ES2716674T3 - Célula congelada lista para ensayo y método para minimizar variabilidad en el rendimiento de la misma - Google Patents

Célula congelada lista para ensayo y método para minimizar variabilidad en el rendimiento de la misma Download PDF

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Christophe Lallemand
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Description

DESCRIPCIÓN
Célula congelada lista para ensayo y método para minimizar variabilidad en el rendimiento de la misma Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de células congeladas listas para ensayo.
Descripción de la técnica relacionada
El uso de células congeladas listas para ensayo permite que se lleven a cabo ensayos basados en células sin la necesidad de cultivo celular o del mantenimiento de las células de manera continua en el laboratorio, reduciendo enormemente de ese modo los costes y aumentando la aplicabilidad de ensayos basados en células para uso rutinario en ensayos de examen y diagnóstico. Las células congeladas listas para ensayo presentan a menudo una sensibilidad marcadamente reducida, sin embargo, en relación con la de las células cultivadas de manera continua cuando se usan en un ensayo particular. Además, lotes individuales de células así como viales individuales de células congeladas listas para ensayo presentan a menudo un alto grado de variabilidad, tanto dentro de un mismo ensayo como entre ensayos, en su rendimiento. El tratamiento de células con vinblastina proporciona un medio de evitar la proliferación celular sin reducir la sensibilidad del ensayo, permitiendo de ese modo la comercialización de células congeladas listas para ensayo al tiempo que se evita que un cliente cultive las propias células (documento WO2004/039990; documento US2004/0235157; patente estadounidense 7.470.536).
El tratamiento de células con vinblastina y la congelación posterior pueden conducir a apoptosis y lisis celular, que resultan del tratamiento con vinblastina y la formación de cristales de hielo respectivamente. Esto da como resultado la activación y liberación de diversas proteasas (caspasas, catepsonas y calpaínas) al citosol. La apoptosis y/o lisis celular pueden conducir también a ubiquitinación y por tanto a actividad proteosómica aumentada. Se liberan también especies reactivas de oxígeno (ROS) y pueden crear un estado de estrés oxidativo. Todo lo anterior puede alterar o dañar potencialmente la actividad enzimática bioluminiscente e interferir con el resultado de ensayos de gen indicador. La luciferasa de luciérnagas (FL) es generalmente menos estable que la luciferasa de Renilla (RL) y más sensible a la inactivación en células apoptóticas. Además, especies reactivas de oxígeno también pueden activar y modular determinadas rutas de transducción de señales tales como la ruta de NF k B que conduce por ejemplo a variabilidad en las lecturas de FL inducidas por TNFa . Un enfoque para superar tales problemas es modificar por ingeniería genética las proteínas bioluminiscentes para aumentar su estabilidad por ejemplo mutando un sitio de escisión por proteasas; o aumentando su estabilidad frente a pH o termoestabilidad (Law et al., 2006; Baggett et al., 2004; Thompson et al., 1997; Loening et al., 2006). Un enfoque alternativo que es más rápido, barato y generalmente aplicable a diferentes tipos de ensayos se describe en el presente documento como objeto de la presente invención.
Weetall, M. et al., Anal. Biochem., 2001, 293(2), páginas 277-287, se refieren a una célula eucariota lista para ensayo almacenada en una composición que comprende un crioconservante y un inhibidor de xantina oxidasa proporcionando de ese modo un ensayo homogéneo con variación reducida de pocillo a pocillo y de placa a placa. El documento WO 92/03046 proporciona un método para congelar y descongelar células que potencia sustancialmente la viabilidad de digestos de órganos y cultivos celulares primarios. Los mejores resultados se lograron cuando estaba presente el 5% de FCS en las composiciones. La disolución de Beltzer con DMSO al 10% demostró ser el medio más eficaz para la congelación de hepatocitos humanos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una célula eucariota congelada lista para ensayo (congelada almacenada) en una composición que incluye un crioconservante y un inhibidor de xantina oxidasa y un método de preparación de la misma para minimizar la variabilidad en el rendimiento de la célula, particularmente en cuanto a variabilidad indeseable dentro de un mismo ensayo y entre ensayos.
En consecuencia, la presente invención se refiere a una célula eucariota lista para ensayo congelada almacenada en una composición que comprende un crioconservante y alopurinol, estando la concentración de alopurinol en la composición en el intervalo de 50 a 200 |i M.
La presente invención proporciona también un kit que contiene una pluralidad de las células eucariotas congeladas listas para ensayo de la presente invención.
En consecuencia, la presente invención se refiere a un kit para llevar a cabo un ensayo, que comprende:
- un dispositivo de pruebas que tiene una pluralidad de pocillos, siendo dicho dispositivo de pruebas preferiblemente una placa de microtitulación; y
- un reactivo que comprende una pluralidad de las células listas para ensayo de la presente invención, estando dicho reactivo dispuesto preferiblemente en los pocilios de dicho dispositivo de pruebas.
La presente invención se refiere también a un método para preparar la célula eucariota congelada lista para ensayo según la invención, que comprende:
añadir una composición que comprende un crioconservante y alopurinol a una célula eucariota; y
enfriar la célula a una velocidad de 1°C por minuto hasta -80°C para almacenamiento congelado de la célula eucariota lista para ensayo, mejorando de ese modo el rendimiento, tras la descongelación, de la célula lista para ensayo en un ensayo.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A y 1B son gráficos que muestran las unidades relativas de luciferasa (URL) para células KJL-2 después de congelar durante un día (figura 1A) o 5 días (figura 1B) en la disolución de crioconservante preferida dada a conocer en el documento WO2004/039990; el documento US 2004/0235157 y la patente estadounidense 7.470.536 (es decir, el 40% de suero bovino fetal (FBS) y el 2,5% de dimetilsulfóxido el l0% de glicerol) con o sin (control) la presencia de alopurinol 100 |iM, en la que se sometieron a ensayo los productos de los genes indicadores de FL y RL inducidos por TNFa (después de descongelar las células congeladas) usando el sistema Promega Dual-Glo que permite determinar secuencialmente la actividad de FL y RL en el mismo pocillo de una placa de microtitulación. El eje X es TNFa, en ng/ml.
La figura 2 es un gráfico que muestra que alopurinol (designado AO - barra derecha de cada par de barras; 100 mM) redujo el coeficiente de variación entre distintos viales (%CV) en comparación con el control que no contiene alopurinol (designado NAO - barra izquierda de cada par de barras). El eje X es TNFa, en ng/ml.
Las figuras 3A y 3B son gráficos que muestran la variación de vial a vial en URL normalizadas (figura 3A) y las veces normalizadas de inducción (figura 3B) para las células tratadas con vinblastina congeladas en ausencia de alopurinol y el ensayo usado en las figuras 1A y 1B.
Las figuras 4A y 4B son gráficos que muestran la variación de vial a vial en URL normalizadas (figura 4A) y las veces normalizadas de inducción (figura 4B) para las células tratadas con vinblastina congeladas en presencia de 100 |iM de alopurinol y el ensayo usado en las figuras 1A y 1B.
Las figuras 5A y 5B son gráficos que muestran la variación de vial a vial en URL normalizadas (figura 5A) y las veces normalizadas de inducción (figura 5B) para las células tratadas con vinblastina congeladas en presencia de 1 mM de glutatión-SH (GSH) y el ensayo usado en las figuras 1A y 1B.
Las figuras 6A y 6B son gráficos que muestran la variación de vial a vial en URL normalizadas (figura 6A) y las veces normalizadas de inducción (figura 6B) para las células tratadas con vinblastina congeladas en presencia de 5 mM de N-acetilcisteína (NAC) y el ensayo usado en las figuras 1A y 1B.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona una célula eucariota lista para ensayo que se almacena congelada de una manera tal que se minimiza la variación (variabilidad dentro de un mismo ensayo y entre ensayos entre lotes individuales y entre recipientes individuales, por ejemplo, viales o placas de múltiples pocillos, o kits) en el rendimiento de células congeladas listas para ensayo, tras la descongelación, para un ensayo deseado. Una célula lista para ensayo de este tipo que tiene la propiedad ventajosa de variabilidad dentro de un mismo ensayo y entre ensayos minimizada (es decir, baja, insignificante o despreciable) entre lotes o recipientes individuales es de importancia comercial como una necesidad insatisfecha. Una célula eucariota adecuada que va a usarse en un ensayo deseado, tal como un ensayo de gen indicador, puede prepararse para que sea una célula congelada lista para ensayo según la presente invención preparando la célula eucariota para almacenamiento congelado poniendo la célula en contacto con una composición que contiene un crioconservante y un inhibidor de xantina oxidasa. Por consiguiente, la célula eucariota lista para ensayo de la presente invención es parte de una composición que contiene un inhibidor de xantina oxidasa y un crioconservante, y se almacena congelada en esta composición. La célula eucariota que se convierte en una célula eucariota congelada lista para ensayo según la presente invención puede incluir cualquiera de las muchas células eucariotas usadas comúnmente en ensayos, tales como, por ejemplo, ensayos enzimáticos y ensayos de gen indicador. Los ejemplos incluyen una célula de mamífero, aviar (preferiblemente de pollo), de pez (preferiblemente de pez cebra), de insecto y de levadura. La célula de mamífero es preferiblemente una célula humana y más preferiblemente una célula promonocítica humana (lo más preferiblemente una célula PIL5 que porta el vector ISRE-luc que contiene el constructo de gen indicador de luciferasa de luciérnagas y se da a conocer en la patente estadounidense 7.470.536) o una célula de eritroleucemia humana (lo más preferiblemente una célula KJL-2, derivada de la línea celular K562 con n.° de registro de ATCC CCL-243, una leucemia mielógena crónica). Otras líneas celulares preferidas incluyen líneas celulares mieloides humanas (es decir, U266R), de linfoma de células T humanas (es decir, Jurkatt), de adenocarcinoma de mama humano (es decir, MCF7) y líneas celulares de linfoma de ratón (es decir, L1210) y de leucemia eritroide de ratón.
El inhibidor de la enzima xantina oxidasa en la composición en la que está presente la célula eucariota para el proceso de congelación (y almacenamiento congelada) sirve para inhibir la producción de peróxido de hidrógeno (y quizás actúa también de otra manera aún no determinada). El inhibidor preferido de xantina oxidasa es alopurinol, y la concentración de alopurinol en la composición en la que la célula eucariota se almacena está en un intervalo de aproximadamente 50 a 200 |iM, más preferiblemente de aproximadamente 75 a 150 |iM y lo más preferiblemente es de 100 |iM. Se contemplan también mezclas de inhibidores de xantina oxidasa en la composición para almacenar la célula.
En una realización preferida de la presente invención, la composición incluye también un eliminador de especies reactivas de oxígeno (ROS). Se conocen en la técnica muchos eliminadores de ROS (por ejemplo, peróxido de hidrógeno), pero se prefieren N-acetilcisteína (NAC) y glutatión-SH (GSH). Cuando se usa NAC como eliminador de ROS en la composición, la concentración de NAC está en un intervalo de aproximadamente 1 mM a 10 mM, preferiblemente en un intervalo de 2,5 mM a 5 mM, y más preferiblemente es de 5 mM. Cuando se usa GSH en la composición, la concentración de GSH está en un intervalo de aproximadamente 0,5 mM a 5 mM, preferiblemente en un intervalo de aproximadamente 1 mM a 2 mM, y más preferiblemente es de 1 mM. Pueden usarse mezclas de eliminadores incluyendo mezclas de NAC y GSH.
La célula eucariota lista para ensayo según la presente invención es preferiblemente una célula (por ejemplo, después de haberse transformado/transfectado con un constructo de ADN tal como un constructo de gen indicador para la detección en un ensayo de una molécula o señal de interés) que se ha tratado con un agente químico antimitótico o pro-apoptótico tal como vinblastina, cisplatino, doxorrubicina o un agente intercalante antitumoral (es decir, mitomicina C) en una cantidad suficiente y durante un tiempo suficiente de manera que la célula tratada mantiene la actividad de transducción de señales de la proteína de superficie celular o receptor de reconocimiento de patrones durante un periodo de al menos aproximadamente 1 hora pero no más de aproximadamente 30 días a una temperatura por encima de la congelación tras el tratamiento con el agente, periodo de tiempo después del cual la célula tratada experimenta inmediatamente muerte celular. Se conocen en la técnica muchos constructos de gen indicador. El constructo de ADN que puede portar la célula es preferiblemente uno que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de gen indicador operativamente unido a uno o más elementos de control de la transcripción que se regula mediante la actividad de transducción de señales de una proteína de superficie celular en respuesta a una señal extracelular. Se dan a conocer ejemplos preferidos del constructo de ADN así como la célula para ensayo en el documento WO2004/039990; el documento US2004/0235157; la patente estadounidense 7.470.536; el documento WO2008/055153; el documento US20080138818; el documento WO2009/058884; el documento US20090136947; la patente estadounidense 8.426.123; el documento WO2009/111572; y el documento US20110189658.
Un agente antimitótico o proapoptótico afectará a una célula tratada cuando empieza a replicarse, tal como por ejemplo evitando la formación del huso acromático, induciendo de ese modo apoptosis y destruyendo la célula. Por tanto, las células que se han tratado con un agente antimitótico o proapoptótico, tales como células promonocíticas humanas transformadas, tendrán una vida útil de almacenamiento de aproximadamente 24 horas durante la cual puede llevarse a cabo el ensayo de transducción de señales, y periodo de tiempo después del cual las células morirán. Se apreciará que una célula que tiene sólo una vida útil de almacenamiento de 24 horas no es deseable desde un punto de vista comercial. Con el fin de prolongar la vida útil de almacenamiento y minimizar variabilidad dentro de un mismo ensayo y entre ensayos en el rendimiento de las células, las células tratadas se lavan inmediatamente para retirar el agente antimitótico o proapoptótico residual (es decir, retirar la célula eucariota tratada del contacto adicional con el agente antimitótico o proapoptótico), y entonces se ponen en contacto (tal como mediante resuspensión de la célula o pluralidad de células) con la composición que incluye un crioconservante y un inhibidor de xantina oxidasa según la presente invención tal como se dio a conocer anteriormente. Una vez que la(s) célula(s) se pone(n) en contacto con la composición de crioconservación, se congelan inmediatamente, estado en el que tendrán una vida útil de almacenamiento mucho más prolongada, dependiendo de la manera de congelar y descongelar. Una vez descongeladas, sin embargo, las células que se han tratado con un agente antimitótico o proapoptótico deben usarse en el plazo de 24 horas, después del cual experimentarán muerte celular (es decir, apoptosis). Debe reconocerse en el presente documento que la célula eucariota lista para ensayo de la presente invención es preferiblemente una que se ha tratada con un agente antimitótico o proapoptótico tal como se da a conocer en el documento WO2004/039990; el documento US2004/0235157; la patente estadounidense 7.470.536; el documento WO2009/058884; el documento US20090136947; la patente estadounidense 8.426.123; el documento WO2009/111572; y el documento US20110189658. Una célula no tratada con un agente antimitótico o proapoptótico para su uso en un ensayo en un momento posterior puede prepararse para que esté lista para ensayo y congelarse de la misma manera que se comentó en el presente documento excepto porque no se trata con un agente antimitótico o proapoptótico.
El conocimiento común es que la crioconservación de células requiere un proceso (y equipo) de congelación y descongelación especial en el que las células se congelan a una velocidad de aproximadamente 1°C por minuto hasta que alcanzan -80°C o temperaturas de nitrógeno líquido de aproximadamente -200°C, en donde pueden almacenarse indefinidamente, y después de lo cual deben descongelarse muy rápidamente. Se prefiere una temperatura de almacenamiento de o aproximadamente de -80°C. A menudo, se usa también dimetilsulfóxido (DMSO) u otro crioconservante con el fin de ayudar a proteger a las células. Aunque el glicerol es también un compuesto crioconservante conocido que protegerá a las células, existe la posibilidad de que pueda evitar que ligandos proteicos interaccionen con receptores de superficie en el porcentaje alto (el 50%) de glicerol usado convencionalmente para la crioconservación. Sin embargo, puede usarse un porcentaje bajo de glicerol (mucho menor que el 50% usado convencionalmente). El DMSO no tiene esta desventaja. Después de tratar con un agente antimitótico o apoptótico, una célula puede lograr un vida útil de almacenamiento prolongada si, antes de la congelación, se pone en contacto con una composición que incluye un inhibidor de xantina oxidasa y un crioconservante tal como DMSO de manera que una vez descongelada una célula de este tipo permanecerá activa, es decir, para ensayos de transducción de señales usados para determinar la cantidad de ligando o anticuerpos neutralizantes frente al ligando o frente a un anticuerpo anti-ligando, durante aproximadamente 24 horas hasta que experimenta apoptosis como resultado de tratarse con un agente antimitótico y proapoptótico. Cualquier agente antimitótico o proapoptótico que destruye células durante el proceso de replicación induciendo apoptosis, tal como radiación y y agentes químicos tales como vinblastina, 5-FU, cisplatino, doxorrubicina o un agente intercalante antitumoral (es decir, mitomicina C), puede usarse para este propósito ya que se esperaría que las células permanezcan biológicamente activas durante un periodo de quiescencia y hasta que llegue el momento en que las células tratadas empiezan a morir.
La célula transformada tratada (por ejemplo, transformada con un constructo de ADN, tal como con un constructo de gen indicador) se congela a una temperatura y en condiciones tales que se reanudará la transducción de señales después de la descongelación. Aunque la célula se congela preferiblemente a una temperatura a o de aproximadamente -80°C, está previsto que otras temperaturas adecuadas para la crioconservación de las células, tales como la temperatura de nitrógeno líquido de aproximadamente -200°C, se abarquen también. Esto se aplica a todas las células, tanto si se tratan como si no se tratan con un agente antimitótico o proapoptótico. La célula se pone en contacto (por ejemplo, se resuspende) con una composición que incluye un inhibidor de xantina oxidasa y un crioconservante antes de congelar la célula. Dimetilsulfóxido (DMSO) es el crioconservante preferido aunque otros crioconservantes adecuados que tienen una alta afinidad de unión con el agua, tales como glicol, pueden usarse siempre y cuando sean adecuados a la temperatura final para la congelación y no interfieran con el uso de la célula después de la descongelación.
Preferiblemente, se usa el 2,5% de DMSO en combinación con el 10% de glicerol como crioconservante. Se prefiere también la presencia de suero bovino fetal (FBS) en la composición, particularmente en la cantidad de aproximadamente el 40% de FBS.
Un aspecto adicional de la presente invención es un método para preparar la célula eucariota congelada lista para ensayo e implica añadir una composición que incluye un crioconservante y un inhibidor de xantina oxidasa a una célula eucariota (tratada o no tratada con un agente antimitótico o proapoptótico), y enfriar la célula a una velocidad de preferiblemente 1°C por minuto aproximadamente hasta aproximadamente -80°C para almacenamiento congelado de la célula eucariota lista para ensayo para mejorar de ese modo el rendimiento, tras la descongelación, de la célula lista para ensayo en un ensayo. Aunque la velocidad de aproximadamente 1°C por minuto es la más preferida, en parte porque el equipo para hacerlo se usa comúnmente en la técnica, una velocidad de congelación ligeramente modificada que puede determinarse empíricamente mediante experimentación de rutina, tal como entre aproximadamente 0,5°C y 1,5°C, puede ser adecuada también. Una pluralidad de células eucariotas congeladas listas para ensayo preparadas de tal manera pueden almacenarse congeladas en una pluralidad de viales o recipientes individuales separados, minimizando el método ventajosamente la variabilidad entre viales o recipientes individuales (por ejemplo, en variabilidad dentro de un mismo ensayo y entre ensayos) en el rendimiento de las células eucariotas congeladas listas para ensayo, tras la descongelación, en un ensayo.
La célula, cuando se trata con un agente antimitótico o proapoptótico, da como resultado una línea celular comercial que tiene las propiedades comercialmente deseables de una vida útil de almacenamiento suficiente para el propósito del ensayo y de ser una célula de un solo uso que no puede propagarse para uso adicional posible. Preferiblemente, la célula se trata o bien 1) mediante irradiación con de 6 a 12 Gy de radiación y, más preferiblemente aproximadamente 9 Gy, y almacenamiento a temperatura ambiente durante hasta 14 días después de la irradiación 0 bien 2) mediante exposición a un agente antimitótico o proapoptótico, tal como vinblastina, cisplatino o 5-fluorouracilo, lo más preferiblemente vinblastina, durante 10 minutos a 37°C, ambos antes de la resuspensión en lo más preferiblemente una disolución/composición que contiene el 40% de suero bovino fetal (FBS) y el 2,5% DMSO el 10% de glicerol, 100 |i M de alopurinol (5 mM de NAC o 1 mM de GSH) y congelación a -80°C. Una célula no tratada con un agente antimitótico o proapoptótico puede ponerse en contacto con lo más preferiblemente una disolución/composición que contiene el 2,5% DMSO el 10% de glicerol, 100 |i de alopurinol (5 mM de NAC o 1 mM de GSH), opcionalmente el 40% o una cantidad menor de FBS, y congelarse a -80°C.
Los expertos habituales en la técnica, basándose en la orientación proporcionada en el presente documento, reconocerán que los parámetros (algunos de los cuales no serán aplicables cuando la célula es una célula no tratada con un agente antimitótico o proapoptótico) que pueden variarse para optimizar adicionalmente la composición y las condiciones incluyen:
1) Concentración de FBS. Aparte de FBS, podrán usarse la mayoría de los sueros, ya que actúa como sumidero de tóxicos para proteger a las células de las toxinas, tal como mientras se descongelan o mientras se tratan con un agente antimitótico o proapoptótico. La concentración de FBS puede provocar que los resultados varíen.
2) El tiempo es una variable. La cantidad de tiempo de exposición a un agente químico antimitótico o proapoptótico, por ejemplo vinblastina, antes de que las células se extraigan por centrifugación y se laven para retirar el agente (es decir, vinblastina).
3) Usando vinblastina la formulación de la vinblastina marca la diferencia. En la actualidad, se usa preferiblemente vinblastina soluble en una formulación tamponada previamente patentada comercializada por Eli Lilly con el nombre Velbe en Francia. Una formulación diferente puede requerir una combinación de parámetros ligeramente diferente.
4) La concentración de vinblastina.
5) Concentración de células durante el tratamiento con vinblastina.
6) La cantidad de crioconservante o combinación de crioconservantes.
Todos estos parámetros pueden variarse empíricamente y los resultados después de la congelación se sometieron a prueba para determinar la sensibilidad y precisión y dentro de un mismo ensayo y entre ensayos después de descongelarse. Esto puede determinarlo fácilmente un experto habitual en la técnica sin excesiva experimentación, particularmente en vista de la orientación proporcionada en los experimentos mostrados en el presente documento y en las figuras 11-24 para células PIL5 en el documento WO 2004/039990; el documento Us 2004/023517; y la patente estadounidense 7.470.536. Las células tratadas con un agente antimitótico o proapoptótico son aquellas con sustancialmente la misma sensibilidad que las células vivas no tratadas durante un periodo de al menos una hora, preferiblemente 8-24 horas, tras la descongelación pero que tienen una viabilidad de no más de 30 días, preferiblemente no más de 14 días, más preferiblemente no más de 5 días, lo más preferiblemente no más de 3 días.
Se ejemplifican a continuación protocolos para la preparación de placas de ensayo de microtitulación y ampollas/viales de células PIL5 (como células modelo) tratadas con el agente antimitótico y proapoptótico vinblastina 1 |ig/ml durante 10 minutos a 37°C antes del almacenamiento congelado a - 80°C y descongelación en un momento posterior para los propósitos de llevar a cabo el ensayo.
PREPARACIÓN DE PLACAS DE ENSAYO DE MICROTITULACIÓN
1. Se tratan células PIL5 a una concentración de aproximadamente 2 x 105 a 7 x 105 células/ml en medio RMPI 1640 con el 10% de suero bovino fetal (FBS) con una disolución recién preparada de vinblastina 1 |ig/ml (comercialmente disponible de Eli Lilly con la formulación tamponada previamente VELBE), diluida a partir de 1 mg/ml en H2O, durante 10 minutos a 37°C en una atmósfera del 5% de CO2 en aire. Puede usarse un incubador de CO2 por comodidad.
2. Las células PIL5 se centrifugan a 800 x g durante 10 minutos a 4°C, y se lavan una vez con el mismo volumen de medio RPMI 1640 con el 10% de FBS para retirar la vinblastina.
3. Las células PIL5 se resuspenden a una concentración de 2 x 107 células/ml en medio RMPI 1640 con el 40% de suero bovino fetal (FBS), el 2,5% de dimetilsulfóxido el 10% de glicerol y 100 |iM de alopurinol (5 mM de NAC o 1 mM de GSH).
4. La suspensión celular se dispensa en los pocillos de una placa de microtitulación de fondo plano para dar 300.000 células por pocillo (equivalentes a 25 |il de suspensión celular por pocillo).
5. La placa de microtitulación se congela a -80°C en una bolsa de aluminio sellada a vacío con la cubierta hacia arriba.
6. Las placas de microtitulación se almacenan posteriormente durante periodos limitados a -20°C hasta su uso. Alternativamente, las células PIL5 a una concentración de 2 x 107 células/ml en medio RMPI 1640 con el 40% de suero bovino fetal (FBS) y el 2,5% de dimetilsulfóxido el 10% de glicerol pueden congelarse a -80°C o -200°C en viales de crioconservación individuales o múltiples.
Inmediatamente antes de su uso, el vial se descongela rápidamente y las células se distribuyen en una o más placas de microtitulación. Pueden prepararse también viales que contienen células suficientes para la mitad o una cuarta parte de una placa de microtitulación según se requiera.
Se prefiere que la temperatura a la que las células se congelan sea de aproximadamente -80°C y que las células se resuspendan en una disolución, por ejemplo, medio RPMI 1640, con aproximadamente 100 |iM de alopurinol, de aproximadamente 2,5 a 5 mM de NAC (preferiblemente aproximadamente 5 mM), que contiene crioconservantes, que preferiblemente son aproximadamente el 2,5% de DMSO aproximadamente el 10% glicerol, antes de la congelación. Puede incluirse ventajosamente FBS en la cantidad del 40% o menos cuando sea apropiado.
Un aspecto adicional de la presente invención es un kit que contiene una pluralidad de las células eucariotas congeladas listas para ensayo. Este kit para su uso en llevar a cabo un ensayo incluye un dispositivo de pruebas que tiene una pluralidad de pocilios y un reactivo que contiene una pluralidad de células congeladas listas para ensayo según la presente invención. Preferiblemente, el dispositivo de pruebas es una placa de microtitulación de múltiples pocillos, pero puede ser también cualquier tipo de receptáculo, tal como platos o placas de Petri, con una pluralidad de pocillos en los que puede llevarse a cabo un ensayo. Se prefiere que el reactivo que contiene una pluralidad de las células eucariotas congeladas listas para ensayo ya esté dispuesto en los pocillos del dispositivo de pruebas, aunque se apreciará que tales células puede en su lugar dispensarlas en los pocillos del dispositivo de pruebas el usuario final justo antes de llevar a cabo el ensayo.
Habiéndose descrito ahora la invención en general, la misma se entenderá más fácilmente por referencia al siguiente ejemplo que se proporciona a modo de ilustración.
Ejemplo
En resumen, las células no tratadas o las células tratadas con vinblastina tal como se describieron en el documento WO 2004/039990; el documento US 2004/0235157 y la patente estadounidense 7.470.536 se trataron durante 10 minutos con sustancias que inhiben la formación de especies reactivas de oxígeno y/o eliminadores de especies reactivas de oxígeno o bien solos o bien de manera concomitante con el tratamiento con vinblastina. Las células se congelaron entonces usando el medio crioconservante descrito en el documento WO 2004/039990; el documento US 2004/0235157 y la patente estadounidense 7.470.536 con o sin sustancias que inhiban la formación de especies reactivas de oxígeno y/o eliminadores de especies reactivas de oxígeno. Se usaron células KJL-2 en todos los experimentos (llevados a cabo hasta la fecha). Todos los grupos se trataron con vinblastina usando el mismo procedimiento descrito en el documento w O 2004/039990; el documento US 2004/0235157 y la patente estadounidense 7.470.536. Con el fin de reducir la formación de cristales de hielo y la lisis celular posterior, se congelaron todos los grupos experimentales usando el sistema de congelación controlado por Biocison libre de alcohol que enfría células a aproximadamente 1,0°C/minuto. Todos los ensayos se efectuaron usando Dual-Glo (Promega, n.° de catálogo 2920) que permite que se determinen secuencialmente la actividad de luciferasa de luciérnagas (FL) y luciferasa de Renilla (RL) en el mismo pocillo de una placa de microtitulación.
RESULTADOS
El tratamiento de KJL-2 (derivada de la línea celular K562 con el n.° de registro de ATCC CCL-243, unas células de leucemia mielógena crónica) con estaurosporina 10 micromolar, un fármaco que induce apoptosis, inhibe la actividad de FL progresivamente a lo largo de 24 horas mientas que la actividad de RL permanece bastante constante.
El tratamiento previo de células con diversos inhibidores de proteasas (pepstatina A, PMSF, cloruro de amonio, etc.), y la adición de los inhibidores de proteasas al medio de congelación no aumentaron significativamente la actividad de FL.
El tratamiento previo de células con los inhibidores de proteosoma MG-132, epoximicina y lactacistina no aumentó la actividad de FL significativamente. MG-132, que se sabe que inhibe la transducción de señales de NFickB, redujo la actividad de FL (Nakajima et al., 2011). Además, determinadas rutas de transducción de señales tales como la ruta de p-catenina requieren un proteosoma funcional (Jullig et al., 2006).
Se producen también varios radicales libres durante el estrés oxidativo incluyendo superóxido O2', radical hidroxilo (-OH) y peróxido de hidrógeno H2O2.
Los inhibidores de O2' permeables en células, Tiron y TEMPOL, no tenían efecto sobre la razón FL/RL.
MNTMPyP, un mimético de superóxido dismutasa (SOD) permeable en células, tampoco tenía efecto sobre la razón FL/RL.
Manitol, un eliminador de -OH específico y el quelante de hierro deferoxamina, y el quelante de cobre tetraetilenpentamina, tampoco tenían efecto sobre la razón FL/RL. Se investigaron también sustancias que reducen H2O2 tales como catalasa (eliminador de H2O2), alopurinol (inhibidor de xantina oxidasa XO), ácido acetilsalicílico, inhibidor de ciclooxigenasa (COX 1 COX 2) y Vioxx (inhibidor de COX2).
El ácido acetilsalicílico y Vioxx aumentaron la actividad de FL marginalmente.
El tratamiento de células con p-mercaptoetanol puede ser también de algún uso.
Se sometió a prueba también el efecto de alopurinol que inhibe la enzima xantina oxidasa que oxida hipoxantina y xantina, produciendo H2O2 como subproducto. Los resultados muestran que el tratamiento de células con alopurinol aumenta significativamente los valores de FL (figuras 1A y 1B). Además, el alopurinol parece reducir el coeficiente de variación entre viales (figura 2).
El alopurinol redujo la variación en un mismo vial con relación a lo observado con células tratadas con vinblastina sola (figuras 3A y 3B) tanto si los resultados se expresaron como expresión de FL normalizada con respecto a la expresión de RL constitutiva (figura 4A: valores de URL normalizados) o si se expresaron como veces normalizadas de inducción (figura 4B). El tratamiento con alopurinol de células KJL-2, sin embargo, dio como resultado alguna alteración de la forma de la curva de respuesta a la dosis de TNFa a concentraciones de TNFa de 10 ng/ml y mayores (figuras 4A y 4B).
Además de alopurinol, que inhibe la producción de H2O2, se investigaron también los efectos de glutatión-SH (GSH; forma reducida de glutatión) y N-acetilcisteína (NAC) con el fin de neutralizar el H2O2 ya producido dentro de la célula. El tratamiento de células KJL-2 con GSH parecía ser eficaz en la reducción de la variación de vial a vial (figuras 5A y 5B). La N-acetilcisteína parecía ser superior al tratamiento con GSH en la reducción de la variación de vial a vial tanto si los resultados se expresaron como expresión de FL normalizada con respecto a expresión de RL constitutiva (figura 6A: valores de URL normalizados) o si se expresaron como veces normalizadas de inducción (figura 6B).
El mayor grado de variabilidad en las lecturas de FL observado tras el tratamiento con glutatión-SH con relación al observado tras el tratamiento con N-acetilcisteína se debe lo más probablemente a la capacidad de glutatión-SH para interaccionar con la ruta de NF k B y por tanto influir en la activación por TNFa de la actividad de FL. Por tanto, se usó N-acetilcisteína (NAC) como alternativa a la adición de glutatión-SH con el fin de neutralizar el H2O2 ya producido dentro de la célula sin afectar a la ruta de NF k B. Las células se trataron también con 1 mM de metionina para reducir el flujo de salida de GSH desde las células tanto durante el cultivo como durante el procedimiento de ensayo.
DISCUSIÓN
La observación que los valores de URL bajos observados en algunos lotes de células congeladas listas para ensayo no se producen inmediatamente después de la congelación sino que tardan algunos días, de 5 a 7, en hacerse patentes y de que los valores de u Rl disminuyen entonces progresivamente con el tiempo, sugiere que está(n) produciéndose un(os) acontecimiento(s) a -80°C que inhiben posteriormente la actividad de FL. Dado que las reacciones enzimáticas se producen a velocidades notablemente reducidas a -80°C, esto sugiere que está produciéndose una reacción química que puede dar como resultado, por ejemplo, la producción y acumulación de especies reactivas de oxígeno. Los resultados obtenidos con alopurinol sugieren que H2O2 es la principal ROS responsable de los bajos niveles de FL observados tanto en determinados lotes de células dando como resultado variabilidad de lote a lote como en determinados viales individuales dando como resultado variabilidad de vial a vial. Por tanto, se encontró que la incorporación de N-acetilcisteína (NAC) tanto durante el tratamiento con vinblastina como en el medio crioconservante (es decir, el 40% de suero bovino fetal (FBS) y el 2,5% de dimetilsulfóxido el 10% de glicerol) descrito en el documento WO2004/039990; el documento US 2004/0235157 y la patente estadounidense 7.470.536 es un medio eficaz para eliminar especies reactivas de oxígeno y reducir notablemente tanto la variación entre viales como entre lotes en el rendimiento de células congeladas listas para ensayo.
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Jullig M, Zhang WV, Ferreira A, Stott NS. MG132 induced apoptosis is associated with p53-independent induction of pro-apoptotic Noxa and transcriptional activity of beta-catenin. Apoptosis. 200611 (4): 627-41.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Célula eucariota lista para ensayo congelada almacenada en una composición que comprende un crioconservante y alopurinol, estando la concentración de alopurinol en la composición en el intervalo de 50 a 200 |iM.
  2. 2. Célula eucariota congelada lista para ensayo según la reivindicación 1, en la que la concentración de alopurinol en la composición está en el intervalo de 75 a 150 |iM, siendo preferiblemente 100 |iM.
  3. 3. Célula eucariota congelada lista para ensayo según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho crioconservante es dimetilsulfóxido (DMSO) o glicerol o una combinación del 2,5% de dimetilsulfóxido (DMSO) y el 10% de glicerol.
  4. 4. Célula eucariota congelada lista para ensayo según la reivindicación 3, en la que:
    - la cantidad de DMSO en la composición es del 10%.
  5. 5. Célula eucariota congelada lista para ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición comprende adicionalmente suero bovino fetal (FBS), siendo la cantidad de FBS en la composición del 40%.
  6. 6. Célula eucariota congelada lista para ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la composición comprende adicionalmente un eliminador de especies reactivas de oxígeno, siendo preferiblemente dicho eliminador de especies reactivas de oxígeno N-acetilcisteína (NAC) o glutatión-SH (GSH).
  7. 7. Célula eucariota congelada lista para ensayo según la reivindicación 6, en la que:
    - la concentración de NAC está en un intervalo de 1 mM a 10 mM, siendo preferiblemente de 5 mM, o - la concentración de GSH es de 1 mM.
  8. 8. Célula eucariota congelada lista para ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el alopurinol está a una concentración de 100 |iM y dicha composición comprende adicionalmente el 40% de FBS y una concentración de NAC en un intervalo de 2,5 |iM a 5 |iM.
  9. 9. Célula eucariota congelada lista para ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que contiene un constructo de gen indicador que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de gen indicador operativamente unido a uno o más elementos de control de la transcripción que se regula mediante la actividad de transducción de señales de una proteína de superficie celular en respuesta a una señal extracelular.
  10. 10. Célula eucariota congelada lista para ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que las células se trataron con un agente antimitótico o proapoptótico antes de congelarse para almacenamiento, eligiéndose preferiblemente el agente antimitótico o proapoptótico del grupo que consiste en vinblastina, cisplatino, doxorrubicina y 5-fluorouracilo, siendo lo más preferiblemente vinblastina.
  11. 11. Célula eucariota congelada lista para ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la célula eucariota se selecciona del grupo que consiste en una célula de mamífero, preferiblemente de ser humano, más preferiblemente una célula promonocítica humana; aviar, preferiblemente de pollo; de pez, preferiblemente de pez cebra; de insecto; y de levadura.
  12. 12. Kit para llevar a cabo un ensayo, que comprende:
    - un dispositivo de pruebas que tiene una pluralidad de pocillos, siendo preferiblemente dicho dispositivo de pruebas una placa de microtitulación; y
    - un reactivo que comprende una pluralidad de las células congeladas listas para ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, estando preferiblemente dicho reactivo dispuesto en los pocillos de dicho dispositivo de pruebas.
  13. 13. Método para preparar la célula eucariota congelada lista para ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende:
    añadir una composición que comprende un crioconservante y alopurinol a una célula eucariota; y enfriar la célula a una velocidad de 1°C por minuto hasta -80°C para almacenamiento congelado de la célula eucariota lista para ensayo, mejorando de ese modo el rendimiento, tras la descongelación, de la célula eucariota lista para ensayo en un ensayo.
  14. 14. Método según la reivindicación 13, en el que, antes de añadir la composición que comprende un crioconservante y alopurinol a la célula eucariota, la célula eucariota se trata con un agente antimitótico o proapoptótico y entonces la célula eucariota se retira del contacto con el agente antimitótico o proapoptótico, eligiéndose preferiblemente el agente antimitótico o proapoptótico del grupo que consiste en vinblastina, cisplatino, doxorrubicina y 5-fluorouracilo, siendo lo más preferiblemente vinblastina.
  15. 15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que una pluralidad de células eucariotas congeladas listas para ensayo se preparan y almacenan congeladas en una pluralidad de viales o recipientes individuales separados y el método minimiza la variabilidad entre viales o recipientes individuales en el rendimiento de las células eucariotas congeladas listas para ensayo, tras la descongelación, en un ensayo.
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