CN107198771A - 微载体悬浮培养细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法 - Google Patents

微载体悬浮培养细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用BHK细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，其包括以下步骤：将BHK21细胞复苏，采用低血清培养基进行微载体培养，然后以细胞维持液替换低血清培养基，进行灌流连续培养，使细胞密度维持在1.5～3×107个/ml时接毒，48h后收获病毒液，连续收获6天，将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，制成成品疫苗。所述的疫苗效价高，具有较强的免疫原性，不需要添加免疫增强剂即可达到好的免疫效果，经免疫后可促进体内分泌中和抗体，免疫保护率达到100％，完全达到疫苗效力评价标准。

Description

微载体悬浮培养细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的 方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法。
背景技术
猪伪狂犬病病毒(PRV)属于疱疹病毒科a疱疹病毒亚科水泡病毒属猪疱疹病毒I型，猪是该病毒的唯一自然宿主，引起猪的伪狂犬病。该病在猪群多呈暴发流行，主要危害母猪群，引起母猪流产或垂直传播给仔猪，造成初生仔猪大量死亡，给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。
目前尚无治疗猪伪狂犬病的有效药物，因此疫苗接种成为控制该病发生和流行的主要措施。目前在市场上广泛使用是自然缺失弱毒疫苗。自然缺失弱毒疫苗是通过非猪源细胞或鸡胚的连续传代，或在某些诱变剂的存在下，用低于或高于通常的培养温度在细胞培养物上连续传代获得，其基因组的内部存在着多处的点突变以及一些基因的缺失，它是一种自然的基因缺失疫苗。其中，世界上使用最广泛的疫苗主要是PRV Bartha-K61株疫苗，然而近几年我国猪伪狂犬疫病流行现状表明使用的PRV Bartha-K61株疫苗免疫猪产生的中和抗体不能有效中和新分离的病毒PRV HeN1株，该疫苗不能完全保护新流行PRV的攻击。
伪狂犬病基因缺失疫苗是利用基因工程技术在PRV基因组中插入或缺失一段序列，致使PRV的某些基因(特别是一些毒力基因)不能表达，从而使PRV的毒力减弱，同时又保持其较强的免疫原性。伪狂犬病糖蛋白基因gE是造成伪狂犬病毒潜伏和免疫逃避的主要因素，是伪狂犬病毒的主要毒力相关基因。糖蛋白gE是至今发现的所有PRV毒株(某些疫苗株除外)均能表达的蛋白，具有群特异性，在PRV的鉴别诊断中具有重要的意义。因此，通过接种伪狂犬病毒gE基因缺失灭活疫苗来预防和控制狂犬病，已成为国际上普遍接受和流行的方法。
目前对猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗的研究主要是针对如何构建和筛选伪狂犬病病毒基因缺失的毒株，而对相应毒株的扩大培养条件没有进行深入的研究，大部分是采用常规的培养条件，如公开号为CN 1244692C的中国专利申请“一种伪狂犬病TK-/gE-/gI-基因缺失标志活疫苗及制备方法”，将构建的基因缺失伪狂犬病病毒株采用原代鸡胚成纤维细胞进行转瓶培养，不仅不易转染，易引入污染，且规模较小，不适合疫苗的大规模生产。
微载体反应器培养是贴壁细胞进行大规模培养的常用手段，兼有悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易，在微球表面培养细胞可以在较短时间内得到大量的细胞，且细胞传代只需要添加新的微载体，基本上可避免细胞在胰酶消化过程中受到的损伤，因此微载体培养细胞技术是非常方便和有意义的。目前，我国应用于细胞培养生产病毒疫苗的商品化微载体主要有：GE公司的CytodexⅠ、CytodexⅡ、CytodexⅢ和Thermo公司的Cytopore、Cytoline、Biosilon、Cultispher G等，价格昂贵，导致病毒疫苗生产的成本大大增加。因此，有必要提供一种成本较低，且可大规模生产高病毒滴度的猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的方法，以充分实现猪伪狂犬gE基因缺失病毒低毒，免疫原性强的价值。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法。
本发明提供的技术方案为如下：
一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其包括以下步骤：
(1)将种子细胞BHK21进行复苏，然后接种至搅拌式生物反应器中，采用低血清培养基进行微载体悬浮培养，培养条件为：转速30～50r/min，溶氧40～60％、pH值7.2～7.3、温度36.5～37.5℃，培养至细胞的浓度为1.5～3×107个/ml；
(2)沉降微载体和细胞，以细胞维持液替换低血清培养基，进行灌流连续培养，培养条件为：转速60～80r/min，溶氧30～50％、pH值7.4～7.5、温度35～37℃，灌流速度为1～2个反应器体积/天，同时以同样的速率泵出细胞悬浮液，保证细胞在反应器中停留时间内扩增至1.5～3×107个/ml；
(3)将猪伪狂犬gE基因缺失病毒按照感染复数为0.01，接种至连续培养的BHK21细胞反应器中进行培养，培养条件为：转速40～50r/min，溶氧40～50％、pH值7.4～7.5、温度35.5～36.5℃，接毒12h后开始灌流，灌流速度为1个反应器体积/天，接毒48h后开始收获病毒液；
(4)将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，即得。
其中，上述的将种子细胞BHK21进行复苏具体为：将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为3～5×105个/mL的细胞悬液。
进一步地，所述的低血清培养基的组成为包含有1～1.5％(m/v)FBS、0.5～2％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4mmol/L谷氨酰胺、4～6％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/v)双抗的DMEM培养液。
所述的细胞维持液的组成为包含有4～8mmol/L谷氨酰胺、0.4～1.2mg/L二亚油酰磷脂胆碱、2～6％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/v)双抗的DMEM培养液。
进一步地，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.05～0.2的质量比组成。
优选地，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。
具体地，上述的硫酸角质素寡聚糖为硫酸角质素低聚糖混合物，即为硫酸角质素二糖、硫酸角质素三糖、硫酸角质素四糖、硫酸角质素五糖的混合物，其制备方法参考公开号为CN 1174557A的中国专利“硫酸角质素寡聚糖级分及含该级分的药剂”，具体为：取硫酸角质素50g，溶解在300ml的0.1M醋酸缓冲液(pH6.0)中，加入25U内-β-N-乙酰基葡萄糖胺酶型硫酸降解酶，在37℃下降解24h。反应结束后，加入2倍体积的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，在4000rpm下离心15min，取上清(上清A)。往沉淀中加入300ml蒸馏水，进行溶解，加入3倍量的乙醇，搅拌，在室温下放置1夜，4000rpm下离心15min，取上清(上清B)。将上清A和上清B混合，减压浓缩，使用Bio-Gel-P-2柱(3.6╳134cm)，以蒸馏水作为溶剂，进行凝胶过滤，将滤液冷冻干燥即得。
具体地，上述的壳聚糖微载体为表面含有聚羟基脂肪酸酯的壳聚糖微球，所述的聚羟基脂肪酸酯是一种胞内聚酯，具有良好的生物相容性和可降解性，其结构中的羟基、羧基可与壳聚糖在酸性溶液中质子化形成的-NH3 +产生交联作用，从而使壳聚糖分子沉析出来。进一步地，所述的微载体浓度为4～6g/L，优选为5g/L，具体地，所述的壳聚糖微载体的制备包括以下步骤：
取壳聚糖溶解于2％(v/v)的稀醋酸中，磁力搅拌制成浓度为10～15％(m/v)的壳聚糖溶胶液，加入1～4％(m/v)醋酸铵，搅拌均匀，加入聚羟基脂肪酸酯，超声处理25～30min，然后密封于高压蒸汽锅中，在250℃下处理3～4h，冷却至室温，离心取沉淀，用去离子水清洗2～3次，在60℃下真空干燥4～6h，得到表面含有聚羟基脂肪酸酯的壳聚糖微球，将得到的壳聚糖微球浸泡于1％(m/v)戊二醛溶液中，常温下反应2h，过滤，取沉淀，用去离子水反复清洗多次，真空40℃下干燥24h，即得壳聚糖微载体。
上述的聚羟基脂肪酸酯的加入量为壳聚糖的30～40％(m/m)，优选为35％(m/m)。
在本发明用于制备疫苗的病毒液中病毒的滴度≥1010.0TCID50/mL，所收获的病毒液在制成成品疫苗前需经过浓缩、灭活、除菌处理，具体地，所述的浓缩步骤为：将病毒液通过50K中空纤维柱进行浓缩；
灭活步骤为：采用福尔马林灭活，所述福尔马林在病毒浓缩液的终浓度为0.1％；
除菌步骤为：将灭活后的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。
在本发明疫苗的制备过程中，以表面含有聚羟基脂肪酸酯的壳聚糖微球作为BHK21细胞悬浮培养的载体，
本发明以自制的壳聚糖微载体用于BHK21细胞悬浮培养，所述的壳聚糖微载体为表面含有聚羟基脂肪酸酯的壳聚糖微球，在高温高压以及醋酸铵的作用下，制得的壳聚糖微球呈中空疏松多孔结构，与常规的壳聚糖实心微球相比，其比表面积大大增加，更有利于黏附更多的细胞以及营养物质的传输，促进细胞贴壁生长。所述的聚羟基脂肪酸酯显著改善了壳聚糖微载体表面的性质，使其更适宜于细胞生长。实验证明，使用本发明自制的壳聚糖微载体用于BHK21细胞悬浮培养，可使BHK21细胞在较短的时间内获得较高的扩增倍数，所述的BHK21细胞生长较快，在培养时间为5天时，细胞密度达到2.8×107个/ml，显著优于使用不含聚羟基脂肪酸酯的壳聚糖微球进行培养的效果，且略优于市售的CytodexⅠ微载体(GE公司)进行培养的效果，大大降低了生产成本。
在本发明用BHK21细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒液的过程中，使用的低血清培养基和细胞维持液均添加由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以一定质量比组成的生长促进剂，所述的生长促进剂能使BHK21细胞在低血清甚至无血清的环境下保持较佳的生长状态，使BHK21细胞在培养后期不易从载体中脱落，达到长期培养收获病毒液的效果，大大提高了生产效率。所述的活性矿物酵母多肽(ACB Bio-Chelate5)是矿物元素与酵母多肽形成的络合物，具体为酵母多肽络合的锌、铜、镁、铁和硅，购自美国艾缇科技公司(Active Concepts)，为BHK21细胞和病毒的生长繁殖提供了必不可少的营养元素，促进细胞和病毒的繁殖。所述的硫酸角质素寡聚糖以低聚糖的形式存在，有利于细胞吸收，其具有一些生长因子的类似作用，可刺激细胞繁殖与分化，提高BHK21细胞悬浮培养密度。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)采用本发明提供的微载体悬浮培养生产方法，用BHK21细胞系生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗，所述的疫苗效价高，稳定在1010.0TCID50/mL以上，且纯度高，质量稳定，具有较强的免疫原性，不需要添加免疫增强剂即可达到好的免疫效果，经免疫后可促进体内分泌中和抗体，免疫保护率达到100％，完全达到疫苗效力评价标准。
(2)本发明以自制的壳聚糖微载体对BHK21细胞进行悬浮培养，使BHK21细胞在较短的时间内即可获得较高的扩增倍数，培养5天后细胞密度达到2.8╳107个/ml，显著优于使用不含聚羟基脂肪酸酯的壳聚糖微球进行培养的效果，且略优于市售的CytodexⅠ微载体(GE公司)进行培养的效果，大大降低了生产成本。
(3)本发明创造性地在低血清培养基和细胞维持液中添加由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽组成的生长促进剂，大大提高了BHK21细胞的生长活性，使BHK21细胞在培养后期不易从载体中脱落，达到长期培养收获病毒液的效果，大大提高了生产效率。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
实施例1 壳聚糖微载体制备和性能检测
组分(重量) A组 B组 C组 D组
壳聚糖(g) 200 200 200 200
聚羟基脂肪酸酯(g) 60 70 80 /
A组壳聚糖微载体的制备：
取壳聚糖200g溶解于2％(v/v)的稀醋酸中，磁力搅拌制成浓度为12％(m/v)的壳聚糖溶胶液，加入3％(m/v)醋酸铵，搅拌均匀，加入聚羟基脂肪酸酯60g，超声处理25min，然后密封于高压蒸汽锅中，在250℃下处理3.5h，冷却至室温，离心取沉淀，用去离子水清洗3次，在60℃下真空干燥5h，得到表面含有聚羟基脂肪酸酯的壳聚糖微球，将得到的壳聚糖微球浸泡于1％(m/v)戊二醛溶液中，常温下反应2h，过滤，取沉淀，用去离子水反复清洗多次，真空40℃下干燥24h，即得壳聚糖微载体。
B组和C组壳聚糖微载体的制备参考上述A组，而D组壳聚糖微载体的制备与上述A组区别在于在制备过程中不添加聚羟基脂肪酸酯。
性能检测
分别对本发明A-D组制得的壳聚糖微载体进行直径及孔径大小、孔隙率、吸水率、溶胀度、比表面积和悬浮密度测定，其中，①直径及孔径大小的测定为：光学显微镜下测定一个视野中微载体的直径及孔径大小，计算其平均值；②孔隙率检测：采用液体置换方法，测定微载体的孔隙率。选取无水乙醇作为置换液体。将一定量干态微载体浸泡在V1体积无水乙醇中5min，之后刻度管显示为V2；取出微载体后，管中显示为V3体，所以微载体的体积V＝V2-V3，孔隙率为：ξ＝(V1-V3)/(V2-V3)╳100％；③吸水率：称取干态时微载体质量W1。室温下，将其浸泡在蒸馏水中12h，取出后用滤纸吸干表面的水分，称重为W2，微载体的吸水率＝(W2-W1)/W1×100％；④比表面积＝总表面积/干态微载体重量结果见表1和2。
表1 壳聚糖微载体的直径及孔径检测结果
组别 干球直径(μm) 湿球直径(μm) 干球孔径(μm) 湿球孔径(μm)
A组 800～1200 1000～1300 60～90 70～100
B组 800～1200 1000～1300 55～85 60～90
C组 800～1200 1000～1300 55～90 60～95
D组 700～1000 800～1100 50～85 55～90
表2 壳聚糖微载体的孔隙率、吸水率、比表面积检测结果
组别 孔隙率(％) 吸水率(g/g) 比表面积(cm2/g)
A组 92.5 6.2 3900～4200
B组 91.2 6.2 3900～4200
C组 90.6 6.0 3900～4200
D组 91.8 5.3 3600～4000
实施例2 壳聚糖微载体对BHK-21细胞生长的影响
分别采用实施例1A和D组制得壳聚糖微载体以及市售的CytodexⅠ微载体对BHK21细胞进行悬浮培养，具体为：
(1)将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为4.5×105个/mL的细胞悬液；
(2)将步骤(1)得到细胞悬液接种至搅拌式生物反应器中，采用含有1.5％(m/v)FBS、1％(m/v)D-氨基葡萄糖、3.5mmol/L谷氨酰胺、6％(m/v)生长促进剂、1.0％(v/v)双抗的DMEM培养液进行微载体悬浮培养，其中，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成；所述的微载体为实施例1A组制得的壳聚糖微载体(或D组制得的壳聚糖微载体或CytodexⅠ微载体)，微载体浓度为5g/L，培养条件为：转速50r/min，溶氧60％、pH值7.25、温度37℃，观察细胞的生长情况，结果见下表3。
表3 不同微载体对BHK21细胞生长的影响
由上表3可知，采用本发明实施例1A组制得的壳聚糖微载体对BHK21细胞进行悬浮培养，细胞的生长状态良好，培养5天后细胞的密度达到2.8×107个/ml，并有持续增长的趋势，效果显著优于实施例1D组制得的壳聚糖微载体，且略优于CytodexⅠ。表明本发明制得的壳聚糖微载体有利于BHK21细胞生长，可使细胞在较短的时间内获得较高的扩增倍数。
另外，本发明人发现，采用实施例1D组制得的壳聚糖微载体进行BHK21细胞培养，所述的细胞在培养9d后的细胞密度有所降低，培养11d后，降低较为明显，而采用CytodexⅠ对BHK21细胞培养，在培养11d后的细胞密度也有所降低，推测，BHK21细胞在这两种微载体上进行低血清悬浮培养，在培养后期细胞从载体中脱落，生长状态恶化。表明CytodexⅠ和实施例1D组制得的壳聚糖微载体均不适于BHK21细胞在低血清甚至无血清的环境中长期培养。
实施例3 微载体悬浮培养BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
(1)将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为4.5×105个/mL的细胞悬液；
(2)将步骤(1)得到细胞悬液接种至搅拌式生物反应器中，采用含有1.5％(m/v)FBS、1％(m/v)D-氨基葡萄糖、3.5mmol/L谷氨酰胺、6％(m/v)生长促进剂、1.0％(v/v)双抗的DMEM培养液进行微载体悬浮培养，其中，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成；所述的微载体为实施例1A组制得的壳聚糖微载体，微载体浓度为5g/L，培养条件为：转速50r/min，溶氧60％、pH值7.25、温度37℃，培养至细胞的浓度为3×107个/ml；
(3)沉降微载体和细胞，以含有6mmol/L谷氨酰胺、0.8mg/L二亚油酰磷脂胆碱、4％(m/v)D-氨基葡萄糖、3％(m/v)生长促进剂、1.0％(v/v)双抗的DMEM培养液，进行灌流连续培养，其中，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成；培养条件为：转速80r/min，溶氧40％、pH值7.4、温度36.5℃，灌流速度为1.5个反应器体积/天，同时以同样的速率泵出细胞悬浮液，保证细胞在反应器中停留时间内扩增至3×107个/ml；
(4)将猪伪狂犬gE基因缺失病毒按照感染复数为0.01，接种至连续培养的BHK21细胞反应器中进行培养，培养条件为：转速45r/min，溶氧40％、pH值7.4、温度35.5℃，接毒12h后开始灌流，灌流速度为1个反应器体积/天，接毒48h后开始收获病毒液，即得病毒液。
实施例4 微载体悬浮培养BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
(1)将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化8min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为3×105个/mL的细胞悬液；
(2)将步骤(1)得到细胞悬液接种至搅拌式生物反应器中，采用含有1.0％(m/v)FBS、1.5％(m/v)D-氨基葡萄糖、3mmol/L谷氨酰胺、4％(m/v)生长促进剂、1.0％(v/v)双抗的DMEM培养液进行微载体悬浮培养，其中，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.2的质量比组成；所述的微载体为实施例1B组制得的壳聚糖微载体，微载体浓度为6g/L，培养条件为：转速45r/min，溶氧50％、pH值7.2、温度36.5℃，培养至细胞的浓度为1.5×107个/ml；
(3)沉降微载体和细胞，以含有8mmol/L谷氨酰胺、0.6mg/L二亚油酰磷脂胆碱、6％(m/v)D-氨基葡萄糖、4％(m/v)生长促进剂、1.0％(v/v)双抗的DMEM培养液，进行灌流连续培养，其中，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.2的质量比组成；培养条件为：转速60r/min，溶氧50％、pH值7.4、温度37℃，灌流速度为1个反应器体积/天，同时以同样的速率泵出细胞悬浮液，保证细胞在反应器中停留时间内扩增至1.5×107个/ml；
(4)将猪伪狂犬gE基因缺失病毒按照感染复数为0.01，接种至连续培养的BHK21细胞反应器中进行培养，培养条件为：转速50r/min，溶氧50％、pH值7.4、温度36.5℃，接毒12h后开始灌流，灌流速度为1个反应器体积/天，接毒48h后开始收获病毒液，即得病毒液。
对比例1 微载体悬浮培养BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
对比例1用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒的步骤与实施例3基本相同，区别在于，所述步骤(2)和(3)中的培养液中均不添加生长促进剂。
对比例2 微载体悬浮培养BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
对比例2用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒的步骤与实施例3基本相同，区别在于，所述步骤(2)和(3)中的培养液中的生长促进剂仅含硫酸角质素寡聚糖。
对比例3 微载体悬浮培养BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
对比例3用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒的步骤与实施例3基本相同，区别在于，所述步骤(2)和(3)中的培养液中的生长促进剂仅含活性矿物酵母多肽。
对比例4 微载体悬浮培养BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒
对比例4用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒的步骤与实施例3基本相同，区别在于，所述步骤(2)和(3)中的培养液中的生长促进剂由硫酸角质素和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。
实施例5 病毒含量测定
分别对实施例3-4、对比例1-4收获的病毒液进行病毒含量测定，具体为：将病毒液用DMEM培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞孔；每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加细胞维持液0.3mL，于37℃、5％CO2培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50，结果见表4。
表4病毒滴度检测结果
由上表4可知，本发明实施例3-4用BHK-21细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒的滴度较高，均＞108.5TCID50/mL，明显优于对比例1-4收获的猪伪狂犬gE基因缺失病毒滴度，表明以硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽组成的生长促进剂有利于BHK-21细胞的生长，促进病毒在细胞繁殖，所述的硫酸角质素以低聚糖的形式与活性矿物酵母多肽合用，对BHK-21细胞在低血清甚至无血清的培养条件下仍保持较佳的生长状态发挥着重要的作用。
实施例6 猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的制备
(1)病毒液浓缩、灭活、除菌
分别将实施例3-4、对比例1-4收获的病毒液通过50K的中空纤维柱超滤浓缩20倍，即得病毒浓缩液；往浓缩后的病毒液中加入福尔马林灭进行灭活，所述福尔马林在病毒浓缩液的终浓度为0.1％(v/v)，然后将灭活后的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，即得疫苗抗原。
(3)疫苗成品制备
①油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份，先将白油缓慢加温，加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；
②水相制备：取灭活疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
③乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；
④分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
实施例7灭活疫苗成品检验
(1)性状
①外观：为乳白色乳剂。
②剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不扩散。
③稳定性：吸取疫苗10毫升加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5mL。
④粘度：用出口内径为1.2mm的1.0mL吸管，吸取25℃左右1.0mL，令其垂直自然流出，记录流出0.4mL所需的时间，应不超过8秒。
(2)无菌检验：取成品接种硫乙醇酸盐培养基小管和酪胨琼脂各两支，每支0.2mL，一支置37℃培养，一支置25℃培养，观察3～5日，应纯粹，无菌生长。
(3)安全检验：用21日龄健康仔猪10头，每头颈部注射疫苗2mL，观察14日，结果试验仔猪均健活，无任何局部和全身不良反应。
(4)甲醛含量测定：
①对照品溶液的制备：取已标定的甲醛溶液适量，配成每1.0mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0mL置50mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。
②被测样本的制备：用5.0mL刻度吸管量取被检品5.0mL，置50mL量瓶中，用20％吐温-80乙醇溶液10mL，分次洗涤吸管，洗液并入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如果不澄清，滤过，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。
③测定法：精密吸取对照品溶液和被检品溶液各0.5mL，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10mL，乙酰丙酮试液10mL，置60℃恒温水浴15分钟，冷水冷却5分钟，放置20分钟后，按紫外-可见分光光度计法，在410nm的波长处测定吸收度，计算即得。甲醛溶液(40％)含量％(g/mL)＝0.25×(被检样品溶液的吸收度/对照样本溶液的吸收度)×100％。甲醛含量符合国家标准，即检验合格。
(5)装量检查：取供试品3个，使之恢复至室温，开启时注意避免损失。参照装量检查使用量取参考表，用经标化的吸管、注射器或量筒进行装量检查。
试验例一、免疫原性试验
分别使用实施例3-4和对比例1-4收获的病毒液制得的成品疫苗进行抗体诱导试验和攻读试验，具体为：筛选21日龄健康仔猪(猪伪狂犬中和抗体＜1:4)70头，随机分为对照组、实施例3-4组、对比例1-4组，每组10头。其中，对照组中每头猪肌肉或颈部皮下注射2mL PBS，实施例3-4组和对比例1-4组中每头猪分别肌肉或颈部皮下注射2mL实施例3-4和对比例1-4收获的病毒液制得的成品疫苗，免疫后28天后，各组分别采血、分离血清后，于56℃灭活30min用于中和抗体测定；同时将各组进行攻毒，连续观察2周，其结果见下表5。
表5 各组免疫原性检测结果
由上表5可知，使用本发明实施例3、4制得的成品疫苗对健康仔猪进行抗体诱导28天，其血清中的中和抗体效价分别为1:25.6和1:25.2，显著高于对比例1-4制得的成品疫苗；同时，对免疫后的仔猪进行攻毒试验，结果显示，本发明实施例3、4制得的成品疫苗对健康仔猪具有较佳的保护作用，经攻毒后的仔猪未出现临床症状。而对比例1-4制得的成品疫苗对仔猪的攻毒保护作用均有不同程度的降低，尤其以对比例1制得的成品疫苗保护效果最差，试验仔猪中有半数死亡。以上结果表明，本发明提供的猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗能引起较好的免疫反应，其免疫保护率达到100％，完全达到疫苗效力评价标准。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将种子细胞BHK21进行复苏，然后接种至搅拌式生物反应器中，采用低血清培养基进行微载体悬浮培养，培养条件为：转速30～50r/min，溶氧40～60％、pH值7.2～7.3、温度36.5～37.5℃，培养至细胞的浓度为1.5～3╳107个/ml；
(2)沉降微载体和细胞，以细胞维持液替换低血清培养基，进行灌流连续培养，培养条件为：转速60～80r/min，溶氧30～50％、pH值7.4～7.5、温度35～37℃，灌流速度为1～2个反应器体积/天，同时以同样的速率泵出细胞悬浮液，保证细胞在反应器中停留时间内扩增至1.5～3╳107个/ml；
(3)将猪伪狂犬gE基因缺失病毒按照感染复数为0.01，接种至连续培养的BHK21细胞反应器中进行培养，培养条件为：转速40～50r/min，溶氧40～50％、pH值7.4～7.5、温度35.5～36.5℃，接毒12h后开始灌流，灌流速度为1个反应器体积/天，接毒48h后开始收获病毒液；
(4)将收获的病毒液进行浓缩、灭活、除菌，即得。
2.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的将种子细胞BHK21进行复苏具体为：将BHK21细胞种自液氮罐中取出复苏，加入含10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃，5％CO2下培养，直至其长成良好单层，然后用适量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为3～5×105个/mL的细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的低血清培养基的组成为包含有1～1.5％(m/v)FBS、0.5～2％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4mmol/L谷氨酰胺、4～6％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/v)双抗的DMEM培养液；
所述的细胞维持液的组成为包含有4～8mmol/L谷氨酰胺、0.4～1.2mg/L二亚油酰磷脂胆碱、2～6％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4％(m/v)生长促进剂、1.0～1.2％(v/v)双抗的DMEM培养液。
4.根据权利要求3所述的微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.05～0.2的质量比组成。
5.根据权利要求4所述的微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的生长促进剂由硫酸角质素寡聚糖和活性矿物酵母多肽以1:0.15的质量比组成。
6.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的微载体为壳聚糖微载体，所述的微载体浓度为4～6g/L。
7.根据权利要求6所述的微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的壳聚糖微载体的制备包括以下步骤：
取壳聚糖溶解于2％(v/v)的稀醋酸中，磁力搅拌制成浓度为10～15％(m/v)的壳聚糖溶胶液，加入1～4％(m/v)醋酸铵，搅拌均匀，加入聚羟基脂肪酸酯，超声处理25～30min，然后密封于高压蒸汽锅中，在250℃下处理3～4h，冷却至室温，离心取沉淀，用去离子水清洗2～3次，在60℃下真空干燥4～6h，得到表面含有聚羟基脂肪酸酯的壳聚糖微球，将得到的壳聚糖微球浸泡于1％(m/v)戊二醛溶液中，常温下反应2h，过滤，取沉淀，用去离子水反复清洗多次，真空40℃下干燥24h，即得壳聚糖微载体。
8.根据权利要求7所述的微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的聚羟基脂肪酸酯的加入量为壳聚糖的30～40％(m/m)。
9.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(4)浓缩具体为：将病毒液通过50K中空纤维柱进行浓缩；
灭活具体为：采用福尔马林灭活，所述福尔马林在病毒浓缩液的终浓度为0.1％；
除菌具体为：将灭活后的浓缩液使用过滤精度为0.45μm的筒式滤芯精滤，再用过滤精度为0.20μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，即得。
10.根据权利要求1所述的微载体悬浮培养BHK细胞生产猪伪狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，经浓缩后的病毒液的病毒滴度≥1010.0TCID50/mL，方可用于制苗。
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Inventor before: Yan Tikun

Inventor before: Zhang Yujin

Inventor before: Huang Shufen

Inventor before: Ao Yanhua

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Effective date of registration: 20181116

Address after: Room 203, 79 Ruihe Road, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong 510700

Applicant after: Guangzhou Fisher Biological Technology Co., Ltd.

Address before: 511500 Room 402, 4th Floor, Building A, Enterprise Service Center, No. 1 Guangzhou Road, Guangzhou (Qingyuan) Industrial Transfer Park, Shijiao Town, Qingcheng District, Qingyuan City, Guangdong Province

Applicant before: Guangdong Yue Yue Biotechnology Co., Ltd.

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Effective date of registration: 20210122

Address after: 510000 A403, building 2, No. 6, Xinrui Road, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province

Applicant after: GUANGZHOU YUYUE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Applicant after: GUANGDONG YUYUE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: Room 203, 79 Ruihe Road, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong 510700

Applicant before: GUANGZHOU YUYUE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

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