CN102847144A

CN102847144A - 一种提高机体免疫功能的细胞类生物药物、及其制备方法和应用

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Publication number: CN102847144A
Application number: CN201210352979XA
Authority: CN
Inventors: 刘华
Original assignee: SHANGHAI XINGHUA BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI XINGHUA BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-09-20
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2032-09-20
Also published as: CN102847144B

Abstract

本发明提供了一种制备提高机体免疫功能的生物药物的方法，步骤包括：步骤1，将免疫细胞与特定抗原在液态细胞培养基中共同培养，所述培养基中包括细胞有丝分裂原、抗原、超抗原、细胞因子、免疫佐剂等。从而获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物；步骤2，从步骤1中获得的培养物中分离具有免疫应答反应的细胞，本发明所制备的生物制剂和药物，安全性好、活性高，能够有效地提高机体的免疫功能。可以应用于治疗和预防恶性肿瘤以及病毒感染（如艾滋病和肝炎）等免疫功能相关疾病。

Description

一种提高机体免疫功能的细胞类生物药物、及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新型生物药物、及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有提高机体免疫功能、可以应用于治疗和预防恶性肿瘤以及病毒感染（如艾滋病和肝炎）的细胞类生物药物的制备方法。

背景技术

免疫系统是机体保护自身的防御性体系，能够准确的识别自己和非己物质，以维持机体的相对稳定，同时还能接受、传递、扩大、储存和记忆有关免疫的信息，针对不同的免疫信息发生增强和减弱的应答并不断调整其反应性。免疫系统的基本功能为：免疫防御、免疫稳定和免疫监视。

免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。免疫应答可分为T细胞介导的细胞免疫应答和B细胞介导的体液免疫应答。过去30年来，严格的实验研究已明确表明，免疫系统在抗御肿瘤和病毒感染中具有重要作用。而且在严格控制的动物模型中也获得了一些最新成果，从而使免疫监视理论重新引起了重视。正如Burnet所述，胸腺依赖性淋巴细胞，即T淋巴细胞，是免疫监视中最重要的效应细胞。

T细胞介导的细胞免疫应答多数情况下对机体是有利的，但在某些情况下也可导致机体损伤。有利的保护作用包括：1）对胞内感染的病原体的抗感染作用，主要是针对胞内感染的病原体，包括：①抗细菌感染，如结核杆菌、麻风杆菌、沙门菌感染等；②抗病毒感染，主要指在活细胞内寄生的病毒如艾滋病病毒；③抗真菌感染，如白色念珠菌、新型隐球菌、球范子菌及组织胞浆菌等；④抗寄生虫感染，如原虫感染等：2）抗肿瘤，参与抗肿瘤的细胞免疫效应包括：①Tc细胞的特异性杀伤作用；②巨噬细胞、NK细胞通过ADCC的杀瘤效应；③各种淋巴细胞和其他免疫细胞所产生的细胞因子（如淋巴毒素和TNF-α等）可直接或间接发挥杀瘤效应等。T细胞介导的免疫效应还可能参与下列免疫损伤病理过程的发生发展：1）迟发型超敏反应；2）急性移植物排斥反应；3）移植物抗宿主反应；4）某些自身免疫病等等。

细胞毒T淋巴细胞（CTL）是一类可杀伤表达特异性抗原靶细胞的T细胞（CD8+T）亚群。细胞毒T淋巴细胞是抗细胞内感染、急性同种异型移植物排斥反应和杀伤肿瘤的主要效应细胞。研究人员发现，机体内抵御病毒和肿瘤的T细胞有“立刻保护”和“长期保护”的分工：一类带有“战士”分子标记，能直接杀灭肿瘤细胞或病毒；另一类则显示“记忆细胞”的特征，能潜伏多年以防未来的肿瘤复发或病毒再次入侵。

机体免疫力低下的人，在同样导致疾病发生的环境中患病几率大大高于正常人。免疫系统一旦出现障碍，癌症、以及HIV和肝炎等病毒感染性疾病就容易出现。例如，当免疫系统有缺失时这种可以引起癌细胞凋亡的抗癌免疫监视功能就会失效。而且，肿瘤形成后，也会反过来抑制机体的免疫系统功能。研究发现，肿瘤患者的免疫功能会随着肿瘤的不断生长而呈进行性下降，这就构成了肿瘤发展过程中恶性因果转化链上的重要一环。

我国和许多发达国家花费巨额资金和大量人力进行研究攻克癌症，但至今尚未取得根本性的进展，总体疗效很不理想，许多癌症患者的长期生存率仍然很低。据美国癌症学会（American Cancer Society）分析，2007年全世界约有肿瘤患者1200万，其中760万人死亡，每天达2万人。过去的三十年中，我国的癌症发病率增加了80％。每年有260万人被诊断为癌症，同时有180万病人死于恶性肿瘤。近几年来，恶行肿瘤发病率在中国呈明显上升和年轻化的趋势，严重威胁人民的生命和健康。研究人员预测，癌症的发生在未来15年有可能上升一倍。到2030年癌症的发病率上升75％，而在发展中国家，这个数字将接近90％。因此，临床上迫切需要有一种疗效确切，对防止肿瘤复发和转移有很好的作用，不容易产生耐药性，安全可靠，毒副作用轻微，同时能提高肿瘤患者自身的抗肿瘤的免疫功能的新型治疗方法。针对迅速上升的肿瘤发病率，理想的方法还应该能够预防肿瘤的发生。

免疫活性细胞回输疗法是消灭体内微小残留病灶的最佳方法，甚至可以使晚期肿瘤得到完全缓解，因而在抗肿瘤免疫治疗领域倍受重视。已知研究较多的免疫活性细胞有淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞（CD3-AK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、树突状细胞（DC）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、B淋巴细胞等，它们分别在抗肿瘤免疫治疗中扮演着不同的角色。

肿瘤生物治疗本质上属于一种生理性治疗措施，这些以细胞和免疫为基础的治疗方法是通过和化疗或放疗治疗不同的作用机理，代表了一个非交叉性的耐药性，而且其毒性也与化疗和放疗完全不同。其抗肿瘤的特异性和免疫记忆是其它方法所不能比拟的。由于生物治疗具有安全性好、毒副作用低、可反复多次使用，是一种治疗恶性肿瘤的人性化的治疗方法，对不能耐受化疗和放疗的晚期肿瘤患者也可适用。在防止肿瘤的复发和转移方面，生物治疗的地位更为重要。生物治疗作为继手术、放疗和化疗后治疗肿瘤的第四模式，是目前肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有前途的手段，生物治疗有望达到完全消灭根治癌细胞的目的，是今后癌症治疗发展的一个主要方向。而通过以细胞毒T淋巴细胞（CTL，CD8+细胞）为基础的抗肿瘤免疫治疗还可以用于研究开发获得周围或中央型记忆细胞的肿瘤预防性疫苗。

此外，艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征（Acquired ImmunodeficiencySyndrome，AIDS），其病原为人类免疫缺陷病毒（Human ImmunodeficiencyVirus，HIV），亦称艾滋病病毒，自发现至今在全球肆虐，截止2003年底，估计已造成6900万人感染，其中2700万人已死亡。艾滋病在1985年传入我国，截止2003年底，专家估计我国现存活的HIV感染者约84万，其中AIDS病人8万。疫情已覆盖全国所有省、自治区、直辖市，流行范围广，面临艾滋病发病和死亡高峰期，我国的艾滋病已由吸毒、暗娼等高危人群开始向一般人群扩散。目前，艾滋病不仅已成为严重威胁我国人民健康的公共卫生问题，且已影响到经济发展和社会稳定。

HIV在全球范围内流行一直是对人类健康的一个重大威胁，迫切需要采取有效的预防和控制措施。抗病毒治疗是治疗艾滋病的有效手段，人们针对艾滋病寻找HIV特异性酶和其他特异性功能的抑制剂，现有药物在艾滋病治疗过程中能有效抑制病毒复制，特别是高效联合抗逆转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy，HAART）能将病毒的复制抑制到现有方法检测不到的水平，并促进免疫重建。但近年随着HAART的广泛应用，HAART的副作用和耐药性问题也日益突出，如代谢紊乱便是长期治疗副作用中最突出且最复杂的问题，交叉耐药性也成为导致临床治疗失败的一项主要原因。

人类在对HIV疾病的预防方面的研究进展相对缓慢。虽然目前防治艾滋病有许多措施，但艾滋病的发病以免疫功能的受损为主，最终控制HIV流行需要依靠有效的HIV疫苗，艾滋病疫苗是控制艾滋病的重要手段。对HIV致病机理的研究证实有时人体能够取得对HIV的自然免疫，发展安全有效的艾滋病疫苗在理论上是可行的。可以最大限度地抑制病毒的复制，保存和恢复免疫功能，降低病死率和HIV相关性疾病的发病率，提高患者的生活质量，减少艾滋病的传播。

CTL细胞是特异性细胞免疫的效应细胞，可以通过分泌各种细胞因子或直接杀死被病毒感染的靶细胞。特异性T8细胞毒T淋巴细胞是机体抗HIV最主要的免疫细胞，也是目前HIV疫苗研究的重点之一。

CD8+T细胞治疗恶性肿瘤的的优点是：能特异性的识别肿瘤细胞、与肿瘤细胞可发生紧密的接触和黏附从而产生相应的生物学效应、通过多种途径杀灭肿瘤细胞、对白细胞介素-2的依赖低、长效的记忆细胞有利于发挥抗肿瘤复发和转移的作用。但CTL治疗的疗效尚不理想，这与我们对T细胞的特性了解不够，以及细胞扩增的条件未能达到最佳化有关。例如：CD8T细胞的前体细胞（precursors）较少。CD8T细胞的扩增速度不够快。对刺激CD8T细胞生长的细胞因子了解不够。随着培养扩增时间延长，效应细胞抗肿瘤的活性降低等。

另外，淋巴细胞进入宿主，既可以作为抗原刺激宿主细胞的免疫系统，使宿主发生宿主抗移植物反应，同时又可以识别宿主的抗原，产生抗宿主反应，严重者可导致移植物抗宿主病（GvHD）。如DLI并发症主要有GvHD，大约50～60％的使用DLI治疗的病人发生GvHD。据EBMT的记录，急性GvHD的发生率为I级的占18％，II级占24％，III-IV级占13％。因此目前CTL治疗采用自体细胞，通过体外培养、活化扩增抗病原体的特异性T淋巴细胞，再回输体内杀伤病原体。苛刻的培养和分离条件，使得该方法无法作为药物大规模生产，其临床使用受到很大限制。

发明内容

针对现有技术中CD8T细胞的前体细胞（precursors）较少、CD8T细胞的扩增速度不够快、对刺激CD8T细胞生长的细胞因子了解不够、随着培养扩增时间延长，效应细胞抗肿瘤的活性降低、以及异体淋巴细胞引起免疫排斥反应，无法作为药物大规模生产等问题，本发明提供了一种制备提高机体免疫功能的药物的方法，克服了上述各种问题。

本发明的第一个目的是提供一种制备提高机体免疫功能的细胞类生物药物的方法，步骤包括：

步骤1，将免疫细胞与特定抗原在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物；

步骤2，从步骤1中获得的培养物中分离具有免疫应答反应的细胞类生物药物。

其中，所述培养液为基础培养液加血清或无血清培养液。

其中，所述的液态细胞培养基中，除免疫细胞外，还包括组分a）～e）：

a）细胞有丝分裂原：如刀豆素、植物血凝素、美洲商陆、脂多糖、葡聚糖、抗CD3抗体中的任意一种或几种；

b）抗原（即特定抗原）：如源于同种异体、和/或异种、和/或自身的胸腺依赖型抗原和/或胸腺非依赖型抗原，如肿瘤、病毒中的任意一种或几种。

c）超抗原：如外源性超抗原：细菌内毒素等，内源性超抗原：如逆转录病毒、热休克蛋白中的任意一种或几种；可以是外源性超抗原和内源性超抗原中的任意一种或两种的组合；

d）细胞因子：如来源于淋巴细胞、单核细胞和其他细胞产生的淋巴因子、单核因子、激活炎症的细胞因子和刺激造血的细胞因子中的任意一种或几种；

e）免疫佐剂：如无机、有机、合成和油剂中的任意一种或几种。

本发明所述的方法中，所述免疫细胞可以是异体细胞或自体细胞，本发明中优选为异体细胞。

本发明所述的方法中，所述免疫细胞可以是野生型免疫细胞，也可以是基因改性细胞，并优选为不经基因改性的细胞。

本发明所述的方法中，所述具有免疫应答反应的细胞，细胞毒T淋巴细胞、细胞因子激活的杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、和/或树突状细胞。并优选为淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞等，最优选为T细胞。

其中，所述免疫细胞与特定抗原的比例优选为5～100：1。

其中，所述免疫细胞与特定抗原共同培养时间优选为3～180天。

其中，所述细胞培养容器优选为三维大体积高密度细胞培养容器，但也可以是其它任意已知的培养容器，包括生物反应器。

根据本发明所述方法的一种优选实施方式，其中，步骤1中还可以加入抗原递呈细胞。

根据本发明所述方法的一种优选实施方式，其中，还包括细胞克隆步骤：以步骤1中得到的培养物，或者步骤2中得到的具有免疫应答反应的细胞为原料，在所述培养基中进行克隆，得到具有免疫应答反应的细胞株。所述克隆可以是：1）间歇循环刺激法；2）连续刺激法。

本发明的第二个目的是提供一种具有能够提高机体免疫功能、临床上可作为用于预防和治疗多种疾病的细胞类生物药物，所述药物由上述第一个目的中所述方法制备。

本发明第三个目的是提供一种生物制剂，包括容器，以及置于所述容器中的、本发明第二个目中的所述的药物。

其中，所述生物制剂还包括生理盐水、白蛋白、以及其他稳定剂。

本发明的第四个目的是提供本发明第二个目中的细胞类生物药物在治疗和预本发明的第四个目的是提供本发明第二个目中的细胞类生物药物在治疗和预防淋巴细胞的功能和数量异常有关的疾病的药物中应用，包括如下领域的应用：肿瘤免疫、移植免疫、超敏免疫、自身免疫性疾病、免疫增生性疾病、免疫缺陷病、感染与免疫、衰老与免疫、生殖与免疫、生殖系统与免疫、免疫血液病、呼吸系统疾病与免疫、肾脏病与免疫、消化系统疾病与免疫、内分泌疾病与免疫、心血管系统疾病与免疫、结缔组织病、免疫皮肤病学、创伤与免疫、寄生虫病与免疫。例如治疗和预防肿瘤、艾滋病和病毒性肝炎等疾病，或用于延缓衰老等。

本发明上述内容中，所述药物可以是用于提高机体免疫功能的疫苗，或者是通过提高机体免疫功能而治疗疾病的药物。

本发明所述的疫苗或药物，可以制成任意可用的剂型、和/或通过任意可用途径输入患者或需求者体内。

本发明所述方法制备的含T淋巴细胞的药物中，T淋巴细胞可以是来自异体的细胞，使用时不会出现异体排异反应，安全性高；并且通过实验验证，所制备的药物具有明显的提高机体免疫功能的作用。

本发明制备药物的方法，改变了传统疫苗的作用方式，传统疫苗是由病原生物或其抗原性物质制成，输入到人体后，免疫系统产生保护物质（如抗体），免疫系统依循原有记忆制造更多保护物质来阻止病原菌伤害，本发明将包括具有免疫应答反应的细胞的疫苗输送的到机体内，直接提高基体免疫功能，不仅增加了机体抗肿瘤、HIV和肝炎病毒等病原菌感染的能力，可用于治疗和预防癌症、艾滋病和病毒性肝炎，同时对于延缓衰老也有良好的效果。

附图说明

图1：流式细胞术分析免疫细胞亚群显示CD8+T淋巴细胞可达95％以上；

图2：流式细胞术进一步分析显示主要为CD45RO阳性细胞

图3：流式细胞术分析显示CD45RO阳性细胞中有68％同时表达CD62；

图4：流式细胞术分析显示CD56阳性细胞仅占0.8％；

图5：CTL体外杀瘤实验中，流式细胞术检测死亡肿瘤细胞数；

图6：CTL体外杀瘤实验中，流式细胞术检测效应细胞存活率；

图7为效果实施例3中裸鼠肺部转移病灶的变化；

图8为效果实施例5中，采用本发明所制备的药物治疗前后肿瘤细胞形态；

图9为效果实施例6中，采用本发明所制备的药物治疗前后，胸部X照片；

图10为效果实施例7治疗前后黑色素瘤变化；

图11为效果实施例7中，采用本发明所制备的药物治疗前后，血液中单核细胞和嗜酸细胞变化；

图12为效果实施例8治疗前后胸部CT照片；

图13为效果实施例10治疗两个月后出现黑头发生长照片；

图14为本发明所示药物制备方法流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种制备提供免疫功能的药物的方法，参照图14，步骤包括：步骤1，将免疫细胞与特定抗原在液态细胞培养基中置于培养容器共同培养，从而获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物；

其中，所述的液态细胞培养基包括组分a）～e）：

b）抗原：可以是源于同种异体、异种、自身的胸腺依赖型抗原、胸腺非依赖型抗原，如肿瘤、病毒中的任意一种或几种；

c）超抗原：可以是自外源性超抗原细菌内毒素；内源性超抗原如逆转录病毒、热休克蛋白中的任意一种或几种。；

实施例1

源于异体的单个核细胞，与特定抗原在液态培养基中共同培养，所述培养基包括刀豆素、肝癌细胞（抗原）、外源性超抗原、淋巴因子、免疫佐剂，其中，刀豆素在培养基中用量为1μg/L；外源性超抗原（绿脓杆菌毒素）在培养基中用量为5μg/L；淋巴因子（白细胞介素II）在培养基中用量为1000u/L；免疫佐剂（5％吐温-80）用量为0.1mL/L。

单个核细胞与特定抗原（肝癌细胞）的比例为5：1（细胞数比）。

将单个核细胞与特定抗原共同培养30天，获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物。

从培养物中分离出具有免疫应答反应的细胞，主要为细胞毒T淋巴细胞。

实施例2

源于异体的单个核细胞，与特定抗原在液态培养基中共同培养，所述培养基包括植物血凝素、同种异体肺癌细胞（抗原）、外源性超抗原、淋巴因子、免疫佐剂，其中，植物血凝素（PHA）在培养基中用量为5μg/L；外源性超抗原（绿脓杆菌毒素）在培养基中用量为1μg/L；淋巴因子（干扰素）在培养基中用量为1000u/L；免疫佐剂（5％吐温-80）用量为0.1mL/L。同时加入抗原递呈细胞自体树突状细胞。

单个核细胞与特定抗原（异体肺癌细胞）比例为100：1（细胞数比例）。

单个核细胞与抗原递呈细胞（自体树突状细胞）比例为50：1（细胞数比例）。

将单个核细胞与特定抗原共同培养90天，获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物。

实施例3

源于异体的单个核细胞（基因改性T淋巴细胞），与特定抗原在液态培养基中共同培养，所述培养基包括植物血凝素、HIV病毒（抗原）、外源性超抗原、细胞因子、免疫佐剂。其中，植物血凝素在培养基中用量为10μg/L；HIV病毒在培养基中用量为10²拷贝/L；外源性超抗原（绿脓杆菌毒素）在培养基中用量为5μg/L；淋巴因子（GM-CSF）在培养基中用量为500u/L；免疫佐剂（5％吐温-80）用量为0.1mL/L。

单个核细胞与特定抗原HIV病毒的比例为100：1（细胞数量：病毒拷贝数）。

将单个核细胞与特定抗原共同培养10天，获得具有抗相应抗原的特异性免疫细胞培养物。

实施例4

源于异体的单个核细胞，与特定抗原在液态培养基中共同培养，所述培养基包括刀豆素、同种异体的原发性和继发性胰腺癌细胞（抗原）、外源性超抗原、淋巴因子、免疫佐剂，其中，刀豆素在培养基中用量为10μg/L；外源性超抗原（绿脓杆菌毒素）在培养基中用量为1μg/L；淋巴因子（白细胞介素II）在培养基中用量为800u/L；免疫佐剂（5％吐温-80）用量为0.1mL/L。

单个核细胞与同种异体的原发性和继发性胰腺癌细胞的比例为20：1：1（细胞数比）。

将单个核细胞与抗原在37℃、5％CO₂条件下培养7天。

重悬，经离心收集界面细胞，调整细胞浓度，加入经过照射的自身MNC，以未照射的自身细胞为饲养细胞和抗原提呈细胞，培养7天，重复该步骤。收集细胞，有限稀释后，在上述条件下继续培养，传代并经间歇刺激培养。

从上述培养物中分离出具有免疫应答反应的细胞株。

实施例5

源于异体的单个核细胞，与特定抗原在液态培养基中共同培养，所述培养基为无血清培养基，加入包括植物血凝素、通用型肿瘤相关抗原、外源性超抗原、淋巴因子、免疫佐剂，其中，植物血凝素（PHA）在培养基中用量为10μg/L；外源性超抗原（绿脓杆菌毒素）在培养基中用量为1μg/L；淋巴因子（白细胞介素II）在培养基中用量为800u/L；免疫佐剂（5％吐温-80）用量为0.1mL/L。

单个核细胞与通用型肿瘤相关抗原的比例为10：1（重量比）。

将抗原与T淋巴细胞（单个核细胞）在37℃、5％CO₂条件下培养7天。

将所培养细胞加入大体积细胞培养生物反应器，进行高密度细胞培养30天。

从上述培养物中分离出具有免疫应答反应的细胞，主要为细胞毒T淋巴细胞。

效果实施例1

以T淋巴细胞为例，采用上述方法，本发明可获得大量活化扩增的免疫细胞，流式细胞术分析各免疫细胞亚群显示（图1）：CD8+T淋巴细胞增多，可达95％以上，进一步分析其中主要是CD45RO阳性细胞，约为93％（图2），CD45RO阳性细胞中有68％同时表达CD62（图3），强烈提示所获得的免疫效应细胞属于细胞毒T淋巴细胞（CTL），具有特异性的杀伤肿瘤细胞的作用。

在血液恶性肿瘤如淋巴细胞性白血病或淋巴瘤细胞与外周血单个核细胞共同培养的实验中，流式细胞术分析同样观察到CD8+T淋巴细胞增多，CD4+T淋巴细胞（HIV病毒的靶细胞）减少，CD56阳性细胞仅占0.8％（图4），未检测到CD19+B淋巴细胞。

上述结果表明，本发明上述实施例制备的免疫效应细胞具有强大的杀灭肿瘤细胞的效应，为肿瘤生物学治疗提供了一种全新的治疗措施，在体液免疫系统的配合下有望进一步提供生物学效应，包括对肿瘤细胞增殖周期静止期、有耐药性的细胞，甚至包括对肿瘤干细胞的生物学效应。

效果实施例2

将按照上述实施例制备的细胞毒T细胞（CTL），进行杀瘤活性实验，采用流式细胞仪分析所获得的免疫细胞的杀瘤活性显示：当效应细胞（K562激活的免疫细胞）与靶细胞（K562细胞）的比例为10：1，作用时间4小时时靶细胞杀灭率80％左右（图5），而效应细胞（CTL）存活率仍达到90％以上（图6）。

对靶细胞攻击后大部分的CTL仍存活，可继续攻击其它靶细胞。一个CTL在几小时内可以杀伤数十个靶细胞，故CTL这种连续、高效的杀伤功能，在机体的细胞免疫中有重要作用，尤其在抗肿瘤与抗细胞内感染的微生物中有更重要的意义。

效果实施例3

用带有红色荧光蛋白基因转染的肝癌细胞株在裸鼠体内建立肺癌转移模型，然后分别用同样细胞株激活的CTL（1x10⁶）和生理盐水腹腔内注射，每周一次共三次。观察肺部转移病灶的变化情况，结果显示（图7），与对照组（图7A）相比，CTL治疗后（图7B）肺部转移病灶明显减少。

我们对近500例肺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、淋巴瘤、恶性黑色素瘤等晚期肿瘤患者进行了治疗和预防尝试。初步结果表明：我们研制的免疫效应细胞的临床应用安全、有效。接受免疫效应细胞治疗的病人通常仅有轻到中等度的发热，未见有其他明显的毒副反应。同时，免疫效应细胞治疗后多数患者的临床症状有明显改善，有时伴随着肿瘤的缩小和肿瘤标志物的明显下降或恢复正常，以及生存期的延长。另外，我们还观察到这一治疗方法还可强烈地激活晚期肿瘤患者的细胞和体液免疫功能，表现为外周血中的单核细胞和嗜酸性细胞计数的显著增多以及免疫球蛋白IgG和IgA的明显升高。此外，治疗后患者肿瘤组织或胸腹水中可见大量激活的淋巴细胞的浸润。

效果实施例4：临床治疗恶性血液病

姓名：林xx 性别：男性年龄：18岁临床诊断：MDS

因皮肤苍白，乏力头晕，劳累后心悸气短半年于2010-12-30入院。检查发现三系减少，白细胞2.34×10⁹/L、红细胞2.14×10⁹/L、血色素81g/L、血小板86×10⁹/L。胸骨穿刺显示三系增生伴轻度病态造血骨髓象。病情进展较快，第一次诊断后的五个月即需输血，其后靠输血维持，五个多月期间共输血4300mL。

治疗两个多月后，输血次数及数量减少，其中血色素逐步从最低水平4.8g/L上升到16.2g/L，增长了11.4g/L，四个月后（2012-04-21到2012-08-26）不用再输血维持。治疗近一年时，血常规白细胞4.18-7.46×10⁹/L、红细胞2.61-4.45×10⁹/L、血红蛋白99-162g/L、血小板，47-69×10⁹/L。伴随临床症状体征的明显改善，体力恢复正常。治疗后的骨髓穿刺、骨髓活检和骨髓干细胞培养均有造血功能明显改善。治疗过程中病人耐受良好。

效果实施例5：联合手术治疗和预防复发

姓名：曾xx 性别：女年龄：65岁临床诊断：肺癌

2008年6月因体检发现双侧肺阴影，同年7月22日于上海市胸科医院行微创右侧上叶肺肿瘤切除术，病理为肺乳头状腺癌侵及脏层胸膜。如图8A所示，治疗前肿瘤细胞多层排列（照片1），肿瘤细胞异性明显，细胞核大，染色质粗，核仁明显（照片2、3）

术后于2008年8月6日采用本发明所述药物（CTL）进行生物治疗。治疗三个月后复查CT显示病灶稳定，未见有发展。血液检查肿瘤标志物明显下降。

2008年12月2日患者再去胸科医院行左上肺肺癌微创手术，病理切片中显示左肺上叶腺癌，腺泡样及乳头状腺癌混合亚型。侵及脏层胸膜，P-T2N2M 1IV期，呈单层排列（图8B照片1），细胞形态温和（图8B照片2、3）。肿瘤内有大量淋巴细胞浸润。

第二次手术后继续给予CTL治疗，以每周一次至每月一次，病人一般情况良好，PET-CT及影象学检查无肿瘤复发转移。血中肿瘤标记物CA125及NSE转为正常。至今随访已近四年。全血中嗜酸细胞增多，从6.2％增加至最高10.5％；血清球蛋白明显升高，从33g/L增加至最高39g/L。

效果实施例6：联合化疗治疗和预防复发

姓名：吴xx 性别：女年龄：36岁诊断：非何杰金氏淋巴瘤

患者于2004年4月反复因低热、乏力，胸部X检查发现纵隔阴影。同年5月25日经穿刺病理证实为HDII型。

病程中经过化疗和放疗。因疗效不明显且出现严重副反应而停止放化疗。2008年3月25日胸部CT发现左上肺结节（图9A），考虑淋巴瘤肺内侵润。左肺结节穿刺病理证实为经典型HD，因组织较少无法分类。于2008年4月再次接受NHL化疗，因疗效不明显出现严重副反应，停止治疗。后于2008年10月6日采用本发明所述药物进行生物治疗。

CTL静脉输注二个月后病人低热消失，自我感觉良好，体力增强。复查CT发现肺部病灶消失及纵隔淋巴结明显缩小（图9B）。五个月后复查CT提示病灶已吸收，此后疾病无进展达四年。

效果实施例7：联合局部治疗后治疗和预防复发

姓名：李xx 性别：男年龄：74岁诊断：恶性黑色素瘤

2006年6月份发现右足趾截除术及腹股沟淋巴结清扫。术后半年发现腹股沟淋巴结转移，予以氮西米胺、顺铂化疗。2008年1月因发现右下肢黑色素细胞瘤大量生长，最高位已蔓延至右侧腹股沟。入院检查右下肢大、小腿处多个黑色素瘤，右侧腹股沟数枚淋巴结肿大（图10A）。

经CTL生物局部注射和全身静脉治疗，黑色素瘤明显缩小（图10B），未观察到明显毒性反应。治疗后实验室检查，酸性细胞和单核细胞增多（图11A，B），血清中球蛋白升高，从23g/L最高达40g/L。此后疾病无进展达五年。

效果实施例8：联合靶向治疗后治疗和预防复发：

姓名：施某性别：男年龄：39岁诊断：肺腺癌

2008年3月份因发热咯血就诊，查胸片两肺广泛弥漫性小结节病灶（图12A），考虑结核而行结核治疗。但病灶加重，咯血量增多，需用垂体后叶素控制出血。2008年5月来上海胸科医院诊治。发现有右锁骨上淋巴结肿大，经穿刺病理诊断为肺腺癌。同时痰液中找到脱落肿瘤细胞（肺腺癌）。

2008年6月开始生物治疗，静脉滴注CTL，治疗以后二天咯血即停止。病人感到胸闷咳嗽明显好转。2008年11月份复查胸部CT（图12B），有进一步明显好转。

查血中肿瘤标志物明显下降：

治疗前CEA 65.86 CA125 86.89 FREE 401.1 NSE 55.43

治疗后CEA 34.45 CA125 13.89 FREE 283.5 NSE 32.9

全血中：单核细胞由原来的10.5％升高到13.6％，酸性细胞从2.3％升高到5.4％。

效果实施例9：

董xx，女性年龄：75岁诊断：1，胰腺癌，2，慢性湿疹

因患胰腺癌接受本发明所述药物进行生物治疗，治疗后一个月，病人长达五年之久、经过多种治疗无效的慢性湿疹彻底痊愈。

慢性湿疹是由多种内外因素引起的以苔藓样变为主，易反复发作的慢性炎症性皮肤病，其发病机制复杂且尚未完全阐明，传统观念认为由IV型变态反应介导，众多的炎症细胞和炎症因子参与其发病。

效果实施例10：

胡xx，男性年龄：88岁诊断：结肠癌

因患结肠癌接受本发明所述药物进行生物治疗，治疗两个月后出现黑头发生长（图13）。

效果实施例11：

雷xx，女性年龄：85岁诊断：食道癌（中段）

因吞咽困难数月，X射线检查发现食道中段癌。因为年龄较大不适合手术和化疗，故行局部放疗。共五周25次。放疗同时联合生物治疗，应用本发明所述药物进行生物治疗每周一次。治疗后症状明显改善，影像学肿瘤明显缩小。治疗前后流式细胞仪外周血免疫细胞检查结果显示，总T淋巴细胞和细胞毒T淋巴细胞明显升高。（见表1）

表1，使用本发明上述实施例制备的药物前后免疫细胞检验结果

虽然目前防治艾滋病有许多措施，但艾滋病的发病以免疫功能的受损为主，最终控制HIV流行需要依靠有效的HIV疫苗。艾滋病疫苗是控制艾滋病的重要手段。对HIV致病机理的研究证实有时人体能够取得对HIV的自然免疫，发展安全有效的艾滋病疫苗在理论上是可行的。可以最大限度地抑制病毒的复制，降低病毒血症或保持低病毒载量水平、减缓HIV疾病的进程，保存和恢复免疫功能，降低病死率和HIV相关性疾病的发病率，提高患者的生活质量，减少艾滋病在人群中的传播率。

特异性T8细胞毒T淋巴细胞是机体抗HIV最主要的免疫细胞，本发明所述药物进行生物治疗具有以下一些优点，适用于新型预防和治疗艾滋病疫苗的开发：

1、我们采用的免疫效应细胞是细胞毒T淋巴细胞（CTL）。细胞毒T淋巴细胞是一类可杀伤表达特异性抗原靶细胞的T细胞亚群。细胞毒T淋巴细胞是抗细胞内感染、急性同种异型移植物排斥反应和杀伤肿瘤的主要效应细胞。抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是CD8+T淋巴细胞的亚群，在各种各样的病毒感染（CMV、EBV和流感）中发挥着至关重要的作用，尤其在人类免疫缺陷病毒（HIV）感染中起着控制病毒感染和延缓疾病进展的关键性保护作用。

2、我们研制的免疫效应细胞的临床应用安全、接受免疫效应细胞治疗的约500多例病人，年龄从18个月到88岁，超过2000次的临床应用，通常无明显反应或仅有轻到中等度的畏寒发热，未见有其他明显的毒性反应。

3、通过过继性细胞免疫治疗来增加效应细胞的数量，消除HIV病毒感染对CD8+T细胞功能的影响。这一生物制剂主要成分为CD8+T淋巴细胞，可达95％以上，同时表达CD45RO。这些激活的细胞可通过直接细胞毒作用或间接作用抑制HIV。具有扩增能力的HIV-特异性CD8+T细胞以及细胞颗粒酶的外分泌所介导免疫反应可以消灭HIV病毒感染的CD4靶细胞。对于该病毒基因组整合到宿主细胞的染色体，以及潜伏于静止的记忆性T细胞中的病毒可能都会有控制作用。

4、这一药物还可激活患者的体液免疫功能，包括免疫球蛋白IgG和IgA的明显升高。这一作用有助于克服野生型病毒对血清中的抗性中和作用有耐受。CD8+T细胞的非细胞毒性抗病毒反应(CNAR)与HIV感染者保持长期健康的临床状况密切相关，长期的CNAR能够延缓疾病的进展。

5、接受治疗这一生物制剂治疗的患者周围血液中单核细胞和嗜酸性细胞计数的显著增多，这一作用可通过黏膜屏障作用抵御HIV感染，阻止疾病通过粘膜途径传播。

6、癌症患者采用这一药物治疗后肿瘤组织中可见大量激活的淋巴细胞的浸润，这可能有助于清除隐匿于组织中的HIV，阻止感染的细胞传播病毒。

7、激活的细胞毒T淋巴细胞的T细胞受体功能活跃，抗原识别能力增强，有利于克服HIV抗原的多样性和病毒在宿主中迅速出现病毒突变逃逸。

8、机体内抵御病毒和肿瘤的Ｔ细胞中含有长效记忆细胞成分，能潜伏多年以防未来的病毒再次入侵，有利于发挥抗病毒的复发和传播作用。

本发明制备的药物在临床应用中，五年多时间治疗近500例病人，年龄18个月-88岁，最多使用110次，时间最长为六年，经过临床多中心应用证明：安全性好、无排异反应和自体免疫性疾病，而传统的使用DLI治疗的病人大约有50～60％发生GvHD。前期研究显示本发明上述实施例制备的CTL是活化的CD8+细胞毒T淋巴细胞，并表达CD45RO。CTL是针对原发性和/或继发性癌细胞的肿瘤细胞全抗原而制备，并以癌细胞为靶点的生物制剂。可与肿瘤细胞特异性结合并裂解肿瘤细胞、或通过激活巨噬细胞和吞噬肿瘤细胞等多种机制杀灭肿瘤细胞。CTL不是针对个体化治疗的自体免疫细胞回输，也不是简单的同种异体细胞移植。经肿瘤细胞全抗原活化的CTL细胞具有很强的杀瘤特异性，且本身不具有免疫原性，适用于群体化临床治疗。对比现有技术，本发明打破了CTL治疗的肿瘤生物治疗仅适合个体化治疗的瓶颈，具有很好的创新性和可行性。

本发明所制备的药物可用于单一治疗，亦可和放化疗、手术治疗或局部和靶向治疗联合应用。临床上不仅可以用于治疗，也可以用于预防术后复发以及有明确肿瘤家族史或其他肿瘤高发高危人群、以及治疗和预防病毒感染引起的疾病，如AIDS。

本发明上述实施例中虽然以T淋巴细胞为例，但是本领域技术人员能够理解的是，上述方法同样可以用于其它诸如肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、激活的杀伤性单核细胞、细胞毒T淋巴细胞和/或树突状细胞等任意具有免疫应答反应的细胞群。

本发明上述实施例虽然以抗肿瘤、抗艾滋病和抗衰老为例，但是本领域技术人员能够理解的是，上述方法也可用于其它与机体免疫功能相关的疾病的治疗和预防，如病毒性肝炎等病原体感染疾病，预防和治疗方法参照上述实施例。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种制备提高机体免疫功能的细胞类生物药物的方法，其特征在于，步骤包括：

步骤2，从步骤1中获得的培养物中分离具有免疫应答反应的细胞类生物药物；

其中，所述的液态细胞培养基中，除免疫细胞外，还包括组分a）~e）：

a）细胞有丝分裂原；

b）抗原；

c）超抗原；

d）细胞因子；

e）免疫佐剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞选自异体细胞或自体细胞的任意一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞选自不经基因改性的免疫细胞或基因改性的免疫细胞的任意一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养液选自基础培养液加血清或无血清培养液的任意一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养容器为三维大体积高密度细胞培养容器。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞有丝分裂原选自刀豆素、植物血凝素、美洲商陆、脂多糖、葡聚糖、抗CD3抗体中的任意一种或几种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原选自胸腺依赖型和/或胸腺非依赖型，来源于自体、同种异体、和/或异种的肿瘤、病毒中的任意一种或几种。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超抗原选自外源性超抗原为细菌内毒素；内源性超抗原为逆转录病毒、热休克蛋白中的任意一种或几种。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子选自来源于淋巴细胞、单核细胞和其他细胞产生的淋巴因子、单核因子、激活炎症的细胞因子和刺激造血的细胞因子中的任意一种或几种。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的具有免疫应答反应的细胞选自：细胞毒 T 淋巴细胞、细胞因子激活的杀伤细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、和/或树突状细胞。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中还加入抗原递呈细胞。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括细胞克隆步骤：以步骤1中得到的培养物，或者步骤2中得到的具有免疫应答反应的细胞为原料，在所述培养基中进行克隆，得到具有免疫应答反应的细胞株。

13.一种具有能够提高机体免疫功能、临床上可作为用于预防和治疗多种疾病的细胞类生物药物，其特征在于，包括由权利要求1所述方法制备的提高机体免疫功能细胞类生物药物。

14.一种如权利要求13所述的细胞类生物药物在治疗和预防淋巴细胞的功能和数量异常有关的疾病的药物中应用，其特征在于，包括如下领域的应用：肿瘤免疫、移植免疫、超敏免疫、自身免疫性疾病、免疫增生性疾病、免疫缺陷病、感染与免疫、衰老与免疫、生殖与免疫、生殖系统与免疫、免疫血液病、呼吸系统疾病与免疫、肾脏病与免疫、消化系统疾病与免疫、内分泌疾病与免疫、心血管系统疾病与免疫、结缔组织病、免疫皮肤病学、创伤与免疫、寄生虫病与免疫。

15.一种生物制剂，其特征在于，包括：容器，以及置于容器内的如权利要求13所述的细胞类生物药物。