JP5230654B2 - エクオール合成に関与する酵素 - Google Patents
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Description
項A1. 以下の(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチド:
(Aa)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Ab)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Ac)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
項A2. 以下の(Ad)〜(Af)のいずれかであるポリヌクレオチド:
(Ad)配列番号4に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Ae)配列番号1に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Af)前記(Ad)又は(Ae)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項A3. 項A2に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
項A4. 項A3に記載の発現ベクターによって形質転換された組換え細胞。
項A5. 組換え細胞が細菌性原核細胞である、項A4に記載の組換え細胞。
項A6. 細菌性原核細胞がラクトコッカス属に属するものである、項A5に記載の組換え細胞。
項A7. 項A4乃至A6のいずれかに記載の細胞を培養し、ダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドを得る工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
項A8. 項A7に記載の製造方法により得られるポリペプチド。
項A9. ダイゼインに対して、項A1又はA8に記載のポリペプチド、並びにNADPH及び/又はNADHを作用させる工程を含む、ジヒドロダイゼインの製造方法。
項A10. ダイゼインに、項A4乃至A6のいずれかに記載の細胞を作用させる工程を含む、ジヒドロダイゼインの製造方法。
項A11. 項A1に記載のポリペプチド、又は項A2に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに結合性を有する抗体。
項A12. 項A11に記載の抗体を被験試料に接触させる工程を含む、項A1に記載のポリペプチド又は項A2に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法。
項A13. 検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項A12に記載の方法。
項A14. 項A1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項A2に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プローブ。
項A15. 項A1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項A2に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プライマー。
項A16. 項A14に記載のプローブを用いて、項A1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項A2に記載のポリヌクレオチドを検出又は測定する方法。
項A17. 検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項A16に記載の方法。
項A18. 項A1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、項A2に記載のポリヌクレオチド又はこれらの一部をPCRにより増幅させる工程を含む、項A16に記載の方法。
項A19. 項A1記載のポリペプチド、又は項A2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを含有することを特徴とする、ジヒドロダイゼイン合成酵素組成物。
項A20. 更にNADPH及び/又はNADHを含む、項A19に記載の組成物。
項A21. (Ai)項A1記載のポリペプチド、又は項A2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、(Aii)NADPH及び/又はNADH、及び(Aiii)ダイゼインを含有することを特徴とする、ジヒドロダイゼイン合成原料組成物。
項A22. (Aiv)項A4乃至A6のいずれかに記載の細胞、及び(Aiii)ダイゼインを含有することを特徴とする、ジヒドロダイゼイン合成原料組成物。
項A23. (Ai)項A1記載のポリペプチド、又は項A2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、(Aii)NADPH及び/又はNADH、及び(Aiii)ダイゼインを含む、ジヒドロダイゼイン合成用キット。
項A24. (Aiv)項A4乃至6のいずれかに記載の細胞、及び(Aiii)ダイゼインを含む、ジヒドロダイゼイン合成用キット。
項A25. 少なくとも項A11に記載の抗体を含む、項A1記載のポリペプチド、又は項A2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを測定するための免疫学的測定用キット。
項A26. 少なくとも項A15に記載のプライマーを含む、項A1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項A2に記載のポリヌクレオチドの検出用PCR用キット。
項A27. 項A1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項A2に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞の同定用である、項A26に記載の同定用キット。
項A28. PCR用のキットである、項A27に記載の同定用キット。
項A29. 項A1に記載のポリペプチドからなる、ジヒドロダイゼイン合成酵素。
項B1. 以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチド:
(Ba)配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Bb)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Bc)配列番号7に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
項B2. 以下の(Bd)〜(Bf)のいずれかであるポリヌクレオチド:
(Bd)配列番号10に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Be)配列番号7に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
;
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項B3. 項B2に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
項B4. 項B3に記載の発現ベクターによって形質転換された組換え細胞。
項B5. 組換え細胞が細菌性原核細胞である、項B4に記載の組換え細胞。
項B6. 細菌性原核細胞がラクトコッカス属に属するものである、項B5に記載の組換え細胞。
項B7. 項B4乃至B6のいずれかに記載の細胞を培養し、ジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドを得る工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
項B8. 項B7に記載の製造方法により得られるポリペプチド。
項B9. ジヒドロダイゼインに対して、項B1又はB8に記載のポリペプチド、並びにNADPH及び/又はNADHを作用させる工程を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法。
項B10. ジヒドロダイゼインに、項B4乃至B6のいずれかに記載の細胞を作用させる工程を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法。
項B11. 項B1に記載のポリペプチド、又は項B2に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに結合性を有する抗体。
項B12. 項B11に記載の抗体を被験試料に接触させる工程を含む、項B1に記載のポリペプチド又は項B2に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法。
項B13. 検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項B12に記載の方法。
項B14. 項B1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項B2に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プローブ。
項B15. 項B1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はB項2に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プライマー。
項B16. 項B14に記載のプローブを用いて、項B1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項B2に記載のポリヌクレオチドを検出又は測定する方法。
項B17. 検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項B16に記載の方法。
項B18. 項B1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、項B2に記載のポリヌクレオチド又はこれらの一部をPCRにより増幅させる工程を含む、項B16に記載の方法。
項B19. 項B1記載のポリペプチド、又は項B2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを含有することを特徴とする、テトラヒドロダイゼイン合成酵素組成物。
項B20. 更にNADPH及び/又はNADHを含む、項B19に記載の組成物。
項B21. (Bi)項B1記載のポリペプチド、又は項B2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、(Bii)NADPH及び/又はNADH、並びに(Biii)ジヒドロダイゼインを含有することを特徴とする、テトラヒドロダイゼイン合成原料組成物。
項B22. (Biv)項B4乃至6のいずれかに記載の細胞、及び(Biii)ジヒドロダイゼインを含有することを特徴とする、テトラヒドロダイゼイン合成原料組成物。
項B23. (Bi)項B1記載のポリペプチド、又は項B2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、(Bii)NADPH及び/又はNADH、並びに(Biii)ジヒドロダイゼインを含む、テトラヒドロダイゼイン合成用キット。
項B24. (Biv)項B4乃至6のいずれかに記載の細胞、及び(Biii)ジヒドロダイゼインを含む、テトラヒドロダイゼイン合成用キット。
項B25. 少なくとも項B11に記載の抗体を含む、項B1記載のポリペプチド、又は項B2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを測定するための免疫学的測定用キット。
項B26. 少なくとも項B15に記載のプライマーを含む、項B1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項B2に記載のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの検出用PCR用キット。
項B27. 項B1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項B2に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞の同定用である、項B26に記載の同定用キット。
項B28. PCR用のキットである、項B27に記載の同定用キット。
項B29. 項B1に記載のポリペプチドからなる、テトラヒドロダイゼイン合成酵素。
項C1. 以下の(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチド:
(Ca)配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Cb)配列番号13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド;
(Cc)配列番号13に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。
項C2. 以下の(Cd)〜(Cf)のいずれかであるポリヌクレオチド:
(Cd)配列番号16に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Ce)配列番号13に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項C3. 項C2に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
項C4. 項C3に記載の発現ベクターによって形質転換された組換え細胞。
項C5. 組換え細胞が細菌性原核細胞である、項C4に記載の組換え細胞。
項C6. 細菌性原核細胞がラクトコッカス属に属するものである、項C5に記載の組換え細胞。
項C7. 項C4乃至C6のいずれかに記載の細胞を培養し、テトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドを得る工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
項C8. 項C7に記載の製造方法により得られるポリペプチド。
項C9. テトラヒドロダイゼインに対して、項C1又はC8に記載のポリペプチドを作用させる工程を含む、エクオールの製造方法。
項C10. テトラヒドロダイゼインに、項C4乃至C6のいずれかに記載の細胞を作用させる工程を含む、エクオールの製造方法。
項C11. 項C1に記載のポリペプチド、又は項C2に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに結合性を有する抗体。
項C12. 項C11に記載の抗体を被験試料に接触させる工程を含む、項C1に記載のポリペプチド又は項C2に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法。
項C13. 検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項C12に記載の方法。
項C14. 項C1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項C2に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プローブ。
項C15. 項C1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項C2に記載のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を有する、プライマー。
項C16. 項C14に記載のプローブを用いて、項C1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は項C2に記載のポリヌクレオチドを検出又は測定する方法。
項C17. 検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、項C16に記載の方法。
項C18. 項C1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、項C2に記載のポリヌクレオチド又はこれらの一部をPCRにより増幅させる工程を含む、項C16に記載の方法。
項C19. 項C1記載のポリペプチド、又は項C2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを含有することを特徴とする、エクオール合成酵素組成物。
項C20. (Ci)項C1記載のポリペプチド、又は項C2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、並びに(Cii)テトラヒドロダイゼインを含有することを特徴とする、エクオール合成原料組成物。
項C21. (Ciii)項C4乃至C6のいずれかに記載の細胞、及び(Cii)テトラヒドロダイゼインを含有することを特徴とする、エクオール合成原料組成物。
項C22. (Ci)項C1記載のポリペプチド、又は項C2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、並びに(Cii)テトラヒドロダイゼインを含む、エクオール合成用キット。
項C23. (Ciii)項C4乃至C6のいずれかに記載の細胞、及び(Cii)テトラヒドロダイゼインを含む、エクオール合成用キット。
項C24. 少なくとも項C11に記載の抗体を含む、項C1記載のポリペプチド、又は項C2のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを測定するための免疫学的測定用キット。
項C25. 少なくとも項C15に記載のプライマーを含む、項C1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項C2に記載のポリヌクレオチドの検出用PCR用キット。
項C26. 項C1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は項C2に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞の同定用である、項C25に記載の同定用キット。
項C27. PCR用のキットである、項C26に記載の同定用キット。
項C28. 項C1に記載のポリペプチドからなる、エクオール合成酵素。
項D1.以下の(第1工程)及び(第2工程)を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法:
(第1工程)ダイゼインに、以下の(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにNADPH及び/又はNADHを用させることにより、ジヒドロダイゼインを生成する工程;
(Aa)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Ab)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Ac)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(第2工程)ジヒドロダイゼインに、以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにNADPH及び/又はNADHを作用させることにより、テトラヒドロダイゼインを生成する工程;
(Ba)配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Bb)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Bc)配列番号7に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
項D2.項D1に記載の方法により製造された、テトラヒドロダイゼインを含有する生成物。
項D3.以下の(第2工程)及び(第3工程)を含む、エクオールの製造方法:
(第2工程)ジヒドロダイゼインに、以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにNADPH及び/又はNADHを作用させることにより、テトラヒドロダイゼインを生成する工程;
(Ba)配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Bb)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Bc)配列番号7に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(第3工程)テトラヒドロダイゼインに、以下の(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにNADPH及び/又はNADHを作用させることにより、エクオールを製造する工程、
(Ca)配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Cb)配列番号13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド;
(Cc)配列番号13に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。
項D4.項D3に記載の方法により製造された、エクオールを含有する生成物。
項D5.(第1工程)〜(第3工程)を含む、エクオールの製造方法。
項D6.項D5に記載の方法により製造された、エクオールを含有する生成物。
項D7.以下の(Ad)〜(Af)、(Bd)〜(Bf)及び(Cd)〜(Cf)からなる群より選択される少なくとも1種のポリヌクレオチドを有する発現ベクター:
(Ad)配列番号4に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Ae)配列番号1に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Af)前記(Ad)又は(Ae)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Bd)配列番号10に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Be)配列番号7に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Cd)配列番号16に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Ce)配列番号13に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項D8.項D7に記載の発現ベクターによって形質転換された組換え細胞。
項D9.組換え細胞が細菌性原核細胞である、項D8に記載の組換え細胞。
項D10.細菌性原核細胞がラクトコッカス属に属するものである、項D9に記載の組換え細胞。
項D11.以下の(第4工程)〜(第6工程)の少なくとも2つの工程を含む、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールの製造方法:
(第4工程)(Ad)〜(Af)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞をダイゼインを含有する培地で培養することにより、ジヒドロダイゼインを生成させる工程、
(Ad)配列番号4に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Ae)配列番号1に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Af)前記(Ad)又は(Ae)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(第5工程)(Bd)〜(Bf)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞をジヒドロダイゼインを含有する培地で培養することにより、テトラヒドロダイゼインを生成させる工程、
(Bd)配列番号10に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Be)配列番号7に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(第6工程)(Cd)〜(Cc)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞をテトラヒドロダイゼインを含有する培地で培養することにより、エクオールを生成させる工程、
(Cd)配列番号16に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Ce)配列番号13に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
ここで、(Ad)〜(Af)、(Bd)〜(Bf)及び(Cd)〜(Cf)からなる群より選択されるポリヌクレオチドの少なくとも2つが一つの組換え細胞内にあってもよい。
項D12.組換え細胞が細菌性原核細胞である、項D11に記載の製造方法。
項D13.細菌性原核細胞がラクトコッカス属に属するものである、項D12に記載の製造方法。
項D14.項D11〜C13のいずれかに記載の方法により製造された、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールを含有する生成物。
項D15.以下の(第1反応槽)〜(第3反応槽)の少なくとも1つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールの製造装置:
(第1反応槽)(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素が固定されている反応手段を有しており、該ポリペプチドからなる酵素を用いてダイゼインからジヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のダイゼインと接触できるように配置されている;
(第2反応槽)(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素が固定されている反応手段を有しており、該ポリペプチドからなる酵素を用いてジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のジヒドロダイゼインと接触できるように配置されている;
(第3反応槽)(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素が固定されている反応手段を有しており、該ポリペプチドからなる酵素を用いてテトラヒドロダイゼインからエクオールを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のテトラヒドロダイゼインと接触できるように配置されている;
ここで、前記反応手段の少なくとも2つは一つの反応槽に共に存在していてもよい。
項D16.以下の(第4反応槽)〜(第6反応槽)の少なくとも1つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールの製造装置:
(第4反応槽)(Ad)〜(Af)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞が固定されている反応手段を有しており、該反応手段を用いてダイゼインからジヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のダイゼインと接触できるように配置されている;
(第5反応槽)(Bd)〜(Bf)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞が固定されている反応手段を有しており、該反応手段を用いてジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のジヒドロダイゼインと接触できるように配置されている;
(第6反応槽)(Cd)〜(Cf)のいずれかであるポリヌクレオチドを有する組換え細胞が固定されている反応手段を有しており、該反応手段を用いてテトラヒドロダイゼインからエクオールを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のテトラヒドロダイゼインと接触できるように配置されている;
ここで、前記反応手段の少なくとも2つが一つの反応槽に共に存在していてもよい。
A:ジヒドロダイゼイン合成酵素
本項では、ジヒドロダイゼイン合成酵素(以下、E1酵素と表記する場合もある)について詳しく説明する。ジヒドロダイゼイン合成酵素に関する一般的な説明は、別段の記載がされる場合を除き、後述するテトラヒドロダイゼイン合成酵素及びエクオール合成酵素についても適用される。
本発明は、ダイゼインを基質として利用し、ジヒドロダイゼインを合成するポリペプチドとして、以下の(Aa)〜(Ac)のポリペプチド(以下、該ポリペプチドを「E1ポリペプチド」と表記することもある)を提供する:
(Aa)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;例えば1〜250個、好ましくは1〜200個、より好ましくは1〜150個、より好ましくは1〜100個、より好ましくは、1〜50個、より好ましくは1〜30個、更に好ましくは1〜15個、更により好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜4個、より特に好ましくは1〜3個、最も好ましくは1又は2個が挙げられる。
(Ab)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Ac)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
芳香族アミノ酸:Phe、Trp、Tyr
脂肪族アミノ酸:Ala、Leu、Ile、Val
極性アミノ酸:Gln、Asn
塩基性アミノ酸:Lys、Arg、His
酸性アミノ酸:Glu、Asp
水酸基を有するアミノ酸:Ser、Thr
側鎖の小さいアミノ酸:Gly、Ala、Ser、Thr、Met。
0.1 M リン酸カリウム緩衝液
1 mM PMSF(フェニルメチルスルフォニルフルオライド)
2 mM dithiothreitol
5 mM Sodium hydrosulfite
2 mM NADPH又はNADH
40 μM ダイゼイン
pH 7.0
E1ポリペプチドは、ダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成する酵素活性を有する。よって、E1ポリペプチドは、E1酵素とも称される。E1酵素は、Sodium hydrosulfite等の還元剤やマンガンイオンや鉄イオン等の金属イオンの存在により、その酵素活性が賦活化される。E1酵素は、補酵素として、NADPH又はNADHを必要とし、至適温度は30℃付近であり、至適pHは7.0である。E1酵素は、ダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成するだけでなく、その逆反応、即ち、ジヒドロダイゼインを基質としてダイゼインを合成することも可能である。
本発明は、更に、ダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(以下、該ポリヌクレオチドを「E1ポリヌクレオチド」と表記することもある)を提供する。具体的には、E1ポリヌクレオチドとして、以下の(Ad)〜(Af)のポリヌクレオチドを提供する:
(Ad)配列番号4に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Ae)配列番号1に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Af)前記(Ad)又は(Ae)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本発明の発現ベクターは、E1ポリヌクレオチドを含んでおり、且つ該E1ポリヌクレオチドを発現できるものであれば特に制限されず、一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。
本発明は、上記E1ポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって形質転換された組み換え細胞(形質転換体)を提供する。
E1ポリヌクレオチドが導入された組み換え細胞を培養し、細胞及び又は培養物からE1ポリペプチドを回収することにより、E1ポリペプチドを製造することができる。
本発明は、E1ポリペプチドを用いたジヒドロダイゼインの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、E1ポリペプチドを、NADPH及び/又はNADHの存在下で、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。好ましくは、E1ポリペプチドを、NADPHの存在下で、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。
上記ポリペプチドが0.0001〜1.0重量%、好ましくは0.001〜0.1重量%、更に好ましくは0.001〜0.01重量%;
ダイゼインが0.0001〜10.0重量%、好ましくは0.001〜1.0重量%、更に好ましくは0.001〜0.1重量%;及び
NADPH及び/又はNADHが0.01〜5重量%、好ましくは0.05〜1重量%、更に好ましくは0.1〜0.5重量%。
本発明は、更に、E1ポリペプチドを含むジヒドロダイゼイン合成酵素組成物を提供する。該酵素組成物は、E1ポリペプチドを用いたジヒドロダイゼインの製造方法において、ジヒドロダイゼイン合成酵素として好適に使用される。
本発明は、E1ポリヌクレオチドが導入された組み換え細胞を用いたジヒドロダイゼインの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、上記組み換え細胞を、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。
本発明は、更に、E1ポリペプチドに結合性を有する抗体(IgG抗体)を提供する。
更に、本発明は、上記抗体を用いてE1ポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法を提供する。具体的には、該免疫学的方法は、上記抗体を被験試料に接触させることにより実施される。即ち、上記抗体を被験試料に接触させることにより、被験試料中にE1ポリペプチドが存在する場合には、上記抗体とE1ポリペプチドが特異的に結合する。次いで、E1ポリペプチドに結合した上記抗体を検出し、必要に応じてこれを定量することにより、被験試料中の上記ポリペプチドを検出又は測定することができる。
また、本発明は、E1ポリヌクレオチドを検出又は測定する方法を提供する。該方法は、具体的には、E1ポリヌクレオチドに結合するプローブを被験試料と接触させることにより実施される。即ち、該プローブを被験試料に接触させることにより、被験試料中にE1ポリヌクレオチドが存在する場合には、該プローブとE1ポリヌクレオチドがハイブリダイズする。次いで、この二本鎖の形成の有無を検出し、必要に応じてこれを定量することにより、被験試料中のE1ポリヌクレオチドを検出又は測定することができる。
B−1.ポリペプチド
本発明は、ジヒドロダイゼインを基質として利用しテトラヒドロダイゼインを合成するポリペプチドとして、以下の(Ba)〜(Bc)のポリペプチド(以下、該ポリペプチドを「E2ポリペプチド」と表記することもある)を提供する:
(Ba)配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Bb)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Bc)配列番号7に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
0.1 M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)
1 mM PMSF(フェニルメチルスルフォニルフルオライド)
2 mM dithiothreitol
5 mM Sodium hydrosulfite
2 mM NADPH
2 mM NADH
40 μM ジヒドロダイゼイン
E2ポリペプチドは、ジヒドロダイゼインを基質としてテトラヒドロダイゼインを合成する酵素活性を有する。よって、E2ポリペプチドは、E2酵素とも称される。E2酵素は、補酵素として、NADPH又はNADHを必要とする。E2酵素の至適温度は37℃付近であり、至適pHは4.5である。E2酵素は、ジヒドロダイゼインを基質としてテトラヒドロダイゼインを合成するだけでなく、その逆反応、即ち、テトラヒドロダイゼインを基質としてジヒドロダイゼインを合成することも可能である。
本発明は、更に、ジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(以下、該ポリヌクレオチドを「E2ポリヌクレオチド」と表記することもある)を提供する。具体的には、E2ポリヌクレオチドとして、以下の(Bd)〜(Bf)のポリヌクレオチドを提供する:
(Bd)配列番号10に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Be)配列番号7に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本発明の発現ベクターは、E2ポリヌクレオチドを含んでおり、且つ該E2ポリヌクレオチドを発現できるものであれば特に制限されず、E1ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと同様に、一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。具体的な宿主細胞としては、前記A-3.セクションに記載のものを使用することができる。
本発明は、上記E2ポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって形質転換された組換え細胞(形質転換体)を提供する。組換え細胞に使用される宿主細胞としては、前記A−4.セクションに記載のものを特に制限なく使用することができる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法については、上記A−4.セクションの記載に従って行うことが出来る。
E2ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、培養物からE2ポリペプチドを回収することにより、E2ポリペプチドを製造することができる。培養は、前記A−5.セクションの記載に準じて行うことができる。
本発明は、E2ポリペプチドを用いたテトラヒドロダイゼインの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、E2ポリペプチドを、NADPH及び/又はNADHの存在下で、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。
ジヒドロダイゼインが0.0001〜10.0重量%、好ましくは0.001〜1.0重量%、更に好ましくは0.001〜0.1重量%;及び
NADPH及び/又はNADHが0.01〜5重量%、好ましくは0.05〜1重量%、更に好ましくは0.1〜0.5重量%。
本発明は、更に、E2ポリペプチドを含むテトラヒドロダイゼイン合成酵素組成物を提供する。該酵素組成物は、E2ポリペプチドを用いたテトラヒドロダイゼインの製造方法において、テトラヒドロダイゼイン合成酵素として好適に使用される。
本発明は、E2ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を用いたテトラヒドロダイゼインの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、上記組み換え細胞を、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。
本発明は、更に、E2ポリペプチドに結合性を有する抗体(IgG抗体)を提供する。
更に、本発明は、上記抗体を用いてE2ポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法を提供する。具体的には、該免疫学的方法は、前記A-10.セクションに記載の方法に準じて行うことが出来る。
また、本発明は、E2ポリヌクレオチドを検出又は測定する方法を提供する。該方法は、具体的には、E2ポリヌクレオチドに結合するプローブを被験試料と接触させることにより実施され、前記A−11.セクションに記載の方法に準じて行うことが出来る。
C−1.ポリペプチド
本発明は、テトラヒドロダイゼインを基質として利用しエクオールを合成するポリペプチドとして、以下の(Ca)〜(Cc)のポリペプチド(以下、該ポリペプチドを「E3ポリペプチド」と表記することもある)を提供する:
(Ca)配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Cb)配列番号13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド;
(Cc)配列番号13に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。
0.1 M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)
1 mM PMSF(フェニルメチルスルフォニルフルオライド)
2 mM dithiothreitol
5 mMSodium hydrosulfite
40 μM テトラヒドロダイゼイン
E3ポリペプチドは、テトラヒドロダイゼインを基質としてエクオールを合成する酵素活性を有する。よって、E3ポリペプチドは、E3酵素とも称される。E3酵素の至適温度は約23〜37℃であり、至適pHは4.5である。E3酵素は、テトラヒドロダイゼインを基質としてエクオールを合成するだけでなく、その逆反応、即ち、エクオールを原料としてテトラヒドロダイゼインを合成することも可能である。
本発明は、更に、テトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(以下、該ポリヌクレオチドを「E3ポリヌクレオチド」と表記することもある)を提供する。具体的には、E3ポリヌクレオチドとして、以下の(Cd)〜(Cf)のポリヌクレオチドを提供する:
(Cd)配列番号16に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Ce)配列番号13に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本発明の発現ベクターは、E3ポリヌクレオチドを含んでおり、且つ該E3ポリヌクレオチドを発現できるものであれば特に制限されず、E1ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと同様に、一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。具体的な宿主細胞としては、前記A-3.セクションに記載のものを使用することが出来る。
本発明は、上記E3ポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって形質転換された組換え細胞(形質転換体)を提供する。組み換え細胞細胞に使用される宿主細胞としては、前記A-4.セクションに記載されるものを特に制限なくしようすることができる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法については、上記A-4.セクションの記載に従って行うことが出来る。
E3ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、培養物からE3ポリペプチドを回収することにより、E3ポリペプチドを製造することができる。培養は、前記A−5.セクションの記載に従って行うことができる。
本発明は、E3ポリペプチドを用いたエクオールの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、E3ポリペプチドを、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。
テトラヒドロダイゼインが0.0001〜10.0重量%、好ましくは0.001〜1.0重量%、更に好ましくは0.001〜0.1重量%。
本発明は、更に、E3ポリペプチドを含むエクオール合成酵素組成物を提供する。該酵素組成物は、E3ポリペプチドを用いたエクオールの製造方法において、エクオール合成酵素として好適に使用される。
本発明は、E3ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を用いたエクオールの製造方法を提供する。即ち、該製造方法では、上記組み換え細胞を、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。
本発明は、更に、E3ポリペプチドに結合性を有する抗体(IgG抗体)を提供する。
更に、本発明は、上記抗体を用いてE3ポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法を提供する。具体的には、該免疫学的方法は、前記A−10.セクションに記載の方法に準じて行うことが出来る。
本発明は、E3ポリヌクレオチドを検出又は測定する方法を提供する。該方法は、具体的には、E3ポリヌクレオチドに結合するプローブを被験試料と接触させることにより実施され、前記A−11.セクションに記載の方法に準じて行うことができる。
D−I−1.第1工程及び第2工程を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法
本発明は、以下の、ダイゼインからジヒドロダイゼインを生成する第1工程、及びジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを生成する第2工程を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法(以下、該製造方法を「第1製造方法」と表記することもある)を提供する。
(Aa)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Ab)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Ac)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
(Ba)配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Bb)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Bc)配列番号7に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
第1工程では、E1ポリペプチドからなる酵素を、NADPH及び/又はNADHの存在下で、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。 第1工程に採用される反応は、前記E1ポリペプチドからなる酵素、ダイゼイン及びNADPH及び/又はNADHを含有する溶液中で、前記E1ポリペプチドからなる酵素、ダイゼイン等の原料及びジヒドロダイゼイン等の生成物が変質・不活性化されない温度条件及び時間インキュベートすることにより実施される。具体的には、上記A−6.セクションに記載の条件に従って実施することができる。
E1ポリペプチドからなる酵素が0.0001〜1.0重量%、好ましくは0.001〜0.1重量%、更に好ましくは0.001〜0.01重量%;
ダイゼインが0.0001〜10.0重量%、好ましくは0.001〜1.0重量%、更に好ましくは0.001〜0.1重量%;及び
NADPH/またはNADHが0.01〜5重量%、好ましくは0.05〜1重量%、更に好ましくは0.1〜0.5重量%。
第2工程では、E2ポリペプチドからなる酵素を、NADPH及び/又はNADHの存在下で、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。
E2ポリペプチドからなる酵素が0.0001〜1.0重量%、好ましくは0.001〜0.1重量%、更に好ましくは0.001〜0.01重量%;
ジヒドロダイゼインが0.0001〜10.0重量%、好ましくは0.001〜1.0重量%、更に好ましくは0.001〜0.1重量%;及び
NADPH及び/またはNADHが0.01〜5重量%、好ましくは0.05〜1重量%、更に好ましくは0.1〜0.5重量%。
本発明の第1製造方法では、前記A−1.に記載のE1ポリペプチドからなる酵素及び前記B−1.に記載のE2ポリペプチドからなる酵素が使用される。
本発明は、第1工程及び第2工程を含むテトラヒドロダイゼインの製造方法(第1製造方法)により製造された、テトラヒドロダイゼインを含有する生成物を提供する。
本発明は、以下の、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを生成する第2工程、及びテトラヒドロダイゼインからエクオールを生成する第3工程を含む、エクオールの製造方法(以下、該製造方法を「第2製造方法」と表記することもある)を提供する。
(Ba)配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Bb)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Bc)配列番号7に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。
(Ca)配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Cb)配列番号13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド;
(Cc)配列番号13に記載のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。
第2工程
本発明の第2製造方法に含有される第2工程は、前述の第1製造方法に含有される第2工程と同様に説明される。
E2ポリペプチドからなる酵素が0.0001〜1.0重量%、好ましくは0.001〜0.1重量%、更に好ましくは0.001〜0.01重量%;
ジヒドロダイゼインが0.0001〜10.0重量%、好ましくは0.001〜1.0重量%、更に好ましくは0.001〜0.1重量%;及び
NADPH及び/またはNADHが0.01〜5重量%、好ましくは0.05〜1重量%、更に好ましくは0.1〜0.5重量%。
第3工程では、E3ポリペプチドからなる酵素を、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。
E3ポリペプチドからなる酵素が0.0001〜1.0重量%、好ましくは0.001〜0.1重量%、更に好ましくは0.001〜0.01重量%;
テトラヒドロダイゼインが0.0001〜10.0重量%、好ましくは0.001〜1.0重量%、更に好ましくは0.001〜0.1重量%;及び
NADPH及び/又はNADHが0.01〜5重量%、好ましくは0.05〜1重量%、更に好ましくは0.1〜0.5重量%。
本発明の第2製造方法では、前記B−1.セクションに記載のE2ポリペプチドからなる酵素及び前記C−1.セクションに記載のE3ポリペプチドからなる酵素が使用される。
本発明は、第2工程及び第3工程を含むエクオールの製造方法(第2製造方法)により製造された、エクオールを含有する生成物を提供する。
本発明は、前記第1工程、第2工程及び第3工程を含む、エクオールの製造方法(以下、該製造方法を「第3製造方法」と表記することもある)を提供する。
本発明の第3製造方法に含有される第1工程では、E1ポリペプチドからなる酵素を、NADPH及び/又はNADHの存在下で、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。本発明の第3製造方法に含有される第1工程は、前述の第1工程と同様に説明される。
本発明の第3製造方法に含有される第2工程では、E2ポリペプチドからなる酵素を、NADPH及び/又はNADHの存在下で、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。第2工程は、前述の第2工程と同様に説明される。
本発明の第3製造方法に含有される第3工程では、E3ポリペプチドからなる酵素を、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。第3工程は、前述の第3工程と同様に説明される。
E3ポリペプチドからなる酵素が0.0001〜1.0重量%、好ましくは0.001〜0.1重量%、更に好ましくは0.001〜0.01重量%;
テトラヒドロダイゼインが0.0001〜10.0重量%、好ましくは0.001〜1.0重量%、更に好ましくは0.001〜0.1重量%;及び
NADPH及び/又はNADHが0.01〜5重量%、好ましくは0.05〜1重量%、更に好ましくは0.1〜0.5重量%。
本発明の第3製造方法では、前記E1ポリペプチドからなる酵素、E2ポリペプチドからなる酵素及びE3ポリペプチドからなる酵素が使用される。E1〜E3ポリペプチドは、前述と同様に説明される。
本発明は、第1工程〜第3工程を含むエクオールの製造方法(第3製造方法)により製造された、エクオールを含有する生成物を提供する。
本発明は、以下の、ダイゼインからジヒドロダイゼインを生成する第4工程、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを生成する第5工程、及びテトラヒドロダイゼインからエクオールを生成する第6工程のうち少なくとも2つの工程を含む、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールの製造方法(以下、該製造方法を「第4製造方法」と表記することもある)を提供する。
(Ad)配列番号4に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Ae)配列番号1に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Af)前記(Ad)又は(Ae)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(Bd)配列番号10に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Be)配列番号7に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(Cd)配列番号16に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Ce)配列番号13に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
第4工程では、前記A−2.セクションに記載のE1ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。
第4工程で使用される組換え細胞はE1ポリヌクレオチドを有し、E1ポリヌクレオチドを発現できる限り制限されない。具体的には、前記A−4.セクションに記載の組み換え細胞を使用することが出来る。
E1ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、細胞及び/又は培養物からE1ポリペプチドを回収することにより、E1ポリペプチドからなる酵素を製造することができる。具体的には、前記A−5.セクションに記載の条件に従って当該組換え細胞を培養することによってE1ポリペプチドを製造することが出来る。
第5工程では、前記B−2.セクションに記載のE2ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。
第5工程で使用される組換え細胞は前記B−2.セクションに記載のE2ポリヌクレオチドを有し、E2ポリヌクレオチドを発現できる限り制限されない。具体的には、前記B−4.セクションに記載の組み換え細胞を使用することが出来る。
E2ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、細胞及び/又は培養物からE2ポリペプチドを回収することにより、E2ポリペプチドからなる酵素を製造することができる。
第6工程では、前記C−2.セクションに記載のE3ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。
第6工程で使用される組換え細胞は前記C−2.セクションに記載のE3ポリヌクレオチドを有し、E3ポリヌクレオチドを発現できる限り制限されない。具体的には、前記C−4.セクションに記載の組換え細胞を使用することが出来る。
E3ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、細胞及び/又は培養物からE3ポリペプチドを回収することにより、E3ポリペプチドからなる酵素を製造することができる。
本発明の第4製造方法では、E1〜E3ポリヌクレオチドの少なくとも1種が使用される。これらのポリヌクレオチドは、各々前記A−2.、B−2.及びC−2.セクションに説明されるものである。
本発明は、第4製造方法により製造された、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールを含有する生成物を提供する。
本発明は、以下の第1反応槽〜第3反応槽の少なくとも1つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールの製造装置(以下、「第1製造装置」と表記することもある)を提供する。
(第1反応槽)(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチド(すなわち、E1ポリペプチド)からなる酵素が固定されている反応手段(以下、これを「反応手段1」と表記することもある)を有しており、該ポリペプチドを用いてダイゼインからジヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は該反応槽内のダイゼインと接触できるように配置されている;
(第2反応槽)(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチド(すなわち、E2ポリペプチド)からなる酵素が固定されている反応手段(以下、これを「反応手段2」と表記することもある)を有しており、該ポリペプチドを用いてジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は該反応槽内のジヒドロダイゼインと接触できるように配置されている;
(第3反応槽)(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチド(すなわち、E3ポリペプチド)からなる酵素が固定されている反応手段(以下、これを「反応手段3」と表記することもある)を有しており、該ポリペプチドを用いてテトラヒドロダイゼインからエクオールを製造するための反応槽、ここで該反応手段は該反応槽内のテトラヒドロダイゼインと接触できるように配置されている。
本発明の第1製造装置において使用される第1反応槽〜第3反応槽の形状、大きさ、素材等は、前記反応手段を有することができ、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールの製造が好適に実施される限り制限されない。
本発明の第1製造装置において使用される反応手段1〜3は、各々の反応手段が有する前記ポリペプチドからなる酵素が固定されており、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールの製造に好適に適用できる限り制限されない。
本発明の第1製造装置において使用される供給手段は、本発明の第1製造装置において使用され得る異なる反応槽を該供給手段を介して接続させることができ、本発明の第1製造装置においてジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールを製造できる限り制限されない。該供給手段は、従来公知の技術に従い適宜選択される。
本発明の第1製造装置において使用されるE1〜E3ポリペプチドは、前述と同様に説明される。
第1反応槽では、反応手段1に固定されたE1ポリペプチドからなる酵素を、NADPH及び/又はNADHの存在下で、ダイゼインに作用させることにより、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。E1ポリペプチドからなる酵素は、E1ポリペプチドからなる酵素の補酵素として作用するNADPH及び/又はNADHとともに、反応手段に固定されていても良い。第1反応槽における反応は、前述の「第1工程」に基づき実施される。
第2反応槽では、反応手段2に固定されたE2ポリペプチドからなる酵素を、NADPH及び/又はNADHの存在下で、ジヒドロダイゼインに作用させることにより、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。E2ポリペプチドからなる酵素は、E2ポリペプチドからなる酵素の補酵素として作用するNADPH及び/又はNADHとともに、反応手段に固定されていても良い。第2反応槽における反応は、前述の「第2工程」に基づき実施される。
第3反応槽では、反応手段3に固定されたE3ポリペプチドからなる酵素を、テトラヒドロダイゼインに作用させることにより、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。第3反応槽における反応は、前述の「第3工程」に基づき実施される。
本発明は、以下の第4反応槽〜第6反応槽の少なくとも1つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールの製造装置(以下、「第2製造装置」と表記することもある)を提供する。
(第4反応槽)(Ad)〜(Af)のいずれかであるポリヌクレオチド(すなわち、E1ポリヌクレオチド)を有する組換え細胞が固定されている反応手段(「以下、これを反応手段4と表記することもある」)を有しており、該反応手段を用いてダイゼインからジヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のダイゼインと接触できるように配置されている;
(第5反応槽)(Bd)〜(Bf)のいずれかであるポリヌクレオチド(すなわち、E2ポリヌクレオチド)を有する組換え細胞が固定されている反応手段(「以下、これを反応手段5と表記することもある」)を有しており、該反応手段を用いてジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のジヒドロダイゼインと接触できるように配置されている;
(第6反応槽)(Cd)〜(Cf)のいずれかであるポリヌクレオチド(すなわち、E3ポリヌクレオチド)を有する組換え細胞が固定されている反応手段(「以下、これを反応手段6と表記することもある」)を有しており、該反応手段を用いてテトラヒドロダイゼインからエクオールを製造するための反応槽、ここで該反応手段は反応槽内のテトラヒドロダイゼインと接触できるように配置されている。
本発明の第2製造装置において使用される第4反応槽〜第6反応槽の形状、大きさ、素材等は、前記反応手段を有することができ、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールの製造が好適に実施される限り制限されない。
本発明の第2製造装置において使用される反応手段4〜6は、各々の反応手段が有する前記組換え細胞が固定されており、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールの製造に好適に適用できる限り制限されない。
本発明の第2製造装置において使用される供給手段は、本発明の第2製造装置において使用され得る異なる反応槽を該供給手段を介して接続させることができ、本発明の第2製造装置においてジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールを製造できる限り制限されない。該供給手段は、従来公知の技術に従い適宜選択される。
本発明の第2製造装置において使用される組換え細胞は、前述の「第4工程で使用される組換え細胞」、「第5工程で使用される組換え細胞」及び「第6工程で使用される組換え細胞」等の記載と同様に説明される。
本発明の第2製造装置において使用されるE1〜E3ポリヌクレオチドは、前述と同様に説明される。
第4反応槽では、反応手段4に固定された、E1ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を用いて、ダイゼインをジヒドロダイゼインに変換する。第4反応槽における反応は、前述の「第4工程」等の記載に基づき実施される。
第5反応槽では、反応手段5に固定された、E2ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を用いて、ジヒドロダイゼインをテトラヒドロダイゼインに変換する。第5反応槽における反応は、前述の「第5工程」等の記載に基づき実施される。
第6反応槽では、反応手段6に固定された、E3ポリヌクレオチドを有する組換え細胞を用いて、テトラヒドロダイゼインをエクオールに変換する。第6反応槽における反応は、前述の「第6工程」等の記載に基づき実施される。
本発明は、前述の第1反応槽〜第3反応槽の少なくとも1つの反応槽、及び第4反応槽〜第6反応槽の少なくとも1つの反応槽を備える、ジヒドロダイゼイン、テトラヒドロダイゼイン及び/又はエクオールの製造装置(以下、「第3製造装置」と表記することもある)を提供する。
参考例A1
ラクトコッカス20-92株(FERM BP-10036号)を、ダイゼイン含有増殖用液体培地(ダイゼインを10μg/mLとなる量で変法GAMブイヨン培地(日水製薬株式会社)に添加したもの)に接種し、嫌気的条件下(BBL Gas Pack systemsを使用)、37℃で7から18時間適宜培養した。培養後、遠心分離により集菌して冷凍保存し、以下の実施例に使用した。
保存してある凍結菌体(67mL分、2本)を融解後8,000rpm、4℃、10分間遠心分離し、沈渣を以下の試験に供した。沈渣を、1 mM PMSF(和光純薬工業株式会社)及び2mM DTT(和光純薬工業株式会社)、5 mM Sodium hydrosulfite(和光純薬工業株式会社)を含有する0.1 M リン酸カリウム溶液2mLに懸濁させた。懸濁液をあらかじめ0.1 mm zirconia/silica beads(BioSpec Products, Inc.)を入れておいた2ml容スクリューキャップ付チューブ(株式会社アシスト製)2本に移し、FastPrep(登録商標) FP100A(Thermo ELECTRON CORPORATION)にて菌体を破砕し(6500rpm 10秒 氷冷を8回)、菌体破砕液を得た。得られた菌体破砕液を約10,000rpm、4℃にて10分間遠心して遠心上清を得、遠心上清を1 mM PMSF及び2mM DTT、5 mM Sodium hydrosulfiteを含有する0.1 M リン酸カリウム溶液で4.5mLに希釈し、これを酵素源とした。
酵素反応液組成
培養ボトル当たり67 mlの変法GAMブイヨン培地(日水製薬株式会社)にて18時間培養したラクトコッカス20-92株菌体9本を遠心後、2 mM DTT(1, 4-Dithiothreitol、Merck)、5 mM Sodium hydrosulfite(和光純薬工業株式会社)及びプロテアーゼインヒビター(コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルEDTA-free、Roche Diagnostics)を含有する0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7に縣濁させた。懸濁液を0.1 mm zirconia/silica beads(BioSpec Products, Inc.)を入れた2ml容スクリューキャップ付チューブ(株式会社アシスト製)3本に移し、FastPrep(登録商標) FP100A(Thermo ELECTRON CORPORATION)にて菌体を破砕し(6500rpm、20秒を4回)、破砕液を遠心して上清を得た。また、培養ボトル当たり200mlの同液体培地にて18時間培養したラクトコッカス20-92株菌体8本を同様に菌体破砕後遠心し8本分の上清を得た。
カラム: TSKgel Ether-5PW
流速: サンプルアプライ時0.05〜0.1 ml/分、溶出時 0.1 ml/分
溶離液A: 0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7/2mM DTT/2.5 mM Sodium hydrosulfite/1% 2-プロパノール
溶離液B: 1M 硫安を含む溶離液A
カラム: Mono Q PC 1.6/5
溶離液C: 0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7.5/3 mM DTT/2.5 mM Sodium hydrosulfite/1% 2-プロパノール
溶離液D: 1M NaClを含む溶離液C
酵素活性は0.4〜0.46 M NaCl画分(フラクション No. 28〜30)に認められた。
70μlのMono Q HPLCで得たジヒドロダイゼイン合成活性のあるフラクション、No. 29に、30μlの0.1 %トリフルオロ酢酸(TFA)を加えて100μlとした。
Met Lys Asn Lys Phe Tyr Pro Lys Thr Phe Glu Arg Gly Tyr Ile Gly Asn Leu Glu Val Glu Asn (配列番号19)
ジヒドロダイゼイン合成活性を示す酵素タンパク質を消化酵素で断片化しペプチドとした。ペプチドのN末端アミノ酸配列分析を行って、内部アミノ酸配列情報を得た。
培養ボトル当たり200 mlの変法GAMブイヨン培地(日水製薬株式会社)にて18時間培養したラクトコッカス20‐92株菌体3本を遠心後、2 mM DTT(1, 4-Dithiothreitol、Merck)、5 mM Sodium hydrosulfite(和光純薬工業株式会社)及びプロテアーゼインヒビター(コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテルEDTA-free、Roche Diagnostics)を含有する0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7に縣濁させた。懸濁液を0.1 mm zirconia/silica beads(BioSpec Products, Inc.)を入れた2ml容スクリューキャップ付チューブ(アシスト)3本に移し、FastPrep(登録商標) FP100A(Thermo ELECTRON CORPORATION)にて菌体を破砕し(6500rpm、20秒を4回)、破砕液を遠心して上清を得た。
切り出したゲル片は細断し、50 %アセトニトリル水溶液を用いて脱色した後アセトニトリルで脱水し、遠心濃縮機(SpeedVac A160、Savant)にて乾燥させた。55 mM のDTTを含む100 mM炭酸水素アンモニウム水溶液を加え、56 ℃で1時間還元した。DTT溶液を除き、100 mMのヨードアセトアミドを含む100 mM炭酸水素アンモニウム水溶液を加え、遮光下、室温で30 分間ゆるく振とうしてカルボキサミドメチル化処理を行った。反応試薬を除去後、50 %アセトニトリル水溶液、アセトニトリル、100 mM炭酸水素アンモニウム水溶液、及びアセトニトリルの順に洗浄し、ゲルを遠心濃縮機にて乾燥した。2 μgのAchromobacter protease I(和光純薬工業株式会社)を含む0.02 % Tween 20入り20 mMトリス塩酸緩衝液 pH 9を加え、37℃で7 時間消化した。遠心上清を別チューブに移し、ゲルに60 % アセトニトリル- 0.1 % TFA水溶液を加えて30 ℃で20 分間加温後、10 分間ボルテックスする操作を3回行って断片化したペプチドを抽出した。集めた上清液はUltrafree-MC(0.22μm、Amicon)を用いてろ過した後、遠心濃縮した。
逆相HPLCを行い、酵素消化後のペプチドを分離した。
カラム: μRPC C2/C18 SC2.1/10(GEヘルスケアバイオサイエンス)
流速: 0.1 ml/分
溶離液E: 0.05 % TFA
溶離液F: 90 % アセトニトリル/0.04 % TFA
溶出プログラム: 0 分 5 %F
3 分 5 %F
43 分 65 %F
48 分 100 %F
68 分 100 %F
フラクション: 30μl
検出: 215 nm
なお、例えば上記「0 分 5 %B」は、溶出0時間時には溶離液Eが95%、溶離液Fが5%含有された溶離液を使用したことを示す。
コントロールのクロマトグラムとの比較により、ジヒドロダイゼイン合成活性を示す酵素タンパク質由来のペプチドピークを選び、プロテインシーケンサ(アプライドバイオシステムズ、Procise 492HT)にてN末端アミノ酸配列分析を行った。逆相HPLCで分離開始後、20.6分から溶出し始めたピークのアミノ酸配列(以下、Peptide1とする)は次の通りであった。
PheAspGluProValTyrProGlnAlaGlu(配列番号20)
22.1分から溶出し始めたピークのアミノ酸配列(以下、Peptide2とする)は次の通りであった。
AlaSerArgMetValMetAspAlaValHisGluGlyTyrIleAlaGly(配列番号21)
26.6分から溶出し始めたピークは、非特異的に切断されたペプチドであったが、次に示すように当該酵素タンパク質のN末端から13残基目のグリシンをN末とするペプチドであった(以下のアミノ酸配列を、Peptide3とする)。
GlyTyrIleGlyAsnLeuGluValGluAsnArgAlaIleArgMetProMet(配列番号22)
図4に、実施例A4においてペプチドマッピングを行った結果及び各ピークに対応するペプチドのアミノ酸配列を示す。
ピーク1(20.6 分)
ピーク2(22.1分)
ピーク3(26.6分)
上記実施例A3及びA4で得られたN末端及び部分アミノ酸配列を基にDegenerative-プライマーを設計、作製し、ラクトコッカス20-92株のゲノムDNAを鋳型にDegenerative-PCRを行うことによりジヒドロダイゼイン合成酵素をコードする遺伝子の増幅を試みた。
変法GAMブイヨン培地(日水製薬株式会社) 40mLで嫌気培養したラクトコッカス20-92株を5000rpm、4℃、10分間で遠心し、培地をデカンテーションで除去し、菌体を集めた。集めた菌体は直ちにQIAGEN Genomic DNA Buffer Set(キアゲン)のB1溶液11mL (200μg/mL RNaseを含有)に懸濁し、更に300μLのLysozyme溶液(100mg/mL)、500μLのQIAGEN Proteinase K solution(キアゲン)を加えて、37℃、16時間インキュベーションした。次いで、B2溶液4mL加え、数回転倒混和した後、50℃、3時間インキュベーションした。
Degenerative-プライマーの設計では縮退数を小さくするため、5’側の配列はラクトコッカス ガルビエのコドンユーセイジ情報(Codon Usage Database http://www.kazusa.or.jp/codon/)に基づき、各アミノ酸において最も出現頻度が高いコドンを採用した。3’側は混合塩基を利用することにより、ジヒドロダイゼイン合成酵遺伝子とのミスマッチが起こらないように工夫した。
E1-N-terminal-31:TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGA(配列番号23)
(ただし、配列番号23において、位置11及び14の「N」はイノシンを示し、位置20及び26の「N」はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを示す。)
E1-N-terminal-37:TGAAGAATAANTTNTAYCCNAARACNTTYGARRGNGG(配列番号24)
(ただし、配列番号24において、位置11、14、20及び26の「N」はイノシンを示し、位置35の「N」はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを示す。)
E1-N-terminal-F32:ATGAAGAATAAGTTTTAYCCNAARACNTTYGA(配列番号25)
(ただし、配列番号25において、位置21及び27の「N」はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを示す。)
E1-internal-RP1:CCTGCAATATAACCTTCATGTACNGCRTCCATNACCAT(配列番号26)
(ただし、配列番号26において、位置24及び33の「N」はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを示す。)
上記のDegenerative-プライマーを用いてDegenerative-PCRによるジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の増幅を試みた。
Degenerative-PCRに用いたDegenerative-プライマーの組み合わせを以下に示す。
[1]E1-N-terminal-31とE1-internal-RP1
[2]E1-N-terminal-37とE1-internal-RP1
[3]E1-N-terminal-F32とE1-internal-RP1
Degenerative-PCRによるジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の増幅はEx-Taq DNA polymerase(タカラバイオ株式会社)を使用し、増幅プログラム:
95℃ 2min、(95℃ 45sec、38℃−54℃ 30sec、72℃ 2min)×50cycles、72℃ 3minで行った。Degenerative-プライマーのゲノムDNAへのミスマッチを考慮し、アニーリングの温度は38℃から4℃刻みに54℃までの5段階で行った。PCR反応終了後、PCR産物に1/10量の10×Dyeを加え、6μLを0.8%のアガロースゲルで電気泳動した。本実施例におけるアガロース電気泳動ではエチジウムブロミドによる染色で行い、分子量マーカーにはλ/StyI(株式会社ニッポンジーン)、100bp ladder(東洋紡績株式会社)を使用した。
増幅した約1.9kbのDNA断片(アニーリング温度54℃)をアガロースゲルから切り出し、Gel-Extraction kit(キアゲン)を用いて精製した。精製したDNA断片はpT7-Blue Cloning Vector(Novagen)に挿入し、塩基配列を決定した。
実施例A5で得られた1.9kbのジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の5’端及び3’端の配列を決定し、全塩基配列の決定をおこなうため、ラクトコカッス20-92株のゲノムDNAライブラリーを鋳型にcDNA末端配列の急速増幅(5’−、3’−RACE(rapid amplification of cDNA ends))を行った。
実施例A5で精製したラクトコカッス20-92株のゲノムDNAを制限酵素(BamHI,EcoRI,HindIII,KpnI,PstI,SacI,SalI,Sau3AI,XhoI)(いずれもタカラバイオ株式会社)により37℃、16時間消化することで断片化し、フェノール・クロロホルム処理後、エタノール沈殿にて精製した。精製したゲノムDNA断片はあらかじめ相当する制限酵素で切断処理し、Shrimp Alkaline Phosphatase(タカラバイオ株式会社)処理により脱リン酸化しておいたpUC19クローニング ベクターへTaKaRa Ligation kit var.2.1(タカラバイオ株式会社)を用いてライゲーションし、ゲノムDNAライブラリーを作製した。
ゲノムDNAライブラリー(ライゲーション反応液)を滅菌水で20倍希釈し、1μLを鋳型に使用して、cDNA末端配列の急速増幅(5’−RACE、3’−RACE)によるジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の5’端及び3’端の配列の増幅を試みた。
5’−RACE、3’−RACEにそれぞれ用いたプライマーの組み合わせを以下に示す。
First-PCR:E1-RACE-N-P1とpUC19-FP-1、E1-RACE-N-P1とpUC19-RP-1
Nested-PCR:E1-RACE-N-P2とpUC19-FP-2、E1-RACE-N-P2とpUC19-RP-2
First-PCR:E1-RACE-RP2-1とpUC19-FP-1、E1-RACE-RP2-1とpUC19-RP-1
Nested-PCR:E1-RACE-RP2-2とpUC19-FP-2、E1-RACE-RP2-2とpUC19-RP-2
5’−RACE、3’−RACEにそれぞれ用いたプライマーの配列を以下に示す。
ベクター側プライマー:
pUC19-FP-1: ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG(配列番号27)
pUC19-RP-1: AGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGC(配列番号28)
pUC19-FP-2: ATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGG(配列番号29)
pUC19-RP-2: CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG(配列番号30)
ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子側プライマー
E1-RACE-N-P1: ATGCGGATCGCTCGGTTCTCGACCTCTAGGTTAC(配列番号31)
E1-RACE-RP2-1: ATCGAGGAGAAGTGCGAGGACGTCAGGGTCATC(配列番号32)
E1-RACE-N-P2: TTCTCGACCTCTAGGTTACCGATGTAGCCGC(配列番号33)
E1-RACE-RP2-2: ACGTCAGGGTCATCGGCATCGGCGACTGCAAG(配列番号34)
5’−RACE、3’−RACEにはEx-Taq DNA polymerase(タカラバイオ株式会社)を使用し、First-PCR及びNested-PCRを同増幅プログラム:
95℃ 2min、(95℃ 45sec、60℃ 30sec、72℃ 1min)×30cycles、72℃ 3minで行った。First-PCRでは鋳型に調製方法を上記記載したゲノムDNA希釈液1μL(40ng)を使用し、Nested-PCRには0.5μLのFirst-PCR産物を使用した。
実施例A5で示したDegenerative-PCR及び本実施例内(2)に示したcDNA末端配列の急速増幅により得られたDNA塩基配列をDNAシークエンス-アセンブルソフトウェアSEQUENCHER(Gene Codes Inc、USA)を使用してアセンブル解析を行った。その結果、3548bpのジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子周辺のゲノム構造を決定し、ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子は1935ヌクレオチド、644アミノ酸からなるポリペプチドであることが判明した。
本実施例内(3)で得られた配列にはPCRでの増幅の際、DNAポリメラーゼの塩基取り込みエラーによるクローン間で塩基の異なる箇所が多数見られた。そのため、First strand cDNAを鋳型にして、High-FidelityDNA−PolymeraseであるEasy-A(R) High-Fidelity PCR Cloning Enzyme (Stratagene)を使用したPCRにより、ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子のコーディング領域を含んだ領域(2368bp)を増幅させた。
使用した増幅プライマーを以下に示す。
E1-conf-NP:TGCCGGTGCAATGGCTGACATCATGTTCAACCTG(配列番号35)
E1-conf-CP:TCCTCCATCGTTCCTCCAATCAGTAAGACACGCG(配列番号36)
得られたDNA断片はGel-Extraction kit(キアゲン)を用いて精製し、ダイレクトシークエンスにより、配列の確認、最終決定を行った。
実施例A1で示したようにラクトコッカス20-92株の増殖用培養液に基質であるダイゼインを添加した場合、培養された菌体はジヒドロダイゼイン合成活性を有する。このことから増殖培養液中へのダイゼインの添加により、ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の転写が誘導され、更にタンパク質へと翻訳されることが推測されるため、ダイゼインを添加した培地及び添加していない培地でそれぞれ培養したラクトコッカス20−92株菌体由来のcDNAを作製し、RT-PCRを行うことで増殖培養液中へのダイゼインの添加によりジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子の発現が誘導されるか否かについて検討した。
ラクトコッカス20−92株からの全RNAの抽出、精製は以下の方法で行った。
DNaseI処理を施した全RNA 2μgからSuperScript(登録商標)First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)を用いてfirst-strand cDNA(逆転写物)を合成した。DNA合成のための伸長プライマーには付属のランダムヘキサマーミックスを用いてマニュアルに従いfirst-strand cDNAの合成を行った。また、first-strand cDNAの合成に用いたDNase I処理済みの全RNAへのゲノムDNAの混入が無いことを確認するため、逆転写を行わない反応も併せて行った。RT−PCRの鋳型には最終反応液を使用した。
1.ダイゼイン添加培地で培養した菌体由来全RNAの逆転写物(DZN(+)RT(+))
2.ダイゼイン無添加培地で培養した菌体由来全RNAの逆転写物(DZN(‐)RT(+))
3.ダイゼイン添加培地で培養した菌体由来全RNAの無逆転写物(DZN(+)RT(‐))
4.ダイゼイン無添加培地で培養した菌体由来全RNA無逆転写物(DZN(‐)RT(‐))
本実施例内(2)で示した4種類の最終反応物を鋳型にしてRT-PCRを行うことにより、ジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子を増幅し、発現量を比較した。コントロール遺伝子として16S−リボゾームRNA配列を採用し、併せてRT-PCRを行った。
RT-PCRにはEx-Taq DNA polymerase(タカラバイオ株式会社)を使用し、増幅プログラム:
95℃ 2min、(95℃ 30sec、56℃ 20sec、72℃ 30sec)×30cycles、72℃ 2minで行った。鋳型には本実施例内(2)の最終反応液1μLを使用した。
ジヒドロダイゼイン合成酵素:239bp
E1-FP:CTACATCGGTAACCTAGAGGTCG(配列番号37)
E1-RP:CCGTGCTGCTTGATGGTCTTTGC(配列番号38)
16S−リボゾームRNA配列:326bp
Gar-16S-Ribo-FP:TGCGTAGATATATGGAGGAAC(配列番号39)
Gar-16S-Ribo-RP:CTTATCTCTAAGGATAGCACG(配列番号40)
大腸菌を用いた組換えタンパク質発現システムであるpETシステムを用いてE1ポリペプチドを発現させ、そのジヒドロダイゼイン合成活性を確認した。
E1ポリペプチド発現ベクター(pET21-E1-His)を作製する目的でPCRにより、E1ヌクレオチドのオープン・リーディング・フレーム領域のDNAを増幅した。
exp.E1 pet F Nde:AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA (配列番号:41)
exp. E1 pet His:AATCGAATTCCTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT (配列番号:42)
上記増幅プライマー:exp.E1 pet F Nde、exp.E1 pet HisにはpET21a(Novagen)へ挿入するため、それぞれ制限酵素NdeI切断部位、EcoRI切断部位配列を含ませてある。
組換えE1ポリペプチドを発現するプラスミドpET21-E1-His とpET21a(ネガティブコントロール)を用いて、大腸菌BL21(DE3)株(Novagen)を形質転換した。形質転換体はアンピシリン(50μg/mL)を含むLB培地アガープレート上で37℃、終夜生育させ、シングルコロニーを得た。
本実施例内(2)で得た菌体破砕液を酵素源として、ダイゼインからジヒドロダイゼインへの変換活性を測定し、発現させた組換えE1ポリペプチドにその活性を確認した。
酵素反応液組成
インキュベート後、得られた酵素反応液に3mLの酢酸エチルを添加して抽出処理を行い、乾固した後、移動層(溶離液)で溶解した。溶解物をHPLC分析することにより、酵素反応液中のダイゼイン及びジヒドロダイゼインの含量を測定した。
参考例B1 シス−テトラヒドロダイゼイン及びトランス−テトラヒドロダイゼインの合成
シス−テトラヒドロダイゼイン及びトランス−テトラヒドロダイゼインを、以下のフローに従って製造した。なお、以下、化合物の表記に関して、下記の略記を使用する。
化合物1(ダイゼイン): 4’,7−ジヒドロキシイソフラボン
化合物2: 4’,7−ジアセトキシイソフラボン
化合物3: 4’,7−ジアセトキシイソフラバン−4−オン
化合物4: シス−4’,7−ジアセトキシイソフラバン−4−オール
化合物5: トランス−4’,7−ジアセトキシイソフラバン−4−オール
化合物6: シス−テトラヒドロダイゼイン
化合物7: トランス−テトラヒドロダイゼイン
ダイゼイン(化合物1) 500 mg(1.97 mmol)のピリジン(5 mL)溶液に無水酢酸0.76 mL(8.0 mmol)を加え、60℃で2時間撹拌した。反応液に少量のメタノールを加えた後に、3N塩酸中に注いだ。水で希釈した後に析出した固体を濾取し、これを水洗した。得られた固体を室温にて風乾して白色粉末状の化合物2 609 mg(1.80 mmol、91%収率)を得た。
化合物2:1H NMR(250 MHz, CDCl3)δ(ppm): 2.33 (3H, s), 2.37 (3H, s), 7.13-7.22 (3H, m), 7.32 (1H, d, J = 2.3 Hz), 7.54-7.63 (2H, m), 8.01 (1H, s), 8.33 (1H, d, J = 8.8 Hz).
化合物2 400 mg(1.18 mmol)及び10%パラジウム−炭素(含水品、約50 wt%)150 mgのメタノール(6 mL)−酢酸エチル(6 mL)懸濁液を水素雰囲気下、室温で2時間撹拌した。反応液をセライト濾過し、残渣を酢酸エチルで洗浄した。濾液を濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル:ジクロロメタン/酢酸エチル= 100/0 − 19/1)で精製して、白色粉末状の化合物3 312 mg(0.917 mmol、78%収率)を得た。
化合物3:1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ(ppm): 2.29 (3H, s), 2.32 (3H, s), 3.93-4.04 (1H, m), 4.60-4.75 (2H, m), 6.76-6.84 (2H, m), 7.04-7.13 (2H, m), 7.27-7.35 (2H, m), 7.93-8.01 (1H, m).
化合物3 100 mg(0.294 mmol)のメタノール(1 mL)−ジクロロメタン(1 mL)溶液に0℃で水素化ホウ素ナトリウム11 mg(0.29 mmol)を加え、0℃で30分撹拌した。反応液に1N塩酸2 mL、水50 mLを順に加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和重曹水、飽和食塩水の順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル:ジクロロメタン/酢酸エチル= 19/1−3/1)で精製した。得られたジアスレレオマー混合物を中圧カラムクロマトグラフィー(山善製ウルトラパックSI-40B:n-へキサン/酢酸エチル = 3/2)で精製して、無色針状の化合物4 44 mg(0.13 mmol、44%収率)及び無色針状の化合物5 26 mg(75 mmol、26%収率)を得た。化合物4:1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ(ppm): 1.80 (1H, d, J = 4.0 Hz), 2.30 (3H, s), 2.31 (3H, s), 3.32 (1H, td, J = 3.5, 11.5 Hz), 4.32 (1H, ddd, J = 1.3, 3.5, 10.5 Hz), 4.59 (1H, dd, J= 10.5, 11.5 Hz), 4.76-4.83 (1H, m), 6.64-6.73 (2H, m), 7.06-7.14 (2H, m), 7.27-7.35 (3H, m).
化合物5:1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ(ppm): 2.02 (1H, d, J = 5.5 Hz), 2.29 (3H, s), 2.30 (3H, s), 3.11-3.24 (1H, m), 4.26 (1H, dd, J = 9.0, 11.3 Hz), 4.37 (1H, dd, J = 3.8, 11.3 Hz), 4.92 (1H, dd, J = 5.5, 7.8 Hz), 6.62 (1H, d, J = 2.3 Hz), 6.72 (1H, dd, J= 2.3, 8.5 Hz), 7.04-7.12 (2H, m), 7.21-7.30 (2H, m), 7.47 (1H, d, J = 8.5 Hz).
化合物4 116 mg(0.339 mmol)のメタノール(4 mL)溶液にナトリウムメトキシド55 mg(1.0 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応液にイオン交換樹脂(ダウエックス50×8W、アンモニウムフォーム)を加えて中和した後に、樹脂を濾去した。濾液を濃縮して得られた固体をメタノールで洗浄して、白色粉末状の化合物6 62 mg(0.24 mmol、71%収率)を得た。
化合物6:1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 3.03 (1H, td, J = 3.3, 12.0 Hz), 4.00-4.15 (1H, m), 4.31-4.51 (2H, m, including 4.39, dd, J = 10.3, 12.0 Hz), 4.96 (1H, d, J = 5.8 Hz), 6.18 (1H, d, J = 2.3 Hz), 6.32 (1H, dd, J = 2.3, 8.3 Hz), 6.69 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.09 (2H, d, J= 8.5 Hz), 9.19 (1H, br s), 9.31 (1H, br s).
化合物5 84 mg(0.25 mmol)のメタノール(2 mL)懸濁液に1N水酸化ナトリウム0.73 mL(0.73 mmol)を加え、室温で2.5時間撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和重曹水、飽和食塩水の順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去して白色粉末状の化合物7 64 mg(0.25 mmol、定量的収率)を得た。
化合物7:1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 2.82-2.96 (1H, m), 4.04-4.22 (2H, m), 4.60 (1H, t, J = 7.0 Hz), 5.18 (1H, d, J = 7.0 Hz), 6.14 (1H, d, J = 2.3 Hz), 6.34 (1H, dd, J= 2.3, 8.5 Hz), 6.67 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.04 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.16 (1H, d, J = 8.5 Hz), 9.21 (1H, s), 9.28 (1H, s).
ラクトコッカス20−92株(FERM BP-10036号)を、ダイゼイン含有増殖用液体培地に接種し、嫌気的条件下、37℃で7から24時間培養した。培養後、遠心分離により集菌して冷凍保存し、以下の実施例に使用した。
以下の試験を行い、テトラヒドロダイゼインがエクオール生合成の中間代謝物であることを確認した。
-80℃で保存したラクトコッカス20‐92株菌体をすばやく融解、タッピングで懸濁し、8000rpm×5min,4℃で遠心分離VC‐960(タイテック株式会社(製))した。上清を取り除いた後に、0.1Mリン酸カリウム緩衝液/1mM PMSF(PhenylMethaneSulfonyl Fluoride)/2mM DTT(dithiothreitol)/5mM Sodium hydrosulfite(pH7.0)を加え、菌懸濁液を得た。次いで、予め、ジルコニア‐シリカビーズ[0.1mm 1lb(和研薬株式会社(製))を約0.8mL容入れておいた2 mlチューブに菌懸濁液を入れ、更に0.1Mリン酸カリウム緩衝液/1mM PMSF/2mM DTT/5mM Sodium hydrosulfite(pH7.0)を加え、チューブをほぼ一杯にした。次いで、チューブの蓋をして、氷冷しながらFastPrepTM‐FP100A(Thermo ELECTRON CORPORATION(製))を用いて6500rpm×20秒-氷冷の操作を合計4回繰り返して、破砕処理を行った。斯くして得られた菌破砕物を酵素源として酵素反応を行った。
上記(1)の菌破砕物を0.1ml含む下記組成の酵素反応液1mLを調製し、37℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、得られた酵素反応生成物に3mLの酢酸エチルを添加して抽出処理を行った後、乾固して、HPLC分析に供した。
0.1Mリン酸カリウム緩衝液/1mM PMSF/2mM DTT/5mM Sodium hydrosulfite(pH7.0)
2 mM NADPH
2 mM NADH
10μg/mL ジヒドロダイゼイン又はテトラヒドロダイゼイン
基質にジヒドロダイゼインを用いて、菌破砕物を酵素源にして得られた酵素反応生成物のHPLC分析の結果を図9に示す。また、上記参考例1で合成したテトラヒドロダイゼインのHPLC分析を図9に併せて示す。この結果から、基質にジヒドロダイゼインを用いて、菌破砕物を酵素源にして得られた酵素反応生成物には、トランス−テトラヒドロダイゼインの保持時間に一致する保持時間を有する中間体の存在が認められ、トランス−テトラヒドロダイゼインが生成していることが明らかとなった。
基質にシス−テトラヒドロダイゼイン又はトランス−テトラヒドロダイゼインを用いて、菌破砕物を酵素源にして得られた酵素反応生成物のHPLC分析の結果を図10に示す。図10から明らかなように、いずれの化合物からもエクオールが生成され、テトラヒドロダイゼインはシス型及びトランス型を問わず、エクオール生合成過程において基質として利用されることが判明した。
保存してある凍結菌体を融解後5000×G、4℃、15分間遠心分離し、沈渣を以下の試験に供した。沈渣(湿重量2.7 g)を、1 mM PMSF及び5 mM Sodium hydrosulfiteを含有する0.1 M リン酸一カリウム溶液10 mlに縣濁させ、37℃で5分間予温した後、Lysozymeを湿重量1g当たり100 mg/ wet weightとなるよう加え、37℃にて1.5時間反応させた。次いで、得られた反応液に、等量の0.1Mリン酸二カリウム溶液を加えた後、更にジルコニア‐シリカビーズ3 ml量を加えVortex Mixerにて激しく攪拌し、更に超音波処理機 (Branson Sonifier Cell Disruptor 200)にて菌体破砕した(5min処理2min休憩のサイクルを3回)。得られた菌体破砕液を約10,000 ×Gにて15 分間遠心して遠心上清を得、これを酵素源とした。
培養ボトル当たり67 mlのダイゼイン含有増殖用液体培地にて20時間培養したラクトコッカス20‐92株菌体10本分を遠心後1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)及び4 mM DTT(Dithiothreitol)を含有する0.02 M リン酸カリウム緩衝液pH 7 (以下、「Buffer A」と表記する)に縣濁させ、フレンチプレス(SLM INSTRUMENTS INC)にて菌体を破砕し(1800 psiにて6回)、破砕液を遠心して上清液を得た。また、培養ボトル当たり200mlの液体培地にて18時間培養したラクトコッカス20‐92株菌体5本分を同様にフレンチプレスに供して菌体破砕後遠心し上清を得た。前者及び後者の遠心上清を、それぞれ38 ml及び47mlを混合し、その混合液の82 mlを、予めBuffer Aにて平衡化しておいたRed-Sepharose(約7 ml)に供した。次いで、150 mlのBuffer AにてRed-Sepharoseを洗浄した後、10 mMのNADPHを含むBuffer Aにて溶出した(20 ml/フラクション)。各フラクションを酵素源として用いて、実施例B2に示す酵素反応条件(補酵素としてNADPHを使用)と同条件でテトラヒドロダイゼイン生合成活性について測定し、活性画分としてフラクションNo.1〜5を得た。
流速: 1 ml / min
フラクション: 2 ml/2 min/フラクション
溶離液 A: 0.02 M リン酸カリウム緩衝液pH 7/1mM DTT / 2.5 mM Sodiumhydrosulfite/0.5% isoPrOH
溶離液 B: 1M 硫安を含む溶離液A
溶出プログラム: 時間(min) (溶離液B)/(溶離液A+溶離液B)
0 1
5 1
25 0
45 0
流速: 0.6 ml/min
フラクション: 1.2 ml/2 min/フラクション
溶離液: 0.05 Mリン酸カリウム緩衝液pH 7/1mM DTT/2.5 mM Sodium hydrosulfite/1% isoPrOH/0.3M NaCl
上記実施例3で得られたテトラヒドロダイゼイン合成活性を有するフラクション(フラクションNo.7)をサンプルとしてMS分析を行った。具体的には、サンプルをSDS-PAGEにて分離し、バンドを切り出した。切り出したバンドをゲル内還元アルキル化し、トリプシンでゲル内消化した。次いで、トリプシン消化ペプチドを回収・精製し、LC-MSにて分析した。LC-MS分析により取得されたデータについてMS分析支援ソフトウェアであるPEAKSTM(インフォコム株式会社)を用いたde novo シーケンシングを行うことにより、ペプチドのアミノ酸配列を計算・推定した。詳細な方法等については、以下の通りである。
本試験では、SuperSep HG 10/20% (和光純薬工業株式会社)、Flamingo gel staining kit (Bio-Rad)、TCEP(Tris[2-carboxyethyl]phosphine)(Pierce)、分子量マーカー(株式会社アプロサイエンス)、DTT(Calbiochem)、ヨードアセトアミド(和光純薬工業株式会社)、アセトニトリル(関東化学株式会社)、トリプシン(Promega)、TFA(Pierce)、Ammonium Bicarbonate(Sigma)、アンモニア水(メルク株式会社)、ギ酸(関東化学株式会社)、Empore Cation-SR Disk(住友スリーエム株式会社)、MonoCap濃縮カラム(GLサイエンス株式会社)、MonoCap for Nano Flow 0.1X150mm(GLサイエンス株式会社)、FortisTip(エーエムアール株式会社)、SpeedVac Concentrator(SAVANT)、HTS-PALオートサンプラー(CTC-Analytics)、Chorus220(CTC-Analytics)、QSTAR Pulsar i(アプライドバイオシステムズ)、PEAKSTMソフトウェア(インフォコム株式会社)を使用した。
上記実施例B3で得られた、テトラヒドロダイゼイン合成活性を有するフラクション(フラクションNo.7)20μl に100mM TCEPを1μl加え、70℃にて10分還元処理を行った。サンプルをSuperSep HGに全量アプライし、定法に従いSDS-PAGEを行った。泳動後にFlamingo Gel staining kit(Bio-Rad)にて染色した(図14参照)。染色後に確認されたバンドLG1及びLG2をそれぞれ切り出し1mm角程度に裁断した。切り出したゲルを100mM Ammonium Bicarbonate溶液にて洗浄後、アセトニトリルで脱水し、SpeedVac Concentratorにて乾燥固化した。
乾燥したゲル片にDTT溶液(1.54mg/ml in 100mM Ammonium Bicarbonate)を加え55℃にて45分間インキュベートし、還元処理を実施した。DTT溶液を捨て、ヨードアセトアミド溶液(10.1mg/ml in 100mM Ammonium Bicarbonate)を加えて室温遮光条件下で30分間インキュベーションした。溶液を捨て、ゲル片を50%アセトニトリル溶液、100%アセトニトリル溶液、100mM Ammonium Bicarbonate溶液、100%アセトニトリル溶液で順次洗浄し、SpeedVac Concentratorにて乾燥固化した。乾燥したゲル片にトリプシン溶液(12.5μg/ml in 50mM Ammonium Bicarbonate)を少量加え、氷上にて45分間浸透させた。浸透後に余分なトリプシン溶液を取り除き、ゲル片が浸る程度の50mM Ammonium Bicarbonate溶液を加え37℃にて16時間反応させた。
トリプシン消化ペプチドを回収し、Empore Cation-SR Diskをピペットチップに詰めた簡易カラムで前処理精製した。トリプシン消化ペプチドの回収は、0.1%TFA/90%アセトニトリル溶液にて洗浄回収した。簡易カラムの操作は、平衡化0.1%TFA/2%アセトニトリル溶液、サンプル吸着、カラム洗浄0.1%TFA/90%アセトニトリル溶液、サンプル溶出5%アンモニア/30%アセトニトリル溶液の順に行い、溶出させた消化ペプチドをSpeedVac Concentratorにて乾燥濃縮した。消化ペプチド溶液にTFAを加えpH3付近になるよう調整し、オートサンプラーHTS-PALにセットした。HTS-PALにセットしたサンプルを、LC-MS用インジェクターバルブにあるサンプル濃縮カラムにロードし、オンカラム洗浄を行った。濃縮カラムのサンプルを、nanoHPLC-Chorus220により分析カラムにて分離し、分析カラムにセットしたFortisTipにおいてイオン化し、QSTAR Pulsar iにて分析した。LC-MS分析条件は、次の通りである。
(1)Inverse-PCR用ゲノムDNAライブラリーの作製
実施例A5で精製したラクトコッカス20−92株(FERM BP-10036号)のゲノムDNAを以下に示す制限酵素(BamHI,EcoRI,HindIII,KpnI,PstI,SacI,SalI,Sau3AI,XhoI)(いずれもタカラバイオ株式会社)により37℃、16時間消化することで断片化し、フェノール・クロロホルム処理後、エタノール沈殿にて精製した。精製したゲノムDNA断片はTaKaRa Ligation kit var.2.1(タカラバイオ株式会社)を用いてセルフ−ライゲーションした。各ライゲーション溶液を滅菌水で10倍希釈することにより、Inverse-PCR用ゲノムDNAライブラリーを作製した。
上記(1)に記載したInverse-PCR用ゲノムDNAライブラリー1μL(40ng相当)を鋳型に使用して、Inverse-PCRにより、E1ポリヌクレオチド周辺上流及び下流域のゲノムDNAの増幅を試みた。上流側領域増加のInverse-PCRにはPstI、XhoIで処理したものを、下流側領域増加のInverse-PCRにはHindIII,PstI,SacI,XhoIで処理したものをそれぞれ鋳型DNAとして使用した。Inverse-PCRにはTaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社)を使用した。First-PCRは1×PCR Buffer(Mg2+ free)、プライマー各0.5nM、dNTP 各0.5mM、MgCl2 2.5mM、TaKaRa LA Taq 0.2U を含む20μLの反応液を用いて、ゲノムDNAライブラリー希釈液1μL(40ng)を鋳型に使用し、以下の増幅プログラム: 98℃ 1min、(95℃ 10sec、62℃ 10sec、68℃ 10min)×35cycles、68℃ 15minで行った。更に、続いてNested-PCRをFirst-PCR産物0.5μLを鋳型に1×PCR Buffer(Mg2+ free)、プライマー各0.5nM、dNTP各0.5mM、MgCl2 2.5mM、TaKaRa LA Taq 0.3U を含む30μLの反応液を用いて、以下の増幅プログラム:98℃ 1min、(95℃ 10sec、62℃ 10sec、68℃ 10min)×30cycles、68℃ 15minで行った。
Inverse-PCRに用いたプライマーの組み合わせを以下に示す。
First-PCR:RACE-N-P3-1とE1-Bub-N-P1
Nested-PCR:RACE-N-P3-2とE1-Bub-N-P2
First-PCR:RACE-C-P3-1とE1-Bub-C-P1
Nested-PCR:RACE-C-P3-2とE1-Bub-C-P2
上流側及び下流側のInverse-PCRそれぞれに用いたプライマーの配列を以下に示す。
上流側の増幅プライマー配列
RACE-N-P3-1: ATGGAGATAGTGCCGCTGGCAAGGCAACGGCAC (配列番号:43)
RACE-N-P3-2: TCAACGAAGACTCGATTTGAGCGAGAGGCGAGG (配列番号:44)
E1-Bub-N-P1: ACGGTGGAACCGGCATCGTGTTCATGGACAAC (配列番号:45)
E1-Bub-N-P2: GCGTGACCCAGTTCCACCATGTCGGACTGTC (配列番号:46)
下流側の増幅プライマー配列
RACE-C-P3-1: GACATCCCGTTCGAGCGCAGGATCACCCATGAG (配列番号:47)
RACE-C-P3-2: AGGATCACCCATGAGCGCATCGCTATCATGGAC (配列番号:48)
E1-Bub-C-P1: CATCGCTCTTGCAGTCGTTGTCCAGGAAGTCC (配列番号:49)
E1-Bub-C-P2: TTGTCCAGGAAGTCCATCGCGTACACGACGGAG (配列番号:50)
本実施例(2)で実施したNested-PCR産物に1/10量の10×dayを加え、5μLを0.8%のアガロースゲルで電気泳動し、上流側領域で0.5kb(PstI),3.5kb(XhoI)のDNA断片の増幅を、下流側領域で1kb(HindIII)、1kb(SacI)、2.5kb(XhoI)のDNA断片の増幅を確認した。本実施例におけるアガロース電気泳動ではエチジウムブロミド(株式会社ニッポンジーン)による染色を行い、分子量マーカーにはλ/StyI(株式会社ニッポンジーン)、100bp ladder(東洋紡株式会社)を使用した。増幅したDNA断片をアガロースゲルから切り出し、QIAGEN Gel-Extraction kit(キアゲン)を用いて精製した。精製したDNA断片は増幅に使用したプライマーを使用したダイレクトシークエンス、及びウォーキング法により、その塩基配列を決定した。
本実施例(3)で得られたDNA配列をシーケンス−アセンブルソフトウェアSEQUENCHER(Gene Codes Inc、USA)を使用してアセンブル解析を行い、さらにORFの予測を行った。その結果、E1酵素遺伝子を含めた周辺ゲノム領域6685bpの配列を決定した。解析結果から得られたジヒドロダイゼイン合成酵素遺伝子周辺のゲノム構造の略図を図15に示す。ORF予測の結果、E1酵素遺伝子の上流に3つ(うち一つはN末端未同定)、下流に1つのORFを見出した。見出したORFはジヒドロダイゼイン合成酵素から上流に向かってUpstream(US)1、US2、US3、下流に向かってDownstream(DS)1とした。
上記実施例B4において得られた推定アミノ酸配列を上記実施例B5で決定したジヒドロダイゼイン合成(E1)酵素遺伝子の周辺ゲノムDNA配列データと照合した。その結果、主にLG2より得られたいくつかの配列がORF-US2ヌクレオチド配列から推定されるポリペプチドの配列に一致した。以上のことからORF-US2ポリペプチドがテトラヒドロダイゼイン合成酵素である可能性が示唆された。以下にORF-US2ポリペプチドと一致した消化ペプチド配列を示す。また、図16−1、16−2、16−3にLC-MSにて取得したデータを示す。
ORF-US2ポリペプチドを無細胞系タンパク質合成システム(PURESYSTEM Classic II mini(ポストゲノム研究所))を用いて合成し、そのテトラヒドロダイゼイン合成活性を確認した。
2段階PCRにより、無細胞系タンパク質合成に用いたORF-US2ポリヌクレオチド鋳型DNAを作製した。
ORF-US2用鋳型DNA作製のためのPCRに使用したプライマーを以下に示す。E2-invitroTS-FP1:ACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGCACAGGAAGTCAAAGTCC (配列番号:57)
E2-invitroTS-RP:CTAGACCTCGATCTCGCCCTGCATGCCG (配列番号:58)
Universal-Primer:GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA (配列番号:59)
E2-invitroTS-FP1及びE2-invitroTS-RPは実施例B5で決定したORF-US2ヌクレオチド配列を基にシグマ アルドリッチ ジャパンにて合成した。また、Universal-PrimerはPURESYSTEM Classic II mini(ポストゲノム研究所)に付属されていたものを使用した。
ORF-US2ポリペプチドの合成に用いた鋳型DNAはマニュアルに従い、2段階PCRで作製した。本実施例でのPCRにはDNA-ポリメラーゼにEasy-A(登録商標) High-Fidelity PCR Cloning Enzyme (ストラタジーン)、PCR装置はGeneAmp PCR System 9700 (アプライド・バイオシステムズ)を用いた。
−80℃保存しておいたPURESYSTEM Classic II miniのA液25μLとB液10μLを氷上で融解後、混合し、そこへ2段階PCRで作製したORF-US2ポリペプチド合成用鋳型DNA(開始コドンの5‘側上流にT7‐プロモーター配列及びリボゾーム結合配列を有する)を0.6μg(60ng/μLを10μL)加え、さらに滅菌水を加えて計50μLにして37℃、90分間インキュベーションすることで目的のポリペプチドを合成した。このシステムを用いたタンパク質合成のポジティブコントロールにはPURESYSTEM Classic II miniに付属のジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)合成用鋳型DNAを0.5μg(0.2μg/μLを2μL)用いた。ネガティブコントロールには鋳型となるDNAは添加せず、滅菌水のみを使用した。活性測定は前記反応液40μLを以下の組成の酵素反応用バッファーに加え、37℃、6時間インキュベーションし、反応終了後、酵素反応液を3mLの酢酸エチルで抽出、乾固し、泳動バッファーで溶解してHPLC分析により、酵素反応液中のテトラヒドロダイゼインを測定した。
0.1Mリン酸カリウム緩衝液/1mM PMSF/2mM DTT/5mM Sodium hydrosulfite(pH7.0)
2 mM NADPH
2 mM NADH
10μg/mL ジヒドロダイゼイン
なお、前記ヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)合成用鋳型DNAを用いた場合には、当該DNAを基にしてタンパク質が良好に発現されたが、鋳型となるDNAを添加しない場合には、タンパク質は発現されなかった。このことから、当該実験は適切に行われているものと判断される。
大腸菌を用いた組換えタンパク質発現システムであるpETシステムを用いてORF-US2ポリペプチドを発現させ、そのテトラヒドロダイゼイン合成活性を確認した。
ORF-US2ポリペプチド発現ベクター(pET21-US2)を作製する目的でPCRにより、ORF-US2ポリペプチドのオープン・リーディング・フレーム領域のDNAを増幅した。
実施例B5で決定したORF-US2ポリペプチド配列を基に下記の増幅プライマーを作製した。
exp.US2 pet F Nde:TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC (配列番号:60)
exp. US2 pet:AATCGAATTCCTAGACCTCGATCTCGCCCTGC (配列番号:61)
組換えORF-US2ポリペプチドを発現するプラスミドpET21-US2 とpET21a(ネガティブコントロール)を用いて、大腸菌BL21(DE3)株(Novagen)を形質転換した。形質転換体はアンピシリン(50μg/mL)を含むLB培地アガープレート上で37℃、終夜生育させ、シングルコロニーを得た。
本実施例内(2)で得た菌体破砕液を酵素源として、ジヒドロダイゼインからテトラヒドロダイゼインへの変換活性を測定し、発現させた組換えORF-US2ポリペプチドにその活性を確認した。
酵素反応液組成
菌体破砕液(酵素源) 100 μl
NADH(100 mM) 20 μl
NADPH(100 mM) 20 μl
ジヒドロダイゼイン (2 mg / ml) 5 μl
KPB-PDH 855 μl
計 1000 μl
実施例C1 菌体のテトラヒドロダイゼインからのエクオール生合成活性の確認
ラクトコッカス20-92株(FERM BP-10036号)を、テトラヒドロダイゼイン含有増殖用液体培地(シス-もしくはトランス-テトラヒドロダイゼイン(自社で有機合成:参考例B1参照)を10μg/mLとなる量に加えた変法GAMブイヨン培地(日水製薬株式会社))に接種し、嫌気的条件下(BBL Gas Pack systemsを使用)37℃で18時間培養した。培養終了後、直ちに培養液1mLを蓋付ガラス製遠沈管に分取し、3mLの酢酸エチルを添加して抽出処理を行った後、乾固し、HPLC分析を行った。HPLC分析の標準溶液にはダイゼイン(フナコシ株式会社)、エクオール(フナコシ株式会社)、ジヒドロダイゼイン(トレンドリサーチケミカル社)シス-テトラヒドロダイゼイン、トランス-テトラヒドロダイゼイン(共に自社で化学合成)の混合溶液(各2μg/mL)を用いた。
大腸菌を用いた組換えタンパク質発現システムであるpETシステム(Novagen)を用いて、実施例B5において決定したジヒドロダイゼイン合成(E1)酵素遺伝子周辺ゲノムDNA配列上に同定した3つのORFポリヌクレオチド(ORF-US3,US1,DS1)に対応するポリペプチドを大腸菌内でそれぞれ発現させ、そのテトラヒドロダイゼインからのエクオールへの変換を触媒する活性を調べることにより、エクオール合成(E3)
酵素の探索を行った。
各ORFポリペプチド(ORF-US3,US1,DS1)の発現ベクターを作製する目的でPCRにより、それぞれのオープン・リーディング・フレーム領域のポリヌクレオチドを増幅し、pET21aベクター(Novagen)に挿入した。
実施例B5で決定したジヒドロダイゼイン合成酵素(E1)周辺ゲノム配列を基に下記の増幅プライマーを作製した。
ORF-US3ポリペプチド
exp.US3 F:TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG (配列番号:62)
exp.US3 R:CCGCAAGCTTCTACATAGTGGAGATCGCGTGG (配列番号:63)
ORF-US1ポリペプチド
exp.US1 F:TATACATATGTTCAAGGGTCCACAGGGC (配列番号:64)
exp.US1 R:GCTCGAATTCTTAGTGCTGCTGTGCCTTTTCAG (配列番号:65)
ORF-DS1ポリペプチド
exp.DS1 F:ATATACATATGCAGGATATGGACTTCATGG (配列番号:66)
exp.DS1 R:GCTCGAATTCTCATAGTGACATCAGCGCTCCC (配列番号:67)
上記した増幅プライマーを各5pmol、dNTP 5nmol each、実施例A5において精製したラクトコッカス20-92株のゲノムDNA 40ng 、KOD-plus DNA polymerase用10×緩衝液(東洋紡績株式会社)2.5μL、KOD-Plus DNA polymerase 0.3ユニット(東洋紡績株式会社)を含む25μLの反応液を用い、増幅プログラム:95℃ 3分、(94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 2分)×30cycles、68℃ 7分でGeneAmpPCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ)を用いてPCRを行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動した結果、それぞれに予想される大きさのバンドが検出できた。PCR産物全量をQIAGEN PCR Purification kit(キアゲン)にて回収した。
(1-2)で回収したORF-US3ポリヌクレオチド断片を制限酵素NdeI及びHindIIIで、ORF-US1及びORF-DS1ポリヌクレオチド断片をNdeI及びEcoRIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Qiagen Gel Extraction kit (キアゲン)により精製、回収した。得られたポリヌクレオチド断片はDNA Ligation Kit ver.2.1(タカラバイオ株式会社)を用いて、NdeI及びHindIIIもしくはEcoRIで消化したpET21aと16 ℃、終夜でライゲーションした後、ライゲーション反応液を用いて大腸菌JM109株(タカラバイオ株式会社)を定法で形質転換した。斯くして得た形質転換体を、アンピシリン(50μg/mL)を含むLB培地アガー(GIBCO)プレート上で37℃、終夜生育させ、コロニーを形成させた。得られたシングルコロニーを、アンピシリン(50μg/mL)を含むLB培地(GIBCO)3mLで終夜培養した後、プラスミド自動抽出機PI-100(KURABO)を用いてプラスミドDNAを抽出した。
(2−1)大腸菌BL21形質転換体の作製
組換えORFポリペプチドを発現するプラスミドpET-US3、pET-US1、pET-DS1とpET21a(ネガティブコントロール)を用いて、大腸菌BL21(DE3)株(Novagen)を定法で形質転換した。形質転換体はアンピシリン(50μg/mL)を含むLB培地アガープレート上で37℃、終夜生育させ、シングルコロニーを得た。
上記の大腸菌BL21(DE3)形質転換体それぞれをアンピシリン(50μg/mL)を含む3mLの液体LB培地で終夜37℃において培養を行った。その培養液0.5mLを同濃度のアンピシリンを含む液体LB培地50mLに加え、3時間(OD630nmが約0.4-0.7になるまで)前培養し、終濃度が1mMになるようにIPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド)(和光純薬工業株式会社)を加え、さらに37℃で4時間培養し、大腸菌内での組換えポリペプチドの発現誘導行った。
上記(2-2)での発現誘導終了後、菌体をAvanti HP25(beckman coulter)で遠心分離(6000rpm 4℃ 15分)により集菌した。以降の操作は氷上で行った。遠心上静(培地)を除いた後、1mM PMSF、2mM DTT、5mM Sodium hydrosulfiteを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液pH7.0(以後KPB-PDHと略す)1mLに懸濁し、あらかじ0.7mL容のジルコニア-シリカビーズ(BioSpec Products, Inc.)及びKPB-PDH 400μLを入れておいた2mL容アシストチューブへ入れ、FastPrep(R)(Thermo ELECTRON CORPORATION)を用いて6500rpm、20秒間処理-3分間氷冷を2回繰り返すことで、菌体を破砕し、菌体破砕液を得た。
大腸菌内での各組換えORFポリペプチドの発現確認はSDS-PAGEで行った。(2-3)に記した菌体破砕液20μLに5×サンプル緩衝液(125mM Tris-HCl(pH6.5)/ 25% グリセロール/5% SDS/5% 2-メルカプトエタノール/BPB 0.5%)を5μL加え、98℃ 5分間加熱変性後、氷冷し、うち4μLをSDS-PAGEで泳動した。SDS‐PAGEには市販のゲル板(SuperSepTM5-20% (和光純薬工業株式会社))を使用し、染色はクイックCBB(和光純薬工業株式会社)で行った。分子量マーカーにはPrestained XL-Ladder Broad range(株式会社アプロサイエンス)を使用した。SDS-PAGEの結果を図21に示す。pET-US3、pET-DS1形質転換体由来の菌体破砕液それぞれにおいて分子量約52kDa、50kDaの組換えORF-US3及びORF-DS1ポリペプチドの発現が確認された。pET-US1形質転換体由来の菌体破砕液では組換えORF-US1ポリペプチドの発現は確認できなかった。
実施例C2で得た各形質転換体菌破砕液を酵素源として、テトラヒドロダイゼインからエクオールへの変換活性を測定した。本実施例でのテトラヒドロダイゼインからエクオールへの変換活性の測定は以下の方法で行った。
実施例D1 大腸菌を用いた組換えHis-タグ付きエクオール産生関連酵素の発現及び精製
大腸菌を用いた組換えタンパク質発現システムであるpET システム(Novagen)を用いて、His−タグ付きエクオール産生関連酵素[ジヒドロダイゼイン合成酵素(E1),テトラヒドロダイゼイン合成酵素(E2),エクオール合成酵素(E3)]を発現させ、His-タグ付きタンパク質精製用(Ni)カラムを用いてアフィニティー精製を行った。
各酵素(E1,E2,E3)の発現ベクターを作製する目的でPCRにより、それぞれのオープン・リーディング・フレーム領域のポリヌクレオチドを増幅し、pET21aベクター(Novagen)に挿入した。
実施例B5で決定したジヒドロダイゼイン合成酵素(E1)周辺ゲノム配列を基に下記の増幅プライマーを作製した。
His-タグ付きE1酵素
exp.E1 pet F Nde:AGCTCATATGAAGAACAAGTTCTATCCGAA (配列番号:41)
exp.E1 pet His:AATCGAATTCGTACAGGTTGCAGCCAGCGATGT (配列番号:42)
His-タグ付きE2酵素
exp.US2 pet F Nde:TATACATATGGCACAGGAAGTCAAAGTC (配列番号:60)
exp.E2 pet His:AATCGAATTCGAGACCTCGATCTCGCCCTGC (配列番号:68)
His-タグ付きE3酵素
exp.US3 F:TATACATATGGCAGAATTCGATGTTGAG (配列番号:62)
exp.E3 R His:CCGCAAGCTTGTACATAGTGGAGATCGCGTGG (配列番号:69)
上記増幅プライマー:exp.E1 pet F Nde、exp.US2 pet F、exp.US3 FにはpET21a(Novagen)へ挿入するため、制限酵素NdeI切断部位配列を、exp.E1 pet His、exp.E2 pet HisにはEcoRI切断部位配列をexp.E3 R HisにはHindIII切断部位配列を含ませてある。
上記した増幅プライマーを各5pmolとdNTPを各5nmolと実施例A5において精製したラクトコッカス20-92株(FERM BP-10036号)のゲノムDNA 40ng 、KOD-plus DNA polymerase用10×緩衝液(東洋紡績株式会社)2.5μL、KOD-Plus DNA polymerase 0.3ユニット(東洋紡績株式会社)を含む25μLの反応液を用い、増幅プログラム:95℃ 3分、(94℃ 30秒、60℃ 30秒、68℃ 2分)×30cycles、68℃ 7分でGeneAmpPCR System 9700(アプライド・バイオシステムズ)を用いてPCRを行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動した結果、それぞれに予想される大きさのバンドが検出できた。PCR産物全量をQIAGEN PCR Purification kit(キアゲン)にて回収した。
(1-2)で回収した各His-タグ付き酵素ポリヌクレオチド断片を制限酵素NdeI及びEcoRIで切断後、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Qiagen Gel Extraction kit (キアゲン) により精製、回収した。得られたポリヌクレオチド断片はDNA Ligation Kit ver.2.1(タカラバイオ株式会社)を用いて、NdeI及びEcoRIで消化したpET21aと16 ℃、終夜でライゲーションした後、ライゲーション反応液を用いて大腸菌JM109株(タカラバイオ株式会社)を定法で形質転換した。斯くして得た形質転換体を、アンピシリン(50μg/mL)を含むLB培地アガー(GIBCO)プレート上で37℃、終夜生育させ、コロニーを形成させた。得られたシングルコロニーを、アンピシリン(50μg/mL)を含むLB培地(GIBCO)3mLで終夜培養した後、プラスミド自動抽出機PI-100(KURABO)を用いてプラスミドDNAを抽出した。
(2−1)大腸菌BL21形質転換体の作製
His-タグ付き酵素ポリペプチドを発現するプラスミドpET-E1-His、pET-E2-His、pET-E3−Hisを用いて、大腸菌BL21(DE3)株(Novagen)を定法で形質転換した。形質転換体はアンピシリン(50μg/mL)を含むLB培地アガープレート上で37℃、終夜生育させ、シングルコロニーを得た。
(2−2−1)大腸菌培養及び組換えHis-タグ付きE1及びE2酵素ポリペプチドの発現誘導
上記pET-E1-His又はpET-E2-Hisによる大腸菌BL21(DE3)形質転換体それぞれをアンピシリン(50μg/mL)を含む10mLの液体LB培地で終夜37℃において培養を行った。その培養液7.5mL を同濃度のアンピシリンを含む液体LB培地150mL 加え、37℃で2時間(OD600nmが約0.5になるまで)前培養し、終濃度が0.5mM になるようにIPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド)(和光純薬工業株式会社)を加え、さらに弱い振とう条件下で30℃、4時間培養し、大腸菌内での組換えHis-タグ付きE1及びE2酵素ポリペプチドの発現誘導行った。
上記(2-2)での発現誘導終了後、菌体をAvanti HP25(beckman coulter)で遠心分離(6000rpm 4℃ 10分)により集菌し、組換えHis-タグ付きE1及びE2酵素ポリペプチド発現大腸菌をそれぞれ湿重量にして0.66g及び0.73gを得た。得た菌体はBugbuster protein Extraction solution(Novagen)が菌体湿重量1gあたり15mLになるように加え、ピペットで穏やかに懸濁し、更にLysozyme(SIGMA) を2000units/mL、Benzonase(Novagen)を 25units(1μL)/mLになるように加えた。その後、ローテーター(RT-50:タイテック)を用いて30分間室温でゆっくり攪拌し、菌ライゼートAを得た。更に菌ライゼートAをAvanti HP25(beckman coulter)で遠心分離(8000rpm 4℃ 15分)により、その上清である菌ライゼートBを得た。
His-タグ付きタンパク質精製用カラムにはHis GraviTrap(GEヘルスケアバイオサイエンス)を用い、取り扱い説明書に記載されている手順に従い、一部変更した方法でHis-タグ付きE1及びE2酵素ポリペプチドのアフィニティー精製を行った。即ち、His GraviTrapを氷冷した10mLの結合バッファーで平衡化した後、(2-2-2)で調製した菌ライゼートBを全量注ぎ込み、自然落下にて目的のHis-タグ付きE1或いはE2酵素をHis GraviTrapに吸着させた。その後、His GraviTrapを氷冷した10mLの洗浄バッファーで2回洗浄した後、氷冷しておいた3mLの溶出バッファーで目的のHis-タグ付きE1及びE2酵素をHis GraviTrapより溶出した。溶出液にDTT[dithiothreitol](和光純薬工業株式会社)を終濃度が3mMになるように加えた後、 300μLずつマイクロチューブに小分けした。それらの一部を用いて、それぞれの溶出液のE1酵素活性及びE2酵素活性を確認し、溶出液は酵素実験に使用するまで4℃で保存した。
結合バッファー:20mM Tris-HCl、20mM Imidazole(和光純薬工業株式会社)、0.5M NaCl(和光純薬工業株式会社)、1mM DTT[dithiothreitol](和光純薬工業株式会社)、1 mM PMSF[phenylmethylsulfonyl fluoride](和光純薬工業株式会社)
洗浄バッファー:20mM Tris-HCl、 60mM Imidazole、0.5M NaCl、1mM DTT[dithiothreitol]、1 mM PMSF[phenylmethylsulfonyl fluoride]
溶出バッファー:20mM Tris-HCl 500mM Imidazole、0.5M NaCl、1mM DTT[dithiothreitol]、1 mM PMSF[phenylmethylsulfonyl fluoride]
(2−3−1)大腸菌培養及び組換えHis-タグ付きE3酵素ポリペプチドの発現誘導
上記(2-1)に記載のpET-E3-Hisによる大腸菌BL21(DE3)形質転換体をアンピシリン(50μg/mL)を含む50mLの液体LB培地で終夜37℃において培養を行った。その培養液20mL を同濃度のアンピシリンを含む液体LB培地1Lに加え、37℃で3時間(OD660nmが約0.4になるまで)前培養した。終濃度が0.5mM になるようにIPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド)(和光純薬工業株式会社)を加え、37℃で4時間振とう培養し、大腸菌内での組換えHis-タグ付きE3酵素ポリペプチドの発現誘導行った。発現誘導を行った大腸菌をAvanti HP25(beckman coulter)で遠心分離(6000rpm 4℃ 10分)をして集菌した。菌体を1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)2 mM DTT(和光純薬工業株式会社)5mM Sodiumhydrosulfite(和光純薬工業株式会社)を含有する0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7.0(以後バッファーAとする)を25 ml加えて懸濁し、遠心分離(6000rpm 4℃ 10分)後そのままの状態で-80℃に保存した。
上記(2-3-1)で保存した菌体を融解後、遠心(10,000xg 15 min)し、新しいバッファーAを25 ml加えて懸濁させた。その懸濁液をFastPrep(R)(Thermo ELECTRON CORPORATION)を用いて6500rpm、20秒間処理-3分間氷冷を3回繰り返すことで、菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を遠心 (10000 X g, 15 min)し、その上清を分離し、菌ライゼートを得た。
上記(2-3-3)で得た菌ライゼート4 mLを以下に示す精製条件によりHis-タグ融合タンパク質精製用カラムであるHisTrap HP (GEヘルスケアバイオサイエンス)に供して、組換えHisタグ付きE3酵素の精製を行った。蛋白質の測定は280 nmの吸収によった。またフラクションコレクターによる分画は素通り画分の280nmにおける吸収がベースラインに低下した後開始した。
フラクション: 2 ml/2 min/フラクション
溶離液 A: 0.1 M リン酸カリウム緩衝液pH 7/0.5 M NaCl /1 % isoPrOH
溶離液 B: 0.5 M Imidazoleを含む溶離液A
溶出プログラム: 時間(min) (溶離液B)/(溶離液A+溶離液B)
0 0.05
5 0.05
25 0.5
30 1
35 1
37 0.05
上記実施例D1の(2-2-3)にて得た組換えHis-タグ付きE1酵素及びE2酵素を酵素源として、下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で2時間反応させることでダイゼインからテトラヒドロダイゼインの合成を行った。また、同時に酵素源として組換えHis-タグ付きE1、E2酵素それぞれを単独で用いた反応も行った。
酵素反応液組成
HPLC分析の標準溶液はダイゼイン(フナコシ)、エクオール(フナコシ)、ジヒドロダイゼイン(トレンドリサーチケミカル社)シス-テトラヒドロダイゼイン(参考例B1)、トランス-テトラヒドロダイゼイン(参考例B1)の混合溶液(各2μg/mL)を用いた。
HPLC分析の結果を図23に示す。酵素源に組換えHis-タグ付きE1酵素及びE2酵素の混合を使用した場合、その生成物にシス-及びトランス-テトラヒドロダイゼインを確認した。しかしながら、酵素源に組換えHis-タグ付きE1酵素もしくは組換えHis-タグ付きE2酵素単独で使用した場合には、その生成物にシス-及びトランステトラヒドロダイゼインは確認できなかった。
上記実施例D1の (2-2-3)及び(2-3-3)にて得た組換えHis-タグ付きE2及びE3酵素を酵素源として、下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で2時間反応させることでジヒドロダイゼインからエクオールの合成を行った。また、同時に酵素源として組換えHis-タグ付きE2酵素及びE3酵素それぞれを単独で用いた反応も行った。
酵素反応液組成
インキュベート後、得られた酵素反応液に3mLの酢酸エチル(和光純薬)を添加して抽出処理を行い、乾固した後、移動層(溶離液)で溶解した。溶解物をHPLC分析することにより、酵素反応液中のエクオールを測定した。
HPLC分析の結果を図24に示す。酵素源に組換えHis-タグ付きE2、E3酵素混合を使用した場合、その生成物にエクオールを確認した。しかしながら、酵素源に組換えHis-タグ付きE2酵素もしくは組換えHis-タグ付きE3酵素を単独で使用した場合には、その生成物にエク オールは確認できなかった。
上記実施例D1の(2-2-3)及び(2-3-3)にて得た組換えHis-タグ付きE1酵素、E2酵素及びE3酵素を酵素源として、下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で2時間反応させることでダイゼインからエクオールの合成を行った。また、同時に酵素源として組換えHis-タグ付きE1酵素、E2酵素、及びE3酵素をそれぞれ単独で用いた反応も行った。
酵素反応液組成
HPLC分析の結果を図25に示す。酵素源にそれぞれの組換えHis-タグ付き酵素単独で使用した場合、その生成物にエクオールは確認できなかった。しかしながら、酵素源に組換えHis-タグ付きE1酵素、E2酵素及びE3酵素混合を使用した場合には、その生成物にエクオールが確認された。
Ni-Sepharoseにて精製した大腸菌発現His-タグ付き組換えE1酵素(E1-His)を酵素源として、ダイゼインからジヒドロダイゼインへの変換活性に対する金属イオンの影響を検討した。 各種金属 (MnCl2・2H2O、FeSO4・7H2O、CaCl2・2 H2O、Zn(CH3COO)2・2H2O、CoSO4・7H2O、MgSO4・7 H2O、NiSO4・6 H2O ) を蒸留水にて100mMとなるよう溶解し、実験に供した。活性の測定は下記組成の酵素反応液を調製し、37℃で1時間インキュベートして行った。
酵素反応液組成
組換えHis−タグ付きE1酵素 20 μl
NADH(100 mM) 10 μl
NADPH(100 mM) 10 μl
ダイゼイン (1 mg / ml) 10 μl
金属イオン溶液 100 μl
0.2M KPB-DH 850 μl
計 1000 μl
配列番号24はプライマーE1-N-terminal-37の塩基配列を示す。
配列番号25はプライマーE1-N-terminal-F32の塩基配列を示す。
配列番号26はプライマーE1-internal-RP1の塩基配列を示す。
配列番号27はプライマーpUC19-FP-1の塩基配列を示す。
配列番号28はプライマーpUC19-RP-1の塩基配列を示す。
配列番号29はプライマーpUC19-FP-2の塩基配列を示す。
配列番号30はプライマーpUC19-RP-2の塩基配列を示す。
配列番号31はプライマーE1-RACE-N-P1の塩基配列を示す。
配列番号32はプライマーE1-RACE-RP2-1の塩基配列を示す。
配列番号33はプライマーE1-RACE-N-P2の塩基配列を示す。
配列番号34はプライマーE1-RACE-RP2-2の塩基配列を示す。
配列番号35はプライマーE1-conf-NPの塩基配列を示す。
配列番号36はプライマーE1-conf-CPの塩基配列を示す。
配列番号37はプライマーE1-FPの塩基配列を示す。
配列番号38はプライマーE1-RPの塩基配列を示す。
配列番号39はプライマーGar-16S-Ribo-FPの塩基配列を示す。
配列番号40はプライマーGar-16S-Ribo-RPの塩基配列を示す。
配列番号41はプライマーexp.E1 pet F Ndeの塩基配列を示す。
配列番号42はプライマーexp. E1 pet Hisの塩基配列を示す。
配列番号43はプライマーRACE-N-P3-1の塩基配列を示す。
配列番号44はプライマーRACE-N-P3-2の塩基配列を示す。
配列番号45はプライマーE1-Bub-N-P1の塩基配列を示す。
配列番号46はプライマーE1-Bub-N-P2の塩基配列を示す。
配列番号47はプライマーRACE-C-P3-1の塩基配列を示す。
配列番号48はプライマーRACE-C-P3-2の塩基配列を示す。
配列番号49はプライマーE1-Bub-C-P1の塩基配列を示す。
配列番号50はプライマーE1-Bub-C-P2の塩基配列を示す。
配列番号57はプライマーE2-invitroTS-FPの塩基配列を示す。
配列番号58はプライマーE2-invitroTS-RPの塩基配列を示す。
配列番号59はプライマーUniversal-Primerの塩基配列を示す。
配列番号60はプライマーexp.US2 pet F Ndeの塩基配列を示す。
配列番号61はプライマーexp. US2 petの塩基配列を示す。
配列番号62はプライマーexp.US3 Fの塩基配列を示す。
配列番号63はプライマーexp.US3 Rの塩基配列を示す。
配列番号64はプライマーexp.US1 Fの塩基配列を示す。
配列番号65はプライマーexp.US1 Rの塩基配列を示す。
配列番号66はプライマーexp.DS1 Fの塩基配列を示す。
配列番号67はプライマーexp.DS1 Rの塩基配列を示す。
Claims (21)
- 以下の(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチド:
(Ca)配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Cb)配列番号13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド;
(Cc)配列番号13に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有する
ポリペプチド。 - 以下の(Cd)〜(Cf)のいずれかであるポリヌクレオチド:
(Cd)配列番号16に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Ce)配列番号13に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Cf)前記(Cd)又は(Ce)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - テトラヒドロダイゼインに対して、請求項1に記載のポリペプチドを作用させる工程を含む、エクオールの製造方法。
- 以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチド:
(Ba)配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Bb)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Bc)配列番号7に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。 - 以下の(Bd)〜(Bf)のいずれかであるポリヌクレオチド:
(Bd)配列番号10に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(Be)配列番号7に記載のアミノ配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(Bf)前記(Bd)又は(Be)のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを生成する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - ジヒドロダイゼインに対して、請求項4に記載のポリペプチド、並びにNADPH及び/又はNADHを作用させる工程を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法。
- 以下の(第1工程)及び(第2工程)を含む、テトラヒドロダイゼインの製造方法:
(第1工程)ダイゼインに、以下の(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、及びNADPHを作用させることにより、ジヒドロダイゼインを生成する工程;
(Aa)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Ab)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Ac)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(第2工程)ジヒドロダイゼインに、以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにNADPH及び/又はNADHを作用させることにより、テトラヒドロダイゼインを生成する工程;
(Ba)配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Bb)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Bc)配列番号7に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド。 - 以下の(第2工程)及び(第3工程)を含む、エクオールの製造方法:
(第2工程)ジヒドロダイゼインに、以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにNADPH及び/又はNADHを作用させることにより、テトラヒドロダイゼインを生成する工程;
(Ba)配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Bb)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Bc)配列番号7に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(第3工程)テトラヒドロダイゼインに、以下の(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにNADPH及び/又はNADHを作用させることにより、エクオールを製造する工程、
(Ca)配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Cb)配列番号13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド;
(Cc)配列番号13に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。 - 以下の(第1工程)〜(第3工程)を含む、エクオールの製造方法:
(第1工程)ダイゼインに、以下の(Aa)〜(Ac)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、及びNADPHを作用させることにより、ジヒドロダイゼインを生成する工程;
(Aa)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Ab)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Ac)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つダイゼインを基質としジヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(第2工程)ジヒドロダイゼインに、以下の(Ba)〜(Bc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにNADPH及び/又はNADHを作用させることにより、テトラヒドロダイゼインを生成する工程;
(Ba)配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Bb)配列番号7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド;
(Bc)配列番号7に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つジヒドロダイゼインを基質としテトラヒドロダイゼインを合成する活性を有するポリペプチド
(第3工程)テトラヒドロダイゼインに、以下の(Ca)〜(Cc)のいずれかであるポリペプチドからなる酵素、並びにNADPH及び/又はNADHを作用させることにより、エクオールを製造する工程、
(Ca)配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(Cb)配列番号13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド;
(Cc)配列番号13に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つテトラヒドロダイゼインを基質としエクオールを合成する活性を有するポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチド、又は請求項2に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに対する結合性を有する抗体。
- 請求項10に記載の抗体を被験試料に接触させる工程を含む、請求項1に記載のポリペプチド又は請求項2に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は請求項2に記載のポリヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖の10〜40ヌクレオチドの長さの部分断片である、プローブ。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は請求項2に
記載のポリヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖の10〜40ヌクレオチドの長さの部分断片である、プライマー。 - 請求項12に記載のプローブを用いて、請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は請求項2に記載のポリヌクレオチドを検出又は測定する方法。
- 検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、請求項14に記載の方法。
- 請求項4に記載のポリペプチド、又は請求項5に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに対する結合性を有する抗体。
- 請求項16に記載の抗体を被験試料に接触させる工程を含む、請求項4に記載のポリペプチド又は請求項5に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出又は測定する免疫学的方法。
- 請求項4に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は請求項5に記載のポリヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖の10〜40ヌクレオチドの長さの部分断片である、プローブ。
- 請求項4に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は請求項5に
記載のポリヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖の10〜40ヌクレオチドの長さの部分断片である、プライマー。 - 請求項18に記載のプローブを用いて、請求項4に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は請求項5に記載のポリヌクレオチドを検出又は測定する方法。
- 検出又は測定対象となるポリペプチドが、細菌性原核細胞内に存在するものである、請求項20に記載の方法。
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