CN115646567A - 集成液滴在线培养和高通量筛选功能的微流控芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学工程技术，公开了一种集成液滴在线培养和高通量筛选功能的微流控芯片及其应用。该微流控芯片包括玻璃毛细管组件和点样器，玻璃毛细管组件包括呈两端开口状的外相毛细管和呈两端开口状的内相毛细管，内相毛细管的一端嵌套在外相毛细管的一端内，外相毛细管内设置有储液段，储液段的内径大于外相毛细管上其余段的内径，外相毛细管和内相毛细管两者的连接处与点样器的出液端密封连接，以使得点样器能够向外相毛细管内输入液体。该微流控芯片能够实现液滴原位在线培养，无需转移，具有耐有机溶剂、气密性好、易于进行表面处理、重复利用性高等优点，能够减少液滴的破损率，提高后续的分选精确性。

Description

集成液滴在线培养和高通量筛选功能的微流控芯片及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术，具体地，涉及一种集成液滴在线培养和高通量筛选功能的微流控芯片及其应用。

背景技术

绿色生物制造是未来工业绿色变革的重要突破口，与化学合成相比，生物合成有低成本、高质量、高收率、环境友好等优点，因此近年来发展迅速。在生物合成链条中较为关键的是底盘细胞的改造，随机突变能够一次性获得大量突变株，由此快速筛选出高产菌株对绿色生物制造至关重要，这也对筛选的通量提出更高的要求。传统的筛选方法大多采用摇瓶或是平板进行，结合测序、PCR或特定响应机制来进行菌株筛选，整个体系耗时长、仪器复杂、试剂用量多且筛选效率低下。

目前较为先进的方法是液滴微流控筛选策略，其核心是将单个菌株封装在微流控液滴中，每个液滴相当于一个微型反应器，对单个特定菌株进行分析，独立无交叉污染。液滴微流控筛选依赖芯片作为平台，在目前涉及微生物高通量筛选的研究中，芯片使用的大多是聚二甲基硅氧烷（PDMS）材质，PDMS是一种常见的弹性体聚合物材料，其加工方便，成本较低，可以在温和的条件下（40-70℃）发生固化，并且可以通过软光刻的方法进行模板复制和加工。虽然PDMS材料广泛使用，但是PDMS芯片存在许多的问题，例如，其具有的良好透气性会加速内部水分或油相溶剂的挥发，导致溶液浓度改变、液滴破裂等问题；PDMS本身对疏水性小分子和生物分子有一定的吸收，会导致内部微通道溶胀变形；对非极性物质吸附强，使得PDMS自身在常态下无法与玻璃金属薄片等材料键合，需要借助复杂的表面改性或加入胶水。由于用于微生物高通量筛选的油相通常为挥发性强的氟化油，无法在PDMS芯片中长时间保留，因此，在芯片中生成的菌株封装液滴需要立刻转移，进入其他气密性较好的容器中培养，然而，在转移过程中一些不稳定的因素将会扰动液滴，甚至会使液滴二次乳化，最终影响筛选结果。因此，急需一种能够同时实现液滴生成、原位培养、液滴分选等操作的微流控芯片。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是提供一种集成液滴在线培养和高通量筛选功能的微流控芯片，该微流控芯片具有耐有机溶剂、气密性好、易于进行表面处理、重复利用性高等优点，允许液滴原位在线培养，能够减少液滴的破损率，提高后续的分选精确性。

本发明其次所要解决的技术问题是提供一种集成液滴在线培养和高通量筛选功能的微流控芯片的应用，将微流控芯片有效应用于微生物筛选中，保证内部菌株稳定地产生代谢物，具有较高的筛选精确性，且过程简单。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种集成液滴在线培养和高通量筛选功能的微流控芯片，包括玻璃毛细管组件和点样器，所述玻璃毛细管组件包括呈两端开口状的外相毛细管和呈两端开口状的内相毛细管，所述内相毛细管的一端嵌套在所述外相毛细管的一端内，所述外相毛细管内设置有储液段，所述储液段的内径大于所述外相毛细管上其余段的内径，所述外相毛细管和所述内相毛细管两者的连接处与所述点样器的出液端密封连接，以使得所述点样器能够向所述外相毛细管内输入液体。

优选地，该微流控芯片还包括载玻片，所述外相毛细管固定在所述载玻片上。

优选地，所述外相毛细管上所述储液段的两侧和/或所述内相毛细管通过调节件与所述载玻片连接，以使得所述外相毛细管和所述内相毛细管两者均与所述载玻片平行。

优选地，所述调节件为盖玻片或者海绵片。

优选地，所述外相毛细管与所述内相毛细管为同轴嵌套连接。

优选地，所述内相毛细管靠近所述外相毛细管的一端、所述外相毛细管的两端中的至少一者呈锥形尖口结构。

优选地，所述储液段的内径为1-5mm，所述外相毛细管上其余段的内径为300-800μm；所述内相毛细管的内径为100-200μm。

优选地，所述外相毛细管采用经疏水处理的玻璃管，所述疏水处理的过程包括：在密闭条件下，利用疏水剂对所述外相毛细管进行3-5次蒸镀，其中，所述疏水剂采用二氯甲烷与三氯十八烷基硅烷的混合液，每次所述蒸镀的条件包括：温度为60-70℃，时间为1.5-3h；所述内相毛细管采用经乙醇清洗后的玻璃管。

本发明第二方面提供如上所述的微流控芯片在液滴原位在线培养和/或高通量筛选微生物中的应用。

本发明第三方面提供一种高通量筛选微生物的方法，采用如上所述的微流控芯片，包括以下步骤：

S1、建立微生物突变体库；

S2、将含有表面活性剂的氟化油作为外相从所述点样器输入所述外相毛细管内，将所述微生物突变体库菌株的培养液作为内相从所述内相毛细管远离所述外相毛细管的一端输入并经该内相毛细管输入所述外相毛细管内，以对所述微生物突变体库中的菌株进行包埋形成液滴；

S3、所述液滴在所述储液段中聚集后，停止将所述外相和所述内相输入所述外相毛细管内，将所述点样器和所述内相毛细管的进液口、所述外相毛细管的出液口封闭，使得所述液滴在所述储液段中进行原位在线培养；

S4、对所述原位在线培养后的液滴进行微流控分选。

优选地，步骤S1中所述微生物为藤仓赤霉菌。

优选地，步骤S2中所述表面活性剂为含氟表面活性剂，优选为Pico-Surfin FC40、FS-Kryjeff D900、EA表面活性剂和FS-008中的至少一种。

优选地，所述微生物突变体库菌株的培养液通过将所述微生物突变体库菌株进行液体培养得到。

优选地，所述外相的流速为3-8mL/h，所述内相的流速为0.1-1.0mL/h。

优选地，步骤S3中所述原位在线培养的条件至少包括：温度为28-30℃，时间为2-8天。

优选地，步骤S4中所述微流控分选采用的筛选信号选自荧光、吸光度、拉曼光谱和质谱中的至少一种。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明提供的微流控芯片中，外相毛细管采用“中间粗两端细”的结构，使得生成的液滴停留在外相毛细管的储液段内，因而液滴能够直接在该微流控芯片中进行原位在线培养，无需后续的转移操作；该微流控芯片不仅可以减少液滴的破损率、提高后续的分选精确性，而且具有耐有机溶剂、气密性好、易于进行表面处理、重复利用性高等优点，该装置的制备过程简单易操控，可多次重复利用，应用范围广；在应用于高通量筛选微生物时，能够保证内部菌株稳定地产生代谢物，具有较高的筛选精确性，且筛选过程简单、操作方便。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1是本发明中微流控芯片的一种具体实施方式的结构示意图；

图2是本发明中内相毛细管与外相毛细管连接端的一种具体实施方式的结构示意图；

图3是本发明中内相毛细管与外相毛细管连接端的另一种具体实施方式的结构示意图；

图4是本发明中微流控芯片的一种具体实施方式的实物图；

图5是对比例1中生成的液滴图。

附图标记说明

1外相毛细管；11储液段；

2内相毛细管；3点样器；

4载玻片。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供了一种集成液滴在线培养和高通量筛选功能的微流控芯片，参见图1和图4，包括玻璃毛细管组件和点样器3，玻璃毛细管组件包括呈两端开口状的外相毛细管1和呈两端开口状的内相毛细管2，内相毛细管2的一端嵌套在外相毛细管1的一端内，外相毛细管1内设置有储液段11，储液段11的内径大于外相毛细管1上其余段的内径，外相毛细管1和内相毛细管2两者的连接处与点样器3的出液端密封连接，以使得点样器3能够向外相毛细管1内输入液体。

本发明中，内相毛细管2的一端外径小于外相毛细管1一端的内径，以保证内相毛细管2的一端嵌套在外相毛细管1的一端内，但内相毛细管2不会将外相毛细管1的端口完全堵塞，以使得内相毛细管2内的液体能够输入外相毛细管1中；外相毛细管1内设置有储液段11，使得外相毛细管1呈“中间粗两端细”的结构；点样器3可以采用如图4中所示的点样针头，也可以采用其它结构的密闭点样装置。

本发明的发明人在研究过程中发现，传统的微流控芯片在应用于液滴高通量筛选微生物时，由于其密封性差，导致外相氟化油因挥发极快，无法作为液滴长期培养的介质，针对液体的培养，则需要将形成的液滴转移至后续装置中进行培养，转移过程对液滴会造成破坏。本发明的发明人在结构设计时，创造性地在外相毛细管1中设置内径较大的储液段11，并结合外相毛细管1和内相毛细管2嵌套连接的密封结构特征，以实现在微流控芯片中形成液滴后能够在储液段11中聚集并进行液滴原位在线培养，可最大程度减少转移操作对液滴造成的影响，减少液滴的破损率、保证内部菌株稳定地产生代谢物，提高后续的分选精确性。其中，由于液滴的密度比外相氟化油的密度小，因此液滴会漂浮在外相氟化油上方贴着储液段11的管壁聚集，且储液段11较宽空腔与其前端较细的毛细管通道形成的压差，能够进一步促进该液滴聚集效应。

本发明提供的微流控芯片在使用时，外相从点样器3输入外相毛细管1内，内相从内相毛细管2远离外相毛细管1的一端输入内相毛细管2中，再经内相毛细管2输入外相毛细管1内，形成外相包裹内相以封装单孢子的液滴；生成的液滴停留聚集在外相毛细管1的储液段11内，达到一定数量后，停止内相与外相的输入，将整个微流控芯片与外界空气连通部分用PE管和夹子堵塞，并转移至菌株最适生长条件下，使得液滴直接在外相毛细管1的储液段11中进行原位培养，在进行原位培养后经外相毛细管1远离内相毛细管2的一端输出至相应的筛选装置，进行高通量筛选。

本发明中，微流控芯片可以配合相应的承载装置或者固定装置进行使用，例如，可以将外相毛细管1和/或内相毛细管2进行固定后进行使用。优选情况下，该微流控芯片还包括载玻片4，外相毛细管1固定在载玻片4上。载玻片4可以采用商购的实验室用载玻片，通用易得，使得微流控芯片的装配简单。此外，为了进一步提高微流控芯片的结构稳定性，内相毛细管2也可以与载玻片4固定连接。

本发明中，外相毛细管1和内相毛细管2可以通过速干胶固定连接在载玻片4上，操作简单；外相毛细管1和内相毛细管2两者的连接处与点样器3的出液端也可以通过速干胶实现密封连接，速干胶也属于通用易得的商购产品，便于在实验室进行微流控芯片的装配。示例性地，速干胶为AB胶，按照1：1的比例挤出等量的A胶与B胶，均匀地搅拌混合在一起，用枪头取少量混匀的胶水涂抹在外相毛细管1与载玻片4的连接处，或者涂抹在外相毛细管1和内相毛细管2两者的连接处与点样器3的出液端之间，在室温下保持10min即可。

本发明中，为了能够保持微流控芯片中内相与外相的流动稳定性，形成尺寸均一、封装单孢子的微液滴，优选情况下，外相毛细管1上储液段11的两侧和/或内相毛细管2通过盖玻片与载玻片4连接，以将外相毛细管1上除储液段11以外的其余段以及内相毛细管2垫高，使得外相毛细管1和内相毛细管2两者均与载玻片4平行，以在载玻片4上保持平稳状态。进一步优选地，调节件为盖玻片或者海绵片，其中，盖玻片或者海绵片均可以采用商购产品，通用易得。

本发明中，为了能够更好地控制形成的微液滴的尺寸，保证对微生物的封装效果，优选情况下，外相毛细管1与内相毛细管2为同轴嵌套连接，即，外相毛细管1的轴线与内相毛细管2的轴线重合，呈现共轴的排列模式。

根据本发明，外相毛细管1和内相毛细管2两者端口可以呈平口结构，也可以呈锥形尖口结构，以能够形成不同形态的毛细管通道，对形成的液滴形态大小、生成频率进行调控。作为本发明中外相毛细管1和内相毛细管2的一种优选的实施方式，参见图2和图3，内相毛细管2靠近外相毛细管1的一端以及外相毛细管1的两端中的至少一者呈锥形尖口结构。内相毛细管2靠近外相毛细管1的一端呈锥形尖口结构，有利于更好地嵌套在内相毛细管2内；外相毛细管1的一端或两端呈锥形尖口结构，形成的液滴直径小、频率大，效果更好。

本发明中，外相毛细管1和内相毛细管2可以采用两根规格不同的玻璃圆管，使用乙炔喷灯将其拉制而成，其中，外相毛细管1的初始玻璃圆管利用乙炔喷灯将两端拉成细管，中间部分的内径不变作为储液段11；初始玻璃圆管的内外径的选择需要保证拉制后内相毛细管2一端的外径小于外相毛细管1一端的内径。优选情况下，储液段11的内径为1-5mm，外相毛细管1上其余段的内径为300-800μm；内相毛细管2的内径为100-200μm。

本发明中，作为外相毛细管1的一种优选实施方式，外相毛细管1采用经疏水处理的玻璃管，疏水处理的过程包括：在密闭条件下，利用疏水剂对外相毛细管1进行3-5次蒸镀，其中，疏水剂采用二氯甲烷与三氯十八烷基硅烷的混合液，每次蒸镀的条件包括：温度为60-70℃，时间为1.5-3h。在该优选的实施方式下，对外相毛细管1进行充分疏水，能够减少液滴与外相毛细管1的玻璃管壁间的粘性，提高液滴生成和长时间培养的稳定性。其中，混合液中二氯甲烷与三氯十八烷基硅烷的体积比为90-110:1。

本发明中，作为内相毛细管2的一种优选实施方式，内相毛细管2采用经乙醇清洗后的玻璃管，避免外界杂质的引入。具体地，将初始玻璃圆管使用乙炔喷灯拉制后，置于无水乙醇中，超声条件下反复清洗，再将酒精吹干，形成尖端平整、内壁干净无杂质残留的玻璃管作为内相毛细管2。

本发明第二方面提供上述的微流控芯片在液滴原位在线培养和/或高通量筛选微生物中的应用。本发明提供的微流控芯片能够实现对形成的液滴进行原位培养，在应用于高通量筛选微生物时，能够保证内部菌株稳定地产生代谢物，具有较高的筛选精确性，且筛选过程简单、操作方便。

本发明第三方面提供一种高通量筛选微生物的方法，采用上述的微流控芯片，包括以下步骤：

S1、建立微生物突变体库；

S2、将含有表面活性剂的氟化油作为外相从点样器3输入外相毛细管1内，将微生物突变体库菌株的培养液作为内相从内相毛细管2远离外相毛细管1的一端输入并经该内相毛细管2输入外相毛细管1内，以对微生物突变体库中的菌株进行包埋形成液滴；

S3、液滴在储液段11中聚集后，停止将外相和内相输入外相毛细管1内，将点样器3和内相毛细管2的进液口、外相毛细管1的出液口封闭，使得液滴在储液段11中进行原位在线培养；

S4、对原位在线培养后的液滴进行微流控分选。

根据本发明，优选地，步骤S1中所述微生物为酵母菌和/或赤霉菌，进一步优选为藤仓赤霉菌，所述微流控分选通过筛选信号获得高产赤霉素的藤仓赤霉菌菌株。

根据本发明，步骤S1中建立微生物突变体库可以采用常规的微生物诱变方法对某微生物菌种进行诱变，以获得包含多个该微生物菌株的突变体库，例如，采用紫外辐照、等离子体诱变和化学诱变中的至少一种。其中，紫外辐照、等离子体诱变和化学诱变可以采用市售的多功能等离子体诱变系统进行。

根据本发明，优选地，步骤S2中所述表面活性剂为含氟表面活性剂，优选为Pico-Surfin FC40、FS-Kryjeff D900、EA表面活性剂和FS-008中的至少一种。在该优选的实施方式下，有利于提升外相对内相的包裹效果，且能够更好地与内相配合，提高液滴的形态稳定性。进一步优选地，所述氟化油中所述表面活性剂的浓度为2-5wt%。在该优选的实施方式下，液滴在较长时间孵育中不易融合，有利于进一步提高液滴的稳定性。

根据本发明，优选地，所述微生物突变体库菌株的培养液通过将所述微生物突变体库菌株进行液体培养得到。具体地，将微生物突变体库菌株接种至相应的液体培养基中进行液体培养，计算理想生物量以确保后续的菌株单包裹。

根据本发明，对于菌株的液体培养基没有特别的限定，根据不同的微生物菌种，选择能够为该微生物菌种提供生长所需营养的培养基即可，例如，微生物为藤仓赤霉菌时，液体培养基中含有碳源、氮源，具体可以采用含有葡萄糖、蛋白胨和酵母膏的培养基，示例性地，液体培养基含有：葡萄糖15-25g/L、蛋白胨15-25g/L和酵母膏5-15g/L。优选地，所述液体培养的培养基采用YPD液体培养基，所述培养的条件至少包括：温度为28-30℃，具体地培养时间可以根据所需实现的理想生物量以及微流控芯片中外相、内相的使用量进行控制。

根据本发明，优选地，所述外相的流速为3-8mL/h，所述内相的流速为0.1-1.0mL/h。本发明中，外相与内相可以分别通过液泵（例如蠕动泵）以一定的流速泵入微流控芯片中，便于控制外相与内相的流速。

根据本发明，所述原位在线培养的条件根据微生物菌种的生长特性进行确认，优选地，步骤S3中所述原位在线培养的条件至少包括：温度为28-30℃，时间为2-8天。

根据本发明，优选地，步骤S4中所述微流控分选采用的筛选信号选自荧光、吸光度、拉曼光谱和质谱中的至少一种。本发明提供的高通量筛选微生物的方法可以适用于任意一种微生物菌种的筛选，可以根据筛选的目的设置步骤S4中所述微流控分选的检测信号及参数，例如，筛选的目的是筛得高产某产物的菌株，则所述微流控分选的检测信号可以根据该产物的检测方法确定，示例性地，需要筛选高产赤霉素的菌株，可以将检测赤霉素的荧光、吸光度、拉曼光谱、质谱等信号作为微流控分选的信号检测策略，通过信号比对实现高产赤霉素的菌株筛选。

作为本发明中微流控芯片一种相对优选的具体实施方式，包括玻璃毛细管组件、点样器3、载玻片4和盖玻片，玻璃毛细管组件包括呈两端开口状的外相毛细管1和呈两端开口状的内相毛细管2，内相毛细管2的一端嵌套在外相毛细管1的一端内，使得外相毛细管1与内相毛细管2同轴嵌套连接，外相毛细管1内设置有储液段11，储液段11的内径大于外相毛细管1上其余段的内径，外相毛细管1和内相毛细管2两者的连接处与点样器3的出液端密封连接，以使得点样器3能够向外相毛细管1内输入液体，外相毛细管1上储液段11的两侧和内相毛细管2均通过盖玻片平行地与载玻片4连接并用速干胶固定，内相毛细管2靠近外相毛细管1的一端和外相毛细管1靠近内相毛细管2的一端均呈锥形尖口结构；储液段11的内径为1-5mm，外相毛细管1上其余段的内径为300-800μm，内相毛细管2的内径为100-200μm，外相毛细管1采用经疏水处理的玻璃管，疏水处理的过程包括：在密闭条件下，利用疏水剂对所述外相毛细管进行3-5次蒸镀，其中，疏水剂采用二氯甲烷与三氯十八烷基硅烷的混合液，每次蒸镀的条件包括：温度为60-70℃，时间为1.5-3h，内相毛细管2采用经乙醇清洗后的玻璃管。

相应地，本发明中高通量筛选微生物的方法一种相对优选的具体实施方式，以藤仓赤霉菌为例，采用上述的微流控芯片，包括以下步骤：

S1、采用紫外辐照、等离子体诱变和化学诱变中的至少一种方式诱变藤仓赤霉菌获得藤仓赤霉菌突变体库，将藤仓赤霉菌突变体库菌株置于YPD液体培养基中，在温度为28-30℃下培养得到微生物突变体库菌株的培养液（计算理想生物量以确保后续的菌株单包裹）；

S2、以含有含氟表面活性剂的氟化油（表面活性剂的浓度为2-5wt%）为外相，以微生物突变体库菌株的培养液作为内相；用外相蠕动泵将外相以3-8mL/h的流速从点样器3输入外相毛细管1中，用内相蠕动泵将内相以0.1-1.0mL/h的流速从内相毛细管2远离外相毛细管1的一端输入外相毛细管1中，对微生物突变体库中的菌株进行包埋形成封装单孢子的液滴；

S3、液滴在储液段11中聚集达到一定数量后，停止将外相和内相输入外相毛细管1内，将点样器3和内相毛细管2的进液口、外相毛细管1的出液口封闭，使得液滴在储液段11中进行原位培养（温度为28-30℃下培养2-8天）；

S4、对原位培养后的液滴进选用合适的信号检测策略（荧光、吸光度、拉曼光谱和质谱中的至少一种）实现高产赤霉素的菌株筛选。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，荧光信号采用复享光学FX2000光纤光谱仪检测，液滴的粒径通过光镜镜检测量方法测得；藤仓赤霉菌购自上海抚生实业有限公司、编号为FS-J5114，Pico-Surfin FC40购自世联博研（北京）科技有限公司、编号为C012，氟化油（电子氟化液）购自深圳市华美亚科技有限公司、编号为KEY-128，在没有特殊说明的情况下，其他原料及试剂均为常规的市售品。

以下实施例中，在没有特殊说明的情况下，室温为25±2℃；

YPD液体培养基的配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L和酵母膏10g/L。

实施例1微流控芯片的制备

玻璃管的处理：准备两根规格不一致的两端开口的玻璃圆管，一根内径约为580μm，另一根内径约为1.5mm，使用乙炔喷灯将其中较小内径的圆管的一端拉制成锥形尖口状，在显微镜下测量，利用金刚石玻璃刻刀切割成内径约为150μm，将其置于无水乙醇中，超声条件下反复清洗，再将酒精吹干，即可获得尖端平整、内壁干净无杂质残留的玻璃管作为内相毛细管2；另一根内径较大的圆管使用类似方式，对其两端进行拉制，形成“中间粗两端细”的结构，随后切割清洗，控制锥形尖口的内径约为500μm，中间的储液段11内径约为1.5mm，采用蒸镀疏水方法进行疏水处理（将二氯甲烷和三氯十八烷基硅烷（OTS）按体积比100:1的比例混合配成疏水剂，将该玻璃管和疏水剂共同放置在密闭容器中，随后置于65℃左右的烘箱中2h，重复此操作4次），即可获得内壁干净且疏水的玻璃管，作为外相毛细管1；

内外相玻璃管的共轴嵌套组装：首先将上述外相毛细管1置于载玻片4上合适的位置，然后将内相毛细管2呈锥形尖口状的一端插入外相毛细管1呈锥形尖口状的一端中，使内相毛细管2的尖端深入外相毛细管1的内部但不要将外相毛细管1的端口完全堵塞；然后在显微镜下对外相毛细管1和内相毛细管2两管的相对位置进行调整，使两者的轴线相互重合呈现共轴的排列模式，利用速干胶将两者固定，并将外相毛细管1上储液段11的两侧和内相毛细管2均通过盖玻片平行地与载玻片4连接并用速干胶固定，最后在外相毛细管1与内相毛细管2的接口处用速干胶安装点样针头作为点样器3，使得外相毛细管1和内相毛细管2两者的连接处与点样器3的出液端密封连接，得到微流控芯片。

实施例1制得的微流控芯片能够用于液滴高通量筛选，该微流控芯片可以作为藤仓赤霉菌长期培养的介质，且该微流控芯片中各部分是密封连接的，外相中的氟化油不易挥发，能够减少液滴转移过程中的不稳定因素。

实施例2

为了更好的改善微流控芯片，探索了不同形态的收集通道（外相毛细管1与内相毛细管2连接的一端形状）对液滴生成的影响。按照实施例1的方法制备微流控芯片，不同的是，制备了两种不同的外相毛细管1的端口形状，一种为锥形尖口状（如图2所示），另一种为平口状（如图3所示），控制两种微流控芯片的外相毛细管1管口内径约为500μm（储液段11以外的部分），内相毛细管2管口内径约为150μm，控制内相的流速为0.8mL/h，设定外相的流速分别为：3mL/h、4mL/h、5mL/h、6mL/h、7mL/h、8mL/h，发现随着流体流量的增大，外相毛细管1与内相毛细管2连接的一端呈锥形尖口状时，通道中形成的液滴直径小，且液滴生成频率大；外相毛细管1与内相毛细管2连接的一端呈平口状时，通道中形成的液滴直径大，且液滴生成频率小。控制外相的流速为4mL/h，设定内相的流速分别为：0.1mL/h、0.2mL/h、0.3mL/h、0.4mL/h、0.5mL/h、0.6mL/h、0.7mL/h、0.8mL/h、0.9mL/h、1.0mL/h，其他参数条件不变，发现结果不变，仍是外相毛细管1与内相毛细管2连接的一端呈锥形尖口状时，通道中形成的液滴直径小，且液滴生成频率大；外相毛细管1与内相毛细管2连接的一端呈平口状时，通道中形成的液滴直径大，且液滴生成频率小。因此，外相毛细管1与内相毛细管2连接的一端呈锥形尖口状时，形成的液滴效果好。

外相毛细管1与内相毛细管2连接的一端是收集通道的通道口，作为制备液滴的颈缩区域，在收集液滴的同时，更重要的是起到对流体的聚焦作用；相对于没有收集通道的玻璃毛细管芯片，颈缩区域的存在，使得连续相流体的通过面积减小，流速突然增大，进而影响液滴在破裂过程中受到的剪切应力，且在液滴通过外相毛细管1的端口处后，不同形态的通道壁面会对液滴受到的作用力产生不同的影响，锥形的收集通道对流体的剪切作用大，其中的液滴直径小，而液滴的生成频率与通道形态没有直接的作用关系，但单个液滴体积减小，形成需要的时间减少，因此相对应地，液滴生成频率更大。

基于此，外相毛细管1与内相毛细管2连接的一端设计为锥形尖口状，将外相的流速设置为5mL/h，内相的流速设置为0.1mL/h，控制液滴的粒径在150-170μm之间。

实施例3

S1、菌株培养：将藤仓赤霉菌于YPD液体培养基中培养48h后，取OD₆₀₀=0.6的菌液进行常压室温等离子体（ARTP）诱变，具体地，将菌液与5%甘油溶液混合，取10μL涂布在铁片上，设置ARTP诱变仪功率为120W，气流为10SLM，诱变40s，诱变结束后，将诱变后的突变菌株接种至YPD液体培养基中，在温度为29℃下培养10h得到藤仓赤霉菌突变体库菌株的培养液；

S2、选择添加Pico-Surfin FC40的氟化油（氟化油中Pico-Surfin FC40的含量为2wt%）作为外相，将步骤S1得到的培养液作为内相；采用实施例1制得的微流控芯片，保持微流控芯片处于40℃恒温条件下，用注射器分别吸取内相、外相各1mL，外相的注射器安装在外相蠕动泵上，并通过聚乙烯管与点样器3连接，将外相以5mL/h的流速从点样器3输入外相毛细管1中，内相的注射器安装在内相蠕动泵上，并通过聚乙烯管与内相毛细管2远离外相毛细管1的一端连接，将内相以0.1mL/h的流速从内相毛细管2输入外相毛细管1中，在外相毛细管1内，当外相与内相的流体相遇时，由于剪切力和表面张力的共同作用，内相流体被拉伸并最终断裂形成单分散性乳液液滴；

S3、生成的液滴放置在外相毛细管1的储液段11内聚集一定的数量后，停止内相与外相的输入，将整个微流控芯片与外界空气连通部分（包括点样器3和内相毛细管2的进液口、外相毛细管1的出液口）用PE管和夹子堵塞，在温度为29℃下进行静置培养7天；

S4、将微流控芯片安装在微流控分选装置上，将含有微球的培养液泵入微流控分选装置对应的入口，将激光对准分选装置的检测点，并采集每个液滴的荧光信号，针对荧光信号强度最高的液滴进行加电压分选，使其流入收集通道；

筛选出信号强度较高的一个或几个液滴，分别进行摇瓶发酵筛选出赤霉素高产菌株，筛选出的赤霉素高产菌株中赤霉素的产量最高为2.3 g/L，比出发菌株提高62%。

实施例4

按照实施例3的方法进行藤仓赤霉菌高产赤霉素的高通量筛选，不同的是，将步骤S2中采用的微流控芯片替换为：采用实施例1的方法制得，外相毛细管1的储液段11内径约为5mm、其余段的内径约为800μm，内相毛细管2的内径约为200μm。

筛选出信号强度较高的一个或几个液滴，分别进行摇瓶发酵筛选出赤霉素高产菌株，筛选出的赤霉素高产菌株中赤霉素的产量最高为3.7g/L，比出发菌株提高159.8%。

实施例5

按照实施例3的方法进行藤仓赤霉菌高产赤霉素的高通量筛选，不同的是，将步骤S2中采用的微流控芯片替换为：采用实施例1的方法制得，外相毛细管1的储液段11内径约为3mm、其余段的内径约为600μm，内相毛细管2的内径约为200μm。

筛选出信号强度较高的一个或几个液滴，分别进行摇瓶发酵筛选出赤霉素高产菌株，筛选出的赤霉素高产菌株中赤霉素的产量最高为3.1g/L，比出发菌株提高117.7%。

对比例1

（1）将藤仓赤霉菌于YPD液体培养基中培养48h后，取OD₆₀₀=0.6的菌液进行常压室温等离子体（ARTP）诱变40s，将诱变后的突变菌株接种至YPD液体培养基中，在温度为29℃下培养10h得到藤仓赤霉菌突变体库菌株的培养液；组装水包油O/W单乳液微流控芯片：利用乙炔喷灯拉制两种不同尺寸的玻璃毛细管作为外相毛细管1和内相毛细管2，内相毛细管2的内径约为150μm，整个外相毛细管1的内径约为580μm，将内相毛细管2的一端同轴嵌套在外相毛细管1的一端内，外相毛细管1采用速干胶固定在载玻片4上，外相毛细管1与内相毛细管2的连接处与点样器3密封连接，形成微流控芯片；

（2）选择添加Pico-Surfin FC40的氟化油（氟化油中Pico-Surfin FC40的含量为3wt%）作为外相，将步骤（1）得到的培养液作为内相；用注射器分别吸取内相、外相各1mL，外相的注射器安装在外相蠕动泵上，并通过聚乙烯管与点样器3连接，将外相以4mL/h的流速从点样器3输入外相毛细管1中，内相的注射器安装在内相蠕动泵上，并通过聚乙烯管与内相毛细管2远离外相毛细管1的一端连接，将内相以0.4mL/h的流速从内相毛细管2输入外相毛细管1中，对藤仓赤霉菌突变体库中的菌株进行包埋形成封装单孢子的液滴；

（3）将步骤（2）中的液滴收集于盛有过量上述外相的玻璃瓶中，随后在温度为29℃下静置培养7天，将含有液滴的培养液（培养液中的液滴如图5所示）泵入微流控分选装置对应的入口，将激光对准分选装置的检测点，并采集每个液滴的荧光信号，针对荧光信号强度最高的液滴进行加电压分选，使其流入收集通道。

经观察发现，采用不存在储液段的微流控芯片，在液滴转移过程中容易出现液滴破裂的情况，对后续精确分选产生极大的影响；筛选出信号强度较高的一个或几个液滴，分别进行摇瓶发酵筛选出赤霉素高产菌株，筛选出的赤霉素高产菌株中赤霉素的产量最高为1.9g/L，比出发菌株提高33.4%。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种集成液滴在线培养和高通量筛选功能的微流控芯片，其特征在于，包括玻璃毛细管组件和点样器（3），所述玻璃毛细管组件包括呈两端开口状的外相毛细管（1）和呈两端开口状的内相毛细管（2），所述内相毛细管（2）的一端嵌套在所述外相毛细管（1）的一端内，所述外相毛细管（1）内设置有储液段（11），所述储液段（11）的内径大于所述外相毛细管（1）上其余段的内径，所述外相毛细管（1）和所述内相毛细管（2）两者的连接处与所述点样器（3）的出液端密封连接，以使得所述点样器（3）能够向所述外相毛细管（1）内输入液体。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片还包括载玻片（4），所述外相毛细管（1）固定在所述载玻片（4）上。

3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述外相毛细管（1）上所述储液段（11）的两侧和/或所述内相毛细管（2）通过调节件与所述载玻片（4）连接，以使得所述外相毛细管（1）和所述内相毛细管（2）两者均与所述载玻片（4）平行；

所述调节件为盖玻片或者海绵片。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述外相毛细管（1）与所述内相毛细管（2）为同轴嵌套连接。

5.根据权利要求1至3中任意一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述内相毛细管（2）靠近所述外相毛细管（1）的一端以及所述外相毛细管（1）的两端中的至少一者呈锥形尖口结构。

6.根据权利要求1至3中任意一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述储液段（11）的内径为1-5mm，所述外相毛细管（1）上其余段的内径为300-800μm；所述内相毛细管（2）的内径为100-200μm。

7.根据权利要求1至3中任意一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述外相毛细管（1）采用经疏水处理的玻璃管，所述疏水处理的过程包括：在密闭条件下，利用疏水剂对所述外相毛细管（1）进行3-5次蒸镀，其中，所述疏水剂采用二氯甲烷与三氯十八烷基硅烷的混合液，每次所述蒸镀的条件包括：温度为60-70℃，时间为1.5-3h；

所述内相毛细管（2）采用经乙醇清洗后的玻璃管。

8.权利要求1至7中任意一项所述的微流控芯片在液滴原位在线培养和/或高通量筛选微生物中的应用。

9.一种高通量筛选微生物的方法，其特征在于，采用权利要求1至7中任意一项所述的微流控芯片，包括以下步骤：

S1、建立微生物突变体库；

S2、将含有表面活性剂的氟化油作为外相从所述点样器（3）输入所述外相毛细管（1）内，将所述微生物突变体库菌株的培养液作为内相从所述内相毛细管（2）远离所述外相毛细管（1）的一端输入并经该内相毛细管（2）输入所述外相毛细管（1）内，以对所述微生物突变体库中的菌株进行包埋形成液滴；

S3、所述液滴在所述储液段（11）中聚集后，停止将所述外相和所述内相输入所述外相毛细管（1）内，将所述点样器（3）和所述内相毛细管（2）的进液口、所述外相毛细管（1）的出液口封闭，使得所述液滴在所述储液段（11）中进行原位在线培养；

S4、对所述原位在线培养后的液滴进行微流控分选。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述微生物为藤仓赤霉菌；

步骤S2中所述表面活性剂为Pico-Surfin FC40、FS-Kryjeff D900、EA表面活性剂和FS-008中的至少一种；

所述微生物突变体库菌株的培养液通过将所述微生物突变体库菌株进行液体培养得到；

所述外相的流速为3-8mL/h，所述内相的流速为0.1-1.0mL/h；

步骤S3中所述原位在线培养的条件至少包括：温度为28-30℃，时间为2-8天；

步骤S4中所述微流控分选采用的筛选信号选自荧光、吸光度、拉曼光谱和质谱中的至少一种。

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