CN111235029B - 一种多功能微流控芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种多功能微流控芯片，从上至下依次设置有微阀控制通道层、流体通道层和玻璃基底层；所述微阀控制通道层与流体通道层通过PDMS热键合构成流体通道单元，所述流体通道单元与玻璃基底层通过等离子键合成一体。芯片整体的三大功能结构单元分别用于单细胞液滴生成、细胞培养及钙离子灌注或药物干预，细胞培养区分为结构相同的细胞培养池。通过控制阀的开闭，实现对微流体的灵活操控，独立的辅助流体灌注单元，避免了提前凝胶化、凝胶堵塞通道及钙离子分布不均等问题，同时液滴凝胶化提高了液滴的稳定性。该芯片能够同时实现单细胞液滴生成、三维培养及抗肿瘤药物筛选三种功能。

Description

一种多功能微流控芯片及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于细胞生物学及微流控技术领域，具体涉及一种用于单细胞液滴生成、三维培养及抗肿瘤药物筛选的微流控芯片。
背景技术
药物筛选是抗肿瘤新药研究的最初过程和关键步骤，然而新药研发具有成本高，周期长，过程复杂，成功率低等不足，一直制约着现代药物的筛选和开发。现阶段以96孔板为基础的药物筛选，是国际大多数药物研究机构广泛使用的药物的初步筛选的技术手段之一。然而这种基于常规孔板的药物筛选方式存在一些局限，如试剂消耗大、操作繁琐、检测灵敏度低等，此外，在操作过程中，细胞受到人为干扰因素较大，使得结果重现性不好，对实验结果的精确性产生一定的影响。因此，药物筛选技术的微型化、自动化和集成化是未来发展的必然趋势。
微流控技术是一种在微米级通道内进行流体控制以实现微量的生物、化学相关实验过程的新兴技术。微流控芯片具有微型化、自动化和集成化等优点，目前广泛用于药物的筛选及分析。然而，传统的微流控技术同样存在一些不足，如由于层流驱动压力使得样品混合不充分、样品间容易产生交叉污染等。此外，临床研究和文献资料表明肿瘤具有异质性，而异质性又是肿瘤易复发和难治疗的重要原因之一，传统的分析方法以细胞群体作为研究对象，以群体的统计平均值作为分析结果，往往会掩盖细胞与细胞之间微小的差异，因此关键的信息却很可能被隐藏，而分析单个肿瘤细胞对掌握和了解肿瘤的发生、发展和治疗肿瘤都有积极的意义。
液滴微流芯片控技术属于微流控技术的一个子类,被广泛应用于单细胞液滴生成，它不仅具有微流控技术的优点，还能克服上述常规微流控技术的缺点。然而，传统的液滴微流控芯片的培养条件属于二维培养，无法真实地模拟肿瘤微环境，如有文献报道肿瘤细胞在群体水平与单细胞水平存在耐药性差异。相比较于二维培养，三维培养可以模拟生物体内真实环境，模拟细胞与细胞之间、细胞与基质间的相互作用。
目前有相关文献报道，多采用海藻酸钠凝胶提供细胞三维培养条件，如Sabhachandani等在文献(Sabhachandani P,Motwani V,Cohen N,et al.Generation andfunctional assessment of 3D multicellular spheroids in droplet basedmicrofluidics platform[J].Lab on a chip,2016,16(3):497-505.)中设计了一种芯片，采用液滴微流控芯片技术生成海藻酸钠凝胶包裹的3D肿瘤多细胞球，用于药物筛选、毒性研究。在实际操作过程中，常规的3D液滴生成芯片，存在不均匀的钙离子分布、过早凝胶化及微通道堵塞等问题。因此，亟需对现有的液滴芯片进行结构优化，开发一种加工难度相对较低、集成化、操作灵活且微流控芯片，以解决以上问题。
CN106497771A公开了一种用于多种药物及细胞同时筛选的多功能微流控芯片，但是与本发明有所区别：其存在以下问题：1.该芯片研究的以群体细胞为研究对象，而本发明以单细胞为研究对象，故本发明增加了液滴生成结构用于单细胞液滴生成；2.该芯片的培养模式为二维培养，而三维培养模式更加贴近人体微环境，故本发明辅助灌流结构用于液滴的原位凝胶化而形成三维结构；3.该芯片涉及的多级分支流体进样通道末端作为细胞培养腔进样口，本发明中与之结构类似的辅助灌流结构为多末端，形成梳形结构，作为细胞培养池的进样口。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种多功能微流控芯片及其制作方法与应用，用于单细胞液滴生成、3D培养及抗肿瘤药物筛选。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种多功能微流控芯片，从上至下依次设置有微阀控制通道层、流体通道层和玻璃基底层；所述微阀控制通道层与流体通道层通过PDMS热键合构成流体通道单元，所述流体通道单元与玻璃基底层通过等离子键合成一体；
所述流体通道层包括液滴生成结构、阵列式细胞培养结构和辅助灌流结构，上述结构通过微流体通道相连通；
所述液滴生成结构包括连续相微流体通道、分散相微流体通道和分枝结构；所述连续相微流体通道包括连续相注入口、从注入口延伸出的对称弧形流体通道和与弧形流体通道相连的连续相S形通道；所述分散相微流体通道包括分散相注入口、从分散相注入口垂直延伸的第二流体通道和与第二流体通道相连的分散相S形通道；所述分枝结构包括微流体通道宽度变窄的第一分枝、第二分枝、第三分枝和第四分枝，所述第一、二分枝与连续相S形通道相连，所述第三分枝与分散相S形通道相连；所述第四分枝与阵列式细胞培养结构连接；所述阵列式细胞培养结构包括细胞入口、细胞培养池和代谢液出口；所述细胞入口通过树形分支结构的微流体通道与液滴生成结构连通；所述细胞培养池内设置网格状支柱结构；所述代谢液出口分别与对应的细胞培养池通过微流体通道连接；
所述辅助灌流结构包括液体总通道注入口、液体分通道注入口和梳形单元；所述液体总入口通过树枝状微流体通道与梳形单元连通；所述梳形单元与细胞培养池相连通；
所述微阀控制通道层包括第一微阀和第二微阀；所述第一微阀包括第一微阀注入口、流体通道、压力阀和第一微阀出液口；所述第二微阀包括第二微阀注入口、流体通道和第二微阀出液口；所述第一微阀设置在液滴生成结构与阵列式细胞培养结构之间，控制液滴生成结构与细胞培养区之间的连通与闭塞；所述第二微阀设置在阵列式细胞培养结构与辅助灌流结构之间，控制细胞培养区与辅助灌流结构的连通与闭塞。
优选的，所述细胞培养池数目为四组。
优选的，所述液体分通道注入口数目为四个。
所述第一微阀和第二微阀均为液动控制微阀；所述第一微阀和第二微阀的结构是由微阀控制通道层的PDMS薄膜与流体通道层的PDMS薄膜组合构成密闭的空腔，分别与压力施加装置相连得到的。
所述液滴生成结构，基于“流动聚焦”设计理念，由油相通道及水相通道构成，两通道通过分枝结构交叉，其中两通道均设计“S”结构，用于缓冲流体。操作时，连续相(矿物油+3％ABIL EM-90)从连续相注入口注入，分散相(海藻酸钠+HepG2细胞的DMEM完全培养基)从分散相注入口注入，两相液体于分枝结构处形成油/水界面，水相受到两侧油相切力作用，形成油包水型液滴；细胞培养结构，由四组相同且独立的细胞培养池构成，细胞培养池通过对称的微流体通道与液滴生成结构连接，包括废液/代谢液出口，为了避免生成的液滴在培养腔内分布不均及长时间使用引起培养腔塌陷等问题，在培养腔中设计了网状“支柱”结构；辅助灌流结构，包括四组平行相同且互相独立的分支流体通道结构，包括液体总通道注入口及四个液体分通道注入口。
作为本发明的一种优选方案，所述压力施加装置为注射器、精密微量注射泵。
一种多功能微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)单晶硅片前处理
单晶硅片放入食人鱼溶液(浓H2SO4:H2O2＝3:1体积比)浸泡，取出后分别用丙酮、无水乙醇和去离子水清洗，加入烘干至完全干燥；
(2)SU-8硅片阳模制备
SU8-2075光刻胶均匀铺在在单晶硅片表面，旋涂，然后进行加热，前烘完毕后将设计好的掩模(阀层、通道层)置于其上，磁石固定后进行光刻，然后进行中烘，完毕后经显影、氮气吹干和后烘，即得；
(3)微阀控制通道层制备
将PDMS预聚物与固化剂按重量比10:1均匀混合，脱气，然后浇注到微阀控制通道层SU-8阳模板上，旋涂，然后进行加热，冷却后从阳模板揭下，经切割打孔得到微阀控制通道层；
(4)流体通道层制备
将PDMS预聚物与固化剂按重量比15:1均匀混合、脱气，浇注到微阀控制通道层SU-8阳模板上，然后加热，经切割打孔得到流体通道层；
(5)芯片键合
将微阀控制通道层、与贴附于SU-8阳模板上的流体通道层同时进行氧等离子处理，然后将两者贴合，110℃加热1h进行两层PDMS的键合；然后将键合成整体的芯片从SU-8阳模板上剥离,得双层PDMS；将双层PDMS与清洗干净的玻璃片同时进行氧等离子处理，完成双层PDMS与清玻璃片的键合。
进一步的，所述步骤(2)中，旋涂采用匀胶机进行，参数为Ⅰ档-750rpm-10s；Ⅱ档-1000rpm-50s。进一步的，所述步骤(2)中，加热程序为65℃→10min；65-95℃→5min；95℃→30min；95℃-65℃→10min，65℃→室温。
进一步的，所述步骤(2)中，中烘程序为65℃→5min；65-95℃→5min；95℃→10min；95℃→室温。
进一步的，所述步骤(2)中，后烘程序为110℃→30min。
进一步的，所述步骤(3)中，旋涂采用匀胶机进行，参数为Ⅰ档-750rpm-5s；Ⅱ档-1000rpm-10s。
进一步的，所述步骤(3)中，加热程序为65℃→5min；65-95℃→5min；95℃→5min；95℃-65℃→5min，65℃→室温。
进一步的，所述步骤(3)中，切割打孔涉及到的孔包括：第一微阀注入口、第一微阀出液口，第二微阀注入口、第二微阀出液口。
进一步的，所述步骤(4)中，加热程序为65℃→10min；65-95℃→5min；95℃→10min；95℃-65℃→5min，65℃→室温。
进一步的，所述步骤(4)中，切割打孔涉及到的孔包括：连续相注入口1，分散相注入口2，代谢液出口14，液体总通道注入口15和液体分通道注入口16。与现有技术相比本发明的有益效果：
本发明提供的可控化产生稳定单细胞液滴的微流控芯片，并可在原位进行凝胶化形成三维立体结构，进行3D培养。通过对液滴生成结构及油相、水相组成及流速的优化，使生成的液滴尺寸均一、稳定，通过对芯片结构的优化，有效降低了液滴生成过程中的泊松效应，使单细胞液滴比例显著提高；通过独立的辅助灌流结构与微阀的巧妙结合，使得钙离子或者药液稳定均匀地灌注到细胞培养池中，避免过早凝胶化，钙离子分布不均及药物刺激不均匀等问题。此外，实验结果表明，凝胶化的液滴稳定性较未凝胶化液滴比较，显著提高。通过对微阀流体控制通道层结构进行了优化，简化了操作，提高了阀控效果。该芯片操控简单，不需要复杂的外部设备，即能实现所述功能。
附图说明
图1为本发明微流控芯片整体结构与流体通道层示意图，其中A为本发明微流控芯片整体结构示意图，B为流体通道层示意图；A中的Ⅰ为微阀控制通道层，Ⅱ为流体通道层，Ⅲ为玻璃基底层。
图2为本发明微流控芯片流体通道层示意图，其中a为液滴生成结构、b为阵列式细胞培养结构，c为辅助灌流结构。
图3为本发明微流控芯片的液滴生成结构示意图。图4为本发明微流控芯片液滴生成结构的分枝结构示意图。
图5为本发明微流控芯片的阵列式细胞培养结构示意图。
图6为本发明微流控芯片的辅助灌流结构示意图。
图7为本发明微流控芯片的第一微阀结构示意图。
图8为本发明微流控芯片的第二微阀的结构示意图。
图9为细胞培养腔中的单细胞液滴(A),单细胞液滴图(B)。
图10为液滴凝胶前(A)后(B)对比图。
图11为不同药物刺激后，HepG2细胞存活率图。
其中：1-连续相注入口，2-弧形流体通道，3-连续相S形通道，4-分散相注入口，5-第二流体通道，6-分散相S形通道，7-第一分枝，8-第二分枝，9-第三分枝，10-第四分枝，11-细胞入口，12-细胞培养池、13-网格状支柱结构，14-代谢液出口，15-液体总通道注入口，16-液体分通道注入口，17-梳形单元，18-第一微阀注入口，19-压力阀，20-第一微阀出液口，21-第二微阀注入口，22-第二微阀出液口。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
参阅图1至图8，一种多功能微流控芯片，自上而下依次为微阀控制通道层Ⅰ、流体通道层Ⅱ和玻璃基底层Ⅲ，通过等离子清洗技术的键合工艺组装成一体。
所述流体通道层包括液滴生成结构a、阵列式细胞培养结构b和辅助灌流结构c，上述结构通过微流体通道相连通；
所述液滴生成结构a包括连续相微流体通道、分散相微流体通道和分枝结构；所述连续相微流体通道包括连续相注入口1、从注入口延伸出的对称弧形流体通道2和与弧形流体通道相连的连续相S形通道3；所述分散相微流体通道包括分散相注入口4、从分散相注入口垂直延伸的第二流体通道5和与第二流体通道相连的分散相S形通道6；所述分枝结构包括微流体通道宽度变窄的第一分枝7、第二分枝8、第三分枝9和第四分枝10，所述第一分枝7、第二分枝8与连续相S形通道3相连，所述第三分枝9与分散相S形通道6相连；所述阵列式细胞培养结构b包括细胞入口11、细胞培养池12和代谢液出口14；所述细胞入口11通过树形分支结构的微流体通道与液滴生成结构连通；所述细胞培养池12内设置网格状支柱结构13；所述代谢液出口14分别与对应的细胞培养池12通过微流体通道连接；
所述辅助灌流结构c包括液体总通道注入口15、液体分通道注入口16和梳形单元17；所述液体总通道注入口15通过树枝状微流体通道与梳形单元17连通，钙离子或者药液从液体总注入口注入；所述梳形单元17与细胞培养池12相连通，液体流经对称的树状分支通道，经由末端的“梳齿”形通道流入细胞培养池。
所述微阀控制通道层Ⅰ包括第一微阀和第二微阀；所述第一微阀包括第一微阀注入口18、流体通道、压力阀19和第一微阀出液口20；所述第二微阀包括第二微阀注入口21、流体通道和第二微阀出液口22；所述第一微阀设置在液滴生成结构a与阵列式细胞培养结构b之间，控制液滴生成结构a与细胞培养区之间的连通与闭塞；所述第二微阀设置在阵列式细胞培养结构b与辅助灌流结构c之间，控制细胞培养区与辅助灌流结构c的连通与闭塞。
优选的，所述连续相微流体通道中，连续相注入口为圆形，尺寸为1.0×1.0mm；弧形流体通道宽度为150μm；连续相S形通道，宽度为150μm；第一、三分枝处流体通道的宽度为60μm。
优选的，所述分散相微流体通道中，分散相注入口为圆形，尺寸为1.0×1.0mm；第二流体通道宽度为150μm；分散相S形通道，宽度为150μm；分枝结构汇合处流体通道，第二、四分枝处宽度为60μm。
优选的，所述第一微阀中，第一微阀注入口为圆形，尺寸为1.0×1.0mm；所述流体通道，宽度为200μm，所述压力阀为椭圆形，尺寸为0.6×2.5mm。
优选的，所述第二微阀中，第二微阀注入口为圆形，尺寸为1.0×1.0mm；所述流体通道，宽度为200μm。
优选的，所述细胞培养池为水滴型与长方形的复合形状，其中长方形的尺寸为1.5×8mm；细胞培养池内流体通道，宽度为200μm。
优选的，所述细胞培养池数目为四组。
优选的，所述辅助灌流结构中，液体总通道注入口为圆形，尺寸为0.8×0.8mm；所述分通道注入口为圆形，尺寸为0.8×0.8mm；全部流体通道，宽度为200μm；“梳”形结构，弯曲流体通道，宽度为200μm，与细胞池连接处流体通道宽度为100μm。
优选的，所述液体分通道注入口数目为四个。
所述第一微阀和第二微阀均为液动控制微阀；所述第一微阀和第二微阀的结构是由微阀控制通道层的PDMS薄膜与流体通道层的PDMS薄膜组合构成密闭的空腔，分别与压力施加装置相连得到的。第一微阀组用于操控液滴生成结构与细胞培养结构的连通，第二微阀组用于操控细胞培养结构与辅助灌流结构的连通。
所述微阀控制通道层和流体通道层均为PDMS薄膜材料制备而成；所述多功能微流控芯片上优选设有液滴生成结构、相同且独立的细胞培养池以及钙离子灌注结构。每个细胞培养池可实现一种药物的筛选，可实现多种药物同时在线筛选，具体操作结合实施例进行详细说明。
实施例1
一种多功能微流控芯片的制作方法：
采用SU-8负性光刻胶工艺、多层PDMS热键合技术及等离子键合技术，并采用具有良好透光透气性和生物相容性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)以及常规玻璃基片作为材料，制作了具有多层结构的集成化微流控芯片，具体步骤如下：
1.单晶硅片的清洗：将切割成合适大小的单晶硅片放入食人鱼溶液(浓H2SO4:H2O2＝3:1体积比)浸泡过夜，取出，分别用丙酮、无水乙醇和去离子水清洗后，放在加热板上120℃烘干30min，使硅片完全干燥。
2.SU-8硅片阳模制作：SU8-2075光刻胶适量沿步骤1中的硅片边角倾倒，轻轻摇晃硅片，使得光刻胶均匀铺在表面，使用匀胶机对光刻胶进行旋涂，参数为(Ⅰ档-750rpm-10s；Ⅱ档-1000rpm-50s)，之后放到加热台加热，程序：(65℃→10min；65-95℃→5min；95℃→30min；95℃-65℃→10min，65℃→室温)，前烘完毕后，将设计好的掩模(阀层、通道层)置于其上，磁石固定，使用光刻机进行光刻，设定能量值(220mJ·cm2)，光刻后，进行中烘，程序(65℃→5min；65-95℃→5min；95℃→10min；95℃→室温)，中烘完成后，室温条件下使用配套的SU8-2075光刻胶显影液进行显影，最后氮气吹干，110℃→30min进行后烘，即得，阳模厚度为170μm。
3.PDMS微阀控制通道层制备：将PDMS预聚物与固化剂按重量比10:1均匀混合，搅拌均匀后置于真空干燥箱中脱气30min，然后浇注到微阀控制通道层SU-8阳模板上，将PDMS缓慢倾倒于通道层阳膜上，匀胶机旋涂，参数：(Ⅰ档-750rpm-5s；Ⅱ档-1000rpm-10s)，之后置于加热台加热程序：(65℃→5min；65-95℃→5min；95℃→5min；95℃-65℃→5min，65℃→室温)。冷却后将其从模板上缓慢揭下，并经切割打孔得到PDMS微阀控制通道层；
切割打孔中，涉及到的孔包括：第一微阀注入口18、第一微阀出液口20，第二微阀注入口21、第二微阀出液口22。
4.PDMS流体通道层制备:将PDMS预聚物与固化剂按重量比15:1均匀混合，搅拌混合均匀后，置于真空箱中进行脱气30min，然后浇注到微阀控制通道层SU-8阳模板上，加热程序：(65℃→10min；65-95℃→5min；95℃→10min；95℃-65℃→5min，65℃→室温)。并经切割打孔得到PDMS微阀控制通道芯片层；
切割打孔中，涉及到的孔包括：连续相注入口1，分散相注入口2，代谢液出口14，液体总通道注入口15和液体分通道注入口16。5.芯片键合:将从模板上剥离并切割打孔的PDMS微阀控制通道层，与贴附于SU-8阳模板上的PDMS流体通道层，同时放入等离子清洗机中进行氧等离子处理2min，在显微镜下将两部分对准贴合在一起，置于110℃加热台上加热1h，完成两层PDMS的键合。之后，将键合成整体的芯片从SU-8阳模板上剥离,并将双层PDMS与清洗干净的玻璃片同时放入等离子清洗机中进行氧等离子处理，完成双层PDMS与清玻璃片的键合。
实施例2
一种多功能微流控芯片的应用，包括如下步骤:
仪器与试剂：
精密微量注射泵(LSP04-1A，保定兰格公司)；Nikon ECLIPSETI倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；海藻酸钠；氯化钙；荧光素钠；矿物油；ABIL EM-90；白杨素-7-O-β-葡糖糖醛酸苷，黄芩素，木蝴蝶苷B；DMEM完全培养基。
溶液的配制：称取适量海藻酸钠粉末及氯化钙粉末于超净台紫外灯下照射0.5h，以DMEM完全培养基分别配置1％(w/w)的海藻酸钠溶液及1％(w/w)的氯化钙溶液；取适量ABIL EM-90油包水型乳化剂于矿物油中，最终形成3％ABIL EM-90-矿物油溶液。
海藻酸钠3D单细胞液滴生成
将精密注射泵通过聚四氟乙烯管与芯片相连接，通过微量注射泵，关闭第二微阀，开启第一微阀。具体原理：PDMS流体通道受到上方相应位置流体压力，发生形变而被关闭堵塞，撤销压力时，PDMS流体通道恢复原状，以此实现对流体通道的操控。
使用精密注射泵，同时推动分散相从分散相注入口4注入，连续相从连续相注入口1注入。分别调整水相流速以50μl/h，油相流速100μl/h。分散相中HepG2细胞在分散相S形通道6中有序排列，在分枝结构汇合处，分散相受到连续相的切力，形成液滴，单细胞被包裹在液滴之中，通过流体通道进入细胞培养池。具体原理及结构优化：在距离分枝结构交汇处前，各流体通道增加“S”形通道，用以缓冲溶液，提高流体通道长宽比，用以减弱泊松效应。此外，分枝结构交汇处通道宽度(60μm)，相比较于流体通道宽度(100μm)变窄，用以控制液滴尺寸。通过调整连续相的流速，调整液滴的大小，通过优化条件，最终单细胞液滴大小为60-100μm，见图9。
当液滴充满细胞培养池12并趋于稳定时，通过液动微泵微阀控制装置，关闭第一微阀，开启第二微阀，用软胶带封住液体分通道注入口16，从液体总通道注入口15，以流速0.2μl/min注入Ca2+-DMEM溶液，Ca2+与海藻酸钠发生反应，生成海藻酸钠凝胶，此时单细胞液滴原位形成三维立体结构,用荧光倒置显微镜观察凝胶细胞图并拍照记录，如图10。具体原理及结构优化：海藻酸钠G单元上的Na+与Ca2+发生离子交换反应，G单元堆积形成交联网络结构，从而形成水凝胶。为防止出现过早凝胶化及钙离子分布不均问题，本发明设计了独立的辅助灌流结构，该结构由4个平行且相同单元构成，确保钙离子均匀、平行地灌注到四个细胞培养池12。此外，为了避免生成的液滴在培养腔内分布不均及长时间使用引起培养腔塌陷等问题，设计了网格状支柱结构13。
药效筛选
培养12h后，通过液动微泵微阀控制装置，关闭第一微阀，开启第二微阀，用软胶带封住液体总通道注入口15，从液体分通道注入口16以流速0.2μl/min分别注入空白培养基、黄芩素(Baicalein)、白杨素7-O-β-D-葡萄糖酸苷(Chrysin-7-O-β-glucoronide)及木蝴蝶苷B(Oroxin B)进行干预，代谢液从代谢液出口14收集，用于后续实验。
药物刺激24h后，关闭第一微阀，开启第二微阀，用软胶带封住液体分通道注入口16，从液体总通道注入口15，以流速0.2μl/min注入Calcein-AM/PI荧光试剂对各组细胞进行染色，荧光倒置显微镜下选择LIVE/DEAD荧光激发模式并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0对图片进行量化处理，计算荧光强度，经SPSS 21.0统计分析。得到最终结果，如图11，各组的肿瘤细胞存活率分别是56.78％、61.16％及39.05％，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

Claims (10)

1.一种多功能微流控芯片，其特征在于，从上至下依次设置有微阀控制通道层（Ⅰ）、流体通道层（Ⅱ）和玻璃基底层（Ⅲ）；所述微阀控制通道层（Ⅰ）与流体通道层（Ⅱ）通过PDMS热键合构成流体通道单元，所述流体通道单元与玻璃基底层（Ⅲ）通过等离子键合成一体；
所述流体通道层包括液滴生成结构（a）、阵列式细胞培养结构（b）和辅助灌流结构（c），上述结构通过微流体通道相连通；
所述液滴生成结构（a）包括连续相微流体通道、分散相微流体通道和分枝结构；所述连续相微流体通道包括连续相注入口（1）、从注入口延伸出的对称弧形流体通道（2）和与弧形流体通道（2）相连的连续相S形通道（3）；所述分散相微流体通道包括分散相注入口（4）、从分散相注入口（4）垂直延伸的第二流体通道（5）和与第二流体通道（5）相连的分散相S形通道（6）；所述分枝结构包括微流体通道宽度变窄的第一分枝（7）、第二分枝（8）、第三分枝（9）和第四分枝（10），所述第一、二分枝与连续相S形通道（3）相连，所述第三分枝（9）与分散相S形通道（6）相连；所述第四分枝（10）与阵列式细胞培养结构连接；所述阵列式细胞培养结构包括细胞入口（11）、细胞培养池（12）和代谢液出口（14）；所述细胞入口（11）通过树形分支结构的微流体通道与液滴生成结构（a）连通；所述细胞培养池（12）内设置网格状支柱结构（13）；所述代谢液出口（14）分别与对应的细胞培养池（12）通过微流体通道连接；
所述辅助灌流结构包括液体总通道注入口（15）、液体分通道注入口（16）和梳形单元（17）；所述液体总入口通过树枝状微流体通道与梳形单元（17）连通；所述梳形单元（17）与细胞培养池（12）相连通；
所述微阀控制通道层包括第一微阀和第二微阀；所述第一微阀包括第一微阀注入口（18）、流体通道、压力阀（19）和第一微阀出液口（20）；所述第二微阀包括第二微阀注入口（21）、流体通道和第二微阀出液口（22）；所述第一微阀设置在液滴生成结构（a）与阵列式细胞培养结构之间，所述第二微阀设置在阵列式细胞培养结构与辅助灌流结构之间。
2.根据权利要求1所述的多功能微流控芯片，其特征在于，所述第一微阀和第二微阀均为液动控制微阀；所述第一微阀和第二微阀的结构是由微阀控制通道层的PDMS薄膜与流体通道层的PDMS薄膜组合构成密闭的空腔，分别与压力施加装置相连得到的。
3.根据权利要求2所述的多功能微流控芯片，其特征在于，所述压力施加装置包括注射器、精密微量注射泵。
4.根据权利要求1所述的多功能微流控芯片，所述连续相微流体通道中，连续相注入口（1）为圆形，尺寸为1.0×1.0mm；弧形流体通道（2）宽度为 150μm；连续相S形通道（3），宽度为 150μm；第一、三分枝处流体通道的宽度为60μm。
5.根据权利要求1所述的多功能微流控芯片，所述分散相微流体通道中，分散相注入口（4）为圆形，尺寸为1.0×1.0mm；第二流体通道（5）宽度为 150μm；分散相S形通道（6），宽度为 150μm；第二、四分枝处宽度为60μm。
6.根据权利要求1所述的多功能微流控芯片，其特征在于，所述第一微阀中，第一微阀注入口（18）为圆形，尺寸为1.0×1.0mm；所述流体通道，宽度为200μm，所述压力阀（19）为椭圆形，尺寸为0.6×2.5mm。
7.根据权利要求1所述的多功能微流控芯片，其特征在于，所述第二微阀中，第二微阀注入口（21）为圆形，尺寸为1.0×1.0mm；所述流体通道，宽度为200μm。
8.根据权利要求1所述的多功能微流控芯片，其特征在于，所述细胞培养池（12）为水滴型与长方形的复合形状，其中长方形的尺寸为1.5×8mm；细胞培养池（12）内流体通道，宽度为200μm。
9.根据权利要求1所述的多功能微流控芯片，其特征在于，所述辅助灌流结构中，液体总通道注入口（15）为圆形，尺寸为0.8×0.8mm；所述液体分通道注入口（16）为圆形，尺寸为0.8×0.8mm；全部流体通道，宽度为200μm；梳形单元（17），弯曲流体通道，宽度为200μm，与细胞池连接处流体通道宽度为100μm。
10.权利要求1-9所述的多功能微流控芯片在单细胞液滴生成、三维培养及抗肿瘤药物筛选的用途。
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