CN109266581A - 一株嗜热链球菌及其应用 - Google Patents

一株嗜热链球菌及其应用 Download PDF

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CN109266581A CN201811179177.7A CN201811179177A CN109266581A CN 109266581 A CN109266581 A CN 109266581A CN 201811179177 A CN201811179177 A CN 201811179177A CN 109266581 A CN109266581 A CN 109266581A
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姚国强
其木格苏都
高鹏飞
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Beijing Scitop Bio Tech Co ltd
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
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Abstract

本申请提供一株分离的嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)，其微生物保藏编号为CGMCC No.16129，该嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S10发酵豆乳能力良好、能够有效去除发酵豆乳制品中的豆腥气味，而且，该嗜热链球菌S10具有良好的产酸、产黏、产香能力等特点。本申请还提供该菌株在发酵乳品以及制备乳品发酵剂中的用途。

Description

一株嗜热链球菌及其应用
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，特别涉及一株嗜热链球菌及其应用。
背景技术
豆乳具有丰富的植物蛋白、不饱和脂肪酸、膳食纤维和维生素等营养成分，是一种营养 价值较高的天然植物蛋白饮料。但是未经发酵的豆乳中营养成分的活性较低，豆乳经过乳酸 菌发酵后能够形成类似于酸牛乳的发酵豆乳制品，经过发酵后，豆乳中的糖苷型大豆异黄酮 能够转化为生物活性更高的游离型大豆异黄酮，使大豆异黄酮更易被吸收，表现出更强的生 物活性，如抗氧化作用等，而且，发酵豆乳制品中B维生素的活性增强，甚至还可以产生具 有降低血压作用的ACE抑制肽(血管紧张素转化酶抑制肽)以及γ-氨基丁酸等多种益生活性 物质。
发酵豆乳制品是以豆乳为主要原料，可选地以牛乳为辅助原料，通过添加白砂糖、增稠 剂、稳定剂、发酵剂等配料，再经均质、杀菌、冷却、发酵、灌装、冷藏后熟等工艺加工而成的一种发酵型乳制品。
目前，常用用于发酵牛乳的乳酸菌来发酵豆乳，采用这种方案制得的发酵豆乳制品常有 浓重的豆腥气味和发酵而产生的酸腐气味，使得发酵豆乳制品口感差，不易被消费者接受。
发明内容
本申请的目的是提供一株嗜热链球菌，所述嗜热链球菌命名为嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)。
本申请的另一目的是提供豆乳发酵剂嗜热链球菌S10(Streptococcusthermophilus S10) 在制备乳品发酵剂中的应用。
本申请的目的是通过如下技术方案实现的：
本申请所述嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)分离自我国传统发酵乳制 品，具体地，是通过如下方法分离筛选得到的：
嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)分离自我国青海自然发酵酸牛乳中， 通过TPY选择性培养基分离，通过挑取单个菌株扩配得到。
本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.16129；分类命名为：嗜热链球菌Streptococcus thermophilus(Streptococcusthermophilus S10)； 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利 微生物保藏中心)；保藏时间：2018年7月17日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所。
本申请所分离的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S10具有如下生物学特性：嗜 热链球菌(Streptococcus thermophilus)隶属于链球菌属，革兰氏阳性菌。细胞形态呈现圆球 形或者椭圆形，链状排列，且无芽孢无鞭毛，长0.7～1.1μm，宽0.6～0.9μm，呈成对，或短链 状出现，最适生长条件为38～43℃，pH6.0～7.0。
本申请所述的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S10发酵豆乳能力良好、能够有 效去除发酵豆乳制品中的豆腥气味，而且，该嗜热链球菌S10具有良好的产酸、产黏、产香 能力等特点。
所述嗜热链球菌S10的发酵方法包括：将嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus S10) 接入到M17液体培养基，42℃培养24h，继代培养3代，恢复菌株活力，对菌液进行10倍比 稀释，得到10-1～10-7稀释梯度，分别吸取200μL的10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释液，均匀 涂布于M17固体培养基平皿内，42℃厌氧培养24h，挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接 种于液体培养基中，于37℃恒温厌氧培养箱中培养24h，待菌株生长良好后，进行革兰氏染 色、镜检，保存分离株。
本申请的另一目的是提供所述嗜热链球菌S10在发酵乳品，或者制备乳品发酵剂中的用 途，所述乳品包括豆乳和牛乳。
本申请的另一目的是提供一种乳品发酵剂及其用于乳品发酵的用途，所述乳品发酵剂含 有有效含量的所述嗜热链球菌S10和可接受的载体。
根据本申请的具体实施方式，本申请提供的嗜热链球菌S10(Streptococcusthermophilus S10)可以与适量其他常规发酵剂复配，制成复合发酵剂，用于乳制品的发酵。优选地，所述 常规发酵剂包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌和鼠李 糖乳杆菌等中的一种或几种，其中，所述嗜热链球菌不包括本申请所述的嗜热链球菌S10。
特别地，当所述常规发酵剂为上述几种菌种的组合时，在能够顺利进行反应的前提下， 本领域一般技术人员可以对各菌种的用量比例进行合理的调配和选择。
本申请的另一目的是提供一种发酵乳制品，所述发酵乳制品由所述的嗜热链球菌S10或 者所述乳品发酵剂发酵而成。
本申请的另一目的是提供一种利用所述嗜热链球菌S10发酵乳品的方法，所述方法包括： 将所述的嗜热链球菌S10加入灭菌乳品中，隔氧保温反应，所述乳品为豆乳和/或牛乳。
可选地，所述的嗜热链球菌S10的加入量为0.5×106CFU/mL～3×106CFU/mL，优选为1×106 CFU/mL～2×106CFU/mL；保温温度为(42±0.5)℃；保温时间为8～12小时，优选为(9.5-10.5) 小时。
在一种可实现的方式中，利用所述嗜热链球菌S10发酵乳品的方法可以为：将嗜热链球 菌S10加入灭菌豆乳中，接种量为1×106CFU/mL；摇匀震荡(30～50)s，使得所述嗜热链球 菌在乳品中分散均匀，从而有利于菌体生长和发酵；将摇匀后的乳品混合体系置于42℃恒温 培养箱中，42℃培养有利于于菌体的快速生长繁殖，可节约时间成本。本申请人发现，在上 述条件下，嗜热链球菌S10处于最佳生长状态。
与现有技术相比，本申请提供的嗜热链球菌S.thermophilus S10以及与之相关的技术方案 具有如下有益效果：
(1)所述嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)能够发酵豆乳，并且发酵得 到的发酵豆乳制品中不存在豆腥气味和酸腐气味；
(2)所述嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)在发酵豆乳制品中具有较高 活菌数；
(3)所述嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)在发酵豆乳的过程中具有良 好的产酸、产香、产黏能力。
附图说明
图1示出本申请所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S10的菌落形态图片；
图2示出本申请所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S10菌体的显微镜图片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步说明，以下实施例仅为说明性的，本申请并不受 这些实例的限制。
实施例1菌株活化及单克隆挑取
将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus S10)接入到M17液体培养基，42℃培养24h， 继代培养3代，恢复菌株活力，对菌液进行10倍比稀释，得到10-1～10-7稀释梯度，分别吸 取200μL的10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释液，均匀涂布于M17固体培养基平皿内，42℃厌 氧培养24h，挑取形态、大小、颜色不同的单克隆接种于液体培养基中，于37℃恒温厌氧培 养箱中培养24h，待菌株生长良好后，进行革兰氏染色、镜检，保存分离株，并提取菌株基因组DNA用于后续测定分析。
并且，通过生理学研究发现，有些嗜热链球菌S10能够分解硝酸盐，偶尔有些菌株表现 出拟过氧化氢酶活性。
实施例2分子生物学鉴定
将实施例1冷冻保存的供试菌株接种于TPY增菌液体培养基中，30℃恒温培养24h，经 TPY传代培养2～3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000×g 离心力离心3min(4℃)后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。
其中，TPY增菌培养液的组成是：乳糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、磷酸氢二钾2.5g、磷酸二氢钾2.5g、硫酸镁0.1g、吐温80 0.25g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、15g琼脂、蒸馏水1L，121℃、15min灭菌。
利用PacBio SMRT测序平台对嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilusS10)原始菌 株进行深度为200X的测序，并将嗜热链球菌S10(Streptococcusthermophilus S10)与模式菌 株进行比较，发现其与模式菌株亲缘关系较近。
实施例3形态学特性
采用电子显微镜观测本申请嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilusS10)，放大倍数 为1000X，以对其进行形态学特性检测，结果如图1所示，由图1可知，本申请的嗜热链球 菌S10(Streptococcus thermophilus S10)具有如下形态学特征：细胞呈圆球形，长0.9～1.1μm， 宽0.6～0.9μm，呈成对或短链状出现。
实施例4菌落形态特性
采用培养皿培养本申请嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S10，培养条件为：M17 液体培养基，42℃培养24h。对其进行菌落形态特性检测，结果如图2所示，由图2可知， 本申请提供的嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)在M17培养基上生长形成乳 白色菌落，不透明，圆形，表面光滑，中央凸起，直径约为1.1～1.3mm。
实施例5菌株发酵特性研究
将筛选后得到的嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)在豆乳培养基中发酵 24h后，进行菌株活菌计数。
用活化第二代的嗜热链球菌M17培养液(1×109cfu/ml)按照0.03wt‰的比例混合后接种 到100g的豆乳中，并且以未添加嗜热链球菌S10的豆乳为对照，在37℃条件下静置培养6h， 取发酵液以4000×g离心10min，取上清，上清液经0.22μm微膜过滤，-20℃冰箱保存备用。
本申请以下实验例中试验菌株来源分别为：
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S10为实施例5制取；
所述发酵剂Y14购自意大利乳品研发中心CSL；
所述发酵剂904-vege购自科汉森(中国)有限责任公司。
实验例
实验例1：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S10发酵豆乳产酸能力测定
pH测定的是乳制品中的游离氢离子的含量，而滴定酸度测定的是乳制品中总的氢离子 含量，是体现菌株发酵能力的常见指标。
将筛选后得到的嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)与商业发酵剂Y14和 科商业发酵剂904-vege分别进行发酵实验，其中，商业发酵剂Y14和科商业发酵剂904-vege 作为对照菌，对3种发酵乳的pH和滴定酸度进行测定。
当体系的pH小于4.5时，认为发酵已至终点，不再继续测量体系pH值，结果如表1所示。
由表1可知，嗜热链球菌S10发酵豆乳达到发酵终点所用时间最短，在发酵4h后，不同 发酵体系的pH值和滴定酸度开始产生明显差异；经过计算，嗜热链球菌S10发酵豆乳产酸 速率为6.02Δ°T/h，发酵剂Y14发酵豆乳产酸速率为3.98Δ°T/h，发酵剂904-vege发酵豆乳产 酸速率为5.00Δ°T/h，即，嗜热链球菌S10发酵豆乳产酸速率最大。
pH测定的具体方法为：使用pH计测定液相体系的pH。
酸度滴定的具体方法为：豆乳培养基滴定酸度按照国家标准GB5009.239—2016中规定 的“酚酞指示剂法”进行检测。
表1 S.thermophilus S10发酵的pH和滴定酸度的测定结果
其中，数字肩a，b和c表示活菌数变化差异性，差异性水平设定为0.05，具体体，a，b和c活菌数变化差异性依次递增。“—”代表已完成发酵。
实验例2：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)发酵豆乳黏度和持水能力 测定
将筛选后得到的嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)，与商业发酵剂Y14和 商业发酵剂904-vege进行对照，对3株菌的黏度和持水能力进行测定，结果如表2所示，由 表2可知，用嗜热链球菌S10(S.thermophilus S10)发酵制得的发酵豆乳具有良好的黏度和 持水能力，均显著高于由另外两株嗜热链球菌制得的发酵豆乳的黏度和持水能力。
黏度测定的具体方法为：发酵豆乳样品放至室温后，黏度仪设为测量酸奶黏度程序，并 使用该黏度仪测定酸奶黏度。
持水能力测定的具体方法为：准确称取发酵豆乳样品20.00g，置于有滤纸的漏斗中，室 温放置90min后收集滤液并称重，并按照以下计算公式计算持水能力：
持水性(％)＝1-(滤液质量g/样品质量g)×100％。
表2 S.thermophilus发酵的黏度和持水能力的测定结果
其中，数字肩a，b和c表示活菌数变化差异性，差异性水平设定为0.05；“—”代表已完 成发酵。
实验例3：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)发酵豆乳活菌数测定
将筛选后得到的嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)，与商业发酵剂Y14和 商业发酵剂904-vege进行对照，将3株菌在豆乳培养基中42℃恒温培养24h后，进行菌株活 菌计数。结果如表3所示，由表3可知，嗜热链球菌S10在豆乳中能够大量繁殖，其活菌数 显著高于其余两株嗜热链球菌。
活菌计数的具体方法为：采用MRS固体培养基进行总活菌数培养，37℃恒温厌氧培养 (72±6)h，记录菌落总数变化。
表3菌株活菌计数结果
其中，数字肩a，b和c表示活菌数变化差异性，差异性水平设定为0.05。“—”代表已完 成发酵。
实验例4：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)发酵豆乳豆腥味测定
将筛选后得到的嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)，与商业发酵剂Y14和 商业发酵剂904-vege进行对照，将3株菌在豆乳培养基中培养24h后，20名感官评定人员对 发酵豆乳进行感官评定，以豆腥味评定的主要标准(0分表示无豆腥味，5分表示豆腥味浓重)。 结果如表4所示，结果显示嗜热链球菌S10发酵豆乳能够显著降低发酵豆乳的豆腥味。
表4菌株发酵豆乳感官评定结果
其中，数字肩a，b和c表示感官评分差异性，差异性水平设定为0.05。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理 解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对 本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。 本申请的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北京科拓恒通生物技术股份有限公司
<120> 一株嗜热链球菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2629
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
acaccgaaga acattcataa tctacttcta aagaagcaca agtaatctgg atgaaggcct 60
tcaaaaacta agtaggtcgt cagcctcttc ctgaggaatt tcttataggt aggtcttcag 120
gttatgatgt gtcgatcatc tatcagttta tctcatatgg taaggctgct aaactggcca 180
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tagcgcttgc tggttatgga tttggttttt attattactc acgtggtcaa gtagcagatc 300
gttatgaagc agcaacttat ggtaagtttg atagttatgc ctcaaatcat aacacaacac 360
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agtattatga aagttagaat cgaattggac ccatccatgg atgagcctga aatcttgatt 1020
cgagctcctc ggttaacaca ggaattggcc cagctccaag aatctattct aaagaaaaag 1080
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ctcttttttg aaacagacgg ggaaaagatt tttggacata ccaaggatga ggcctatgag 1200
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aaatcgacga ttgttaatgc taagcagatt tattctttag agaagtcttt ttcggggact 1320
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cctcttgatc cttttggcag ctttggtaat tgtacaagac tattttataa aatgggaaat 1500
tagtatttgg atgttggcct gggtagtctt attggcaatt ttgtcccttt ctagtctttt 1560
gaagcgacat tttggtcttg gtttcgccta tggcattgtg gctctatttt cacttaatgg 1620
acagttccat tttcttccag tatctaactc ggtccttatc ttctcttcca ttcttgcagt 1680
tattggcttg aacattctct tcaattcttc tagtaaaaca aagaatcgct ttggactggg 1740
ttctactggc tcagacgcta ataatggtgg aaatgatatt gatgtcactt tttcagtagt 1800
gaccaaatat ctcaatgacc agcaatttac acatgggagt gcggatgtta gtttaggaca 1860
ggcttccgtt tattttgata attgccgtat tgaggggcca tctgctcagt ttgatgtgga 1920
cgtttctctt ggaagtctta gcctctatgt gcccagtgat tggcgggtgc atgtgaatgt 1980
ggataactct ctttcagctg tacagcatga ggaaaatcct agcaacttaa ctaacaagga 2040
cttctacatc aaaggtgatg tttccttggg taatttagaa attatttatg ttggtgagag 2100
ttcgattgat taagttagtg tagggaacct ctgattaata taatacctat tgttttatct 2160
caatccctgt gataagatag gctcaatcta ttttcaagag ggacaagagc tctgggattc 2220
ctaacgtcat caagtctttt aaatcaacta atactcgagg gagtaggaca agggagagtt 2280
tttgaaaagc tgttcggtat cactctcttt tttcctacta gaacaggaat taatttttaa 2340
ataaagttgt ggtgctaaat cttttgattt ggttcttttt ttggctagag gaccagatat 2400
tttgggcttt tcctgtagga gataagctta tgcctggccc ataggccaga gggctagaaa 2460
gggatgaggg aggagtctga ttgtttgtta attctgtgtt ataatagcaa ggattagtgg 2520
ttgttagtgc taagtgaatg gaaattcttg cttagtccga cttagtccga acgactggtg 2580
tagagacaag aaagggacgt cttatgaaat tactttatac ggatatgtc 2629

Claims (9)

1.一株分离的嗜热链球菌S10(Streptococcus thermophilus S10)，其特征在于，其微生物保藏编号为CGMCC No.16129。
2.权利要求1所述的嗜热链球菌S10菌株在发酵乳品中的用途。
3.权利要求1所述的嗜热链球菌S10菌株在制备乳品发酵剂中的用途。
4.一种乳品发酵剂，其特征在于，含有有效含量的权利要求1所述的嗜热链球菌S10和可接受的载体。
5.权利要求4所述的乳品发酵剂在发酵乳品中的用途。
6.根据权利要求2、3或5所述的用途，其特征在于，所述乳品包括豆乳和牛乳。
7.一种发酵乳制品，其特征在于，所述发酵乳制品由权利要求1所述的嗜热链球菌S10或者权利要求4所述的乳品发酵剂发酵而成。
8.一种利用权利要求1所述嗜热链球菌S10发酵乳品的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的嗜热链球菌加入灭菌乳品中，隔氧保温反应，其中，所述乳品包括豆乳和牛乳。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，权利要求1所述的嗜热链球菌S10的加入量为0.5×106CFU/mL～3×106CFU/mL；和/或
保温温度为(42±0.5)℃；和/或
保温时间为8小时～12小时。
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