CN104059899A - 一种类芽孢杆菌在麸皮培养基生产凝乳酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在麸皮培养基发酵生产凝乳酶的方法。该方法包括以下步骤：将所述的类芽孢杆菌种子液接种于麸皮培养基进行发酵，以250mL锥形瓶为标准装液量为20～40mL，发酵温度为28℃～32℃，发酵时间为16～20小时，获得具有凝乳酶活性的发酵液。经测定凝乳酶活力最高可达到6733.81SU/mL。利用优化的培养条件可以获得具有较高凝乳酶活性的类芽孢杆菌发酵液提取物，该发酵液提取物在干酪生产加工产业中具有广阔应用前景。

Description

一种类芽孢杆菌在麸皮培养基生产凝乳酶的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌(Paenibacillusdamxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在麸皮培养基发酵生产凝乳酶的方法。
背景技术
近年来，干酪产业发展较快，凝乳是生产原制干酪的关键步骤，凝乳酶在此过程中发挥至关重要的作用，并直接关系到干酪的品质和得率。因而随着世界干酪产量保持增长势头，凝乳酶的需求量也不断增长。世界上凝乳剂年需求量25×106L，产量占全世界酶制剂总量的20％左右，成为第一大酶制剂。凝乳酶主要功能是专一性的水解乳中κ-酪蛋白多肽链，形成副酪蛋白及亲水性的糖巨肽，当酪蛋白被水解到一定程度后，体系中的钙离子通过酪蛋白胶粒间形成的化学键形成凝块，以此用于干酪生产。
传统的凝乳酶来源于小牛皱胃，然而自1961年以来，世界干酪产量大约增加了3.5倍，小牛皱胃凝乳酶供应量却呈下降趋势，目前，世界小牛皱胃凝乳酶的仅能满足世界干酪产量所需凝乳酶的20～30％，无法满足快速增加的干酪产量的需求。因此必须通过微生物发酵的方式以获得凝乳活力高的提取物。目前，国内对于微生物源凝乳酶也有部分的研究。如孙健等利用60Co-γ射线诱变初筛的产凝乳酶霉菌，最终获得提取物凝乳酶的活力为4000SU/mL。郭光远等筛选了高温链霉菌凝乳酶活性较高的为100SU/mL。丁明亮等利用枯草芽孢杆菌进行发酵产生凝乳酶，通过响应面法进行优化，最终获得凝乳活性最高为1129SU/mL，但其所获得的凝乳酶活性仍比较有限。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对目前微生物来源凝乳酶活力(milkclotting activity,MCA)不高、产量较低的缺陷，提供一种微生物来源凝乳酶的生产方法。本发明所述的方法采用类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensissp.nov.)CGMCC No.8333在麸皮液体培养基发酵生产凝乳酶，并且在较佳的培养条件下，获得的凝乳酶具有高于现有利用微生物发酵产生凝乳酶的MCA值。
本发明采用以下技术方案来解决上述技术问题：
本发明的技术方案为：
一种类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在麸皮培养基发酵生产凝乳酶的方法，包括以下步骤：将类芽孢杆菌CGMCCNo.8333种子液接种于麸皮培养基进行发酵，以250mL锥形瓶为标准装液量为20～40mL，发酵温度为28℃～32℃，发酵时间为16～20小时，获得具有凝乳酶活性的发酵液。
本发明所述的种子液可以是常规的，较佳的，由包括以下步骤的方法制备而得：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于TYC培养基，28～32℃活化培养18～20小时后，即得种子液。
本发明所述的接种可以是常规的，较佳的使用单菌落。
本发明所述的种子液的接种量可以为常规的接种量，较佳的为4～6％，更佳的为5％，所述百分比为体积百分比。
本发明所述的麸皮培养基可以为常规的麸皮培养基，较佳的包括麸皮和水，所述麸皮含量为1％～14％，较佳的为2％～6％，最佳的为3％，所述百分比为质量百分比。
本发明所述的麸皮可以为常规的麸皮，较佳的，所述麸皮为小麦麸皮。
本发明所述的一种类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在麸皮培养基发酵生产凝乳酶的方法，所述的种子液由包括以下步骤的方法制备而得：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于TYC培养基，28～32℃活化培养18～20小时后，即得种子液；所述的种子液的接种量为4～6％，所述百分比为体积百分比；所述的麸皮培养基包括麸皮和水，其中麸皮含量为1％～14％，所述百分比为质量百分比。
本发明所述的TYC培养基为常规的TYC培养基，较佳的由以下组分组成：酪蛋白胨或胰蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸钠20g/L，Na2SO40.1g/L，NaCl1g/L，Na2HPO4·12H2O2g/L，NaHCO32g/L，琼脂15～20g/L，余量为水。
本发明所述的发酵的方法为常规，较佳的，在需氧条件下进行。
本发明所述的发酵可以为常规的发酵培养方式，较佳的，使用振荡培养，转速为300r/min。
本发明所述的类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCCNo.8333，由西藏当雄县采集的牦牛乳样品中分离获得，但不仅限于所述的来源。本发明所用的类芽孢杆菌CGMCC No.8333已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，并且在中国专利申请CN103740618A中公开，该专利申请的全文为本发明所引用。
本发明的一较佳的实施例是，将所述的类芽孢杆菌发酵，在以250mL锥形瓶为标准装液量为29mL，发酵温度为30℃，发酵时间为18小时的条件下获得具有凝乳酶活性的发酵液，所述的发酵使用振荡培养，转速为300r/min。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的方法，将类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333，于麸皮培养基中发酵，通过实验和研究发现发酵温度、三角瓶装液量、发酵时间是三个显著影响发酵的因素，在调整这三个因素之后，获得CGMCC No.8333麸皮液体发酵液提取物的凝乳酶活力最高达到6733.81SU/mL。采用本发明的生产方法制备凝乳酶的活力得到了显著的提升，较目前国内凝乳酶活力方面研究MCA值100-4000SU/mL有了较大幅度的提高，并且利用低成本的麸皮作为培养基来源，有效节约了社会资源。因此，本发明的有效实施不仅解决了微生物源凝乳酶产量及活力不高的现象，同样带来了良好的经济和社会效益。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明所述的凝乳酶活力(MCA)值的测得包括以下步骤：按发酵时间培养类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液，将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液；将脱脂奶粉以10％(w/v)的比例配置成pH6.0含有10mmol/L CaCl2的溶液，在35℃水浴中孵育10min后，获得脱脂乳溶液；将所述的0.5mL的稀释液加入所述的脱脂乳溶液获得样品。将所述的样品取出并倾斜45°观察组织状态，以所述的样品形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间，计算MCA值。
实施例1种子液的制备
取30mL TYC液体培养基分别置于100mL锥形瓶中，用多层(8-12层)纱布密封、牛皮纸封口后，121℃高温蒸汽灭菌15分钟；
挑取在TYC固体培养基(琼脂)上培养24h的类芽孢杆菌(Paenibacillusdamxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333的新鲜培养物，接种到TYC液体培养基，30℃摇床培养20h，即得到种子液。
实施例2
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基5％(体积百分数)接种，于20mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为3％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度30℃、转速300r/min，振荡发酵培养20h。
培养20h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在30℃振荡发酵培养20h后20mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为4760.71SU/mL。
实施例3
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基5％(体积百分数)接种，于40mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为3％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度30℃、转速300r/min，振荡发酵培养20h。
培养20h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在30℃振荡发酵培养20h后40mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为4578.64SU/mL。
实施例4
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基5％(体积百分数)接种，于30mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为3％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度30℃、转速300r/min，振荡发酵培养16h。
培养16h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在30℃振荡发酵培养16h后30mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为6460.98SU/mL。
实施例5
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基5％(体积百分数)接种，于29mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为3％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度30℃、转速300r/min，振荡发酵培养18h。
培养18h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在30℃振荡发酵培养18h后29mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为6733.81SU/mL。
实施例6
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基5％(体积百分数)接种，于40mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为3％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度28℃、转速300r/min，振荡发酵培养16h。
培养16h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在28℃振荡发酵培养16h后40mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为3658.65SU/mL。
实施例7
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基5％(体积百分数)接种，于20mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为3％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度28℃、转速300r/min，振荡发酵培养20h。
培养20h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在28℃振荡发酵培养20h后20mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为4469.17SU/mL。
实施例8
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基5％(体积百分数)接种，于20mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为3％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度32℃、转速300r/min，振荡发酵培养20h。
培养20h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在32℃振荡发酵培养20h后20mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为4121.01SU/mL。
实施例9
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基5％(体积百分数)接种，于40mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为3％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度32℃、转速300r/min，振荡发酵培养16h。
培养16h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在32℃振荡发酵培养16h后40mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为3942.06SU/mL。
实施例10
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基5％(体积百分数)接种，于29mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为2％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度30℃、转速300r/min，振荡发酵培养18h。
培养18h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在30℃振荡发酵培养18h后29mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为5512.38SU/mL。
实施例11
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基5％(体积百分数)接种，于29mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为6％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度30℃、转速300r/min，振荡发酵培养18h。
培养18h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在30℃振荡发酵培养18h后29mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为3756.46SU/mL。
实施例12
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基4％(体积百分数)接种，于29mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为3％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度30℃、转速300r/min，振荡发酵培养18h。
培养18h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在30℃振荡发酵培养18h后29mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为6127.64SU/mL。
实施例13
将实施例1制备得到的种子液，按液体培养基6％(体积百分数)接种，于29mL麸皮培养基(所述的麸皮培养基麸皮含量为3％，其余为去离子水)中发酵，设定摇床温度30℃、转速300r/min，振荡发酵培养18h。
培养18h后，取5mL发酵液，经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为粗酶液。将得到的粗酶液稀释5倍，取0.5mL的稀释液测定MCA值。
实验结果表明，测得类芽孢杆菌的菌株(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333在30℃振荡发酵培养18h后29mL麸皮培养的粗酶液凝乳酶活力为5712.42SU/mL。
对比例1-10
改变发酵条件并测定凝乳酶活力。改变的发酵条件和对应的凝乳酶活力的数据见于表1，其余发酵条件，发酵方法及凝乳酶测定的方法均同实施例5。
表1 发酵条件与凝乳酶活力的测定

Claims (10)

1.一种类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCCNo.8333在麸皮培养基发酵生产凝乳酶的方法，包括以下步骤：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子液接种于麸皮培养基进行发酵，以250mL锥形瓶为标准装液量为20～40mL，发酵温度为28℃～32℃，发酵时间为16～20小时，获得具有凝乳酶活性的发酵液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子液由包括以下步骤的方法制备而得：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于TYC培养基，28～32℃活化培养18～20小时后，即得种子液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子液的接种量为4～6％，所述百分比为体积百分比。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的麸皮培养基包括麸皮和水，其中麸皮含量为2％～6％，所述百分比为质量百分比。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的麸皮培养基中麸皮的含量为3％，所述百分比为质量百分比。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的装液量是29mL。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵温度是30℃。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵时间是18小时。
9.如权利要求1所述的方法，其特点在于，所述的发酵温度为30℃，装液量为29mL，发酵时间为18小时。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵使用振荡培养，转速为300r/min。
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CN105018450A (zh) * 2015-07-13 2015-11-04 光明乳业股份有限公司 类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶粗提物及制备方法

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