BRPI0619235A2 - métodos para preservação celular e célula emissora - Google Patents
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Classifications
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- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
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Abstract
<UM>MéTODOS PAPA PRESERVAçãO CELULAR E CéLULA EMISSORA.<MV> São descritos métodos para produzir células que permanecem viáveis em temperaturas ambiente ou não-refrigerada, ou que são capazes de serem armazenadas em estado seco. Particularmente, a preservação celular destina-se ao armazenamento a longo prazo de células, tais como células mamíferas, em temperaturas ambiente ou não-refrigerada, mantendo a viabilidade celular. São providas ainda células sensórias capazes de detectar partículas alvo, agentes biológicos ou outros materiais e que permanecem viáveis em temperaturas ambiente ou não- refrigerada, ou que podem ser armazenadas em estado seco.
Description
"MÉTODOS PARA PRESERVAÇÃO CELULAR E CÉLULA EMISSORA"
Este pedido reivindica a prioridade do pedido provisório norte-americano 60/741,384 depositado em 30 de novembro de 2005.
A totalidade dos ensinamentos do pedido acima se encontra aqui incorporada por referência.
Este pedido foi subsidiado, no todo ou em parte, por fundos governamentais do contrato da Força Aérea Norte- Americana F19628-00-C-0002. 0 governo possui certos direitos na invenção.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A necessidade de detectores pequenos, ágeis e sensíveis de agentes biológicos, que sejam capazes de monitorar um ambiente por períodos de tempo prolongados é ressaltada pela proliferação de armas químicas e biológi cas. Em situações de campo de batalha um detector útil iria rapidamente alertar um soldado quando um agente específico biológico ou químico fosse detectado para que medidas apropriadas possam ser implementadas. Tais detectores seriam úteis ainda em uso não militar. A rápida detecção de bactéria resistente a antibióticos em um paciente ajudaria os médicos a selecionar um regime de tratamento mais eficaz. 0 monitoramento contínuo do suprimento de água potável de uma cidade iria fornecer alerta antecipado de patógenos em potencial, dando às autoridades de serviço público mais tempo para administrar riscos de saúde em potencial para o público. Além disso, o uso destes detectores nas inspeções de carnes e aves seria um aperfeiçoamento significativo sobre o procedimento atual de "cutucar e cheirar". De modo geral, tais detectores são especialmente necessários para uso analítico e diagnóstico nas áreas de medicina (por exemplo, medicina veterinária) , agricultura, proteção ambiental (por exemplo no diagnóstico da Sindrome do Edifício Doente) e regulamento ou processamento de alimentos.
Aparelhos que exploram a diversidade de anticorpos para detecção de partículas alvo ou antígenos múltiplos e raros são descritos por exemplo, na Patente US 6.087.114 e na Patente US 6.248.542. De modo geral tais aparelhos incluem um meio líquido que contém células sensoriais (por exemplo, uma célula B, micrófago ou fibroblasto) também denominadas aqui de células "CANARY" ou células "emissoras", um detector óptico, e um meio líquido que recebe as partículas alvo a serem detectadas. Embora as células mamíferas possam ser armazenadas congeladas a temperaturas de -80°C ou mais frio, é conhecido que perdem viabilidade dentro de semanas quando armazenadas em estado líquido em temperatura ambiente ou refrigerada. Além disso, a tecnologia necessária para armazenar células em estado seco por períodos prolongados mantendo a viabilidade ainda carece de desenvolvimento. 0 armazenamento de células sensoriais em temperaturas e condições outras que - 80°C ou mais frio iria aumentar em muito a conveniência de aparelhos que utilizam células sensoriais.
Portanto, existe uma necessidade de tais células, tais como células mamíferas que permaneçam viáveis em temperaturas ambiente ou não-refrigerada, ou que possam ser armazenadas em estado seco. Existe particularmente a necessidade de células sensoriais que possam detectar agentes biológicos ou outros materiais e que permaneçam viáveis em temperaturas ambiente ou não-refrigerada, ou que possam ser armazenadas em estado seco.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção prevê métodos de preservação de viabilidade celular quando as células são armazenadas em temperaturas ambiente ou não-refrigerada, o que iria de outra maneira resultar em redução ou perda da viabilidade celular.
Em uma modalidade, a técnica de preservação celular trata de uma célula emissora (também denominada aqui como célula CANARY ou célula sensorial) . Em uma modalidade especifica a célula emissora expressa um ou mais receptores para uma partícula alvo. Em uma modalidade o receptor é um anticorpo. Em outra modalidade o receptor é um receptor Fe. Em ainda outra modalidade a célula emissora é uma célula B, um macrófago ou célula fibroblasto.
Em ainda outra modalidade a célula emissora expressa uma molécula emissora. Em uma modalidade específica a molécula emissora emite um fóton em resposta a um aumento no cálcio intracelular. Em ainda outra modalidade a molécula emissora é Aequorina.
Em outra modalidade, o método para preservação da célula compreende proteger a célula (tal como uma célula emissora) de apoptose, oxidação, e/ou degradação protéica com combinações de um ou mais inibidores de caspase, inibidores de protease e/ou inibidores de proteassoma. Em outra modalidade, o método para preservação celular compreende adicionalmente ou alternativamente, aumentar a expressão de genes na célula que são responsáveis por induzir e/ou manter a quiescência, dessa forma aumentando o tempo que as células podem permanecer em estado quiescente.
Em outra modalidade, o método para preservação celular compreende adicionalmente ou alternativamente controlar a expressão de genes que regulam a apoptose. Em uma modalidade especifica um Inibidor de Apoptose Protéico (IAP) é expresso na célula.
Em outra modalidade, o método para preservação celular compreende adicionalmente ou alternativamente, estender as condições para incluir armazenamento a longo prazo em liquido a temperaturas ambiente e refrigerada.
Em ainda outra modalidade, o método para preservação celular compreende adicionalmente ou alternativamente induzir um estado quiescente protetor compreendendo a adição de inibidores do ciclo celular. Em uma modalidade especifica, os inibidores de ciclo celular são selecionados do grupo consistindo de actinomicina D, mitomicina C, rapamicina, mevastatina, tunicamicina e wortmanina.
A invenção ora descrita prevê ainda uma célula emissora que é um extremófilo. Em uma modalidade especifica, o extremófilo é um extremófilo tolerante a dessecação. Em uma modalidade o extremófilo é uma alga clamidomona. Em uma modalidade particular o extremófilo expressa um ou mais receptores para uma partícula alvo. Em uma modalidade o receptor é um anticorpo. Em outra modalidade o receptor é um receptor Fe.
Em uma outra modalidade, o extremófilo expressa uma molécula emissora. Em uma modalidade especifica a molécula emissora emite um fóton em resposta a um aumento no cálcio intracelular. Em ainda outra modalidade, a molécula emissora é Aequorina.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
O processo do pedido ou patente contém ao menos um desenho em cores. Cópias desta patente ou pedido de patente publicado com desenhos coloridos serão fornecidas pelo Escritório se solicitadas e mediante pagamento da taxa oficial.
A descrição acima e outros objetos, características e vantagens da invenção serão aparentes a partir da descrição a seguir, mais minuciosa, das modalidades preferidas da invenção, conforme ilustrada pelos desenhos em anexo. Os desenhos não estão necessariamente em escala, a ênfase estando sobre a ilustração dos princípios da invenção.
A Figura 1 é um esquema de técnicas de preservação celular e uma fotografia de células B durante a formação esferóide.
A Figura 2 é um gráfico demonstrativo da atividade das células após uma semana de armazenamento em temperatura ambiente.
A Figura 3 é um gráfico linear demonstrando atividade celular após uma semana de armazenamento em temperatura ambiente e um gráfico em barras da percentagem de células viáveis após 1-3 semanas de armazenamento, em temperatura ambiente, com ou sem inibidor Pan-Caspase III.
A Figura 4 é um gráfico demonstrativo dos resultados de uma análise de expressão de gene durante a indução de quiescência, armazenamento e revitalização de células HEK293.
A Figura 5 é um diagrama global da logística de célula B sobre as condições de armazenamento e uso de células em diferentes temperaturas e sob condições de armazenamento em seco.
As Figuras 6(a) e 6 (b) são gráficos de resultados com tratamentos e aditivos que aumentam a atividade de células CANARY armazenadas por longos períodos. A Figura 6 (a) é um gráfico demonstrativo do aperfeiçoamento na viabilidade e atividade de células armazenadas a 4°C quando as células são incubadas com wortmanina antes do preparo para o ensaio, e armazenadas na presença do inibidor de caspase Z-LEED-FMK e os antioxidantes N-acetilcisteína, selenita de sódio, deferoxamina e aminoguanidina. A Figura 6 (b) é um gráfico demonstrativo do aumento da viabilidade e atividade de células armazenadas em temperatura ambiente quando as células foram incubadas com tunicamicina antes do preparo para o ensaio e foram armazenadas na presença de Inibidor de Caspase III. Este tratamento estendeu o tempo pelo qual as células poderiam ser armazenadas em temperatura ambiente sem perda de atividade de 2 dias até 1 semana.
A Figura 7 é um gráfico do padrão de expressão (níveis) de genes em células CANARY após 24 horas de tratamento com DMSO a 2% ("I" no eixo χ), após 24 horas de rotação em temperatura ambiente ("2" no eixo x) e após ser armazenado por uma semana a 4°C ("3" no eixo χ) , quando comparado com o controle ("0" no eixo x) .
A Figura 8 é um gráfico demonstrando que a superexpressão do gene heat-shock Artemia franciscana, artemina, melhora a atividade de células armazenadas em temperatura ambiente, aumentando o tempo de armazenamento para 1 semana sem perda de atividade.
A Figura 9 é um gráfico em barras demonstrando que a superexpressão do gene anti-apoptótico, Bcl-XL, aumenta tanto a viabilidade como a atividade de células armazenadas a 4 °C, aumentando o tempo de armazenamento de 2 para 4 semanas.
A Figura 10 é um gráfico demonstrativo de uma comparação da atividade de células CANARY recém preparadas vs. células CANARY armazenadas. Quantidades iguais (1600 células) de células recém preparadas (Frescas) especificas para Y pestis, e aquelas que foram armazenadas em temperatura ambiente por 3 semanas (Armazenadas) foram comparadas com relação às suas respostas ao antigeno em um ensaio CANARY.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Embora células mamíferas possam ser armazenadas e congeladas a temperaturas de -80°C ou mais frio, é conhecido que as células perdem sua atividade após algumas semanas quando armazenadas em estado líquido refrigeradas ou em temperatura ambiente. Além disso, a tecnologia necessária para armazenar células em estado seco por períodos prolongados de tempo mantendo a viabilidade das mesmas continua em desenvolvimento. Diversas abordagens para aumentar o armazenamento a seco de células viáveis envolveram o uso de dissacarídeos tais como trihalose, tanto intra- como extra-celular, no entanto estas tem tido sucesso limitado [Nat. Biotechnol., 2000, 18(2): 168-171; FEBS Lett., 2000, 487:199-202; J. Opthalmol., 85:610- 612(2001); Cryobiology, 42 (3): 207-217 (2001); J. Physiol., 558:181-191 (2004)]. 0 armazenamento por 6 semanas de uma linha de células humanas em temperatura ambiente foi recentemente alcançado pela inclusão de um estado quiescente, mantendo simultaneamente o nível de conteúdo de água e reduzindo a oferta de oxigênio e eletricidade estática [Jack et ai., J. Cell.Physiol. , 206(2):526- 536(0005)]. O estado de quiescência foi induzido pela criação das células em estruturas tridimensionais denominadas esferóides, e acredita-se que estão protegidas da apoptose e outras formas de morte celular.
A presente invenção aperfeiçoa esta tecnologia através do uso de uma ou mais das seguintes técnicas de preservação celular compreendendo: (1) prover proteção adicional contra apoptose, oxidação e/ou degradação protéica com combinações de inibidores de caspase (por exemplo, Z-AEVD-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-LEED-FMK, Z-LEHD-FMK, Z- WEHD-FMK, Z-VAD-FMK, Z-VDVAD-FMK, Z-YVAD-FMK, Z-VEID-FMK, Z-IETD-FMK, OPH-109, e/ou inibidor Pan-Caspase III), antioxidantes (por exemplo, selenita de sódio, N- acetilcisteína, deferoxamina, aminoguanidina, Trolox, ebselen e/ou Tempol) e/ou inibidores de protease e/ou proteassoma (por exemplo, AEBSF, aprotonina, bestatina, calpeptina, inibidor catepsina L, E-64, leupeptina e/ou pepstatina A) ; (2) aumentar as expressões de genes que são responsáveis pela indução e manutenção da quiescência de modo a aumentar o tempo que as células podem permanecer em estado imóvel (tais genes podem ser identificados, por exemplo, em uma análise transcricional usando técnicas conhecidas por aqueles versados no assunto). Expressões de gene melhoradas podem ser alcançadas por quaisquer meios conhecidos na técnica, por exemplo através da superexpressão de gene ou genes na célula com um forte promotor; (3) controlar a expressão de genes que regulam apoptose, por exemplo, através de métodos genéticos tais como superexpressão de um Inibidor de Proteína Apoptose (IAP) tal como XIAP; (4) estender as condições para incluir armazenamento por longo período em líquido a temperatura ambiente e refrigerada; e/ou (5) induzir um estado de quiescência protetora com o uso de inibidores do ciclo celular (por exemplo, actinomicina D, mitomicina C, rapamicina, mevastatina, tunicamicina, e/ou wortmanina). Como usado presentemente, "armazenamento de longo prazo" refere-se a períodos de tempo maiores que cerca de 10 anos, maiores que cerca de 1 ano, maiores que cerca de 9 meses, maiores que cerca de 6 meses, maiores que cerca de 3 meses, maiores que cerca de 2 meses, maiores que cerca de 1 mês, maiores que cerca de 2 semanas, maiores que cerca de 1 semana, ou maiores que cerca de 72 horas.
Além disso, conforme descrito no presente documento, a presente invenção fornece métodos para preservação celular, tal como uma célula emissora, nos estados liquido, semi-liquido ou dessecado, em temperaturas ambiente, refrigerada ou não-refrigerada. Conforme usado na presente invenção, temperatura ambiente ou não- refrigerada varia de cerca de 5°C até cerca de 50°C, de cerca de 10°C até cerca de 40°C, de cerca de 15°C até cerca de 30°C e de cerca de 20°C até cerca de 30°C.
Em uma modalidade particular, uma ou mais técnicas de preservação celular é aplicada em uma célula emissora (também ora denominada como célula CANARY, ou célula sensória). Da forma usada na presente invenção, uma célula emissora é usada para a detecção de uma partícula alvo (tal como antígeno biológico, ou antígeno solúvel, ácido nucléico, uma toxina, um produto químico, e similares). A detecção da partícula alvo é mediada em parte pela ligação da partícula alvo a um receptor, seja diretamente ou indiretamente, expressa na superfície celular de uma célula emissora. A ligação direta pode ser através de um receptor, tal como um anticorpo, que liga diretamente e especificamente à partícula alvo. A ligação indireta da partícula alvo pode ser através, por exemplo, de um receptor Fe que liga a um anticorpo que está conectado (isto e, ligado) à partícula alvo. A ligação do antígeno ao receptor resulta em um aumento na concentração de cálcio. As células emissoras contém ainda uma ou mais células emissoras (por exemplo, Aequorina) em seu citosol, que emite fótons em resposta ao aumento na concentração de cálcio no citosol. A emissão de fóton pode ser detectada dessa forma detectando a presença da partícula alvo. Isto é ainda aqui denominado de "ensaio CANARY". Para maiores informações sobre células emissoras, sistemas
optoeletrônicos de detecção que utilizam as mesmas, e ensaios CANARY, veja por exemplo, o pedido de patente norte-americano 11/001,583, pedido de patente norte- americano No. 2004/0121402, Patente US 6.087.114 e Patente US 6.248.542 cujos ensinamentos encontram-se ora incorporados em sua totalidade por referência.
Uma abordagem alternativa compreende a modificação genética de extremófilos tolerantes ao dessecamento para uso em uma célula CANARY. Por exemplo, algas clamidomonas são conhecidas por formarem esporos quando seu habitat ambiente local seca devido à estiagem. Há relatos de re- hidratação dos esporos resultando em viabilidade mais de 70 anos após a criação de esporos. Ainda, é sabido que as clamidomonas possuem uma cascata de transdução sinalizadora de cálcio ativada por receptor de célula de superfície semelhante a que existe em células B. Portanto, um extremófilo pode ser modificado geneticamente para expressar um ou mais receptores, tais como um anticorpo ou receptor Fe, e uma molécula emissora, tal como Aequorina. A expressão do receptor na superfície da célula quando cruzada por um patógeno ou antígeno estimula uma cascata sinalizadora causando um aumento na concentração do cálcio intracelular e esta concentração aumentada de íons cálcio intracelulares estimula a molécula emissora a emitir luz capaz de ser medida e correlacionada com a presença da partícula alvo ou patógeno. Assim, uma célula emissora extremófila pode ser armazenada por períodos de tempo prolongados (por exemplo, armazenamento a longo prazo) em estado desidratado, isto é, em temperatura ambiente, refrigerada ou não-refrigerada, e permanecer viável guando re-hidratada para uso em, por exemplo, um ensaio CANARY.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1
A tunicamicina aumenta tanto a viabilidade como atividade de células B CANARY (ver Figura 2) . Após o armazenamento de células B CANARY (expressando um receptor especifico para Yersinia pestis) com tunicamicina em temperatura ambiente, as células B CANARY retiveram a capacidade sensória para Yersinia pestis (ver gráfico, Figura 2).
Ainda, o tratamento de células CANARY com wortmanina também acarretou aumento tanto na viabilidade como atividade de detecção antigena de células CANARY refrigeradas.
EXEMPLO 2
O tratamento de células com inibidor Pan-Caspase III (denominado como "Caspase III" no gráfico em barras da Figura 3) aumenta a viabilidade de células armazenadas em temperatura ambiente por uma, duas ou três semanas, guando comparado com células armazenadas em temperatura ambiente por uma, duas ou três semanas, sem wortmanina (ver gráfico em barras na Figura 3).
EXEMPLO 3
Demonstrativo de melhorias na logística de armazenamento de células. A tecnologia sensória de bio-agente célula B CANARY demonstra a melhor combinação de velocidade e sensibilidade para qualquer tecnologia de identificação de bio-agente conhecida [Rider et al., Science 301:213(2003)].
CANARY é capaz de detectar patógenos em muitas matrizes e formatos incluindo ar, alimentos, superfícies e amostras medicinais. No entanto, persiste a necessidade de logística e armazenamento fácil e econômico para as células B em si. As células de modo geral são mantidas congeladas ou refrigeradas até que estejam prontas para uso, o que é aceitável (embora não ótimo), para muitos ambientes médicos e caseiros, mas não é o ideal para qualquer circunstância, por exemplo, para unidades militares avançadas. Além disso, a maior parte dos usuários almeja um kit reagente de célula emissora (por exemplo, uma célula B) que possa ter vida de prateleira em um depósito ou laboratório em temperatura ambiente por períodos de cerca de 6 meses até cerca de 10 anos ou mais e que possa ser removido, carregado em um sensor e usado para um teste. Tais kits incluiriam, por exemplo, a célula emissora e opcionalmente instruções para uso de células emissoras em um ensaio, tal como um ensaio CANARY.
Até o advento da presente invenção da requerente, a vida de prateleira do reagente célula CANARY era de 2 dias em temperatura ambiente e 2 semanas em 4 °C. As células podem ser armazenadas congeladas indefinidamente em temperaturas de -80° ou mais frio, porém isto requer nitrogênio líquido ou congeladores especiais que nem todos os laboratórios possuem. Encontram-se aqui descritos exemplos de uma variedade de tratamentos, aditivos e superexpressões de genes para melhorar tanto a viabilidade como a atividade de células armazenadas por longos períodos em temperatura ambiente (por exemplo, temperatura ambiente) e/ou 40C.
Métodos e Materiais
Os aditivos químicos investigados foram: inibidores caspase AEVD, DEVD, LEED, LEHD (tóxico a 50 μΜ), WEHD (tóxico em 50μΜ), VAD, VDVAD, YVAD, VEID, IETD (Sistema R&D), OPH-109 (MP Biomedicals), Inibidor Caspase III (Calbiochem); inibidores protease AEBSF, aprotonina, bestatina, calpeptina, inibidor catepsina L, E-64, leupeptina, pepstatina A (Sigma); inibidores de ciclo celular rapamicina (LC Labs), actinomicina D, mitomicina C, mevastatina, tunicamicina, wortmanina (Sigma); selenita de sódio anti-oxidante, N-acetilcisteína, deferoxamina, aminoguanidina, Trolox, ebselen, Tempol (Sigma) , MnTBAP (A G. Scientific).
Para armazenamento a 4 °C, as células foram incubadas a uma densidade de 2,5-3 χ IO5 células/mL em 1-3- μΜ wortmanina por 24 horas a 37°C. As células foram então incubadas no escuro em temperatura ambiente por 2 horas em meio de ensaio [meio CO2-Independente, soro bovino fetal a 10%, estreptomicina 50^g/ml, 50-U/ml penicilina, e 250 ng/mL anfotericina B (Life Technologies) com 50-μΜ colenterazina (Molecular Probes, Eugene, 0R) ] . As células foram então lavadas duas vezes, re-suspensas em uma concentração final de 5 χ IO5 células/mL em meio de ensaio com as seguintes adições: 100-μΜ Z-LEED-FMK, 50μg/mL N- acetilcisteína, 150 ng/mL selenita de sódio, 15μΜ deferoxamina (caldo recém feito), 1,5 mM aminoguanidina (caldo recém feito), e deixadas para rotação por uma noite em temperatura ambiente.
Para armazenagem em temperatura ambiente as células foram incubadas a uma densidade de 2,5-3 χ 10^5 células/mL em 0,ug/mL tunicamicina por 24 horas a 37°C, em seguida incubadas em 2% DMSO a uma concentração de 5 χ 10^5 células/mL por 24 horas a 37°C. Em seguida as células foram incubadas no escuro em temperatura ambiente por 2 horas em meio de ensaio com 50-μΜ colenterazina, lavadas duas vezes e re-suspensas em uma concentração final de 5 χ 10^5 células/mL em meio de ensaio com 100-μΜ Inibidor Caspase III.
Tubos de células foram selados a vácuo em bolsas Food Saver usando um selador MagicVac e o espaço respectivo foi obtido armazenando as células em tubos 15-mL e 50mL que não estavam totalmente preenchidos. As células estimuladas com anti-CD4 0 foram incubadas com o anticorpo (BD Biosciences) a uma concentração de 2 χ 10^5 células/mL por 24 horas a 37°C, em seguida tratadas com DMSO 2% e incubadas em colenterazina conforme descrito acima. Condições heat-shock eram 42°C por 2-5 horas. A resposta heat-shock foi medida pela transfecção com um promotor de resposta Hsp70 guiando a expressão de luciferase do vaga- lume e uma plasmidia de luciferases de renilla como controle da eficácia da transfecção. As células foram transfectadas por electroporação, deixadas em recuperação por 24 horas, submetidas ao heat-shock, e avaliadas no dia seguinte com Dual Luciferase Repórter Assay (Promega).
Células transfectadas com Artemia p26 e artemina em plasmidias pcDNA3.1 foram selecionadas em 500^g/mL Higromicina (Invitrogen). GADD45P Murine foi clonado para RT-PCT e inserido em pEF6/V5/His-TOPO (Invitrogen). Células transfectadas com esta plasmidia foram selecionadas em 5^g/mL Blasticidina (Invitrogen) . Sitios de restrição foram acrescentados ao gene humano Bcl-XL (Invivogen) por PCT, foi inserido nos sítios Nhel e Xhol de pcDNA3.1 (Invitrogen) e a seqüência confirmada. Outros genes que foram superexpressos mas não forneceram proteção durante armazenamento incluem: Artemia p22 e p21 (duas versões, uma com G na posição aminoácido 62 e uma com Ε) , BiP, XIAP, baculovirus p35, e um mutante deletor de HSFa (aminoácidos 221-315) que se mostrou constitutivamente ativo [Voellmy, Methods 35:199 (2005)].
As células foram transfectadas por electroporação (BioRad) a 270 V, 950μΓ e clonadas pela limitação da diluição. Os clones foram analisados para expressão por RT-PCT quantitativo usando TaqMan®Gene Expression Assays (Applied Biosystems). Diversos clones com expressão moderada e alta foram selecionados para subseqüentes experimentos de armazenamento . Células B foram preparadas para o ensaio de luminescência por incubação em um meio de crescimento com a adição de DMSO 2% em uma concentração de 5 χ 10"5 células/mL. Após 20-24 horas, as células foram incubadas no escuro em temperatura ambiente por 2 horas em meio de ensaio [meio independente de CO2, soro bovino fetal a 10%, estreptomicina 50μς/κι1, penicilina 50-U/ml e anfotericina B a 250-ng/mL (Life Technologies)] com 50-μΜ de colenterazina (Molecular Probes, Eugene, OR). As células foram em seguida lavadas duas vezes, re-suspensas em meio de ensaio a uma concentração final de 5 χ IO5 células/mL em tubos de microcentrifugação 1,5-mL, e deixadas em rotação durante a noite em temperatura ambiente. Após o preparo as células foram armazenadas em meio de ensaio em tubos de microcentrifugação.
Resultados
O acréscimo de produtos químicos às células durante o preparo para o ensaio e/ou armazenamento foi testado com relação à melhoria na atividade e/ou viabilidade das células quando armazenadas a ou 40C ou temperatura ambiente. Os produtos químicos foram selecionados das seguintes classes: inibidores de apoptose, antioxidantes, inibidores de ciclo celular, e inibidores de protease. Uma listagem completa é fornecida em Métodos e Materiais, veja abaixo. Cada aditivo foi aplicado em uma variedade de concentrações. A viabilidade foi avaliada e a atividade testada antes do armazenamento e em intervalos semanais durante o armazenamento. Os aditivos considerados benéficos foram então combinados uns com os outros para experimentos adicionais.
De modo geral os tratamentos tidos como benéficos durante armazenamento em temperatura ambiente não apresentaram necessariamente melhoria em outra temperatura de armazenamento e, em um dos casos (células tratadas com tunicamicina armazenadas a 4°C) foi prejudicial. A melhoria na viabilidade e atividade das células armazenadas a 4 °C foi descoberta quando as células haviam sido incubadas com wortmanina antes do preparo para o ensaio CANARY, e foram armazenadas na presença do inibidor de caspase Z-LEED-FMK e os antioxidantes N-acetilcisteina, selenita de sódio, deferoxamina, e/ou aminoguanidina. Este tratamento estendeu a duração do tempo durante o qual as células poderiam ser armazenadas a 4°C, sem perda de atividade, de 2 semanas para 3 semanas. Quando aplicado de forma independente, foi descoberto que embora o tratamento com wortmanina houvesse aumentado tanto a viabilidade como a atividade, o armazenamento em Z-LEED-FMK e os antioxidantes somente aumentaram a atividade. Similarmente, foi descoberto que a viabilidade e atividade de células armazenadas em temperatura ambiente apresentou melhoria quando as células haviam sido incubadas com tunicamicina antes do preparo para o ensaio e em seguida armazenadas na presença do Inibidor Caspase III. Este tratamento estendeu o período de tempo em que as células podiam ser armazenadas em temperatura ambiente sem perda de atividade de 2 dias para 1 semana. Quando aplicado de forma independente, tanto o tratamento com tunicamicina como o armazenamento em Inibidor Caspase III melhoraram tanto a viabilidade como a atividade. Outros tratamentos que apresentaram melhoria na atividade das células foram o selamento a vácuo, armazenamento das células com espaço livre e estimulação das células com anti-soro anti-CD40. No entanto a resposta das células armazenadas de acordo com tais tratamentos foi inconsistente e os resultados mostrados na Figura 6 representam resultados que ocorreram em mais da metade mas não mais do que 70% dos experimentos.
A superexpressão de certos genes foi também estudada com relação a um beneficio de proteção durante armazenamento. O gene GADD45 gama ("growth arrest and DNA damage-inducible") apresenta dramática regulação ascendente transcricional em células HEK293 durante o armazenamento, e estas células permanecem viáveis após 6 semanas de armazenamento em temperatura ambiente [Jack et al., J. Cell Physiol. 206:526 (2006)]. Similarmente, células B CANARY também regulam de forma ascendente o GADD45p após o preparo para o ensaio e mantém tal nivel durante o armazenamento (ver Figura 7). As proteínas heat-shock de Artemia franciscana mostraram conferir resistência ao estresse quando expressas em células mamíferas [ver, por exemplo, Ma et al., Criobil. 51:, 15 (2005); Villeneuve et al., Cell Stress Chaperones 11:71 (2006); e Collins and Clegg, Cell Biol. Int. 28:449 (2004)]. Superexpressões de GADD45P e Artemia p26 e artemina melhoraram a atividade de células B armazenadas em temperatura ambiente, aumentando o tempo de armazenamento para 1 semana sem perda de atividade (ver Figura 8). De modo geral, a atividade de células expressando artemina foi melhor do que aquela de células expressando p26 ou superexpressando GADD45P· A superexpressão de Bcl-XL, uma proteína anti-apoptótica, melhorou tanto a viabilidade como a atividade de células armazenadas a 4 °C, aumentando o tempo máximo de armazenamento de 2 para 4 semanas (ver Figura 9) . Em alguns experimentos estas células mantiveram atividade total por até 6 semanas. Não se observou melhora quando os aditivos e tratamentos acima descritos foram aplicados em qualquer uma das linhas de célula superexpressas.
Discussão
CANARY apresenta uma combinação de velocidade e sensibilidade não alcançadas pelos outros métodos. No entanto, o reagente de célula via de modo geral tem vida de prateleira limitada a 2 dias em temperatura ambiente e 2 semanas a 4°C. 0 reagente (isto é, células CANARY) pode ser armazenado congelado a -80°C ou mais frio mas isto requer nitrogênio liquido ou um congelador especial. Experimentos comparando células armazenadas com células recém preparadas indicaram que a perda de atividade durante armazenamento era devida não somente a uma redução na viabilidade como também a uma redução na quantidade de luz emitida por célula em resposta ao antigeno (ver Figura 10) . Portanto, os requerentes buscaram métodos para preservar tanto a capacidade de resposta como a viabilidade das células ao longo do tempo. Os requerentes descobriram que tanto inibidores de caspase como antioxidantes eram benéficos, presumivelmente porque os inibidores de caspase preservaram a viabilidade e os antioxidantes preservaram ou a saúde geral da célula ou o estado de oxidação do co- fator para aequorina, colenterazina.
Células HEK293 podem ser armazenadas em temperatura ambiente por até 6 semanas com bom índice de sobrevivência, e o estado de quiescência é essencial para sua sobrevivência [Jack et al., J. Cell Physiol. 206:526 (2006)]. Células CANARY foram tratadas com produtos químicos que interrompem o ciclo celular para induzir um estado de quiescência. É interessante observar que embora efeitos benéficos foram demonstrados quando as células foram tratadas com wortmanina e tunicamicina, não estavam em concentrações que inibissem o crescimento da célula.
A resposta heat-shock é induzida sob uma variedade de condições de estresse e é representada por proteínas, incluindo chaperones de moléculas e proteases, as quais protegem as células de agregação e precipitação de intermediários desdobrados [Winter e Jacob, Crit. Ver. Biochem. Mol. Biol. 39:297 (2004; Mosser et al., Mol. Cell Biol. 17:5317 (1997)]. Descobriu-se que a expressão de genes heat-shock Artemia p26 e artemina preservam a atividade de células CANARY armazenadas em temperatura ambiente.
O GADD4 5P desempenha um papel tanto na regulação do ciclo celular como na apoptose. Trata-se de uma proteína anti- apoptótica que é induzida pela estimulação CD40 de células B e media a supressão de apoptose induzida por Faz. Tem sido ainda descrita como um gene de resposta de estresse, e a expressão de GADD45p tem regulação ascendente em células CANARY após tratamento com DMSO, uma etapa que os Requerentes descobriram ser útil para assegurar atividade consistente. GADD45P não é o único gene relacionado a danos ao DNA que demonstra mudança na expressão de células CANARY quando tratado com DMSO. Enquanto a expressão de GADD45P e Histone 1 (HistlHlc) aumenta, a expressão de helicase linfóide-específica (Hells) diminui (Ver Figura 7) . No entanto, a regulação ascendente de GADD45p é muito mais dramática em células HEK293, que também exibem melhor viabilidade após o armazenamento. Ao induzir maior expressão do gene, foi possível demonstrar atividade melhorada nas células CANARY armazenadas em temperatura ambiente.
Embora não esteja provado que a apoptose é o mecanismo responsável pela perda de células viáveis durante o armazenamento, há vários sinais de evidência que indicam que pode ser ao menos parcialmente responsável. Primeiro, existem pelo menos 2 inibidores de apoptose que melhoram a viabilidade e atividade das células armazenadas. Segundo, a análise transcricional revela que diversos facilitadores de apoptose, tais como Bcl 12 tipo 11 (Bcl211) , ligante 1 morte celular programada 1 (Pded11gl), e fator de modificação Bcl 2 (Bmf) são reguladores ascendentes (ver Figura 7). O Bmf mostrou estar fisicamente ligado aos membros da família anti-apoptótica (Bcl2, Bcl-w, Mcl-1 e Bcl-XL) e acredita-se que iniba sua capacidade de seqüestrar e desativar proteínas pró-apoptóticas, desta forma de-reprimindo o caminho para a apoptose. Além disso, a superexpressão de Bmf em linhas de célula mamíferas induz apoptose, um efeito que pode ser superado pela superexpressão das proteínas anti-apoptóticas listadas acima. Os requerentes demonstraram as melhorias tanto na viabilidade como na atividade de células superexpressando Bcl-XL após armazenar a 4°C. Um fator interessante é que enquanto outros demonstraram que a expressão de p35 também reverte o efeito da superexpressão de Bmf, não demonstrou benefício significativo quando expresso em células Bmf. Outra observação foi a de que enquanto muitos dos genes superexpressos em células CANARY não apresentavam efeito observável, a superexpressão de XIAP inibiu completamente a resposta celular ao antigeno. Isto é pouco provável, devido a um efeito insercional não previsto uma vez que ocorreu quando XIAP tanto humano como Murine foram transfectados e em todos os clones testados. Estes resultados indicam que a vida de prateleira de um reagente de célula viva, tal como uma célula emissora, pode ser estendida. A superexpressão de genes que inibem apoptose ou atuam como chaperone molecular tem conferido proteção contra morte celular e talvez contra a degradação dos componentes celulares, e tem estendido a vida de prateleira de células CANARY de 1 semana em temperatura ambiente e até 4 semanas a 4°C.
Embora a presente invenção tenha sido particularmente descrita e demonstrada com referência às modalidades preferidas, deve ser entendido por um técnico no assunto que várias alterações na forma e detalhes podem ser efetuadas sem se afastar do escopo da invenção compreendida pelas reivindicações anexas.
Os ensinamentos relevantes de todas as referências, patentes e pedidos de patente aqui citados são incorporados ao presente em sua totalidade.
Claims (20)
1. Método para preservação celular caracterizado pelo fato de compreender tratar as células com um inibidor de caspase, um inibidor de protease, um inibidor de proteassoma ou uma combinação destes.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da célula ser uma célula emissora.
3. Método para preservação celular caracterizado pelo aumento da expressão de um gene regulador da quiescência, desta forma aumentando o tempo que as células podem permanecer um estado quiescente.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato da célula ser uma célula emissora.
5. Método para preservação celular caracterizado pelo fato de compreender controlar a expressão de um gene que regula apoptose.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o gene que regula a apoptose é uma Proteína Inibidora de Apoptose (IAP).
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a expressão é uma regulação ascendente de um gene inibidor da apoptose.
8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a expressão é uma regulação descendente de uma gene ativador da apoptose.
9. Método para preservação celular caracterizado pelo fato de compreender induzir quiescência.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a indução de quiescência compreende a inibição do ciclo celular na célula.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a inibição do ciclo celular compreende adicionar um ou mais inibidores de ciclo celular à célula.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o um ou mais inibidor de ciclo celular é selecionado do grupo consistindo de actinomicina D, mitomicina C, rapamicina, mevastatina, tunicamicina, wortmanina e combinações destes.
13. Célula emissora, caracterizada pelo fato da célula emissora ser um extremófilo.
14. Célula emissora, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula emissora é um extremófilo tolerante a dessecaçãó.
15. Célula emissora, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato do extremófilo ser uma alga clamidomona.
16. Célula emissora, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato do extremófilo expressar um receptor para partícula alvo e uma molécula emissora.
17. Célula emissora, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato do receptor ser um anticorpo.
18. Célula emissora, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato do receptor ser um receptor Fe.
19. Célula emissora, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato da molécula emissora emitir um fóton em resposta a um aumento no cálcio intracelular.
20. Célula emissora, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato da molécula emissora ser aequorina.
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