CN212393695U

CN212393695U - 一种精子冷冻载体系统

Info

Publication number: CN212393695U
Application number: CN202020208432.2U
Authority: CN
Inventors: 黄吴键; 洪志伟; 姚兵
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-02-25
Filing date: 2020-02-25
Publication date: 2021-01-26
Anticipated expiration: 2030-02-25

Abstract

本实用新型为一种精子冷冻载体系统，它包括内芯麦管、外套麦管，近端二阶插头；内芯麦管远端开设置有一沿其长度方向布置且用于放置微量精子液滴的凹槽；内芯麦管的近端插于近端二阶插头中的小插头，外套麦管套设于内芯麦管外，外套麦管的近端插于近端二阶插头中的大插头，外套麦管的远端封口。本实用新型用于冷冻保存低品质人类精子，适用于少精子或无精子症患者接受冷冻精子ICSI治疗周期；它具有操作快速，生物安全性高、精子复苏率高等特点。

Description

一种精子冷冻载体系统

技术领域

本实用新型涉及辅助生殖技术精子冷冻保存领域，特别是一种微量精子冷冻载体系统以及微滴不连续加样超快速冷冻微量精子方法，适用于低品质精子的冷冻，如：严重少、弱、畸形精子症、隐匿精子症、手术获取的微量睾丸和附睾精子。

背景技术

无精子症、严重少、弱精子症、隐匿精子症在男性不育门诊中并不少见，流行病学调查研究表明无精子症在普通人群中发病率约1％，在男性不育人群中约为10％。一些患者能够发现特定病因，针对性的治疗，可以改善部分生精功能；但是大多数患者往往无法找到确切病因或是基因染色体异常，就诊时已是生精功能不可逆减退，药物治疗无法改善。肿瘤治疗学的进步使超过三分之二的患者在诊断肿瘤后获得了超过5年的生存率，并且生活质量大大改善，但许多患者往往在放、化疗后面临严重的生育问题。单精子卵胞浆内注射技术(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)是男性不育治疗学上里程碑意义的发明，实现了男性少、弱、畸形精子症患者获得遗传学后代的愿望，理论上仅需要一条健康的精子就有希望解决生育问题。但是受成功率限制，患者往往需要多个ICSI周期才能获得生育，同时许多生精严重低下患者，精液质量存在较大波动性，有时射出精液中能找到活动精子，但常常离心后仍找不到精子，手术取精也存在取精失败和反复手术生殖腺受损问题，这些情况给ICSI准备带来巨大挑战，存在取卵日无法获得有效精子完成ICSI的风险。如果能把这部分病人精子提前冷冻保存，将会给辅助生育治疗带来极大便利，大大缩短患者获得生育的时间，同时也能很大程度降低患者心理压力。此外这些生精功能低下人群中，有部分患者随着龄的增长可能面临无精子症风险，自身有冷冻保存精子的需求。以慢速冷冻技术为代表的传统精子冷冻技术，在正常精子冷冻保存方面比较成功，但对这些低品质精子的冷冻保存效率仍低下，存在复苏后无活动精子可用风险，难以满足临床需要。

玻璃化冷冻技术是近年来人类配子冷冻领域最大的突破，该技术在胚胎保存上取得很大成功，已经完全取代传统胚胎慢速冷冻保存技术。玻璃化冷冻理论上因其微量、快速、细胞损伤小的优点非常适合精子的微量冷冻，然而传统的玻璃化冷冻技术要求冷冻保护剂至少>30％，高浓度的冷冻保护剂能够导致精子严重的渗透性损伤，采用传统的玻璃化冷冻技术冷冻精子的复苏率极低甚至为0，即使降低一半保护剂浓度，精子也无法承受，玻璃化冷冻技术在精子冷冻保存的探索上一度进展缓慢。2002年，Nawroth等首次报道精子无渗透性保护剂玻璃化冷冻获得成功。其后一些学者的研究认为：只要找到体积足够小的载体来实现极高的冻融速率，可以在不添加冷冻保护剂的情况下实现溶质的玻璃化，同时也避免了保护剂的化学毒性；微型载体的玻璃化冷冻方法比常规玻璃化冷冻方法有更大的优势。此后的探索主要集中在各种微量液体载体运用上。然而精子无渗透性保护剂的玻璃化冷冻技术，采用低浓度的蔗糖溶液(0.125～0.25mol/L)，不是真正意义上的玻璃化，细胞外液黏滞度过低无法真正实现玻璃化，仍有冰晶形成，其复苏率与传统冷冻方法相当，根据冷冻前精子质量不同文献报道复苏率在30％～70％之间。另外许多技术设计为了追求更快的冷冻速率，采用的是开放设计，精子与液氮直接接触，存在较大的微生物污染隐患和交叉污染风险。

另一类被称为“单个精子”冷冻的技术，随着近年显微取精技术的发展，也逐渐被研究和完善。该技术主要使用特殊载体系统，冷冻一条或数条精子。Cohen等(1997)首次报道采用人卵、小鼠和仓鼠空卵透明带保存单个精子，ICSI获得与新鲜精子相当的受精率。此后其他设计巧妙的载体系统，如空心的琼脂糖微球、球团藻、ICSI注射针、冷冻环、Cryotop、Cell Sleeper等也被尝试用来冷冻单个精子。2017年李铮团队报道采用新型的超薄片Cryopiece作为微滴精子冷冻载体，诞生了国内第一例单精子冷冻试管婴儿。但是单个精子冷冻技术需要显微操作设备；操作难度大；一些特殊载体如透明带、球团藻等存在生物安全隐患；并且为了追求最大的降温速率，大多采用开放设计，存在微生物交叉污染风险。该技术目前复苏精子的存活情况并不理想，一定程度影响了受精和胚胎发育。单个精子冷冻技术只适用于一些极端病例，开发一种适用于大多数少弱畸精症患者精液冷冻保存的技术仍然是非常重要的任务。

发明内容

本实用新型的目的在于：提供了一种精子冷冻载体系统，用于冷冻保存低品质人类精子，用于少精子或无精子症患者接受冷冻精子ICSI治疗周期；它具有操作快速，生物安全性高、重复性好、精子复苏率高的特点。

本实用新型通过如下技术方案实现：一种精子冷冻载体系统，

它包括内芯麦管、外套麦管，近端二阶插头；

内芯麦管远端开设置有一沿其长度方向布置且用于放置微量精子液滴的凹槽；

内芯麦管的近端插于近端二阶插头中的小插头，外套麦管套设于内芯麦管外，外套麦管的近端插于近端二阶插头中的大插头，外套麦管的远端封口。

较之前技术而言，本实用新型的有益效果为：

搭配超快速冷冻精子方法，用于冷冻低品质精子，如重度少、弱、畸形精子症、隐匿精子症、附睾精子、睾丸精子；具体1、复苏率高；对于精液参数正常样品冷冻试验，平均复苏率77.8±11.2％，对于极重度少弱精子症样品，复苏率30～70％；2、复苏后有活动精子的精子冷冻下限较传统冷冻方法提高3个数量级(500只活动精子/份标本)，传统方法大约需要100000只活动精子/份，解决低品质精子冷冻难题；3、操作流程快速，具体表现在冷冻以及解冻过程快速；4、无需特殊设备；5、全程闭合式，无交叉污染问题，生物安全性高；6、从物品准备到冷冻、解冻完成仅需20分钟；重复性好。

附图说明

图1为微量精子冷冻载体麦管系统(闭合套管式麦管系统)的结构示意图。

标号说明：1内芯麦管、11凹槽、2外套麦管、3近端二阶插头、31小插头、32大插头、4远端插头。

具体实施方式

下面结合附图说明对本实用新型做详细说明：

如图1所示：精子冷冻载体系统，它包括内芯麦管、外套麦管，近端二阶插头；

内芯麦管1远端开设置有一沿其长度方向布置且用于放置微量精子液滴的凹槽11；

内芯麦管1的近端插于近端二阶插头3中的小插头31，外套麦管2套设于内芯麦管1外，外套麦管2的近端插于近端二阶插头3中的大插头32，外套麦管2的远端封口。

外套麦管的远端封口可以通过远端插头4或热封方式封口。

这里采用近端二阶插头，在操作过程中近端二阶插头可以作为抓手使用，大大降低了操作污染的问题，使得整个内芯在整个操作过程中达到无菌操作的要求。

进一步的，所述内芯麦管的长度为5-10cm，内芯麦中凹槽的长度为4-9cm。内芯麦管可以根据装载精子悬液的量调整长度。只要不比外芯长就可以。

所述内芯麦管为0.25ml麦管；所述外套麦管为0.5ml麦管。上述提到的内芯麦管可以采用以下方式进行制作：选取一根无菌的0.25ml麦管(MTG,Bruckberg,德国)从正中切成两段，1/2麦管一端削开约4cm，形成开放式的凹槽，凹槽上可放置微量精子液滴。当然也可以直接委托生产商直接进行生产。

近端二阶插头的小插头用于连接0.25ml麦管，二阶插头的大插头用于连接0.5ml麦管。外套管采用PETG材质的CBS 0.5ml麦管(CBS；Cryo Bio System,法国)。

上述精子冷冻载体系统可以搭配超快速冷冻精子方法进行使用，它包括如下步骤：

S1精液预处理：将精子悬液中加入精子冷冻液，之后室温平衡；这里的精子冷冻液可以采用任意品牌货自行配置。

S2精液装载:将内芯麦管近端插上近端二阶插头，将S1中准备的精子滴在内芯麦管远端的凹槽中，之后在内芯麦管外套上外套麦管，外套麦管近端于插于近端二阶插头，外套麦管的远端通过远端插头或热封方式封口，从而形成闭合套管式麦管系统；

S3精液冷冻：将闭合套管式麦管系统放置于装有液氮的精子冷冻泡沫塑料箱中，其中精子冷冻泡沫塑料箱内设有浮在液氮液面的泡沫塑料块，闭合套管式麦管系统的外套麦管的远端封口和近端二阶插头架设于泡沫塑料块，使得内芯麦管投影暴露在液氮蒸汽中熏蒸(即内芯麦管投影不被泡沫塑料块阻挡)；液氮蒸汽熏蒸一定时间后，将闭合套管式麦管系统平行快速浸入液氮中进行冷冻,之后将闭合套管式麦管系统转移到液氮罐中保存。

需要说明的是冷冻过程中：需准备精子冷冻泡沫塑料箱，在精子冷冻泡沫塑料箱中事先加入10cm深液氮，特定厚度的矩形环状聚苯乙烯泡沫塑料块，放置于液氮面上，作为冷冻麦管的放置平台，使麦管能够悬空固定于液氮面特定高度(直接与液氮蒸汽接触熏蒸，麦管不与泡沫塑料接触)，盖上箱盖平衡10min备用。

S1中的具体参数为：将洗涤回收后的精子悬液，按悬液与冷冻液体积比1:1或者2:1比例逐滴加入精子冷冻液，边加边混匀，每滴间隔30s；混合均匀后，室温平衡10min。

S2中，精子采用微滴方式滴于凹槽上，每滴2～10μl，每滴间隔2mm，装载10～20滴。

S3中，泡沫塑料块的高度为1～10cm，液氮蒸汽熏蒸45s～30min。

S3中，闭合套管式麦管系统平行浸入液氮中进行冷冻保存。

它还包括

S4精液解冻：从液氮罐中取出闭合套管式麦管系统，室温空气解冻或特定温度水浴解冻至液滴完全融化后，取出闭合套管式麦管系统中的内芯麦管，将内芯麦管竖直插入1.5ml无菌小管底部，轻轻快速撞击管底，让精子液滴从内芯麦管上滑落到小管中；分3次加入总量为20～40μl培养液，每次间隔30s。解冻后的标本，放置于37℃复温15min后检测。

以下为微滴不连续加样超快速冷冻微量精子方法的最优实施例：

冷冻过程：准备精子冷冻泡沫塑料箱(高密度聚丙烯(EPP)泡沫塑料箱，容积11L，内径：25×18×23.5cm)，在精子冷冻泡沫塑料箱事先加入10cm深液氮，在液氮液面上放置一块厚度为1cm的矩形环状聚苯乙烯泡沫塑料块，作为冷冻麦管的放置平台，使闭合套管式麦管系统能够悬空固定于液氮面特定高度(直接与液氮蒸汽接触熏蒸，麦管不与泡沫塑料接触)，盖上箱盖平衡10min备用。将洗涤回收后的精子悬液，按1:1比例逐滴加入精子冷冻液(Quinn’s

Sperm Freeze，SFM,SAGE In-Vitro Fertilization,Inc.美国)，边加边混匀，每滴间隔30秒；室温平衡10分钟。在内芯麦管近端接上二阶插头，远端装载精子微滴，每滴2μl，每滴间隔2mm左右，装载10滴，动作尽可能快，尽量减少冷冻液滴挥发；套上外套麦管，远端插头封闭外套麦管远端。之后打开冷冻箱盖，将加样后闭合套管式麦管系统(尽快进行冷冻，室温放置不要超过1min)放置在液氮面漂浮的聚苯乙烯泡沫塑料块上，塞子架于两端，中间悬空让冷冻麦管与液氮蒸汽直接接触，液氮蒸汽熏蒸45秒，将闭合套管式麦管系统平行快速浸入液氮中，转移到液氮罐中保存。

解冻过程：从液氮罐中取出冷冻麦管，室温空气解冻，液滴完全融化后(大约1min)，取出闭合套管式麦管系统内芯麦管，将内芯麦管竖直插入1.5ml无菌小管底部，轻轻快速撞击管底，让精子液滴从内芯麦管上滑落到无菌小管中。分3次加入总量为20μl培养液(培养液量视精子浓度确定，使解冻后的标本便于使用)，每次间隔30s。解冻后的标本，放置于37℃复温15min后使用。

尽管本实用新型采用具体实施例及其替代方式对本实用新型进行示意和说明，但应当理解，只要不背离本实用新型的精神范围内的各种变化和修改均可实施。因此，应当理解除了受随附的权利要求及其等同条件的限制外，本实用新型不受任何意义上的限制。

Claims

1.精子冷冻载体系统，其特征在于：它包括内芯麦管(1)、外套麦管(2)，近端二阶插头(3)；

内芯麦管(1)远端开设置有一沿其长度方向布置且用于放置微量精子液滴的凹槽(11)；

内芯麦管(1)的近端插于近端二阶插头(3)中的小插头(31)，外套麦管(2)套设于内芯麦管外，外套麦管(2)的近端插于近端二阶插头(3)中的大插头(32)，外套麦管(2)的远端封口。

2.根据权利要求1所述的精子冷冻载体系统，其特征在于：所述内芯麦管的长度为5-10cm，内芯麦中凹槽的长度为4-9cm。

3.根据权利要求1所述的精子冷冻载体系统，其特征在于：所述内芯麦管为0.25ml麦管；所述外套麦管为0.5ml麦管。