CN110586210B - 一种用于凝胶3d细胞培养的浓度梯度发生装置、制备及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置，包括多级混合及浓度梯度生成模块，以及多级浓度梯度范围的凝胶腔室，可同时载入多个凝胶样品，并通过分段式浓度梯度的施加，同时进行各个不同浓度梯度范围内的凝胶内细胞行为的检测和评估；多级浓度梯度范围的设立，能够在同一块流体芯片上同时检测处于不同浓度跨度的样品；本发明提供的流体芯片具有体积小，成本少，与微量凝胶集成性能好等优点，在体外组织再造、细胞生理学、病理学及药物筛选，生物医学和环境监测等方面具有广阔应用前景；同时，本发明还公开了其制备方法及应用方法。

Description

一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置、制备及应用 方法

技术领域

本发明属于微型分析仪器技术领域，具体涉及一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置、制备及应用方法。

背景技术

随着微机电系统的发展，分析仪器，化学仪器，医疗器械也更倾向于微型化，自动化，集成化和便携化。浓度梯度发生装置通常是用于细胞生物学研究的一种在微尺度上产生分子浓度梯度并将其加载与细胞或细胞群体之上的一种微型器械。在人体内，生物分子的浓度梯度控制诸多基本的细胞功能，例如发育，免疫反应，伤口愈合，胚胎发生和癌转移等。生物过程依靠生物分子梯度来增加和调节细胞信号通路。为了了解化学刺激对细胞信号传导通路的影响，生物学家们寻求能够在体外模拟体内细胞微环境的方法。近些年在细胞信号传导分析领域，有通过使用琼脂糖/培养皿和微量吸引器在单细胞水平上体外重建了生物分子的浓度梯度。

微流控芯片技术在细胞分析领域中发挥着十分强大的作用，其中为了研究生化浓度梯度对细胞功能的影响，各种各样的微流控浓度梯度芯片(即微流控浓度梯度发生器)被开发及应用。与以毫米(mm)至厘米(cm)为特征长度的非微流控平台相比，微流控浓度梯度芯片可以提供更高的浓度梯度分辨率，并提供较好控制的流体动力学和质量传输条件。微流控浓度梯度芯片通过亚微米至微米大小的通道网络对微量试剂(体积通常为纳升或微升)进行传输及其它处理，并且随着微加工技术的进步，通道几何形状持续微型化。通道尺寸的微型化直接减少了特定浓度剂量输送到细胞所需的时间，达到了生理意义上的时间尺度。由此而来，微流控浓度梯度芯片中通道尺寸及时间尺度上的强大优势直接实现了对浓度梯度的精确控制。

根据梯度形成原理可将微流体浓度梯度装置分为两大类：(1)基于动态流动的浓度梯度芯片(Flow-based concentration gradient device)；(2)基于静态扩散的浓度梯度梯度芯片(Diffusion-based concentration gradient device)。区分这两者的重要特征就是判断在形成梯度的区域上是否存在流体流动。基于动态流动的浓度梯度发生器正是通过利用层流间物质的扩散传递产生浓度梯度，在不同入口处引入由不同化学物质或浓度组成的流体，当溶质随着流体沿微通道向下流动时，溶质在液流间的界面上发生扩散传递，因而产生浓度梯度。最常见的基于动态流动的浓度梯度芯片有T型、Y型和“圣诞树”型等。除了上述基于动态流动的浓度梯度芯片，还有静态扩散梯度芯片，其通过克服对流剪切力的影响，在静态稳定的无液体流动的环境下生成分子浓度梯度。目前减小或消除对流，创建静态无流动环境的方式通常是设计具有高液阻的窄细通道，使用多孔膜和半渗透膜，或者胶原和琼脂糖等水凝胶物质。这些障碍物提供了对抗流体对流的物理屏障并且巧妙地隔离出源区(source)和汇区(sink)，在两者之间形成浓度梯度区域。因为分子的传输主要是通过扩散进行的，所以浓度梯度随着时间的推移而发展生成，直到在流入和流出传输平衡时达到稳定状态。例如，利用窄细通克服流体剪切力的静态扩散浓度梯度芯片，以及基于膜/凝胶扩散的浓度梯度芯片等。

基于静态扩散的梯度芯片原理明确，能有效地减小或消除了梯度形成区域的对流，免除了细胞受对流所产生的剪切力的不利影响，更加真实地模拟了细胞存在的生理环境，所得的相关实验结果也更为准确可靠。

目前，现有技术中的芯片是面向2D细胞样品，在芯片上的浓度梯度区域载入凝胶时，需要从外部通过片上的微流道注射凝胶至指定区域。而在注入凝胶的同时会导致凝胶提前固化残留于微流道，或者导致凝胶样品受到的分子浓度梯度范围较为单一；而且存在单次只能测试一个凝胶样品的问题；同时，由于分子扩散完全是自发性，导致生成的梯度不易定量和进行动态变换，也较难在同一流体芯片上形成具有多种分子浓度梯度范围的外部分子加载形式。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种具有微型化、集成溶液预混合、分段式凝胶内分子浓度梯度生成功能，以及不同浓度梯度值域的并行测试功能的用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置，同时还提供该装置的分析设备及操作方法。

本发明解决其技术问题是通过以下技术方案实现的：

一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置，包括上基板、下基板、第一级混合及浓度梯度生成模块、第二级混合及浓度梯度生成模块组、第三级混合及浓度梯度生成模块，所述第二级混合及浓度梯度生成模块组包括若干个依次相连，且微流道数量依次增加1的第二级混合及浓度梯度生成模块，所述第一级混合及浓度梯度生成模块的进口端设有高浓度分子溶液的进口和低浓度分子溶液的进口，出口端与微流道数量最少的第二级混合及浓度梯度生成模块的进口端连接，所述微流道数量最多的第二级混合及浓度梯度生成模块的出口端与第三级混合及浓度梯度生成模块的进口端连接，所述第三级混合及浓度梯度生成模块的微流道之间均设有一个第一浓度梯度范围的凝胶腔室且每个微流道的出口端均设有一个第一级流体出口，所述第一浓度梯度范围的凝胶腔室两端均通过窄通道阵列与两侧的第三级混合及浓度梯度生成模块的微流道连接，最两端的第一级流体出口延伸出连接至第三浓度梯度范围的凝胶腔室的微流道，且最两端的第一级流体出口延伸出的微流道之间设有第二浓度梯度范围的凝胶腔室，最中间的第一级流体出口延伸出的微流道末端设有第二级流体出口，所述第二浓度梯度范围的凝胶腔室均通过窄通道阵列与最中间的第一级流体出口延伸出的微流道，以及同侧的与最两端的第一级流体出口延伸出的微流道连接，所述第三浓度梯度范围的凝胶腔室设有第三流体出口；

所述第一级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量≥3，所述微流道数量最少的第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量≥4，所述微流道数量最多的第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量＝第三级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量-1；

所述第一级混合及浓度梯度生成模块、第二级混合及浓度梯度生成模块组和第三级混合及浓度梯度生成模块位于上基板的下表面，所述上基板和下基板通过键合紧密连接，实现浓度梯度发生装置的密封。

进一步的，所述第一级混合及浓度梯度生成模块的微流道包括高浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道、混合后液体流速阻尼平衡弯曲微流道和低浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道，所述高浓度分子溶液的进口与高浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道连接，所述低浓度分子溶液的进口与低浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道连接，所述混合后液体流速阻尼平衡弯曲微流道通微流道分别与高浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道和低浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道连接；

所述第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道与第一级混合及浓度梯度生成模块的微流道、相邻两个第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道以及第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道与第三级混合及浓度梯度生成模块的微流道均交错排列。

进一步的，所述第二级混合及浓度梯度生成模块组包含1-3个第二级混合及浓度梯度生成模块。

进一步的，所述高浓度分子溶液的进口、低浓度分子溶液的进口、第一级流体出口、第二级流体出口、第三级流体出口和微流道结构深度相同且底部在同一水平面。

进一步的，所述的窄通道阵列的通道方向均与第一浓度梯度范围的凝胶腔室、第二浓度梯度范围的凝胶腔室、第三浓度梯度范围的凝胶腔室垂直。

进一步的，所述第一浓度梯度范围的凝胶腔室、第二浓度梯度范围的凝胶腔室和第三浓度梯度范围的凝胶腔室内充满水凝胶，所述第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道与第三级混合及浓度梯度生成模块的微流道均为液体流速阻尼平衡弯曲流道，所述液体流速阻尼平衡弯曲流道的弯曲的圈数为1～6圈。

进一步的，所述上基板采用聚二甲基硅氧烷、聚四氟乙烯材料或者有机玻璃，所述下基板采用玻璃或者有机玻璃。

一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置的制备方法，包括以下步骤：

S1、制作所述用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置的SU-8模具；

S2、将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂在真空干燥箱按照10：1的质量配比混合均匀，并除净气泡，得到聚二甲基硅氧烷聚合物，将所述聚二甲基硅氧烷聚合物倒在所述步骤S1中制作好的SU-8模具上，再放置于水平的热板上进行固化，固化时间为30分钟，固化温度为85℃，然后将所述聚二甲基硅氧烷聚合物从SU-8模具中脱模，得到初聚二甲基硅氧烷微流体浓度梯度装置；

S3、取聚二甲基硅氧烷预聚体和薄片玻璃，通过氧等离子体氧化处理将所述垫板直接与所述步骤S2中的初聚二甲基硅氧烷微流体浓度梯度装置结合，完成键合，并完成进口和出口的打孔，得到用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置。

一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置的应用方法，包括以下步骤：

S4、用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置上的出口连接阻尼微阀和细软管，并最终与与外界的废液池连接；

S5、向所述浓度梯度发生装置的第一浓度梯度范围的凝胶腔室、第二浓度梯度范围的凝胶腔室和第三浓度梯度范围的凝胶腔室内直接载入凝胶样品，或者将凝胶的前体溶液和交联剂于敞口的第一浓度梯度范围的凝胶腔室、第二浓度梯度范围的凝胶腔室和第三浓度梯度范围的凝胶腔室中混合，进而实现凝胶的原位交联成型；

S6、将最高浓度分子溶液从高浓度分子溶液的进口注入，将最低浓度分子溶液从低浓度分子溶液的进口注入，通过调节若干出口连接管路上的阻尼微阀，使得混合后具有不同分子浓度的流体实现同步流动；

S7、通过显微镜观测片上凝胶样品内细胞行为，包括细胞的伸展和迁移。

本发明的有益效果为：

(1)本发明中的浓度梯度生成装置集成了多级混合及浓度梯度生成模块，以及多级浓度梯度范围的凝胶腔室，可同时载入多个凝胶样品，并通过分段式浓度梯度的施加，进行各个不同浓度梯度范围内的凝胶内细胞行为的检测和评估。

(2)多级浓度梯度范围的设立，能够在同一块流体芯片上同时检测处于不同浓度跨度的样品。本发明提供的流体芯片具有体积小，成本少，耗能低，分析速度快等优点。

(3)微流道采用液体流速阻尼平衡弯曲流道，增大了整个流道的黏滞阻力，使得流体的流动波动降低，维持了平稳的浓度梯度的生成过程。

(3)在药物筛选，生物医学和环境监测，分析系统，化学等方面展现出了广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例的主要结构示意图；

图2为本发明实施例的芯片封装后的剖面示意图；

图3为本发明实施例的第一、二、三级混合及浓度梯度生成模块的局部放大图；

图4为本发明实施例的第一、二、三级浓度梯度范围的凝胶腔室的局部放大图；

图5为本发明实施例中与第一级流体出口对应连接的阻尼微阀的侧视剖面图。

附图标记说明：

01、高浓度分子溶液的进口；02、低浓度分子溶液的进口；1、第一级混合及浓度梯度生成模块；2、第二级混合及浓度梯度生成模块组；3、第三级混合及浓度梯度生成模块；4、窄通道阵列；41-44、第一浓度梯度范围的凝胶腔室；51-52、第二浓度梯度范围的凝胶腔室；61、第三浓度梯度范围的凝胶腔室中心腔体；401-405、第一级流体出口；501、第二级流体出口；601、第三级流体出口；71、上基板；72、下基板；11、微流体预混合流道区域；121、高浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲流道；122、混合后液体流速阻尼平衡弯曲流道；123、低浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲流道；124、流速阻尼平衡弯曲流道；4011-4015、与第一级流体出口对应连接的阻尼微阀。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

此外，术语“水平”、“竖直”、“悬垂”等术语并不表示要求部件绝对水平或悬垂，而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相对“竖直”而言更加水平，并不是表示该结构一定要完全水平，而是可以稍微倾斜。

在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

实施例

一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置，包括上基板71、下基板72、第一级混合及浓度梯度生成模块1、第二级混合及浓度梯度生成模块组2、第三级混合及浓度梯度生成模块3，第二级混合及浓度梯度生成模块组2包括若干个依次相连，且微流道数量依次增加1的第二级混合及浓度梯度生成模块，第一级混合及浓度梯度生成模块1的进口端设有高浓度分子溶液的进口01和低浓度分子溶液的进口02，出口端与微流道数量最少的第二级混合及浓度梯度生成模块的进口端连接，微流道数量最多的第二级混合及浓度梯度生成模块的出口端与第三级混合及浓度梯度生成模块3的进口端连接，第三级混合及浓度梯度生成模块3的微流道之间均设有一个第一浓度梯度范围的凝胶腔室且每个微流道的出口端均设有一个第一级流体出口，第一浓度梯度范围的凝胶腔室两端均通过窄通道阵列4与两侧的第三级混合及浓度梯度生成模块3的微流道连接，最两端的第一级流体出口延伸出连接至第三浓度梯度范围的凝胶腔室的微流道，且最两端的第一级流体出口延伸出的微流道之间设有第二浓度梯度范围的凝胶腔室，最中间的第一级流体出口延伸出的微流道末端设有第二级流体出口，第二浓度梯度范围的凝胶腔室均通过窄通道阵列4与最中间的第一级流体出口延伸出的微流道，以及同侧的与最两端的第一级流体出口延伸出的微流道连接，第三浓度梯度范围的凝胶腔室设有第三流体出口；第三级流体出口只有一个。

第一级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量≥3，微流道数量最少的第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量≥4，微流道数量最多的第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量＝第三级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量-1；

上基板71和下基板72通过键合紧密连接，实现浓度梯度发生装置的密封。

如图1-4所示，本实施例中，第一级混合及浓度梯度生成模块1的微流道数量＝3，第二级混合及浓度梯度生成模块组2仅包括一个第二级混合及浓度梯度生成模块，且其微流道数量＝4，第三级混合及浓度梯度生成模块3的微流道数量为5。

第一级混合及浓度梯度生成模块1包括微流体预混合流道区域11、高浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲流道121、混合后液体流速阻尼平衡弯曲流道122、低浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲流道123。

所有的液体流速阻尼平衡弯曲流道均一端与上游的直流道相连，另一端与混合区域流道或者最高浓度分子溶液流道或者最低浓度分子溶液流道相连接。所述高浓度分子溶液的进口01、低浓度分子溶液的进口02、第一级流体出口401-405、第二级流体出口501、第三级流体出口601和微流道结构深度相同且底部在同一水平面。第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道与第一级混合及浓度梯度生成模块1的微流道、相邻两个第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道以及第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道与第三级混合及浓度梯度生成模块3的微流道均交错排列。

窄通道阵列4的通道方向与凝胶腔室的一边垂直、且分布在凝胶腔室的两侧，窄通道阵列4设置于所有的凝胶腔室。第一级流体出口401-405设置在第一浓度梯度范围的凝胶腔室41-44两侧流道的下游，第二级流体出口501设置在第二浓度梯度范围的凝胶腔室51-52之间，第三级流体出口601设置在第三浓度梯度范围的凝胶腔室61两侧流道的下游。

一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置的制备及工作方法，包括以下步骤：

S1、制作所述用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置的SU-8模具；

S2、将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂在真空干燥箱按照10：1的质量配比混合均匀，并除净气泡，得到聚二甲基硅氧烷聚合物，将所述聚二甲基硅氧烷聚合物倒在所述步骤S1中制作好的SU-8模具上，再放置于水平的热板上进行固化，固化时间为30分钟，固化温度为85℃，然后将所述聚二甲基硅氧烷聚合物从SU-8模具中脱模，得到初聚二甲基硅氧烷微流体浓度梯度装置；

S3、取聚二甲基硅氧烷预聚体和薄片玻璃，通过氧等离子体氧化处理将所述垫板直接与所述步骤S2中的初聚二甲基硅氧烷微流体浓度梯度装置结合，完成键合，并完成进口和出口的打孔，得到用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置。

一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

S4、用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置上的出口连接阻尼微阀和细软管，并最终与与外界的废液池连接；

S5、向所述浓度梯度发生装置的第一浓度梯度范围的凝胶腔室41-44、第二浓度梯度范围的凝胶腔室51-52和第三浓度梯度范围的凝胶腔室内直接载入凝胶样品，或者将凝胶的前体溶液和交联剂于敞口的第一浓度梯度范围的凝胶腔室41-44、第二浓度梯度范围的凝胶腔室51-52和第三浓度梯度范围的凝胶腔室中混合，进而实现凝胶的原位交联成型；

S6、将最高浓度分子溶液从高浓度分子溶液的进口01注入，将最低浓度分子溶液从低浓度分子溶液的进口02注入，通过调节若干出口连接管路上的阻尼微阀，使得混合后具有不同分子浓度的流体实现同步流动；

S7、通过显微镜观测片上凝胶样品内细胞行为，包括细胞的伸展和迁移。

如图5所示，上述的阻尼微阀4011-4015是外部的微型流体阻尼阀，用以控制和调节出口液体的流量。阻尼微阀4011-4015与第一级流体出口401-405一一对应连接。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置，其特征在于，包括上基板、下基板、第一级混合及浓度梯度生成模块、第二级混合及浓度梯度生成模块组、第三级混合及浓度梯度生成模块，所述第二级混合及浓度梯度生成模块组包括若干个依次相连，且微流道数量依次增加1的第二级混合及浓度梯度生成模块，所述第一级混合及浓度梯度生成模块的进口端设有高浓度分子溶液的进口和低浓度分子溶液的进口，出口端与微流道数量最少的第二级混合及浓度梯度生成模块的进口端连接，所述微流道数量最多的第二级混合及浓度梯度生成模块的出口端与第三级混合及浓度梯度生成模块的进口端连接，所述第三级混合及浓度梯度生成模块的微流道之间均设有一个第一浓度梯度范围的凝胶腔室且每个微流道的出口端均设有一个第一级流体出口，所述第一浓度梯度范围的凝胶腔室两端均通过窄通道阵列与两侧的第三级混合及浓度梯度生成模块的微流道连接，最两端的第一级流体出口延伸出连接至第三浓度梯度范围的凝胶腔室的微流道，且最两端的第一级流体出口延伸出的微流道之间设有第二浓度梯度范围的凝胶腔室，最中间的第一级流体出口延伸出的微流道末端设有第二级流体出口，所述第二浓度梯度范围的凝胶腔室内侧通过窄通道阵列与最中间的第一级流体出口延伸出的微流道连接，外侧通过窄通道阵列与最两端的第一级流体出口延伸出的微流道连接，所述第三浓度梯度范围的凝胶腔室设有第三流体出口；

所述第一级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量≥3，所述微流道数量最少的第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量≥4，所述微流道数量最多的第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量＝第三级混合及浓度梯度生成模块的微流道数量-1；

所述第一级混合及浓度梯度生成模块、第二级混合及浓度梯度生成模块组和第三级混合及浓度梯度生成模块位于上基板的下表面，所述上基板和下基板通过键合紧密连接，实现浓度梯度发生装置的密封。

2.根据权利要求1所述的一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置，其特征在于，所述第一级混合及浓度梯度生成模块的微流道包括高浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道、混合后液体流速阻尼平衡弯曲微流道和低浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道，所述高浓度分子溶液的进口与高浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道连接，所述低浓度分子溶液的进口与低浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道连接，所述混合后液体流速阻尼平衡弯曲微流道分别与高浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道、低浓度分子溶液流速阻尼平衡弯曲微流道连接；

所述第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道与第一级混合及浓度梯度生成模块的微流道、相邻两个第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道以及第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道与第三级混合及浓度梯度生成模块的微流道均交错排列。

3.根据权利要求1所述的一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置，其特征在于，所述第二级混合及浓度梯度生成模块组包含1-3个第二级混合及浓度梯度生成模块。

4.根据权利要求1所述的一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置，其特征在于，所述高浓度分子溶液的进口、低浓度分子溶液的进口、第一级流体出口、第二级流体出口、第三级流体出口和微流道结构深度相同且底部在同一水平面。

5.根据权利要求1所述的一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置，其特征在于，所述的窄通道阵列的通道方向均与第一浓度梯度范围的凝胶腔室、第二浓度梯度范围的凝胶腔室、第三浓度梯度范围的凝胶腔室垂直。

6.根据权利要求2所述的一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置，其特征在于，所述第一浓度梯度范围的凝胶腔室、第二浓度梯度范围的凝胶腔室和第三浓度梯度范围的凝胶腔室内充满水凝胶，所述第二级混合及浓度梯度生成模块的微流道与第三级混合及浓度梯度生成模块的微流道均为液体流速阻尼平衡弯曲流道，所述液体流速阻尼平衡弯曲流道的弯曲的圈数为1～6圈。

7.根据权利要求1所述的一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置，其特征在于，所述上基板采用聚二甲基硅氧烷、聚四氟乙烯材料或者有机玻璃，所述下基板采用玻璃或者有机玻璃。

8.基于权利要求1所述的一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制作所述用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置的SU-8模具；

S2、将聚二甲基硅氧烷单体与固化剂在真空干燥箱按照10：1的质量配比混合均匀，并除净气泡，得到聚二甲基硅氧烷聚合物，将所述聚二甲基硅氧烷聚合物倒在所述步骤S1中制作好的SU-8模具上，再放置于水平的热板上进行固化，固化时间为30分钟，固化温度为85℃，然后将所述聚二甲基硅氧烷聚合物从SU-8模具中脱模，得到初聚二甲基硅氧烷微流体浓度梯度装置；

S3、取薄片玻璃，通过氧等离子体氧化处理，直接与所述步骤S2中的初聚二甲基硅氧烷微流体浓度梯度装置结合，完成键合，并完成进口和出口的打孔，得到用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置。

9.基于权利要求1所述的一种用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

S4、用于凝胶3D细胞培养的浓度梯度发生装置上的第一级流体出口、第二级流体出口、第三级流体出口根据需要连接阻尼微阀和细软管，且至少保证其中有一个出口与外界的废液池连接；

S5、向所述浓度梯度发生装置的第一浓度梯度范围的凝胶腔室、第二浓度梯度范围的凝胶腔室和第三浓度梯度范围的凝胶腔室内直接载入凝胶样品，或者将凝胶的前体溶液和交联剂于敞口的第一浓度梯度范围的凝胶腔室、第二浓度梯度范围的凝胶腔室和第三浓度梯度范围的凝胶腔室中混合，进而实现凝胶的原位交联成型；

S6、将最高浓度分子溶液从高浓度分子溶液的进口注入，将最低浓度分子溶液从低浓度分子溶液的进口注入，通过调节所述阻尼微阀，使得混合后具有不同分子浓度的流体实现同步流动；

S7、通过显微镜观测片上凝胶样品内细胞行为，包括细胞的伸展和迁移。

Images