CN205056049U - 一种用于生物毒素检测的生物芯片 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种用于生物毒素检测的生物芯片，包括芯片本体，还包括用于输出不同浓度的样品的V型浓度梯度形成模块，所述的芯片本体内设有多个通道，所述的通道上设有进液口和出液口，所述的V型浓度梯度形成模块上设有与通道一一对应的多个出口，所述的进液口与V型浓度梯度形成模块的出口一一对应连接，所述的通道上连接有多个单细胞固定单元，所述的单细胞固定单元包括与通道连通的容纳槽和由3～5个表面为曲面的凸出部依次连接形成的凸出阵列，所述的凸出阵列的一端与通道的侧壁连接并且另一端延伸至容纳槽中。本实用新型的目的是提供一种检测精度高、检测成本低、响应时间短的用于生物毒素检测的生物芯片。

Description

一种用于生物毒素检测的生物芯片

技术领域

本实用新型涉及生物检测技术领域，特别是一种用于生物毒素检测的生物芯片。

背景技术

麻痹性贝毒(PSP)是一种是海洋藻类产生的天然产物，贝类摄入含此毒素的海洋藻类对本身无害，但在体内富集，人食入此贝类后，毒素迅速释放并呈现毒素作用，其毒性是眼镜蛇毒性的80倍。PSP是目前已知的赤潮生物毒素中，发生次数最频繁，对人类影响最严重的一种。城市化和工农业的发展，出现了水体环境的污染和富营养化，带来水产品的污染，沿海赤潮不断发生，引起贝类的毒化和鱼类大量死亡，间接对人类造成极大的危害。水产品中生物毒素中毒事件不断发生，鉴于生物毒素独特的结构以及不易找到解毒剂，对毒素的检测与监控就显得尤为重要。

目前PSP检测方法大都使用“麻痹性贝类毒素的小白鼠生物测定法”进行贝体的麻痹性毒素分析测定，然而该方法重现性差，灵敏度低，耗时长，且易受多种因素干扰而影响结果的准确性，在实际应用中受到很大的限制。随着科学技术的发展，又出现了一些新的研究方法应用于检测STX(石房蛤毒素，为麻痹性贝类毒素的主要毒素之一)及其类似物，例如其它生物学检测方法，如细胞毒性试验、电生理化验或者荧光定量PCR，以及化学方法，如HPLC，色谱-质谱连用、CE和SPR已经被发展起来用于PSP毒素。HPLC是第一种用于检测PSP的仪器分析方法。然而，该技术也存在一些缺点，首先需要毒素标准品作参照，其次缺少用来制备荧光产物的光反应酶或后置柱衍生物化法的载色体，尤其是在样品制备过程中PSTs可能会发生化学转化。这种转化经常会使低毒的毒素变成毒性强的毒素，导致无法确定原始样品中毒素的真实毒性。色谱-质谱联用是一种有效的检测技术，然而LC-MS价格昂贵，需要有专业知识的技术人员操作和维护。到目前为止仍然替代不了小白鼠生物测定法。

电压门控钠离子通道是调整细胞兴奋性的药物和毒素的主要作用位点，因此已被作为主要的分子靶标用于离子通道研究、高通量新药开发以及毒素检测。由于所有的PSP毒素都具有相同的毒理性质，即抑制作用细胞的电压门控钠离子通道，因此以神经细胞的电压门控钠离子通道作为毒素靶标分析水产品中的麻痹性贝毒，使得整个检测过程更加直观、快速、灵敏，而且干扰因素少，这在水产品检测、赤潮监控等领域将具有巨大的潜在价值和应用前景，并能为完善海产品监测及管理体系提供基础。

微流控技术，又称微全分析系统或者芯片实验室，是目前迅速发展的高新技术和多学科交叉科技前沿领域之一，主要以分析化学和分析生物化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以化学和生物分析等领域中的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选、裂解等功能微型化为目标，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术平台。近年来，在当今分析设备微型化、集成化、自动化和便携化的发展趋势下，微流控平台的理论和技术得到了极大的发展，特别是多样化芯片操纵和检测方法的建立，微流控芯片技术在细胞学研究领域展现出前所未有的活力，尤其是在细胞操纵方面，微流控芯片因为具有与单细胞相近的微小尺寸、多维网络通道对细胞的易操纵性、可满足高通量细胞分析、各细胞分析模块的易整合等特点得到了越来越多的重视和关注，也产生一系列具有巨大应用前景的技术成果。

因此开发出一种以微流控技术为基础的用于生物毒素检测的生物芯片符合市场需求。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供一种检测精度高、检测成本低、响应时间短的用于生物毒素检测的生物芯片。

本实用新型提供的技术方案为：一种用于生物毒素检测的生物芯片，包括芯片本体，还包括用于输出不同浓度的样品的V型浓度梯度形成模块，所述的芯片本体内设有多个通道，所述的通道上设有进液口和出液口，所述的V型浓度梯度形成模块上设有与通道一一对应的多个出口，所述的进液口与V型浓度梯度形成模块的出口一一对应连接，所述的通道上连接有多个单细胞固定单元，所述的单细胞固定单元包括与通道连通的容纳槽和由3～5个表面为曲面的凸出部依次连接形成的凸出阵列，所述的凸出阵列的一端与通道的侧壁连接并且另一端延伸至容纳槽中。具体来说，V型浓度梯度形成模块的结构如中国实用新型专利CN202290071U《用于产生连续浓度梯度和输出独立浓度的微流控制芯片》所描述。

在上述的用于生物毒素检测的生物芯片中，所述的每个通道中设置有15个单细胞固定单元。在实际应用中，其并不限定单细胞固定单元为15个，可以选择为8-18个均是可行的。

在上述的用于生物毒素检测的生物芯片中，所述的通道的数量为12条。在实际应用中，通道并不限定为12条，其还可以为6-16条，条数越多其检测通量越高，但是其检测效率会受到影响。

在上述的用于生物毒素检测的生物芯片中，还包括废液池，所述的出液口与废液池连接。

在上述的用于生物毒素检测的生物芯片中，所述的通道的宽度为90μm，高为30μm。在实际应用中，通道的宽度并不限定为90μm，高并不限定为30μm，一般来说，通道的宽度可以选择为80μm、100μm等，高可以选择为25μm、35μm等。

在本实用新型中，凸出部的直径约为40～60μm，容纳槽的宽度约为凸出部直径的3～4倍；

本用于生物毒素检测的生物芯片的表面积约为1至数平方厘米，目视可见通道、凸出部、容纳槽等，以直径为60μm的普通头发为例，通道的宽度略大于单根头发直径，凸出部的直径与单根头发直径相似，容纳腔的宽度约为单根头发的2～4倍。

在上述的用于生物毒素检测的生物芯片中，所述的芯片本体由PDMS(polydimethylsiloxane,聚二甲基硅氧烷)层和设置在所述的PDMS层下表面的载玻片组成，所述的通道由PDMS层和载玻片围成。

在上述的用于生物毒素检测的生物芯片中，还包括缓冲液供应单元、标样供应单元、提取物供应单元，所述的V型浓度梯度形成模块的入口分别与缓冲液供应单元、标样供应单元、提取物供应单元连接。

本实用新型在采用上述技术方案后，其具有的有益效果为：

(1)本方案采用多通道的单细胞固定单元的芯片本体与V型浓度梯度形成模块结合，可以提高对生物毒素的检测精度，采用本方案的生物芯片，检测STX的检出限可以达到1ng/ml。

(2)本方案的单个单细胞固定单元的凸出部的数量提高了单细胞固定的准确性，防止在一个微型管道固定多个细胞或者无法稳定的固定细胞的问题的出现，进而提高检测的准确性。

附图说明

图1是本实用新型实施例1的结构示意图；

图2是本实用新型实施例1的局部A的放大图；

图3是本实用新型实施例1的图2的B-B剖视图。

图1至图3中各标号所代表的部件为：1、芯片本体，2、V型浓度梯度形成模块，3、废液池，4、缓冲液供应单元，5、标样供应单元，6、提取物供应单元，11、通道，12、进液口，13、出液口，14、容纳槽，15、凸出部，16、凸出阵列，17、微型管道，18、单细胞固定单元，19、PDMS层，10、载玻片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本实用新型的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本实用新型的任何限制。

实施例1：

如图1至3所示，一种用于生物毒素检测的生物芯片，包括芯片本体1，还包括用于输出不同浓度的样品的V型浓度梯度形成模块2和废液池3，所述的V型浓度梯度形成模块2的入口分别与缓冲液供应单元4、标样供应单元5、提取物供应单元6连接；所述的芯片本体1上设有多个通道11，所述的通道11上设有进液口12和出液口13，所述的V型浓度梯度形成模块2上设有与通道11一一对应的多个出口，所述的进液口12与V型浓度梯度形成模块2的入口一一对应连接，所述的出液口13与废液池3连接，所述的通道11上连接有多个单细胞固定单元18，所述的单细胞固定单元18包括与通道11连通的容纳槽14和由3～5个表面为曲面的凸出部15依次排列形成的凸出阵列16，所述的凸出阵列16的一端与通道11的侧壁连接并且另一端延伸至容纳槽14中，即凸出阵列16是固定在容纳槽14中并延伸至通道11的侧壁，其另一端与容纳槽的侧壁并不接触，形成一个引导溶液从通道11流向容纳槽14并从容纳槽14流回通道11的流体阻力结构。由于凸出部15的表面为曲面，因此相邻的两个凸出部15之间就形成了微型管道17。

具体来说，所述的每个通道11中设置有15个单细胞固定单元18，所述的通道11的数量为12条，所述的通道11的宽度为90μm，高为30μm。

在实际应用中，在出液口13位置还连接有微型泵，提高通道11内液体流速，通过微型泵将通道11内的液体倒入到废液池3中。

如图1至图3所示，本实施例的用于生物毒素检测的生物芯片每个单细胞固定单元中包含5个凸出部15，这5个凸出部15形成了5个微型管道17，具体如图2和图3所示。该凸出阵列16设计成与通道11(宽90μm，高30μm)垂直。液体从V型浓度梯度形成模块2中流入通道11，遇到凸出阵列16，液体可以选择向垂直方向流动，也可以选择水平方向流过凸出阵列16形成的微型管道17。当细胞流入通道11的时候，遇到凸出阵列16后，水平方向流过微型管道17的液体携带的细胞，有机会可以被固定在微型管道17上。

这里每一个凸出部15都可以看成是一个流体阻力装置，通过细胞固定在凸出阵列16形成的微型管道17(最狭窄处直径为1.9μm)上，可以增加这个凸出阵列16对流体的阻力值。当细胞(以Jurkat细胞为例，直径10μm)流入通道11中，进入容纳槽14后，随着液体的流动细胞会被带进由凸出阵列16形成的微型管道17中。细胞进入微型管道17以后，由于细胞直径大于微型管道17最窄处的直径，从而将细胞固定在微型管道17上。细胞固定在微型管道17上，使得这个微型管道17对流体阻力值大大增加，迫使其他细胞倾向于进入没有固定细胞的微型管道17上。细胞会随着液体继续流动，这些细胞可以固定在其他没有被细胞占据的微型管道17上，或是随着液体流向通道11下游。利用这种细胞固定以后可以改变微型管道17对液体阻力的方法，使得每一个凸出部15形成的微型管道17只固定一个细胞，从而形成了单细胞阵列。

在实验过程中，将不同数量(如2个和14个)的凸出部15整合在一个固定单位中，然后研究细胞固定的情况。在凸出部15数量很少的时候(一个固定单位中，2个凸出部)，由于凸出部15数量少，对通道11液体流动阻力小，因此流体流速很快，细胞在微型管道17上固定以后很容易被液体冲走，从而使得固定细胞的数量大大减少。如果降低流速，容易在一个微型管道17上固定多个细胞，因此也做不到单细胞固定。

相反地，如果一个凸出阵列16中，凸出部15数量很大的时候(一个凸出阵列16中，14个凸出部15)，增加了细胞固定的位点，对流体的阻力也相应升高，只有少量的细胞可以固定在远端3～5个凸出部15形成的微型管道17上。因为当增加凸出部15数量之后，液体只有在远端的凸出部15处，才具有一定的水平方向的速度，可以携带细胞进入远端凸出部15形成的微型管道17，从而使细胞固定在远端的微型管道17上。而在近端的微型管道17处，液体主要以垂直方向流动为主，液体速度不足以携带细胞进入微型管道17，因此细胞很少固定在近端的凸出部15形成的微型管道17处。此外，由于制作芯片的手段的限制，当我们凸出阵列16中凸出部15数量较多时，结构破损的情况增加。我们发现当一个结构中设置5个凸出部15的时候，可以得到不错的单细胞固定效果。

在本实施例中，如图1至3所示，所述的芯片本体1由PDMS层19和设置在所述的PDMS层19下表面的载玻片10组成，所述的通道11由PDMS层19和载玻片10围成。当然本方案并不限定为采用玻璃和PDMS聚合材料来制备芯片本体1，芯片本体1还可以采用同材质的PDMS代替载玻片10来制作芯片本体1，在芯片本体1中制备通道11的具体的制备方法在多个文献中均有描述，如《PDMS微流控芯片的制备工艺研究》夏飞，南京理工大学，硕士学位论文中已经详细论述了，采用同材质的PDMS来制备芯片本体1和采用PDMS和玻璃组合来制备芯片本体1的具体方法。

具体到本实施例中，其不同的地方在于，需要在容纳槽14中安装凸出阵列16，其具体的方法为：芯片采用以感光电路板(PCB)为模板的光刻蚀技术制备。首先将设计的芯片结构图样通过绘图软件(CorelDRAW9.0)绘制出来，并以3000dpi的分辨率打印在Kodak的菲林胶片上制备出芯片的光掩膜。将光掩膜覆盖在PCB板并置于紫外曝光机中曝光110s，然后将PCB板放入100mL显像液(显像剂：水＝1：20)中显像6min，再用水冲洗掉溶解的光刻胶和残余的显像液。将显像完毕的PCB板放入200mL刻蚀液(FeCl₃·6H₂O：水＝1：2，质量体积比)静置刻蚀45min，刻蚀深度约为30μm。刻蚀后的PCB板上就呈现出与通道11对应的凸出和与凸出部15对应的凹部，刻蚀完毕用自来水彻底冲洗PCB板，并用丙酮洗掉残余的光刻胶。将PDMS预聚体与固化剂按一定比例(12：1，质量分数)均匀混合，真空除气后倒在PCB模板表面，65℃条件下固化3h。

将固化完成的PDMS片从模板上剥离，在预先设计的废液池位置打孔。然后将PDMS片和洗净的载玻片置于等离子清洗器中，用氧等离子体对二者表面进行处理(功率50W，时间3min，空气流量1200mL/min)，处理后将二者迅速加压贴合，得到不可逆封接的芯片。贴合后的芯片再放入75℃烘箱中后烘6h以增强PDMS与载玻片的键合。最后在芯片表面安装进样接口和出样收集装置，得到实验用的微流控装置即生物芯片。

在实际应用中，也可以采用PDMS平板代替载玻片，在这种情况下，具体的操作方法为：(1)UV曝光，将光掩膜上的微流控设计图案转到印刷电路板上；(2)对印刷电路板进行蚀刻，将微流控设计转移到铜层上；(3)以具有微流控芯片设计样式的铜板作为模具，将PDMS前聚体浇注在铜板上；(4)聚合后，将PDMS从铜板上剥离；(5)将具有微流控芯片结构的PDMS与平坦的PDMS薄片进行封接，芯片制作完成。

芯片上STX测定

将本实施例所得的用于生物毒素检测的生物芯片用于麻痹性贝类毒素的检测。

染毒贝类样品取自深圳海域，将新鲜或冷冻贝类去壳后匀浆，称取均质后样品5.0g于50ml离心管中，加入20ml酸性超纯水(加入盐酸将pH值调到2.4)超声提取2min后，以1000g离心10min。

采用本实施例所制备的用于生物毒素检测的生物芯片进行STX的测定，可兴奋成神经细胞瘤细胞BE(2)-M17在与麻痹性贝毒作用时其膜电位会发生改变，因此可以通过荧光探针bis-oxonol对细胞膜电位差异进行分析，从而对STX毒素进行分析及定量。该荧光探针的激发波长为540nm，发射波长为560nm。

BE(2)-M17细胞(1×10⁶cell/ml)悬浮在1ml的2μM的bis-oxonol不含胚胎牛血清的EMEM培养液(美国GIBCO公司出品)中。在室温下孵育10分钟，将细胞离心，重新混悬，在37摄氏度含有5％CO₂情况下，孵育10分钟。然后将细胞重新离心，再以5×10⁶cell/ml浓度混悬在缓冲溶液中待用。实验前，通过缓冲液供应单元4、标样供应单元5、提取物供应单元6从V型浓度梯度形成模块2的的3个入口中分别加入40μl缓冲液，同时将出样口中的液体吸出，使缓冲液充满所有的通道11。在进行细胞固定时，通过缓冲液供应单元4、标样供应单元5、提取物供应单元6从V型浓度梯度形成模块2的3个入口同时加入20μl含有用bis-oxonol染色的细胞的缓冲液。依靠负压力，细胞流进本生物芯片中，持续1.5到2分钟进行细胞固定。细胞固定以后，将V型浓度梯度形成模块2每一个入口，用缓冲液冲洗3次，然后再加满20μl缓冲液。

藜芦定是钠离子通道蛋白β亚基结合的Na⁺通道激活剂，具有开放钠离子通道作用。因此，先加藜芦定可放大细胞对麻痹性贝毒的响应。经bis-oxonol处理过后的BE(2)-M17细胞在生物芯片的通道11中被固定之后，进样口加入20μl的40μM藜芦定使细胞去极化。而这种去极化过程可以被已知浓度的标准STX毒素及未知浓度的海产品来源STX毒素所抑制。从进样口加入STX，V型浓度梯度产生模块将从V型浓度梯度形成模块2的入口加入的STX生成12个独立浓度分别导入到12个平行的凸出阵列16，每分钟成像一次，每次成像曝光3.2秒，记录10分钟。最后，10μg/mL的短杆菌肽用于诱导完全的细胞去极化。采用GenePixPro(4.0，AxonInstrumentsInc，CA，USA)软件提取随机选取单细胞，提取细胞荧光强度值。将荧光强度值导入Excel和OriginPro7.5软件进行进一步分析。

我们使用了3种PSP毒素混合提取物：样品A(55％ToxC2，4％GTX1，15％GTX2，9％GTX3，16％GTX5，0.5％GTX6，3％NeoSTX)，样品B(0.7％ToxC1，4％ToxC2，7％GTX1，51％GTX2，14％GTX3，0.5％GTX4，24％GTX5，0.4％GTX6，1％STX)和样品C(9％ToxC1，4.8％GTX1，12％GTX2，7％GTX3，14％GTX5，1％GTX6，3％NeoSTX，24％dcSTX，25％STX)。加入藜芦定使得BE(2)-M17细胞中bis-oxonol的荧光增强，随后加入STX选择性地降低藜芦定引起的去极化并呈现出浓度依赖地降低bis-oxonol的荧光。去极化的被抑制程度与毒素的浓度呈线性关系。此方法检测STX的检出限可以达到1ng/ml。为测试方法的效率和灵敏度，这些样品平行地用动物试验的生物测定法(GB/T23215-2008)和HPLC(SN/T1735-2006)进行测定。结果如表1所示，显示此微流控芯片方法能用于PSP的高灵敏检测。

表1

本实施例的用于生物毒素检测的生物芯片适合用于芯片上STX测定。含有未知毒素样本的提取物中加入已知量的PSP毒素。混合物通过生物芯片中的V型浓度梯度产生模块稀释并输送到固定有细胞的凸出阵列16。可兴奋成神经细胞瘤细胞BE(2)-M17在与麻痹性贝毒作用时其膜电位会发生改变，因此可以通过荧光探针bis-oxonol对细胞膜电位差异进行分析，从而对STX毒素进行分析及定量。

本实施例所得到的用于生物毒素检测的生物芯片完全能够满足高特异性地、高灵敏的、快速可靠的和高通量的海产品和有毒藻类中的PSP监测的需要。使用该用于生物毒素检测的生物芯片的检测方法简便、快速、准确，达到目前国际上检测PSP的先进水平，可用于海产品和藻类样品中PSP的高通量定量测定。

上述实施例为本实用新型较佳的实施方式，但本实用新型的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本实用新型的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本实用新型的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于生物毒素检测的生物芯片，包括芯片本体(1)，其特征在于：还包括用于输出不同浓度的样品的V型浓度梯度形成模块(2)，所述的芯片本体(1)内设有多个通道(11)，所述的通道(11)上设有进液口(12)和出液口(13)，所述的V型浓度梯度形成模块(2)上设有与通道(11)一一对应的多个出口，所述的进液口(12)与V型浓度梯度形成模块(2)的出口一一对应连接，所述的通道(11)上连接有多个单细胞固定单元(18)，所述的单细胞固定单元(18)包括与通道(11)连通的容纳槽(14)和由3～5个表面为曲面的凸出部(15)依次连接形成的凸出阵列(16)，所述的凸出阵列(16)的一端与通道(11)的侧壁连接并且另一端延伸至容纳槽(14)中。

2.根据权利要求1所述的用于生物毒素检测的生物芯片，其特征在于：所述的每个通道(11)上连接有15个单细胞固定单元(18)。

3.根据权利要求2所述的用于生物毒素检测的生物芯片，其特征在于：所述的通道(11)的数量为12条。

4.根据权利要求1所述的用于生物毒素检测的生物芯片，其特征在于：还包括废液池(3)，所述的出液口(13)与废液池(3)连接。

5.根据权利要求1所述的用于生物毒素检测的生物芯片，其特征在于：所述的通道(11)的宽度为90μm，高为30μm。

6.根据权利要求1至5任一所述的用于生物毒素检测的生物芯片，其特征在于：所述的芯片本体(1)由PDMS层(19)和设置在所述的PDMS层(19)下表面的载玻片(10)组成，所述的通道(11)由PDMS层(19)和载玻片(10)围成。

7.根据权利要求1至5任一所述的用于生物毒素检测的生物芯片，其特征在于：还包括缓冲液供应单元(4)、标样供应单元(5)、提取物供应单元(6)，所述的V型浓度梯度形成模块(2)的入口分别与缓冲液供应单元(4)、标样供应单元(5)、提取物供应单元(6)连接。