JP2020198845A - 細胞又は組織の凍結融解方法 - Google Patents
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
(1)載置部を有する本体部材及び該本体部材に着脱自在なキャップ部材を少なくとも有する凍結保存用治具の載置部に、細胞又は組織を保存液と共に載置し、該載置部をキャップ部材で密閉する密閉工程と、該密閉した載置部を冷却溶媒により冷却し、細胞又は組織を凍結する凍結工程と、該凍結工程において凍結された細胞又は組織の凍結状態を維持する保冷工程、および凍結状態が維持されていた細胞又は組織を融解する融解工程を少なくとも有し、該融解工程の開始前においてキャップ部材によって密閉された細胞又は組織は、冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつ本体部材とキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態で一旦保持され、該融解工程では本体部材とキャップ部材を分離し、載置部を融解液に浸漬して細胞又は組織を融解する、細胞又は組織の凍結融解方法。
(2)上記した融解工程の開始前に、キャップ部材の固定機能を有した固定具を用いて、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織を冷却溶媒中で一旦保持する、上記(1)記載の細胞又は組織の凍結融解方法。
(3)上記した載置部が保存液吸収体を有する上記(1)記載の細胞又は組織の凍結融解方法。
P=(V/T)×100(%)
P:空隙率(%)
V:空隙容量(ml/m2)
T:厚み(μm)
下記、凍結保存用治具を用いて、以下の手順で細胞又は組織の載置から密閉工程、凍結工程、保冷工程、融解工程を行った。
図1〜図4に示す形態を有する本体部材2及びキャップ部材3を作製した。本体部材2が有する載置部4は短冊状(幅1.5mm、長さ20mm、厚み250μm)のポリエチレンテレフタレート樹脂フィルムを用い、ABS樹脂からなる把持部5に付設した。キャップ部材3は、ABS樹脂からなり、図3及び図4に示した形状を有しており、内腔構造の一部である篏合接触部8にはテーパー構造を有している。キャップ部材3の開口部は円型であり直径は2mmである。
平衡化処理したマウス8細胞期胚を、ピペットを用いて、保存液と共に凍結保存用治具の載置部4上に滴下付着させ、余分な保存液を除いた後に、透過型の顕微鏡観察下で、載置部4をキャップ部材3へ挿入し、嵌合・固定した(密閉工程:図7の状態)。その後、凍結保存用治具1のキャップ部材側を液体窒素に浸漬した(凍結工程)。なお、保存液は、L−グルタミン、フェノールレッド、25mMのHEPES(4−(2−hydroxyethyl)−1−piperazineethanesulfonic acid)を含む市販のMedium199培地(Life Technologies社)を基礎液として、エチレングリコールを15容量%とDMSO(ジメチルスルホキシド)を15容量%、スクロースを0.5M、ゲンタマイシンを50mg/L含有するものを使用した。マウス8細胞期胚を平衡化液から保存液に移した時点から、液体窒素へ浸漬するまでの時間は、1分間で行った。凍結工程を行った凍結保存用治具は、融解工程を行うまで、液体窒素下で保管した(保冷工程)。
上記の各工程を行った凍結保存用治具を取り出し、図10に示す形態で、アルミニウムからなる固定具13のスリット部14に固定し、凍結保存用治具のキャップ部材3の接合部10が冷却溶媒17である液体窒素の液面18よりも上に位置する状態で一旦保持した。次いで、キャップ部材3と把持部5の嵌合を緩め、キャップ部材3から本体部材2を分離し、本体部材2が有する載置部4を37℃に保温した融解液に浸漬した。その後、載置部4上からの胚の回収操作を行った。なお、キャップ部材3の篏合を緩めてから、キャップ部材3から本体部材2を分離するまでの作業は10秒以内に、キャップ部材3から本体部材2を分離後、載置部4を融解液19に浸漬するまでの時間は、1秒以内に操作することが可能であった。なお、融解液は、前記Medium199培地を基礎液として、1Mのスクロースを含有するものを使用した。
ポリエチレンテレフタレート樹脂フィルム(幅1.5mm、長さ20mm、厚み180μm)に、その長さ方向の両端2mmにポリウレタン接着材を塗布し、その後、親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン樹脂からなる多孔性樹脂シート(細孔径0.2μm、空隙率71%、厚み30μm)をこれに貼り合わせ、これを凍結保存用治具の載置部4とした以外は実施例1と同様にして、凍結したマウス8細胞期胚に対する一連の凍結融解方法を行った。なお、実施例2の凍結融解方法では、細胞又は組織を載置する時に、胚を滴下付着する際に余分な保存液が自動的にのぞかれることから、ピペットを用いて保存液を除く操作は行わなかった。
実施例1において、マウス8細胞期胚を載置部4上に滴下付着した後に、キャップ部材3で被包することなく、載置部4を液体窒素に直接浸漬し、その後、液体窒素中で載置部4をキャップ部材3にて被包・保護し、凍結した以外は、実施例1と同様にして比較例1の凍結融解方法を行った。
実施例2において、マウス8細胞期胚を載置部4上に滴下付着した後に、キャップ部材3で被包することなく、載置部4を液体窒素に直接浸漬し、その後、液体窒素中で載置部4をキャップ部材3にて被包・保護し、凍結した以外は、実施例2と同様にして比較例2の凍結融解方法を行った。
実施例1の融解工程において、凍結保存用治具のキャップ部材3の接合部10が液体窒素中に入った状態(接合部10が液体窒素の液面よりも下に位置する状態)で、キャップ部材3と把持部5の嵌合を緩め、キャップ部材3から本体部材2を分離し、本体部材2が有する載置部4を37℃に保温した融解液に浸漬した。
実施例1、2及び比較例1〜3の凍結保存用治具について、融解工程時に、載置部を融解液に浸漬してから5秒後の時点での載置部上への気泡の付着の様子を評価した。評価として、先端から2mm〜先端から7mmの領域(幅1.5mm×長さ5mmの面積)での、載置部4表面への気泡(直径30μm以上)の付着数を計測した。それぞれの凍結融解方法において、評価は3回繰り返して実施した。結果を表1に示す。
2 本体部材
3 キャップ部材
4 載置部
5 把持部
6 マーキング部
7 篏合構造部
8 嵌合接触部
9 固定部位
10 接合部
11 細胞
12 保存液
13 固定具
14 スリット部
15 スリット固定部
16 凍結容器
17 冷却溶媒
18 液面
19 融解液
Claims (3)
- 載置部を有する本体部材及び該本体部材に着脱自在なキャップ部材を少なくとも有する凍結保存用治具の載置部に、細胞又は組織を保存液と共に載置し、該載置部をキャップ部材で密閉する密閉工程と、該密閉した載置部を冷却溶媒により冷却し、細胞又は組織を凍結する凍結工程と、該凍結工程において凍結された細胞又は組織の凍結状態を維持する保冷工程、および凍結状態が維持されていた細胞又は組織を融解する融解工程を少なくとも有し、該融解工程の開始前においてキャップ部材によって密閉された細胞又は組織は、冷却溶媒の液面よりも下方に位置し、かつ本体部材とキャップ部材の接合部が冷却溶媒の液面よりも上方に位置する状態で一旦保持され、該融解工程では本体部材とキャップ部材を分離し、載置部を融解液に浸漬して細胞又は組織を融解する、細胞又は組織の凍結融解方法。
- 前記した融解工程の開始前に、キャップ部材の固定機能を有した固定具を用いて、キャップ部材によって密閉された細胞又は組織を冷却溶媒中で一旦保持する、請求項1記載の細胞又は組織の凍結融解方法。
- 前記した載置部が保存液吸収体を有する請求項1記載の細胞又は組織の凍結融解方法。
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