CN105018450A - 类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶粗提物及制备方法 - Google Patents

类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶粗提物及制备方法 Download PDF

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CN105018450A CN201510408813.9A CN201510408813A CN105018450A CN 105018450 A CN105018450 A CN 105018450A CN 201510408813 A CN201510408813 A CN 201510408813A CN 105018450 A CN105018450 A CN 105018450A
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Abstract

本发明公开了一种类芽孢杆菌CGMCC？No.8333的凝乳酶粗提物及其制备方法。所述的方法包括以下的步骤：(1)将保藏编号为CGMCC？No.8333的类芽孢杆菌的种子液以0.4～3.2％的接种量接种于麸皮培养基震荡发酵培养24～72小时得发酵液，所述震荡发酵培养的转速为160～180r/min，所述百分比为体积百分比；(2)将发酵液离心取上清液即可。所述的凝乳酶粗提物，总糖含量少，粘度较低，便于后续进一步的纯化，较好地满足了工业化生产凝乳酶的要求。

Description

类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶粗提物及制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶粗提物及制备方法。
背景技术
与植物来源和动物来源的凝乳酶相比较，微生物来源的凝乳酶具有生产成本低、生化多样性高、基因易改造的优势。目前，越来越多的报道说明微生物的胞外蛋白酶具有凝乳功能，部分微生物的凝乳酶已实现大规模工业化生产，并广泛应用于干酪生产中。能够产生具有一定凝乳作用的胞外蛋白酶的微生物主要属于放线菌、细菌和霉菌等的范畴，包括放线菌中的链霉菌属、小单孢菌属、马杜拉放线菌属，霉菌中根霉、总状毛霉、微小毛霉、米黑毛霉、易脆毛霉，细菌中粟疫菌、寄生内座壳菌以及其他通过基因工程或辐照获得的高产凝乳酶的菌株。
将凝乳酶从发酵上清中分离出来并实现凝乳酶的高效回收是分离纯化、酶学性质研究以及工业化生产凝乳酶的前提和基础。常用的分离方法有盐析法、有机溶剂沉淀法(乙醇、丙酮)以及等电点法。然而这些方法适用于发酵上清黏度很低或不含有微生物胞外多糖的情况。因此，探索开发一种能够有效降低发酵液中糖类含量的发酵方式，对于分离纯化微生物源凝乳酶有着重要的意义。
中国专利申请(CN103740618A)公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种类芽孢杆菌BD3526，Paenibacillusdamxungensissp.nov.，并且芽孢杆菌BD3526于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性。但是目前没有从该菌株中获得多糖含量较少的凝乳酶的记载。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对目前利用类芽孢杆菌麸皮发酵物制备凝乳酶时，所得的发酵物粘稠难以将凝乳酶纯化分离，所得的凝乳酶回收率低，难以满足大规模工业化生产的要求的不足，提供一种类芽孢杆菌CGMCC No.8333的凝乳酶粗提物及其制备方法。该方法在保证凝乳酶凝乳活力的前提下，有效降低了因多糖导致的发酵物黏度增加对凝乳酶提取分离的影响。利用本发明所述的方法获得的凝乳酶多糖等杂质含量较少，便于大规模工业化生产。
本发明的发明人发现，由于类芽孢杆菌CGMCC No.8333的发酵液中胞外多糖含量较高造成所得类芽孢杆菌发酵液较为粘稠，采用乙醇沉淀类芽孢杆菌CGMCC No.8333的发酵液时，多糖类代谢产物易伴随蛋白质沉淀析出。使离心后的上清液存在大量的糖类，粘度过大，为后续凝乳酶的分离纯化带来一定的困难。然而通过适当延长类芽孢杆菌的发酵培养时间、改变接种量以及降低摇床转速等培养方式，能使发酵液中的胞外多糖物质被类芽孢杆菌代谢，降低培养物中胞外多糖类物质含量，同时结合后续发酵液的提纯工艺，能够进一步降低所得凝乳酶中的杂质，以提高类芽孢杆菌凝乳酶的回收率。
本发明提供一种制备类芽孢杆菌CGMCC No.8333的凝乳酶粗提物的方法，其包括以下的步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的种子液以0.4～3.2％的接种量接种于麸皮培养基震荡发酵培养24～72小时得发酵液，所述震荡发酵培养的转速为160～180r/min，所述百分比为体积百分比；
(2)将步骤(1)所得的发酵液离心取上清液即得凝乳酶粗提物。
步骤(1)为：将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的种子液以0.4～3.2％的接种量接种于麸皮培养基震荡发酵培养24～72小时得发酵液，所述震荡发酵培养的转速为160～180r/min，所述百分比为体积百分比。其中，所述种子液的获得方式为本领域常规的获得方式。较佳地，将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌在种子培养基上进行种子培养获得种子液。所述的种子培养的培养基为本领域常规的培养基，较佳地为TYC培养基，更佳地由以下组分组成：酪蛋白胨或胰蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸钠20g/L，Na2SO40.1g/L，NaCl 1g/L，Na2HPO4·12H2O 2g/L，NaHCO32g/L，琼脂15～20g/L，余量为水。所述种子培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为20小时。所述种子培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为30℃。所述的麸皮培养基为本领域常规的麸皮培养基，其包括麸皮和水。所述的麸皮为本领域常规的麸皮，较佳地为小麦麸皮。所述麸皮的含量为本领域常规的含量，较佳地为1％～5％，更佳地为2％，所述百分比为质量百分比。较佳地，所述发酵培养在锥形瓶中进行，更佳地在250mL锥形瓶中进行。所述锥形瓶中所述的麸皮培养基的装液量为本领域常规装液量，较佳地为50mL。所述发酵培养的时间为24～72h，较佳地为48～72h，更佳地为72h。所述种子液的接种量为0.4～3.2％，较佳地为0.8～3.2％，更佳地为0.8％，所述百分比为体积百分比。所述震荡发酵培养的转速为160～180r/min，较佳地为160～170r/min，更佳地为160r/min。所述发酵培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为28～30℃，更佳地为30℃。
步骤(2)为：将步骤(1)所得的发酵液离心取上清液即得凝乳酶粗提物。其中，所述离心完成后，初步获得了凝乳酶含量较高的粗提物。所述离心的时间为本领域常规的时间，较佳地为10～15分钟。所述离心的温度为本领域常规的温度，较佳地为4℃。所述离心的速度为本领域常规的速度，较佳地为15000g。
本发明提供一种由所述方法制得的凝乳酶粗提物。
所述的凝乳酶粗提物为浅棕色粉末状固体，且所述的凝乳酶粗提物中凝乳酶活力达到2285.71SU/mL，相对高转速(300r/min)摇床培养，总糖含量由3.71mg/mL降低至1.33mg/mL，总糖含量降低了64.2％；相对于短时发酵(12h)，糖含量降低72.68％；相对于高菌体接种浓度(4.0％)，糖含量降低80.41％。因此，利用本发明所述的方法制得的凝乳酶粗提物，总糖含量少，粘度较低，便于后续进一步的纯化，较好地满足了工业化生产凝乳酶的要求。
较佳地，所述的方法还包括以下的步骤：
(3)将步骤(2)所得上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵的饱和度为50～75％，静置混合液，离心收集沉淀物；
(4)将步骤(3)所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。
步骤(3)为：将步骤(2)所得上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵的饱和度为50～75％，静置混合液，离心收集沉淀物。其中，较佳地，所述混合液中硫酸铵的饱和度为60％。所述静置的温度为本领域常规的温度，较佳地为2～6℃。所述静置的时间为本领域常规的时间，较佳地为0～5小时，更佳地为2小时。所述离心的时间为本领域常规的时间，较佳地为15分钟。所述离心的温度为本领域常规的温度，较佳地为4℃。
步骤(4)为：将步骤(3)所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。其中，所述溶解的溶剂为本领域常规的溶剂，较佳地为水或PBS溶液。所述的PBS溶液为本领域常规的PBS溶液，较佳地为0.02mol/L、pH 7.0的PBS溶液。所述离心的时间为本领域常规的时间，较佳地为15分钟。所述离心的温度为本领域常规的温度，较佳地为4℃。所述离心的速度为本领域常规的速度，较佳地为5000g。所述离心的步骤的目的是回收率残留在凝乳酶中不溶解的杂质，如菌体、培养基和其他的代谢产物等。较佳地，还包括将步骤(4)所述的上清液冻干的步骤。所述的冻干为本领域常规的冻干，能够将上清液冷冻干燥即可。
本发明提供一种由上述的方法制备获得的凝乳酶。
本发明所述的类芽孢杆菌BD3526，由西藏当雄县采集的牦牛乳样品中分离获得，但不仅限于所述的来源。本发明所用的类芽孢杆菌BD3526已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，经鉴定为类芽孢杆菌(Paenibacillusdamxungensissp.nov.)，并获得保藏编号CGMCCNo.8333。类芽孢杆菌BD3526在中国专利申请CN103740618A中公开，该专利申请的全文为本发明所引用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的方法在保证凝乳酶活力及其回收率的前提下，通过适当延长类芽孢杆菌的发酵培养时间、调整接种量以及摇床转速等参数，能使发酵液中的胞外多糖的含量降低，同时结合后续发酵液的提纯工艺，能够进一步降低所得凝乳酶中的杂质，以提高类芽孢杆菌凝乳酶的回收率。使所得的凝乳酶粗提物，总糖含量少，粘度降低，能够较好的满足工业化生产凝乳酶的需求。
附图说明
图1为不同的接种量对上清液中总糖含量的影响。
图2为不同的摇床转速对上清液中总糖含量的影响。
图3为不同的发酵时间对上清液中总糖含量的影响。
图4为不同的摇床转速对上清液中粘度、总糖浓度和凝乳酶活性的影响。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述的“室温”是指常规的操作室内温度，一般为10～30℃。
实施例中所述的各个试剂若无特别说明均为分析纯试剂，购自国药集团。
实施例中所述的凝乳酶活力(MCA)值的测得包括以下的步骤：
将类芽孢杆菌BD3526接种至TYC培养基(所述TYC培养基由以下组分组成：酪蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸钠20g/L，Na2SO40.1g/L，NaCl 1g/L，Na2HPO4·12H2O 2g/L，NaHCO32g/L，琼脂15g/L，余量为水)中35℃、180r/min培养16h作为种子使用，按9％的接种至250mL锥形瓶中装有20mL的1％小麦麸皮培养基中并混匀，于20℃，300r/min的条件下，震荡培养18h。培养结束后，称取5mL培养好的小麦麸皮培养基经4℃，9000r/min离心后得到的上清即为含有凝乳酶的粗提物。
将制备得到的500μL的粗酶液按照下述方法进行凝乳实验，凝乳酶活力(milk clotting activity，MCA)测定方法包括以下步骤：
将脱脂奶粉以10％(w/v)的比例配置成pH 6.0含有10mmol/L CaCl2的溶液，在35℃水浴中孵育10min后，将500μL的凝乳酶加入至35℃的10mL脱脂乳溶液中，每15s将样品取出并倾斜45℃观察样品组织状态，以形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间。1个凝乳酶单位(Soxhlet unite，SU)定义为35℃条件下，使1mL脱脂乳在40min发生凝乳所需的酶量。
其中，T表示凝乳时间，单位为秒；VS表示底物体积，单位为mL；VE表示酶液体积，单位为mL；D表示稀释倍率。
实施例中所述的糖含量的测得包括以下的步骤：
制作标准曲线：准确称取标准葡萄糖10mg于10mL容量瓶中，加水至刻度配制成葡萄糖标准液；分别吸取2、5、10、50和100μL葡萄糖标准液，分别添加蒸馏水补至200μL，然后加入5％苯酚1.0mL及98％硫酸5.0mL，摇匀冷却，所述百分比为质量百分比；室温放置20分钟后，于490nm测光密度，以2.0mL蒸馏水作为空白对照，得标准曲线y＝0.002x+0.043
R2＝0.9984(x表示总糖浓度)。
样品中总糖含量的测定：吸取用pH7.0、0.02mol/L的PBS溶液稀释后的凝乳酶的粗提物200μL，然后加入5％苯酚0.4mL及浓硫酸2mL，所述百分比为质量百分比；摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以200μL蒸馏水作为空白对照，依据标准曲线计算样品总糖含量mg/mL。
实施例中所述的粘度值的测得包括以下的步骤：
使用proRheo-R180型号粘度计，调节转速1000rpm，操作环境温度10℃，将样品倒入样品槽内，转子旋转10s后测定度数即可。
实施例1
将类芽孢杆菌BD3526接种于TYC培养基中30℃种子培养20小时获得种子液，所述TYC培养基由以下组分组成：酪蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸钠20g/L，Na2SO40.1g/L，NaCl 1g/L，Na2HPO4·12H2O 2g/L，NaHCO32g/L，琼脂15g/L，余量为水。
将0.8％(v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分比为体积百分比，30℃、摇床震荡速度160r/min发酵培养72小时得BD3526发酵液。所述麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为2％，余量为水。
将BD3526发酵液于4℃、15000g条件下离心15分钟后收集上清液，得凝乳酶粗提物。使用0.02mol/L、pH7.0的PBS溶液将凝乳酶粗提物稀释3倍，测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力(SU/mL)、总糖含量(mg/mL)和粘度(Pa·S)值，测定结果如表1所示。
将硫酸铵固体粉末缓慢加入至凝乳酶粗提物中溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的60％，混合均匀后4℃静置2小时；静置后于4℃、15000g离心15分钟，得沉淀物。
将沉淀物用pH7.0、0.02mol/L的PBS溶液溶解后，4℃，15000g条件下离心10分钟，弃沉淀，将上清液进行冻干处理，得到类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳酶。
表1凝乳酶粗提物测定结果
实施例2
将类芽孢杆菌BD3526接种于TYC培养基中30℃种子培养20小时获得种子液，所述TYC培养基由以下组分组成：胰蛋白胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸钠20g/L，Na2SO40.1g/L，NaCl 1g/L，Na2HPO4·12H2O 2g/L，NaHCO32g/L，琼脂20g/L，余量为水。
将0.4％(v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分比为体积百分比，28℃、摇床震荡速度180r/min发酵培养24小时得BD3526发酵液。
将BD3526发酵液于4℃、15000g条件下离心15分钟后收集上清液，得凝乳酶粗提物。将硫酸铵固体粉末缓慢加入至凝乳酶粗提物中溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的60％，混合均匀后2℃静置0小时。
其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力(SU/mL)、总糖含量(mg/mL)和粘度(Pa·S)值，测定结果如表2所示。
表2凝乳酶粗提物测定结果
实施例3
将3.2％(v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分比为体积百分比，30℃、摇床震荡速度180r/min发酵培养48小时得BD3526发酵液。
将BD3526发酵液于4℃、15000g条件下离心15分钟后收集上清液，得凝乳酶粗提物。将硫酸铵固体粉末缓慢加入至凝乳酶粗提物中溶解，至硫酸铵的浓度达到饱和度的60％，混合均匀后6℃静置5小时。
其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力(SU/mL)、总糖含量(mg/mL)和粘度(Pa·S)值，测定结果如表3所示。
表3凝乳酶粗提物测定结果
实施例4
所述麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为1％，余量为水。
将0.8％(v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分比为体积百分比，30℃、摇床震荡速度180r/min发酵培养24小时得BD3526发酵液。
其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力(SU/mL)、总糖含量(mg/mL)和粘度(Pa·S)值，测定结果如表4所示。
表4凝乳酶粗提物测定结果
实施例5
所述麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为5％，余量为水。
将1.6％(v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分比为体积百分比，30℃、摇床震荡速度170r/min发酵培养72小时得BD3526发酵液。
其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力(SU/mL)、总糖含量(mg/mL)和粘度(Pa.S)值，测定结果如表5所示。
表5凝乳酶粗提物测定结果
实施例6
将2.4％(v/v)种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分比为体积百分比，30℃、摇床震荡速度160r/min发酵培养48小时得BD3526发酵液。
其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力(SU/mL)、总糖含量(mg/mL)和粘度(Pa.S)值，测定结果如表6所示。
表6凝乳酶粗提物测定结果
实施例7
分别将0.4％、0.8％、1.6％、2.0％、2.4％和3.2％(v/v)的种子液接种于含有50mL麸皮培养基的250mL锥形瓶中，所述百分比为体积百分比，其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
测定凝乳酶粗提物中的总糖含量(mg/mL)，测定结果如表7所示(参见图1)。
表7凝乳酶粗提物测定结果
表7的结果说明，BD3526麸皮培养液中的总糖含量，随着TYC种子液的加入量的增加，其糖含量也不断增加，可以看出种子液的接入量对于发酵上清糖含量有重要的影响。
实施例8
30℃、摇床震荡速度分别为160r/min、170r/min和180r/min，发酵培养48小时得BD3526发酵液。
其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
测定凝乳酶粗提物中的总糖含量(mg/mL)，测定结果如表8所示(参见图2)。
表8凝乳酶粗提物测定结果
表8的结果说明，BD3526麸皮发酵液中的总糖含量，与锥形瓶培养过程中转速也有着密切关系。在160～180r/min范围内，随着摇床转速的增加，发酵上清的总糖含量也不断增加。
实施例9
分别发酵培养24、48和96小时得BD3526发酵液。
其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
测定凝乳酶粗提物中的总糖含量(mg/mL)，测定结果如表9所示(参见图3)。
表9凝乳酶粗提物测定结果
表9的结果说明，随着摇床培养时间的延长，发酵液上清中总糖含量不断降低，可能是部分糖类被菌种利用代谢，因此，麸皮培养BD3526时间对发酵液上清总糖含量也有较大的影响作用。
对比实施例1
分别将0.1％、0.2％、3.6％和4.0％(v/v)的种子液接种于麸皮培养基中。
其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力(SU/mL)、总糖含量(mg/mL)和粘度(Pa.S)值，测定结果如表10所示。
表10凝乳酶粗提物测定结果
对比实施例2
设定摇床发酵培养的温度30℃，摇床的震荡的速度为160r/min，分别培养6小时、12小时、84小时、96小时，收集BD3526发酵液；
其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力(SU/mL)、总糖含量(mg/mL)和粘度(Pa.S)值，测定结果如表11所示。
表11凝乳酶粗提物测定结果
对比实施例3
30℃、摇床震荡速度分别为140r/min、170r/min和300r/min，发酵培养48小时得BD3526发酵液。
其余条件和操作步骤均与实施例1完全相同。
测定凝乳酶粗提物中凝乳酶活力(SU/mL)、总糖含量(mg/mL)和粘度(Pa.S)值，测定结果如表12所示(参见图4)。
表12凝乳酶粗提物测定结果
表10～12说明，摇床转速、接种量以及发酵时间对粗凝乳酶溶液中的糖含量影响较大。一定范围内，摇床转速越低、接种量越少、发酵时间越长，发酵上清液中糖含量就越低，则其测定的粘度也越低，但超出本专利申请发明内容中设定的相关发酵参数的数据范围，如转速过低、发酵时间过长时，则均会严重影响发酵液凝乳酶活力，而转速过快则会大量增加发酵液中糖含量。同时，发酵液中糖含量越高，液体粘度越高，离心后上清液越浑浊，会使上清黏度越大，且沉淀底部白色沉淀层越厚。
因此，将类芽孢杆菌BD3526按0.4％～3.2％(体积百分数)接种于麸皮培养基中震荡发酵培养，设定摇床温度为30℃，摇床转速160r/min～180r/min，连续培养24～72小时，在此较佳工艺条件下所得的发酵上清凝乳酶活力可以达到2285.71SU/mL，在保证凝乳酶酶活的前提下，糖含量可以降低至1.33mg/mL，相对于高转速(300r/min)摇床培养，糖含量可大幅降低64.2％；相对于短时发酵(12小时)，糖含量降低72.68％；相对于高接种量(4.0％)，糖含量降低80.41％。因此，通过优化后的发酵条件，可有效地降低了发酵过程中糖含量和发酵液粘度，易于工厂化操作。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备类芽孢杆菌CGMCC No.8333的凝乳酶粗提物的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的种子液以0.4～3.2％的接种量接种于麸皮培养基震荡发酵培养24～72小时得发酵液，所述震荡发酵培养的转速为160～180r/min，所述百分比为体积百分比；
(2)将步骤(1)所得的发酵液离心取上清液即得凝乳酶粗提物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为48～72小时。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述震荡发酵培养的转速为160～170r/min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子液的接种量为0.8～3.2％，所述百分比为体积百分比。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCCNo.8333的类芽孢杆菌在种子培养基上进行种子培养获得种子液；所述的种子培养基为TYC培养基；所述种子培养的时间为20小时；所述种子培养的温度为30℃；所述的麸皮培养基包括麸皮和水，所述麸皮的含量为1％～5％，所述百分比为质量百分比；和/或，所述麸皮为小麦麸皮。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28～30℃；步骤(2)所述离心的时间为15分钟；所述离心的温度为4℃；和/或，所述离心的速度为15000g。
7.一种由权利要求1～6任一项所述的方法制得的凝乳酶粗提物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括以下的步骤：
(3)将步骤(2)所得上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵的饱和度为50～75％，静置混合液，离心收集沉淀物；
(4)将步骤(3)所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述混合液中硫酸铵的饱和度为60％；步骤(3)所述静置的温度为2～6℃；步骤(3)所述静置的时间为0～5小时；步骤(4)中所述的溶解的溶剂为水或PBS溶液；和/或，步骤(4)还包括将步骤(4)所述上清液冻干的步骤。
10.一种由权利要求8～9任一项所述的方法制得的凝乳酶。
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