CN114181901A - 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法 - Google Patents
一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114181901A CN114181901A CN202111491600.9A CN202111491600A CN114181901A CN 114181901 A CN114181901 A CN 114181901A CN 202111491600 A CN202111491600 A CN 202111491600A CN 114181901 A CN114181901 A CN 114181901A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- immune cells
- culture medium
- special
- cells
- immune
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 231
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title abstract description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 91
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 40
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 35
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims abstract description 21
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 68
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 68
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 39
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N Resveratrol Natural products OC1=CC=CC(C=CC=2C=C(O)C(O)=CC=2)=C1 QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N Trans-resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims description 30
- 229940016667 resveratrol Drugs 0.000 claims description 30
- 235000021283 resveratrol Nutrition 0.000 claims description 30
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N propane-1,3-diol Chemical compound OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- MXXWOMGUGJBKIW-YPCIICBESA-N piperine Chemical compound C=1C=C2OCOC2=CC=1/C=C/C=C/C(=O)N1CCCCC1 MXXWOMGUGJBKIW-YPCIICBESA-N 0.000 claims description 12
- WVWHRXVVAYXKDE-UHFFFAOYSA-N piperine Natural products O=C(C=CC=Cc1ccc2OCOc2c1)C3CCCCN3 WVWHRXVVAYXKDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229940075559 piperine Drugs 0.000 claims description 12
- 235000019100 piperine Nutrition 0.000 claims description 12
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 11
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 10
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 claims description 10
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 9
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 9
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 9
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 7
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 108010057717 laminin 8 Proteins 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N (+)-propylene glycol Chemical compound C[C@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229940035437 1,3-propanediol Drugs 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 229920000166 polytrimethylene carbonate Polymers 0.000 description 4
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 108010028309 kalinin Proteins 0.000 description 3
- 108010038862 laminin 10 Proteins 0.000 description 3
- 108010057725 laminin 6 Proteins 0.000 description 3
- 108010057697 laminin 9 Proteins 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- -1 flavonoid polyphenol organic compound Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- LCDCPQHFCOBUEF-UHFFFAOYSA-N pyrrolidine-1-carboxamide Chemical class NC(=O)N1CCCC1 LCDCPQHFCOBUEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，得到初步扩增免疫细胞；利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，得到诱导免疫细胞；利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，获得大量的激活功能的免疫细胞；本发明还公开了一种体外诱导扩增的免疫细胞及其冻存方法；本发明对免疫细胞的单个核细胞进行诱导扩增培养，得到大量功能激活的免疫细胞，不仅具有诱导效率高、扩增速度快，具有成本低的优点，同时制备的冻存液能够保存免疫细胞并提高复苏免疫细胞增值率，并取得了极好的预期效果。
Description
技术领域
本发明涉及免疫细胞的体外诱导扩增技术领域，尤其涉及一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法。
背景技术
免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色，从血液中分离出来的单个核细胞是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。
生物免疫细胞治疗是通过体外培养、增殖、激活，回输体内诱导自体抗病毒免疫应答，从而使得人体抗病毒免疫被激活后源源不断地产生抗病毒的物质杀灭病毒。免疫细胞对肿瘤细胞、细菌等的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞或细菌，但不会伤及“无辜”的正常细胞，是一种十分有效的治疗方式。
冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。为了将冻融过程中细胞的损伤降至最低，必须进一步优化化学和温度操作过程，但需要在降温前加入一种或两种低温保护剂，在溶解后又将其去除。细胞冷冻技术无论对临床还是基础研究均具有重要意义，细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，但DMSO却可以迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。
目前，细胞的冻存除了采用DMSO对干细胞进行冻存，还会采用普通商品化的培养基或血清进行细胞冻存，目前DMSO作为细胞冷冻保存剂，单独使用保存免疫细胞存活率低，复苏后细胞数量及活力都无法满足临床应用的标准，目前市场上已有NK细胞治疗产品，其不仅扩增倍数低，且冻存复苏效果差，导致杀瘤效果不佳。
白藜芦醇，是一种非黄酮类多酚有机化合物，是许多植物受到刺激时产生的一种抗毒素，在专利CN 111727961 A公开了一种牙髓干细胞冻存液及其冻存方法，通过在其冻存液中添加白藜芦醇，所述白藜芦醇在所述干细胞冻存液体中的浓度为0.1-10μM，用其冻存过的牙髓干细胞复苏后，其增殖能力得到显著地提升，可以极大地提升牙髓干细胞分离培养的效率。发明人发现将其加入至免疫细胞冻存中，效果较差，细胞活性与表达率远低于预期。
免疫细胞与上述牙髓干细胞等干细胞的功能与应用各不相同，将白藜芦醇直接添加至免疫细胞冻存中效果较差，发明人通过寻找能够促进冷冻保存下免疫细胞存活率的成分并与白藜芦醇复配，达到能够保存免疫细胞并提高复苏免疫细胞活性与表达率，取得了极好的预期效果。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法。
本发明提出的一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-2600-1200U/ml、IL-101200-1800U/ml、γ-干扰素400-600U/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-2600-1200IU/ml、IL-101200-1800IU/ml、沙培林0.001-0.006KE/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-2600-1200IU/ml、IL-11200-1800IU/ml、白藜芦醇20-80ng/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
优选地，所述免疫细胞为自然杀伤细胞或树突状细胞。
优选地，所述无血清淋巴细胞培养基为OpTmizerTM CTSTM无血清培养基或SuperCultureTM L500人淋巴细胞无血清培养基。
一种体外诱导扩增的免疫细胞，采用所述免疫细胞的体外诱导扩增的方法制备。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 10-20mg/ml；人血白蛋白5-15mg/ml；1,3-丙二醇1.2-3mg/ml；海藻糖0.1-0.5ml/ml；白藜芦醇0.2-0.6mg/ml；胡椒碱0.01-0.06ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将所述的免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2-8×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存20-30h，然后转入液氮中冻存。
免疫细胞的复苏包括如下步骤：取出冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中1-2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤2-3次，得到复苏免疫细胞。
本发明的技术效果如下所示：
(1)本发明对免疫细胞的单个核细胞进行诱导扩增培养，得到大量功能激活的免疫细胞，不仅具有诱导效率高、扩增速度快，同时具有成本低的优点；
(2)本发明提出的免疫细胞专用冻存液，可有效提高免疫细胞保存时间，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高，从而满足临床治疗中大量免疫细胞的需求；
(3)在免疫细胞专用冻存液中，海藻糖广泛存在于低等动物、藻类、细菌、真菌、酵母中，是应激代谢的重要产物，具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、高渗透压、有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能；
胡椒碱是一种吡咯烷类酰胺生物碱，发明人通过研究发现，胡椒碱可提高白藜芦醇的活性，可使白藜芦醇的暴露程度增加一倍，本发明在DMSO中，海藻糖保护下采用胡椒碱与白藜芦醇复配，冻存细胞复苏后，其细胞活性与表达率得到显著的提升，这是单独使用白藜芦醇所不具备的。
附图说明
图1为实施例5的免疫细胞体外扩增线形图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-2600U/ml、IL-101200U/ml、γ-干扰素400U/ml、层粘连蛋白5μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-2600IU/ml、IL-101200IU/ml、沙培林0.001KE/ml、层粘连蛋白5μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-2600IU/ml、IL-11200IU/ml、白藜芦醇20ng/ml、层粘连蛋白5μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 10mg/ml；人血白蛋白5mg/ml；1,3-丙二醇1.2mg/ml；海藻糖0.1ml/ml；白藜芦醇0.2mg/ml；胡椒碱0.01ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存20h，然后转入液氮中冻存。
实施例2
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-21200U/ml、IL-101800U/ml、γ-干扰素600U/ml、层粘连蛋白10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-21200IU/ml、IL-101800IU/ml、沙培林0.006KE/ml、层粘连蛋白10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-21200IU/ml、IL-11800IU/ml、白藜芦醇80ng/ml、层粘连蛋白10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 20mg/ml；人血白蛋白15mg/ml；1,3-丙二醇3mg/ml；海藻糖0.5ml/ml；白藜芦醇0.6mg/ml；胡椒碱0.06ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为8×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存30h，然后转入液氮中冻存。
实施例3
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-2700U/ml、IL-101300U/ml、γ-干扰素450U/ml、层粘连蛋白6μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-2700IU/ml、IL-101300IU/ml、沙培林0.0012KE/ml、层粘连蛋白6μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-2700IU/ml、IL-11400IU/ml、白藜芦醇30ng/ml、层粘连蛋白6μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 12mg/ml；人血白蛋白7mg/ml；1,3-丙二醇1.5mg/ml；海藻糖0.2ml/ml；白藜芦醇0.3mg/ml；胡椒碱0.03ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为4×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存25h，然后转入液氮中冻存。
实施例4
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-21150U/ml、IL-101700U/ml、γ-干扰素550U/ml、层粘连蛋白9μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-21100IU/ml、IL-101700IU/ml、沙培林0.005KE/ml、层粘连蛋白9μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-21150IU/ml、IL-11600IU/ml、白藜芦醇75ng/ml、层粘连蛋白9μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
其中所述免疫细胞为树突状细胞。所述无血清淋巴细胞培养基为OpTmizerTMCTSTM无血清培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 18mg/ml；人血白蛋白13mg/ml；1,3-丙二醇2.5mg/ml；海藻糖0.4ml/ml；白藜芦醇0.5mg/ml；胡椒碱0.05ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为6×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存28h，然后转入液氮中冻存。
实施例5
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-21000U/ml、IL-101500U/ml、γ-干扰素500U/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-101500IU/ml、沙培林0.004KE/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-11500IU/ml、白藜芦醇60ng/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
所述免疫细胞为自然杀伤细胞。所述无血清淋巴细胞培养基为SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 15mg/ml；人血白蛋白12mg/ml；1,3-丙二醇2mg/ml；海藻糖0.3ml/ml；白藜芦醇0.3mg/ml；胡椒碱0.04ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为5×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存26h，然后转入液氮中冻存。
对比例1
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-21000U/ml、IL-101500U/ml、γ-干扰素500U/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-101500IU/ml、沙培林0.004KE/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-11500IU/ml、白藜芦醇60ng/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
所述免疫细胞为自然杀伤细胞。所述无血清淋巴细胞培养基为SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 15mg/ml；人血白蛋白12mg/ml；1,3-丙二醇2mg/ml；海藻糖0.3ml/ml；胡椒碱0.04ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为5×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存26h，然后转入液氮中冻存。
对比例2
一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-21000U/ml、IL-101500U/ml、γ-干扰素500U/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-101500IU/ml、沙培林0.004KE/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-21000IU/ml、IL-11500IU/ml、白藜芦醇60ng/ml、层粘连蛋白8μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
所述免疫细胞为自然杀伤细胞。所述无血清淋巴细胞培养基为SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基。
一种免疫细胞冻存的方法，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 15mg/ml；人血白蛋白12mg/ml；1,3-丙二醇2mg/ml；海藻糖0.3ml/ml；白藜芦醇0.3mg/ml；
II、冻存免疫细胞
将免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为5×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存26h，然后转入液氮中冻存。
性能测试
1、免疫细胞体外扩增测试
将实施例5的免疫细胞进行体外扩增测试，分别在第0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天进行细胞计数，绘制免疫细胞体外扩增线形图，测试结果如图1所示，图1为由图可1可知，实施例5制备的免疫细胞在突变体的共同作用下，免疫细胞的数量显著增加，其在前9天为激活并缓慢扩增阶段，12天后开始进入对数生长期，在14天时细胞数量达到1.4×1010，扩增效果优异。
对诱导扩增得到的产品检测乙肝表面抗原、丙肝抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，检测未发现病原体感染，本发明过程安全的，培养过程中没有造成污染。
2、将实施例5和对比例1-2的冻存方法中所得细胞悬浮液进行台盼蓝染色计算活性，采用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将余下的细胞悬液加入冻存管中，每管1mL；分为10天、30天、60天三组，每组3管细胞，总共9管细胞；将冻存管放入-80℃冰箱中冻存26h，转移至液氮中冻存。
将分别在液氮中保存10天、30天、60天的免疫细胞取出，按各组复苏方法执行，将解冻后的CIK细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比，其中细胞活性计算结果如下表1所示，细胞表面标记物表达率检测结果如下表2所示。
表1细胞活性
表2细胞表面标记物表达率
由以上表1、表2可知，在海藻糖的保护下，胡椒碱可提高白藜芦醇的活性，可使白藜芦醇的暴露程度增加一倍，采用胡椒碱与白藜芦醇复配，两者同时加入，冻存细胞复苏后，其细胞活性与表达率得到显著的提升，这时单独使用白藜芦醇所不具备的。
综上，通过实施例5与对比例1-2进行比较可以得出，采用本发明的冻存液可使得细胞复苏后具有更好的细胞活性，细胞生物学特性几乎不发生变化，保证了免疫细胞的生物学活性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种免疫细胞的体外诱导扩增的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、利用免疫细胞专用扩增培养基将免疫细胞的单个核细胞进行第一阶段扩增培养，每1天传代一次，得到初步扩增免疫细胞；
免疫细胞专用扩增培养基为添加了IL-2600-1200U/ml、IL-101200-1800U/ml、γ-干扰素400-600U/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S2、利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，每2天传代一次，得到诱导免疫细胞；
免疫细胞专用诱导培养基为添加了IL-2600-1200IU/ml、IL-101200-1800IU/ml、沙培林0.001-0.006KE/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基；
S3、利用免疫细胞专用激活培养基将诱导免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，每2天传代一次，获得大量的激活功能的免疫细胞；
免疫细胞专用激活培养基为添加了IL-2600-1200IU/ml、IL-11200-1800IU/ml、白藜芦醇20-80ng/ml、层粘连蛋白5-10μg/ml的无血清淋巴细胞培养基。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法，其特征在于，免疫细胞为自然杀伤细胞或树突状细胞。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法，其特征在于，无血清淋巴细胞培养基为OpTmizerTM CTSTM无血清培养基或SuperCultureTM L500人淋巴细胞无血清培养基。
4.一种体外诱导扩增的免疫细胞，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述免疫细胞的体外诱导扩增的方法制备。
5.一种免疫细胞冻存的方法，其特征在于，包括如下步骤：
I、制备免疫细胞专用冻存液
免疫细胞专用冻存液其组分包括：DMSO 10-20mg/ml；人血白蛋白5-15mg/ml；1,3-丙二醇1.2-3mg/ml；海藻糖0.1-0.5ml/ml；白藜芦醇0.2-0.6mg/ml；胡椒碱0.01-0.06ml/ml；
II、冻存免疫细胞
将权利要求4所述免疫细胞与免疫细胞专用冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2-8×107个/ml，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存20-30h，然后转入液氮中冻存。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111491600.9A CN114181901B (zh) | 2021-12-08 | 2021-12-08 | 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111491600.9A CN114181901B (zh) | 2021-12-08 | 2021-12-08 | 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114181901A true CN114181901A (zh) | 2022-03-15 |
| CN114181901B CN114181901B (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=80542736
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111491600.9A Active CN114181901B (zh) | 2021-12-08 | 2021-12-08 | 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114181901B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116751745A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-09-15 | 北京圣美细胞生命科学工程研究院有限公司 | 一种组合免疫细胞外泌体多肽再生因子及其应用 |
| CN117065005A (zh) * | 2023-10-16 | 2023-11-17 | 北京圣美细胞生命科学工程研究院有限公司 | 一种利用组合免疫细胞外泌体多肽因子治疗抑郁症的方法 |
| CN118620839A (zh) * | 2024-08-13 | 2024-09-10 | 山东博森医学工程技术有限公司 | 一种用于提高无血清环境下nk细胞扩增和杀伤活性的培养基和方法 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005102656A (ja) * | 2003-10-02 | 2005-04-21 | Toray Ind Inc | 細胞培養器具およびそれを用いた細胞製剤の製造方法 |
| CN101084001A (zh) * | 2004-09-10 | 2007-12-05 | 杨德茂 | 使用先体外后体内激活的细胞的组合物和疗法以用于骨髓抑制病人 |
| CN102755298A (zh) * | 2012-02-07 | 2012-10-31 | 李万忠 | 白藜芦醇冻干聚合物胶束的制备方法及应用 |
| US20150351380A1 (en) * | 2012-07-25 | 2015-12-10 | Osaka University | Tissue-preserving liquid and tissue-preserving method |
| US20160213584A1 (en) * | 2015-01-20 | 2016-07-28 | Bruce L. Howe | Compositions of resveratrol and methods for their use and manufacture |
| CN111019892A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-17 | 杭州恩格生物医疗科技有限公司 | 一种免疫细胞体外诱导扩增方法 |
| CN111183972A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-05-22 | 成都艾伟孚生物科技有限公司 | 一种组合物及其应用和一种精子冷冻液及其制备方法 |
| CN111454903A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-07-28 | 青岛瑞思德生物科技有限公司 | 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立 |
| WO2020186206A1 (en) * | 2019-03-13 | 2020-09-17 | Membrane Protective Technologies, Inc. | Methods and systems for protective supplementation during temperature depression |
| CN112514891A (zh) * | 2019-12-23 | 2021-03-19 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 一种大熊猫乳汁冻存液及大熊猫乳汁的保存方法 |
| CN112753695A (zh) * | 2021-01-04 | 2021-05-07 | 浙江卫未生物医药科技有限公司 | 一种免疫细胞冻存方法 |
| US20210254106A1 (en) * | 2018-05-30 | 2021-08-19 | Institute For Research In Biomedicine | Engineering b lymphocytes by utilizing endogenous activation-induced cytidine deaminase |
-
2021
- 2021-12-08 CN CN202111491600.9A patent/CN114181901B/zh active Active
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005102656A (ja) * | 2003-10-02 | 2005-04-21 | Toray Ind Inc | 細胞培養器具およびそれを用いた細胞製剤の製造方法 |
| CN101084001A (zh) * | 2004-09-10 | 2007-12-05 | 杨德茂 | 使用先体外后体内激活的细胞的组合物和疗法以用于骨髓抑制病人 |
| CN102755298A (zh) * | 2012-02-07 | 2012-10-31 | 李万忠 | 白藜芦醇冻干聚合物胶束的制备方法及应用 |
| US20150351380A1 (en) * | 2012-07-25 | 2015-12-10 | Osaka University | Tissue-preserving liquid and tissue-preserving method |
| US20160213584A1 (en) * | 2015-01-20 | 2016-07-28 | Bruce L. Howe | Compositions of resveratrol and methods for their use and manufacture |
| US20210254106A1 (en) * | 2018-05-30 | 2021-08-19 | Institute For Research In Biomedicine | Engineering b lymphocytes by utilizing endogenous activation-induced cytidine deaminase |
| WO2020186206A1 (en) * | 2019-03-13 | 2020-09-17 | Membrane Protective Technologies, Inc. | Methods and systems for protective supplementation during temperature depression |
| CN111019892A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-17 | 杭州恩格生物医疗科技有限公司 | 一种免疫细胞体外诱导扩增方法 |
| CN112514891A (zh) * | 2019-12-23 | 2021-03-19 | 成都大熊猫繁育研究基地 | 一种大熊猫乳汁冻存液及大熊猫乳汁的保存方法 |
| CN111183972A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-05-22 | 成都艾伟孚生物科技有限公司 | 一种组合物及其应用和一种精子冷冻液及其制备方法 |
| CN111454903A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-07-28 | 青岛瑞思德生物科技有限公司 | 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立 |
| CN112753695A (zh) * | 2021-01-04 | 2021-05-07 | 浙江卫未生物医药科技有限公司 | 一种免疫细胞冻存方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 刘丹;于丽红;李磊;: "提高白藜芦醇生物利用度的制剂策略", 医药导报, no. 03, pages 66 - 70 * |
| 舒晓宏: "白藜芦醇及其生物利用度", 《大连医科大学学报》, vol. 40, no. 3, pages 193 - 197 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116751745A (zh) * | 2023-08-09 | 2023-09-15 | 北京圣美细胞生命科学工程研究院有限公司 | 一种组合免疫细胞外泌体多肽再生因子及其应用 |
| CN117065005A (zh) * | 2023-10-16 | 2023-11-17 | 北京圣美细胞生命科学工程研究院有限公司 | 一种利用组合免疫细胞外泌体多肽因子治疗抑郁症的方法 |
| CN118620839A (zh) * | 2024-08-13 | 2024-09-10 | 山东博森医学工程技术有限公司 | 一种用于提高无血清环境下nk细胞扩增和杀伤活性的培养基和方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114181901B (zh) | 2024-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114181901A (zh) | 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法 | |
| CN108207930B (zh) | 一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用 | |
| CN104719282B (zh) | 一种外周血单个核细胞无血清冻存液及冻存方法 | |
| Helliot et al. | Cryopreservation for the elimination of cucumber mosaic and banana streak viruses from banana (Musa spp.) | |
| Withers | Freeze preservation of somatic embryos and clonal plantlets of carrot (Daucus carota L) | |
| ES2762966T3 (es) | Procedimiento de crioconservación de células con objetivo terapéutico | |
| CN111602648B (zh) | 一种免疫细胞无血清冻存液及冻存方法 | |
| Kim et al. | A comparative study of the effects of glycerol and hydroxyethyl starch in canine red blood cell cryopreservation | |
| Hak et al. | Toxic effects of DMSO on cultured beating heart cells at temperatures above zero | |
| CN111019892A (zh) | 一种免疫细胞体外诱导扩增方法 | |
| US3852155A (en) | Cryopreservation of equine cell cultures | |
| CN112167245A (zh) | 用于细胞保存的保护剂 | |
| CN114097770B (zh) | 一种免疫细胞冻存液及其应用方法 | |
| JPH0646840A (ja) | 細胞凍結保存液 | |
| Ercan et al. | Reducing bacterial density in the semen of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by applying gradient centrifugation and swim‐up washing methods | |
| Varianytsia et al. | Storage methods of complex RNA viruses | |
| CN108018260A (zh) | 用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏液及其应用 | |
| CN116058363A (zh) | 一种增加nk细胞冻存复苏后活性的方法及其应用 | |
| CN111411087B (zh) | 一种鲤疱疹病毒ii型弱毒株及其应用 | |
| Berge et al. | Preservation of enteroviruses by freeze-drying | |
| Damjanovic et al. | The use of polyvinylpyrrolidone as a cryoprotectant in the freezing of human lymphocytes | |
| Rowe | Cryopreservation of red blood cells | |
| Herold et al. | Mitochondria in odontoblastic processes | |
| Wolf et al. | Infectious pancreatic necrosis virus: lyophilization and subsequent stability in storage at 4 C | |
| CN108251366A (zh) | 用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏液及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |