CN102994427A

CN102994427A - 利于家禽生长的胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备法及所用菌

Info

Publication number: CN102994427A
Application number: CN2012104948697A
Authority: CN
Inventors: 胡秀芳; 伍渡清; 钱鹏
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2012-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2013-03-27

Abstract

本发明公开了一种胶质类芽孢杆菌，保藏名称为：胶质类芽孢杆菌YC-13﹟（Paenibacillus mucilaginosus YC-13﹟），保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年10月16日，保藏号：CCTCC No: M 2012406。本发明还同时公开了上述胶质类芽孢杆菌的用途：制备利于家禽生长的饲料添加剂。本发明还同时公开了一种利于家禽生长的胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备方法，包括菌株活化、发酵培养、提取粗多糖。

Description

利于家禽生长的胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备法及所用菌

技术领域

本发明涉及一种利于家禽生长的胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备法及所用菌。

背景技术

微生物多糖是细菌、真菌和蓝藻等微生物在次生代谢过程中产生的对微生物有保护作用的生物高聚物。近年来，越来越多的细菌多糖在生产和生活中发挥着广泛的作用，这些细菌多糖可以在人工控制条件下利用各种废渣、废液进行生产，减轻了环保压力，应用前景比动植物多糖更为广阔。美国生物技术副产品协会(the biotechnology byproducts consortium，简称BBC，主要致力于增加农产品的附加值及防治农业活动中所产生的污染物)近年来的研究调查显示细菌多糖的应用已成为当前生物产品在农业领域中应用的五大主题之一。

随着畜禽业的迅速发展，畜禽养殖业规模呈逐年扩大趋势。现在畜禽养殖已从过去的粗放养殖转向高密度、集约化养殖，因此对配合饲料的需求量越来越大。在配合饲料中，促生长剂和抗生素的应用日益普及。促生长剂是指可刺激畜禽生长，提高畜禽增重速率和饲料利用率，并增进畜禽动物健康的添加剂。多糖作为免疫调节剂代替或部分代替促生长剂和抗生素显示了巨大的潜力，其中植物和真菌多糖作为饲料添加剂的研究较为普遍，而细菌多糖用于畜禽养殖的报道较为鲜见。细菌多糖来源广泛，生产周期短、成本低，因此相对于植物、真菌多糖更具优势。

胶质类芽孢杆菌因具固氮、解钾、解磷与生物吸附等功能而广泛用于农业、冶金及环保领域。作为微生物肥料，胶质类芽孢杆菌已有20多年的应用历史。胶质类芽孢杆菌的重要特征是产生丰厚的荚膜多糖，其分子量可达2.6×10⁶ D，富含羧基和羟基的高分子多糖可高效络合离子、吸附悬浮颗粒和胶体物质，近几年作为絮凝剂、络合剂在废水处理和生物冶金行业中的应用研究极其活跃。2003年有报道将胶质类芽孢杆菌用于生产保健饮料。利用该菌荚膜多糖作为家禽饲料添加剂未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备方法及所用菌株。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种胶质类芽孢杆菌，保藏名称为：胶质类芽孢杆菌YC-13﹟（Paenibacillus mucilaginosus YC-13﹟），保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年10月16日，保藏号：CCTCC No:M 2012406。

该菌以下简称胶质类芽孢杆菌CCTCC 2012406。

本发明还同时提供了上述胶质类芽孢杆菌的用途：利于和促进家禽生长。

本发明还同时提供了利于家禽生长的胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备方法，包括以下步骤：

1）、菌株活化：

胶质类芽孢杆菌CCTCC 2012406经选择性培养基于27~29 ℃（最佳为28℃）活化培养22~26 h（最佳为24h），然后接种于种子菌生产培养基中，于27~29℃（最佳为28℃），摇床转速200~250r/min （最佳为220r/min）培养22~26 h（最佳为24h），得种子菌；

2）、发酵培养：

将种子菌按9~11%（最佳为10%）体积比的接种量接种于液体发酵培养基中，在29~31℃（最佳为30℃），摇床转速200~250r/min（最佳为220r/min）条件下发酵培养60~96 h （最佳为72 h），得发酵液；

3）、提取粗多糖：

在发酵液中加入2~3体积倍的灭菌去离子水进行稀释；然后离心（离心目的为去除菌体），收集上清；将所得的上清减压浓缩，所得的浓缩液用体积浓度为94~96%（最佳为95%）酒精进行醇沉；

备注说明：所得的浓缩液约为发酵液体积的1/2~1/4；浓缩液与酒精的体积比一般为1：2~4；

所得的沉淀用体积浓度为94~96%（最佳为95%）酒精进行洗涤，然后经冷冻处理，得胶质类芽孢杆菌粗多糖。

备注说明：冷冻处理为：先于低温（-80℃）冰箱冷冻处理12 h，再于-110℃冻干处理16~24小时。

作为本发明的胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备方法的改进：

选择性培养基为：蔗糖 7.8~8.2g/L，NaH₂PO₄ 0.7~0.9g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4~0.6 g/L，CaCO₃ 0.08~0.12 g/L，琼脂粉 16.5~17.5g/L，其余为水；pH 7.0；

种子菌生产培养基为：蔗糖9.5~10.5 g/L，K₂HPO₄ 0.4~0.6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4~0.6g/L，（NH₄）SO₄ 1.8~2.2 g/L，CaCO₃ 0.08~0.12 g/L，其余为水；pH 7.5；

液体发酵培养基为：蔗糖14.5~15.5 g/L，K₂HPO₄ 0.4~0.6 g/L，MgSO₄·7H2O 0.4~0.6 g/L，FeCl₃ 0.08~0.12 g/L，CaCO₃1.4~1.6 g/L，其余为水；pH 7.5。

作为本发明的胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备方法的进一步改进：

选择性培养基为：蔗糖 8.0g/L，NaH₂PO₄ 0.8 g/L，MgSO₄·7H₂O0.5 g/L，CaCO₃ 0.1 g/L，琼脂粉 17 g/L，其余为水；pH 7.0；

种子菌生产培养基为：蔗糖10.0 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，（NH₄）SO₄ 2.0 g/L，CaCO₃ 0.1 g/L，其余为水；pH 7.5；

液体发酵培养基为：蔗糖15.0 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H2O 0.5 g/L，FeCl₃ 0.1 g/L，CaCO₃ 1.5 g/L，其余为水；pH 7.5。

本发明制备而得的胶质类芽孢杆菌粗多糖作为饲料添加剂用于家禽养殖，以代替或部分代替促生长剂和抗生素，促进家禽绿色养殖。

胶质类芽孢杆菌粗多糖实际使用时，研细后添加于基础饲料中，充分混匀，从而获得改进型家禽饲料；每1kg基础饲料中添加1~7 g的胶质类芽孢杆菌粗多糖。

基础饲粮组成及营养水平见下表1：

表1 基础饲粮组成及营养水平（%）

备注说明：

^（1）预混料可为每千克全价料提供：VA 8500 IU，VD3 3000 IU，VE20 IU，VK 2 mg，VB1 3 mg，核黄素 8 mg，泛酸 10 mg，VB5 36 mg，VB6 4 mg，VB12 0.018 mg，生物素 0.15 mg，叶酸 1.0 mg，胆碱 650.0 mg，Fe 80 mg，Cu 8 mg，I0.40 mg，Se 0.25 mg。

^（2）营养水平为计算值。

本发明的利于家禽生长的胶质类芽孢杆菌粗多糖属于一种细菌多糖；其制备方法选择了以胶质类芽孢杆菌作为生产菌，胶质类芽孢杆菌营养要求简单，所需培养用的营养物质来源广泛，价格低廉，因此胶质类芽孢杆菌用于多糖生产具有降低成本的优点。

本发明具有以下优点：一、通过培养基优化，本发明的胶质类芽孢杆菌粗多糖发酵生产时间缩短，使生产成本得以显著降低；二、添加适量本发明所得的细菌多糖（即，胶质类芽孢杆菌粗多糖）在家禽饲养过程中，结合饲养技术，通过30 ~ 45 d饲养，家禽摄食量和体重增加显著，而料肉比显著降低。

综上所述，本发明利用胶质芽孢杆菌制备细菌多糖，所得的胶质类芽孢杆菌粗多糖能作为利于家禽生长的饲料添加剂，不仅拓展了该菌的应用范围，并且得到了不错的养殖效果。

具体实施方式

实施例1、胶质类芽孢杆菌YC—13菌株的获取：

土样采集地点：杭州下沙元城草莓大棚。

土样采集：采用S形5点取样混合法进行采样，先去浮土，采集耕层0~20cm土壤，每点采集土壤500g，将5个点的土壤混合均匀，以五分法取其中的500g作为一个土样装入灭菌袋中，4℃保存土样。

分离纯化：称取5g土样至无菌三角瓶中，加入45ml无菌水，200rpm振荡15min，静置5min，即为菌悬液原液，取10^-1、10^-2和10^-3菌悬液稀释液（即稀释10倍、100倍、1000倍）100μl涂板。将平板置于30℃培养箱培养48hr，挑选具有胶质芽孢杆菌典型特征的大菌落(菌落圆形，如半粒玻璃球；突起，凸起度大于45度；无色透明，边缘透明；表面光滑，粘稠，弹性大，可拉成丝状)，多次划线培养纯化。

将纯化所得的菌株进行保藏，保藏名称为：胶质类芽孢杆菌YC-13﹟（Paenibacillus mucilaginosus YC-13﹟），保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年10月16日，保藏号：CCTCC No: M 2012406。

该菌株以下简称胶质类芽孢杆菌CCTCC 2012406。

实施例2、一种胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备方法，选用胶质类芽孢杆菌CCTCC 2012406作为生产菌；依次进行以下步骤：

1）、菌株活化：

胶质类芽孢杆菌CCTCC 2012406经选择性培养基于28 ℃活化培养24h，然后挑取单个菌落接种于种子菌生产培养基100ml中，于28℃，摇床转速220r/min 培养24 h，得种子菌。

选择性培养基的制备方法为：在蔗糖 8.0g、NaH₂PO₄ 0.8 g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、CaCO₃ 0.1 g、琼脂粉 17g中，加水定容至1L；然后用10mol/L NaOH调节pH7.0，121℃灭菌20分钟。

种子菌生产培养基的制备方法为：在蔗糖10.0 g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、（NH₄）SO₄ 2.0g 、CaCO₃ 0.1 g中，加水定容至1L；然后用10mol/L NaOH调节pH7.5，121℃灭菌20分钟。

2）、发酵培养：

将种子菌按10%体积比的接种量接种于液体发酵培养基中，在30℃，摇床转速220r/min条件下发酵培养72 h，得发酵液。

液体发酵培养基的制备方法为：在蔗糖15.0 g、K₂HPO₄ 0.5 g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、FeCl₃ 0.1 g、CaCO₃ 1.5 g中，加水定容至1L；然后用10mol/L NaOH调节pH7.5，121℃灭菌20分钟。

3）、提取粗多糖：

在发酵液中加入2.5体积倍的灭菌去离子水进行稀释；然后8000r/min离心（离心目的为去除菌体），收集上清；将所得的上清常温（即20~25℃）减压（50mPa）浓缩，所得的浓缩液约为发酵液体积的1/3。

浓缩液用体积浓度为95%（体积浓度）酒精进行醇沉，浓缩液与95%该酒精的体积比为1：3；

所得的沉淀用体积浓度为95%酒精进行反复洗涤（洗涤次数一般为2~3次，每次的用量约为：5ml酒精/1g沉淀）；

上述洗涤后的沉淀于低温（-80℃）冰箱冷冻处理12 h，再于-110℃冻干处理16~24小时；得胶质类芽孢杆菌粗多糖。

实验1、

1）、从购自浙江余姚神农畜禽有限公司的鸡苗中随机选取7日龄、健康的、大小均一（体重为40.0±1.5g）的鸡苗44羽；随机分成4组；分别为：空白处理组、实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ；

空白处理组喂食基础饲粮；

实验组Ⅰ喂食改进型饲料Ⅰ，改进型饲料Ⅰ为在每1kg基础饲料中添加1g的胶质类芽孢杆菌粗多糖。

实验组Ⅱ喂食改进型饲料Ⅱ，改进型饲料Ⅱ为在每1kg基础饲料中添加4g的胶质类芽孢杆菌粗多糖；

实验组Ⅲ喂食改进型饲料Ⅲ，改进型饲料Ⅲ为在每1kg基础饲料中添加7g的胶质类芽孢杆菌粗多糖。

上述基础饲料均为如表1所示的基础饲料。

将上述空白处理组、实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ均进行如下的饲养管理。

2）、饲养管理：

投饲量：前20d日投饲量每日每羽按日龄+2 g的量进行投喂，20d后每日每羽按日龄+1g的量进行投喂；

给水量：给水量每日每羽按投饲量的2倍进行给水；

剩料量：将每日剩余的饲粮收集起来，准确称量，并做好数据记录；

体重称量：每4d进行一次体重称量，即第4d早上投喂饲粮前进行空腹称量，并做好数据记录。

3）、结果：

饲养管理16d后，记录每羽总摄食量、净增重、日均增重率、料肉比。具体如表2所示。

表2

	每羽总摄食量	净增重	日均增重率	料肉比
					空白处理组	249.59g	72.32g	9.70%	3.45
实验组Ⅰ	261.63g	77.41g	10.23%	3.38
					实验组Ⅱ	267.10g	84.71g	10.80%	3.15
实验组Ⅲ	253.75g	72.34g	9.91%	3.51

根据上述表2所述的数据对比，我们可得知：改进型饲料Ⅱ（在每1kg基础饲料中添加4g的胶质类芽孢杆菌粗多糖）的饲养效果最佳。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.胶质类芽孢杆菌，其特征是：保藏名称为：胶质类芽孢杆菌YC-13﹟（Paenibacillus mucilaginosus YC-13﹟），保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2012年10月16日，保藏号：CCTCC No: M 2012406。

2.如权利要求1所述的胶质类芽孢杆菌的用途，其特征是：制备利于家禽生长的饲料添加剂。

3.利于家禽生长的胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备方法，其特征是包括以下步骤：

1）、菌株活化：

胶质类芽孢杆菌CCTCC 2012406经选择性培养基于27~29 ℃活化培养22~26 h，然后接种于种子菌生产培养基中，于27~29℃，摇床转速200~250r/min 培养22~26 h，得种子菌；

2）、发酵培养：

将种子菌按9~11%体积比的接种量接种于液体发酵培养基中，在29~31℃，摇床转速200~250r/min条件下发酵培养60~96 h，得发酵液；

3）、提取粗多糖：

在发酵液中加入2~3体积倍的灭菌去离子水进行稀释；然后离心，收集上清；将所得的上清减压浓缩，所得的浓缩液用体积浓度为94~96%酒精进行醇沉；

所得的沉淀用体积浓度为94~96%酒精进行洗涤，然后经冷冻处理，得胶质类芽孢杆菌粗多糖。

4.根据权利要求3所述的胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备方法，其特征是：

所述选择性培养基为：蔗糖 7.8~8.2g/L，NaH₂PO₄ 0.7~0.9g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4~0.6 g/L，CaCO₃ 0.08~0.12 g/L，琼脂粉 16.5~17.5g/L，其余为水；pH 7.0；

所述种子菌生产培养基为：蔗糖9.5~10.5 g/L，K₂HPO₄ 0.4~0.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4~0.6g/L，（NH₄）SO₄ 1.8~2.2 g/L，CaCO₃ 0.08~0.12 g/L，其余为水；pH 7.5；

所述液体发酵培养基为：蔗糖14.5~15.5 g/L，K₂HPO₄ 0.4~0.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4~0.6 g/L，FeCl₃ 0.08~0.12 g/L，CaCO₃ 1.4~1.6 g/L，其余为水；pH 7.5。

5.根据权利要求3或4所述的胶质类芽孢杆菌粗多糖的制备方法，其特征是：

所述选择性培养基为：蔗糖 8.0g/L，NaH₂PO₄ 0.8 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，CaCO₃ 0.1 g/L，琼脂粉 17 g/L，其余为水；pH 7.0；

所述种子菌生产培养基为：蔗糖10.0 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，（NH₄）SO₄ 2.0 g/L，CaCO₃ 0.1 g/L，其余为水；pH 7.5；

所述液体发酵培养基为：蔗糖15.0 g/L，K₂HPO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，FeCl₃ 0.1 g/L，CaCO₃ 1.5 g/L，其余为水；pH 7.5。