CN111760600A - 一种微流控芯片及其制备方法与细胞分选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微流控芯片及其制备方法与细胞分选方法。所述微流控芯片的制备方法包括：提供聚二甲基硅氧烷基板；利用激光直写技术在所述聚二甲基硅氧烷基板内部雕刻管道；在所述聚二甲基硅氧烷基板底面设置有阵列分布的多个电极以及在所述主管道的一侧设置光电传感器，得到微流控芯片。与现有技术相比，本发明具有以下优点：制作简单，成本较低，可大规模生产，制备方法可控性好。

Description

一种微流控芯片及其制备方法与细胞分选方法
技术领域
本发明涉及微流控领域，尤其涉及一种微流控芯片及其制备方法与细胞分选方法。
背景技术
液滴微流控技术，因其具有流体操作简便、高单分散性、小型化、低成本、高灵敏度、高通量等优点，在21世纪以来受到广泛的关注。目前对于微流控液滴技术的应用主要用于对液滴的操控，比如实现液滴的分裂、融合、混合、分选，融合等功能。其中液滴的分选在已广泛应用于生物、化学和医学等研究领域。
目前来讲，针对单细胞的差异性分析实验中，进行单细胞操控是关键问题。但是目前对于液滴的分选技术上仍存在着一定的问题。比如电场操控离散液滴进行分裂，具体是使用电场操控液滴进入设计的管道结构，再利用机械方法将液滴一分为多，但生成的微液滴大小不均匀，并且无法保证其内容物均匀分布至各个液滴中，会为后续的收集与处理带来不便。可见，现有液滴微流控技术中单细胞筛选分离效果不理想的问题。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种微流控芯片及其制备方法与细胞分选方法，旨在解决现有液滴微流控技术中单细胞筛选分离效果不理想的问题。
一种微流控芯片的制备方法，其中，包括：
提供聚二甲基硅氧烷基板；
利用激光直写技术在所述聚二甲基硅氧烷基板内部雕刻管道；
其中，所述管道包括：液滴生成管道、筛选分离管道；所述液滴生成管道包括：互相垂直设置的水相管道、第一油相管道、第二油相管道、液滴输送管道，且所述水相管道的出口与所述第一油相管道的出口、与所述第二油相管道的出口、与所述液滴输送管道的进口均连接；所述筛选分离管道包括主管道、多个分管道，所述主管道的出口分别与所述多个分管道的进口连接；所述液滴输送管道与所述主管道连通；
在所述筛选分离管道下方的聚二甲基硅氧烷基板底面上设置有阵列分布的多个电极以及在主管道的一侧设置光电传感器，得到微流控芯片。
所述的微流控芯片的制备方法，其中，所述提供聚二甲基硅氧烷基板包括：
将聚二甲基硅氧烷预聚物，放入模具中，通过加热使聚二甲基硅氧烷预聚物凝固成型，得到聚二甲基硅氧烷基板。
所述的微流控芯片的制备方法，其中，所述聚二甲基硅氧烷基板的厚度为5-10mm。
所述的微流控芯片的制备方法，其中，所述激光直写技术的参数包括：持续时间为50-200fs，波长为600-1000nm，频率为900-1200Hz。
所述的微流控芯片的制备方法，其中，各个所述电极之间的间距为0.5-10mm。
所述的微流控芯片的制备方法，其中，所述光电传感器为光电倍增管传感器。
一种微流控芯片，其中，采用如上所述微流控芯片的制备方法制备得到。
一种基于如上所述微流控芯片的细胞分选方法，其中，包括：
将水相、第一油相、第二油相分别通入所述水相管道、第一油相管道、第二油相管道，并在所述水相管道、第一油相管道、第二油相管道的连接处产生液滴，所述液滴进入所述液滴输送管道中；
所述液滴由所述液滴输送管道进入所述主管道中，所述光电传感器收集所述液滴的内容信息；
所述电极根据所述内容信息驱动所述液滴进入对应的分管道中，实现细胞分选；
其中，所述水相为含有细胞的生理盐水，所述水相分别与所述第一油相以及第二油相不互溶。
所述的细胞分选方法，其中，所述内容信息包括：所述液滴的光吸收强度。
所述的细胞分选方法，其中，所述细胞包括：红细胞、白细胞中的一种。
有益效果：本发明所制备得到的微流控芯片能够实现液滴生成，液滴内容信息检测以及电场控制目标液滴有效筛选分离的功能。与现有技术相比，本发明微流控芯片的制备方法具有以下优点：制作简单，成本较低，可大规模生产，制备方法可控性好。本发明解决了传统离散液滴分离方法在进行单细胞分选时低效率的问题，提高筛选分离效率。
附图说明
图1为本发明所述液滴生成管道的结构示意图。
图2为本发明所述液滴在管道内受电极产生的电场作用从右向左移动的过程示意图。
图3为本发明所述筛选分离管道的结构示意图。
具体实施方式
本发明提供一种微流控芯片及其制备方法与细胞分选方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
微流控(Microfluidics)是指在微米尺度空间对流体进行操控的一种技术，功能微缩到一个几平方厘米芯片上，因此又被称为芯片实验室(Lab-on-a-chip)。微流控芯片可以在几十到几百微米的微小通道或构建中操控流体流动。如何实现对大量的微液滴进行快速检测分析筛选以及大规模低成本快速生产微流控芯片成为亟待解决的问题。
请参阅图1及图3，本发明提供一种微流控芯片的制备方法，其中，包括：
S100、提供聚二甲基硅氧烷基板1；
S200、利用激光直写技术在所述聚二甲基硅氧烷基板1内部雕刻管道(微管道)；
其中，所述管道包括：液滴生成管道、筛选分离管道；所述液滴生成管道包括：互相垂直设置的水相管道211、第一油相管道212、第二油相管道213、液滴输送管道214，且所述水相管道211的出口与所述第一油相管道212的出口、与所述第二油相管道213的出口、与所述液滴输送管道214的进口均连接；所述筛选分离管道包括主管道221、多个分管道222，与所述主管道221分别与所述多个分管道222的进口连接；所述液滴输送管道214与所述主管道221连通；
S300、在所述筛选分离管道下方设置有阵列分布的多个电极3以及在主管道221的一侧设置光电传感器，得到微流控芯片。
本发明所制备得到的微流控芯片能够实现液滴生成，液滴内容信息检测以及电场控制目标液滴有效筛选分离的功能。与现有技术相比，本发明具有以下优点：制作简单，成本较低，可大规模生产，制备方法可控性好。本发明解决了传统离散液滴分离方法在进行单细胞分选时低效率的问题，提高分离分选效率。
所述100中，所述聚二甲基硅氧烷(PDMS，polydimethylsiloxane)，是有机硅的一种，因其成本低，而且具有良好的化学惰性等特点。液态时的二甲基硅氧烷为一黏稠液体，称做硅油，是一种具有不同聚合度链状结构的有机硅氧烷混合物，其端基和侧基全为烃基(如甲基、乙基、苯基等)。固态的二甲基硅氧烷为一种硅胶，无毒、疏水性(hydrophobic)和防水性，惰性物质，且为非易燃性、透明弹性体。
在本发明的一个实施方式中，所述提供聚二甲基硅氧烷基板1包括：
将聚二甲基硅氧烷预聚物，放入模具中，通过加热使聚二甲基硅氧烷预聚物凝固成型，得到聚二甲基硅氧烷基板1。
可选地，所述提供聚二甲基硅氧烷基板1还包括，在所述聚二甲基硅氧烷预聚物中加入交联剂(固化剂)，便于快速凝固成型。可选地，所述交联剂为硅烷偶联剂。
在本发明的一个实施方式中，所述聚二甲基硅氧烷基板1的厚度为5-10mm。可选地，所述聚二甲基硅氧烷基板1为长方体聚二甲基硅氧烷基板1；所述聚二甲基硅氧烷基板1的长、宽、高(厚度)分别为50mm、27mm、7mm。
所述S200中，本发明所述利用激光直写技术在所述聚二甲基硅氧烷基板1内部雕刻管道是利用飞秒激光具有超高精度的加工能力，在透明材料的内部灵活地进行三维直接加工。具体地，主要是通过将飞秒激光聚焦在聚二甲基硅氧烷基板1的内部，配合三维位移平台，实现任意复杂流道结构的制备，CCD实时观察系统主要用来进行焦点对准和对加工过程进行实时观察。管道雕刻加工完成后，采用空气泵作为驱动力，清除管道内的加工残留物。
本发明采用的激光直写技术具有分辨率高，灵活性高的特点，能够制备具有多种形状结构流道的微流控芯片，并降低制作成本。
所述管道的管径大小可以根据液滴的大小实际需要进行设定，所述液滴的大小可以通过控制水相与所述第一油相以及第二油相的流速控制。
在本发明的一个实施方式中，所述激光直写技术的参数包括：持续时间为50-200fs，波长为600-1000nm，频率为900-1200Hz。可选地，所述激光直写技术的参数包括：持续时间为100fs，波长为800nm，频率为1000Hz。
所述S200中，所述液滴生成管道是产生离散液滴的管道，具体是利用互不相容的两液相产生分散的微液滴(离散液滴)，当两相液体在交叉点处相遇后，离散相继续延伸形成喷射状被连续相流体剪切和挤压作用下夹断，以微液滴的形式分散于连续相中。可见，所述离散液滴的形成是两相界面处的内部张力和剪切力共同作用形成，根据分散相和连续相的不同，可分为两种，即油相中水相微液滴和水相中油相微液滴。
具体地，本发明所述水相管道211、第一油相管道212、第二油相管道213分别用于输入水相、第一油相、第二油相。其中水相与第一油相、第二油相均不相溶，第一油相与第二油相可以是相同的物质也可以是不同的物质。所述水相是指以水为主要成分的物质，如含有红细胞的生理盐水。所述第一油相和第二油相是不与所述水相相溶的物质，可以是液体有机物，例如所述第一油相和第二油相均为石蜡油。
本发明所述水相管道211、第一油相管道212、第二油相管道213形成T字形，其中交叉点为水相管道211、第一油相管道212、第二油相管道213的出口。本发明所述水相管道211、第一油相管道212、第二油相管道213与所述液滴输送管道214连接形成十字形。可见，三条流道(水相管道211、第一油相管道212、第二油相管道213)聚焦于一个管道(液滴输送管道214)中，水相、第一油相、第二油相汇合于十字交叉管处，第一油相与第二油相对称的流动挤压水相使其断裂，从而形成离散的液滴。
所述S300中，电润湿(Electrowetting，EW)是指通过改变液滴与绝缘基板之间电场，来改变液滴在基板上的润湿性，即改变接触角，使液滴发生形变、位移的现象。本发明通过PDMS基板底面的电极3改变离散液滴两侧与PDMS基板的润湿性，达到控制离散液滴运动的目的。具体地，所述电极3(微电极)形成的阵列中，所述筛选分离管道的正下方设置一排间隔设置电极3。
可选地，为提高对液滴的控制效果，可以在所述筛选分离管道的侧面设置多排间隔周期分布一排或多排电极3(简称侧面电极)，与所述PDMS基板底面的电极3(简称底面电极)不在同一平面上。具体可在PDMS基板上所述筛选分离管道的一侧或两侧设置凹槽，在所述凹槽内设置一排或多排电极3。进一步地，所述筛选分离管道侧面设置的侧面电极3与所述筛选分离管道下方设置的底面电极3错开设置，即在垂直于该筛选分离管道所在直线的平面上，所述筛选分离管道下方底面电极3的间隔处对应所述筛选分离管道侧面电极3，而所述筛选分离管道下方底面电极3对应所述筛选分离管道侧面电极的间隔处。
所述电极3用于产生电场，改变位于其上方的液滴与基板的润湿性，使液滴发生位移。在本发明的一个实施方式中，各个所述电极3间距为0.5-10mm，如2mm，使液滴实现快速运动，进而实现对大量的微液滴进行快速检测分析。
本发明中所述光电探测器用于收集离散液滴中内容信息，从而实现阵列分布的电极根据内容信息对离散液滴进行分离或分选。所述内容信息可以包括荧光强度、光吸收强度等。在本发明的一个实施方式中，所述光电传感器为光电倍增管(PMT)传感器。所述光电倍增管(PMT)传感器性价比高，能够用于实现光子计数、弱光探测、化学发光、生物发光、极低能量射线探测、分光光度计、色度计生化分析仪。可以理解的是，所述内容信息被传送至处理单元，所述处理单元根据内容信息控制位于该液滴下方电极3的电场输出，进而控制液滴的运动。
本发明还提供一种微流控芯片，其中，采用如上所述微流控芯片的制备方法制备得到。可见，本发明所述微流控芯片包括提供聚二甲基硅氧烷基板1；设置所述聚二甲基硅氧烷基板1内部的管道，其中，所述管道包括：液滴生成管道、筛选分离管道；所述液滴生成管道包括：互相垂直设置的水相管道211、第一油相管道212、第二油相管道213、液滴输送管道214，且所述水相管道211的出口与所述第一油相管道212的出口、与所述第二油相管道213的出口、与所述液滴输送管道214的进口均连接；所述筛选分离管道包括主管道221、多个分管道222，与所述主管道221分别与所述多个分管道222的进口连接；所述液滴输送管道214与所述主管道221连通；设置阵列分布所述筛选分离管道下方的多个电极3；以及设置在所述主管道221的一侧设置光电传感器。
本发明所述微流控芯片具有分选效率高，内容物分布均匀，液滴稳定，能有效收集并进行单细胞分析。
本发明还提供一种基于如上所述微流控芯片的细胞分选方法，其中，包括：
将水相、第一油相、第二油相分别通入所述水相管道211、第一油相管道212、第二油相管道213，并在所述水相管道211、第一油相管道212、第二油相管道213的连接处产生液滴，所述液滴进入所述液滴输送管道214中；
所述液滴由所述液滴输送管道214进入所述主管道221中，所述光电传感器收集所述液滴的内容信息；
所述电极3根据所述内容信息驱动所述液滴进入对应的分管道222中，实现细胞分选；
其中，所述水相为含有细胞的生理盐水，所述水相分布与所述第一油相以及第二油相不互溶。
具体地，所述第一油相和第二油相均为石蜡油。
本发明利用光电传感器识别带有目标物的液滴，用单片机控制阵列分布电极中多个电极3的高电平输出顺序，以此控制离散液滴的移动路径，实现电场控制目标液滴有效筛选分离的功能。在发明的一个实施方式中，所述内容信息包括：液滴的荧光强度或光吸收强度。根据液滴中细胞浓度的不同，产生的荧光强度或光吸收强度不同，从而实现细胞的分选或分离。
在发明的一个实施方式中，所述细胞包括：红细胞、白细胞中的一种。
下面结合图1-3对本发明的技术方案进行说明。
请参照图1，图3，分别为本发明所述微流控芯片中液滴生成管道、筛选分离管道的结构示意图。其中图1，图3所示微流控芯片内部的管道使用激光直写技术进行制造，以下为基本步骤：
提供PDMS基板；
利用激光直写在PDMS内部雕刻目标如图1及图3所示管道，将图1，图3所示液滴生成管道、筛选分离管道结构进行连接，或者直接采用较大的芯片将液滴生成管道、筛选分离管道于同一基板内部上集成。
筛选分离管道结构底部按如图3所示阵列设置电极3，并在E点位置设置光电传感器。
图2为在管道内液滴受微电极3产生的电场而运动的示意图。具体过程为在一定的时间间隔内不断从左至右依次激活多个电极3，驱动液滴4朝着微电极3顺序激活的方向移动。
图3中离散液滴在微流控芯片内受芯片底部的电极3产生的电场作用在管道中选择性通过的过程，其中，E点位置设置PMT传感器。
所述光电传感器将液滴的内容信息发送至分选程序中，通过计算机处理并控制单片机，进而通过单片机控制多个电极3片的高电平顺序，以此控制离散液滴的移动路径。具体地，所述光电传感器用于探测生成的液滴中是否包含(或包含定量)溶质粒子，若不包含(或者非规定定量)溶质粒子，则利用单片机控制微电极3的高电平顺序，以此控制离散液滴的移动路径。其余未在分选管道下方的电极3可作为拓展项目使用，细化对液滴内溶质粒子浓度的分选，例如可以制造从主管道221向不同方向的分管道222。
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行具体的说明。
实施例1
步骤一：取一定量PDMS预聚体，放入长方体容器中，然后使其凝固成型，成型得到长、宽、高分别为50mm、27mm、7mm的PDMS。
步骤二：设置管道在PDMS基板内的具体位置的激光直写程序，采用激光直写技术在PDMS基板内部雕刻如图1和图3所示液滴生成管道、筛选分离管道，加工完成后，采用空气泵作为驱动力，清除微管道内的加工残留物，其中，激光直写技术采用参数为：持续时间100fs，波长800nm，频率1000Hz；分别于A、B、C口通入各液相，
步骤四：针对图3所示筛选分离管道结构，在需固定微电极3的PDMS背面均匀涂上紫外线固化UV胶，并以俯视图矩形的左边和上边为基准进行排列，之后利用紫外线照射芯片约30s，应注意保证电极3不能中途脱落或移位，实现在筛选分离管道下方的PDMS基板背面上设置矩形电极3阵列，其中电极3间距为2mm。
步骤五：将图1所示液滴生产管道结构与图3所示筛选分离管道结构连接，进行试验。图1所示液滴生成管道结构中A口通入含有红细胞的生理盐水，以及从B，C口通入石蜡油，在交汇处生成离散液滴，所述离散液滴由液滴输送管道214的G口排出，由K口进入主管道221，在E处使用PMT传感器收集液滴光吸收强度的内容信息，将其反馈给分选程序，若光吸收强度低于分选程序所示阈值，采用驱动微电极3使该液滴进行上方路径的分管道222(图3中F处管道)中，而若光强高于分选程序设定阈值，采用驱动微电极3使该液滴进行下方路径的分管道222(图3中G处管道)中。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括：
提供聚二甲基硅氧烷基板；
利用激光直写技术在所述聚二甲基硅氧烷基板内部雕刻管道；
其中，所述管道包括：液滴生成管道、筛选分离管道；所述液滴生成管道包括：互相垂直设置的水相管道、第一油相管道、第二油相管道、液滴输送管道，且所述水相管道的出口与所述第一油相管道的出口、与所述第二油相管道的出口、与所述液滴输送管道的进口均连接；所述筛选分离管道包括主管道、多个分管道，所述主管道的出口分别与所述多个分管道的进口连接；所述液滴输送管道与所述主管道连通；
在所述筛选分离管道下方的聚二甲基硅氧烷基板底面上设置有阵列分布的多个电极，以及在所述主管道的一侧设置光电传感器，得到微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述提供聚二甲基硅氧烷基板包括：
将聚二甲基硅氧烷预聚物，放入模具中，通过加热使聚二甲基硅氧烷预聚物凝固成型，得到聚二甲基硅氧烷基板。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述聚二甲基硅氧烷基板的厚度为5-10mm。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述激光直写技术的参数包括：持续时间为50-200fs，波长为600-1000nm，频率为900-1200Hz。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，各个所述电极之间的间距为0.5-10mm。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述光电传感器为光电倍增管传感器。
7.一种微流控芯片，其特征在于，采用如权利要求1-6任一所述微流控芯片的制备方法制备得到。
8.一种基于如权利要求7所述微流控芯片的细胞分选方法，其特征在于，包括：
将水相、第一油相、第二油相分别通入所述水相管道、第一油相管道、第二油相管道，并在所述水相管道、第一油相管道、第二油相管道的连接处产生液滴，所述液滴进入所述液滴输送管道中；
所述液滴由所述液滴输送管道进入所述主管道中，所述光电传感器收集所述液滴的内容信息；
所述电极根据所述内容信息驱动所述液滴进入对应的分管道中，实现细胞分选；
其中，所述水相为含有细胞的生理盐水，所述水相分别与所述第一油相以及第二油相不互溶。
9.根据权利要求8所述的细胞分选方法，其特征在于，所述内容信息包括：所述液滴的光吸收强度。
10.根据权利要求8所述的细胞分选方法，其特征在于，所述细胞包括：红细胞、白细胞中的一种。
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