雌馬酚合成活性的測定
使用實例C2中所獲得之該破裂細胞懸浮液作為酵素源以測定自四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚之轉化活性。在本實例中，自四氫大豆黃酮轉化成雌馬酚之轉化活性的測定步驟如下。
製備具以下組成之酵素反應混合物並於37℃下培育該混合物，費時1小時。
酵素反應混合物之組成
破裂細胞懸浮液(酵素源)：100微升
NADH(100mM)：20微升
NADPH(100mM)：20微升
順式-四氫大豆黃酮(2毫克/毫升)：5微升
反式-四氫大豆黃酮(2毫克/毫升)：5微升
KPB-PDH：850微升
總共：1,000微升
培育後，添加3毫升乙酸乙酯至該酵素反應混合物以進行萃取。乾燥後，藉流動相(溶離劑)而溶解萃取物。藉HPLC而分析該溶解產物以測定二氫大豆黃酮、順式-四氫大豆黃酮、反式-四氫大豆黃酮、及雌馬酚在該酵素反應混合物內之含量。作為HPLC分析之標準溶液，係使用含有大豆黃酮(2微克/毫升；Funakoshi Corporation)、雌馬酚(2微克/毫升；Funakoshi Corporation)、二氫大豆黃酮(2微克/毫升；TrendResearch Chemicals Inc.)、順式-四氫大豆黃酮及反式-四氫大豆黃酮(2微克/毫升；其等皆由Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.化學性合成)之混合物溶液。
鑑於HPLC分析，在衍生自可表現該重組型ORF-US3多胜肽之質體pET-US3轉形體的該破裂細胞懸浮液內，已添加至該酵素反應混合物之四氫大豆黃酮係轉化成雌馬酚(第22圖)。另外，在該雌馬酚生物合成路徑(第22圖)期間可確認該轉化成二氫大豆黃酮之轉化活性，該二氫大豆黃酮為四氫大豆黃酮之前驅物。就pET-US1及pET-DS1轉形物，與pET21a轉形物(負對照物)而言，在該酵素反應混合物內僅偵測到四氫大豆黃酮。需注意在各該圖內，大豆黃酮之縮寫為DZN，二氫大豆黃酮縮寫為DD、順式-四氫大豆黃酮之縮寫為c-THD、反式-四氫大豆黃酮之縮寫為t-THD，而雌馬酚之縮寫為EQL。
這些結果證實ORF-US3多胜肽具有可自四氫大豆黃酮生物合成雌馬酚之活性。因此可確定重組型ORF-US3多胜肽相當於E3多胜肽。
實例D
實例D1：使用大腸桿菌表現並純化經His-標記之重組性雌馬酚製備相關酵素
經由使用pET系統(Novagen)，其係為使用大腸桿菌之重組型蛋白質表現性系統，可表現具有His-標記之3種雌馬酚製備相關酵素：二氫大豆黃酮合成酵素(E1)、四氫大豆黃酮合成酵素(E2)、雌馬酚合成酵素(E3)，繼而使用經His標記之蛋白質純化(Ni)柱進行親和力純化。
(1)經His標記之酵素表現性載體的製備
為了製備用於該等酵素(E1、E2、E3)之表現性載體，在各啟讀架構區域內之一多核苷酸係藉PCR而擴增並插入pET21a載體(Novagen)內。
(1-1)擴增引子
根據在實例B5中所發現之該二氫大豆黃酮合成酵素(E1)之附近中的基因組序列，製成以下擴增引子。
經His標記之E1酵素
exp.E1 pet F Nde：AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA(序列辨識編碼：41)
exp.E1 pet His：AATCGAATTCGTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT(序列辨識編碼：42)
經His標記之E2酵素
exp.US2 pet F Nde：TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC(序列辨識編碼：60)
exp.E2 pet His：AATCGAATTCGAGACCTCGATCTCGCCCTGC(序列辨識編碼：68)
經His標記之E3酵素
exp.US3 F：TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG(序列辨識編碼：62)
exp.E3 R His：CCGCAAGCTTGTACATAGTGGAGATCGCGTGG(序列辨識編碼：69)
為了插入pET21a(Novagen)內，該等擴增引子：exp.E1 pet F Nde、exp.US2 pet F、及exp.US3 F經設計可包括一限制酵素NdeI切割部位序列；exp.E1 pet His及exp.E2 pet His 經設計可包括一EcoRI切割部位序列；而exp.E3 R His經設計可包括一HindIII切割部位序列。
(1-2)經His標記之酵素多核苷酸的擴增
使用25微升反應混合物進行PCR反應，該反應混合物含有該等引子，各5pmol；dNTP，各5nmol；在實例A5中所純化之乳酸球菌屬20-92菌株(FERM BP-10036)的基因組DNA，40毫微克；用於KOD-plus DNA聚合酶(Toyobo)之10×緩衝劑，2.5微升；KOD-plus DNA聚合酶(Toyobo)0.3U，2.5微升；擴增程序：95℃，費時3分鐘、(94℃，費時30秒、60℃，費時30秒、68℃，費時2分鐘)×30次循環、68℃，費時7分鐘(PCR裝置：GeneAmpPCR System 9700(Applied Biosystems))。藉瓊脂糖凝膠電泳偵測一預定大小之條帶而分析該PCR反應混合物之一部份。藉QIAGEN PCR純化套組(Qiagen)而收集完整PCR產物。
(1-3)經His標記之酵素多胜肽表現性載體之純化
以限制酵素NdeI及EcoRI切割(1-2)中所收集之該等經His標記之酵素多核苷酸片段並進行瓊脂糖凝膠電泳。然後，切除含該標靶條帶之部份，並經Qiagen凝膠萃取套組(Qiagen)純化且收集。收集後於16℃下使用DNA連接套組ver.2.1(Takara Bio)以經NdeI及EcoRI切割之pET21a連接該等多核苷酸片段，費時一夜。經由該連接反應混合物，以通用方法進行大腸桿菌JM109菌株(Takara Bio)之轉形。於37℃下在含安比西林(50微克/毫升)之LB培養基瓊脂(GIBCO)平板上培育如此獲得之轉形體。費時一夜。在含安比西林(50微克/毫升)之3毫升LB培養基(GIBCO)內培養所形成單一菌落，費時一夜。然後，使用質體自動萃取PI-100(KURABO)萃取質體DNA。
藉該染劑終止方法而將該質體內之插入DNA的鹼基序列定序。如所欲，其確定ORF-US2多核苷酸成功插入。獲得pET-E1-His、pET-E2-His、及pET-E3-His。在本實例中，係使用DNA測定儀ABI3700(Applied Biosystems)測定該DNA序列。
(2)在大腸桿菌中各經His標記之重組型酵素多胜肽的表現性及親和力純化
經由使用用於表現經His標記之酵素多胜肽的pET-E1-His、pET-E2-His、及pET-E3-His，使用通用方法將大腸桿菌BL21(DE3)菌株(Novagen)轉形。於37℃下含安比西林(50微克/毫升)之LB培養基瓊脂(GIBCO)平板上培養該等轉形體，費時一夜，藉以獲得單一菌落。
(2-2)經His標記之重組型E1及E2酵素多胜肽之純化
(2-2-1)大腸桿菌培養及經His標記之重組型E1及E2酵素多胜肽之表現性的誘發
於37℃下在含安比西林(50微克/毫升)之10毫升液體LB培養基內培養分別藉pET-E1-His及pET-E2-His而轉形之各大腸桿菌BL21(DE3)轉形體。然後。藉添加150毫升含相同濃度之安比西林的液體LB培養基而預培養7.5毫升該培養物，費時2小時(直到於600奈米之OD變成約0.5為止)。藉添加IPTG(異丙基-β-硫半乳哌喃糖苷；Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)而將最終濃度調整至0.5mM後，進一步於30℃下培育該培養基，費時4小時，並同時溫和搖動，藉以誘發經His標記之重組型E1及E2酵素多胜肽在大腸桿菌中之表現性。
(2-2-2)溶胞產物之製備
在(2-2)中之表現性誘發後，使用Avanti HP25(Beckman coulter)離心處理該培養物以收集細胞，藉此獲得分別以0.66克及0.73克數量表現在大腸桿菌中之經His標記之重組型E1及E2酵素多胜肽。添加Bugbuster蛋白質萃取溶液(Novagen)至所獲得細胞，其添加量為每克(淨重)該細胞15毫升。以吸管使該混合物溫和地懸浮並分別以2000個單位/毫升、及25個單位(1微升)毫升之數量添加溶酶體(SIGMA)及Benzonase(Novagen)至該懸浮液。其後，於室溫下以旋轉器(RT-50：Taitec)緩慢攪拌該混合物，費時30分鐘，藉以獲得溶胞產物(溶胞產物A)。以Avanti HP25(Beckman coulter)離心處理(8000rpm，4℃，15分鐘)溶胞產物A以分離上澄清液(溶胞產物B)。
(2-2-3)經His標記之E1及E2酵素多胜肽之親和力純化
經由使用His GraviTrap(GE Healthcare Bioscience)作為經His標記之蛋白質純化柱，除了部份修改不同外，根據指示手冊進行該等經His標記之E1及E2酵素多胜肽的親和力純化。更明確地，His GraviTrap係經冰冷却之10毫升結合緩衝劑平衡，且將(2-2-2)中所製成之整個溶胞產物B倒入該混合物內以藉自由墜落而使該標靶His標記之E1或E2酵素附著於His GraviTrap。其後，以冰冷却之10毫升清潔緩衝劑清洗His GraviTrap共兩次，繼而使用3毫升溶析緩衝劑自His GraviTrap溶析該標靶His標記之E1及E2酵素。添加DTT(二硫蘇糖醇；Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)至該溶離液以使最終濃度變成3mM。將該混合物分成300微升微管。在各別溶離液內檢查部份該等微管之E1酵素活性及E2酵素活性。於4℃下保藏該溶離液，直到用於酵素試驗為止。用於該結合緩衝劑、清潔緩衝劑、及溶析緩衝劑之組成如下。結合緩衝劑：20mM Tris-HCl、20mM咪唑(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、0.5M NaCl(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、1mM DTT(二硫蘇糖醇：Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)、1mM PMSF(苯基甲基硫醯氟：Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)清潔緩衝劑：20mM Tris-HCl、60mM咪唑、0.5M NaCl、1mM DTT(二硫蘇糖醇)、1mM PMSF(苯基甲基磺醯氟)溶析緩衝劑：20mM Tris-HCl 500mM咪唑、0.5M NaCl,1mM DTT(二硫蘇糖醇)、1mM PMSF(苯基甲基磺醯氟)
(2-3)經His標記重組型E3酵素多胜肽之純化
(2-3-1)大腸桿菌培養及經His標記重組型E3酵素多胜肽之表現性的誘發
於37℃在含安比西林(50微克/毫升)之50毫升液體LB培養基內培養該已藉pET-E3-His而轉形之大腸桿菌BL21(DE3)轉形體，費時一夜。然後，藉添加1升含相同濃度之安比西林的液體LB培養基而預培養20毫升該培養物，費時3小時(直到於600奈米之OD變成約0.4為止)。藉添加IPTG(異丙基-β-硫半乳哌喃糖苷；Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)而將最終濃度調整至0.5mM後，進一步於37℃下培育該培養物，費時4小時，同時搖動，藉以在大腸桿菌內誘發經His標記重組型E3酵素多胜肽之表現性。該表現性誘發後，使用Avanti HP25(Beckman coulter)離心處理(6000rpm，4℃，10分鐘)該培養物以收集細胞。添加0.1M含1mM DMSF(苯基甲基磺醯氟)、2mM DTT(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)及5mM亞硫酸氫鈉之磷酸鉀緩衝劑(下文稱為緩衝劑A，pH7.0)至該懸浮液。離心處理(6000rpm，4℃，10分鐘)後，於-80℃下維持該培養物。
(2-3-2)溶胞產物之製備
將於-80℃下保藏之該等細胞快速解凍並離心處理(10,000×g15分鐘)。藉添加25毫升新緩衝劑A而懸浮該等細胞。為了進行破裂，藉使用(Thermo ElectronCorporation)而進行20秒、6,500rpm處置及3分鐘冰冷却之3次重複循環以將該等細胞破裂。離心處理(10000×g，15分鐘)所形成破裂細胞材料。分離上澄清液以獲得溶胞產物。
(2-3-3)經His標記之重組型E3酵素多胜肽的親和力純化
將(2-3-3)中所獲得之溶胞產物(4毫升)送至HisTrap HP(GE Healthcare Bioscience)，其係為His標記融合蛋白質純化柱，以在下述純化條件下純化該經His標記之重組型E3酵素多胜肽。根據於280奈米之吸收性以測定該蛋白質。該直通溶離份中之於280奈米的吸收性降至基線後，使用溶離份收集器收集該溶離份。
流率：1毫升/分鐘
溶離份；2毫升/2分鐘/溶離份
溶離劑A：0.1M磷酸鉀緩衝劑(pH 7)/0.5M NaCl/1% isoPrOH
溶離劑B：含0.5M咪唑之溶離劑A
溶析程序：時間(分鐘)(溶離劑B)/(溶離劑A+溶離劑B)
在第7至9號溶離劑中可發現E3合成活性。匯集藉多次純化而獲得之活性溶離份，以8%之比率使該等活性溶離份與甘油混合，維持於-28℃下，且若必要經溶解以便用於實驗。
實例D2：使用經His標記之重組型E1及E2酵素以自大豆黃酮合成四氫大豆黃酮
經由使用實例D1之製程(2-2-3)中所獲得之該等經His標記之重組型E1及E2酵素作為酵素源，製備具以下組成之酵素反應混合物並於37℃下進行反應，費時2小時以自大豆黃酮合成四氫大豆黃酮。另外，係同時進行個別使用該經His標記之重組型E1或E2酵素作為酵素源之反應。
酵素反應混合物之組成
經His標記之重組型E1酵素：20微升
經His標記之重組型E2酵素：20微升
NADH(100mM)：20微升
NADPH(100mM)：20微升
大豆黃酮(2毫克/毫升)：5微升
0.1M磷酸鉀緩衝劑pH 7/1mM PMSF/2mM DTT/5mM亞硫酸氫鈉：915微升
總共：1000微升
培育後，添加3毫升乙酸乙酯(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)至所獲得酵素反應混合物以進行萃取。乾燥後，藉流動相(溶離劑)而溶解萃取物。藉HPLC而分析溶解產物以測定該酵素反應混合物內之順式-及反式-四氫大豆黃酮之含量。
作為用於HPLC分析之標準溶液，使用含有大豆黃酮(2微克/毫升；Funakoshi Corporation)、雌馬酚(2微克/毫升；Funakoshi Corporation)、二氫大豆黃酮(2微克/毫升；Trend Research Chemicals Inc.)、順式-四氫大豆黃酮(2微克/毫升；參考例B1)及反式-四氫大豆黃酮(2微克/毫升；參考例B1)之混合溶液。
第23圖表示HPLC分析之該等結果。當使用該等經His標記之重組型E1及E2酵素的混合物作為酵素源時，在該產物內可確認順式-及反式-四氫大豆黃酮之存在。然而，當個別使用該經His標記之重組型E1或E2酵素作為酵素源時，在該產物內並未證實順式-或反式-四氫大豆黃酮之存在。
實例D3：使用經His標記之重組型E2及E3酵素以自二氫大豆黃酮合成雌馬酚
經由使用實例D1之製程(2-2-3)及(2-3-3)中所獲得之該等經His標記之重組型E2及E3酵素作為酵素源，製備具有以下組成之酵素反應混合物並於37℃下進行反應，費時2小時以自二氫大豆黃酮合成雌馬酚。另外，係於同時進行個別使用該經His標記之重組型E1或E2酵素作為酵素源之反應。
酵素反應混合物之組成
經His標記之重組型E2酵素：20微升
經His標記之重組型E3酵素：20微升
NADH(100mM)：20微升
NADPH(100mM)：20微升
二氫大豆黃酮(2毫克/毫升)：5微升
0.1M磷酸鉀緩衝劑 pH 7/1mM PMSF/2mM DTT/5mM亞硫酸氫鈉：915微升
總共：1000微升
培育後，添加3毫升乙酸乙酯(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)至所獲得酵素反應混合物以進行萃取。乾燥後，藉流動相(溶離劑)而溶解萃取物。藉HPLC而分析溶解產物以測定該酵素反應混合物中之雌馬酚含量。
第24圖表示HPLC分析之該等結果。當使用該等經His標記之重組型E2及E3酵素的混合物作為酵素源時，在該產物內可確認雌馬酚之存在。然而，當個別使用該經His標記之重組型E2或E3酵素作為酵素源時，在該產物內並未證實雌馬酚之存在。
實例D4：使用經His標記之重組型E1、E2、及E3酵素以自大豆黃酮合成雌馬酚
經由使用實例D1之製程(2-2-3)及(2-3-3)中所獲得之該等經His標記之重組型E1、E2、及E3酵素作為酵素源，製備具有以下組成之酵素反應混合物並於37℃下進行反應，費時2小時以自大豆黃酮合成雌馬酚。另外，係同時進行個別使用該經His標記之重組型E1、E2或E3酵素作為酵素源之反應。
酵素反應混合物之組成
經His標記之重組型E1酵素：20微升
經His標記之重組型E2酵素：20微升
經His標記之重組型E3酵素：20微升
NADH(100mM)：20微升
NADPH(100mM)：20微升
二氫大豆黃酮(2毫克/毫升)：5微升
0.1M磷酸鉀緩衝劑pH7/1mM PMSF/2mM DTT/5mM亞硫酸氫鈉：895微升
總共：1000微升
培育後，添加3毫升乙酸乙酯(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)至所獲得酵素反應混合物以進行萃取。乾燥後，藉流動相(溶離劑)而溶解萃取物。藉HPLC而分析溶解產物以測定該酵素反應混合物中之雌馬酚含量。
第25圖表示HPLC分析之該等結果。當個別使用該經His標記之重組型E1、E2或E3酵素作為酵素源時，在該產物內並未證實雌馬酚之存在。然而，當使用該等經His標記之重組型E1、E2、及E3酵素作為酵素源時，在該產物內可確認雌馬酚之存在。
實 例E：金屬離子對經His標記之重組型E1酵素的二氫大豆黃酮合成活性之影響
經由使用藉Ni-塞法羅斯糖而純化之大腸桿菌中表現之該His標記的重組型E1酵素(E1-His)作為酵素源，可檢查金屬離子對自大豆黃酮轉化成二氫大豆黃酮之轉化活性的影響。使各種金屬(MnCl2 .2H2 O、FeSO4 .7H2 O、CaCl2 .2H2 O、Zn(CH3 COO)2 .2H2 O、CoSO4 .7H2 O、MgSO4 .7H2 O、NiSO4 .6H2 O)溶解在蒸餾水中以獲得100mM濃度。經由使用該金屬離子溶液，製成具以下組成之酵素反應混合物並於37℃下進行反應，費時2小時以測定該活性。
酵素反應混合物之組成
經His標記之重組型E1酵素：20微升
NADH(100mM)：10微升
NADPH(100mM)：10微升
大豆黃酮(1毫克/毫升)：10微升
0.2M KPB-DH：850微升
總共：1000微升
培育後，添加3毫升乙酸乙酯至所獲得酵素反應混合物以進行溶析。乾燥後，藉流動相(溶離劑)而溶解萃取物。藉HPLC而分析溶解產物以測定該酵素反應混合物內之大豆黃酮及二氫大豆黃酮的含量。結果，已證實Mn2+ 及Fe2+ 可刺激該活性(第26圖)。
 序列表非關鍵詞文字(Sequence Listing Free Text)
序列辨識編碼：23為引子E1-N-末端-31之鹼基序列。
序列辨識編碼：24為引子E1-N-末端-37之鹼基序列。
序列辨識編碼：25為引子E1-N-末端-F32之鹼基序列。
序列辨識編碼：26為引子E1-內部-RP1之鹼基序列。
序列辨識編碼：27為引子pUC19-FP-1之鹼基序列。
序列辨識編碼：28為引子pUC19-RP-1之鹼基序列。
序列辨識編碼：29為引子pUC19-FP-2之鹼基序列。
序列辨識編碼：30為引子pUC19-RP-2之鹼基序列。
序列辨識編碼：31為引子E1-RACE-N-P1之鹼基序列。
序列辨識編碼：32為引子E1-RACE-N-RR2-1之鹼基序列。
序列辨識編碼：33為引子E1-RACE-N-P2之鹼基序列。
序列辨識編碼：34為引子E1-RACE-RP2-2之鹼基序列。
序列辨識編碼：35為引子E1-conf-NP之鹼基序列。
序列辨識編碼：36為引子E1-conf-CP之鹼基序列。
序列辨識編碼：37為引子E1-FP之鹼基序列。
序列辨識編碼：38為引子E1-RP之鹼基序列。
序列辨識編碼：39為引子Gar-16S-Ribo-FP之鹼基序列。
序列辨識編碼：40為引子Gar-16S-Ribo-RP之鹼基序列。
序列辨識編碼：41為引子exp. E1 pet F Nde之鹼基序列。
序列辨識編碼：42為引子exp. E1 pet His之鹼基序列。
序列辨識編碼：43為引子RACE-N-P3-1之鹼基序列。
序列辨識編碼：44為引子RACE-N-P3-2之鹼基序列。
序列辨識編碼：45為引子E1-Bub-N-P1之鹼基序列。
序列辨識編碼：46為引子E1-Bub-N-P2之鹼基序列。
序列辨識編碼：47為引子RACE-C-P3-1之鹼基序列。
序列辨識編碼：48為引子RACE-C-P3-2之鹼基序列。
序列辨識編碼：49為引子E1-Bub-C-P1之鹼基序列。
序列辨識編碼：50為引子E1-Bub-C-P2之鹼基序列。
序列辨識編碼：57為引子E2-invitro TS-FP之鹼基序列。
序列辨識編碼：58為引子E2-invitro TS-RP之鹼基序列。
序列辨識編碼：59為引子U niversal-Primer之鹼基序列。
序列辨識編碼：60為引子exp. US2 pet F Nde之鹼基序列。
序列辨識編碼：61為引子exp. US2 pet之鹼基序列。
序列辨識編碼：62為引子exp. US3 F之鹼基序列。
序列辨識編碼：63為引子exp. US3 R之鹼基序列。
序列辨識編碼：64為引子exp. US1 F之鹼基序列。
序列辨識編碼：65為引子exp. US1 R之鹼基序列。
序列辨識編碼：66為引子exp. DS1 F之鹼基序列。
序列辨識編碼：67為引子exp. DS1 R之鹼基序列。
第1圖表示實例A1中之HPLC分析的結果。上面的3個層析圖：未使用輔酵素之酵素反應產物(對照物)、及使用NADH及NADPH作為輔酵素之酵素反應產物。長條圖：尖峰區域相當於在對照物(無輔酵素)中之二氫大豆黃酮及在使用NADH及NADPH作為輔酵素之試樣中之二氫大豆黃酮。
第2圖表示在實例A2中之Mono Q HPLC的結果(上圖)、及各溶離份之二氫大豆黃酮合成酵素的活性(下圖)。該酵素活性係以一相當於使用大豆黃酮作為受質之二氫大豆黃酮的尖峰區域表示。
第3圖表示實例A2中之SDS-PAGE的結果(左圖)、及各溶離劑之二氫大豆黃酮合成酵素的活性(右圖)。該酵素活性係以一相當於使用大豆黃酮作為受質之二氫大豆黃酮的尖峰區域表示。使用SuperSep HG 10-20%(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)作為電泳凝膠平板。
第4圖表示實例A4中之胜肽繪製之結果、及相當於尖峰之胜肽的胺基酸序列。鄰接於上面的HPLC分析曲線圖中之箭號▼的數字分別相當於1：FDEPVYPQAE，2：ASRMVMDAVHEGYIAG，3：GYIGNLEVENRAIRMPM。
第5圖表示實例A5中之變性PCR產物的瓊脂糖電泳結果。E1-N-末端-31及E1-內部-RP1、E1-N-末端-37及E1-內部-RP1、E1-N-末端-F32及E1-內部-RP1；標誌物：M1：λ/Sty1，M2：100bp梯形物(Ladder)。
第6圖表示實例A7中之RT-PCR產物的瓊脂糖電泳結果。
第7圖表示實例A8中之SDS-PAGE的結果。
第8圖表示實例A8中之HPLC分析結果。
第9圖表示實例B1中之HPLC分析結果。上曲線圖：順式-四氫大豆黃酮(REF-000312)；中曲線圖：使用二氫大豆黃酮作為受質並使用破裂細胞材料作為酵素源之酵素反應產物；下曲線圖：反式-四氫大豆黃酮(REF-000313)。
第10圖表示實例B1中之HPLC分析結果。上面的兩個曲線圖：使用順式-四氫大豆黃酮(REF-000312)作為受質並使用破裂細胞材料作為酵素源之酵素反應產物；下面的兩個曲線圖：使用反式-四氫大豆黃酮(REF-000313)作為受質並使用破裂細胞材料作為酵素源之酵素反應產物。
第11圖表示實例B2中之HPLC分析結果。上面的3個曲線圖：未使用輔酵素之酵素反應產物(對照物)、及使用NADH與NADPH作為輔酵素之酵素反應產物。長條圖：尖峰區域相當於在對照物(無輔酵素)中之四氫大豆黃酮、及在使用NADH與NADPH作為輔酵素之試樣中四氫大豆黃酮。
第12圖表示實例B3中之凝膠過濾HPLC分析結果。上曲線圖：用於標準蛋白質之結果；中曲線圖：以一相當於該產物四氫大豆黃酮之尖峰區域表示之各溶離份的酵素活性；下曲線圖：相當於各溶離份之該蛋白質的吸收(280奈米)強度。
第13圖表示實例B3中之SDS-PAGE的結果。
第14圖表示實例B4中之SDS-PAGE的結果。
第15圖表示實例B5中所測定之二氫大豆黃酮合成(E1)酵素基因的周邊基因組結構之圖示。
第16-1圖表示得自LC-MS分析之資料、及自實例B6中之LC-MS資料所推斷之一經切割胜肽胺基酸序列的實例；L為藉在本說明文中之X而表示之胺基酸殘基。該上圖係表示胜肽TPGVAASVADEXK，而該下圖係表示胜肽MPGAPVFGK。
第16-2圖表示得自LC-MS分析之資料、及自實例B6中之LC-MS資料所推斷之一經切割胜肽胺基酸序列的實例；L為藉本說明文中之X而表示之胺基酸殘基。該上圖係表示胜肽KXXXTGTTK，而該下圖係表示胜肽VTQEXXCAHGAFVCGSGR。
第16-3圖表示得自LC-MS分析之資料、及自實例B6中之LC-MS資料所推斷之一經切割胜肽胺基酸序列(WXSPEESVGQR)的實例；L為藉本說明文中之X而表示之胺基酸殘基。
第17圖表示實例B7中之HPLC分析結果。上左曲線圖，使用二氫大豆黃酮作為受質並使用可表現ORF-US2多胜肽之反應混合物作為酵素源(ORF-US2)之酵素反應產物；上右曲線圖：使用無蛋白質之反應混合物作為酵素源(NC)之酵素反應產物。長條圖：相當於藉NC(無蛋白質合成法)中之酵素反應而製成之二氫大豆黃酮(DD)及四氫大豆黃酮(THD)的尖峰區域、及在使用DHFR(可表現二氫葉酸還原酶之反應混合物)及ORF-US2(可表現ORF-US2多胜肽之反應混合物)作為酵素源之實例中的二氫大豆黃酮(DD)及四氫大豆黃酮(THD)的尖峰區域。
第18圖表示實例B8之SDS-PAGE的結果。
第19圖表示實例B8中之HPLC分析結果。上曲線圖：使用二氫大豆黃酮作為受質、並使用衍生可表現重組性ORF-US2多胜肽之質體pET21-US2轉形體作為酵素源(pET21-US2)的酵素反應產物；下曲線圖：使用二氫大豆黃酮作為受質並使用衍生自pET21a轉形體之破裂細胞懸浮液(負對照物)作為酵素源(pET21a)的酵素反應產物。長條圖：相當於使用衍生自可表現ORF-US2多胜肽之反應混合物及pET21a轉形體作為酵素源的破裂細胞懸浮液作為酵素源之試樣中藉酵素反應而製成之二氫大豆黃酮(DD)及順式-(c-THD)與反式-四氫大豆黃酮(t-THD)的尖峰區域。
第20圖表示實例C1中之HPLC分析結果。
第21圖表示實例C2中之SDS-PAGE的結果。
第22圖表示實例C3中之HPLC分析結果。
第23圖表示實例D2中之HPLC結果。
第24圖表示實例D3中之HPLC結果。
第25圖表示實例D4中之HPLC結果。
第26圖表示金屬離子對E1酵素活性之影響。
第27圖表示序列辨識編碼：1、2及3之胺基酸序列的排列。
第28圖表示序列辨識編碼：7、8及9之胺基酸序列的排列。
第29圖表示序列辨識編碼：13、14及15之胺基酸序列的排列。

Claims (12)

  1. 一種選自以下之多胜肽：(Ca)一由序列辨識編碼：13之胺基酸所組成的多胜肽；(Cb)一由具有1至50個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編碼：13的胺基酸所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性；及(Cc)一由與序列辨識編碼：13之胺基酸序列的同一性為90%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性。
  2. 一種選自以下之多核苷酸：(Cd)一由序列辨識編碼：16之核苷酸序列所組成的多核苷酸；(Ce)一可將由序列辨識編碼：13之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Cf)一可在高度嚴苛條件下以該多核苷酸(Cd)或(Ce)之互補鏈進行雜交反應的多核苷酸，且其可將具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性的多胜肽編碼。
  3. 一種用於製備雌馬酚之方法，其包括使申請專利範圍第1項之多胜肽對四氫大豆黃酮作用。
  4. 一種選自以下之多胜肽：(Ba)一由序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成的多胜肽； (Bb)一由具有1至30個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：7的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性；及(Bc)一由與序列辨識編號：7之胺基酸序列的同一性為90%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。
  5. 一種選自以下之多核苷酸：(Bd)一由序列辨識編號：10之核苷酸序列所組成的聚核苷酸；(Be)一可將由該序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成之多胜肽編號的多核苷酸；及(Bf)一可在高度嚴苛條件下以該多核苷酸(Bd)或(Be)之互補鏈進行雜交反應之多核苷酸，且其可將一具有使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性之多胜肽編碼。
  6. 一種用於製備四氫大豆黃酮之方法，其包括使申請專利範圍第4項之多胜肽、與NADPH及/或NADH對二氫大豆黃酮作用。
  7. 一種選自以下之多胜肽：(Aa)一由序列辨識編碼：1之胺基酸序列所組成之多胜肽；(Ab)一由具有1至50個胺基酸之取代、刪除、插入、 及/或加成反應之序列辨識編號：1的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性；及(Ac)一由與序列辨識編號：1之胺基酸序列的同一性為90%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性。
  8. 一種選自以下之多核苷酸：(Ad)一由序列辨識編號：4之核苷酸序列所組成之多核苷酸；(Ae)一可將由該序列辨識編號：1之胺基酸序列所組成之多胜肽編碼的多核苷酸；及(Af)一在高度嚴苛條件下可使用該多核苷酸(Ad)或(Ae)之互補鏈進行雜交且可將具有使用大豆黃酮作為基質以合成二氫大豆黃酮之活性的多胜肽編碼之多核苷酸。
  9. 一種用於製備二氫大豆黃酮之方法，其包括使申請專利範圍第7項之多胜肽、與NADPH及/或NADH對大豆黃酮作用。
  10. 一種用於製備四氫大豆黃酮之方法，其包括以下第一步驟及第二步驟：第一步驟包括使由以下(Aa)至(Ac)多胜肽中任一種所組成之酵素、及NADPH及/或NADH對大豆黃酮作用以製備二氫大豆黃酮的步驟，(Aa)一由序列辨識編號(SEQ ID NO)：1之胺基酸序 列所組成之多胜肽；(Ab)一由具有1至50個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：1的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性；及(Ac)一由與序列辨識編號：1之胺基酸序列的同一性為90%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性。第二步驟包括使由以下(Ba)至(Bc)多胜肽中任一種所組成之酵素與NADPH及/或NADH對二氫大豆黃酮作用以製備四氫大豆黃酮的步驟，(Ba)一由序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成的多胜肽；(Bb)一由具有1至30個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：7的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性；及(Bc)一由與序列辨識編號：7之胺基酸序列的同一性為90%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性。
  11. 一種用於製備雌馬酚之方法，其包括以下第二步驟及第三步驟：第二步驟包括使由以下(Ba)至(Bc)多胜肽中任一種所組成之酵素與NADPH及/或NADH對二氫大豆黃酮作用以製備四氫大豆黃酮的步驟， (Ba)一由序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成的多胜肽；(Bb)一由具有1至30個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：7的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性；及(Bc)一由與序列辨識編號：7之胺基酸序列的同一性為90%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性，第三步驟包括使由以下(Ca)至(Cc)多胜肽中之任一種所組成之酵素對四氫大豆黃酮作用以製備雌馬酚的步驟，(Ca)一由序列辨識編碼：13之胺基酸所組成的多胜肽；(Cb)一由具有1至50個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編碼：13的胺基酸所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性；及(Cc)一由與序列辨識編碼：13之胺基酸序列的同一性為90%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性。
  12. 一種用於製備雌馬酚之方法，其包括下列第一步驟至第三步驟：第一步驟包括使由以下(Aa)至(Ac)多胜肽中任一種所組成之酵素、及NADPH及/或NADH對大豆黃酮作用以製 備二氫大豆黃酮的步驟，(Aa)一由序列辨識編號(SEQ ID NO)：1之胺基酸序列所組成之多胜肽；(Ab)一由具有1至50個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：1的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性；及(Ac)一由與序列辨識編號：1之胺基酸序列的同一性為90%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用大豆黃酮作為受質以合成二氫大豆黃酮之活性。第二步驟包括使由以下(Ba)至(Bc)多胜肽中任一種所組成之酵素與NADPH及/或NADH對二氫大豆黃酮作用以製備四氫大豆黃酮的步驟，(Ba)一由序列辨識編號：7之胺基酸序列所組成的多胜肽；(Bb)一由具有1至30個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編號：7的胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性；及(Bc)一由與序列辨識編號：7之胺基酸序列的同一性為90%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用二氫大豆黃酮作為受質以合成四氫大豆黃酮之活性第三步驟包括使由以下(Ca)至(Cc)多胜肽中之任一種所組成之酵素對四氫大豆黃酮作用以製備雌馬酚的步驟， (Ca)一由序列辨識編碼：13之胺基酸所組成的多胜肽；(Cb)一由具有1至50個胺基酸之取代、刪除、插入、及/或加成反應之序列辨識編碼：13的胺基酸所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性；及(Cc)一由與序列辨識編碼：13之胺基酸序列的同一性為90%或更高之胺基酸序列所組成之多胜肽，且其具有可使用四氫大豆黃酮作為受質以合成雌馬酚之活性。
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